CN111534489B - 一种基于3d打印的t淋巴细胞扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及T淋巴细胞扩增方法，尤其涉及一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法。该方法包括提供功能化处理的生物墨水；所述功能化处理的生物墨水包括生物墨水本体，以及结合了IL‑2、CD3抗体和CD28抗体的微载体；将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合，进行3D打印；将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构进行培养。本发明方法可以解决传统的T淋巴细胞扩增方法细胞增殖空间受限及无法对细胞的增殖形成持续、可控的刺激的技术问题，从而实现快速扩增T淋巴细胞。

Description

一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法

技术领域

本发明涉及T淋巴细胞扩增方法，尤其涉及一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法。

背景技术

T淋巴细胞的体内活化和增殖，需要第一信号、第二信号、第三信号的共同参与，其中第一信号指的是T淋巴细胞表面受体(TCR)与靶细胞表面组织相容性抗原(MHC)结合引发的刺激信号，第二信号指的是共刺激分子(例如，CD28-B7分子对，B7表达于抗原递呈细胞(APC)表面，CD28表达于T淋巴细胞表面)结合引发的刺激信号，第三信号指的是参与此过程调节的细胞因子。

随着过继性T淋巴细胞免疫疗法(例如，经基因工程改造的CAR-T和TCR-T细胞疗法)在临床前和临床研究中不断创造巨大的成功案例，细胞免疫疗法也为肿瘤患者提供了更大范围的治疗选择，而这些疗法都依赖于对免疫细胞的离体大量扩增，以获取足够的治疗剂量，因此，对有效的、临床相关的T淋巴细胞活化和扩增方法的需求也在不断增长。

传统的体外T淋巴细胞活化和扩增方法，主要在二维(2D)平面进行，即T淋巴细胞自然沉降在培养瓶/板/袋底部；此外，用于刺激T淋巴细胞活化和增殖的CD3抗体、CD28抗体、细胞因子(IL-2)，直接加入到培养液中；其原理为：CD3与CD28抗体模拟体内抗原递呈细胞(APC)的作用，与T淋巴细胞表面的CD3、CD28分子结合，提供第一、第二信号，IL-2因子提供第三信号。其中，细胞的增殖空间取决于培养瓶/板/袋底部面积，当细胞增殖到一定密度(例如，≥2.5×10⁶/mL)，细胞活力降低，增殖受到抑制，因此，每2～3天需进行一次密度调整，方可进行后续扩增培养。近年来，为了提升单位空间内T淋巴细胞的增殖能力，在培养系统的设计上进行了一些改进。例如，G-Rex悬浮细胞透气培养系统，通过增加培养液液面高度，底面透气膜设计，从而增加单位空间内的细胞养分，良好的对流环境，使得溶液中的溶质(例如，CD3和CD28抗体、IL-2)通过自然对流与细胞更充分地接触，氧气交换更充分，二氧化碳及时排出。

发明内容

本发明提供一种T淋巴细胞扩增方法，可以解决传统的T淋巴细胞扩增方法细胞增殖空间受限及无法对细胞的增殖形成持续、可控的刺激的技术问题，从而实现快速扩增T淋巴细胞。

一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，包括：

提供功能化处理的生物墨水；所述功能化处理的生物墨水包括生物墨水本体，以及结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体；

将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合，进行3D打印；及

将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构进行培养。

本发明中，所述生物墨水是指可用于3D打印的墨水。本发明可采用本领域常规生物墨水。

在本发明一些实施例中，所述生物墨水选自甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、透明质酸(HA)、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或丝素蛋白。

本发明采用的功能化处理的生物墨水，至少具有如下技术效果：

(1)使T淋巴细胞在3D结构中生长，增加了T淋巴细胞垂直方向上的增殖空间；

(2)将T淋巴细胞、结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体，同时装载于所述生物墨水中，微载体为T淋巴细胞提供更为稳定、持续、可控的第一、第二和第三信号；

(3)3D打印成型后的支架结构，有利于细胞获得充分的氧气和养分；从而极大促进T淋巴细胞在生物墨水中的快速扩增。

本发明中，IL-2即Interleukin-2，是一种白介素，是免疫系统中促进T淋巴细胞存活、增殖和活化的一类细胞生长因子。

在本发明一些实施例中，所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体，该微载体为纳米-微米级的微球，其原料可选自甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、透明质酸(HA)、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或丝素蛋白等，可用这些原料通过乳化法制备；或市售购得。

在本发明一些实施例中，所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体，该微载体的直径在1微米左右。

