KR102186534B1 - 수지상세포의 성숙도 측정 방법 및 조성물, 그리고 이의 용도 - Google Patents
수지상세포의 성숙도 측정 방법 및 조성물, 그리고 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
성숙 수지상세포 검출용 바이오마커, 이를 이용한 성숙 수지상세포 검출용 조성물, 미성숙 수지상세포의 분화를 조절하기 위한 조성물, 수지상세포 치료제의 제조 방법, 및 면역 관용 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 성숙 수지상세포를 특이적으로 검출할 수 있고, 성숙 수지상세포의 분화를 조절하여 성숙 수지상세포 또는 면역 관용 수지상세포를 제조할 수 있다. 또한, 이에 의해 제조된 성숙 수지상세포 및 면역 관용 수지상세포는 암 면역 치료제 또는 자가 면역 치료제로 이용할 수 있다.
Description
수지상세포의 성숙도 측정 방법 및 조성물, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.
수지상세포는 주로 T 세포에 항원제시 기능을 수행하는 전문적 항원 제시 세포의 일종으로서, 림프절, 비장, 흉선, 피부 밑 또는 여러 조직의 세포 간극에서 나뭇가지 모양으로 존재한다. 수지상세포는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시함으로써, T 세포 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
또한, 수지상세포는 주위에 존재하는 환경적 신호와 종류에 따라 성숙도(maturity)가 상이한 상태로 분화되어, 미성숙(immature), 준성숙(semi-mature) 또는 성숙(mature) 수지상세포로 존재한다. 미성숙 수지상세포는 초기 성숙 단계에서 발견되는 것으로서 세포 간액으로부터 데브리스(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행하나, 이 세포의 염증성 사이토카인의 발현 수준은 낮기 때문에 T 세포와 접촉하여도 T 세포를 활성화시키지 못한다. 반면, 성숙 수지상세포는 원시 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 가진다.
최근 수지상세포는 암, 면역 관련 질환 등에 대한 세포치료제로서 사용하기 위해 연구되고 있다. 예를 들어, 수지상세포는 림프절에서 T 세포를 활성화시킴으로써 종양 세포를 억제할 수 있고, 면역 반응에 관여하여 감염성 질환, 염증성 질환 등의 치료에 사용될 수 있다. 수지상세포를 치료제로 사용하기 위해서는 수지상세포의 성숙도를 확인할 수 있어야 한다. 수지상세포의 성숙도를 확인할 수 있는 바이오마커에 대한 연구가 진행되고 있으나, 정확도가 떨어지는 문제점이 있고 성숙도에 따른 수지상세포의 활성, 모양 등의 변화를 측정할 수 있는 바이오마커에 대하여는 밝혀진 바 없다.
따라서, 수지상세포의 성숙도를 특이적으로 확인할 수 있는 바이오마커를 확인하고, 이를 이용하여 수지상세포의 성숙, 이동능, 활성 등을 조절하는 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 성숙 수지상세포의 검출용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 미성숙 수지상세포의 분화를 조절하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 성숙 수지상세포의 수상돌기 형성을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 수지상세포 치료제의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 수지상세포 치료제를 제공한다.
다른 양상은 면역관용 수지상세포의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 면역관용 수지상세포를 제공한다.
일 양상은 PDZ 및 LIM 도메인 단백질 4(PDZ and LIM domain protein 4: Pdlim4) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 성숙 수지상세포 검출용 조성물을 제공한다.
상기 PDZ 및 LIM 도메인 단백질 4(PDZ and LIM domain protein 4: Pdlim4)는 액틴에 결합하는 단백질로, 액틴 세포골격(cytoskeleton)의 인지에 관여하는 단백질이다. LIM protein RIL 또는 Reversion-induced LIM protein로도 불릴 수 있다. 상기 Pdlim4 단백질은 인간에서 UniprotKB P50479의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 Pdlim4 단백질은 PDLIM4 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 Pdlim4는 이의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물” 이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 Pdlim4 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, Pdlim4 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한 상기 Pdlim4 단백질이 수지상세포의 이동능, 성숙도에 관여하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능하다.
상기 단편(fragment)은 Pdlim4 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.
상기 제제는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다.
상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항- Pdlim4 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 핵산은 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다. 상기 프라이머는 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 2개의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 포함한다.
상기 조성물은 Pdlim4의 검출에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
상기 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 소, 말, 돼지, 양, 고양이, 원숭이, 및 염소를 포함한 포유동물로부터 유래된 세포일 수 있다.
용어 "수지상세포(dendritic cell: DC)"는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 II 복합체와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 말한다. 수지상세포는 면역원성(immunogenic) 및 면역관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함한다. 수지상세포는 수지상세포 타입 1(dendritic cell 1: DC1) 세포 및 수지상세포 타입 2(dendritic cell 2: DC2) 세포를 포함할 수 있다. 상기 수지상세포는 통상형 수지상세포(Conventional dendritic cell: cDC) 또는 형질세포 모양 수지상세포(plasmacytoid dendritic cell: pDC)일 수 있다. 상기 통상형 수지상세포는 분화 수준 또는 성숙도에 따라 미성숙 수지상세포(immature dendritic cell: imDC), 준성숙 수지상세포(semimature dendritic cell: smDC), 성숙 수지상세포(mature dendritic cell: mDC)로 분류할 수 있다. 상기 미성숙 수지상세포는 조혈 골수 간세포로부터 유래될 수 있고, 수지상세포의 초기 성숙 단계에 발견될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “성숙되지 않은 수지상세포”는 미성숙 수지상세포, 준성숙 수지상세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 “미성숙 수지상세포”는 세포 간액으로부터 데브리스(debris)들을 수집하고 제거하는 1차적인 기능을 수행하나, 이 세포의 염증성 사이토카인의 발현 수준은 낮기 때문에 T 세포와 접촉하여도 T 세포를 활성화시키지 못한다. 상기 “준성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상세포를 의미한다.
