KR102091748B1 - 수지상세포의 이동능을 증가시키는 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
수지상세포의 이동능을 증가시키는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 방법은 성숙 수지상세포의 이동능을 증가시킬 수 있고, 수지상세포의 염증성 사이토카인 생산 유도, T 림프구 증식 유도, 및 T 림프구 분극화 유도를 증가시킬 수 있으므로 면역 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
Description
수지상세포의 이동능을 증가시키는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
수지상세포는 주로 T 세포에 항원제시 기능을 수행하는 전문적 항원 제시 세포의 일종으로서, 림프절, 비장, 흉선, 피부 밑 또는 여러 조직의 세포 간극에서 나뭇가지 모양으로 존재한다. 수지상세포는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시함으로써, T 세포 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
또한, 수지상세포는 주위에 존재하는 환경적 신호와 종류에 따라 성숙도가 상이한 상태로 분화되어, 미성숙(immature), 준성숙(semi-mature) 또는 성숙(mature) 수지상세포로 존재한다. 미성숙 수지상세포는 초기 성숙 단계에서 발견되는 것으로서 세포 간액으로부터 데브리스(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행하나, 이 세포의 염증성 사이토카인의 발현 수준은 낮기 때문에 T 세포와 접촉하여도 T 세포를 활성화시키지 못한다. 반면, 성숙 수지상세포는 원시 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다.
최근 수지상세포는 암, 면역 관련 질환 등에 대한 세포치료제로서 사용하기 위해 연구되고 있다. 예를 들어, 수지상세포는 림프절에서 T 세포를 활성화시킴으로써 종양 세포를 억제할 수 있고, 면역 반응에 관여하여 감염성 질환, 염증성 질환 등의 치료에 사용될 수 있다. 수지상세포가 이러한 효과를 나타내기 위해서는 림프절로 이동하여 T 세포를 활성화시켜야 하는데, 수지상세포의 생체 내 림프절 이동은 투여 세포수에 비하여 약 2-5% 정도로 매우 낮은 실정이다.
따라서, 수지상세포의 이동능을 향상시킬 수 있는 조성물, 또는 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 수지상세포의 이동능을 증가시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 이동능이 증가된 수지상세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양상은 성숙되지 않은 수지상세포와 오토탁신(autotaxin)을 접촉시키는 단계를 포함하는 이동능이 증가된 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “수지상세포”는 항원을 세포내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 본 명세서에서의 수지상세포는 Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998.에 개시된 수지상세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상세포는 면역성(immunogenic) 및 면역관용성 (tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells: imDC), 준성숙 수지상세포(semimature dendritic cells: smDC) 및 성숙 수지상세포(mature dendritic cells: mDC)로 분류한다.
본 명세서에서, 용어 “성숙되지 않은 수지상세포”는 미성숙 수지상세포, 준성숙 수지상세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 “미성숙 수지상세포”는 세포 간액으로부터 데브리스(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행하나, 이 세포의 염증성 사이토카인의 발현 수준은 낮기 때문에 T 세포와 접촉하여도 T 세포를 활성화시키지 못한다. 상기 “준성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상세포를 의미한다.
상기 수지상세포는 동물의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다.
상기 수지상세포를 얻기 위한 과정에서 이용되는 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Waymouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 성숙되지 않은 수지상세포는 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 배양하는 단계를 통하여 획득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “성숙 수지상세포”는 성숙되지 않은 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅱ, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높으며, 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction) 에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또 는 수지상세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다. 성숙 수지상세포는 나이브 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 “오토탁신(Autotaxin)”은 멜라노마 세포의 배지에서 처음 분리된 125-kDa의 당단백질로서, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 포스포디에스터라제 패밀리 멤버 2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2: ENPP2)로도 알려져 있다. 오토탁신은 리소포스포리아파제 D(lysophospholipase D) 활성을 가지며, LPC(lysophosphatidylcholine)를 LPA(lysophosphatidic acid)로 분해하는 역할을 수행하는 세포외 효소이다.
상기 오토탁신은 공지된 재조합 단백질 생산 방법에 따라 제조된 것이거나, 생체로부터 분리된 것이거나, 상업적으로 얻은 것일 수 있다.
상기 오토탁신은 이의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물” 이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 오토탁신 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 오토탁신 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한 상기 오토탁신 단백질이 수지상세포의 이동능에 관여하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능하다.
본 명세서에서, 용어 “접촉”은 충분한 시간 및 조건 하에서 성숙되지 않은 수지상세포에 오토탁신이 영향을 줄 수 있는 상태를 의미한다. 구체적으로, 상기 성숙되지 않은 수지상세포와 오토탁신의 접촉은 RPMI 배지에서 수행되는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 성숙되지 않은 수지상세포와 오토탁신을 RPMI 배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다.
상기 배지는 일반적으로 세포 배양배지에 포함될 수 있는 성분이나 성숙되지 않은 수지상세포의 성숙화를 유도할 수 있는 성분, 예를 들어, FBS(fetal bovine serum), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), IL(interleukin), 및 머캅토에탄올을 더 포함할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 약 1시간 내지 48시간, 약 5시간 내지 40시간, 약 10시간 내지 35시간, 약 15시간 내지 30시간, 또는 약 20시간 내지 25시간 동안, 바람직하게는 약 24시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 접촉시키는 단계가 너무 짧을 경우, 성숙되지 않은 수지상세포의 성숙이 충분히 이루어지지 않고, 상기 접촉시키는 단계가 너무 길 경우, 수지상세포의 사멸이 증가할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 성숙되지 않은 수지상세포의 배양 4일 내지 8일째, 또는 5일 내지 7일째, 또는 6일째에 수행되는 것일 수 있다.
