JP6876746B2 - 免疫療法のための医薬の組合わせ - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は一般に、免疫反応を調節する方法、及び同目的のために有用な試験物質に関す
る。具体的には、本発明の方法は、ヒト及びマウス形質細胞様樹状細胞（PDC）に発現す
る神経成長因子受容体p75NTRの調節に関する。より具体的には、本発明は、p75NTRシグナ
ル伝達に関与する疾患又は病理的状態に罹患する対象を治療するために使用することがで
き、又はワクチン用アジュバントとして使用することができる、p75NTRアンタゴニスト又
はp75NTRアゴニストから選択されるp75NTRシグナル伝達の少なくとも1つの調節因子、並
びにTLR7及び/又はTLR9のアゴニストから選択される少なくとも1つのTLR受容体アゴニス
トを含む、組合わせに関する。本発明は、PDCによるサイトカイン機能及び抗原提示、並
びにリンパ球及び骨髄細胞、例えばT細胞の活性化及び増殖の調節に有用な、様々なアゴ
ニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするためのアッセイを提供する。従って、本
発明はさらに、p75NTRにより調節される免疫反応のアゴニスト及びアンタゴニストのため
の、スクリーニングアッセイを提供する。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストはサ
イトカイン機能、抗原提示、リンパ球及び骨髄細胞の活性化及び増殖を制御するための、
ワクチン組成物又は薬物の製造に有用であり、該ワクチン組成物又は薬物は感染症、癌、
炎症反応、免疫障害、増殖障害、及びp75NTRシグナル伝達が関与するあらゆる他の状態を
含む、様々な状態の予防又は治療に重要である。
（発明の背景）
免疫系は感染性病原体、例えば細菌、多細胞生物、及びウイルスから、並びに癌から、
個体を保護するように機能する。この系には数種類のリンパ球及び骨髄細胞、例えばT細
胞、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞（DC）、好酸球、及び好中球が含まれる。
これらのリンパ球及び骨髄細胞はしばしば、サイトカインとして知られるシグナル伝達タ
ンパク質を生産する。免疫反応には、炎症、すなわち免疫細胞の全身又は体の特定の部位
への蓄積が含まれ、自己免疫性疾患又は移植片対宿主病（GvHD）を引き起こし得る。免疫
細胞は、感染性病原体又は異物に反応して、サイトカインを分泌し、それにより、続いて
、免疫細胞の増殖、発達、分化、遊走、又は活性化を調節する。サイトカインはいくつか
の障害及び状態の病理に関係があるとされている。
より詳細には、ヒト免疫系は先天性（非特異的）免疫機構及び適応性/獲得性免疫機構
を協調させること（細胞性免疫反応及び体液性免疫反応の組合わせ）により、ヒトを微生
物から保護するように発達してきた。先天性免疫細胞には、食細胞（マクロファージ、他
のDC、好中球）、マスト細胞、好塩基球及び好酸球、生得のT細胞（γδT細胞）、上皮細
胞、NK（ナチュラルキラー）細胞、並びにPDCがある。これらの細胞は、抗微生物サイト
カインを分泌することにより、攻撃してくるあらゆる微生物に対する生体防衛の第一線と
しての機能を果たす。例えば、PDCはウイルスとの遭遇に際し、強力な抗ウイルス活性を
有するサイトカインファミリーであるI型インターフェロン（IFN）を分泌する。一方適応
性免疫には、ヘルパーT細胞（Th1、Th2、及びTh17）及び細胞傷害性T細胞（CTL）をベー
スとした免疫反応（細胞性免疫）、並びに抗原特異的な抗体を生産するB形質細胞（体液
性免疫）へと分化するB細胞がある。PDCはその先天性免疫における中心的な役割に加え、
T細胞反応を誘発し、B細胞の増殖及び抗体を分泌する形質細胞への分化を調節する能力を
有している。PDCは本質的に、抗原により誘導された先天性免疫反応及び適応性免疫反応
の調節及び橋渡しに寄与する。
PDCはエンドソームのToll様受容体7（TLR7）及び9（TLR9）を発現し、これらはそれぞ
れ一本鎖ウイルスRNA、及び細菌又はウイルスのDNAと結合することができる。TLR7又はTL
R9が活性化すると、例えばMyD88、TRAF6、IRAK4、IRF3、及びIRF7が関与するシグナル伝
達カスケードが活性化され、これにより最終的に非常に高レベルのインターフェロンα（
IFNα）が生産される。IFNαはTh1及びCTLによる免疫反応を誘導し、ヒト生体でのウイル
ス防衛、腫瘍細胞の排除における複数の機能を有するが、同時に自己免疫の誘導における
機能も有する。長きにわたり、Th1による免疫反応の誘導に関連するToll様受容体の活性
化に際するインターフェロンの生産は、PDCが原因となり得る唯一の機能であるのではな
いかと考えられていた。
TRAF3及びTRAF6は、TNF受容体関連因子（TRAF）タンパク質ファミリーの、ヒトタンパ
ク質メンバーである。TRAFタンパク質はTNF受容体スーパーファミリーのメンバーからの
シグナル伝達に関連し、これを仲介する。これらのタンパク質は、TNF受容体スーパーフ
ァミリーのメンバーからのシグナル伝達を仲介するだけでなく、Toll/IL-1ファミリーの
メンバーからのシグナル伝達をも仲介する。
骨髄分化第一応答遺伝子88（MyD88）の発現の消失は、細菌感染症への減少した抵抗性
と関連する。さらに、MyD88の変異型は、様々なヒトリンパ腫において確認されてきた（H
awnらの文献、J Infect Dis. (2006) 193 (12): 1693-1702）。
インターフェロン調節因子3（IRF3）及び7（IRF7）は、インターフェロン調節因子ファ
ミリーの転写調節因子のメンバーである。IRF3及びIRF7は、炎症誘発性遺伝子及びI型イ
ンターフェロン遺伝子を含む、ウイルス誘導性細胞遺伝子の転写の活性化に役割を果たす
ことが示されてきた。特に、IRF7は多くのIFNα遺伝子を調節する。IRF7の構成的発現は
、主としてリンパ組織；特にPDCに限定されている。しかしながら、IRF7の発現は多くの
組織で誘導性である。
ニューロトロフィンは脊椎動物神経系の発達において必須の役割を有すると考えらえて
いる、タンパク質のファミリーである。神経成長因子（NGF）はニューロトロフィンファ
ミリーの最も特徴が明らかにされいるメンバーであり、一番初めに単離された。ますます
大きくなるニューロトロフィンファミリーの他のメンバーには、：脳由来神経因子（Brai
n derived nerve factor）（BDNF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、並びにニューロト
ロフィン-4及び5（NT-4及びNT-5）がある。ニューロトロフィンは、異なる親和性を有す
る2つの異なる受容体クラス：i) Trk A、Trk B、及びTrk C（トロポミオシン受容体キナ
ーゼA、B、及びC）を含む高親和性神経成長因子受容体、並びにii) p75NTR又はCD271とし
ても知られる腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである低親和性神経成長
因子受容体（LNGFR）への結合により、その作用が仲介される（Lykissasらの文献、Curr
Neurovasc Res. 2007 May;4(2): 143-51）。
近年、PDCもまた外因性抗原及び自己抗原への免疫反応の調節に、中心的な役割を果た
すことが実証されてきた。マウスにおけるPDCの減少は、Th2免疫反応であるアレルギー性
喘息を悪化させるが、Th1免疫反応に基づく多発性硬化症のマウスモデルである、実験的
自己免疫性脳脊髄炎（EAE）における自己免疫性反応もさらに重くすることが実証できた
。これらの結果から、PDCは寛容性を誘導する主要な調節機能を有するが、腫瘍細胞によ
る宿主免疫の回避にも関与し得ることが推論され得る。
免疫反応の誘導及び寛容性の阻害は、ワクチン接種戦略の成功の主要な決定要素である
。古典的なワクチンは、ワクチン用抗原に対する体液性免疫を誘導する、Th2免疫反応の
誘導に依存している。弱毒ワクチンは強い免疫反応を誘導しないため、免疫反応を増強す
るために、アジュバントが使用される。最も一般的なTh2誘導性アジュバントはアルミニ
ウム塩である。細胞内生物を殺傷し、又は腫瘍細胞を排除するため、Th1及びCTLによる免
疫反応が誘導される必要があり、従ってこれらに対し異なるアジュバントが使用されるこ
ととなる。Th1を誘導するアジュバントのほとんどは、TLRの活性化を介して作用する。現
在使用されているアジュバント又は臨床試験において評価中である新規アジュバントの概
要を以下の表1に示す：
表1：アジュバント及び現在臨床試験で評価中の新規アジュバント
Figure 0006876746
WO 2012/101664は、慢性炎症性疾患の治療のための、例えばリウマチ性関節炎、若年性
特発性関節炎、乾癬、多発性硬化症、腸管慢性炎症性疾患、エリテマトーデスのような慢
性炎症性疾患の治療のための、少なくとも1つのp75NTR受容体阻害剤の単独の、若しくは
少なくとも1つのTrkA受容体活性化因子と結び付けての使用、又は少なくとも1つのTrkA受
容体活性化因子の使用に関するものである。
WO 97/37228は、培養神経堤由来メラニン細胞を使用してアルツハイマー病を発症する
個体のリスクを評価するための方法に関する。同様に記載されるのは、ニューロトロフィ
ン受容体（p75NTR）と結合し、かつβアミロイドのp75NTRへの結合を競合阻害するペプチ
ドを使用した、アルツハイマー病の治療方法である。
US 2008/064036は、試験化合物の、p75NTRにより誘導されたアポトーシスを調節する能
力を特定する方法であって：i.) p75NTR（配列番号：2）又はその細胞死誘導性断片をコ
ードするベクターにより、真核細胞の懸濁液に形質移入すること、ii.) 前記細胞を試験
される化合物と接触させること、及びiii.) 前記細胞におけるアポトーシス反応を決定す
ること、を含み、前記試験化合物の非存在下での該アポトーシス反応と比較した該試験化
合物の存在下のアポトーシス反応の変化が、該試験化合物のp75NTRにより誘導されたアポ
トーシスを調節する能力の徴候である、前記方法を提供する。
（本発明の概要）
本発明は形質細胞様樹状細胞（PDC）が、神経成長因子受容体p75NTRを発現するという
予期せぬ発見に基づいている。インビトロ実験及び様々なマウスモデルで生み出された幅
広い証拠に基づいて、p75NTRがPDCにより駆動される免疫反応の重要な調節因子であるこ
とをさらに確立することができた。すなわち、サイトカイン分泌アッセイ及び細胞増殖ア
ッセイ、並びにCTL、Th1、及びTh2のマウスの疾患、例えば、アレルギー性喘息、GvHD及
び自己免疫性I型糖尿病モデルにおいて示される通り、TLR7又はTLR9が活性化されたPDCで
のp75NTRの活性化は、CTL及びTh1の反応を阻害し、免疫反応をよりTh2反応へと方向づけ
るのである。
従って、本発明は、細胞をp75NTRのアゴニスト又はアンタゴニストと接触させる工程を
含む、細胞の活動を調節する方法であって、ここで該細胞がTLR7及び/又はTLR9と、p75NT
Rとを発現し、該p75NTRのアゴニスト又はアンタゴニストがTLR7又はTLR9のアゴニストに
反応して免疫反応及び/又は細胞の増殖を調節する、前記方法を提供する。
また、先の方法であって、該細胞が、好ましくは初代組織から単離されたPDC、又はイ
ンビトロでの初代組織からの分化により生成させたPDC、又は初代PDC若しくはインビトロ
で分化した初代組織に由来する細胞株である、前記方法をも提供する。
別の態様において、本発明は、感染症、炎症性障害、免疫障害、又は癌のようなp75NTR
シグナル伝達が関与する、疾患又は病理的状態に罹患する対象を治療するための、TLR7又
はTLR9のアゴニスト及びp75NTRのアゴニスト又はアンタゴニストの医薬の組合わせの使用
であって、該疾患又は病理的状態が単球、又はマクロファージ、好中球、T細胞、又はB細
胞、DC、上皮細胞、又は内皮細胞によって仲介される、前記使用を提供する。さらなる実
施態様において、該疾患はPDCを介して仲介される。
PDC上のp75NTRはPDCが仲介する免疫反応の調節におけるマスタースイッチとして機能す
る。免疫反応の調節は、ワクチン用アジュバントの主要な機能である。従って、PDC活性
化因子、好ましくはTLR7及び/又はTLR9のアゴニストと組合わせたp75NTRのアゴニスト及
びアンタゴニストは、新たなアジュバントの手段を提供する。そのため、本発明はp75NTR
シグナル伝達のアゴニスト又はアンタゴニストを含むワクチン組成物をさらに提供する。
活性化されたPDCでのp75NTRの活性化は、Th2免疫反応を強く誘導する。従って、アゴニ
ストはTh2依存性ワクチンにおける免疫反応をブーストすることができる。対象となる免
疫反応はアルミニウム塩と同様であるが、局所的な炎症の誘導とは関係しない。p75NTRア
ゴニストを使用して、現在一般的に用いられるワクチン用アジュバントの成分と置き換え
ることができ、又はワクチン反応をさらにブーストすることと組合わせて使用することが
できる。
別の実施態様において、本発明は、これらに限定はされないが、Th2免疫反応の刺激、T
h1免疫反応の抑制、Th17免疫反応の抑制、CTL反応の抑制、及び制御性T細胞によって誘導
される寛容性の抑制などを含む、免疫反応を調節するためのp75NTRアゴニストを含む、ワ
クチン組成物の使用に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は、これらに限定はされないが、Th2免疫反応の
抑制、Th1免疫反応の刺激、Th17免疫反応の刺激、CTL反応の刺激、及び制御性T細胞によ
って誘導される寛容性の刺激などを含む、免疫反応を調節するためのp75NTRアンタゴニス
トを含む、ワクチン組成物の使用に関する。
PDCの活性化因子と、p75NTRシグナル伝達のアゴニスト又はアンタゴニストとのこれら
の組合わせは、免疫療法における使用のための医薬組成物、好ましくはワクチン組成物に
組み込むことができる。
本発明の別の実施態様は、p75NTR及びToll様受容体TLR7又はTLR9の少なくとも1つを共
発現する真核細胞での、p75NTRシグナル伝達を調節する化合物をスクリーニングする方法
を提供する。
本発明の別の実施態様は、p75NTRのノックアウト、又はp75NTRの低下した発現、及びTo
ll様受容体TLR7又はTLR9の少なくとも1つを有する真核細胞、あるいは非機能型p75NTRバ
リアント、及びToll様受容体TLR7又はTLR9の少なくとも1つを発現する真核細胞での、p75
NTRシグナル伝達を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
別の実施態様は、p75NTRノックアウト、又は低下したp75NTRの発現を有するか、又は非
機能型p75NTRバリアントを発現するマウスを候補化合物と接触させること、及び該接触さ
せたp75NTRノックアウトマウスにおける生理活動を決定すること；該候補化合物と接触さ
せていない、p75NTRノックアウト、又は低下したp75NTRの発現を有するか、又は非機能型
p75NTRバリアントを発現するマウスにおける生理活動を決定すること；及びp75NTRノック
アウト、又は低下したp75NTRの発現を有するか、又は非機能型p75NTRバリアントを発現す
る、該接触させたマウスの生理活動を、p75NTRノックアウト、又は低下したp75NTRの発現
を有するか、又は非機能型p75NTRバリアントを発現する、接触させていないマウスと比較
すること、を含む方法、並びに該生理活動が免疫活動；炎症、反応性亢進、又は増殖活動
を含む、前記方法を提供する。
（図面の簡単な説明）
アレルゲンが仲介する免疫反応の間の、マウスPDCでのNGFの作用を示す。気管支肺胞洗浄液（BALF）において、PDCによるOVAの取り込みがNGFの存在下で行われた際に、OVA単独でインキュベートされたPDCと比較して、好酸球及びリンパ球の数が有意に増加し、一方マクロファージの数は減少した（図1a、b）。OVAを負荷したPDCをNGFで処理すると、NGFの非存在下、OVAで短時間処理したPDCと比較して、肺でのTh2サイトカイン（IL-4、IL-5、及びIL-13）の生産が増加した（図1c）。OVAを負荷したPDCを与えられたマウスからの組織学的肺切片は、増加した血管周囲の炎症及び増強された粘膜生産を示した（図1d）。OVAを取り込む間のPDCのNGFによる処理は、肺における炎症表現形を増強した（図1d）。 OVAが仲介するアレルギー性喘息のマウスモデルでの、疾患を引き起こすプロセスにおいて、マウスPDCで発現するp75NTRの役割の調査の結果を示す。OVAエアロゾルでの誘発後、重度の好酸球増加症、肺炎症、及び激しい粘膜生産など喘息の特徴的な症状を分析した。OVAを負荷した、p75NTR-/-のPDCで処理したp75NTR+/+マウス（野生型）及びp75NTR-/-マウス（ノックアウト）は、p75NTR+/+のPDCを与えられたマウスと比較して、BALFにおける免疫細胞（リンパ球及び好酸球）の数の有意な低下を示した（図2a、b）。OVAが仲介する免疫反応はさらに、p75NTR+/+のPDCで処理されたマウスのBALFにおける、増加したTh2サイトカイン（IL-4、IL-5、及びIL-13）の分泌をもたらすが、p75NTR-/-のPDCを与えられたマウスではこれをもたらさない（図2c）。肺における血管周囲の炎症及び杯細胞肥厚化は、p75NTR+/+のPDCで処理されたマウスと比較して、p75NTR-/-のPDCで処理したマウスにおいて縮小した（図2d、e）。 インビトロでのCPGオリゴデオキシヌクレオチドで刺激された免疫反応のプロセスにおける、マウスPDCで発現するp75NTRの役割の研究結果を示す。p75NTR+/+（野生型）系統に由来するマウスPDCは、低親和性ニューロトロフィン受容体p75NTRを発現し、一方p75NTR-/-（ノックアウト）系統はこれを発現しない（図3a、b）。p75NTR+/+のPDCは他のニューロトロフィンTrk受容体のいずれも発現しない（図3a；抗体染色：実線；抗体染色なし：斜線領域）。p75NTR-/-のPDCとは対照的に、CPG Aにより誘導されたp75NTR+/+のPDCによるIFNαの分泌は、濃度依存的なNGFの追加により低下した。図はTh1反応の低下を示す（図3c）。p75NTR+/+のPDCは、Th2を誘導するオリゴデオキシヌクレオチドCPG Bによる刺激後、有意に高い量の炎症誘発性サイトカインIL-6及びTNFαを分泌した（図3d）。また、PDCで発現するToll様受容体TLR9の発現は、CPG Aで刺激されたp75NTR+/+のPDCへのNGFの追加により負の影響を受けた一方、p75NTR-/-ではTLR9の発現の差異は示されなかった（図3e）。Th1反応を誘導するオリゴデオキシヌクレオチドCPG AにNGFを追加すると、p75NTR+/+のPDCが刺激され、MyD88及びTRAF6の低下した発現、並びにシグナル伝達タンパク質IRF-3、IRF7、IKK、及びc-Junの低下した活性化（リン酸化）により反応する（図3f）。p75NTR+/+のPDCと、炎症誘発性のTh2反応を誘導するオリゴデオキシヌクレオチドCPG Bと、NGFとをコインキュベートすると、MyD88及びTRAF3の増加した発現が誘導された。また、シグナル伝達タンパク質IRF3、IRF7、IKK、及びc-Junの活性化（リン酸化）も増加した（図3g）。 主要組織適合性複合体タンパク質クラスI（MHCクラスIタンパク質）及び/又はクラスII（MHCクラスIIタンパク質）の、Toll様受容体リガンドCPG A及びBで共刺激されたマウスPDCでの発現へのNGFの作用を示す。p75NTR+/+（野生型）のPDCは、Th1反応を誘導するCPG Aを含む培養物にNGFを加えた後に、MHCIIの減少した発現により反応する（図4a；NGFなし：実線、NGFあり：破線）。Th2反応を誘導するCPG Bにより刺激されたPDCは、該培養物へのNGFの追加に際し、MHCII発現のさらなる増加を示した（図4b；NGFなし：実線、NGFあり：破線）。p75NTR-/-（ノックアウト）のPDCと比較して、p75NTR+/+のPDCへNGFを追加すると、炎症誘発性CPG Bにより誘導されるMHCIの発現がさらに増加した（図4c；NGFなし：実線、NGFあり：破線）。染色されていないPDCは、斜線領域のヒストグラムとして示される。 マウスPDC及びT細胞の共培養物におけるT細胞が分泌するTh1サイトカインIFNγ及びIL-2の分泌に対するNGFの影響を示す。PDCを、p75NTR+/+（野生型）又はp75NTR-/ -（ノックアウト）のマウス系統のいずれかから単離した。