미성숙 수지상세포는 단핵구 세포의 표면 표현형인 CD14를 발현하지 않으며, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상세포에 비해 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 상기 미성숙 수지상세포는 식균 활성이 강하고 T 세포 활성화 기능이 낮은 세포일 수 있다. 상기 성숙 수지상세포는 Pdlim4뿐만 아니라, CD80, CD86, CD83, MHC II, 또는 이들의 조합을 높게 발현할 수 있다.
상기 수지상세포는 동물의 기관, 조직, 골수 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다.
상기 수지상세포를 얻기 위한 과정에서 이용되는 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Waymouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 성숙되지 않은 수지상세포는 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 배양하는 단계를 통하여 획득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “성숙 수지상세포”는 성숙되지 않은 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅱ, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높으며, 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction) 에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다. 성숙 수지상세포는 나이브 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 갖는다.
상기 성숙 수지상세포는 Th1 보조(helper) T 세포, 세포독성(cytotoxic) T 세포, 또는 이들의 조합을 활성화시킬 수 있다. 상기 성숙 수지상세포는 Th1 세포의 분화, 증식, 그의 활성, 또는 이들의 조합을 증가시켜 Th1 세포를 활성화시킬 수 있다. 상기 성숙 수지상세포는 세포독성 T 세포의 분화, 증식, 그의 활성, 또는 이들의 조합을 증가시켜 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 상기 성숙 수지상세포는 인터루킨(interleukin: IL)-12, 종양 괴사 인자 α(tumor necrosis factor α: TNF-α), IL-1β, IL-6, 또는 이들의 조합의 사이토카인 분비능이 증가된 것일 수 있다.
상기 조성물은 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블로팅(Northern blotting), 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 또는 이들의 조합의 방법에 사용될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR 또는 역전사 PCR일 수 있다.
다른 양상은 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제, 또는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는, 미성숙 수지상세포의 분화를 조절하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제, 또는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는, 수지상세포의 수상돌기 형성을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 Pdlim4 단백질, 단편, 수지상세포, 및 미성숙 수지상세포는 전술한 바와 같다.
상기 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현시키는 제제는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터(expression vector)는 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드(예, pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUB110, pTP5), 효모-유래 플라스미드(예, YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(예, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 또는 바큘로바이러스(baculovirus)일 수 있다.
상기 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 활성화시키는 제제는 인터페론(interferon), 바이러스, 폴리이노신산:폴리시티딜산(Polyinosinic:polycytidylic acid: poly I:C), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide), Pdlim4 특이적 리간드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 인터페론은 인터페론 감마(interferon γ: IFR-γ)일 수 있다. 상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스이다. 상기 바이러스는 예를 들어 웨스트 나일 바이러스(west Nile virus: WNV), 뎅기(dengue) 바이러스, 신드비스(sindbis) 바이러스, 인플루엔자(influenza) 바이러스, 센다이(sendai) 바이러스, 및 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus: VSV)이다. 상기 리간드는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다.
상기 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 마이크로 RNA(microRNA: miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA), Rsad2 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 압타머(aptamer), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 분화(differentiation)는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상을 말한다. 상기 분화는 성숙(maturation)을 포함할 수 있다. 상기 성숙은 세포의 운명이 변경되지는 않지만, 기능이 더욱 특수화되는 것일 수 있다.
상기 분화의 조절은 분화를 유도하거나 또는 억제하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로 분화를 유도하기 위한 것일 수 있다. 성숙 수지상세포는 T 세포의 증식, 분화, 또는 활성화를 유도할 수 있으므로, 상기 조성물은 성숙 수지상세포로의 분화를 유도함으로써 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 면역 반응은 항원-특이적 세포독성 T 림프구에 의한 것일 수 있다. 상기 면역 반응은 암세포-특이적 세포독성 T 림프구에 의한 것일 수 있다. 상기 면역 반응은 항암 면역 반응일 수 있다. 상기 조성물은 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로 분화를 억제하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 성숙 수지상세포로의 분화를 억제함으로써, 면역 관용을 유도할 수 있다. 용어 "면역 관용(immune tolerance)"은 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태를 의미한다. 따라서, 상기 조성물은 면역반응 또는 면역관용을 유도하기 위한 것일 수 있다.
Pdlim4는 F-액틴의 위치를 변화시키고, 이에 따라 성숙 수지상세포의 모양에 영향을 준다. 또한 Pdlim4의 발현 억제, 촉진에 따라 F-액틴의 발현에 의한 성숙 수지상세포의 크기 및 수상돌기의 수가 조절되는 효과가 있다.
다른 양상은 미성숙 수지상세포와, Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제를 접촉시켜 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상세포 치료제의 제조 방법, 및 이에 의해 제조된 수지상세포 치료제를 제공한다.
미성숙 수지상세포, 수지상세포, Pdlim4 단백질, 단편, 제제, 및 분화는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 미성숙 수지상세포와, Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다. 상기 접촉은 미성숙 수지상세포를 상기 제제의 존재 하에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 접촉에 의해, 상기 제제는 미성숙 수지상세포로 형질전환(transduction) 또는 형질 감염(transfection)될 수 있다. 상기 배양은 실온 내지 약 40℃, 또는 약 37℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 배양은 약 1% 내지 약 10% CO2, 또는 약 5% CO2의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 배양은 약 1일 내지 약 2 개월, 약 3일 내지 약 1개월, 약 3일 내지 약 21일, 약 3일 내지 약 19일, 또는 약 5일 내지 약 16일 동안 수행될 수 있다. 상기 배양은 세포 배양을 위한 배지의 존재 하에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “접촉”은 충분한 시간 및 조건 하에서 수지상세포에 Pdlim4가 영향을 줄 수 있는 상태를 의미한다.