상기 이동능이 증가된 성숙 수지상세포를 제조하는 방법에서, 상기 성숙되지 않은 수지상세포와 LPS(lipopolysaccharide), KLH(keyhole Limpet Hemocyanin), 또는 이들의 조합을 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 LPS는 성숙되지 않은 수지상세포와 접촉하여 성숙되지 않은 수지상세포가 성숙하도록 자극하는 촉진제로 사용된다.
상기 KLH는 항원 제시 세포인 수지상세포에 대하여 항원에 대한 정보를 제공하기 위해 사용된다.
상기 LPS, KLH, 또는 이들의 조합을 접촉시키는 단계는 상기 성숙되지 않은 수지상세포와 오토탁신을 접촉시키는 단계와 동시에, 또는 전, 후에 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에서, 오토탁신의 농도는 당업자에 의해 바람직한 범위로 선택될 수 있고, 예를 들어, 약 0.01μg/ml 내지 1mg/ml, 약 0.05μg/ml 내지 500 μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 100μg/ml, 약 0.5μg/ml 내지 50μg/ml, 약 1μg/ml 내지 30μg/ml, 약 3μg/ml 내지 20μg/ml, 또는 약 5μg/ml 내지 15μg/ml일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “이동능”은 성숙 수지상세포가 이동하는 능력을 지칭할 수 있다. 성숙 수지상세포는 항원을 포획한 후, 림프관을 거쳐 나이브 T 세포들이 존재하는 림프절로 이동하게되고, 이들 T 세포들이 항원을 인식함으로써 면역반응을 유도한다. 따라서, 면역반응 유도 효과를 극대화시키기 위해서는 성숙 수지상세포가 림프절로 이동할 수 있는 능력인 이동능을 증가시키는 것이 중요하다.
상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포는 이동능이 증가된 것을 특징으로 한다. 증가된 이동능을 갖지 않는 일반 성숙 수지상세포에 비해서 이동능이 증가된 성숙 수지상세포가 림프절로 이동하는 비율이 증가하므로, 림프절에서의 면역반응 유도 효과가 유의적으로 증가하여 자가면역질환, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과가 증가할 수 있다.
상기 방법에서, 성숙 수지상세포의 이동능의 증가는 pp38, pJNK, 또는 ERK1/2 신호전달에 기인한 것일 수 있다.
상기 방법은, 성숙 수지상세포의 염증성 사이토카인 생산 유도를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 성숙 수지상세포에 비해 상기 방법에 따른 성숙 수지상세포가 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α의 생산을 유발하는 능력이 증가하는 것을 확인하였다. 성숙 수지상세포가 염증성 사이토카인의 발현을 증가시켜 T 세포 활성화를 증가시킬 수 있다.
상기 방법은, 성숙 수지상세포의 T 림프구 증식 유도를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대조군인 성숙 수지상세포에 비해 상기 방법에 따른 성숙 수지상세포가 T 림프구의 증식을 유발하는 능력이 증가한 것을 확인하였다.
상기 방법은, 성숙 수지상세포의 T 림프구 분극화 유도를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대조군인 성숙 수지상세포에 비해 상기 방법에 따른 성숙 수지상세포가 T 림프구 분극화를 유도하는 능력이 증가한 것을 확인하였다.
상기 방법에 따른 성숙 수지상세포는 염증성 사이토카인의 생산 유도, T 림프구 증식 유도, 또는 T 림프구 분극화를 유도함으로써, 다양한 면역 관련 질환을 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 이동능이 증가된 성숙 수지상세포를 포함하는 약학적 조성물로서, 자가면역질환, 암, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것인 약학적 조성물을 제공한다.
상기 방법, 이동능, 이동능이 증가된 성숙 수지상세포에 대하여는 전술한 바와 같다.
상기 자가면역질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 제 1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병 등이 있다.