在本发明一些实施例中，所述功能化处理的生物墨水中，CD3抗体和CD28抗体的浓度比例为1:1。

在本发明一些实施例中，所述功能化处理的生物墨水中，IL-2的浓度为30-500U/mL，优选浓度为100-300U/mL。

在本发明一些实施例中，所述功能化处理的生物墨水中，CD3抗体和CD28抗体浓度分别为1-30ng/mL，优选浓度分别为10-20ng/mL。

在本发明一些实施例中，所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体与T淋巴细胞的数量比为3:1-1:3，优选比例为1:1。

在本发明一些实施例中，选用以上浓度或比例范围，培养7-12天后，3D培养扩增得到的T淋巴细胞数量是2D培养的2-10倍，显著优于2D培养。

在本发明一些实施例中，将生物墨水与所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体混合均匀即可制得所述功能化处理的生物墨水。

在本发明一些实施例中，将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合后，控制混合体系中T淋巴细胞的浓度范围为0.5-2.5×10⁶/mL，例如0.5×10⁶/mL、1×10⁶/mL、1.5×10⁶/mL或2.5×10⁶/mL。

研究表明，细胞密度对于T淋巴细胞扩增能力具有重要意义。将T淋巴细胞维持在上述较低的密度有利于维持细胞的生长、存活和增殖。

在本发明一些实施例中，T淋巴细胞来源包括：小鼠脾淋巴细胞、小鼠淋巴结淋巴细胞、正常人外周血单个核细胞(PBMC)、工程化修饰后的T淋巴细胞(CAR-T、TCR-T)，通过常规的分离、分选方案(例如，机械研磨、酶消化、非连续梯度离心、流氏分选)获得T淋巴细胞。

在本发明一些实施例中，所述T淋巴细胞为小鼠脾脏来源的T淋巴细胞，其为机体适应性免疫中负责杀伤肿瘤细胞的主要免疫细胞。

在本发明一些实施例中，是将T淋巴细胞与已功能化处理的生物墨水混合，通过挤出式打印进行3D打印。关于所用3D打印设备及打印方法可参考现有技术，本发明不做特别限制。

在本发明一些实施例中，将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构置于G-Rex透气型培养系统中培养，其优点在于为结构中不断扩增的T淋巴细胞，提供充足的养分，充分的氧气交换，代谢产生的二氧化碳及时排出。

在本发明一些实施例中，培养T淋巴细胞所使用的培养基为淋巴细胞培养专用培养基。本领域技术人员可根据需要选择这些培养基，例如市售购得。

在本发明一些实施例中，将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构培养7～12天。

研究发现，采用本发明T淋巴细胞扩增方法，在保证T淋巴细胞表型和功能的前提下，细胞扩增速度显著优于2D(二维)层面培养的扩增速度。

研究发现，经上述方法所得3D打印结构可以为T淋巴细胞扩增提供充分的增殖空间、氧气和养分供给。并且该3D打印结构经过功能化处理，使T淋巴细胞与信号分子稳定接触，可以为结构中T淋巴细胞的增殖提供持续、可控的刺激信号，从而有利于显著提高细胞扩增速度。

本发明还包括上述方法培养所得T淋巴细胞。

有益效果

本发明方法可以快速扩增得到大量T淋巴细胞。快速扩增得到大量T淋巴细胞，是细胞免疫治疗中亟待解决的一个问题。现有的T淋巴细胞扩增方法主要在2D层面进行，T淋巴细胞自然沉降在培养容器底部，细胞增殖空间受限；信号刺激分子(抗体和因子)直接加入培养液中，或预包被于培养器皿底面，信号分子的释放不可控。而本发明通过T淋巴细胞3D打印扩增得到的T淋巴细胞，耗时短，7～12天内获得的细胞量显著高于传统T淋巴细胞扩增方法得到的细胞量。本发明方法为过继细胞免疫治疗，提供一种更为快速、有效的T淋巴细胞扩增途径。

附图说明

图1表示本发明实施例结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体及功能化处理的生物墨水的制备流程示意图；

图2表示本发明实施例基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下所用3D打印设备为SUNP BioMaker(上普博源生物科技有限公司)。

以下所用T淋巴细胞为小鼠脾淋巴细胞，其获取方法：小鼠脾脏组织取材，机械研磨法结合密度梯度离心法，流氏细胞分选仪分选出T淋巴细胞群。

以下实施例中，结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体及功能化处理的生物墨水的制备流程参见示意图1。