T細胞を、オボアルブミンペプチド特異的T細胞受容体を発現する、OTIIマウス系統から単離した。該オボアルブミンペプチド（OVA）をT細胞に提示するp75NTR+/+のPDCの存在下、T細胞はTh1サイトカインであるIFNγ（図5a）及びIL-2（図5b）を分泌する。p75NTR-/-のPDCとの共培養物と比較して、p75NTR+/+系統由来のPDCと共培養したT細胞は、NGFの追加に際し、両方のTh1サイトカインの低下した分泌により反応する。 ODN 2216（▲）対ODN 2216＋200 ng/ml NGF（□）により活性化された、ヒトPDCにより生産されたIFNα（pg/ml）の図式表現を示す（図6a）。活性化されたPDCにより上清に分泌されたIFNαを、ELISAにより決定した。示されているデータは、平均±SEMである（n＝20）。有意水準p＜0.05を選択した。有意差はスチューデントの対応のある（両側）t検定により決定した通り、＊＊により示した（p＝0.0031）。さらに、NGFの存在下で、合成ペプチドPEP5によりp75NTR受容体を遮断すると、IFNαの分泌が有意に増加した（図6b）。＊及び＊＊により示される有意水準を、スチューデントの対応のある（両側）T検定により決定した；ns＝有意差なし。 T細胞の増殖、及びアレルギー患者から単離されたT細胞及びPDCの共培養物における炎症誘発性サイトカインの分泌への、NGFの影響を示す。共培養物にNGFを加えると、T細胞は特定のアレルゲンの存在下で、増加した増殖を示した（図7a）。また、T細胞は炎症誘発性サイトカインであるIL-2及びIL-5の増加した分泌により反応する（図7b）。値は4名の異なるアレルギーを有するドナーのSEMを伴う平均として示す（n＝4）。値は一元配置ANOVA多重比較法（テューキーの方法）を用いて比較した。差は、p＜0.05の時に有意であるとみなした。Ag.：アレルゲン。 インビトロでのCpGオリゴデオキシヌクレオチドで刺激された免疫反応のプロセスにおける、マウスPDCで発現するp75NTRの役割の研究結果を示す。p75NTR+/+（野生型）系統由来のマウスPDCは、低親和性ニューロトロフィン受容体p75NTRを発現し、一方、p75NTR-/-（ノックアウト）系統は、これを発現しない。NGFの非存在下、p75NTR+/+（野生型）のPDC及びp75NTR-/-（ノックアウト）のPDCはいずれも、CPGオリゴデオキシヌクレオチドA型（CpG A）又はB型（CpG B）、リポ多糖（LPS）又はオボアルブミン（OVA）による刺激に際し、同じ割合のTLR9発現細胞を示す（図8a）。p75NTR-/-のPDCと対照的に、p75NTR+/+のPDCは、CpG A（図8b）又はCpG B（図8c）で刺激されていてもいなくても、より高い基準TLR9発現レベルを示した。CpGで誘導されたTLR9発現レベルの増加は、NGFの存在下で有意に減少した。 主要組織適合性複合体タンパク質クラスII（MHC II；図9a）又はクラスI（MHC I；図9c）、並びにオボアルブミンタンパク質（OVA）で共刺激したマウスPDCでの共刺激性分子ICOS-L（図9b）、PD-L1（図9d）、及びOx40-L（図9e）の発現に対するNGFの作用を示す。p75NTR+/+（野生型）のPDCは、OVAを含む培養物にNGFを追加した後、MHCII及びICOS-Lの増加した発現により反応する。p75NTR-/-（ノックアウト）のPDCと比較して、p75NTR+/+のPDCにNGFを加えると、NGFの追加後のMHCI、PD-L1、及びOx40Lの発現が減少する。 マウスPDCとの共培養物における、T細胞の増殖及びサイトカイン（IFNγ、IL-6、及びTNFα）分泌に関するT細胞へのNGFの影響を示す。PDCをp75NTR+/+（野生型）又はp75NTR-/-（ノックアウト）マウス系統のいずれかから単離した。T細胞を、CD4+ T細胞にオボアルブミンペプチド特異的T細胞受容体を発現するOT-IIマウス系統（図10a）、又はCD8+ T細胞にオボアルブミンペプチド特異的T細胞受容体を発現するOT-Iマウス系統（図10b）のいずれかから単離した。オボアルブミンタンパク質をT細胞に提示するp75N TR+/+のPDCの存在下、続いて該T細胞はサイトカインを分泌し、増殖する。p75NTR-/-のPDCとの共培養物と比較して、p75NTR+/+系統由来のPDCと共培養したOT-II系統由来のCD4+ T細胞は、NGFの追加に際し、増加したサイトカイン分泌及び増殖により反応するのに対し、OT-I系統由来のCD8+ T細胞は、共培養物中にNGFが存在した場合に、より少ないサイトカインを分泌し、低下した増殖を示した。 合成ペプチドPEP5によるp75NTR受容体のさらなる遮断を伴う場合、又は伴わない場合の、NGF存在下でのFcεRIα特異的、IgE架橋抗体によって活性化されたヒトPDCによって生産されたIL-6（pg/ml）の図式表現を示す。値を抗体処理のみに対して正規化する。活性化されたPDCによって分泌されたIL-6をELISAにより決定した。示されているデータは、平均±SEM（n＝8）である。NGFの存在下で合成ペプチドPEP5によりp75NTR受容体を遮断すると、IL-6の分泌が有意に減少した。 NGF存在下でのアレルゲン仲介性免疫反応の間の、マウスPDCでのp75NTR受容体遮断の作用を示す。p75NTR特異的遮断抗体の存在下でPDCがOVAを取り込んだ場合、気管支肺胞洗浄液（BALF）において、好酸球の数（図12a）は、OVA及びNGF単独とともにインキュベートしたPDCと比較して、有意に減少した。一方で、マクロファージの数は増加した（図12b）。OVAを負荷したPDCを遮断抗体で処理すると、p75NTR遮断抗体の非存在下OVA及びNGFで短時間処理したPDCと比較して、肺におけるIL-4及びIL-5の生産が減少した（図12c、d）。 Th2傾向異種移植モデルにおける、累積移植片対宿主病（GvHD）の発生率（図13a）及び生存率（図13b）へのNGFの作用を示す。ヒト、自己T細胞及びPDCを移植されたNSGマウスは、GvHDを発症する。PDCを移植前にNGFの存在下で培養した場合、GvHDの重症度が増加し、増加した死亡率がこれに伴った。PDCをCpG Bにより事前に刺激することを省くことにより、加速するNGFの作用が無効化され、このことからTLR7/9依存的なプロセスが示唆された（データは示さない）。 Th1傾向I型糖尿病モデルにおける、糖尿病の発症へのNGFの作用を示す。LCMV-GPペプチドで刺激されたPDCを移植されたRIP-CD80×RIP-LCMV-GPマウスは、増加した血中グルコースレベルにより判断される自己免疫性糖尿病を発症する。NGFの存在下でPDCの事前刺激が行われた場合、糖尿病でない期間は有意に延長された。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書における用語「p75NTR」は、低親和性神経成長因子受容体（LNGFR、p75ニュー
ロトロフィン受容体、TNFRSF16（TNFRスーパーファミリー、メンバー16）、Gp80-LNGFR、
p75、p75ICD、メンバー16、CD271、又はNGF受容体とも呼ばれる）を指す。「p75NTR」は
ニューロトロフィン、すなわち神経細胞の生存及び分化を刺激するタンパク質成長因子の
ファミリーの2つの受容体型のうちの１つである。本明細書で使用される「p75NTR」は、
哺乳類細胞で通常に発現されるp75NTRタンパク質を包含するが、その全てのスプライスバ
リアントも含むものとする。p75NTRのスプライスバリアントは、「選択的スプライシング
」、すなわち複数のタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす遺伝子発現の間の調
節されたプロセスによって形成することができる。この選択的スプライシングのプロセス
の間に、遺伝子の特定のエキソンがその遺伝子から生産される最終的にプロセシングされ
たメッセンジャーRNA（mRNA）に含まれ得るか、又は該mRNAから除外され得る。その結果
、選択的スプライシングを受けたmRNAから翻訳されたタンパク質は、それらのアミノ酸配
列、及びしばしば、それらの構造において差異を含むこととなる。好ましくは、本発明に
従って、p75NTRタンパク質は配列番号4の核酸配列（遺伝子ID 4804; NCBI参照配列NM_002
507.3）を有する遺伝子によりコードされる。最も好ましくは、本明細書で使用されるp75
NTRタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列（Swiss-Prot受託番号P08138.1）を有する。
「活性化」、「刺激」、及び「処理」は、細胞又は受容体に適用する場合、そうでない
ことが文脈により、又は明らかに示されない限り、例えば、リガンド、アゴニスト、又は
アンタゴニストによる細胞又は受容体の活性化、刺激、又は処理と同じ意味を有し得る。
「活性化」とは、内部機構により、並びに外部因子又は環境因子により調節されるよう
な細胞の活性化を指すことができる。
「リガンド」は、天然及び合成の（人工の）リガンド、例えばサイトカイン、サイトカ
インバリアント、類似体、変異タンパク質、及び抗体に由来する結合組成物を包含する。
また、「リガンド」は低分子、例えばサイトカインのペプチド模倣物、抗体のペプチド模
倣物、核酸、及び核酸模倣物を包含する。
「アゴニスト」は、受容体に結合し、該受容体を活性化させて生物学的反応を引き起こ
す化学薬剤又はリガンドである。アゴニストが作用を引き起こすのに対し、アンタゴニス
トは該アゴニストの作用を遮断し、かつインバースアゴニストは該アゴニストの作用と逆
の作用を引き起こす。
「p75NTRアゴニスト」はp75NTRと結合し、これを活性化させる化学薬剤又はリガンドで
ある。
「TLR7アゴニスト」は、Toll様受容体7と結合し、これを活性化させる化学薬剤又はリ
ガンドである。
「TLR9アゴニスト」は、Toll様受容体9と結合し、これを活性化させる化学薬剤又はリ
ガンドである。
「アンタゴニスト」は、受容体への結合に際してアゴニストが仲介する反応を遮断する
リガンドである。「アンタゴニスト」の結合は相互作用を途絶させ、受容体における「ア
ゴニスト」の機能を阻害する。「アンタゴニスト」は受容体上の活性部位、若しくはアロ
ステリック部位に結合することにより、その作用を仲介し、又は「アンタゴニスト」は、
受容体の活動の生物学的調節に通常は関与しない特有の結合部位で、相互作用し得る。「
アンタゴニスト活性」は、可逆的でも不可逆的でもあり得る。薬物アンタゴニストの大部
分は、構造的に定義された受容体の結合部位で、内因のリガンド又は基質と競合すること
により、その効力を達成する。
「p75NTRアンタゴニスト」はp75NTRアゴニストとの相互作用を途絶させ、p75NTRアゴニ
ストの機能を阻害し、又はp75NTRが仲介するシグナル伝達を阻害する化学薬剤又はリガン
ドである。
例えば、細胞、組織、器官、又は生物の「反応」は、生化学的又は生理的挙動、例えば
、生物学的区画内での濃度、密度、接着、若しくは遊走、遺伝子発現の速度、タンパク質
翻訳、活性化若しくは阻害（例えば、リン酸化）、又は分化状況の変化を包含し、ここで
、該変化は活性化、刺激、若しくは処理と、又は遺伝的プログラミングのような内部機構
と相関する。
分子の「活性」は、該分子のリガンド若しくは受容体への結合、触媒活性；遺伝子発現
又は細胞のシグナル伝達、分化、若しくは成熟を刺激する能力；抗原性活性、他の分子の
活性の調節などを説明し、又はこれらを指すことができる。また、分子の「活性」は、細
胞間相互作用、例えば接着を調節し、若しくは維持する活性、又は細胞の構造、例えば細
胞膜若しくは細胞骨格を維持する活性をも指すことができる。
「増殖活性」は、例えば正常な細胞分裂、並びに癌、腫瘍、形成異常、細胞癌化、転移
、及び血管新生を促進し、これらに必要とされ、又はこれらと具体的に関連付けられる活
性を包含する。
「投与」及び「処置」は、ヒト対象、研究対象、獣医学的対象、動物、又は細胞の処置
に適用する場合、医薬上、治療上、診断上の薬剤若しくは組成物、又は偽薬を、ヒト対象
、動物、又は細胞と接触させることを指す。細胞の処置は、試薬の該細胞への接触、並び
に試薬の該細胞と接触する流体への接触を包含する。
また、「投与」及び「処置」は、エクスビボ処置、例えば細胞、組織、又は器官をエク
スビボで処置し、続いて該細胞、組織、又は器官を対象又は動物と接触させることをも包
含する。ここで、薬剤又は組成物は、該エクスビボ処置の間又は後に代謝され、変化し、
分解され、又は除去されている。
「候補化合物」又は「試験化合物」は、例えば分子、分子の複合体、又は分子の混合物
を指し、ここで該候補化合物は、治療薬剤又は診断薬剤の開発又は特定において使用され
る。候補化合物の試験又はスクリーニングを使用して、該化合物が治療薬又は診断薬とし
て有用となり得るかどうか決定される。「候補化合物」は、第二の治療薬若しくは診断薬
、又は担体、希釈剤、安定化剤、若しくは賦形剤とともに、例えばポリペプチド、抗体、
天然生産物、合成化学物質、有機化合物、無機化合物、核酸、及びこれらの組合わせを包
含する。
「障害」又は「疾患」は、病理的状態、又は病理的状態と相関する、若しくは病理的状
態の素因になる状態を指す。特に、「障害」又は「疾患」は、生きている動物又はヒトの
体又はその一部の正常な状態における、その生命機能の遂行能力を中断させ、又は変化さ
せる障害であり、それは、典型的に徴候及び症状がはっきりと区別されることにより顕出
し、また環境因子（栄養不良、公害、又は気候）、特定の感染性病原体（蠕虫、細菌、又
はウイルス）、生物の固有の欠陥（遺伝的異常、又は免疫系の機能性の悪化）、又はこれ
らの因子の組合わせへの反応である。
「感染性障害」又は「感染症」は、例えば微生物、細菌、寄生生物、病原性真菌、ウイ
ルスなどに起因する障害、並びに該障害への不適切な、無効な、又は病理的な免疫反応を
指す。
「腫瘍形成性障害」は、癌、癌化細胞、腫瘍、形成異常、血管新生、腫瘍転移など、並
びに該障害への不適切な、無効な、又は病理的な免疫反応を包含する。
「有効量」は、例えば障害、状態、若しくは病理的状態の症状若しくは徴候を改善する
のに十分なp75NTRアゴニスト、アンタゴニスト、又は結合化合物若しくは組成物の量を意
味する。
「発現」は、特定の遺伝子にコードされたmRNA又はポリペプチドの規準を指す。発現の
単位は、例えば細胞若しくは組織、又は細胞抽出物若しくは組織抽出物中のタンパク質1
mg当たりのmRNA又はポリペプチド分子の数の規準とすることができる。発現の単位は相対
的なものとすることができ、例えば対照及び実験哺乳動物からのシグナルの比較、又はmR
NA又はポリペプチドに特異的な試薬によるシグナルと、非特異的な試薬によるシグナルの
比較とすることができる。
「炎症性障害」又は「炎症性疾患」は、病理が全体的に、又は部分的に、免疫系の細胞
、例えばT細胞、B細胞、単球若しくはマクロファージ、肺胞マクロファージ、樹状細胞、
NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、又はマスト細胞の数の増加及び/又は活性化の増加に
起因する、障害又は病理的状態を意味する。
「免疫障害」又は「免疫疾患」は、免疫系の機能不全である。これらの障害は、免疫系
の構成要素が冒されるために、又は免疫系が過剰に活動し、又は活動低下するために発症
する。さらに、これらの障害は先天的でも後天的でもあり得る。
「免疫療法」は、免疫反応を誘導し、増強し、抑制することによる疾患の治療を意味す
る。免疫反応を引き出し、又は増幅させるように設計された免疫療法は、活性化免疫療法
として分類され、一方免疫反応を低下させ、又は抑制する免疫療法は、抑制免疫療法とし
て分類される。
「ノックアウト（KO）」は、遺伝子、例えばp75NTR遺伝子によりコードされたポリペプ
チドの少なくとも一部分の発現を部分的に、又は完全に低下させることを指し、ここで、
該遺伝子は哺乳動物のような動物の単一の細胞、選択された細胞、又は全ての細胞におい
て内因性である。また、KOは生物学的機能が低下する実施態様を包含するが、発現が必ず
しも低下しない実施態様、例えば挿入された不活性化するペプチド、オリゴペプチド、又
はポリペプチドを含む、発現されたp75NTRポリペプチドを含む、p75NTRポリペプチドも包
含する。コード配列又は調節配列における途絶は、ノックアウト技術に包含される。細胞
又は哺乳動物を「ヘテロ接合ノックアウト」とすることができ、ここでは内因の遺伝子の
一方の対立遺伝子が途絶されている。あるいは、細胞又は哺乳動物を「ホモ接合ノックア
ウト」とすることができ、ここでは内因の遺伝子の両方の対立遺伝子が途絶されている。
「ホモ接合ノックアウト」は、両方の対立遺伝子の途絶を同一の技術又はゲノム上での同
一の結果に制限することを意図するものではない。本発明の範囲に含まれるのは、一方又
は両方のp75NTR対立遺伝子がノックアウトされた哺乳動物である。好適には、一方又は両
方のp75NTR対立遺伝子がノックアウトされた前記哺乳動物は、マウス又はラットである。
「ノックダウン（KD）」は、遺伝子、例えばp75NTR遺伝子によってコードされたポリペ
プチドの少なくとも一部分の部分的な低下を指し、ここで該遺伝子は哺乳動物のような動
物の細胞株、単一の細胞、選択された細胞、又は全ての細胞において内因性である。KDは
、例えばsiRNA/shRNAの発現により達成される。
「トランスジェニック」は、安定に遺伝される遺伝子操作技術によって生産される遺伝
的変化を指す。トランスジェニック法、トランスジェニック細胞、及びトランスジェニッ
ク動物は、ノックアウト技術、ノックイン技術、又はトランスジェニックを生産するため
の任意の他の従来技術の使用に起因する遺伝的変化を含む。
「マーカー」は、細胞、組織、器官、動物の表現形、例えば、マウス又はヒト対象の表
現形に関する。細胞表面マーカーは、特定の細胞種、又はさらに限られた数の細胞種の細
胞膜上に位置する分子を指す。細胞内マーカーは特定の細胞種、又はさらに限られた数の
細胞種の細胞の内部に位置する分子を指す。マーカーは、細胞種の特定において通常に使
用される。マーカーは、例えば細胞の精製、定量、遊走、活性化、成熟、又は発達の間に
細胞を検出するために使用され、かつインビトロ及びインビボの研究の両方に対して使用
することができる。活性化マーカーは、細胞の活性化に関連するマーカーである。
「非ヒト動物」は、ヒト以外の全ての他の動物を指す。本発明による非ヒト動物は、好
適には哺乳動物又はげっ歯類である。より好適には、本発明による非ヒト動物は、ラット
、マウス、ウサギ、サル、モルモット、ネコ、又はイヌから選択される。最も好適には、
本発明による非ヒト動物は、ラット又はマウスである。
「感度」、例えば受容体のリガンドへの感度とは、該受容体へのリガンドの結合が、該
受容体、又は該受容体と特異的に結合する事象若しくは分子の検出可能な変化、例えば立
体構造変化、リン酸化、該受容体と結合するタンパク質の性質若しくは量をもたらし、あ
るいは該受容体により仲介され、又は該受容体と結合する遺伝子若しくはタンパク質の発
現の変化をもたらすことを意味する。
「可溶性受容体」は、水溶性であり、かつ例えば細胞外流体、細胞内流体中に存在し、
又は膜と弱く結合する受容体を指す。可溶性受容体はさらに、水溶性となるように操作さ
れた受容体を指す。
「結合の特異性」、「結合の選択性」などは、所定のリガンドと他のリガンドとを、又
は所定の受容体と他の受容体とを、識別することを可能とする所定のリガンド及び所定の
受容体の間の結合相互作用を指す。「特異的に」又は「選択的に」結合することとは、リ
ガンド/受容体、抗体/抗原、又は他の結合対に言及する場合、不均質なタンパク質集団中
でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応を示唆する。従って、指定された条件下で
、特定のリガンドは特定の受容体に結合し、試料中に存在する他のタンパク質とはほとん
ど結合しない。
「初代細胞」は、ヒト又は動物体に直接的に由来する細胞である。
「CpGオリゴデオキシヌクレオチド」（又はCpG ODN、短縮して「CpG」）は、シトシン
三リン酸デオキシヌクレオチドとそれに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチドを含
む、短い一本鎖合成DNA分子である。
「遺伝子」は、ポリペプチドのコード領域及び任意の調節配列、例えばプロモーター、
オペレーター、エンハンサー、イントロン、スプライスアクセプター部位及びスプライス
ドナー部位、翻訳の開始シグナル及び終結シグナル、並びに転写の開始シグナル及び終結
シグナルを包含する。コード領域は1つの連続したエキソンを含むことができ、又は2以上
のエキソンを含むことができる。すなわち、コード領域は1以上のイントロンにより中断
され得る。「遺伝子」は1以上のオープンリーディングフレーム（ORF）を包含することが
できる。