상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염증성 질환은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로서, 부종, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크 론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스성 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 관절염, 골 관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충과 같은 병원체에의 감염에 의해 발생하는 질환을 총칭하는 것으로서, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스(HBV, HCV), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV), 선천성 거대세포바이러스(cytomegalovirus; CMV), 엔테로바이러스(enterovirus), 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C의 인플루엔자(influenza with Influenza virus A, B and C), 호흡기 세포융합바이러스(syncytial respiratory virus; SRV), 또는 HTLV), 박테리아 및/또는 그들의 독소(파상풍(tetanus), 디프테리아(diphtheria), 폐렴구균(pneumococci), 수막염구균(meningococci), 메티실린 내성 형태(methicilin resistant forms)를 포함하는 포도상구균(staphylococci), 클렙시라(Klebsiellas), 시겔라(Shigellas), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테리아(enterobacteria) 또는 병원내 질병(nosocomial diseases)을 포함한 항생제 내성 질환(antibiotic resistant pathologies)), 기생충(말라리아(paludism), 레이쉬마니아증(Leishmaniosis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)) 및 치군군야(chikungunya), 조류독감, SARS(severe acute respiratory syndrome virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스 또는 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)와 같은 출혈열(haemorrhagic fevers)에 관한 바이러스과 같은 신종 질병(emerging diseases), 탄저병(Anthrax), 보툴리누스중독증(botulism), 흑사병(Plague), 천연두(smallpox) 및 수두 바이러스(poxvirus), 튜라레미아증(Tularaemia), 출혈열 병원균(haemorrhagic fever agents), 브루셀라증(brucellosis), 포도상구균 B 엔데로톡신(Staphylococcus B Enterotoxins), 디프데리아 독소(diphtheric toxin) 또는 바이러스성 뇌염(viral Encephalitis)과 같은 바이오 테러리즘(bio-terrorism)에 관한 질병을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 이동능이 증가된 성숙 수지상세포가 림프절에서 T 세포를 활성화시키고 면역반응을 유도함으로써 치료할 수 있는 질환, 예를 들어, 암, 자가면역질환, 감염성 질환, 또는 염증성 질환을 예방하거나 치료하는 효과가 있다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 자가면역질환, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 자가면역질환, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다
상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 세포치료제로 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 통상의 면역증강제와 함께 사용될 수 있다. 면역증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 말하며 이러한 면역증강제는 항원의 표면적을 증가시키거나, 체내에서 항원의 정체를 연장시켜 면역시스템이 항원에 접근할 수 있도록 하거나, 항원 방출을 지연시키거나, 항원을 대식구에 표적화 시키거나, 대식구를 활성화시키는 등을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 작용하는 것으로 보고되었다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol., 4:369-388). 전형적인 면역증강제에는 프로인트 면역증강제((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), LPS 등이 있다.
상기 조성물은 수술 후, 방사선치료와 병행해서 또는 항암제와 병행해서 사용함으로써 그 효과를 극대화 할 수도 있다.
일 양상에 따른 방법은 성숙 수지상세포의 이동능을 증가시킬 수 있고, 수지상세포의 염증성 사이토카인 생산 유도, T 림프구 증식 유도, 및 T 림프구 분극화 유도를 증가시킬 수 있으므로 면역 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 대조군 수지상세포에서 오토탁신 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다(*p<0.05).
도 2는 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 대조군 수지상세포에서 오토탁신 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 그래프이다(***p<0.001).
도 3은 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA), 음성 대조군, 및 성숙 수지상세포(mDC)에서 표면 항원인 CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD86, MHCI, 및 MHCⅡ의 발현을 분석한 히스토그램 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 오토탁신 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 T 림프구의 공동배양액 내 염증성 사이토카인 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05).
도 5는 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)의 T 세포 증식능을 확인한 실험 결과이다.
도 6은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 정상 성숙 수지상세포(mDC)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 8은 Rho A 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 9는 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포의 in vitro 이동능을 이동 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포에서 CCR7의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 11은 성숙 수지상세포, 음성 대조군, 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포, HA130을 처리한 성숙 수지상세포, 및 PF8380을 처리한 성숙 수지상세포에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 배양 과정에서 재조합 오토탁신 단백질을 첨가한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포의 세포 표면 마커 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 13은 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 IL-12p70의 발현 수준을 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 14는 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 T 림프구의 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 17은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 RhoA 단백질의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 이동 분석법을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다(***p < 0.001).
도 19는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)의 세포 내부에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 20은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 것을 추적한 사진이다.
도 21은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 비율을 수치화한 그래프이다.
도 22는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 비율을 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.
도 23은 적출한 슬와림프절에서 림프구를 분리한 후 CD11c 항체로 염색하여 유세포분석법에 의해 성숙 수지상세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 대조군 수지상세포에서 오토탁신 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 그래프이다(***p<0.001).
도 3은 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA), 음성 대조군, 및 성숙 수지상세포(mDC)에서 표면 항원인 CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD86, MHCI, 및 MHCⅡ의 발현을 분석한 히스토그램 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 오토탁신 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 T 림프구의 공동배양액 내 염증성 사이토카인 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05).
도 5는 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)의 T 세포 증식능을 확인한 실험 결과이다.
도 6은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 정상 성숙 수지상세포(mDC)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 8은 Rho A 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 9는 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포의 in vitro 이동능을 이동 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포에서 CCR7의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 11은 성숙 수지상세포, 음성 대조군, 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포, HA130을 처리한 성숙 수지상세포, 및 PF8380을 처리한 성숙 수지상세포에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 배양 과정에서 재조합 오토탁신 단백질을 첨가한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포의 세포 표면 마커 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 13은 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 IL-12p70의 발현 수준을 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 14는 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 T 림프구의 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 17은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 RhoA 단백질의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 이동 분석법을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다(***p < 0.001).
도 19는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)의 세포 내부에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 20은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 것을 추적한 사진이다.
도 21은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 비율을 수치화한 그래프이다.
도 22는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 비율을 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.
도 23은 적출한 슬와림프절에서 림프구를 분리한 후 CD11c 항체로 염색하여 유세포분석법에 의해 성숙 수지상세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예
1:
오토탁신
유전자가 성숙
수지상세포의
특성에 미치는 영향 확인
오토탁신 유전자가 성숙 수지상세포의 특성에 미치는 영향을 다음의 실험을 통해 확인하였다.
