KR101117186B1 - 수지상세포의 이동성 증진 및 수지상세포에 의해 제조된 세포독성 ｔ 세포의 세포살상능 증진방법 - Google Patents

수지상세포의 이동성 증진 및 수지상세포에 의해 제조된 세포독성 ｔ 세포의 세포살상능 증진방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수지상세포의 이동성 증진 및 수지상세포에 의해 제조된 세포독성 T 세포의 세포살상력 증진방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 케모카인(chemokines)을 유효성분으로 하는 조성물이 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 및 수지상세포의 제2림프기관으로 이동성이 증진에 효과 뿐 아니라 동시에 수지상세포로부터 분화된 세포독성 T 세포의 세포 살상능이 현저히 증가시켜, 새로운 수지상세포의 성숙화 유도제로 유용하게 사용할 수 있으며, 나아가 항종양 면역치료 등의 세포 면역치료제의 대중화에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

수지상세포의 이동성 증진 및 수지상세포에 의해 제조된 세포독성 Ｔ 세포의 세포살상능 증진방법{Method for improvement of dendritic cell migration and of CTL cytotoxicity generated with dendritic cells}
본 발명은 수지상세포의 이동성 증진 및 수지상세포에 의해 제조된 세포독성 T 세포의 세포살상능 증진방법에 관한 것이다.
수지상세포(DC; dendritic cells)는 주요 항원제시 세포(APC; antigen presenting cells)로 여겨지고 있으며, 그의 주된 기능은 미생물 구조를 확인하고 림프절에서 이들을 숫 T 세포(naive T cells)에게 제시하는 것이다.
DC는 숫 CD4 T 세포의 Th1, Th2, Treg 세포 및 Th17 세포와 같은 헬퍼 T 세포로의 분화를 자극함으로써 다양한 면역반응을 지휘한다. 초기 T 세포 자극 시 DC에 의해 분비되는 사이토카인(cytokines)은 잇따른 효과가 T 세포의 분화에서 중요한 역할을 한다. Th1 세포는, 인터페론 감마(IFN-γ) 생산을 통해, 항원 제시 및 세포내 병원체에 대한 면역성을 조절하며, Th2 세포는 IL-4 및 IL-13을 생산하여 특정 체액성 반응 및 기생체에 대한 면역성을 매개한다. Th17 세포는 자가면역 및 조직 염증에서 전염증성 역할을 하는 최근에 확인된 Th-세포 계통을 포함한다. 비록 상이한 DC 서브셋이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포를 우세하게 유도하는 어느 정도 내재적인 잠재력을 가질 수 있지만, DC는 또한 미생물 및 국소적 미세환경으로부터의 신호에 반응하여 상당한 기능적 유연성을 나타낸다.
DC 성숙을 유도하는 여러 물질이 보고되어 있으며, 알려진 DC 성숙 자극제는 CD40 리간드(CD40-L), LPS(lipopolysaccharide) 및 TNF-α를 포함한다. 생체 내 및 시험관 내 모두에서 면역반응 동안 존재하는 사이토카인이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포에 대한 반응을 지시하는데 중요한 요소임이 잘 알려져 있다. 일부 보고는 기생체에 의해 생산된 지질과 같은 외부 인자가 숙주 면역성을 기피하기 위한 목적으로 DC 기능을 조절할 수 있음을 입증하였다.
DC 연구의 중요한 목적은 종양, 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 대한 면역반응을 증진시키기 위한 DC-기초한 전략의 개발이다. 최근에, DC는 종양을 치료하기 위한 많은 임상적 면역치료 프로토콜에서 사용되어 오고 있다.
지금까지, DC를 이용한 임상시험에 따르면 아주 강한 임상적 효과는 아닐지라도 임상 면역치료에서 DC가 병증의 진전에 기여하는 것으로 보인다. 따라서, DC의 분화, 성숙 및 기능에 영향을 미칠 수 있는 인자를 확인하는 것이 중요하다.
한편, 수지상세포 백신은 세포간의 정교한 인지작용에 의거한 암세포 특이적 면역반응을 유도하여 암세포만을 공격하여 사멸시키는 방법으로 기존 항암치료와 달리 부작용이나 고통이 거의 없는 무독성의 치료방법이다(Barratt-Boyes SM and Figdor CG, Cytotherapy, 6:105, 2004; Grunebach F et al. Cancer Immunol Immunother, 54:517, 2005).