「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を向上させる生物学的調製物である。ワクチ
ンは典型的には疾患を引き起こす微生物に類似した成分を含み、多くの場合該微生物、そ
の毒素、又はその表面タンパク質の1つの不活性化形態から作製される。該成分は生体の
免疫系を刺激して、該成分を異物として認識させ、それを破壊させ、将来の感染に向けそ
れを記憶させる。ワクチンは予防的（例えば、病原性微生物による将来の感染の作用を予
防し、又は改善すること）にも治療的（例えば、癌に対するワクチン）にもすることがで
きる。
「アジュバント」は、他の薬剤の作用を修正する医薬上の及び/又は免疫学的な薬剤で
ある。アジュバントは抗原に対する免疫反応を増強する、無機又は有機化学物質、高分子
、又は特定の不活性化された病原性微生物の細胞全体である。アジュバントは対象におい
て供給される抗原への免疫反応を増強するためにワクチンに含めることができ、それによ
り注入される異物の量を最小限にする。アジュバントは様々な方法で、例えばToll様受容
体（TLR）シグナル伝達を活性化することにより、血液循環中の抗原の存在を延長するこ
とにより、抗原提示細胞による抗原の吸収を向上させることにより、マクロファージ及び
リンパ球を活性化することにより、及び/又はサイトカインの生産を増強することにより
、抗原に対する免疫反応を増強することができる。
（本発明の好ましい実施態様）
（1. 医薬組成物）
本発明はp75NTRシグナル伝達のアゴニスト、又はp75NTRシグナル伝達のアンタゴニスト
、及び樹状細胞、好ましくはPDCの活性化因子から選択される、少なくとも1つの化合物の
組合わせを提供する。
本発明は、p75NTRシグナル伝達のアゴニスト、又はp75NTRシグナル伝達のアンタゴニス
ト、及び樹状細胞、好ましくはPDCの活性化因子、及び少なくとも1つの医薬として許容し
得る担体又は賦形剤から選択される、前記少なくとも1つの化合物の組合わせを含む医薬
組成物を、さらに提供する。
前記組合わせを含む医薬組成物は、好ましくはワクチン組成物である。
前記樹状細胞、好ましくはPDCの活性化因子は、好ましくはTLR受容体アゴニストであり
、最も好ましくはTLR7又はTLR9について選択されるアゴニストである。
p75NTRシグナル伝達のアゴニスト、又はp75NTRシグナル伝達のアンタゴニスト、及び樹
状細胞、好ましくはPDCの活性化因子から選択される少なくとも1つの化合物の組合わせ、
並びに前記組合わせを含む医薬組成物は、免疫療法、例えば癌及び感染症の治療における
使用に特に適している。より好ましくは、前記組合わせ又は前記組合わせを含む医薬組成
物は、アレルギー性疾患又はアレルギー脱感作の治療における使用に適する。さらに好ま
しくは、前記組合わせ又は前記組合わせを含む医薬組成物は、自己免疫性疾患、慢性炎症
性疾患、GvHDの治療における使用、又は移植片の機能不全を回避するための移植後の使用
に適当である。
さらに好ましい実施態様において、p75NTRシグナル伝達のアンタゴニスト又はアゴニス
トを使用して、これに限定はされないが、移植片対白血病効果（GvL）を含む状態を誘導
することができる。GvL又は移植片対腫瘍効果（GvT）は、移植片対宿主病の有益な態様で
ある。GvLは主にゆっくりと進行する疾患、例えば慢性白血病、低悪性度リンパ腫、及び
一部の事例では多発性骨髄腫において有益である。
本発明のこの態様における使用に適当な医薬組成物には、疾患の1つに関する意図され
た目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む組成物がある。治療上有効な用量の決定
は、当業者の能力の範囲内で十分になされ、最初は細胞培養アッセイ、例えば新生物細胞
のアッセイ、又は動物モデル、通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、又はブタに
おいて評価することができる。また、動物モデルは適当な濃度範囲及び投与経路を決定す
るために使用することができる。続いて、一般にこの情報を使用して、人における有用な
用量及び投与経路が決定される。
治療上有効な用量とは、疾患の特定の症状又は状態を改善する活性成分、例えばp75NTR
に対する抗体、又はp75NTRのアゴニスト、アンタゴニスト若しくは阻害剤の量を指す。例
えば、投与される量は、p75NTRの活性を阻害するのに有効となり得る。治療効果及び毒性
は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬上の手順により、例えばED50統計量（集
団の50％において治療上有効となる用量）又はLD50統計量（集団の50％が死に致る用量）
の計算により、同様に決定することができる。毒性の治療効果に対する用量比は治療指数
であり、この比はLD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成
物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から取得されるデータを、ヒトに使用する
投薬量範囲の処方において使用する。そのような組成物に含まれる投薬量は、毒性がほと
んどないか全くないED50を含む循環濃度の範囲内であるのが好ましい。投薬量は、利用さ
れる投薬形態、患者の感受性、及び投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与方法は通常、治療を要求する対象に関する因子に照らして医療従事者により
決定されるものとし、投薬方法及び投与は十分なレベルの活性部分を提供し、又は所望の
効果を維持するように調整される。考慮されるべき因子には、疾患状況の重篤度、全般的
な対象の健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間と頻度、薬物の組合
わせ（複数可）、反応の感受性、及び治療への忍容性/奏効がある。長く作用する医薬組
成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて3〜4日ごとに、毎週、又は2
週間ごとに1回の頻度ですら、投与され得る。
好ましい実施態様において、本発明はp75NTRシグナル伝達に関する、好ましくは免疫疾
患の疾患又は病理的状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、医薬
として有効な量のp75NTRアゴニスト又はp75NTRアンタゴニスト、又はこれらを含む医薬組
成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
同様に、本発明はそのような治療方法における、p75NTRアゴニスト又はp75NTRアンタゴ
ニストの使用、又はこれらを含む医薬組成物の使用を提供する。
さらに、p75NTRアゴニスト若しくはp75NTRアンタゴニスト、又はこれらを含む医薬組成
物は、p75NTRシグナル伝達に関する疾患又は病理的状態の治療における使用のために提供
される。
さらなる好ましい実施態様において、p75NTRシグナル伝達に関する疾患又は病理的状態
は、中枢性及び末梢性神経変性疾患、老人性認知症、てんかん、アルツハイマー病、パー
キンソン病、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、プリオン病、健忘症、統合失調症、鬱
、双極性障害、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、心血管病態、虚血後心損傷、心筋症
、心筋梗塞、心不全、心虚血、脳梗塞、末梢神経障害、視神経及び/又は網膜の損傷、網
膜色素変性、緑内症、網膜虚血、黄斑変性症、脊髄外傷、頭部外傷、アテローム性動脈硬
化、狭窄、創傷治癒の障害、脱毛症、あらゆる種類の癌、あらゆる種類の腫瘍、あらゆる
種類の腫瘍転移、あらゆる種類の白血病、呼吸障害、肺炎症、アレルギー、アナフィラキ
シー、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、皮膚の疼痛、体性痛、内臓痛、神経
痛、慢性神経障害性疼痛、炎症痛、自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎（多発性関節炎、
少関節炎）、強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis）、膠原病、全身性エリテマトーデ
ス（SLE）、シャープ症候群、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、進
行性全身性硬化症、脊椎関節炎（強直性脊椎炎（Morbus Bechterew）、反応性関節炎、腸
炎性関節炎、乾癬性関節炎、未分化型脊椎関節炎）、リウマチ熱、アイカルディ・グティ
エール症候群、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、腎炎、卒中、潰瘍性大腸炎、クローン病、
ウィップル病、強皮症、スティル病（Stills disease）、気管支肺異形成症（BPD）、細
気管支炎、RSV関連細気管支炎、糖尿病、線維筋痛症候群、セリアック病、橋本病、甲状
腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、移植片対宿主病 （GVHD）、自己免疫性
血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、ロフグレン症候群、ベーチェット病、ネフローゼ
症候群、ブドウ膜炎、乾癬性関節炎、乾癬（尋常性乾癬、濃疱性乾癬）、骨折、骨疾患、
骨粗鬆症、及び全ての細菌、真菌、ウイルス感染性疾患、さらに真核寄生生物による感染
からなる群から選択される。
さらに好ましい実施態様において、本発明は対象におけるp75NTRシグナル伝達に関する
疾患又は病理的状態に対する治療の有効性をモニタリングする方法であって：
・該対象から2以上の機会に採取される試料中のT細胞の活性化、例えばT細胞のサイト
カイン発現、T細胞の増殖、抗原特異的T細胞クローンの誘導、細胞傷害性T細胞の誘導、
及び/又は制御性T細胞の誘導を測定する工程；並びに
・該対象から採取された試料中のT細胞サイトカイン、増殖したT細胞、抗原特異的T細
胞クローン、細胞傷害性T細胞及び/又は制御性T細胞の誘導のレベルを、治療の開始前に
該対象から採取された試料中に存在するレベル、及び/又は治療のより早期段階で該対象
から採取された試料中に存在するレベルと比較する工程、を含む、前記方法を提供する。
試料は、対象の余命にわたって、又はその一部にわたって、間隔を置いて採取すること
ができる。すなわち、治療の有効性をモニタリングするための生物学的試料は、2以上の
機会に採取することができる。好適には、診断又はモニタリングを受ける対象からの試料
の採取の間に経過する時間は、3日、5日、1週間、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6又は12
ヶ月とする。試料は、抗増殖性疾患治療、例えば化学療法の前、及び/又は間、及び/又は
後に採取することができる。好ましい実施態様において、モニタリング法は、2以上の機
会に採取された試料におけるT細胞サイトカインの量、増殖したT細胞、抗原特異的T細胞
クローン、細胞傷害性T細胞及び/又は制御性T細胞の誘導の変化を検出することを含む。
DC、最も好ましくはPDC上のp75NTRは、免疫反応の調節におけるマスタースイッチとし
て機能するようである。免疫反応の調節は、ワクチン用アジュバントの主要な機能である
。従って、p75NTRのアゴニスト及びアンタゴニストは、新規アジュバントのための手段を
提供する。
PDC、最も好ましくはTLR7又はTLR9が活性化されたPDC上のp75NTRの活性化は、Th2免疫
反応を強く誘導する。従って、アゴニストはTh2依存的なワクチンにおける免疫反応をブ
ーストさせ得る。対象となる免疫反応はアルミニウム塩と同様であるが、局所的炎症を誘
導することなく働く。p75NTRアゴニストを使用して、現在のワクチン用アジュバントと置
き換えることができ、又は組合わせて使用することでさらにワクチン反応をブーストする
ことができる。
このように、さらなる実施態様において、本発明はp75NTRシグナル伝達の調節因子、す
なわちp75NTRシグナル伝達のアゴニスト又はアンタゴニストを含むワクチン組成物に関す
る。好ましくは、p75NTRシグナル伝達はp75NTRを発現する樹状細胞、最も好ましくはp75N
TRを発現するPDCにおいて調節される。
好ましい実施態様において、本発明は免疫反応を調節するためのp75NTRアゴニストを含
むワクチン組成物の使用であって、これらに限定はされないが、Th2免疫反応の刺激、Th1
免疫反応の抑制、Th17免疫反応の抑制、制御性T細胞により誘導される寛容性の抑制など
を含む、前記使用を提供する。
本発明のワクチン組成物における使用に好ましいp75NTRアゴニストはNGF、BDNF、NT-3
、NT-4、NT-5などを含む群から選択される。
本発明のワクチン組成物における使用に適当な、さらに好ましいp75NTRアゴニストは、
活性化抗体、例えば抗p75NTR抗体MC192（Kimpinskiらの文献、Neurosci 1999, 93:253-26
3）、活性化ペプチド、及び活性化低分子（例えば、LM11A-24カフェイン又はLM11A-31イ
ソロイシン、LM11A-36を含むがこれらに限定されないLM11A及び誘導体化合物）から選択
されるか、又は核酸によりコードされる。
さらに好ましい実施態様において、本発明はワクチン組成物の使用であって、Th2免疫
反応の抑制、Th1免疫反応の刺激、Th17免疫反応の刺激、制御性T細胞により誘導される寛
容性の抑制などを含むがこれらに限定はされない、免疫反応の調節のためのp75NTRアンタ
ゴニストを含む、前記使用を提供する。
本発明のワクチン組成物における使用のための好ましいp75NTRアンタゴニストは、プロ
NGF、プロBDNF、プロNT-3、プロNT-4、プロNT-5などを含む群から選択される。
本発明のワクチン組成物における使用に適当なさらに好ましいp75NTRアンタゴニストは
、遮断抗体（抗ヒトp75NTRモノクローナル抗体クローン：ME20.4、ME24.1、MLR-1、MLR2
、MLR3、HB-8737、NGFR5、並びにこれらの誘導体及びヒト化型；抗マウスp75NTRモノクロ
ーナル抗体：REX、AB1554；ニューロトロフィンのp75NTRへの結合を妨げる抗体：MAb 911
、MAb 912、及びMAb 938、並びにMAb 911のヒト化型であるタネズマブ、PG110、REGN475
、フルラヌマブ、MEDI-578を含むこれらの誘導体及びヒト化型）、遮断ペプチド（PEP5、
tat-PEP5、C30-35；）、遮断タンパク質（ニューロトロフィンのp75NTRへの結合を妨げる
タンパク質：p75NTRの細胞外ドメイン）、並びに低分子阻害剤（2-オキソ-アルキル-1-ピ
ペラジン-2-オンの誘導体；ニューロトロフィンのp75NTRへの結合を妨げる低分子：PD 90
780、ALE-0540、Ro 08-2750、Y1036）から選択されるか、又は核酸、例えばshRNA、siRNA
、若しくはRNAiによりコードされる。
好ましい遮断ペプチドは、TRAF6のp75NTRの細胞内ドメインへの結合を特異的に阻害す
る（p75NTRの細胞内ドメインに由来するタンパク質モチーフ
Figure 0006876746
 へのペプチドの結合を含むTRAF6と、p75NTRとの相互作用を遮断するペプチド、及び
Figure 0006876746
 を含む、TRAF6デコイペプチド。）。
本発明のワクチン組成物は、例えばモノホスホリル脂質A（MPL）及びその合成誘導体、
ムラミルジペプチド（MDP）及びその誘導体、オリゴデオキシヌクレオチド（例えばCpGな
ど）、二本鎖RNA（dsRNA）、別の病原体関連分子パターン（PAMP、例えば大腸菌（E. col
i）熱不安定性エンテロトキシン（LT）；フラジェリン）、サポニン（Quil、QS-21）、低
分子免疫増強剤（SMIP、例えばレシキモド[R848]）、サイトカイン、ケモカイン、及び結
核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来の抗原から選択される免疫刺激剤と組合わせた
、p75NTRシグナル伝達の調節因子をさらに含むことができる。
本発明のワクチン組成物は、不溶性アルミニウム化合物、リン酸カルシウム、リポソー
ム、Virosomes（登録商標）、ISCOMS（登録商標）、ミクロ粒子（例えば、PLGA）、乳剤
（例えば、MF59、モンタニド）、ウイルス様粒子、及びウイルスベクターと組合わせた、
p75NTRシグナル伝達の調節因子をさらに含むことができる。
本発明のワクチン組成物は、単離樹状細胞、好ましくは単離PDC、最も好ましくはp75NT
Rを発現する単離樹状細胞又はPDCをさらに含むことができる。好ましい実施態様において
、単離樹状細胞は、対象へのワクチン組成物の投与の前に、少なくとも1つのp75NTRシグ
ナル伝達調節因子と共にエクスビボでインキュベートされる。
本発明の好ましい実施態様において、少なくとも1つのp75NTRアゴニストを使用して、
前記単離樹状細胞、好ましくは単離PDCを前処理し、Th2免疫反応の刺激、Th1免疫反応の
抑制、Th17免疫反応の抑制、及び制御性T細胞により誘導される寛容性の抑制を含むがこ
れらに限定はされない、免疫反応を調節する。
本発明のさらに好ましい実施態様において、少なくとも1つのp75NTRアンタゴニストを
使用して前記単離樹状細胞、好ましくは単離PDCを前処理し、Th2免疫反応の抑制、Th1免
疫反応の刺激、Th17免疫反応の刺激、及び制御性T細胞により誘導される寛容性の抑制を
含むがこれらに限定はされない、免疫反応を調節する。
アゴニスト又はアンタゴニストがshRNA又はsiRNAのような核酸によりコードされている
場合、前記核酸は好ましくは樹状細胞に、好ましくはPDCに形質移入され、該樹状細胞に
おける該アゴニスト又はアンタゴニストの過剰発現をもたらす。
さらに好ましい実施態様において、ワクチン組成物はNGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5を
含む群から選択されるp75NTRシグナル伝達のアゴニスト、又はプロNGF、プロBDNF、プロN
T-3、プロNT-4、プロNT-5を含む群から選択されるp75NTRシグナル伝達のアンタゴニスト
を含む。
本発明のワクチンにおける使用、及び/又は本発明による治療法、好ましくは免疫療法
における使用に適当なp75NTRシグナル伝達のアンタゴニストの例は：
○抗ヒトp75NTRモノクローナル抗体、例えばクローンME20.4、ME24.1、MLR-1、MLR2、M
LR3、HB-8737、NGFR5、上記抗体の誘導体及びヒト化型；
○抗マウスp75NTRモノクローナル抗体、例えばREX、AB1554；
○ペプチド又はペプチド誘導体、例えばPEP5、tat-PEP5、C30-35、p75NTRの細胞内ドメ
インに由来するタンパク質モチーフ
Figure 0006876746
 へのペプチドの結合を含むTRAF6と、p75NTRとの相互作用を遮断するペプチド、及び
Figure 0006876746
 を含む、TRAF6デコイペプチド；
○低分子、例えば2-オキソ-アルキル-l-ピペラジン-2-オンの誘導体、ナフタルイミド
の誘導体；
○p75NTRの発現又は下流のシグナル伝達を遮断するsiRNA、shRNA、モルホリノ；
○p75NTRシグナル伝達を阻害するペプチド又はタンパク質をコードする核酸；
○NGF又はBDNFのp75NTRへの結合を妨げるニューロトロフィンアンタゴニスト、例えば
：
・抗体：MAb 911、MAb 912、及びMAb 938、並びにタネズマブ (MAb 911のヒト化型
)、PG110、REGN475、フルラヌマブ、及びMEDI-578を含む上記抗体の誘導体及びヒト化型
；
・タンパク質又はペプチド、例えばp75NTR細胞外ドメイン；
・低分子、例えばPD 90780、ALE-0540、Ro 08-2750、及びY1036、
を含む群から選択される。
本発明のワクチンにおける使用、及び/又は本発明による治療法、好ましくは免疫療法
における使用に適当なTLR7及び/又はTLR9のアゴニストの例は：
○ ・TLR7アゴニスト、例えば一本鎖RNA、CL075、CL097、CL264、CL307、ガーディキ
モド、イミキモド、ロキソリビン、ポリ(dT)、及びR848；
・TLR9アゴニスト、例えば：
・CPG-ODNクラスA、例えばODN 1585、ODN 2216、ODN 2336；
・CPG-ODNクラスB、例えばODN BW006、ODN D-SL01 ODN 1668; ODN 1826、ODN