1.1
오토탁신
특이적
siRNA를
이용한 성숙
수지상세포에서
오토탁신
유전자의 발현 수준 억제
오토탁신 특이적 siRNA를 이용해서 성숙 수지상세포에서 오토탁신 유전자의 발현 수준을 억제하였다. 구체적으로, 마우스 Enpp2 mRNA를 타겟하는 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea)를 lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, USA) 시스템을 이용하여 100 nM 농도로 세포 내로 도입시켰다. 수지상세포 배양 6일 째, 세포를 모두 수거한 후 5% 우태아혈청을 포함한 수지상세포 기본 배지에 현탁하고 6 웰 배양 플레이트에 2 × 105 세포/웰로 분주하였다. siRNA를 처리한 수지상세포는 siRNA 형질감염 4시간 후 LPS를 포함하는 수지상세포 배양 배지로 교환하여 24시간동안 성숙을 유도하고, 미성숙 수지상세포군은 새로운 수지상세포 배양 배지로 교환해주었다. 여기서, scramble siRNA (Bioneer)를 음성 대조군으로 사용하였고, 3회 이상의 반복 실험을 수행하였다. Enpp2 mRNA를 타겟하는 siRNA 정보를 표 1에 나타내었다.
siRNA | 서열 |
Enpp2 siRNA-1 | 5'-GGG UCU UGG UGA AGA AAU AdTdT-3' |
Enpp2 siRNA-2 | 5'-UAU UUC UUC ACC AAG ACC CdTdT-3' |
오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 음성 대조군에서 오토탁신 유전자와 단백질의 발현을 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅으로 각각 확인하였다.qRT-PCR을 위하여, 수지상세포의 RNA를 분리하기 위해 labozol reagent (Cosmo genetech, Seoul, Korea)를 이용하였다. 분리한 RNA로부터 cDNA synthesis kit (Cosmo genetech)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Enpp2 유전자의 정량적 실시간 PCR은 SensiFASTTM SYBR No-ROX kit (Bioline, Sydney, Australia)를 이용하였다. 반응 조건은 95℃서 10분 반응 후, 94℃에서 20초, 62℃에서 30초 및 72℃에서 20초간 반응을 35 사이클 반복하고, 마지막에 72℃에서 5분간 반응하였다. 유전자 발현량은 각 유전자의 threshold cycle (Ct)값을 GAPDH의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다.
웨스턴 블롯팅을 위해, 수지상세포를 2% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지에 현탁 한 후 6 well plate에 1 × 106 세포/웰로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 세포배양액을 수거하여 Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane (Millipore, Germany)을 이용하여 3000 g, 20분간 원심분리 하여 농축하였다. 수지상세포의 세포 내부 단백질은 PRO-PREPTM (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi, Korea)과 포스파타아제 저해제 칵테일 (Calbiochem, CA, USA)을 이용하여 추출하였다. 단백질의 농도는 Bradford (Thermo, MA, USA) 분석법으로 측정하였다. 정량된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인 (Biorad, CA, USA)으로 분리된 단백질을 흡착시켰다. PVDF 멤브레인은 5% skim milk in PBST를 이용하여 1시간동안 상온에서 차단하고, 1차 항체를 5% skim milk에 1:2000으로 희석하여 처리한 후 4℃에서 18시간동안 반응시켰다. 그 후 멤브레인을 1 × PBST로 10분씩 3번 세척하고, 2차 항체를 1:5000으로 처리한 후 상온에서 2시간동안 반응시켰다. 다시 멤브레인을 1 × PBST로 3번 세척한 후 ECL 용액(Thermo)에 노출시켜 LAS-4000 (Fuji film, Tokyo, Japan)으로 단백질 밴드를 확인하였다. 결과는 Multi Gauge software V3.0 (Fuji film)을 사용하여 분석하였다.
도 1은 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 대조군 수지상세포에서 오토탁신 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다(*p<0.05).
도 2는 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포와 대조군 수지상세포에서 오토탁신 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 그래프이다(***p<0.001).
도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 특이적 siRNA를 처리한 성숙 수지상세포에서 오토탁신의 발현이 25% 이상 감소하는 것을 확인하였다.
