CN113881632B - 一种提高dc细胞活性的细胞培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高DC细胞活性的细胞培养基及培养方法，属于生物医药技术领域，所述培养基包括RPMI 1640培养基，还包括泊马度胺；本方法在DC细胞体外培养时，加入适量泊马度胺表现出显著的提升健康人及多发性骨髓瘤患者DC细胞活性及成熟度的作用，显示出作为DC佐剂的潜力，可用于基于DC的治疗策略，例如DC疫苗和DC细胞疗法等。

Description

一种提高DC细胞活性的细胞培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种提高DC细胞活性的细胞培养基及培养方法。

背景技术

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)为浆细胞来源的恶性肿瘤，目前发病率高居血液系统恶性肿瘤第二位，至今仍不可治愈，患者终将面对疾病复发。MM发病与染色体的缺失、基因异常表达、免疫微环境改变等密切相关，且在疾病早期就已经出现免疫紊乱。由此，以提升患者自体抗骨髓瘤免疫力的免疫治疗策略，可以通过提升机体免疫监视、免疫活化、免疫杀伤效应，而有效清除体内癌细胞，甚至达到彻底治愈的目的。

而树突状细胞(Dendritic cell,DC)在启动机体抗肿瘤免疫应答中起着关键作用，DC细胞作为最重要的抗原递呈细胞，通过递呈MHC分子以及肿瘤抗原给初始T细胞识别、同时提供T细胞活化所需的共刺激信号，并促进Th细胞以及细胞毒性T淋巴细胞的分化增殖，从而为启动机体特异性抗肿瘤免疫应答最为关键的第一步。

研究显示，MM患者表现为显著的免疫缺陷，其中患者体内严重免疫缺陷的DC细胞为特异性抗肿瘤免疫力不能被正常、有效激活的主要原因之一，导致疾病的发生发展。由此，逆转患者体内DC细胞的严重免疫缺陷状态，恢复或提升患者DC细胞活性及成熟度，为亟待解决的关键问题之一。

因此，体外培养、诱导形成MM患者自体来源的DC细胞并显著增强其活性及成熟度，之后将其DC细胞回输至患者体内的免疫治疗策略为近年来国内外研究的前沿热点方向，具有良好的研究及转化应用前景。

当前体外培养诱导形成MM患者自体来源DC细胞并将其回输患者体内的免疫治疗策略已得到一定发展。目前常见的体外培养、诱导DC细胞的方法一般为：从外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，将PBMCs在1640培养基中、于37℃，5％CO₂环境中培养2小时，以使其中DC前体细胞(单核细胞)黏附、贴壁。其后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，将DC前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素组成的培养基中培养7天，以诱导形成DC细胞；其后收获DC细胞。又比如中国专利申请CN106085960A公开了一种在培养基中加入IL-4、GM-CSF、干细胞生长因子SCF、IL-14、IL-2、CD40L等成分的DC细胞培养方法；中国专利申请CN 112852732 A公开了一种在培养基中加入酪氨酸激酶抑制剂(伊马替尼、达沙替尼和尼洛替)以及诱导分化刺激物(细胞因子TNF-α、IL-6、PGE2以及原肽MART-1aa26-35*A27L等)的DC细胞培养方法。

但现有的DC细胞体外诱导培养技术虽然可在一定程度上提升患者DC细胞活性以及成熟度，但距离高度活化及成熟的DC细胞刺激出机体显著的抗肿瘤免疫效应、达到显著的临床疗效仍有差距。由此，如何技术创新，研发DC细胞活性和成熟度显著提升的体外DC细胞培养技术，让MM患者免疫缺陷的DC细胞其活性及成熟度恢复正常或显著提高，为当前DC细胞治疗策略中亟需解决的关键问题。

即，MM患者机体存在免疫缺陷，其中严重免疫缺陷状态的DC细胞可导致正常的特异性抗骨髓瘤免疫应答不能被有效激活，亦是体外培养、诱导形成的患者来源DC细胞活性、成熟度不理想、以及自体DC细胞回输患者体内后临床疗效不理想的主要原因。现有的常规培养方案在一定程度上提高了DC的成熟度，但仍有较大提升空间。

发明内容

本发明的目的之一，就在于提供一种提高DC细胞活性的细胞培养基，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种提高DC细胞活性的细胞培养基，包括RPMI 1640培养基，还包括泊马度胺。

