CN110195041B - 利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，该方法可以显著提高调节性T细胞(Tregs细胞)的纯度与免疫调节功能，所述方法首先取对数生长期的ASC种植在三维载体上，预活化处理后再使用γ射线对ASC进行辐照处理，作为饲养层；使用免疫磁珠法从外周血单个核细胞分选纯化得到CD4+CD25+T细胞；然后将三维ASC饲养细胞与CD4+CD25+T细胞进行共同培养，并加入白介素‑2、anti‑CD3抗体和anti‑CD28抗体等刺激Tregs细胞进入有丝分裂。对扩增后得到的Tregs细胞进行检测，结果发现利用三维培养的ASC细胞作为饲养层对Tregs细胞进行扩增，可以显著地提高Tregs细胞的纯度，并高表达IL‑10等免疫调控基因。

Description

利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法。
背景技术
慢性炎症在糖尿病和肥胖发生发展中的关键作用越来越被人们所认识。许多炎症因子如C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血浆纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)及白细胞介素6(IL-6)等与糖尿病及其并发症有密切关联。糖尿病不仅是一个以高血糖为主要表现的疾病，也是一种慢性炎症类疾病。另外，慢性炎症不仅与肥胖相关，也和肿瘤附近的血管发生密切相关。使用调节性T细胞可有效抑制炎症反应，用于治疗1型和2型糖尿病及其它由炎性介导的疾病的治疗，已经成为研究热点。
调节性T细胞(regulatory T cells，Treg cells)是具有免疫调节功能的T细胞亚群，它在自身免疫耐受的获得中起着重要作用，基于Tregs细胞治疗具有作用时间持久、低毒和靶向特定抗原的特点，其被认为是最合适的免疫抑制剂。可以通过输注Tregs细胞治疗慢性炎症类疾病、自身免疫疾病和移植物抗宿主疾病(GVHD)。Tregs细胞主要存在于CD4+CD25+Foxp3+T细胞群中，可以分泌多种细胞因子，主要通过接触抑制的方式抑制T细胞的活化和增殖。另外，Tregs细胞还可以分泌细胞因子IL-10和TGF-β抑制免疫反应，IL-10可明显降低抗原特异性T细胞的增殖、抑制IL-2的产生。间接机制包括下调MHC II类分子的表达、下调单核细胞CD80和CD86的表达以及T细胞共同刺激分子CD28的配体。TGF-β从三个方面对免疫功能起抑制作用：一是抑制免疫效应细胞的增殖；二是抑制免疫效应细胞的分化和活性；三是抑制细胞因子的产生及其免疫调节作用。调节性T细胞所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的调节中具有广泛的应用前景，目有许多研究显示调节性T细胞在Th1或Th2介导的疾病中具有良好效果，如炎症性肠病、移植免疫、支气管哮喘、口服耐受及实验性自身免疫性脑脊髓炎。但在Tregs培养过程中，如何提高CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群的比率，以及在体内外抑制活化T细胞的增殖率，从而提高在治疗慢性炎症类疾病中的疗效，已经成为本领域的研究热点。
人脂肪间充质干细胞(adipose-derved mesenchymal stem cells,ASCs)是来源于脂肪组织的间充质干细胞，可分泌多种免疫细胞增殖所需的细胞因子，如CSF1、LGALS1、PSTL1/3和VEGF等多种细胞因子，可有效的促进Tregs细胞的生长与增殖。本专利所描述的技术体系采用了三维培养方式，所获得的脂肪间充质干细胞饲养层具有更好的因子分泌和调控能力，可以通过共培养技术获得更高活性的CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞，是一种合理高效的Tregs细胞体外增殖扩增方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法。本发明利用三维培养的ASC细胞作为饲养层对Tregs细胞进行扩增，可以显著地提高Tregs细胞的纯度，并高表达IL-10等免疫调控基因。
本发明所采用的技术方案为：
利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，包括如下步骤：
(1)三维饲养层细胞体系的制备：抽取脂肪进行消化，过滤得到单细胞悬液；向其中加入ASC扩增培养基进行培养，得到传代细胞；将传代细胞滴加到三维培养载体上，加入ASC预活化培养基继续培养，最后连同三维培养载体一起经γ射线辐照，使ASC失去增殖分裂的能力但可以保持其原有的生物活性，得到所述三维饲养层细胞体系；