1.2
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 성숙
수지상세포의
표면
항원형
발현의 변화 확인
오토탁신 유전자의 발현과 표면 항원형(surface phenotype) 발현의 관계를 확인하기 위해, 다음과 같이 유세포 분석법을 수행하였다. 2×105-5×105개의 세포를 PBS (Lonza)로 세척한 후 형광이 표지된 단클론 항체를 염색하였다. 사용된 유세포 분석용 단클론 항체는 하기 표 2에 나타내었다. 세포 생존율을 확인하기 위해서 PI (Propidium Iodide) 염색을 실시하였다. T 세포내 사이토카인 염색을 위하여 4시간 동안 세포에 GolgiStop (BD Bioscience, CA, USA)을 처리해주었다. 4시간 후 T 세포를 수거하여 CD4 염색 후, Fixation/Permeabilization Solution (BD)을 넣고 30분간 실온에서 고정해주었다. FACS buffer로 세척한 후 IFN-γ와 IL-17A 단클론 항체를 이용하여 30분간 염색해주었다. 형광이 표지된 세포는 FACS 버퍼로 세척한 후 FACSCalibur (BD)를 이용하여 검출하였다. 모든 데이터는 FlowJo (Tree Star, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
Specificity | Clone | Conjugates | Supplier |
CD11c | N418 | PE | eBioscience |
CD14 | Sa14-2 | FITC | Biolegend |
CD40 | 3/23 | PE | BD |
CD54 | 3E2 | FITC | BD |
CD80 | 16-10A1 | PE | eBioscience |
CD86 | PO3 | FITC | Biolegend |
H-2Db | KH95 | FITC | Biolegend |
I-Ab | AF6-120.1 | PE | BD |
CD4 | RM4-5 | APC | Biolegend |
IFN-γ | XMG1.2 | FITC | Biolegend |
IL-17A | TC11-18H10 | PE | BD |
도 3은 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA), 음성 대조군, 및 성숙 수지상세포(mDC)에서 표면 항원인 CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD86, MHCI, 및 MHCⅡ의 발현을 분석한 히스토그램 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 각각의 성숙 수지상세포에서 표면 항원의 발현은 유사하게 나타났다. 구체적으로, 단핵구 표면 항원인 CD14의 발현은 거의 나타나지 않았고, 수지상세포의 대표적인 표면 항원인 CD11c의 발현은 높게 나타남을 확인하였다. 또한, T 림프구 자극 분자인 CD40과 T 림프구 부착 분자인 CD54, 공동자극분자인 CD80 및 CD86의 발현이 높게 나타남을 확인하였다.
따라서, 오토탁신 유전자의 발현 변화는 성숙 수지상세포의 표면 항원형 발현에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
1.3
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 성숙
수지상세포의
사이토카인 발현의 변화 확인
오토탁신 유전자의 발현과 성숙 수지상세포가 분비하는 사이토카인의 관계를 확인하기 위해, 다음과 같이 ELISA를 이용해서 성숙 수지상세포 배양액 내의 사이토카인 농도를 측정하였다.
C57BL/6 마우스에서 분리한 비장세포를 10% 우태아혈청을 포함한 RPMI 1640에 현탁하고 나일론 울 칼럼에 통과시켜 CD3+ T 림프구를 분리하였다 (Byun, Lee et al. 2016). 6 웰 배양 플레이트에 2×105 성숙 수지상세포와 2×106 T 림프구를 3일간 공동배양하였다. 상기 공동배양액에 대해, 마우스 인터류킨-1β (IL-1β), IL-6, 종양 괴사 인자-α (TNF-α) (Biolegend, CA, USA) 및 IL-12p70 (BD Bioscience) ELISA kit를 사용하여 사이토카인 농도를 분석하였다. 결과는 평균±SEM으로 나타내었다.
도 4는 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 오토탁신 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 T 림프구의 공동배양액 내 염증성 사이토카인 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05).
도 4에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 발현이 억제된 성숙 수지상세포의 세포 배양액 내의 염증성 사이토카인의 농도가 대조군 성숙 수지상세포의 세포 배양액 내 농도에 비하여 약 15% 낮게 측정되었다.
따라서, 선천성 면역을 대표하는 염증성 사이토카인인 TNF-α와 Th1 면역 반응을 유도하는 사이토카인인 IL-12, 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 IL-6의 농도가 낮아졌으므로, 오토탁신 발현이 억제된 성숙 수지상세포의 면역, 염증 반응이 감소하는 것을 확인하였다.
1.4
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 성숙
수지상세포의
T 림프구
증식능의
변화 확인
오토탁신 유전자의 발현과 성숙 수지상세포의 T 림프구 증식능 변화의 관계를 확인하기 위해, 성숙 수지상세포와 CD3+ T 세포를 1:10의 비율로 하여 72시간 동안 공동배양하였다. CD3+ 세포는 나이브 C57BL/6 마우스의 비장세포로부터 분리되었고, 최종 농도 4μM에서 CFSE(carboxyfluorescein succinmidyl ester)로 염색되었다. CFSE-표지된 세포를 세척하고, 카운팅하고 수지상세포와 공동배양 하였다.
도 5는 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)의 T 세포 증식능을 확인한 실험 결과이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포의 경우, 정상 성숙 수지상세포에 비해서 약 45% 낮은 T 림프구 증식능을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 오토탁신 유전자의 억제된 발현이 성숙 수지상세포에서 T 림프구 증식능을 억제하는 것을 확인하였다.
1.5
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 성숙
수지상세포
매개된
T 림프구 분극화 확인
오토탁신 유전자의 발현 억제와 성숙 수지상세포 매개된 T 세포의 분극화의 연관성을 확인하기 위해서 다음과 같이 실험하였다.
성숙 수지상세포를 CD3+ T 세포와 1:10의 비율로 72시간 동안 공동배양하였다. 상기 세포를 항-CD4 및 항-IFN-γ 또는 항-IL-17A 항체로 염색하였고, 유세포분석으로 분석하였다.
도 6은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 정상 성숙 수지상세포(mDC)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 성숙 수지상세포에 비하여 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포와 공동 배양한 T 세포가 Th1 및 Th17 아형 세포로 약 50% 적게 분화하는 것을 확인하였다.
또한, 각각의 성숙 수지상세포를 CD3+ T 세포와 1:10의 비율로 72시간 동안 공동배양하고, 세포 배양 상등액을 수확하여 ELISA에 의해 사이토카인(IFN-γ, IL-17A, IL-4, IL-10)의 발현을 확인하였다. 데이터는 평균±SEM(n=3)으로 나타내었다.