2006、ODN 2007；
・CPG-ODNクラスC、例えばODN D-SL03、ODN 2395、ODN M362；
を含むToll様受容体の特異的活性化因子；
○生又は弱毒ウイルス、細菌、寄生生物；
○ウイルス、細菌、又は寄生生物の抽出物、
を含む群から選択される。
本発明のワクチンにおける使用、及び/又は本発明による治療法、好ましくは免疫療法
における使用に適当なp75NTRシグナル伝達のアゴニストの例は：
○ニューロトロフィン、例えばNGF、NGF-δ 9/13変異体、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5、プ
ロNGF、プロBDNF、プロNT-3、プロNT-4、プロNT-5；
○ニューロトロフィンに由来するペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド；
○低分子、例えばLM11A及びLM11A-24カフェイン又はLM11A-31イソロイシンを含むがこ
れらに限定はされない、誘導体化合物；
○p75NTR、構成的に活性化したp75NTR、又はそれらの断片をコードする核酸、
を含む群から選択される。
（2. 細胞ベースのアッセイ）
本発明は神経成長因子受容体p75NTRを発現する非ヒト動物、又はヒト又は動物初代細胞
又は細胞株を含む細胞ベースのアッセイであって、前記細胞又は細胞株へのp75NTRシグナ
ル伝達の作動性又は拮抗性の作用が測定されることを特徴とする、前記アッセイを提供す
る。
好ましい実施態様において、本発明は神経成長因子受容体p75NTR、及び/又はTLR9、TLR
7、TRAF3、及びTRAF6からなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質、並びにMyD8
8、IRAK1〜4、IRF3、IRF7を含むがこれらに限定はされない、Toll様受容体経路のシグナ
ル伝達分子を発現する非ヒト動物、又はヒト又は動物初代細胞又は細胞株を含む細胞ベー
スのアッセイであって、前記細胞又は細胞株へのp75NTRシグナル伝達の作動性又は拮抗性
の作用が測定される、前記アッセイを提供する。
好適には、本発明のアッセイで使用される初代細胞は、PDCである。さらに好適には、
本発明のアッセイに使用される細胞株はPDCに由来し、又はPDCの特性と類似している。好
ましい実施態様において、本発明のアッセイにおいては非ヒト動物、トランスジェニック
の細胞又は細胞株が存在し、これらはp75NTR及び/又はToll様受容体TLR7及び/若しくはTL
R9を過剰発現するように遺伝子操作され、又はsiRNA、shRNA、モルホリノ、若しくは改変
されたゲノムDNAを用いてこれらの低下した発現を引き出すように操作されている。
PDCはそれ自体の細胞集団を表し、特定の機能を有する。PDCは異なる細胞表面マーカー
及びTLRファミリーの受容体により、従来の樹状細胞及び単球又はGM-CSFで処理された骨
髄から分化した樹状細胞と、明白に、かつ間違えようがなく区別できる。ヒトPDCはBDCA-
2、BDCA-4、CD45RA、及びCD123を発現する。マウスPDCはm-PDCA-1、CD45RA、Ly-6C、及び
Siglec-Hを発現する。さらに、両種のPDCはToll様受容体TLR7及びTLR9を発現する。対照
的に、従来のヒト樹状細胞（CDC）はBDCA-1及びBDCA-3を発現するが、BDCA-2及びBDCA-4
を発現しない。さらに、CDCはTLR 2及びTLR4を発現するが、TLR7及びTLR9を発現しない。
単球から分化した樹状細胞（moDC）はCD16、CD11c、CD11b、及びCD209（マウス）の発現
を示すが、このことはPDCとは区別できる。さらに、moDCはTLR3及びTLR4を発現するが、T
LR7及びTLR9を発現しない。
PDCにおけるp75NTRの発現及び活動は、疾患表現形の原因となる一方、他の種類の樹状
細胞、例えばCDC及びmoDCは、該疾患表現形に関与しないことが、様々な炎症性疾患の動
物モデルにおいて、示されている。
さらに、p75NTRのリガンドによって引き起こされる反応は、CDC及びmoDCと比較して、P
DCにおいて異なっている。CDC及びmoDCは、Th1型のT細胞の活性化及び分極化を誘導する
のに対し、PDCはTh2型のT細胞の活性化及び分極化を誘導する。後者は本明細書で初めて
記述される。
本発明は、p75NTRシグナル伝達に作動性又は拮抗性作用を及ぼす物質のスクリーニング
方法における細胞ベースのアッセイの使用をさらに提供する。
さらなる実施態様において、本発明はp75NTRシグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニ
ストのスクリーニング方法を提供する。
好ましい実施態様において、本発明はp75NTRシグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニ
ストをスクリーニングする方法であって：
・神経成長因子受容体p75NTRを発現する、ヒト又は動物初代細胞又は細胞株を、試験物
質と接触させる工程；
・接触させた前記ヒト又は動物初代細胞又は細胞株を、p75NTRシグナル伝達をもたらす
のに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
・該初代細胞又は細胞株に対する、該試験物質の作用を決定する工程；
・接触させた該初代細胞又は細胞株における該試験物質の作用を、対照細胞における作
用と比較する工程；及び
・p75NTRシグナル伝達を作動させ、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択する
工程、
を含む、前記方法を提供する。
好適には、該対照細胞又は細胞株は、初代細胞、最も好適にはPDCである。
神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動物初代細胞又は細胞株を試験物質と接
触させる工程は、好ましくは該試験物質とp75NTRタンパク質との相互作用を可能とする条
件下で実施される。さらに好ましくは、神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動
物初代細胞又は細胞株を試験物質と接触させる工程は、該試験物質とp75NTRタンパク質と
の相互作用、及び/又は該試験物質とp75NTRシグナル伝達経路の上流又は下流の因子との
相互作用を可能とする条件下で実施することができる。
対照細胞は、好ましくは試験薬剤と接触させていない細胞又は細胞株である。
より好ましくは、対照細胞はp75NTRを発現しない、又は低下した量のp75NTRを発現する
細胞又は細胞株である。p75NTRを発現しない、又は低下した量のp75NTRを発現する前記対
照細胞又は細胞株は、任意に該試験物質と接触させることができる。
さらなる実施態様において、該初代細胞又は細胞株は、本発明のアッセイ及びスクリー
ニング方法におけるそれらの使用の前又は間に、前もって活性化される。該初代細胞及び
細胞株の事前の活性化における使用に適当なのは、TLR7又はTLR9シグナル伝達のアゴニス
トである。TLR7又はTLR9シグナル伝達の好ましいアゴニストは、例えば一本鎖RNA、CPGオ
リゴデオキシヌクレオチド、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、ヌクレオシド類
似体、ウイルス又は細菌調製物などである。TLR7のアゴニストのさらに適当な例は、TLR7
アゴニスト：一本鎖RNA、CL075、CL097、CL264、CL307、ガーディキモド、イミキモド、
ロキソリビン、ポリ(dT)、及びR848を含む。TLR9のアゴニストのさらに適当な例は、TLR9
アゴニストであるCpG-ODNクラスA、例えばODN 1585、ODN 2216、ODN 2336; CpG-ODNクラ
スB、例えばODN BW006、ODN D-SL01 ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、及びCpG
-ODNクラスC、例えばODN D-SL03、ODN 2395、ODN M362を含む。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法において使用される試験物質は、天然
のp75NTRアゴニスト、例えば神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニュ
ーロトロフィン-3（NT-3）、ニューロトロフィン-4（NT-4）、又はニューロトロフィン-5
（NT-5）、又はこれらの組合わせとすることができる。
また、本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法において使用される試験物質は
、天然のp75NTRアゴニストの前駆物質、例えばプロNGF、プロBDNF、プロNT-3、プロNT-4
、プロNT5、又はこれらの組合わせとすることができる。
該方法は、天然のp75NTRのリガンド、例えばp75NTRアゴニスト又はp75NTRアンタゴニス
トの存在下でも非存在下でも、実施することができる。該方法が天然のp75NTRのリガンド
の存在下で実施される場合、該方法は、好適には、該物質とp75NTRタンパク質との相互作
用、又は該試験物質と前記天然のp75NTRのリガンドとの相互作用を可能とする条件下で実
施される。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけるp75NTRシグナル伝達に対する
該試験物質の拮抗性又は作動性作用は、サイトカインの発現分析に基づいて測定すること
ができる。本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法における発現分析に適当なサ
イトカインは、例えばインターフェロンα（IFNα）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インタ
ーロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、イ
ンターロイキン-13（IL-13）、及び他のサイトカインを含む。観察されるNGFの作用と同
様に、アゴニストはTh1サイトカインIFNαの発現を阻害することが期待され、一方Th2サ
イトカインIL-4、IL-5、IL-6、IL-13、及びTNFαの発現は増加する。アンタゴニストはニ
ューロトロフィンの記述された作動性作用を阻害することが期待され、ここで、該ニュー
ロトロフィンは試験細胞による自己分泌生産に由来のものとすることもできるし、又は外
部から補充されたものとすることもできる。アンタゴニストはIFNαの強い誘導及び炎症
性Th2サイトカイン、例えばIL-4、IL-5、IL-6、IL-13、及びTNFαの抑制された、又は低
下した発現によりサイトカイン生産をTh1プロファイルへと転じることが期待される。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけるp75NTRシグナル伝達に対する
該試験物質の拮抗性又は作動性作用は、細胞内シグナル伝達カスケード、例えばそのタン
パク質を発現レベル、及びその活性化、例えばリン酸化について分析することに基づいて
さらに測定することができる。本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法における
分析のための適当な細胞内シグナル伝達カスケードは、例えばこれらに限定はされないが
、TNF受容体関連因子（TRAF）3及び6の活性化、NF-κB必須調節因子（NEMO）の活性化、I
κBキナーゼ（IKK）の活性化、インターフェロン調節因子（IRF）3及び7の活性化、NF-κ
B（活性化B細胞の核因子「κ-軽鎖エンハンサー」）の活性化などを含む。観察されるNGF
の作用と同様に、アゴニストはIRF3及びIRF7の活性化を阻害することが期待され、一方IK
K及びNFκ（古典的及び非古典的経路）は活性化される。アンタゴニストはニューロトロ
フィンの記述された作動性作用を阻害するであろう。ここで、該ニューロトロフィンは試
験細胞による自己分泌生産に由来のものとすることもできるし、又は外部から補充された
ものとすることもできる。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけるp75NTRシグナル伝達に対する
該試験物質の拮抗性又は作動性作用は、表面マーカー及び細胞内マーカーの発現に基づい
てさらに決定することができる。本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけ
るヒト又はマウス細胞の発現分析に適当な表面マーカーは、例えば主要組織適合性複合体
タンパク質クラスI（MHC-I）及び/又はクラスII（MHC-II）、CD80、CD83、CD86、血液樹
状細胞抗原（BDCA）2及び4、インターロイキン-3受容体α（CD 123）、TLR7、TLR9などを
含む。NGFについて観察された作用に基づけば、Th1反応を促進する環境において、アゴニ
ストは細胞表面上のMHC分子の上方調節を阻害することが期待され、Th2反応を促進する環
境においては、アゴニストはMHC分子の表面発現を増加させることが期待される。アンタ
ゴニストはニューロトロフィンの記述された作動性作用を阻害するであろう。ここで、該
ニューロトロフィンは試験細胞による自己分泌生産に由来のものとすることもできるし、
又は外部から補充されたものとすることもできる。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけるp75NTRシグナル伝達に対する
該試験物質の拮抗性又は作動性作用は、外来抗原の取り込み、細胞内プロセシング、及び
提示の測定に基づいてさらに決定することができる。本発明のアッセイ及び/又はスクリ
ーニング方法における分析のために適当な外来抗原は、例えばCpGオリゴデオキシヌクレ
オチド、イミクオド（Imiquod）、オボアルブミン、ウイルス調製物、細菌調製物、人工
ペプチド又はタンパク質精製物などを含む。アゴニストはPDCによる外来抗原の増加した
取り込み、並びにMHC-I及び-II分子上でのエフェクター細胞への増加した抗原エピトープ
提示をもたらし、その結果エフェクター細胞反応が強化される。アンタゴニストは低下し
た抗原取り込み及び抗原提示をもたらし、従ってエフェクター細胞反応を制限する。
（3. T細胞とのコインキュベーション）
また、p75NTRを発現し、本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法において使用
される初代細胞又は細胞株は、細胞性免疫反応において中心的役割を果たす他の細胞とコ
インキュベートすることができる。前記コインキュベーションにおける使用に好ましいの
は、T細胞である。
好ましい実施態様において、本発明はp75NTRシグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニ
ストのスクリーニング方法であって：
・T細胞とコインキュベートされた、神経成長因子受容体p75NTRを発現する、ヒト又は
動物初代細胞又は細胞株を、試験物質と接触させる工程；
・前記ヒト又は動物初代細胞又は細胞株、及び前記T細胞の前記接触させた共培養物を
、p75NTRシグナル伝達をもたらすのに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
・該初代細胞又は細胞株、及び/又はT細胞に対する、該試験物質の作用を決定する工程
；
・接触させた該初代細胞又は細胞株、及び/又はT細胞における該試験物質の作用を、対
照細胞における作用と比較する工程；並びに
・p75NTRシグナル伝達を作動させ、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択する
工程、を含む、前記方法を提供する。
該方法は天然のp75NTRのリガンド、例えばp75NTRアゴニスト又はp75NTRアンタゴニスト
の存在下、又は非存在下で実施することができる。該方法が天然のp75NTRのリガンドの存
在下で実施される場合、該方法は、好適には、該物質とp75NTRタンパク質との相互作用、
又は該試験物質と前記天然のp75NTRのリガンドとの相互作用を可能とする条件下で実施さ
れる。
神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動物初代細胞又は細胞株を試験物質と接
触させる工程は、好ましくは該試験物質とp75NTRタンパク質との相互作用を可能とする条
件下で実施される。さらに好ましくは、神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動
物初代細胞又は細胞株を試験物質と接触させる工程は、該試験物質とp75NTRタンパク質と
の相互作用、及び/又は該試験物質とp75NTRシグナル伝達経路の上流又は下流の因子との
相互作用を可能とする条件下で実施することができる。
対照細胞は、好ましくは試験薬剤と接触させていない細胞又は細胞株である。
好ましい実施態様において、天然にはp75NTRを発現しない対照細胞が使用される。これ
により、p75NTRシグナル伝達に対する該試験物質の作用を、直接的かつ明白に標的p75NTR
に帰することが可能となる。さらに、該試験物質の他の標的に対して可能性のある副作用
を認識することができる。従って、特異性が高く、望ましくない副作用のないp75NTRシグ
ナル伝達の作動性又は拮抗性作用を示す試験薬剤を、スクリーニングし、さらなる開発の
ために選択することができる。
さらなる実施態様において、p75NTRがノックアウト又はノックダウンされたPDCは、対
照細胞として使用される。同様に、対照細胞におけるp75NTRのレベルは別途低下させるこ
とができる。本発明によるさらに適当なものは、p75NTRの発現が低下した、又は阻害され
たPDCの対照細胞としての使用である。
天然にはp75NTRを発現しないか、p75NTRがノックアウト又はノックダウンされている前
記対照細胞又は細胞株は、任意に該試験物質と接触させることができる。
本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法におけるp75NTRシグナル伝達に対する
該試験物質の拮抗性又は作動性作用は、単独で、又は先に記載のパラメータに追加してコ
インキュベートされたT細胞の刺激に基づいてさらに決定できる。T細胞の活性化は、好適
にはT細胞サイトカイン、例えば例として、ケモカイン、インターフェロン、インターロ
イキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子の発現; T細胞の増殖; 抗原特異的T細胞クロー
ンの誘導、及び/又は制御性T細胞の誘導の決定によって検出できる。
T細胞の増殖は、実施例4において本明細書に記載した通りに測定することができる。
抗原特異的T細胞クローンの誘導は、その特定のサイトカイン分泌又はその増殖により
測定することができる。抗原との接触、すなわち抗原提示細胞（すなわち、DC）との共培
養に際し、T細胞クローンはあるパターンのサイトカインを分泌する。具体的なサイトカ
インは、Th1反応についてはIFNγ及びIL-2、Th2反応についてはIL-4、IL-5、及びIL-13、
Th17反応についてはIL-17、IL-21、及びIL-22、並びに制御性T細胞についてはIL-9、IL-1
0、及びTGFβである。T細胞のサイトカイン分泌は、ELISA、サイトメトリックビーズアレ
イ（CBA）、又はELISPOT分析により測定することができる。T細胞の増殖は、T細胞に組み
込まれた蛍光色素（すなわち、CFSE）の強度の定量化及びフローサイトメトリーを用いた
T細胞の増殖の間のその強度の消失により測定することができる。
制御性T細胞の誘導は、PDCとの共培養アッセイにより決定することができる（Gehrieら
の文献、Methods Mol Biol, 2011）。簡潔に説明すると、ナイーブT細胞を、マウス脾臓
又はヒト末梢血液から、磁気ビーズ分離により単離した（CD4+CD25-）。T細胞を抗CD3 mA
b （150 ng/mL）、10 ng/mL IL-2、及び10 ng/mL TGFβの存在下、PDCと共培養した。96
時間後、T細胞をCD4、CD25、及びFoxP3（細胞内）に対する抗体で染色し、活性化した制
御性T細胞の数を決定した。並行して、制御性T細胞のサイトカイン分泌（すなわち、IL-1
0）を上清におけるELISAにより測定することができる。
インビボでのp75NTRシグナル伝達に対する該試験物質の拮抗性又は作動性作用を調べる
ため、p75NTR及び/又はTLR7及び/又はTLR9の少なくとも1つを発現する初代細胞又は細胞