상기 수지상세포 치료제는 성숙 수지상세포일 수 있다. 상기 수지상세포 치료제는 T 세포의 증식 또는 분화를 유도하고, 보조(helper) T 세포 또는 세포독성(cytotoxic) T 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
상기 치료제는 암 면역 치료제일 수 있다. 암 면역 치료제는 면역계를 이용하여 암을 치료할 수 있는 제제를 말한다. 상기 치료제는 암세포에 대해 면역 반응을 유도하여 암세포 특이적으로 암세포를 제거할 수 있다. 상기 암은 예를 들어 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 갑상선암, 또는 혈액암이다.
상기 치료제는 감염 치료제, 예를 들면 바이러스에 의한 감염 치료제 또는 세균에 의한 감염 치료제일 수 있다.
상기 수지상세포 치료제는 수지상세포를 약학적 유효량으로 포함할 수 있다. "약학적 유효량"은 약학적 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 말한다. 수지상세포 치료제 중 수지상세포는 특정의 세포수로 한정되지 않는다. 수지상세포 치료제 중 수지상세포의 개수는 예를 들어 2×106 세포 이하, 1×106 세포수 이하, 5×105 세포수 이하, 또는 5×105 세포 내지 2×105 세포일 수 있다. 상기 수지상세포 치료제는 개체에 비경구로 투여될 수 있고, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여될 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 수지상세포 치료제의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
다른 양상은 미성숙 수지상세포와, Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 접촉시켜 미성숙 수지상세포의 분화를 억제하는 단계를 포함하는, 면역 관용 수지상세포를 제조하는 방법, 및 이에 의해 제조된 면역 관용 수지상세포를 제공한다.
미성숙 수지상세포, 수지상세포, Pdlim4 단백질, 단편, 제제, 접촉, 및 분화는 전술한 바와 같다.
용어 "면역 관용 수지상세포(immune tolerogenic dendritic cell)"는 자가 항원에 대한 관용을 유도하고 T 세포의 증식을 억제하는 수지상세포를 말한다. 상기 면역 관용 수지상세포는 미성숙 수지상세포 또는 준성숙 수지상세포일 수 있다. 상기 면역 관용 수지상세포는 T 세포의 증식 또는 분화를 억제할 수 있다. 상기 면역 관용 수지상세포는 자가 면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 상기 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 상기 자가 면역 질환은 제1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병이다. 상기 면역 관용 수지상세포는 개체에 비경구로 투여될 수 있고, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여될 수 있다.
상기 방법에서, 성숙 수지상세포의 이동능의 증가, 성숙도 증가는 pJNK, 또는 ERK1/2 신호전달에 기인한 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 이동능이 증가된 성숙 수지상세포를 포함하는 약학적 조성물로서, 자가면역질환, 암, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것인 약학적 조성물을 제공한다.
상기 자가 면역 질환은 생체 내에서의 자가 면역 반응에 의해 유발되는 모든 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들어, 상기 자가 면역 질환은 제1 형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 및 고밀도 침착병이다.
상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염증성 질환은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로서, 부종, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크 론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스성 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 관절염, 골 관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충과 같은 병원체에의 감염에 의해 발생하는 질환을 총칭하는 것으로서, 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스(HBV, HCV), 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV), 선천성 거대세포바이러스(cytomegalovirus; CMV), 엔테로바이러스(enterovirus), 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C의 인플루엔자(influenza with Influenza virus A, B and C), 호흡기 세포융합바이러스(syncytial respiratory virus; SRV), 또는 HTLV), 박테리아 및/또는 그들의 독소(파상풍(tetanus), 디프테리아(diphtheria), 폐렴구균(pneumococci), 수막염구균(meningococci), 메티실린 내성 형태(methicilin resistant forms)를 포함하는 포도상구균(staphylococci), 클렙시라(Klebsiellas), 시겔라(Shigellas), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테리아(enterobacteria) 또는 병원내 질병(nosocomial diseases)을 포함한 항생제 내성 질환(antibiotic resistant pathologies)), 기생충(말라리아(paludism), 레이쉬마니아증(Leishmaniosis), 트리파노소마증(trypanosomiasis)) 및 치군군야(chikungunya), 조류독감, SARS(severe acute respiratory syndrome virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 뎅기열(Dengue fever) 바이러스 또는 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)와 같은 출혈열(haemorrhagic fevers)에 관한 바이러스과 같은 신종 질병(emerging diseases), 탄저병(Anthrax), 보툴리누스중독증(botulism), 흑사병(Plague), 천연두(smallpox) 및 수두 바이러스(poxvirus), 튜라레미아증(Tularaemia), 출혈열 병원균(haemorrhagic fever agents), 브루셀라증(brucellosis), 포도상구균 B 엔데로톡신(Staphylococcus B Enterotoxins), 디프데리아 독소(diphtheric toxin) 또는 바이러스성 뇌염(viral Encephalitis)과 같은 바이오 테러리즘(bio-terrorism)에 관한 질병을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 이동능이 증가된 성숙 수지상세포가 림프절에서 T 세포를 활성화시키고 면역반응을 유도함으로써 치료할 수 있는 질환, 예를 들어, 암, 자가면역질환, 감염성 질환, 또는 염증성 질환을 예방하거나 치료하는 효과가 있다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 자가면역질환, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 자가면역질환, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다
상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 통상의 면역증강제와 함께 사용될 수 있다. 면역증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 말하며 이러한 면역증강제는 항원의 표면적을 증가시키거나, 체내에서 항원의 정체를 연장시켜 면역시스템이 항원에 접근할 수 있도록 하거나, 항원 방출을 지연시키거나, 항원을 대식구에 표적화 시키거나, 대식구를 활성화시키는 등을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 작용하는 것으로 보고되었다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol., 4:369-388). 전형적인 면역증강제에는 프로인트 면역증강제((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), LPS 등이 있다.