도 7은 오토탁신 유전자의 발현이 억제된 성숙 수지상세포(ATX siRNA)와 성숙 수지상세포(mDC)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 공동배양액 내의 IFN-γ, IL-17의 농도는 오토탁신 발현을 억제한 성숙 수지상세포에서 낮게 발현되는 것을 확인하였다.
1.6
오토탁신
효소 활성 억제제의 처리에 따른 Rho A 단백질의 발현 변화 확인
오토탁신 특이적 siRNA의 처리에 의해 성숙 수지상세포의 오토탁신 유전자 발현을 억제하였으나, 세포 배양액 내 유리되어 있는 오토탁신이 존재하기 때문에, 오토탁신 효소의 활성을 억제할 수 있는 물질인 HA 130 (Albers, Dong et al. 2010)과 PF8380 (Gierse, Thorarensen et al. 2010)을 성숙 수지상세포 배양 과정 중 첨가하고 7일 동안 배양하였다.
첨가 후, 오토탁신 효소의 생성물인 LPA를 리간드로 하는 LAP 수용체의 하위 신호전달에서 세포의 이동에 관여한다고 알려진 Rho A 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인하고, 확인 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 오토탁신을 억제한 수지상세포(ATX siRNA), HA 130 및 PF8380을 처리한 경우에 성숙 수지상세포(mDC)에 비하여 Rho A 단백질이 약 45% 이상 낮게 발현하는 것을 확인하였다.
1.7 in vitro
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 성숙
수지상세포의
이동능
확인
오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포의 in vitro 이동능을 확인하기 위해서, 이동 분석법(migration assay)을 다음과 같이 수행하였다.
8.0 μm 포어 폴리카보네이트 멤브레인을 함유한 트랜스웰-플레이트 (Corning, NY, USA)를 이용하였다. 7일간 배양한 성숙 수지상세포를 수거한 후, RPMI 1640 배지에 현탁하여 트랜스웰-플레이트 상단에 5×105 세포/500 μL로 넣고, 트랜스웰 하단에 2% 우태아혈청, 100 ng/mL 재조합 마우스 CCL19 (R&D systems)가 첨가된 RPMI 1640 배지를 500 μL 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 배양 후 트랜스웰 하단 배양액을 5 mL 둥근 바닥 튜브 (Corning)로 옮겨 FACSCalibur로 1분간 세포수를 측정하였다. 측정 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 발현을 억제한 성숙 수지상세포의 경우 성숙 수지상세포에 비하여 세포 이동능이 약 20% 감소하는 것을 확인하였다.
1.8
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른
CCR7의
발현 변화 확인
수지상세포의 이동에는 수지상세포의 귀소 수용체(homing receptor)인 CCR7이 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포의 이동능 변화가 CCR7과 관련이 있는지 확인하기 위해서, 성숙 수지상세포에서 CCR7의 발현을 qRT-PCR로 확인하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 발현을 억제한 성숙 수지상세포, 음성 대조군, 성숙 수지상세포 사이에 CCR7의 발현 정도는 거의 차이가 나지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 오토탁신 발현을 억제에 따라 발생한 이동능의 변화는 CCR7의 발현과는 별개로 조절되는 것을 알 수 있다.
1.9
오토탁신
유전자의 발현 억제에 따른 사이토카인의 감소 원인 확인
상기 실시예에서, 오토탁신 유전자의 발현 억제에 따라 사이토카인의 발현 감소를 확인하였는바, 사이토카인의 발현 감소에 대한 원인을 확인하기 위해서, 성숙 수지상세포에서 세포 내부의 신호전달 단백질(pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB)들을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
도 11은 성숙 수지상세포, 음성 대조군, 오토탁신 특이적 siRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포, HA130을 처리한 성숙 수지상세포, 및 PF8380을 처리한 성숙 수지상세포에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교해서, 오토탁신 발현이 감소된 성숙 수지상세포에서 pp38 및 MAPK(ERK 1/2)의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 오토탁신의 발현 감소에 의한 성숙 수지상세포의 이동능 변화는 pp38, MAPK의 발현 변화와 관련되어 있음을 알 수 있다.
상기 실험 결과를 종합하면, 성숙 수지상세포에서 siRNA에 의해 오토탁신의 발현이 감소함으로써 사이토카인 발현의 감소, T 세포 증식 유도능 감소 등 수지상세포의 전반적인 기능이 저하된다. 또한, 오토탁신의 발현이 감소함으로써 세포의 이동능이 감소하고, 이러한 감소는 사이토카인의 발현 변화와 연관되어 있음을 알 수 있다.
실시예
2.
이동능이
향상된 성숙
수지상세포의
제조
상기 실시예 1로부터 성숙 수지상세포에서 오토탁신의 발현이 감소하면 세포의 이동능이 감소하므로, 세포외 효소인 오토탁신 단백질을 수지상세포의 배양 과정에 첨가함으로써 세포의 이동능을 향상시킬 수 있는지 확인하였다.