以下实施例中，基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法参见示意图2。

实施例1

1.制备功能化处理的生物墨水

如图1所示，乳化法制备GelMA(w/v，10％)微球，选取直径1微米左右的GelMA微球，表面偶联CD3抗体和CD28抗体，内部负载IL-2分子，其中IL-2浓度为300U/mL，CD3抗体和CD28抗体浓度分别为10ng/mL。

生物墨水中微载体的数量，依据T淋巴细胞数量进行调整，微载体与T淋巴细胞数量比保持1:1。

2.将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合，控制混合体系中T淋巴细胞的浓度为1×10⁶/mL；

进行3D打印，边打印边固化交联，之后在G-Rex透气型培养系统中培养12天；所使用的培养基为淋巴细胞培养专用培养基。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于生物墨水中T淋巴细胞初始浓度为2.5×10⁶/mL。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于生物墨水中T淋巴细胞初始浓度为0.5×10⁶/mL。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：所用生物墨水中不含结合了IL-2、CD3和CD28抗体的微载体，仅含生物墨水本体和T淋巴细胞。

对比例2

与实施例1的区别仅在于：将IL-2、CD3和CD28抗体直接加入到生物墨水中进行3D打印，而非结合在微载体上。

对比例3 2D培养

与实施例1的区别仅在于：不采用生物墨水进行3D打印，而是仅将T淋巴细胞直接悬浮培养于培养液中(T淋巴细胞的初始浓度为1×10⁶/mL)；不将IL-2、CD3和CD28抗体结合在微载体上，而是直接加入到培养液中。

实验结果

以上实施例1-3及对比例1-3方法T淋巴细胞扩增倍数及细胞存活率(％)见下表1。

表1

注：扩增倍数指培养12天后的细胞数目除以初始细胞数目。

结果表明，对比例1中的T淋巴细胞，当培养2-3天时，T淋巴细胞发生皱缩、死亡，无法进行后续培养；培养12天后，细胞存活率为10％，T淋巴细胞几乎全部凋亡。对比例2中的T淋巴细胞，当培养5-7天时，T淋巴细胞增殖速度减慢，且细胞存活率下降。对比例3中的T淋巴细胞，当培养2-3天时，T淋巴细胞增殖空间受限，增殖速度减慢，且细胞存活率下降。实施例1-3的扩增倍数及细胞存活率显著优于对比例2和3。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，包括：

提供功能化处理的生物墨水；所述功能化处理的生物墨水包括生物墨水本体，以及结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体；所述微载体表面偶联CD3抗体和CD28抗体，内部负载IL-2分子；

将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合，控制混合体系中T淋巴细胞的浓度为1×10⁶/mL；进行3D打印；及

将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构进行培养；

所述生物墨水选自甲基丙烯酰化明胶、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或丝素蛋白；

所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体为纳米-微米级的微球；

所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体的直径1微米；

所述功能化处理的生物墨水中，CD3抗体和CD28抗体的浓度比例为1:1；

所述功能化处理的生物墨水中，IL-2的浓度为30-500 U/mL；

所述功能化处理的生物墨水中，CD3抗体和CD28抗体浓度分别为1-30 ng/mL；

所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体与T淋巴细胞的数量比为3:1-1:3。

2.根据权利要求1所述的基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，其中，所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体的原料可选自甲基丙烯酰化明胶、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或丝素蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，其中，所述功能化处理的生物墨水中，IL-2的浓度为100-300 U/mL；和/或，

所述功能化处理的生物墨水中，CD3抗体和CD28抗体浓度分别为10-20 ng/mL。

4.根据权利要求1或2所述的基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，其中，所述结合了IL-2、CD3抗体和CD28抗体的微载体与T淋巴细胞的数量比为1:1。

5.根据权利要求1或2所述的基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，其中，将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构置于G-Rex透气型培养系统中培养。

6.根据权利要求1或2所述的基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，其中，将3D打印所得含T淋巴细胞的3D结构培养7~12天。

7.一种基于3D打印的T淋巴细胞扩增方法，包括：

1）制备功能化处理的生物墨水

乳化法制备10%w/v GelMA微球，选取直径1微米的GelMA微球，表面偶联CD3抗体和CD28抗体，内部负载IL-2分子，其中IL-2浓度为300 U/mL，CD3抗体和CD28抗体浓度分别为10ng/mL；

生物墨水中微载体与T淋巴细胞数量比保持1:1；

2）将T淋巴细胞与所述功能化处理的生物墨水混合，控制混合体系中T淋巴细胞的浓度为1×10⁶/mL；

进行3D打印，边打印边固化交联，之后在G-Rex透气型培养系统中培养12天；所使用的培养基为淋巴细胞培养专用培养基。

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