일 양상에 따른 방법은 성숙 수지상세포의 이동능을 증가시킬 수 있고, 수지상세포의 염증성 사이토카인 생산 유도, T 림프구 증식 유도, 및 T 림프구 분극화 유도를 증가시킬 수 있으므로 면역 관련 질환, 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
도 1a는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 표면 항원 분자 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.도 1b는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 사이토카인 분비 양상을 EDLISA로 확인한 결과이다.
도 1c는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)의 식세포 능력을 평가한 결과이다.
도 2a는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 mRNA 발현 정도를 GAPDH를 이용해 정량한 결과 그래프이다.
도 2b는 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 단백질 발현 정도를 면역블로팅으로 확인한 결과이다.
도 2c는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 단백질 발현 정도를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 3a, 3b, 3c는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 Pdlim4의 RNA 발현 수준과 Pdlim4 단백질의 양을 각각 RT-PCR, 면역블로팅 및 면역형광염색 방법으로 측정한 결과이다.
도 3d는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 표면 항원 분자를 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 3e는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과이다.
도 4a는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이고, 도 4b는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 5a는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이고, 도 5b는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 생체 내 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 T 세포의 증식을 평가한 결과 그래프이다.
도 7은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 보조 T 세포의 생성을 평가한 결과 그래프이다.
도 8은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포로 자극한 T 세포에서사이토카인 분비 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포 표면의 CCR7 발현을 유세포분석을 통해 확인한 결과이다.
도 10a, 도 10b는 각각 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 p38, ERK 1/2, JNK, NF-κB의 단백질 수준 및 그들의 인산화된 형태의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과, 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 11a 및 11b는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 F-액틴의 위치, 모양을 확인한 결과이다.
도 11c는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 세포 크기를 측정한 결과이다.
도 11d는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 교선의 합을 측정한 결과이다.
도 1c는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)의 식세포 능력을 평가한 결과이다.
도 2a는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 mRNA 발현 정도를 GAPDH를 이용해 정량한 결과 그래프이다.
도 2b는 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 단백질 발현 정도를 면역블로팅으로 확인한 결과이다.
도 2c는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 단백질 발현 정도를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 3a, 3b, 3c는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 Pdlim4의 RNA 발현 수준과 Pdlim4 단백질의 양을 각각 RT-PCR, 면역블로팅 및 면역형광염색 방법으로 측정한 결과이다.
도 3d는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 표면 항원 분자를 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 3e는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과이다.
도 4a는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이고, 도 4b는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 5a는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이고, 도 5b는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 생체 내 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포의 T 세포의 증식을 평가한 결과 그래프이다.
도 7은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포에서 보조 T 세포의 생성을 평가한 결과 그래프이다.
도 8은 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포로 자극한 T 세포에서사이토카인 분비 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 Pdlim4의 발현을 억제시킨 성숙 수지상세포 표면의 CCR7 발현을 유세포분석을 통해 확인한 결과이다.
도 10a, 도 10b는 각각 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 p38, ERK 1/2, JNK, NF-κB의 단백질 수준 및 그들의 인산화된 형태의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과, 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 11a 및 11b는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 F-액틴의 위치, 모양을 확인한 결과이다.
도 11c는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 세포 크기를 측정한 결과이다.
도 11d는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 교선의 합을 측정한 결과이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 성숙 수지상세포의 바이오마커 확인
1.1. 수지상세포의 제조
마우스에서 수지상세포를 수득하기 위하여, C57BL/6 (마우스 기본 유전자 정보의 기준이 되는 스트레인) 마우스를 구입하였다. C57BL/6 마우스의 종아리 뼈와 허벅지 뼈에서 골수 세포를 채취하였다. 10%(v/v)의 열처리한 소태아혈청(FBS)(Gibco), 1X Glutamax(Gibco), 1X antibiotic-antimycotic(Gibco), 1X 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol: 2-ME), 20 ng/㎖의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)(JW creagene), 및 2 ng/㎖의 IL-4(creagene)를 함유한 RPMI1640(Lonza) 배지를 준비하였다. 2x106 세포의 골수 세포를 직경 100 mm의 배양 접시에 가하고, 준비된 배양 배지 10 ㎖를 골수 세포에 가하였다. 골수 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 그 후 3일 마다 10 ㎖의 신선한 배지로 교체하면서 골수 세포를 배양하여, 골수 세포를 미성숙 수지상세포로 분화시켰다.
8일째에 배양된 골수 세포를 수득하고, 수득된 골수 세포에 1 ㎍/㎖의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide: LPS)(Sigma-Aldrich)와 10 ㎍/㎖의 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin: KLH)(JW creagene)을 포함한 RPMI1640(Lonza)의 배지에서, 약 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하여, 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로 분화시켰다.