(2)免疫磁珠细胞分选法分离CD4+CD25+T细胞：采集新鲜成人外周血，使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入抗CD4和CD25免疫磁珠进行分选，获得CD4+CD25+T细胞；
(3)体外扩增培养：将步骤(2)中获得的CD4+CD25+T细胞加入到含有步骤(1)所得三维饲养层细胞体系的培养瓶中，加入CD4+CD25+T细胞扩增培养基进行共培养，得到所述高活性Tregs细胞。
进一步的，步骤(1)中，所述脂肪消化使用的为胶原酶和胰蛋白酶，胶原酶浓度为0.1％，胰蛋白酶的浓度为0.25％，其中胶原酶为I型胶原酶与II型胶原酶的等比例混合。
进一步的，步骤(1)中，消化脂肪先使用胶原酶消化20-40min，然后加入胰蛋白酶消化10-20min，消化温度为36-38℃。
进一步的，步骤(1)中，ASC扩增培养基和ASC预活化培养基均由αMEM培养基进行配制。
进一步的，步骤(1)中，ASC扩增培养基的组成为：3％-20％的FBS；ASC预活化培养基的组成为：1％～5％的FBS、5-200ng/mL的IFN-γ、5-50ng/mL的TNF-α、50-200mmol/L的N-乙酰基-D-葡糖胺。
进一步的，步骤(1)中，所述传代细胞为P3-P6代；所述三维培养载体为聚氟乙烯三维培养载体；加入ASC预活化培养基后培养36-60h；所述辐照使用的为钴60照射，剂量为20-40Gray。
进一步的，步骤(2)中，所述淋巴细胞分离液的密度为1.0067；所述淋巴细胞分离液与外周血的体积比为(1-3):2。
进一步的，步骤(3)中，所述CD4+CD25+T细胞扩增培养基使用的为RPMI1640培养基，FBS浓度为3％-15％；所述CD4+CD25+T细胞与ASC细胞数量比为(1-3):1；共培养总天数为15天。
进一步的，步骤(3)中，扩增培养第一天向共培养体系中加入终浓度均为20ng/mL-100ng/mL抗人CD3抗体和抗人CD28抗体。
进一步的，步骤(3)中，扩增培养第三天向共培养体系中加入终浓度为200-1500IU/mL的白介素2和终浓度为0.5μg/mL-2μg/mL的Rapamycin。
进一步的，步骤(3)中，在扩增第6、10、13天时补充CD4+CD25+T细胞扩增培养基，同时补充终浓度为200-1500IU/mL的白介素2和终浓度为0.5μg/mL-2μg/mL的Rapamycin。
进一步的，权利要求1-9所述方法获得的高活性Tregs细胞在治疗1型和2型糖尿病及其它由炎性介导的疾病中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述方法可以显著提高调节性T细胞(Tregs细胞)的纯度与免疫调节功能，所述方法首先取对数生长期的ASC种植在三维载体上，预活化处理后再使用γ射线对ASC进行辐照处理，作为饲养层；使用免疫磁珠法从外周血单个核细胞分选纯化得到CD4+CD25+T细胞；然后将三维ASC饲养细胞与CD4+CD25+T细胞进行共同培养，并加入白介素-2、anti-CD3抗体和anti-CD28抗体等刺激Tregs细胞进入有丝分裂。对扩增后得到的Tregs细胞进行检测，结果发现利用三维培养的ASC细胞作为饲养层对Tregs细胞进行扩增，可以显著地提高Tregs细胞的纯度，并高表达IL-10等免疫调控基因。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1和图2是脂肪间充质干细胞(ASC)的三维培养；
图3为Tregs细胞在与ASC共培养中的扩增曲线；
图4和图5是Tregs细胞在与ASC共培养中的表型检测和免疫调控关键基因表达检测图；
图6是Tregs细胞在与ASC共培养中的增殖指数；
图7是Tregs细胞扩增培养15天后免疫调控关键基因的mRNA表达倍数。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，具体方法包括以下步骤：
(1)人脂肪间充质干细胞的培养：将去除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入同体积倍数的胶原酶，浓度为0.1％，36℃消化20min，PBS洗3次后，加入同体积倍数的胰蛋白酶在36℃下消化10min，终止消化后于细胞筛上过滤，1500r/min离心5min收集细胞后以2×105个/mL的浓度接种于培养瓶中，向其中加入ASC扩增培养基，置于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，ASC扩增培养基为在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为3％。