株を、動物モデルに投与することができる。該試験物質を、該初代細胞又は細胞株の投与
の前に、一緒に、又は後に、同じ動物に投与することができる。またさらに、該初代細胞
又は細胞株を、動物モデルへの投与の前にインビトロで該試験物質とプレインキュベート
することができる。
（4. 動物モデル）
本発明のさらなる実施態様において、p75NTR及び/又はTLR7及び/又はTLR9の少なくとも
1つを発現する初代細胞又は細胞株をインビボで使用することができ、すなわち免疫、炎
症性、又は増殖性疾患に特異的な動物モデルに投与することができる。適当な動物モデル
は、例えばOVAに誘導されるアレルギー性喘息モデル、アレルギー性疾患の他のモデル、
マウス又はラットにおけるEAEモデル、糖尿病モデル、SLEモデル、移植モデル、GvHDモデ
ル、腫瘍モデルなどから選択される。
適当なアレルギー性喘息モデルは、例えばBALB/c及びC57BL/6マウスである。BALB/cマ
ウスは典型的にはTh2優勢免疫反応を組織し、アレルギー反応のパラメータ、例えばアレ
ルゲン特異的IgE、気道過敏症（AHR）、及び好酸球性気道炎症の誘導が堅調である。反対
に、C57BL/6マウスはTh1優勢免疫反応を示し、BALB/cマウスと比較して、特にアレルゲン
特異的IgE反応及び吸入したメタコリンへの気道反応性の発達において、アレルギー性気
道反応の発達が制限される。驚くべきことに、アレルゲン、例えばオボアルブミン（OVA
）への曝露に反応し、C57BL/6マウスは堅調なBAL好酸球性反応を発達させ、組織において
は、気道の周囲よりも実質組織においてより多くの好酸球が蓄積する傾向を示す。このこ
とは、BALB/cマウスにおいて好酸球が気道の周囲に蓄積することと対照的である。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、ヒト炎症性脱髄性疾患、多発性硬化症（MS）に
ついて最も一般的に使用される実験モデルである。EAEは様々な免疫病理的及び神経病理
的機構間の相互作用によりMSの重要な病理特徴：炎症、脱髄、軸索消失、及び神経膠症へ
の接近をもたらす複雑な状態である。また、EAEにおいては炎症及び再ミエリン化を解決
する反調節機構も発生し、従ってこれらのプロセスのモデルとしても機能することができ
る。周知のインビボEAEモデルは、例えば完全フロイントアジュバント（CFA）中でのMOG3
5-55による免疫により、単相又は慢性の持続形態のEAEを誘導することができる、C57BL/6
マウスである。前者は、単核炎症性浸潤の多病巣性の融合性領域及び脊髄の周辺白質の脱
髄を特徴とする。マクロファージ及びCD4+ T細胞は、炎症性浸潤の主要な細胞種である。
他のEAEモデルは、SJL/Jマウス（PLP139-151での免疫）、ルイスラット（ミエリン塩基性
タンパク質（MBP）により誘導される能動的及び受動的EAE又はMBP特異的T細胞の移転）、
及びダーク・アゴウチ（Dark Agouti）（DA）ラット（同一遺伝子型の脊髄組織又は組換
えラットMOGを使用して、EAEを誘導することができる）である。
本発明の特別な関心対象は、免疫仲介性糖尿病（1A型）の動物モデルである。自然発症
1型糖尿病感受性モデルには、非肥満型糖尿病（NOD）マウス、生体繁殖糖尿病易発性（BB
-DP）ラット、ロングエバンストクシマやせ型ラット（Long-Evans Tokushima Lean rat）
Lew.1.WR1のコメダ糖尿病易発性（Komeda Diabetes-Prone）（KDP）亜系統、及びLew.1AR
1/Ztmラットがある。1) 天然に存在する糖尿病誘発性クローンのT細胞受容体（TCR）を有
するT細胞受容体トランスジェニック（Tg）マウス及びレトロジェニックマウス、2) 自己
免疫の標的とすることができるneo自己抗原の膵臓発現を確立するための、ラットインス
リンプロモーター（RIP）制御下のneo抗原（Ag）の発現、並びに3) β細胞上でのRIPによ
り駆動される共刺激性分子の発現を含む、複数の実験的に誘発された1型糖尿病のモデル
が、利用可能である。推定島自己抗原のノックアウトを有するマウスにより、特定の標的
分子の病理的意義を直接試験することが可能となった。ヒトにおける1型糖尿病と関連す
る遺伝子（FoxP3及びAIRE）の変異（常染色体優性の「ヒト」AIRE変異を含む）を有する
マウス系統が、研究下にある。
全身性エリテマトーデス（SLE）は、複数の器官系を冒す自己免疫性疾患である。SLEは
B細胞及びT細胞の1以上の自己抗原に対する寛容性の消失を特徴とし、多体系的炎症をも
たらす。自然発症する疾患を発症する、最も一般的に使用されるマウス系統には、ニュー
ジーランドブラック及びニュージーランドホワイトの間のF1交雑（NZB/W）マウス、MRL/l
prマウス、及びBXSB/Yaaマウスがある。これら3系統におけるSLEの一般的な免疫学的及び
臨床徴候には、活動亢進性B細胞及びT細胞（その存在及び相互間の相互作用が疾患に要求
される）、核抗原を標的化するいくつかの自己抗体の高力価、免疫複合体の除去の欠陥、
並びに致死的な免疫糸球体腎炎がある。
成功裏の造血幹細胞移植（HSCT）を制限する因子は、移植片対宿主病（GvHD）、移植体
に含まれるドナーT細胞による、レシピエント組織の免疫仲介性攻撃に起因する移植後障
害である。GvHDの発症をもたらす一連の事象は、主としてマウスモデルを用いて定義され
ている。早期の研究により、T細胞の同種異系反応性が、疾患の根底にある原因であるこ
とが確立された（Korngold及びSprentの文献、1978; Sprentらの文献、1986）。GvHDの急
性及び慢性マウスモデルの両方の病理がT細胞の同種異系反応性に依存するが、各形態は
細胞傷害性（CD8+）又はヘルパー（CD4+）T細胞サブセットの異なる関与に起因する異な
る表現形を有する。ドナーCD8+ T細胞は、そのT細胞受容体（TCR）がレシピエントのクラ
スI主要組織適合性複合体（MHC）分子の状況下で存在するレシピエントのペプチドと結合
すると、活性化される。適当なインビボマウスモデルは、Schroeder M.A.及びDiPersio J
.F.の文献、「移植片対宿主病のマウスモデル：進歩と限界（Mouse models of graft-ver
sus-host disease: advances and limitations）」; Dis Model Mech. 2011 May;4(3):31
8-33で概説されている。
適当な腫瘍モデルは、皮膚癌モデル（B16メラノーマ）又は線維肉腫癌モデル（細胞株M
CA-102又はMCA-207）である。癌細胞株又は初代腫瘍細胞を注入した後、C57BL/6又はBALB
/cマウスは癌を発症する。T細胞及びDC、好ましくはPDCを、インビトロで腫瘍細胞溶解物
と共にインキュベートする。その後、T細胞を単独で、又はDCと組合わせて、癌細胞を有
するマウスに注入する。PDC免疫の有効性を、転移発達び細胞傷害性T細胞の発達及び活性
の定量化により測定する。他の腫瘍マウスモデルは、例えばB16-F10により誘導される転
移性肺癌モデル（Liuらの文献、JCI, 2008）、又はE.G7 T細胞リンパ腫モデル（Louらの
文献、J Immunol, 2007）である。両モデルにおいて、活性化されたPDCを、腫瘍を有する
（腫瘍細胞が事前に注入された）マウスに注入し、腫瘍細胞が適用される前に注入し、又
は両方を並行して注入した。数日後/数週間後、腫瘍の大きさを測定することができる。
適当な移植モデルは、マウスにおける同種異系器官移植、例えばDC、好ましくはPDCの
共移植を伴う皮膚及び心移植、骨髄移植である。例えば、レシピエントB10.BR又はBA.B10
マウスに、5.5 Gyの3時間の間隔を挟んだ2回の線量を第-2日に照射した。第0日に、レシ
ピエントマウスに3〜5×103個のFACSで選別したHSC、5×104個のFACSで選別したドナープ
レPDC、及び3×105個又は1×106個のMACSで精製したB6 CD45.1ドナー由来のT細胞の組合
わせを移植した。マウスを週に2回計量し、過去に記載された通りにGVHDの徴候を毎日調
べた。開始時の体重から25％超低下した瀕死の動物、及び実験終了時まで生存したマウス
を安楽死させ、肝臓、小腸、及び大腸を含む組織を腫瘍親和性（tumour-tropic）部位の
組織病理的分析のために処理した。フローサイトメトリーのキメラ現象分析を、移植後40
（±1）、60（±2）、及び90（±5）日に血液白血球に対し実施した（Lu Yらの文献、Blo
od. 2012 Jan 26;119(4): 1075-85）。さらに、BALB/cの心臓を完全に血管を形成させた
異所的移植片として、記載された通りにC57BL/6マウスに移植した。BALB/cの心臓移植片
を、ドナーの大動脈をC57BL/6レシピエントの下腹部大動脈に、ドナーの肺動脈をC57BL/6
レシピエントの下大静脈に、それぞれ末端-側面接合で縫合することにより移植した。レ
シピエントマウスに、様々な時間で0.5 ml PBSの静脈内注入を行った。寛容性のため、マ
ウスを第-7日にDST（1_107個のドナー脾臓細胞を、静脈内に）で、及び（移植に対する時
間で）第-7、-4、0、及び＋4日に250 mgのCD40Lに対するmAbで、処置した。寛容後30日に
100 mgのCD40Lに対するmAbを1つの群に与え、マウスは第37〜40日に拒絶反応を示した。
移植片の機能を、1日おきに、腹部触診によりモニタリングした。寛容性を示したマウス
を移植後第1、5、及び10週に試験した。10週以上の移植片の生存を有したマウスを、「寛
容性を示す」ものとみなした（本明細書では「10週の寛容性を示す」と呼ぶ）。未処置の
対照マウスには、PBS中のハムスターIgGを与えたところ、拒絶反応が、移植から1週後に
発生した。この拒絶反応は、触診可能な鼓動の完全な中止として定義し、開腹による直接
の視認により確認した（Qian Sらの文献、Hepatology. 1994 19:916-924.）。
さらなる好ましい実施態様において、p75NTR及び/又はTLR7及び/又はTLR9の少なくとも
1つを発現する初代細胞又は細胞株を、試験物質又はp75NTRアンタゴニスト及び/又はアゴ
ニストと、天然のp75NTRのアゴニスト又はその前駆物質の存在下又は非存在下でプレイン
キュベートする。天然のp75NTRのアゴニストは、例えば神経成長因子（NGF）、脳由来神
経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、ニューロトロフィン-4（NT-4）、
及びニューロトロフィン-5（NT-5）、又はこれらの組合わせである。天然のp75NTRのアゴ
ニストの前駆物質は、例えば、プロNGF、プロBDNF、プロNT-3、プロNT-4、プロNT-5、又
はこれらの組合わせである。
該試験物質は、任意の適当な経路で動物モデルに投与することができる。典型的な投与
は、経口的に、又は静脈内に実施される。
p75NTR及び/又はTLR7及び/又はTLR9の少なくとも1つを発現する初代細胞又は細胞株は
、典型的に動物モデルの血流内へ注入され、又は所望の器官若しくは組織に特異的に注入
される。
試験物質のインビボでの拮抗性又は作動性作用を決定するため、T細胞の活性化は、処
置された動物から取得された試料中のT細胞サイトカイン、例えば例として、ケモカイン
、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子の発現；T細
胞の増殖；抗原特異的T細胞クローンの誘導、及び/又は制御性T細胞の誘導の決定によっ
て検出できる。該試料は、好ましくは血液試料又は組織試料である。
好ましくは、前記試料及び/又は対照試料は、該動物モデルにおける該試験物質の作用
の決定の前に処置動物及び/又は該対照動物から既に取得されている。
試験物質の拮抗性又は作動性作用のインビボでの決定は、好ましくは対照動物の存在下
で実施される。より好ましくは、同じ種及び/又は同じ系統の動物を、対照動物として使
用する。最も好ましくは、少なくともPDCを含むが、該PDCではp75NTRが発現していないか
、又はより低いレベルで発現している動物を、対照動物として使用する。これにより、p7
5NTRシグナル伝達に対する該試験物質のインビボでの作用を、直接的かつ明白に標的p75N
TRに帰することが可能となる。さらに、該試験物質の他の標的に対して可能性のある副作
用を認識することができる。従って、特異性が高く、望ましくない副作用のないp75NTRシ
グナル伝達への作動性又は拮抗性作用を示す試験薬剤を、スクリーニングし、さらなる開
発のために選択することができる。
一実施態様において、少なくともPDCを含むが、該PDCではp75NTRがノックアウトされて
いる動物を、対照動物として使用する。
同様に、p75NTRのレベルも別途低下させることができる。本発明によりさらに適当なの
は、少なくともPDCを含むが、該PDCではp75NTRの発現が低下又は阻害されている動物の、
対照動物としての使用である。
適当な対照動物を提供するために、本発明の一実施態様において、天然にはp75NTRを発
現しない、又はp75NTR遺伝子がノックアウトされている、又はp75NTR遺伝子の発現が低下
若しくは阻害されている、PDCを該対照動物に投与する。別の実施態様において、投与さ
れるPDCにおいてのみでなく、該対照動物の内在の細胞においても、p75NTR遺伝子をノッ
クアウトしてもよく、又はp75NTR遺伝子の発現を低下若しくは阻害してもよい。
p75NTRの低下又は阻害は、例えばshRNA、siRNA、アンチセンスヌクレオチドなどを用い
て達成することができる。
低分子ヘアピンRNA又は短鎖ヘアピンRNA（shRNA）は、RNA干渉（RNAi）を通じて標的遺
伝子の発現をサイレンシングするために使用することができる堅く結ばれたヘアピンター
ンを形成するRNA配列である。細胞におけるshRNAの発現は、典型的にはプラスミドの送達
により、又はウイルス若しくは細菌のベクターを通じて達成される。低分子干渉RNA（siR
NA）は、時に短鎖干渉RNA又はサイレンシングRNAとして知られ、約20〜25塩基対の長さの
二本鎖RNA分子のクラスである。siRNAは相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子
の発現を干渉する。siRNAはmRNAの転写後の分解を引き起こし、結果として翻訳されない
ようにすることにより機能を果たす。
好ましい実施態様において、本発明は先に記載の動物モデルにPDC及び試験物質を与え
た後に、先に記載の動物モデル及び対照動物から取得された試料における該試験物質の拮
抗性又は作動性作用をエクスビボで決定するための方法を提供する。
本発明はさらに、本発明のアッセイ及び/又はスクリーニング方法で特定されたp75NTR
シグナル伝達のアンタゴニスト及びアゴニストに関する。本発明で開示される方法で特定
されるアゴニスト及びアンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、又は任意
の他の分子を含み得る；例えば、該アゴニスト及びアンタゴニストは、競合型又は非競合
型機構によりp75NTRに結合する低分子及び有機化合物を含み得る。好ましいものは、p75N
TRの低分子アンタゴニスト及びアゴニストである。
本明細書で使用されるp75NTRの特異的アゴニスト又はアンタゴニスト、並びにTLR7及び
/又はTLR9のアゴニストを、表2に記載する。
表2：p75NTRの特異的アゴニスト又はアンタゴニスト、及びTLR7又はTLR9のアゴニスト
Figure 0006876746
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Figure 0006876746
Figure 0006876746
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2-オキソ-アルキル-1-ピペラジン-2-オンの適当な誘導体は、例えば
4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
-2-オキソエチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
-2-オキソエチル}-1-(5-メチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-(5
-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-オキソ-2-[4-(3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
エチル}-1-ピリジン-2-イルピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
-2-オキソエチル}-1-ピリジン-2-イルピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-ピ
リジン-2-イル-ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(2,3-ジクロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-
1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-(6
-クロロピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(3-クロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-(5
-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソ
エチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソ
エチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
-2-オキソエチル}-1-ピリジン-3-イル-ピペラジン-2-オン;
1-(6-クロロピリジン-3-イル)-4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-
ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}ピペラジン-2-オン;
4-{2-オキソ-2-[5-(3-トリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]
エチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-オキソ-2-[4-(3-トリフルオロメトキシルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-
イル]エチル}-1-ピリジン-2-イルピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(4-クロロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-2,5-ジヒドロピロール-1-イル]-2-
オキソエチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(3,5-ビストリフルオロメチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-
オキソエチル}-1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-(3-メチルフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-(5
-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-[4-フェニル-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]-2-オキソエチル}-1-(5-トリフル
オロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
4-{2-オキソ-2-[5-(2,3-ジクロロフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]エチル}-
1-(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン
4-{2-オキソ-2-[5-(3-メトキシフェニル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-イル]エチル}-1-