1.2. 성숙 수지상세포의 특징 확인
(1) 표면 항원 분자의 확인
성숙 수지상세포의 표면 항원 분자를 확인하기 위해, 1.1.에 기재된 바와 같이 성숙 수지상세포를 준비하였다. 1x105 세포의 성숙 수지상세포에 형광 물질이 접합된 항체를 가하고, 약 4℃에서 약 20분 동안 인큐베이션하여 세포를 염색하였다. 항체로서, 피코에리트린(phycoerythrin: PE) 접합 항-CD11c 항체, 플루오로세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate: FITC) 접합 항-CD14 항체, PE 접합 항-CD40 항체, FITC 접합 항-CD54 항체, PE 접합 항-CD80 항체, FITC 접합 항-CD86 항체, FITC 접합 항-MHC I 항체, 및 PE 접합 항-MHC II 항체(BD Pharmingen)를 사용하였다.
그 후, 세포를 인산염 완충 염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척하였다. 세척된 세포를 PBS에 현탁하고, 유세포 분석기 FACS Calibur(BD Biosciences, Mountain View, CA)로 분석하였다. 총 10,000 세포의 형광 강도를 측정하여 BD Biosciences의 flowjo10 소프트웨어로 분석하였다. 유세포 분석 결과를 도 1a에 나타내었다(MFI: mean fluorescence intensity, imDC: 미성숙 수지상세포, mDC: 성숙 수지상세포, *: p<0.05, **: p<0.01).
도 1a에 나타난 바와 같이, 준비된 수지상세포에서 CD40, CD54, CD80, CD86, MHC I, 및 MHC II의 발현이 미성숙 수지상세포에 비해 유의하게 증가하여, 준비된 세포는 성숙 수지상세포의 표면 항원 분자를 갖는 것을 확인하였다.
(2) 사이토카인 분비의 확인
1.1.에 기재된 바와 같이 준비된 성숙 수지상세포에서 사이토카인의 분비를 측정하였다.
성숙 수지상세포를 배양한 배양액을 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액을 0.22 μm 포어 사이즈의 필터로 여과한 후 각각의 사이토카인을 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다. 인터루킨(Interleukin: IL)-12p70(BD Bioscience), IL-1β(Biolegend), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor alpha: TNF)-α의 ELISA 키트, 및 IL-6(Biolegend)를 사용하여 측정하였다. 측정된 사이토카인의 양을 도 1b에 나타내었다(imDC: 미성숙 수지상세포, mDC: 성숙 수지상세포, **: p<0.01, ***: p<0.001).
도 1b에 나타난 바와 같이, 준비된 수지상세포에서 IL-12p70, IL-1β, TNF-α, 및 IL-6가 미성숙 수지상세포에 비해 유의하게 증가하여, 준비된 세포는 성숙 수지상세포와 유사한 사이토카인 분비 특징을 나타내는 것을 확인하였다.
(3) 식세포 능력의 확인
1.1.에 기재된 바와 같이 준비된 성숙 수지상세포에서 식세포 능력을 FITC-덱스트란 흡수 검증법으로 분석하였다.
각각 5x105 세포의 미성숙 수지상세포와 성숙 수지상세포를 1 ㎖의 RPMI1640에 현탁하고, FACS 튜브에 가하였다. 그 후, 세포에 1 mg/㎖의 FITC(Sigma-Aldrich)로 표지된 덱스트란(Sigma-Aldrich)을 가하고, 37℃와 4℃에서 각각 1시간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 세척된 세포를 PBS에 현탁하였다. 유세포 분석기 MACSQuant analyzer 10 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 세포의 FITC에 의해 검출된 형광 강도(% FITC-dextran positive cells)를 측정하고, 그 결과를 도 1c에 나타내었다(imDC: 미성숙 수지상세포, mDC: 성숙 수지상세포, ***: p<0.001).
도 1c에 나타난 바와 같이, 성숙 수지상세포에서 FITC-덱스트란 양성 세포로부터 방출된 형광 강도가 미성숙 수지상세포에 비해 유의하게 감소하였다. 따라서, 미성숙 수지상세포는 강한 식세포 능력이 있는 반면, 성숙 수지상세포는 식세포 능력이 감소하였음을 확인하였다.
1.3. 성숙 수지상세포 특이적 바이오마커의 확인
(1) 역전사 중합효소 연쇄 반응
성숙 수지상세포에서 성숙 수지상세포 특이적 바이오마커를 확인하기 위해, 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription polymerase chain reaction: RT-PCR)을 수행하였다.
우선, 1.1.에 기재된 바와 같이 준비된 성숙 수지상세포에서 LABOzol (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트(Labopass™)를 사용하여, 분리된 총 RNA로부터 상보성 DNA(complementary DNA: cDNA)를 합성하였다.
합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 표 1의 프라이머 세트를 사용하여 Enpp2, Orm1, Pdlim4 및 GAPDH를 증폭하였다.
| 유전자 | 서열 | ||
| Pdlim4 | 정방향 | 5′-GGTGCCTGAATCTAACCAGAAG-3' | 서열번호 1 |
| 역방향 | 5′-CCACGCCAACATCCAGAATA-3′' | 서열번호 2 | |
| GAPDH | 정방향 | 5′-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3′' | 서열번호 3 |
| 역방향 | 5′- CCTGTTGCTGTAGCCGYATT-3′ | 서열번호 4 | |
도 2a는 성숙 수지상세포(mDC)와 미성숙 수지상세포(imDC)에서 Pdlim4 mRNA 발현 정도를 GAPDH를 이용해 정량한 결과 그래프이다(***: p<0.001).도 2a에 나타낸 바와 같이, Pdlim4 mRNA가 미성숙 수지상세포에 비해 성숙 수지상세포에서 유의적으로 높게 발현되는 것을 확인하였다.