(2)三维饲养层细胞的制备：取培养P3代的脂肪间充质干细胞，滴加到聚氟乙烯三维培养载体上进行三维培养，使用ASC预活化培养基继续培养36h，采用γ射线钴60照射培养体系，处理剂量选择最终浓度为20Gray，用作饲养层细胞；ASC预活化培养基的配制方法：在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为1％，添加IFN-γ最终浓度为5ng/mL，添加TNF-α最终浓度为5ng/mL，添加N-乙酰基-D-葡糖胺最终浓度为50mmol/L。
(3)免疫磁珠细胞分选法分离CD4+CD25+T细胞：采集新鲜成人外周血，用淋巴细胞分离液(密度1.0667)分离单个核细胞，所述淋巴细胞分离液与外周血的体积比为1:2，然后加入商品化抗CD4和CD25免疫磁珠进行分选，阳性分离法获得CD4+CD25+T细胞。
(4)Tregs细胞的体外扩增培养：将以上步骤获取的CD4+CD25+T细胞加入含有三维饲养层细胞体系的培养瓶中，两种细胞培养比例调整为细胞数量比1:1(CD4+CD25+T细胞总数：ASC细胞总数)，使用Tregs细胞扩增培养基进行共培养，培养总天数为15天；Tregs细胞扩增培养基为RPMI1640，添加FBS使终浓度为3％；共培养第1天添加抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，两者最终浓度均为20ng/mL；共培养第3天添加白介素2使终浓度为200IU/mL，并且添加Rapamycin使最终浓度为0.5μg/mL；分别在第6、10、13天进行补液，补充Tregs细胞扩增培养基，同时补充白介素2使终浓度为200IU/mL，添加Rapamycin使最终浓度为0.5μg/mL。
实施例2
本实施例提供一种利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，具体方法包括以下步骤：
(1)人脂肪间充质干细胞的培养：将去除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入3倍体积的胶原酶，浓度为0.1％，38℃消化40min，PBS洗3次后，加入脂肪体积3倍的胰蛋白酶在38℃下消化20min，终止消化后于细胞筛上过滤，1500r/min离心5min收集细胞后以2×105个/mL的浓度接种于培养瓶中，向其中加入ASC扩增培养基，置于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，ASC扩增培养基为在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为20％。
(2)三维饲养层细胞的制备：取培养P6代的脂肪间充质干细胞，滴加到聚氟乙烯三维培养载体上进行三维培养，使用ASC预活化培养基继续培养60h，采用γ射线钴60照射培养体系，处理剂量选择最终浓度为40Gray，用作饲养层细胞；ASC预活化培养基的配制方法：在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为5％，添加IFN-γ最终浓度为200ng/mL，添加TNF-α最终浓度为50ng/mL，添加N-乙酰基-D-葡糖胺最终浓度为200mmol/L。
(3)免疫磁珠细胞分选法分离CD4+CD25+T细胞：采集新鲜成人外周血，用淋巴细胞分离液(密度1.0667)分离单个核细胞，所述淋巴细胞分离液与外周血的体积比为3:2，然后加入商品化抗CD4和CD25免疫磁珠进行分选，阳性分离法获得CD4+CD25+T细胞。
(4)Tregs细胞的体外扩增培养：将以上步骤获取的CD4+CD25+T细胞加入含有三维饲养层细胞体系的培养瓶中，两种细胞培养比例调整为细胞数量比3:1(CD4+CD25+T细胞总数：ASC细胞总数)，使用Tregs细胞扩增培养基进行共培养，培养总天数为15天；Tregs细胞扩增培养基为RPMI1640，添加FBS使终浓度为15％；共培养第1天添加抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，两者最终浓度均为100ng/mL；共培养第3天添加白介素2使终浓度为1500IU/mL，并且添加Rapamycin使最终浓度为2μg/mL；分别在第6、10、13天进行补液，补充Tregs细胞扩增培养基，同时补充白介素2使终浓度为1500IU/mL，添加Rapamycin使最终浓度为2μg/mL。