泊马度胺(Pomalidomide)是继第一代沙利度胺、第二代雷那度胺研发以来的第三代免疫调节药物(Immunomodulatory drugs,IMiDs)，不仅由于抗肿瘤作用作为MM的治疗药物投入临床应用，而且更是表现出对免疫细胞的显著免疫调节作用。临床试验显示，在复发/难治性MM患者中，泊马度胺与低剂量的地塞米松联合治疗，可使患者体内T细胞来源的IFN-γ、TNF-α、IL-2含量提高，激活T细胞的功能。此外，亦发现患者体内NK细胞来源的TNF-α、IFN-γ、穿孔素和颗粒酶含量提高，NK细胞表面的CD16、黏附分子CD11a表达水平增加，NK细胞的ADCC作用增强。

本申请经过发明人大量试验证明：泊马度胺能显著提高体外培养、诱导形成的DC细胞MHC分子(HLA-DR)、共刺激分子(CD80\CD86\CD40)的表达及活化免疫相关细胞因子的产生，显著提升DC细胞的活性及成熟度。

由于泊马度胺本身为MM患者的口服治疗药物，而在体外培养、诱导形成MM患者DC细胞的制备方法中，将泊马度胺作为一种制备DC细胞的辅料予以应用，相对于其他DC佐剂药物作为辅料应用于体外MM患者DC制备，可减少药物的使用种类，且即使DC细胞制备过程中的辅料佐剂随DC细胞一同输入患者体内，对MM患者而言安全性和疗效影响均显著降低。

因此，以本申请以率先研究发现为依据，将泊马度胺应用到体外培养诱导形成DC细胞的DC培养技术中，以获得高度活化及成熟的DC细胞为具有良好潜力及转化应用前景的技术创新，而将泊马度胺应用到DC细胞培养技术中的DC细胞培养技术方案，将于下述部分详细阐述。

作为优选的技术方案：所述泊马度胺的浓度为8-10μM。

发明人经过试验证实，泊马度胺的浓度在10μM m以上时，毒性很强，DC细胞发生死亡，活性不好不能达到很好效果；而泊马度胺的浓度过低，对DC细胞活性提升不好，目标功效不好，达不到效果；

根据发明人的试验证明：泊马度胺的浓度为10μM时，为更优浓度。

作为进一步优选的技术方案：所述培养基还包括人血清、GM-CSF、IL-4、青霉素和链霉素。

作为更进一步优选的技术方案：所述组分的浓度为：5vol％人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素。

本发明的目的之二，在于提供一种提高DC细胞活性的细胞培养方法，采用的技术方案为：在培养基中加入泊马度胺。

作为优选的技术方案，包括下述步骤：

从外周血中分离出外周血单个核细胞，即PBMCs，将所述PBMCs在1640培养基中，于37℃、5％CO₂环境中培养2小时，然后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，得到DC前体细胞，然后将所述DC前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10μM泊马度胺组成的培养基中培养7天，以诱导形成DC细胞，最后收获得到DC细胞。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本方法在DC细胞体外培养时，加入泊马度胺在适量浓度下表现出显著的提升健康人及多发性骨髓瘤患者DC细胞活性及成熟度的作用，显示出作为DC佐剂的潜力，可用于基于DC的治疗策略，例如DC疫苗和DC细胞疗法等。

附图说明

图1为CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中占比在HD组和MM患者组之间的比较；

图2为健康人泊马度胺组和对照组之间CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中占比的比较；

图3为健康人(n＝15)的CD40⁺DCs在总DCs中占比；

图4为健康人(n＝15)DCs上CD40表达的平均荧光强度(MFI)；

图5为健康人(n＝15)的HLA-DR⁺DCs在总DCs中占比；

图6为健康人(n＝15)DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度(MFI)；

图7为MM(n＝11)患者泊马度胺组和对照组之间CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中占比的比较；

图8为MM(n＝11)患者的CD40⁺DCs在总DCs中的占比；

图9为MM(n＝11)患者DCs上CD40表达的平均荧光强度(MFI)；

图10为MM(n＝11)患者HLA-DR⁺DCs在总DCs中的占比；

图11为MM(n＝11)患者DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度(MFI)；

图12为泊马度胺不同浓度下DC活性/成熟相关分子表达水平；

图13为健康人DCs和MM患者DCs产生的细胞因子。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种提高DC细胞活性的细胞培养基，由下述组分组成：