(2) 면역블로팅
1.1.에 기재된 바와 같이 준비된 성숙 수지상세포에서 총 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질의 농도는 Bradford assay kit(Sigma aldrich)를 사용하여 측정하였다.
동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동하고, 1차 항체로서 항- Pdlim4 항체 및 항-GAPDH 항체(모두 1:1000 희석, Santa Cruz and BioSS)를 사용하고, 2차 항체로 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP)-접합 2차 항체(1:2000 희석; Cell Signaling Technologies)를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 검출된 밴드 강도는 Luminescent 이미지 분석장치 LAS-4000(GE Healthcare)을 사용하여 산출하고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타난 바와 같이, Pdlim4 단백질은 미성숙 수지상세포에 비해 성숙 수지상세포에서 유의적으로 더 높게 발현되는 것을 확인하였다.
(3) 면역형광염색
동일한 수의 수지상세포를 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)이 코팅된 유리 슬라이드에 부착하여 1% 파라포름알데하이드로 고정한 후, 0.1% 트리톤-엑스 100 용액을 이용하여 투과화하였다. 1차 항체로서 항-Pdlim4항체(1:200 희석)를 사용하고, 2차 항체로 Alexa Fluor 488-접합 2차 항체(1:500 희석, Cell Signaling Technologies)를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다. 슬라이드 시료는 DAPI가 첨가되어 있는 봉입제를 사용하여 고정하였다. Leica TCS-NT SP 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 2c에 나타내었다.
도 2c에 나타난 바와 같이, Pdlim4 단백질은 미성숙 수지상세포에 비해 성숙 수지상세포에서 더 높게 발현되는 것을 확인하였다.
따라서, Pdlim4를 이용하여 성숙 수지상세포를 검출할 수 있음을 확인하였다.
1.4. 성숙 수지상세포에서 Pdlim4의 기능 확인
(1) RNA 간섭
성숙 수지상세포에서 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA)를 이용하여 Pdlim4 유전자 발현을 억제시킬 경우 수지상세포의 성숙에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, Pdlim4 shRNA(센스 서열: 5′-GATCCGACGAATACATTAAGGAGAACTCGAGTTCTCCTTAATGTATTCGTCGTTTTTG-3′)는 화학적으로 합성하여 렌티바이러스 벡터에 초록 형광 단백질에 대한 서열과 함께 삽입하였다. 재조합된 벡터는 패키징 플라스미드와 함께 293T 세포에 공-형질감염하여 렌티바이러스를 제작하였다. 음성 대조군으로는 GFP에 대한 서열만 삽입된 벡터로 만든 렌티바이러스를 사용하였다.
1.1.에 기재된 바와 같이 채취한 골수세포를 10%(v/v)의 열처리한 소태아혈청(FBS)(Gibco) 1X Glutamax(Gibco), 1X antibiotic-antimycotic(Gibco), 1X 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol: 2-ME), 30 ng/㎖의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)(JW creagene),및 20 ng/㎖의 IL-4(creagene)를 함유한 RPMI1640(Lonza) 배지에 2x106 세포/㎖ 되도록 현탁하였다. 이후, 바이러스가 포함된 적절한 부피의 상청액을 세포가 현탁된 배양 배지에 첨가한 뒤, 10㎖를 직경 100mm의 배양접시에 가하고 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤, 바이러스가 포함되지 않은 새로운 배양 배지로 교체하고 2일 마다 절반의 배지를 신선한 배지로 교체하면서 골수 세포를 배양하여, 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
분화 7일째에 1.1에 기재된 바와 같이 미성숙 수지상세포를 1 ㎍/㎖의 LPS와 40 ㎍/㎖의 KLH을 포함한 RPMI1640(Lonza)의 배지에서, 약 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하여, 성숙 수지상 세포로 분화를 유도하였다.
이와 같이 유도된 성숙 수지상세포에서, Pdlim4의 RNA 발현 수준과 Pdlim4 단백질의 양을 각각 상기 기재된 바와 같이 RT-PCR, 면역블로팅 및 면역형광염색 방법으로 측정하고, 그 결과를 각각 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 나타내었다(**: p<0.01).
도 3a, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, Pdlim4 shRNA가 형질감염된 수지상세포(shPdlim4)는 대조군 수지상세포(shCon)에 비해 수지상세포에서 Pdlim4의 발현이 유의하게 감소하였다.
또한, 수지상세포의 표면 항원 분자를 상기 기재된 바와 같이 유세포 분석으로 확인하고, 분비되는 사이토카인을 ELISA로 검출하였다. 유세포 분석 및 사이토카인 분석 결과를 각각 도 3d 및 도 3e에 나타내었다(**: p<0.01, ***: p<0.001).
도 3d에 나타난 바와 같이 Pdlim4 shRNA가 형질감염된 수지상세포는 MHCII, CD40, CD80 및 CD86I이 성숙 수지상세포에 비해 유의하게 감소하였다.
도 3e에 나타낸 바와 같이 Pdlim4 shRNA가 형질감염된 수지상세포는 성숙 수지상세포 및 음성 대조군에 비해 IL-12p70, IL-1β, TNF-α, 및 IL-6가 유의하게 감소하였다.
따라서, Pdlim4의 발현을 억제함으로써 성숙 수지상세포의 면역증진 능력이 저해되었음을 확인하였다.
(2) 수지상세포의 이동능 평가 (in vitro)
성숙 수지상세포에서 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA)를 이용하여 Pdlim4 유전자 발현을 억제시킬 경우 수지상세포의 이동능에 미치는 영향을 이동 분석법(migration assay)을 통해 확인하였다.