(5-トリフルオロメチルピリジン-2-イル)ピペラジン-2-オン;
からなる群から選択される、好適には塩基付加塩又は酸付加塩の形態である、化合物であ
る。
これらの化合物及びそれらの合成は、US2011144122 Al及びUS 8247404 B2に開示されて
いる。
ここで、本発明は以下の実施例においてさらに説明される。
（本発明の実施例）
（実施例1：ニューロトロフィンNGFは、マウスにおいてPDCが仲介するアレルギー性喘息
をp75NTR依存的に強く増強する）
（方法）
（マウス系統）
ヘテロ接合p75NTRノックアウトマウス（p75NTR+/-）をJackson Laboratory社（Bar Har
bor, Maine, USA）から購入し、TU Dresdenの動物施設において無病原体条件下で交配さ
せた。オス及びメスのp75NTR+/+及びp75NTR-/-マウスを10〜12週齢で実験に使用した。
（PDCの生成）
マウスPDCは以下のようにインビトロで生成した：骨髄細胞を、マウスの大腿骨及び脛
骨を洗い流すことにより単離した。赤血球をACK緩衝液を用いて溶解した。残りの細胞を
洗浄し、10％ FCS、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、1 ml当たり100 IU
のペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、10 mM HEPES緩衝液、及び0.1 mM β-メ
ルカプトエタノールを補充したRPMI 1640培地中、1 ml当たり2×l06細胞の密度で培養し
た。骨髄細胞をPDCへと分化させるため、100 ng/ml Flt3-L（fms様チロシンキナーゼ3リ
ガンド）を細胞に加えた。8日間の培養の後、CD11b+画分をCD11bマイクロビーズ（Milten
yi Biotec社）を用いて、製造業者の説明書の通りに除去することによりPDCを濃縮した。
死細胞を死細胞除去キット（Miltenyi Biotec社）を用いて排除した。PDCの純度をフロー
サイトメトリーにより評価した（CD11b- CD11c+ B220+ Siglec-H+）。
（マウスにおけるアレルギー性喘息の誘導）
アレルギー性喘息を誘導するため、インビトロで生成したPDCを100 μg/mlオボアルブ
ミン（OVA; 等級V; Sigma-Aldrich社）で24時間インキュベートした。マウスを感作させ
るため、24GA i.v.カニューレ（i.v. cannula）（BD Neoflon（商標））を用いて麻酔下
マウスの肺に1×1O6個のOVAを負荷したPDCを気管内注入した。対照動物には、OVAを負荷
していない同量のPDC又はPBSのいずれかを与えた。10日後、アレルギー反応を誘導するた
め、マウスを3日間連続で30分にわたり1％ w/v OVA-エアロゾルに曝露した。最後の誘発
から24時間後、動物を安楽死させ、気管支肺胞洗浄液（BALF）の細胞組成（好酸球、リン
パ球、マクロファージ）、及び炎症誘発性サイトカインスペクトル、肺組織学、及び血液
血清中のOVA特異的IgEレベルに基づいて免疫反応を調べた。
（BALF細胞分析）
BALF細胞をフローサイトメトリーにより定量化した。非特異的結合を回避するため、Fc
Rブロッキング試薬で細胞をプレインキュベートした。以下の抗体：CD3-V500、CD4-V450
、CD8-PE Cy7、CD11c-APC Cy7、B220-PE、F4/80-PerCP、SiglecF-AF647、Ly6G-FITCを染
色に使用した。リンパ球（FSC低/SSC低）の中で、CD4+ヘルパーT細胞をCD3陽CD4陽と呼び
；CD8+ヘルパーT細胞をCD3陽CD8陽と呼び；B細胞をCD3陰B220陽と呼び；顆粒球（FSC低/S
SC高, Ly6G陽）の中で、好酸球をSiglecF陽CD11c陰として割り当て、かつ好中球をSiglec
F陰として割り当てた。マクロファージをFSC高である自家蛍光の高いCD11c陽F4/80陽細胞
として割り当てた。さらに、収集された細胞のサイトスピンを調製し、パッペンハイム法
で染色した。
（BALFサイトカインの定量化）
BALF上清を、製造業者の説明書に従って、ELISA（eBioscience社）によるIL-4、IL-5、
及びIL-13の定量化のために使用した。
（組織学的分析）
肺をPBSで潅流し、4％ v/vホルムアルデヒドで固定した。パラフィンで包埋した肺の4
μmの切片を炎症及び杯細胞肥厚化を定量化するためにPAS染色で染色した。
（実施例）
NGFは肺中に存在し、アレルギー性喘息のような炎症性プロセスの間に増加する。アレ
ルゲン仲介性免疫反応の間のPDCに対するNGFの影響を調べるため、p75NTR+/+ PDCを、p75
NTR+/+マウスへの気管内点滴注入の前にNGF（100 ng/ml）の存在下又は非存在下で、オボ
アルブミン（OVA）と共にインキュベートした。BALFにおいて、OVA単独と共にインキュベ
ートしたPDCと比較して、PDCによるOVAの取り込みがNGFの存在下で実施された場合に、好
酸球及びリンパ球の数が有意に増加した（図1a、b）。さらに、OVAを負荷したPDCをNGFで
処理すると、NGFの非存在下でOVAにより短時間処理したPDCと比較して、肺におけるTh2サ
イトカイン（IL-4、IL-5、及びIL-13）の生産が増加した（図1c）。OVAを負荷したPDCを
与えられたマウス由来の組織学的肺切片は、血管周囲の増加した炎症及び増強された粘液
生産を示した（図1d）。OVA取り込みの間のNGFによるPDCの処理は、肺における炎症性表
現形を増強させた（図1d）。対照的に、NGFの存在下又は非存在下でOVAを負荷されたp75N
TR-/-のPDCは、気道の炎症を誘導することができなかった（データは示さない）。本発明
者らのデータは、NGFがp75NTRを発現するPDCの炎症誘発性表現形への誘因となり、喘息モ
デルにおいてずっと重篤な気道炎症をもたらすことを示唆している。
アレルゲン仲介性の免疫反応の間のPDCに対するNGFのp75NTR依存的な影響を立証するた
め、p75NTR+/+マウスへの気管内点滴注入の前に、p75NTR+/+ のPDCを、p75NTR特異的阻害
ペプチドPEP5の存在下又は非存在下で、オボアルブミン（OVA）及びNGF（100 ng/ml）と
共にインキュベートした。BALFにおいて、PEP5を加えずにインキュベートしたPDCと比較
して、NGFで刺激されたPDCによるOVAの取り込みがPEP5の存在下で実施された場合に、好
酸球及びマクロファージの数が有意に低下した（図12a、b）。さらに、OVAを負荷し、NGF
で刺激したPDCをPEP5で処理すると、PEP5の非存在下で短時間処理したPDCと比較して、肺
におけるTh2サイトカイン（IL-4、IL-5、IL-13）の生産が低下した（図12c、d）。
（実施例2：p75NTRノックアウトはTh2免疫反応を阻害し、寛容性の発達を遮断する）
（方法）
先に記載の通りである。
（実施例）
疾患誘因のプロセスにおけるPDC上に発現するp75NTRの役割を調べるため、本発明者ら
はOVA仲介性のアレルギー性喘息のマウスモデルを使用した。マウス由来のOVAで短時間処
理したPDCを、p75NTR+/+又はp75NTR-/-マウスの肺に気管内適用した。OVAエアロゾルによ
る誘発後、重度好酸球増多症、肺炎症、及び激しい粘膜生産など喘息の特徴的な症状を分
析した。OVAを負荷したp75NTR-/-のPDCで処置されたp75NTR+/+ マウスは、p75NTR+/+のPD
Cを与えられたマウスと比較して、BALFにおける有意に低下した数の免疫細胞（リンパ球
及び好酸球）を示した（図2a、b）。OVA仲介性の免疫反応はさらにp75NTR+/+のPDCで処置
されたマウスのBALFにおいて増加したTh2サイトカイン分泌（IL-4、IL-5、及びIL-13）を
もたらしたが、p75NTR-/-のPDCを与えられたマウスではこれをもたらさなかった（図2c）
。肺における血管周囲の炎症及び杯細胞肥厚化は、p75NTR+/+のPDCで処置されたマウスと
比較して、p75NTR-/-のPDCで処置されたマウスにおいて縮小した（図2d、e）。要約する
と、p75NTRを欠くPDCを与えられたマウスは有意に低いアレルギー性喘息を発症した。
当該技術分野では、マウスにおけるp75NTRの遮断又は欠損は、肺炎症及び気道反応性亢
進の発症を妨げることが公知である。しかしながら、本研究においては、アレルギー性喘
息がp75NTR-/-マウスにおいて、OVAを負荷したp75NTR+/+のPDCの気管内への適用により誘
導され得ることを初めて示すことができた。対照的に、OVAを負荷したp75NTR-/-のPDCの
適用は、喘息を誘導しなかった。詳細には、免疫細胞はp75NTR+/+のPDCを与えられたp75N
TR-/-マウスのBALFにおいて有意に増加する（図2a、b）。さらに、Th2サイトカインプロ
ファイル（IL-4、IL-5、及びIL-13）はp75NTR-/-のPDCを与えられたマウスと比較して、
有意に増強される（図2c）。肺組織の組織学試験により、p75NTR+/+のPDCで処置されたマ
ウスは、p75NTR-/-のPDCを与えられたマウスと比較して、重度の血管周囲の炎症及び杯細
胞肥厚化を発症することが明らかとなった（図2d、e）。
（実施例3：NGFはODN（オリゴデオキシヌクレオチド）で刺激されたヒトPDCによるインタ
ーフェロンα（IFNα；Th1反応）及びIL-6生産（Th2反応）を調節する）
（方法）
（リンパ球分離）
細胞の精製に使用する血液試料は、2つの異なる供給源：オリゴデオキシヌクレオチド
（ODN）及び抗FcεRIα刺激実験において使用されるPDCの供給源として機能する、8時間
経過していない新鮮なバフィーコート試料から取得した。
血液試料を50 mlチューブに移し、遠心分離した（470 g、室温（RT）で30分間）。沈殿
した赤血球及び上相の血小板の間の、中間白血球層を、数ミリリットルの赤血球と共に取
り出した。新しい50 mlチューブ中で白血球を、2 mM EDTA及び0.5％ BSA（PBS E/B）を含
む3体積の1×PBSで希釈した。混合物を慎重にフィコール分離溶液（パーコール分離溶液
、密度1.074 g/ml, Biochrom AG社）上に積層し、遠心分離した（1000 g、RTで20分間止
めることなく）。赤血球及び顆粒球はチューブの底に沈殿し、単核球（白血球）及び血小
板を、上相の血漿層及び沈殿した赤血球/顆粒球の間の界面から新しいチューブに収集し
た。収集した細胞を50 ml PBS E/Bで一度洗浄し、遠心分離した（300 g、RTで10分間）。
上清を完全に除いた。血小板を減少させるため、1回目の洗浄に続き、単核球のペレット
に50 ml PBS E/Bを加え、遠心分離する（200 g、RTで15分間）ことにより、2回洗浄した
。200 gでの遠心分離の際に、ほとんどの血小板は上清中に残る。上清を捨てた。リンパ
球のペレットを20 ml PBS E/B中で再懸濁した。細胞精製の間にMACS細胞分離カラムを詰
まらせるおそれのある細胞凝集塊及び血餅を除くため、細胞に40 μmの孔径を有するナイ
ロンメッシュ（セルストレーナー, BD Biosciences社）を通過させた。
（形質細胞様樹状細胞（PDC）/BDCA4+細胞の精製）
末梢血液単核球からのCD4+ヘルパーT細胞の単離と同様に、PDCの精製前に細胞の総数を
決定した。CD304（BDCA-4/ニューロピリン-1）マイクロビーズキット（Miltenyi Biotech
社）を用い、製造業者の説明書に従いながら部分的に改変を加えて、ポジティブ選択によ
りPDCを精製した。簡潔に説明すると、細胞懸濁液を遠心分離し（450 gで6分間）、ペレ
ットを300 μlのPBS E/B中に再懸濁した。続いて総数108個の細胞当たり、各々100 μlの
FcRブロッキング試薬及びCD304（BDCA-4/ニューラオフィリン（Neuraophilin）-1）マイ
クロビーズを加えた。細胞懸濁液を4℃で20分間インキュベートした。細胞を10 ml PBS E
/Bで洗浄し、遠心分離した（470 gで6分間）。細胞ペレットを500 μlのPBS E/Bに再懸濁
し、すすいだMACS LS細胞分離カラム（Miltenyi Biotech社）に装加した。標識した細胞
を分離カラムに付着させた。分離カラムは1 ml PBS E/Bで3回洗浄した。PDCの純度を増加
させるため、溶出画分を第二のMACS MS細胞分離カラム上で濃縮させた。MSカラムの洗浄
が500 μlのPBS E/Bで実施されたことを除き、第一のLSカラムについて記載された通りの
磁気細胞分離手順を、第二のMSカラムについて繰り返した。精製したPDCを計数し、モノ
クローナルマウス抗ヒトBDCA2-PE（Miltenyi Biotech社）及びモノクローナルマウス抗ヒ
トCD271-APC（Miltenyi Biotech社）で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析で
純度を評価した。言及した試薬及び緩衝液の容量は、最大総数108個の細胞に対するもの
である。所与の総細胞数より多くの数を使用した場合は、試薬及び緩衝液の容量もそれに
応じてスケールアップした。
（オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）で刺激されたPDCによって生産されるIFN-α）
末梢血液から単離されたPDCを、ペニシリンG（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100
mg/ml）、L-グルタミン（2 mM）、10 ％熱不活性化ウシ胎仔血清（FBS）、及び10 ng/ml
インターロイキン-3（1L-3、R&D Systems社）を含むRPMI 1640培地（PAA）中に取った。U
字形底96ウェルプレート中の200 μl培地にウェル当たり5×l04細胞を播種し、5％ C02、
37℃でインキュベートした。IFNα誘導のため、刺激性ODN 2216及び対照のODN 2243（Ale
xis Biochemicals社）を0.33 μg/ウェルで指定されたウェルに加えた。p75NTR遮断ペプ
チドTAT-Pep5（Calbiochem社）を100 nMで指定されたウェルに利用した。NGF（R&D Syste
ms社）を200 ng/mlで割り当てられたウェルに加えた。全ての成分を言及された通りに一
連の順序で加えた。12〜14時間の刺激後、プレートを遠心分離した（270 g、5分間）。上
清を収集し、ELISA（Bender MedSystems社）によるIFNαの定量化について分析した。
（IFNα ELISA）
IFNα ELISAを、製造業者の説明書に従い、これに小さな改変を加えて実施した。端的
に説明すると、PBS中の100 μlの10 μg/mlコーティング抗体を、平底96ウェルEIA/RIAス
トリップウェルプレート（Corning社）上の割り当てられた各々のウェルに加えた。プレ
ートをパラフィルムM（Pechiney Plastic Packaging Company）で覆い、4℃で一晩インキ
ュベートした。ウェルを吸引し、洗浄緩衝液（0.05 ％ Tween 20を含むPBS）で3回洗浄し
た。プレートを各々のウェルに250 μlのアッセイ緩衝液（1リットル洗浄緩衝液に5 gのB
SAを加えたもの）を加えることによりブロッキングし、室温で2時間インキュベートした
。試料を加える前に、ウェルを空にし、プレートを300 μlの洗浄緩衝液で2回洗浄した。
100 μlのアッセイ緩衝液をブランクウェル及び標準に割り当てられたウェルに二連で加
え、第一のウェル（500 pg/ml）を空のままとした。90 μlのアッセイ緩衝液を試料用に
指定された全てのウェルに二連で加えた。IFN-αタンパク質標準（50 ng/ml）を500 μl
アッセイ緩衝液中で希釈し、最終濃度500 pg/mlを得た。500〜8 pg/mlの範囲のIFN-αの
希釈系列は、標準としての役割を果たした。10 μlの上清を、割り当てられたウェルに加
え、混合した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をコンジュゲートした検出抗体をア
ッセイ緩衝液で1：1000に希釈し、50 μlをブランクウェルを含む全てのウェルに加えた
。プレートを室温で2時間インキュベートした。ウェルの中身を除き、ウェルをウェル当
たり300 μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。100 μlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン
（TMB）基質溶液（Sigma社）を全てのウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベ
ートした。タンパク質標準濃度が最も高いウェル中で暗青色が発色したら、酵素基質反応
を100 μlの4 N硫酸溶液を各ウェルに加えることにより停止した。プレート全体の吸光度
を、450 nmを主波長とし、630 nmを参照波長として、分光光度計（TECAN社, Infinite 20
0）で読み取った。
（抗FcεRIαで活性化されたPDCによって生産されたIL-6）
末梢血液から単離されたPDCを、ペニシリンG（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100
mg/ml）、L-グルタミン（2 mM）、10％熱不活性化FBS、及び10 ng/mlのIL-3（R&D system
社）を有するRPMI 1640培地（PAA）中に取った。U字形底96ウェルプレート中の200 μl培
地にウェル当たり2×l05細胞を播種し、5％ C02、37℃でインキュベートした。IL-6を生
成させるため、マウス抗ヒトFcεRIα-FITC（eBioscience社）を250 ng/mlで指定された
ウェルに加えた。p75NTR遮断ぺプチドTAT-Pep5（Calbiochem社）を指定されたウェルに10
0 nMで利用した。NGF（R&D Systems社）を指定されたウェルに25 ng/mlの濃度で加えた。
全ての成分を、言及された順序に従って加えた。14時間の刺激の後、プレートを遠心分離
した（270 g、5分間）。上清をELISA（Bender MedSystems社）により、IL-6について分析
した。
（IL-6 ELISA）
IL-6 ELISAを製造業者の仕様書に従って、一部改変を加えて実施した。端的に説明する
と、PBS中の100 μlの2.5 μg/mlコーティング抗体を平底96ウェルEIA/RIAストリップウ
ェルプレート（Corning社）上の各々の割り当てられたウェルに加えた。プレートをパラ
フィルムM（Pechiney Plastic Packaging Company）で覆い、4℃で一晩インキュベートし
た。ウェルを吸引し、ウェル当たり300 μlの洗浄緩衝液（0.0005％ Tween 20を含むPBS
）で3回洗浄した。プレートを各ウェルに250 μlのアッセイ緩衝液（0.005％ BSAを含む
洗浄緩衝液）を加えることによりブロッキングし、プレートを2時間にわたって室温でイ
ンキュベートした。試料を加える前にウェルを空にし、プレートを300 μlの洗浄緩衝液
で2回洗浄した。100 μlのアッセイ緩衝液をブランクウェル及び標準に割り当てられたウ
ェルに二連で加えた。60 μlのアッセイ緩衝液を、試料について指定された全てのウェル
に二連で加えた。2 ng/ml IL-6標準タンパク質を、250 μlのアッセイ緩衝液で希釈し、2
00 pg/mlの最終濃度を得た。100〜1.6 pg/mlの範囲のIL-6タンパク質の段階希釈は、標準
としての役割を果たした。40 μlの上清を試料について割り当てられたウェルに加え、こ
れを混合した。ビオチンをコンジュゲートした検出抗体をアッセイ緩衝液で1:1000に希釈
し、50 μlを全てのウェルに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした。ウェ
ルの中身を除き、ウェル当たり300 μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。アッセイ緩衝液で1:
5000に希釈した100 μlのストレプトアビジン-HRPを全てのウェルに加え、プレートを室
温で1時間インキュベートした。ウェルを吸引し、ウェル当たり300 μlの洗浄緩衝液で3
回洗浄した。100 μl TMB基質溶液（Sigma社）をブランクウェルを含む全てのウェルに加
え、プレートを暗所、室温で10分間インキュベートした。陽性ウェルがもはや適切に記録
可能でなくなる前に、酵素基質反応を、100 μlの4 N硫酸を各ウェルに加えることにより
停止させた。プレート全体の吸光度を、450 nmを主波長とし、620 nmを参照波長として、