최근 연구 결과에 따르면 미성숙 수지상 세포를 세포 치료제로 사용하였을 경우 암을 더 활성화시키는 결과를 나타내기도 하여, 수지상 세포를 이용한 세포 치료제는 충분히 성숙된 성숙 수지상 세포의 이용이 부각되고 있으며 특히, 단구 유래의 성숙 수지상세포 임상 암 백신으로 효과를 향상시키기 위한 성숙 수지상세포의 이동성 및 항원 특이적인 세포 살상능의 향상을 위한 연구 역시 지속적으로 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 단핵구 유래 성숙 수지상세포에 대한 임상 암 백신으로 효과를 향상시키기 위한 지속적인 연구를 하던 중, 단핵구를 미성숙 수지상세포의 수지상세포로의 분화시 케모카인을 처리함으로써 처리하지 않은 대조군에 비해 제2림프기관으로 이동성의 증진과 동시에 수지상세포로부터 세포 살상능이 증가된 세포독성 T 세포(cytolytic T cells)를 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케모카인(chemokines)에 의해 성숙화되어, 숫 T 세포의 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 Th1 세포로의 분화를 증진시키고, 항원 특이적인 세포독성 T 세포로의 세포 살상능이 향상된 수지상세포를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미성숙 수지상세포에 케모카인(chemokines)을 유효성분으로 함유하는, 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진용 조성물을 가하여 성숙 수지상세포로부터 세포독성 T 세포(cytolytic T cells)의 세포 살상능 증진방법을 제공한다.
상기 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진용 조성물은 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진을 위해 케모카인으로 2차림프기관(sencondary lymphoid organ)의 이동에 관여하는 CCL21, CCL19 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 성숙 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 세포 살상능 증진방법은 단핵구를 미성숙 수지상세포의 수지상세포로의 분화시 케모카인을 가하여 배양함으로써 제2림프기관으로 이동성의 증진과 동시에 수지상세포로부터 세포 살상능이 증가된 세포독성 T 세포를 제조할 수 있음을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계; 2) 상기 미성숙 수지상 세포에 항바이러스성 사이토카인, TLR 작동제 또는 이들의 혼합물을 처리하여 성숙 수지상세포로 성숙화 시키는 단계; 및 3) 상기 성숙화된 수지상세포에 케모카인(chemokines)을 유효성분으로 함유하는, 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진용 조성물을 가하여 배양하는 단계; 를 포함하는, 성숙 수지상세포로부터 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells)의 세포 살상능 증진방법을 제공한다.
본 발명은
1) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계; 2) 상기 미성숙 수지상 세포에 항바이러스성 사이토카인, TLR 작동제 또는 이들의 혼합물을 처리하여 성숙 수지상세포로 성숙화 시키는 단계; 3) 상기 성숙화된 수지상세포에 케모카인(chemokines)을 유효성분으로 함유하는, 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진용 조성물을 가하여 배양하는 단계; 및 4) 상기 성숙화된 수지상세포에 IP-10(Interferon-γ inducible protein-10)을 첨가하여 배양하는 단계;를 포함하는, 성숙 수지상세포로부터 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells)의 세포 살상능 증진방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 사용되어진 단핵구와 수지상세포는 건강한 공여자로부터 제공 받은 혈액으로부터 추출한 세포를 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 2) 단계의 혼합물은 IL-1, TNFα, IFNα, IFNγ, 및 polyI:C의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
상기 2) 단계 후 첨가되어지는, 상기 3) 단계의 조성물은 제2차림프기관(sencondary lymphoid organ)의 이동에 관여하는 케모카인인 것으로, CCL21, CCL19, 또는 이들의 혼합물, 보다 바람직하게는 인간에서 유래하여 박테리아에서 발현시킨 CCL21 단백질인 것을 사용할 수 있다.
상기 조성물의 유효성분인 CCL21 또는 CCL19 단백질은 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 CCL21 또는 CCL19 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, CCL21 또는 CCL19 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
또한, 상기 유효성분인 CCL21 또는 CCL19 단백질이 수지상세포의 이동성에 관여하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능하다. 경우에 따라서는 CCL21 또는 CCL19의 기능을 강화시키기 위한, 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 케모카인은 10 내지 250 ng/㎖ 농도로 처리하여, 30분 내지 2시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 성숙 수지상세포는 숫 T 세포의 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 Th1 세포로의 분화를 증진시키고, 상기 항암면역반응에 중요한 Th1 세포들에 작용하는 케모카인 IP-10(Interferon-γ inducible protein-10 )의 높은 발현을 통하여 항원 특이적인 세포독성이 증진된 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 단핵구로부터 유도되어진 미성숙 수지상세포를 성숙 수지상세포로의 성숙화를 유도 시 CCL21을 가하여 배양된, 케모카인에 의해 성숙화된 성숙 수지상세포의 케모카인 및 사이토카인에 대한 발현을 조사하였다. 그 결과 제2림프기관에서 발현하는 케모카인 CCL19에 대한 반응성이 증가로 제2림프기관으로의 성숙 수지상세포의 이동성 증진은 확인할 수 있었으나 수지상세포 표면 단백질인자인 CCR7이나 CD38의 발현양의 증가는 확인할 수 없었다. 도 1 내지 3을 참조한다.