도 4a는 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 8.0 μm 포어 폴리카보네이트 멤브레인을 함유한 트랜스웰-플레이트 (Corning, NY, USA)를 이용하였다. 8일간 배양한 성숙 수지상세포를 수거한 후, RPMI 1640 배지에 현탁하여 트랜스웰-플레이트 상단에 5Х105 세포/200 μL로 넣고, 트랜스웰 하단에 2% 우태아혈청, 100 ng/mL 재조합 마우스 CCL19 (Peprotech)가 첨가된 RPMI 1640 배지를 800 μL 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 배양 후 트랜스웰 하단 배양액을 수거하여 세포수를 측정하였다. 측정 결과를 도 4b에 나타내었다.
도 4b는 shRNA가 형질감염된 수지상세포의 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, Pdlim4 발현을 억제한 성숙 수지상세포의 경우 대조군 성숙 수지상세포에 비하여 세포 이동능이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
(3) 수지상세포의 이동능 평가 (in vivo)
성숙 수지상세포에서 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA)를 이용하여 Pdlim4 유전자 발현을 억제시킬 경우 수지상세포의 이동능에 미치는 영향을 동물 모델을 통해 확인하였다.
도 5a는 수지상세포의 이동능을 측정하기 위한 실험 설계의 모식도이다. 구체적으로, 8일간 배양한 성숙 수지상세포를 수거한 후, 세포를 제품 설명에 따라 5mM의 CellTrace Violet(Invitrogen)으로 표시하였다. 표시된 세포는 따뜻한 PBS에 2×106 세포/mL로 현탁하여 마우스의 왼쪽 발바닥에 50 μL씩 피하주사 하였다. 24시간 뒤, 마우스 양 다리의 슬와 림프절을 절제하여 분쇄해 단일세포화 하였다. 세포는 PE-접합 CD11c항체로 염색하여 유세포 분석기 MACSQuant analyzer 10 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 림프절 내 CD11c+ 세포 중 Violet+인 주사해준 세포의 비율을 확인하였다.
도 5b는 shRNA가 형질감염된 수지상세포의 생체 내 이동능을 측정한 결과 그래프이다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, Pdlim4 발현을 억제한 성숙 수지상세포의 경우 대조군 성숙 수지상세포에 비하여 생체 내 세포 이동능이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
(4) 수지상세포에 의한 T 세포의 증식
C57BL/6 쥐에서 비장을 분쇄한 뒤 ACK 용해 완충액(LONZA) 사용하여 비장 분쇄물에서 적혈구를 제거하였다.
그 후, 나일론 울(wool)(Polysciences Inc., Warrington,PA, USA) 컬럼을 준비하고, 비장 분쇄물을 통과시켜 CD3+ T 세포를 분리하였다. 분리된 CD3+ T 세포에 FITC 접합된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester: CFSE)(eBioscience)를 가하여 T 세포를 염색하였다.
상기 기재된 것과 같은 방법으로 스크램블 siRNA 또는 100 nM Pdlim4 shRNA로 형질감염된 수지상세포를 준비하였다. 약 2x105 세포의 수지상세포와 약 1x107 세포/㎖의 염색된 CD3+ T 세포를 1:10의 세포수 비율로 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2의 조건 하에서 약 72시간 동안 공동 배양하였다. 공동 배양된 세포를 유세포 분석법으로 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다(imDC: 미성숙 수지상세포, T: CD3+ T 세포, 스크램블: 스크램블 siRNA 형질 감염, 100 nM: 100 nM Pdlim4 shRNA로 형질감염). 도 6에서 수치는 증식된 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 6에 나타난 바와 같이, 성숙 수지상세포 또는 스크램블 shRNA로 형질감염된 수지상세포는 T 세포의 증식을 유도하였으나, Pdlim4 shRNA로 형질감염된 수지상세포는 T 세포의 증식을 거의 유도하지 않았다.
(5) 수지상세포에 의한 보조(helper) T 세포의 생성
상기 기재된 바와 같이 스크램블 sihNA로 형질감염된 수지상세포, 및 Pdlim4 shRNA로 형질감염된 수지상세포를 준비하였다.
준비된 수지상세포와 CD3+ T 세포를 약 3일 동안 공동배양하였다. 항-인터페론 감마(interferon gamma: IFN γ) 항체(BD Antibodies), 항-IL-17A 항체(BD Antibodies), 및 항-IL-4 항체(ebioscience)를 사용하여 유세포 분석법으로 T 세포의 서브타입을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, Pdlim4 shRNA로 형질감염된 수지상세포(shPdlim4)는 스크램블 shRNA로 형질감염된 수지상세포(shCon)에 비해, Th1 세포(IFN-γ+/CD4+), Th2(IL-4+/CD4+), 및 Th17(IL-17A+/CD4+)의 비율이 감소하였다.
(6) 수지상세포로 자극한 T 세포의 사이토카인 분비
수지상세포와 CD3+ T 세포를 3일간 공동 배양한 배양액을 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액에서 각각의 사이토카인을 ELISA기법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로는 인터페론(Interferon: IFN)-γ(BD Bioscience), IL-4 (Biolegend) 및 IL-17A (BD Bioscience)의 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 측정된 사이토카인의 양을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Pdlim4 발현을 억제한 성숙 수지상세포(shPdlim4)로 자극한 T 세포는 Pdlim4 발현을 억제한 대조군 성숙 수지상세포(shCon)에 비하여 사이토카인의 분비 양이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이는 Pdlim4 발현 억제에 의해 성숙 수지상세포가 T 세포를 분화, 증식, 또는 활성화시키는 기능을 상실하고, 이에 따라 보조 T 세포의 분화가 억제된 결과이다.