RPMI1640培养基、5％vol％人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10uM泊马度胺(或等量药物溶媒DMSO)。

实施例2

采用实施例1的培养基进行DC细胞培养的方法，包括下述步骤：

(1)获取人外周血单个核细胞

抽取健康供者(Healthy Donor,HD；n＝15)或MM患者(n＝11)20ml外周静脉血(肝素抗凝)，以1×PBS1：1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液液面上方，400g、缓升速缓减速方式离心30min，其后提取、收集中间白色细胞层，即获得PBMCs。之后，用1×PBS洗涤PBMCs，其后300g离心10min，弃去上清液；再用1×PBS重悬PBMCs、洗涤PBMCs，其后300g离心10min，弃去上清液；

(2)体外诱导形成DC细胞

将PBMCs重悬于无血清、含100U/mL青霉素及0.1mg/mL链霉素的1640培养基中，均分为两组，以2×10^6个/ml的细胞浓度于37℃、5vol％CO2环境中培养2小时，以使DC前体细胞(单核细胞)充分黏附、贴壁，之后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞。将DC前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10uM泊马度胺(或等量药物溶媒DMSO)组成的培养基中培养7天，以培养、诱导形成DC细胞；其后收获DC细胞。

对比例1

本对比例与实施例2相比，泊马度胺的加入浓度为5μM，其余与实施例2相同。

对比例2

本对比例与实施例2相比，泊马度胺的加入浓度为20μM，其余与实施例2相同。

实施例3

DC细胞成熟度及活性的评估

本实施例选择了MHC分子HLA-DR(激活T细胞第一信号必需)、共刺激分子CD86、CD80以及CD40(激活T细胞第二信号必需)这四个DC细胞成熟相关分子作为DC细胞成熟度的标志物。

洗涤实施例2收获的DC细胞，重悬于预冷的1×PBS中，然后加入APC标记的CD40单克隆抗体(mAb)，PE标记的CD86 mAb，FITC标记的CD80 mAb和pacific blue标记的HLA-DRmAb或相同浓度同型匹配的阴性对照mAb，在4℃孵育30分钟。随后，将DC细胞洗涤两次并重悬于预冷的1×PBS中，以通过流式细胞术进行免疫荧光分析。在FACS分析系统中，圈出总细胞中CD80⁺CD86⁺细胞群作为DCs，分别分析DCs上CD40和HLA-DR表达的平均荧光强度(MFI)，以及CD40⁺DCs和HLA-DR⁺DCs占总DCs中的比例。使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。配对t检验比较泊马度胺组与对照组CD40和HLA-DR的表达,独立样本t检验用于比较泊马度胺组和对照组之间CD80⁺、CD86⁺细胞群体的比例，P<0.05被认为具有统计学意义。

此外，收集培养体系中的上清液并检测其中细胞因子IL-12、TNF-α和MIP-1α的浓度。上述检测的因子的特异性单克隆抗体将预先包被在一个ELISA用96孔板上。在阻断非特异性结合与洗涤的步骤之后，对照的重组蛋白或样本将被加入到板孔中，任何存在的细胞因子将与固定于孔底膜上的抗体结合，在洗涤以移除未结合的物质之后，一个对需检测的因子特异性的酶联单克隆抗体被加入孔中。在洗涤以移除任何未结合的酶联抗体试剂之后，底物溶液被加入孔中，导致了依据所需检测因子比例及量不同而展现出的不同程度的显色，颜色的密度由相应的ELISAReader与相应的软件在所选择的适当波长下进行检测与数据分析。结果如下：

(1)HD-DC与MM-DC的比较(未予泊马度胺处理)

本研究比较了HD组和MM患者组之间CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中占比的差异，发现HD组收获的细胞中CD80⁺、CD86⁺细胞占比高于MM患者组，但差异无统计学意义(93.49％±6.44％vs 77.04％±29.17％，P＝0.094)，如图1所示。

(2)泊马度胺对健康人DC细胞的作用

本实施例分析整体15例健康人泊马度胺组和对照组DC细胞的差异，发现CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中的占比在泊马度胺组和对照组之间无统计学差异(95.42％±4.50％vs 93.49％±6.44％，P＝0.287)，如图2所示。