동물실험은 차의과학대학교 동물실험윤리(IACUC) 규정에 따라 진행하였다(IRB number: IACUC170111). 수지상세포의 분리를 위해, 6-8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 오리엔트바이오(Seongnam-si, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 마우스 골수세포는 C57BL/6 마우스의 경골(tibia) 및 대퇴골(femur)에서 RPMI 1640 with 25 mM HEPES (Lonza, MD, USA)으로 골수 내강을 세척하여 얻었다. 획득한 골수세포는 70 μm cell strainer를 이용하여 불순물을 제거하고, 1600 rpm, 5분간 원심분리 한 후, 적혈구 용혈제인 ACK 용해 버퍼 (Lonza)를 이용하여 적혈구를 제거하였다. 골수세포는 수지상세포 배양 배지인 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM GlutaMaxTM, 55 nM 2-머캅토에탄올 (Gibco, NY, USA), 20 ng/mL 재조합 마우스(recombinant mouse) (rm)GM-CSF, 20 ng/mL rmIL-4 (JW CreaGene, Gyeonggi, Korea)를 첨가한 RPMI 1640 배지로 현탁한 후 6 웰 배양 플레이트에 3×107 세포로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 2일째, 비 부착 세포를 제거하고 동일한 조성의 수지상세포 배양 배지를 첨가하였다. 배양 4일째, 배양 배지의 절반을 모아 새로운 수지상세포 배양 배지로 교체하였다. 배양 6일째, 세포를 모두 수거한 후, 미성숙 수지상세포는 새로운 수지상세포 배양 배지로 교체해주고, 성숙 수지상세포로 분화시킬 세포는 1 μg/mL 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS)와 10 μg/mL KLH (Sigma Aldrich, MO, USA)를 첨가한 수지상세포 배양 배지에 현탁하여 24시간 동안 성숙을 유도하였다. 여기서, 재조합 오토탁신 단백질(R&D systems, MN, USA)은 LPS 자극과 동시에 10 μg/mL로 처리하여 상기와 같은 방법으로 이동능이 향상된 성숙 수지상세포를 제조하였다.
실시예
3.
이동능이
향상된 성숙
수지상세포의
특성 확인
3.1 포면
항원형
발현 확인
배양 과정에서 재조합 오토탁신 단백질을 첨가한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포의 세포 표면 마커 발현을 유세포분석에 의해 확인하고, 이를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가한 경우(ATX+)와 첨가하지 않은 경우(ATX-)의 성숙 수지상세포에서 세포 표면 마커의 발현은 비슷한 것으로 확인되었다. 따라서, 오토탁신 단백질의 첨가는 수지상세포의 표면 항원형 발현에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.
3.2 염증성 사이토카인의 발현 확인
오토탁신 단백질의 첨가가 수지상세포의 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 성숙 수지상세포를 T 림프구와 공동배양하고, 공동배양액 내 염증성 사이토카인 농도를 ELISA로 확인하였다. 데이터는 평균±SEM(n=3)으로 나타내었다.
도 13은 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α, 및 IL-12p70의 발현 수준을 ELISA로 확인한 그래프이다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 13에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포가 오토탁신 단백질을 첨가하지 않은 성숙 수지상세포에 비해서 염증성 사이토카인을 더 높은 농도로 생산하였음을 확인하였다.
3.3 T 림프구
증식능
확인
오토탁신 단백질의 첨가가 수지상세포의 T 림프구 증식 유도능에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 성숙 수지상세포를 CD3+ T 세포와 1:10의 비율로 72시간 동안 공동배양하였다. 상기 CD3+ T 세포는 나이브 C57BL/6 마우스의 비장세포로부터 분리된 것으로, CFSE로 염색하였다.
도 14는 오토탁신 단백질을 첨가한 성숙 수지상세포(+)와 첨가하지 않은 성숙 수지상세포(-)에서 T 림프구의 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포가 오토탁신 단백질을 첨가하지 않은 성숙 수지상세포에 비해서 약 15% 정도 높은 T 림프구 증식능을 갖는 것을 확인하였다.
3.4
수지상세포
매개된
T 세포 분극화 확인
오토탁신 단백질의 첨가가 수지상세포 매개된 T 세포 분극화에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 성숙 수지상세포를 CD3+ T 세포와 1:10의 비율로 72시간 동안 공동배양하였다. 상기 세포를 항-CD4 및 항-IFN-γ 또는 항-IL-17A 항체로 염색하였고, 유세포분석으로 분석하였다.
도 15는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 유세포분석에 의해 IFN-γ/CD4 및 IL-17/CD4를 확인한 결과를 나타낸 도이다. IFN-γ는 Th1 사이토카인이고, IL-17은 Th17 사이토카인이다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포와 공동 배양한 T 세포가 오토탁신 단백질을 첨가하지 않은 경우에 성숙 수지상세포에 비하여 Th1 및 Th17 아형으로 약 1.5배 더 많이 분화하는 것을 확인하였다.
또한, 각각의 성숙 수지상세포를 CD3+ T 세포와 1:10의 비율로 72시간 동안 공동배양하고, 세포 배양 상등액을 수확하여 ELISA에 의해 사이토카인(IFN-γ, IL-17A, IL-4, IL-10)의 발현을 확인하였다. 데이터는 평균±SEM(n=3)으로 나타내었다.
도 16은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)와 CD3+ T 세포를 공동배양한 공동배양액 내의 사이토카인의 농도를 ELISA로 확인한 그래프이다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 공동배양액 내의 IFN-γ, IL-17의 농도는 오토탁신 발현을 억제한 성숙 수지상세포에서 높게 발현되는 것을 확인하였다.