分光光度計で読み取った。
（実施例）
ヒトPDCはToll様受容体9（TLR9）を発現する。刺激性ODN 2216（AクラスCpG ODN）は、
PDCに発現するTLR9により認識される。TLR9によるODN 2216の認識は、PDCを活性化させ、
抗ウイルス性IFNαの分泌を誘導する（Th1反応）。本発明者らはヒト末梢血液精製PDCをO
DN 2216±200 ng/ml NGFで刺激した。14時間の刺激後、上清を収集し、ELISAによりIFNα
の分泌を分析した。本発明者らは20個の試料を使用した。その結果、ODN 2216＋NGF 200
で活性化されたPDCによるIFNαの分泌は、NGFを加えないでODN 2216により活性化されたP
DCと比較して、有意に低下する（p＝0.0031）ことが明らかとなった（図6a）。対照のODN
2243はPDCを全く刺激せず、従って上清中にはIFN-αは検出されなかった（データは示さ
ない）。ODN 2216で活性化されたPDCにおける、NGFによるIFNα分泌の調節が、TrkAでは
なくCD271を介していることを証明するため、本発明者らはTAT-Pep 5（p75NTRシグナル伝
達阻害剤）を使用して、ODN 2216で活性化されたPDCによるNGFを仲介とした低下したIFN
α生産をレスキューした。全部で23個のバフィーコート試料を分析した。NGF依存的なIFN
α生産の減少は、TAT-Pep5（100 nM）を加えることにより有意にレスキューされた（p＝0
.0168）。TAT-Pep5それ自体及び/又はDMSO（TAT-Pep5の溶媒）は、NGFを加えずにODN 221
6で活性化されたPDCと比較して、ODN 2216で活性化されたPDCにおけるIFNαの分泌を変化
させなかった（図6b）。
さらに、PDCは、IgEに対する高親和性受容体であるFcεRIαを発現することが報告され
ている。本発明者らは、IgE高親和性受容体の架橋剤である抗FcεRIα-FITCを使用して、
PDCを刺激した。IgE受容体の架橋形成に際し、PDCが活性化し、そのため炎症誘発性サイ
トカインIL-6の分泌によりTh2反応が誘発される。
本発明者らは、インビトロで25 ng/mlのNGFの存在下及び非存在下で、抗FcεRIα-FITC
によりFcεRIαを架橋させることにより、末梢血液精製PDCを活性化させた。上清を活性
化から12時間後に回収し、IL-6の分泌量をELISAにより決定した。本発明者らは18個のバ
フィーコート試料を分析した。その結果、25 ng/ml NGFを加えることにより、IgEの高親
和性受容体の架橋により活性化されたPDCからのIL-6の生産は、NGFを加えずにIgE架橋剤
で活性化させたPDCと比較して、有意に増加した（p＝0.0066）ことが示された（図11）。
NGF依存的なIL-6生産の増加は、TAT-Pep5（100 nM）を加えることにより有意に低下した
（図11）。
（実施例4：NGFは抗原が仲介するヒトCD4+ T細胞の増殖を促進する）
（方法）
（CD4+ヘルパーT細胞の精製）
抗原が仲介する自己CD4+ T細胞増殖アッセイにおいて使用するCD4+ヘルパーT細胞及びP
DCを、特定のアレルゲンに対するアレルギーを有することが分かっている指定されたドナ
ーから取得した末梢血液（80 ml）から精製した。末梢血液を抗凝固剤としてLi-ヘパリン
（S-Monovette Li-ヘパリン 7.5 ml, Sarstedt社）を含むチューブに採取した。CD4+ヘル
パーT細胞を、CD4+ T細胞単離キットII（Miltenyi Biotec社）を使用し、製造業者の説明
書に従い、これに小さな改変を加えてネガティブ選択により末梢血液単核球から精製した
。簡潔に説明すると、細胞ペレットを50 μlのPBS E/Bに再懸濁した。続いて、細胞総数1
07個当たり12 μlのビオチン標識抗体カクテルを加え、細胞懸濁液を4℃で15分間インキ
ュベートした。50 μlのPBS E/Bを加え、続いて細胞総数107個当たり25 μlの抗ビオチン
マイクロビーズを加えた。細胞を4℃でさらに20分インキュベートし、続いて10 ml PBS E
/B で洗浄し、遠心分離した（470 gで6分間）。上清を完全に取り去り、ペレットを500
μlのPBS E/Bで再懸濁した。細胞懸濁液を平衡化MACS MS分離カラムに適用し、濃縮され
たCD4+ ヘルパーT細胞の画分をフロースルー中に取得した。単離されたCD4+ ヘルパーT細
胞の純度は、モノクローナルマウス抗ヒトCD3-PE（BD Biosciences社）及びモノクローナ
ルマウス抗ヒトCD4-FITC（BD Biosciences社）による共染色後のフローサイトメトリー分
析により評価したところ、95％超であった。107個よりも多くの細胞を使用した場合、試
薬及び緩衝液の容量は、それに応じてスケールアップした。
（CD4+ヘルパーT細胞のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）に
よる標識）
精製したCD4+ヘルパーT細胞（先の記載を参照されたい）を、PBSで1回洗浄した。3〜8
×106個の細胞を5％ BSAを含む1 ml PBSに再懸濁した。CFSE粉末（Molecular Probes, In
vitrogen Technologies）のアリコートの1つを、18 μl DMSOに溶解させ、最終濃度5 mM
を得た。CD4+ T細胞を、細胞懸濁液＋1 μM CFSEを37℃で8分間インキュベートすること
により、1 μMの最終濃度のCFSEで染色した。1 mlの事前に温めたFCSを懸濁液に加え、細
胞をRPMI培地で2回洗浄した。細胞数を決定した。
（自己PDC及びCFSE標識されたCD4+ヘルパーT細胞の共培養）
抗原により仲介されるCD4+ ヘルパーT細胞の増殖反応を、精製PDC/BDAC4+細胞との共培
養における精製し、CFSEで標識されたCD4+ヘルパーT細胞を使用してアッセイした。PDC及
びT細胞を、ペニシリンG（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100 mg/ml）、L-グルタミ
ン（2 mM）、及び10％ヒトAB血清を補充したRPMI-1640培地中で別々に再懸濁した。共培
養物中でのT細胞に対するPDCの比を、1：6に維持した。抗原を50 SBE U/mlで共培養物に
追加した。NGFを5、25、及び50 ng/mlの濃度で加えた。アッセイをU字底96ウェルプレー
ト中で37℃、5％CO2で構築した。5日間の共培養の後、上清をBDサイトカインビーズアレ
イ（CBA）ヒトTh1/Th2サイトカインキット（BD Biosciences社）を使用することにより、
Th1/Th2サイトカインを分析し、増殖しているCFSE-低CD4+ T細胞の割合をフローサイトメ
トリーにより分析した。
（サイトカインビーズアレイ（CBA）によるサイトカインの測定）
上清中のIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFNγ、及びTNFαの濃度を、CBAキットを用いるこ
とにより、製造業者の説明書に従い、これにMicrosoft Excelを用いるデータ分析の改変
を加えて決定した。簡潔に説明すると、CBAはフローサイトメーターのFL3チャネルで弁別
される一連の離散的な蛍光強度を示すビーズを含む。一連のビーズの各々は、単一のサイ
トカインに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされており、6つのビーズの混合
物は6つの異なるサイトカインを単一の試料中で検出することができる。PEをコンジュゲ
ートした検出抗体は、サイトカインの結合量に比例してビーズを染色する。蛍光強度の較
正及び色調補正手順の後、標準及び試験試料（上清）を、DIVAソフトウェアを備えたFACS
LSRII フローサイトメーター（BD Biosciences社）で分析した。各サイトカインに対し
て作成した標準曲線を、サイトカイン濃度の計算に使用した。IL-2、IL-4、IL-5、IL-10
、TNFα、及びIFNγに対する検出下限は、それぞれ2.6 pg/ml、2.6 pg/ml、2.4 pg/ml、2
.8 pg/ml、2.8 pg/ml、及び7.1 pg/mlであった。
（実施例）
PDCは専門化した抗原提示細胞である。PDCは、イネ科抗原及びモルモット抗原のような
特定の既知のアレルゲンに対するアレルギーを有する患者の末梢血液から、BDCA4+マイク
ロビーズ及びCD4+ T細胞を用いたネガティブ選択により、精製した。精製し、CFSE（カル
ボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で標識したCD4+ T細胞を、5、25、及
び100 ng/mlのNGFを加えて、又は加えずに、最適濃度のアレルギー特異的アレルゲン/抗
原の存在下、二連で自己PDCと共培養した。5日間の培養後、CD4+ T細胞の増殖を、CFSE蛍
光の減少により決定した。図7aに示すように、25 ng/mlのNGFは、NGFを加えずに共培養し
た自己CD4+ T細胞/PDCと比較して、有意に増加した抗原（アレルゲン）仲介性の、CD4+ T
細胞の増殖を示した。対照的に、対照抗原では、ごくわずかな増殖しか観察されなかった
。T細胞単独（PDCと共培養しない）では、抗原（アレルゲン）±NGFを加えてインキュベ
ートしても加えずにインキュベートしても、又はNGF単独を加えてインキュベートしても
、全く増殖を示さなかった。さらに、NGFは、NGFを加えずに共培養した自己CD4+ T細胞/P
DCと比較して、炎症誘発性Th2サイトカインIL-2及びIL-5の用量依存的に増加した分泌を
誘導した（図7b）。
（実施例5：NGFはp75NTR依存的にマウスPDCのサイトカイン分泌及びTLRシグナル伝達を制
御する）
（方法）
先に記載の通りである。
（実施例）
マウスPDCは低親和性ニューロトロフィン受容体p75NTRを発現するが、高親和性ニュー
ロトロフィン受容体を発現しない（図3a、b）。増加したNGFレベルの存在下では、CPG-OD
NクラスAで刺激されたPDCは、減少したレベルのIFNαを分泌し（図3c）、低下したTLR9の
発現を示す（図3e、8a）。p75NTRノックアウトマウスのPDC（p75NTR-/-）は、CPG-ODNク
ラスA又はクラスBでの刺激に際するNGFによって誘導されるTLR9の発現の変化を示さない
（図8b、c）。さらに、p75NTRを発現するPDC（p75NTR+/+）のみが、NGFの存在下でサイト
カインIL-6及びTNFαを誘導するTh2反応の、CPG-ODNクラスBによって誘導される分泌を増
加させた（図3d）。
これらの作用の根底にある機構を調べるため、本発明者らはCPG-ODNクラスA（図3f）又
はクラスB（図3g）で処理されたPDCを、ウェスタンブロットを用いて分析した。p75NTR+/
+及びp75NTR-/-のPDCは、同等のレベルのMyD88、TRAF3、及びTRAF6を発現した。これらは
CpG A及びCpG Bによって活性化されるシグナル伝達経路に関与する。NGFは、p75NTR+/+の
PDCにおいてCpG Aにより誘導される転写調節因子IRF3及びIRF7のリン酸化を弱め、一方Cp
G Bは、IRF3及びIRF7のリン酸化を増加させた。NGFは、p75NTR-/-のpDCによって発現され
るIRF3及びIRF7の、CpGにより誘導されるリン酸化のレベルを変化させなかった。
（実施例6：NGFはp75NTR依存的にマウスPDCによる共刺激性分子及び抗原提示分子、並び
にサイトカインの発現を制御する）
（方法）
先に記載の通りである。
（実施例）
Th1の発端となるCPG-ODNクラスAによる刺激に際し、マウスp75NTR+/+のPDCは、NGFの存
在下で、CD4 T細胞特異的抗原提示分子MHC-IIの低下した発現を示し（図4a）、一方Th2の
発端となるCPG-ODNクラスBにより刺激されたp75NTR+/+のPDCは、NGFの存在下で抗原提示
分子MHC-II（図4b）及びCTL特異的MHC I（図4c）の増加した発現を示した。
オボアルブミンを含むTLR7及びTLR9のリガンドでマウスPDCを刺激すると、p75NTR+/+の
PDCは、抗原提示分子及び共刺激性分子（ICOS-L、MHC-II）の有意に増加した発現を示し
たが、該発現はp75NTR+/+のPDCにNGFを加えることによってのみさらに増加し、p75NTR-/-
のPDCでは増加しなかった（図9a、b）。さらに、NGFの追加はp75NTR+/+のPDCでのMHC-I、
PD-L1、及びMHC-II分子（MHC-II）を駆動するOx40-Landの発現を変化させたが、p75NTR-/
-のPDCでは変化させなかった（図9c〜e）。
（実施例7：NGFはマウスT細胞によるTh1サイトカインIL-2及びIFNγのPDC依存的な分泌を
低下させる）
（方法）
先に記載の通りである。
（マウスT細胞の単離）
マウスT細胞をニワトリオボアルブミン323-339に特異的なマウスα鎖及びβ鎖T細胞受
容体を発現するOTIIマウス系統から、CD+ T細胞単離キット（Miltenyi Biotec社）を用い
て単離した。
（実施例）
マウスPDC及びT細胞の両方を、ニワトリオボアルブミンペプチド323-339を加えて又は
加えずに、NGFの存在下（100 ng/ml）又は非存在下で一晩培養した。上清中のT細胞が分
泌したTh1サイトカインIL-2及びIFNγの濃度を、CBAキット（BD Bioscience社）を用いる
ことにより、製造業者の説明書に従い、これにMicrosoft Excelを用いるデータ分析の改
変を加えて決定した。図5は、共培養物におけるTh1サイトカインIFNγ及びIL-2の分泌に
対するNGFの影響を示す。オボアルブミンペプチド（OVA）をT細胞に提示するp75NTR+/+の
PDCの存在下、T細胞はTh1サイトカインIFNγ（図5a）及びIL-2（図5b）を分泌する。p75N
TR-/-のPDCとの共培養物と比較して、p75NTR+/+系統に由来するPDCと共培養したT細胞は
、NGFを加えるときに両方のTh1サイトカインの低下した分泌により反応する。
（実施例8：NGFはp75NTR依存的にPDCにより誘導されるマウスT細胞の増殖及びサイトカイ
ン分泌を制御する）
（方法）
先に記載の通りである。
（マウスT細胞の単離）
マウスT細胞は、CD4+ T細胞上にオボアルブミンペプチド特異的T細胞受容体を発現する
OT-IIマウス系統、又はCD8+ CTL上にオボアルブミンペプチド特異的T細胞受容体を発現す
るOT-Iマウス系統のいずれかから、CD8+ T細胞単離キット（Miltenyi Biotec社）を用い
て単離した。
（実施例）
p75NTR-/-のPDCとの共培養物と比較して、p75NTR+/+系統由来のPDCと共培養したOT-II
系統由来のCD4+ T細胞は、NGFを加えた時に、増加したTh2サイトカインの分泌及び増殖に
より反応し（図10a）、一方OT-I系統由来のCD8+ CTLは、共培養物中にNGFが存在する時に
、より少ないサイトカインを分泌し、低下した増殖を示した（図10b）。
（実施例8：NGFは異種移植モデルにおけるTh2傾向GvHDを悪化させる）
（方法）
先に記載の通りである。
（マウス系統）
NSGマウス系統由来のレシピエントマウスを、ヒト細胞の移植前に3 Gyの放射線で24時
間事前調整（pre-condition）した。
（GvHDのスコア化及び生存率）
GvHD発生率及び生存率をスコア化するため、移植マウスを体重、行動、皮膚、活動性、
毛並、及び他のパラメータについて毎日モニタリングした。
（実施例）
ヒトの自己T細胞及びPDCをCpG Bで刺激したか、又は刺激しなかった。NGFの非存在下又
は存在下で一晩の共培養を行った。1日後、ヒト細胞を静脈内注入により、放射線照射を
受けたNSGマウスに移植した。PDCをNGFの存在下で共培養した場合、移植後12週の期間に
わたり、GvHDの増加した重症度（累積GvHD発生率、図13a）を観察することができ、この
ことからTh2 T細胞反応の過剰刺激（superstimulation）が強調される。さらに、これら
のマウスの有意に増加した死亡率が観察された（図13b）。PDCがTLRを刺激するCpG Bなし
で培養された場合、累積GvHD発生率又は生存率に対するNGF依存的な作用は観察できなか
った（データは示さない）。
（実施例9：NGFはマウスにおけるTh1傾向I型糖尿病を軽減する）
（方法）
先に記載の通りである。
（マウス系統）
適用されたI型糖尿病マウスモデルについて、RIP-CD80×RIP-LMV-GPマウス系統を使用
した。この系統では、共刺激性分子CD80が過剰発現され、T細胞反応が増強される。さら
に、LCMVウイルスの糖タンパク質が発現され、膵臓β細胞を人為的に標的化してI型糖尿
病を発症させることが可能とされている。
（I型糖尿病の発症及び評価）
マウスPDCをNGFの非存在下又は存在下でLCMV糖タンパク質と共に1時間培養した。続い
て、PDCをレシピエントマウスへ静脈内注入した。移植から2週間後、マウスを血中グルコ
ースレベルについて週に3回観察した。連続して250 mg/lを超える血中グルコースレベル
を伴う場合、マウスを糖尿病であると判断した。
（実施例）
マウスPDCをCpG Bで刺激し、LCMV糖タンパク質と共にコインキュベートした。培養物中
にNGFが存在すると、PDCにより誘導されたI型糖尿病は、NGFの非存在下で培養されたPDC
を移植されたマウスにおけるよりも有意に遅れた段階で発生した。PDCをTLRを刺激するCp
G Bを加えずに培養した場合、I型糖尿病発生に対するNGF依存的な作用は観察できなかっ
た（データは示さない）。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
p75 NTR アンタゴニスト又はp75 NTR アゴニストから選択される、p75 NTR シグナル伝達の少
なくとも1つの調節因子、並びにTLR7及び/又はTLR9の少なくとも1つのアゴニストを含む
、組合わせ。
（構成２）
構成1記載の組合わせを含む、医薬組成物。
（構成３）
ワクチン組成物である、構成2記載の医薬組成物。
（構成４）
前記p75 NTR シグナル伝達のアゴニストが、
i) NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5などを含む群；
ii) 抗p75 NTR 抗体MC192のような活性化抗体；
iii) 活性化ペプチド及び活性化低分子（例えば、LM11A、及びLM11A-24カフェイン又は
LM11A-31イソロイシン、LM11A-36を含むがこれらに限定はされない誘導体化合物）；
vi) 活性化タンパク質；又は
vii) 核酸によりコードされているもの、から選択される、構成1〜3のいずれか1項記
載の組合わせ又は医薬組成物又はワクチン組成物。
（構成５）
前記p75 NTR シグナル伝達のアンタゴニストが、
i) プロNGF、プロBDNF、プロNT-3、プロNT-4、プロNT-5などを含む群；
ii) 遮断抗体、例えば抗ヒトp75 NTR モノクローナル抗体クローン、例えばME20.4、ME24
.1、MLR-1、MLR2、MLR3、HB-8737、NGFR5、並びにそれらの誘導体及びヒト化型；抗マウ
スp75 NTR モノクローナル抗体、例えばREX、AB1554；
iii) ニューロトロフィンのp75 NTR への結合を妨げる抗体、例えばMAb 911、MAb 912、
及びMAb 938、ヒト化型MAb 911であるタネズマブ、PG110、REGN475、フルラヌマブ、MEDI
-578を含む、それらの誘導体及びヒト化型；
iii) 遮断ペプチド（PEP5、tat-PEP5、C30-35）；
vi) p75 NTR の細胞内ドメインに由来するタンパク質モチーフ
（化１）
Figure 0006876746
へのペプチドの結合を含むTRAF6と、p75 NTR との相互作用を遮断するペプチド、
（化２）
Figure 0006876746
を含む、TRAF6デコイペプチド；
v) ニューロトロフィンのp75 NTR への結合を妨げる遮断タンパク質；例えば、p75 NTR の
細胞外ドメイン；
vi) 低分子阻害剤、例えば2-オキソ-アルキル-1-ピペラジン-2-オンの誘導体；ニュー
ロトロフィンのp75 NTR への結合を妨げる低分子、例えばPD 90780、ALE-0540、Ro 08-2750
、Y1036；
vii) p75 NTR の発現を遮断するモルホリノ；或いは
viii）核酸によりコードされているもの、例えばp75 NTR の発現又は下流のシグナル伝達
を遮断するshRNA又はRNAi、から選択される、構成1〜3のいずれか1項記載の組合わせ又
は医薬組成物又はワクチン組成物。
（構成６）
前記TLR7及び/又はTLR9のアゴニストが：