实施例3
本实施例提供一种利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，具体方法包括以下步骤：
(1)人脂肪间充质干细胞的培养：将去除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加入2倍体积的胶原酶，浓度为0.1％，37℃消化30min，PBS洗3次后，加入脂肪体积2倍的胰蛋白酶在37℃下消化15min，终止消化后于细胞筛上过滤，1500r/min离心5min收集细胞后以2×105个/mL的浓度接种于培养瓶中，向其中加入ASC扩增培养基，置于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，ASC扩增培养基为在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为10％。
(2)三维饲养层细胞的制备：取培养P3代-P6代的脂肪间充质干细胞，滴加到聚氟乙烯三维培养载体上进行三维培养，使用ASC预活化培养基继续培养48h，采用γ射线钴60照射培养体系，处理剂量选择最终浓度为30Gray，用作饲养层细胞；ASC预活化培养基的配制方法：在αMEM培养基中添加FBS使终浓度为3％，添加IFN-γ最终浓度为50ng/mL，添加TNF-α最终浓度为15ng/mL，添加N-乙酰基-D-葡糖胺最终浓度为100mmol/L。
(3)免疫磁珠细胞分选法分离CD4+CD25+T细胞：采集新鲜成人外周血，用淋巴细胞分离液(密度1.0667)分离单个核细胞，所述淋巴细胞分离液与外周血的体积比为1:1，然后加入商品化抗CD4和CD25免疫磁珠进行分选，阳性分离法获得CD4+CD25+T细胞。
(4)Tregs细胞的体外扩增培养：将以上步骤获取的CD4+CD25+T细胞加入含有三维饲养层细胞体系的培养瓶中，两种细胞培养比例调整为细胞数量比2:1(CD4+CD25+T细胞总数：ASC细胞总数)，使用Tregs细胞扩增培养基进行共培养，培养总天数为15天；Tregs细胞扩增培养基为RPMI1640，添加FBS使终浓度为8％；共培养第1天添加抗人CD3抗体和抗人CD28抗体，两者最终浓度均为50ng/mL；共培养第3天添加白介素2使终浓度为500IU/mL，并且添加Rapamycin使最终浓度为1μg/mL；分别在第6、10、13天进行补液，补充Tregs细胞扩增培养基，同时补充白介素2使终浓度为500IU/mL，添加Rapamycin使最终浓度为1μg/mL。
实验例
Treg细胞的计数、表型鉴定和功能测定
1、分别于共培养后第0、3、6、9、12和15天检测对照组与实验组扩增T淋巴细胞的总数，绘制生长曲线；
2、通过流式细胞术检测其中CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群的纯度：每管抽取100μL细胞悬液检测CD4+CD25+Foxp3+比例，FoxP3荧光抗体的标记和检测按照FoxP3 Fix/Permbuffer说明书进行：首先每管分别加入5μL表面抗体FITC anti-CD4、PE/Cy5 anti-CD25，室温孵育20min后，加入2ml PBS洗涤；每管加入2ml红细胞裂解液，室温孵育15分钟，用PBS洗涤；加入1×Fixation固定剂孵育40min，加入2ml 1×Perm buffer洗涤2次；加入100μL 1×Perm buffer溶液重悬细胞，分别加入5μL胞内抗体APC anti-FoxP3标记，室温孵育50min，洗涤后加入200μL PBS上机检测。采用GuavaeasyCyte 6HT流式细胞仪检测，结果以FlowJoversion 7.6.2软件分析
3、检测Treg细胞分泌的CCR2、CCR4、IL-10、FoxP3、IL-35、Helios、CTLA-4和TGF-beta1等免疫抑制性基因的mRNA表达含量：根据CD4+CD25+Treg细胞分选试剂盒说明分选出CD4+CD25+细胞，流式细胞学检测Treg细胞分选纯度达90％以上。将分选的Treg细胞加入Trizol，按照说明书提取细胞总RNA。根据按照日本东洋纺RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录及SYBR Green荧光定量PCR检测，引物序列由上海博尚生物公司合成，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃15s、60℃1min，33个循环。实验设3个复孔，以GAPDH为内参照，应用Sequencedetection software(version4.0.25)分析软件分析基因相对表达。由公式2-△△Ct计算mRNA在ALL中的相对表达量：其中△△Ct＝(CtmRNA-CtGAPDH)实验组-(CtmRNA-CtGAPDH)对照组。