3.5 Rho A 단백질 및 in vitro
이동능
확인
오토탁신 단백질의 첨가가 성숙 수지상세포에서 Rho A 단백질의 발현 수준과 성숙 수지상세포의 이동능에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 상기 실시예 1.6 및 1.7과 같이 수행하였다.
도 17은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 RhoA 단백질의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포에서 RhoA 단백질의 발현이 약 1.5배 이상 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
도 18은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)에서 이동 분석법을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다(***p < 0.001).
도 18에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 이동능이 향상된 성숙 수지상세포의 in vitro 이동능이 약 15% 이상 증가하였음을 확인하였다.
3.6 세포 내부 단백질 발현 확인
오토탁신 단백질의 첨가가 성숙 수지상세포에서 세포 내부의 신호전달 단백질(pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB)들에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해서, 상기 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
도 19는 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)의 세포 내부에서 pp38, ERK 1/2, pJNK, NF-κB의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포의 경우 pp38, pJNK, 및 ERK1/2 단백질의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
실시예
4. 배양 중 재조합
오토탁신
단백질을 첨가하여 배양한 성숙
수지상세포의
in
vivo
이동능
평가
배양 중 재조합 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포의 이동능이 향상되었는지 여부를 in vivo에서 확인하기 위해서, 수지상세포의 이동을 추적하였다.
구체적으로, CellVue® NIR815 Midi Kit for Membrane Labeling (Polysciences Inc., Warrington, UK)을 이용하여 Near infrared dye (NIR)를 표지한 수지상세포를 PBS로 현탁하여 C57BL/6 마우스의 발바닥에 1×105 세포/50 μL로 피하 주사하였다. 주사 직후부터 24시간 간격으로 72시간 동안 Pearl Impulse (LI-COR biotechnology, NE, USA) 장비를 이용하여 수지상세포의 이동을 추적하였다. 이미징은 778nm의 파장에서 방출되고 794nm에서 검출하는 near-infrared 800-nm 채널을 이용하여 수행하였다. 주입 후 3일째의 이미지를 대표 이미지로 사용하였다.
도 20은 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)와 성숙 수지상세포(-)가 3일 동안 슬와림프절로 이동한 것을 추적한 사진이다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포의 경우, 그렇지 않은 경우에 비해서 평균 4배 이상 더 많이 슬와림프절로 이동한 것을 확인하였다.
따라서, 배양 중 오토탁신 단백질을 첨가함으로써 성숙 수지상세포의 이동능이 향상되는 것을 확인하였다.
또한, 마우스에서 검출된 전체 형광 값(Fluorescence intensity)을 100%로 환산한 후 슬와림프절(popliteal lymph node)로 이동한 형광 값을 대비하여 이동 효율을 수치화 하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다(*p < 0.05, **p < 0.01).
도 21에 나타낸 바와 같이, 시간이 지남에 따라 주사한 수지상세포주 대비 림프절로 이동한 수지상세포주의 비율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 마우스 슬와림프절로 이동한 수지상세포의 비율을 공초점 현미경으로 확인하기 위하여, 마우스에 Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) (Molecular Probes, OR, USA) 형광을 표지한 수지상세포를 위와 동일한 방법으로 주사하고 24시간 후 슬와림프절을 적출하였다. 적출한 슬와림프절을 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, 동결절편을 제작하였다. 10 μm 두께로 절단한 조직을 슬라이드에 부착하여 DAPI mounting solution (Immunobioscience Co., WA, USA) 처리 후 Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss Co., Oberkochen, Germany)을 이용하여 이미지를 획득하였다. 이미지는 Zeiss ZEN software (Carl Zeiss)를 이용하여 분석하였다. 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)를 주사한 마우스에서 세포의 슬와림프절로의 이동이 성숙 수지상세포(-)를 주사한 대조군에 비하여 더 높게 나타남을 확인하였다.
또한, 적출한 슬와림프절에서 림프구를 분리한 후, 항-CD11c 항체로 염색하여 유세포분석법에 의해 확인한 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 오토탁신 단백질을 첨가하여 배양한 성숙 수지상세포(+)를 주사한 마우스의 슬와림프절에서 CFSE+, CD11c+인 수지상세포의 비율이 대조군에 비해 5배 이상 높게 나타나는 것을 확인하였다.
통계 분석
본 연구의 실험 결과는 최소 3회 이상의 반복 실험 결과에 대하여 Student's t-test 방법으로 통계적 유의성을 검사하였다. 통계적 유의성은 다음과 같이 나타내었다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
Claims (8)
- 성숙되지 않은 수지상세포를 FBS(fetal bovine serum), GMCSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), IL(interleukin)-4 및 머캅토에탄올을 포함하는 RPMI 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양 중인 성숙되지 않은 수지상세포와 오토탁신(autotaxin), LPS(lipopolysaccharide) 및 KLH(keyhole Limpet Hemocyanin)를 접촉시키는 단계를 포함하는 이동능이 증가된 성숙 수지상세포를 제조하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 성숙되지 않은 수지상세포는 미성숙 수지상세포, 준성숙 수지상세포, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 성숙되지 않은 수지상세포는 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 배양시켜 획득한 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 수지상세포의 염증성 사이토카인 생산 유도, T 림프구 증식 유도, 또는 T 림프구 분극화 유도를 증가시키는 것인 방법.
- 삭제
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