i. 特異的TLR7アゴニスト、例えば一本鎖RNA、CL075、CL097、CL264、CL307、ガーディ
キモド、イミキモド、ロキソリビン、ポリ(dU)、ポリ(dT)、及びR848、及びIMO-4200；
ii. 特異的TLR9アゴニスト、例えば細菌DNA、CPG-ODNクラスA、例えばODN 1585、ODN 2
216、ODN 2336； CPG-ODNクラスB、例えばODN BW006、ODN D-SL01 ODN 1668；ODN 1826、
ODN 2006、ODN 2007、及びCPG-ODNクラスC、例えばODN D-SL03、ODN 2395、ODN M362、C7
92；
iii. TLR7及びTLR9の二重アゴニスト；
iv. 生又は弱毒のウイルス、細菌、寄生生物；
v. ウイルス、細菌又は寄生生物抽出物、から選択される、構成1〜5のいずれか1項記
載の組合わせ又は医薬組成物又はワクチン組成物。
（構成７）
例えば、モノホスホリル脂質A（MPL）及びその合成誘導体、ムラミルジペプチド（MDP
）及びその誘導体、オリゴデオキシヌクレオチド（例えばCPGなど）、二本鎖RNA（dsRNA
）、別の病原体関連分子パターン（PAMP、例えば大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（LT
）; フラジェリン）、サポニン（Quil、QS-21）、低分子免疫増強剤（SMIP、例えば、レ
シキモド[R848]）、サイトカイン、ケモカイン、並びに結核菌由来の抗原から選択される
、少なくとも1つの免疫刺激剤をさらに含む、構成3〜6のいずれか1項記載のワクチン組
成物。
（構成８）
不溶性アルミニウム化合物、リン酸カルシウム、リポソーム、Virosomes（登録商標）
、ISCOMS（登録商標）、ミクロ粒子（例えば、PLGA）、乳剤（例えば、MF59、モンタニド
）、ウイルス様粒子、及びウイルスベクターから選択される少なくとも1つの薬剤をさら
に含む、構成3〜6のいずれか1項記載のワクチン組成物。
（構成９）
p75 NTR を発現する単離PDC、p75 NTR を発現するインビトロで生成させたPDC、又はp75 NTR
を発現するPDC細胞株をさらに含む、構成3〜8のいずれか1項記載のワクチン組成物。
（構成１０）
ワクチン用アジュバントとしての使用のための、構成1及び3〜6のいずれか1項記載の
組合わせ。
（構成１１）
中枢性及び末梢性神経変性疾患、老人性認知症、てんかん、アルツハイマー病、パーキ
ンソン病、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、プリオン病、健忘症、統合失調症、鬱、
双極性障害、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、心血管病態、虚血後心損傷、心筋症、
心筋梗塞、心不全、心虚血、脳梗塞、末梢神経障害、視神経及び/又は網膜の損傷、網膜
色素変性、緑内症、網膜虚血、黄斑変性症、脊髄外傷、頭部外傷、アテローム性動脈硬化
、狭窄、創傷治癒の障害、脱毛症、あらゆる種類の癌、あらゆる種類の腫瘍、あらゆる種
類の腫瘍転移、あらゆる種類の白血病、呼吸障害、肺炎症、アレルギー、アナフィラキシ
ー、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、皮膚の疼痛、体性痛、内臓痛、神経痛
、慢性神経障害性疼痛、炎症痛、自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎（多発性関節炎、少
関節炎）、強直性脊椎炎、膠原病、全身性エリテマトーデス（SLE）、シャープ症候群、
シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、進行性全身性硬化症、脊椎関節炎
（強直性脊椎炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、乾癬性関節炎、未分化型脊椎関節炎）、
リウマチ熱、アイカルディ・グティエール症候群、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、腎炎、
卒中、潰瘍性大腸炎、クローン病、ウィップル病、強皮症、スティル病、気管支肺異形成
症（BPD）、細気管支炎、RSV関連細気管支炎、糖尿病、線維筋痛症候群、セリアック病、
橋本病、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、移植片対宿主病（GVHD）、
自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、ロフグレン症候群、ベーチェット病、
ネフローゼ症候群、ブドウ膜炎、乾癬性関節炎、乾癬（尋常性乾癬、濃疱性乾癬）、骨折
、骨疾患、骨粗鬆症、及び全ての細菌、真菌、ウイルス感染性疾患、並びに真核寄生生物
による感染からなる群から選択される疾患の予防及び/又は治療における使用のための、
構成1〜6のいずれか1項記載の組合わせ。
（構成１２）
中枢性及び末梢性神経変性疾患、老人性認知症、てんかん、アルツハイマー病、パーキ
ンソン病、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、プリオン病、健忘症、統合失調症、鬱、
双極性障害、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、心血管病態、虚血後心損傷、心筋症、
心筋梗塞、心不全、心虚血、脳梗塞、末梢神経障害、視神経及び/又は網膜の損傷、網膜
色素変性、緑内症、網膜虚血、黄斑変性症、脊髄外傷、頭部外傷、アテローム性動脈硬化
、狭窄、創傷治癒の障害、脱毛症、あらゆる種類の癌、あらゆる種類の腫瘍、あらゆる種
類の腫瘍転移、あらゆる種類の白血病、呼吸障害、肺炎症、アレルギー、アナフィラキシ
ー、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、皮膚の疼痛、体性痛、内臓痛、神経痛
、慢性神経障害性疼痛、炎症痛、自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎（多発性関節炎、少
関節炎）、強直性脊椎炎、膠原病、全身性エリテマトーデス（SLE）、シャープ症候群、
シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、進行性全身性硬化症、脊椎関節炎
（強直性脊椎炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、乾癬性関節炎、未分化型脊椎関節炎）、
リウマチ熱、アイカルディ・グティエール症候群、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、腎炎、
卒中、潰瘍性大腸炎、クローン病、ウィップル病、強皮症、スティル病、気管支肺異形成
症（BPD）、細気管支炎、RSV関連細気管支炎、糖尿病、線維筋痛症候群、セリアック病、
橋本病、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、移植片対宿主病（GVHD）、
自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、ロフグレン症候群、ベーチェット病、
ネフローゼ症候群、ブドウ膜炎、乾癬性関節炎、乾癬（尋常性乾癬、濃疱性乾癬）、骨折
、骨疾患、骨粗鬆症、及び全ての細菌、真菌、ウイルス感染性疾患、並びに真核寄生生物
による感染からなる群から選択される疾患の予防及び/又は治療における使用のための請
求項2〜9のいずれか1項記載の医薬組成物又はワクチン組成物であって、該医薬組成物がp
75 NTR シグナル伝達のアンタゴニスト又はp75 NTR シグナル伝達のアゴニストから選択され
る少なくとも1つの化合物を含む、前記医薬組成物又はワクチン組成物。
（構成１３）
p75 NTR シグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法であっ
て：
・神経成長因子受容体p75 NTR を発現する、初代又はインビトロで生成させたヒト又は動
物形質細胞様樹状細胞（PDC）又はPDC細胞株を、試験物質と接触させる工程；
・接触させた該ヒト又は動物初代PDC又はPDC細胞株を、p75 NTR シグナル伝達をもたらす
のに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
・該初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株に対する、該試験
物質の作用を決定する工程；
・接触させた該初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株におけ
る該試験物質の作用を、対照細胞又は対照細胞株と比較する工程；及び
・該初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株におけるp75 NTR シ
グナル伝達を作動させる、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択する工程、を含
む、前記スクリーニング方法。
（構成１４）
前記ヒト又は動物PDC又はPDC細胞株が、前記神経成長因子受容体p75 NTR 及び/又はToll
様受容体の群から選択される少なくとも1つのタンパク質、好ましくはTLR7又はTLR9を発
現する、構成13記載のスクリーニング方法。
（構成１５）
前記ヒト又は動物PDCが、p75 NTR 、及び/又はTLR9、TLR7、TRAF3、及びTRAF6からなる群
から選択される、少なくとも1つのタンパク質を過剰発現するように遺伝子操作されたト
ランスジェニック細胞又はトランスジェニック細胞株である、構成13又は14記載のスク
リーニング方法。
（構成１６）
前記対照細胞又は対照細胞株が、ヒト又は動物初代細胞、最も好適にはPDCであるか；
又はp75 NTR を天然には発現しない細胞、又はp75 NTR がノックアウトされた細胞、又はp75 N
TR の発現が低下するか、若しくは阻害された細胞、又はp75 NTR シグナル伝達が遮断され、
阻害され、若しくは低下した細胞である、構成13〜15のいずれか1項記載のスクリーニ
ング方法。
（構成１７）
p75 NTR を発現するPDC又はPDC細胞株を、T細胞とコインキュベートする、構成13〜16
のいずれか1項記載の方法であって：
・前記神経成長因子受容体p75 NTR を発現するヒト又は動物PDC、又はPDC細胞、又はPDC
細胞株をT細胞とコインキュベートし、試験物質と接触させる工程；
・該ヒト又は動物PDC又はPDC細胞株と、該T細胞とを接触させた共培養物を、p75 NTR シ
グナル伝達をもたらすのに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
・該PDC若しくはPDC細胞株、及び/又は該T細胞への該試験物質の作用を決定する工程；
・接触させたPDC若しくはPDC細胞株、及び/又はT細胞における該試験物質の作用を、対
照細胞若しくは対照細胞株、及び/又はT細胞と比較する工程；並びに
・p75 NTR シグナル伝達を作動させる、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択す
る工程、を含む、前記方法。
（構成１８）
前記神経成長因子受容体p75 NTR を発現するヒト又は動物PDC又はPDC細胞株を、前記試験
物質と接触させる工程が、天然又は人工のp75 NTR のリガンドの存在下、該試験物質及びp7
5 NTR タンパク質の相互作用、並びに/又は該試験物質のp75 NTR の天然のリガンドとの相互
作用を可能とする条件下で実施される、構成13〜17のいずれか1項記載のスクリーニン
グ方法。
（構成１９）
前記PDC又は細胞又はPDC細胞株を、それらを前記スクリーニング方法において使用する
前又は間に、好適には少なくとも1つのToll様受容体シグナル伝達のアゴニスト、好まし
くはTLR7及び/又はTLR9のアゴニストにより前もって活性化させる、構成13〜18のいず
れか1項記載のスクリーニング方法。
（構成２０）
アッセイにおける前記p75 NTR シグナル伝達への前記試験物質の拮抗性又は作動性の作用
が、サイトカインの発現分析、並びに/又は細胞内シグナル伝達カスケードの分析、並び
に/又は表面マーカーの発現分析、並びに/又は外来抗原の取り込み、細胞内プロセシング
、及び提示の測定、並びに/又はT細胞の分析、例えば表面マーカー及び転写調節因子の発
現、分化、サイトカイン分泌、抗原特異性、増殖、並びに転写調節因子及びシグナル伝達
カスケードの構成要素の活性化に基づいて測定される、構成13〜19のいずれか1項記載
のスクリーニング方法。
（構成２１）
前記方法がインビボで実施され、p75 NTR 及び/又は少なくとも1つのToll様受容体、好ま
しくはTLR7及び/又はTLR9を発現する前記PDC又はPDC細胞株が、動物モデル、例えばOVAに
より誘発されたアレルギー性喘息のモデル、アレルギー性疾患の別のモデル、EAEモデル
、糖尿病モデル、SLEモデル、移植モデル、GvHDモデル、及び腫瘍モデルのような、免疫
性、炎症性、又は増殖性の疾患に特異的な動物モデルに投与された点において特徴づけら
れる、構成13〜20のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
（構成２２）
試験物質の前記動物モデルにおける前記拮抗性又は作動性の作用が、対照動物、好まし
くは少なくともPDCを含むが、該PDCにはp75 NTR が発現していないか、より低いレベルで発
現している対照動物、或いは適用されるPDC若しくはPDC細胞株が、p75 NTR の低下した若し
くは阻害された発現を示すか、又は遮断された、阻害された、若しくは低下したp75 NTR シ
グナル伝達を示す対照動物の存在下で決定される、構成21記載のスクリーニング方法。

Claims (14)

  1. p75NTRシグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングする方法であって：
    ・神経成長因子受容体p75NTRを発現する、初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物形質細胞様樹状細胞（PDC）又はPDC細胞株を、試験物質と接触させる工程；
    ・該接触させたヒト又は動物初代PDC又はPDC細胞株を、p75NTRシグナル伝達をもたらすのに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
    ・該初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株に対する、該試験物質の作用を決定する工程；
    ・該接触させた初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株における該試験物質の作用を、対照細胞又は対照細胞株と比較する工程；及び
    ・初代又はインビトロで生成させたヒト又は動物PDC又はPDC細胞株におけるp75NTRシグナル伝達を作動させる、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択する工程、を含む、前記スクリーニング方法。
  2. 前記ヒト又は動物PDC又はPDC細胞株が、前記神経成長因子受容体p75NTR 、及びToll様受容体の群から選択される少なくとも1つのタンパク質を発現する、請求項１記載のスクリーニング方法。
  3. 前記ヒト又は動物PDCが、p75NTR、並びにTLR9、TLR7、TRAF3、及びTRAF6からなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質を過剰発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック細胞又はトランスジェニック細胞株である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
  4. 前記対照細胞又は対照細胞株が、ヒト又は動物初代細胞であるか；又はp75NTRを天然には発現しない細胞、又はp75NTRがノックアウトされた細胞、又はp75NTRの発現が低下するか、若しくは阻害された細胞、又はp75NTRシグナル伝達が遮断され、阻害され、若しくは低下した細胞である、請求項１〜３のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  5. p75NTRを発現するPDC又はPDC細胞株を、T細胞とコインキュベートする、請求項１〜４のいずれか1項記載の方法であって：
    ・前記神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動物PDC、又はPDC細胞、又はPDC細胞株をT細胞とコインキュベートし、試験物質と接触させる工程；
    ・該接触させた該ヒト又は動物PDC又はPDC細胞株と該T細胞との共培養物を、p75NTRシグナル伝達をもたらすのに十分な期間にわたりインキュベートする工程；
    ・該PDC若しくはPDC細胞株、及び/又は該T細胞への該試験物質の作用を決定する工程；
    ・該接触させたPDC若しくはPDC細胞株、及び/又はT細胞における該試験物質の作用を、対照細胞若しくは対照細胞株、及び/又はT細胞と比較する工程；並びに
    ・p75NTRシグナル伝達を作動させる、又は該シグナル伝達と拮抗する試験物質を選択する工程、を含む、前記方法。
  6. 前記神経成長因子受容体p75NTRを発現するヒト又は動物PDC又はPDC細胞株を、前記試験物質と接触させる工程が、天然又は人工のp75NTRのリガンドの存在下、該試験物質及びp75NTRタンパク質の相互作用、並びに/又は該試験物質のp75NTRの天然のリガンドとの相互作用を可能とする条件下で実施される、請求項１〜５のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  7. 前記PDC又は細胞又はPDC細胞株を、それらを前記スクリーニング方法において使用する前又は間に、少なくとも1つのToll様受容体シグナル伝達のアゴニストにより前もって活性化させる、請求項１〜６のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  8. アッセイにおける前記p75NTRシグナル伝達への前記試験物質の拮抗性又は作動性の作用が、サイトカインの発現分析、並びに/又は細胞内シグナル伝達カスケードの分析、並びに/又は表面マーカーの発現分析、並びに/又は外来抗原の取り込み、細胞内プロセシング、及び提示の測定、並びに/又はT細胞の分析に基づいて測定される、請求項１〜７のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  9. 前記アッセイにおける前記p75 NTR シグナル伝達への前記試験物質の拮抗性又は作動性の作用が、表面マーカー及び転写調節因子の発現、分化、サイトカイン分泌、抗原特異性、増殖、並びに転写調節因子及びシグナル伝達カスケードの構成要素の活性化に基づいて測定される、請求項８記載のスクリーニング方法。
  10. 前記方法がインビボで実施され、p75NTR及び少なくとも1つのToll様受容体を発現する前記PDC又はPDC細胞株が、動物モデルに投与された点において特徴づけられる、請求項１〜９のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  11. 前記動物モデルが、免疫性、炎症性、又は増殖性の疾患に特異的な動物モデルである、請求項１０記載のスクリーニング方法。
  12. 前記動物モデルが、OVAにより誘発されたアレルギー性喘息のモデル、アレルギー性疾患の別のモデル、EAEモデル、糖尿病モデル、SLEモデル、移植モデル、GvHDモデル、及び腫瘍モデルから選択される、請求項１０又は１１記載のスクリーニング方法。
  13. 試験物質の前記動物モデルにおける前記拮抗性又は作動性の作用が、対照動物の存在下で決定される、請求項１０〜１２のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
  14. 前記対照動物が、少なくともPDCを含むが、該PDCにはp75 NTR が発現していないか、若しくはより低いレベルで発現している、或いは適用されるPDC若しくはPDC細胞株が、p75 NTR の低下した若しくは阻害された発現を示すか、又は遮断された、阻害された、若しくは低下したp75 NTR シグナル伝達を示す、請求項１３記載のスクリーニング方法。
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