具体结果见图1和图2所示，由图中可以看出脂肪间充质干细胞(ASC)在三维培养中可粘附于聚氟乙烯支架(图1和图2)；Treg细胞在与三维培养的ASC共培养中，扩增最慢(图3)，但其CD4+CD25+Foxp3+三阳细胞亚群的比率最高，CD4+CD25+Foxp3+三阳细胞亚群可在Day14达到13.21％，显著高于无饲养层组(Control-Treg)和二维ASC饲养层细胞组(2D-ASC-Treg)(图4、图5和图6)；使用qRT-PCR方法，在Treg细胞扩增培养15天后检测免疫调控关键基因的mRNA表达，可见与三维培养的ASC共培养的组(3D-ASC-Treg)表达CCR2、CCR4、IL-10和FoxP3基因显著高于其它组(图7)，证明与三维培养的ASC共培养的Treg细胞具有最佳免疫抑制效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)三维饲养层细胞体系的制备：抽取脂肪进行消化，过滤得到单细胞悬液；向其中加入ASC扩增培养基进行培养，得到传代细胞；将传代细胞滴加到三维培养载体上，加入ASC预活化培养基继续培养，最后连同三维培养载体一起经γ射线辐照，得到所述三维饲养层细胞体系；
(2)免疫磁珠细胞分选法分离CD4+CD25+T细胞：采集新鲜成人外周血，使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入抗CD4和CD25免疫磁珠进行分选，获得CD4+CD25+T细胞；
(3)体外扩增培养：将步骤(2)中获得的CD4+CD25+T细胞加入到含有步骤(1)所得三维饲养层细胞体系的培养瓶中，加入CD4+CD25+T细胞扩增培养基进行共培养，得到所述高活性Tregs细胞；
步骤(1)中，所述脂肪消化使用的为胶原酶和胰蛋白酶，胶原酶浓度为0.1％，胰蛋白酶的浓度为0.25％，其中胶原酶为I型胶原酶与II型胶原酶的等比例混合；
步骤(1)中，消化脂肪先使用脂肪体积1-3倍的胶原酶消化20-40min，然后加入脂肪体积1-3倍的胰蛋白酶消化10-20min，消化温度为36-38℃；
步骤(3)中，扩增培养第一天向共培养体系中加入终浓度均为20ng/mL-100ng/mL抗人CD3抗体和抗人CD28抗体；
扩增培养第三天向共培养体系中加入终浓度为200-1500IU/mL的白介素2和终浓度为0.5μg/mL-2μg/mL的Rapamycin；
在扩增第6、10、13天时补充CD4+CD25+T细胞扩增培养基，同时补充终浓度为200-1500IU/mL的白介素2和终浓度为0.5μg/mL-2μg/mL的Rapamycin。
2.根据权利要求1所述的利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，ASC扩增培养基和ASC预活化培养基均由αMEM培养基进行配制。
3.根据权利要求1所述的利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，ASC扩增培养基的组成为：3％-20％的FBS；
ASC预活化培养基的组成为：1％-5％的FBS、5-200ng/mL的IFN-γ、5-50ng/mL的TNF-α、50-200mmol/L的N-乙酰基-D-葡糖胺。
4.根据权利要求1所述的利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述传代细胞为P3-P6代；
所述三维培养载体为聚氟乙烯三维培养载体；
加入ASC预活化培养基后培养36-60h；
所述辐照使用的为钴60照射，剂量为20-40Gray。
5.根据权利要求1所述的利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述淋巴细胞分离液的密度为1.0067；
所述淋巴细胞分离液与外周血的体积比为(1-3):2。
6.根据权利要求1所述的利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述CD4+CD25+T细胞扩增培养基使用的为RPMI1640培养基，FBS浓度为3％-15％；
所述CD4+CD25+T细胞与ASC细胞数量比为(1-3):1；
共培养总天数为15天。
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