但是，CD40⁺DC在总DC细胞中的占比在泊马度胺组显著高于对照组(96.85％±3.08％vs 93.83％±5.48％，P＝0.008)，且DCs上CD40表达的平均荧光强度在泊马度胺组亦显著高于对照组(6.70×105±2.36×105vs 5.33×105±1.56×105，P＝0.003)(表1-2，图3-4)；HLA-DR⁺DC在总DC细胞中的占比在泊马度胺组中显著高于对照组(97.73％±1.56％vs 93.36％±8.22％，P＝0.032)，且DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度在泊马度胺组亦显著高于对照组(7.49×105±2.32×105vs 6.76×105±2.84×105，P＝0.040)(表3-4，图5-6)。

表1.健康人(n＝15)的CD40⁺DCs在总DCs中占比(％)

表2.健康人(n＝15)DCs上CD40表达的平均荧光强度(MFI)(10⁵)

表3.健康人(n＝15)的HLA-DR⁺DCs在总DCs中占比(％)

表4.健康人(n＝15)DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度(MFI)(10⁵)

(3)泊马度胺对MM患者DC细胞的作用

本研究分析整体11例MM患者泊马度胺组和对照组DC细胞的差异，发现CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中的占比在泊马度胺组显著高于对照组(85.68％±29.17％vs 77.04％±19.42％，P＝0.039)(图7)。CD40⁺DC在总DC细胞中的占比在两组之间无明显差异(97.4％±3.08％vs 96.75％±4.18％，P＝0.443)，但DCs上CD40表达的平均荧光强度在泊马度胺组显著高于对照组(4.27×10⁵±1.90×10⁵vs 3.83×10⁵±1.91×10⁵，P＝0.047)(表5-6，图8-9)。HLA-DR⁺DC在总DC细胞中的占比在泊马度胺组显著高于对照组(97.65％±3.87％vs 92.4％±5.31％，P＝0.000)，且DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度在泊马度胺组亦显著高于对照组(7.23×10⁵±3.06×10⁵vs 5.64×10⁵±2.75×10⁵，P＝0.006)(表7-8，图10-11)。

表5.MM(n＝11)CD40⁺DCs在总DCs中的比例(％)

表6.MM患者(n＝11)DCs上CD40表达的平均荧光强度(MFI)(10⁵)

表7.MM患者(n＝11)HLA-DR⁺DCs在总DCs中的占比(％)

表8.MM患者(n＝11)DCs上HLA-DR表达的平均荧光强度(MFI)(10⁵)

另外，发明人分别采用对比例1(对比例1组)和对比例2(对比例2组)制得的DC细胞做了其对MM患者DC细胞的作用的对比试验，结果，对比例1组和对比例2组中，CD80⁺、CD86⁺细胞在总收获细胞中的占比，以及HLA-DR⁺DC在总DC细胞中的占比，结果见图12，从图中可以看出，两个对比例的上述指标均并不显著高于对照组。

(4)泊马度胺对健康人及MM患者DCs产生细胞因子的作用

如图13分别显示了健康人DCs及MM患者DCs产生细胞因子的情况(HD，n＝15；MM，n＝11)。

图13的(a)图：该图显示了健康人DCs产生的IL-12、TNF-α、MIP-1α在泊马度胺组显著高于对照组(9.42±4.31vs 4.90±1.61pg/ml，P＝0.020；4.54±0.28vs 4.11±0.20pg/ml，P＝0.006；14.21±2.64vs 12.68±1.53pg/ml，P＝0.055)；

图13的(b)：该图显示了MM患者DCs产生的IL-12、TNF-α、MIP-1α在泊马度胺组与对照组之间比较无显著统计学差异(6.34±5.51vs 8.27±6.88pg/ml，P＝0.458；4.42±0.21vs 4.32±0.32pg/ml，P＝0.377；14.53±2.76vs 13.76±2.48pg/ml，P＝0.248)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种提高人DC细胞活性的细胞培养方法，其特征在于，包括下述步骤：

从人外周血中分离出外周血单个核细胞，即PBMCs，将所述PBMCs在1640培养基中，于37℃、5%CO₂环境中培养2小时，然后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，得到DC前体细胞，然后将所述DC前体细胞于1640培养基、5vol%人血清、800U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4、100U/mL青霉素、0 .1mg/mL链霉素和10μM 泊马度胺组成的培养基中培养7天，以诱导形成DC细胞，最后收获得到DC细胞。