(7) 수지상세포의 CCR7의 발현 변화 확인
수지상세포의 이동에는 수지상세포의 귀소 수용체(homing receptor)인 CCR7이 관여한다고 알려져 있다. 따라서, Pdlim4 발현 억제에 따른 성숙 수지상세포의 이동능 변화가 CCR7과 관련이 있는지 확인하기 위해서, 성숙 수지상세포 표면의 CCR7 발현을 유세포 분석으로 확인하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, Pdlim4 발현을 억제한 성숙 수지상세포에서 표면 단백질인 CCR7 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
따라서, Pdlim4 발현 억제에 따라 발생한 이동능의 변화는 CCR7의 발현과 연관이 있음을 알 수 있다.
(8) Pdlim4 발현 억제에 따른 변화의 원인 확인
상기에서 확인한 바와 같은 수지상세포에서의 변화의 원인을 확인하기 위해서, 성숙 수지상세포에서 세포 내부의 신호전달 단백질(p38, ERK 1/2, JNK, NF-κB)들의 전체 단백질 및 인산화된 형태(p)를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
도 10a, 도 10b는 각각 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 p38, ERK 1/2, JNK, NF-κB의 단백질 수준 및 그들의 인산화된 형태의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과, 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교해서, Pdlim4 발현이 감소된 성숙 수지상세포에서 p-JNK 및 p-NF-κB의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, Pdlim4의 발현 감소에 의한 성숙 수지상세포의 성숙도, 이동능 변화는 p-JNK, p-NF-κB의 발현 변화와 관련되어 있음을 알 수 있다.
(9) Pdlim4 발현에 따른 수상돌기 변화 확인
Pdlim4는 액틴에 결합하는 단백질로, 액틴 세포골격(cytoskeleton)의 인지에 관여하는 단백질이고, 세포골격 재배열이 수지상세포의 성숙에 관여한다. 따라서, Pdlim4가 성숙 수지상세포의 성숙과 관련된 수상돌기의 형성에 관여하는지 확인하기 위해, 성숙 수지상세포에서 F-액틴의 위치, 모양을 면역형광염색을 통해 확인하였다.
도 11a 및 11b는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 F-액틴의 위치, 모양을 확인한 결과이다. 녹색은 F-액틴 형성을, 붉은색은 Pdlim4 발현을, 청색은 DAPI로 염색된 핵을 나타낸다. 스케일바 = 20 μm. 모양 확인을 위해서는 공지된 Sholl 분석 방법을 사용하였다.
도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 성숙 수지상세포는 전형적인 성숙 수지상세포의 모양을 나타내었으나, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포는 성숙 수지상세포에서 나타나는 수상돌기 모양을 나타내지 않았고, 세포 크기가 감소한 것을 확인하였다.
또한, LPS로 상기 성숙 수지상세포를 24시간 동안 자극한 후, 최대 세포 크기 및 교선(intersection)의 합을 측정하였다. 크기 및 교선의 합은 평균±SEM(n=7)으로 나타내었다. ***P<0.001, **P<0.01 이다.
도 11c는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 세포 크기를 측정한 결과이다.
도 11d는 성숙 수지상세포, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포를 LPS로 자극한 후 교선의 합을 측정한 결과이다.
세포 반지름 및 교선(intersection)의 합은 단일 세포 내의 수상돌기의 수를 나타내는 데 사용된다.
도 11c 및 11d에 나타낸 바와 같이, 최대 세포 반지름 및 교선(intersection)의 합 모두 성숙 수지상세포에 비해, Pdlim4 shRNA에 의해 발현이 저해된 성숙 수지상세포에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
따라서, Pdlim4에 의해 F-액틴에 의해 매개되는 수상돌기의 형성이 조절되는 것을 확인하였다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pdlim4 forward primer
<400> 1
ggtgcctgaa tctaaccaga ag 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pdlim4 reverse primer
<400> 2
ccacgccaac atccagaata 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 3
aacagcaact cccactcttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 4
cctgttgctg tagccgyatt 20
Claims (16)
- PDZ 및 LIM 도메인 단백질 4(PDZ and LIM domain protein 4: Pdlim4) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 성숙 수지상 세포 검출용 조성물로서, 상기 성숙 수지상 세포는 수지상세포 타입 1(dendritic cell 1: DC1) 세포인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물. - 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 Th1 보조(helper) T 세포, 세포독성(cytotoxic) T 세포, 또는 이들의 조합을 활성화시키는 것인 조성물.
- 삭제
- Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제, 또는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는, 미성숙 수지상 세포의 분화를 조절하기 위한 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현시키는 제제는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터인 것인 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 마이크로 RNA(microRNA: miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA), Pdlim4 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 항체 또는 압타머(aptamer), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 면역반응 또는 면역관용을 유도하기 위한 것인 조성물.
- Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제, 또는 Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는, 수지상세포의 수상돌기 형성을 조절하기 위한 조성물.
- 미성숙 수지상 세포와, Pdlim4 단백질 또는 이의 단편을 과발현 또는 활성화시키는 제제를 접촉시켜 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포 치료제의 제조 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 치료제는 암 면역 치료제, 바이러스에 의한 감염 치료제, 또는 세균에 의한 감염 치료제인 것인 방법.
- 청구항 12의 방법으로 제조된 수지상세포 치료제.
- 미성숙 수지상세포와, Pdlim4 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 접촉시켜 미성숙 수지상세포의 분화를 억제하는 단계를 포함하는, 면역 관용 수지상세포를 제조하는 방법.
- 청구항 15의 방법으로 제조된 면역 관용 수지상세포.
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