보다 정확한 본 발명의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포의 이동성에 대한 원인규명을 확인한 결과, 수지상세포의 이동성 증진은 PI3-K에 의한 신호가 아닌, 포스파리파제 C(phospholipase C, PLC)의 신호전달에 기인한 세포내 칼슘이온의 변화에 따른 것을 확인할 수 있었다. 도 4를 참조한다.
본 발명에 따른 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포로부터 제조된 세포독성 T 세포의 세포살상능을 조사한 결과, CCL21이 처리되지 않은 성숙 수지상세포로부터 제조된 세포독성 T 세포 보다 세포살상능이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 세포살상능의 증가는 세포살상효소의 발현 증가에 기인되며, 특히 인터페론 감마(IFN-γ)가 높게 발현됨을 확인할 수 있었다. 도 5를 참조한다.
한편, IFN-γ를 생산하는 CD4+ T 세포의 발달은 IL-12를 필요로 하지만 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포의 발달은 IL-12와 무관하다는 보고가 있다(Gorbachev AV, Fairchild RL, 2004). 이에 본 발명에 따른 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에 대한 성숙 수지상세포에서 발현하는 사이토카인인 IL-12p70, IL-10 및 IL-23, 표면단백질 인자인 CD80, CD83 및 CD86, 케모카인 CCL22, P-10의 발현을 조사하였다. 그 결과 성숙 수지상세포 표면단백질 인자인 CD80, CD83 및 CD86의 발현, 성숙 수지상세포에서 발현하는 사이토카인 IL-12p70, IL-10 및 IL-23의 발현 및 성숙 수지상세포에서 발현하는 케모카인인 Th2 세포를 유인하는 CCL22에 대한 발현의 변화가 없는 반면, Th1 세포를 유인하는 IP-10의 발현은 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 도 6 내지 8을 참조한다.
상기의 결과를 바탕으로 Th1 세포를 유인하는 IP-10의 발현에 대한 본 발명의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포로부터 제조된 세포독성 T 세포의 세포 살상능을 확인한 결과, 표준 수지상세포(sDC)로부터 세포독성 T 세포의 제조시 IP-10을 동시에 첨가할 경우, IP-10이 첨가된 표준 수지상세포와 공조배양한 숫 T 세포의 세포살상능이 무처리된 숫 T 세포의 세포살상능 보다 현저히 증진되는 것을 확인할 수 있었다. 도 9를 참조한다.
본 발명은 상기 본 발명에 따른 수지상세포, 이에 의해 분화된 항원 특이적인 세포독성이 증진된 세포독성 T 세포, 또는 이에 의해 생산되는 사이토카인을 함유하는 면역치료용, 특히 종양, 감염성 질환 또는 자가면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 세포 면역치료제를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 세포 면역치료제는 통상의 면역증강제와 함께 사용될 수 있다. 면역증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 말하며 이러한 면역증강제는 항원의 표면적을 증가시키거나, 체내에서 항원의 정체를 연장시켜 면역시스템이 항원에 접근할 수 있도록 하거나, 항원 방출을 지연시키거나, 항원을 대식구에 표적화 시키거나, 대식구를 활성화시키는 등을 포함하는 다양한 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 보고되었다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol., 4:369-388). 전형적인 면역증강제에는 프로인트 면역증강제((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS) 등이 있다.
또한 본 발명에 따른 세포 면역치료제는 수술 후, 방사선치료와 병행해서 또는 항암제와 병행해서 사용함으로써 그 효과를 극대화 할 수도 있다.
본 발명에 따른 성숙 수지상세포로부터 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells)의 세포 살상능 증진방법은 케모카인(chemokines)을 유효성분으로 함유하는, 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 또는 수지상세포의 이동성 증진용 조성물을 미성숙 수지상세포의 수지상세포로의 분화시 처리함으로써 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 및 수지상세포의 제2림프기관으로 이동성이 증진에 효과 뿐 아니라 동시에 수지상세포로부터 분화된 세포독성 T 세포의 세포 살상능을 현저히 증가시켜, 새로운 수지상세포의 성숙화 유도제로 유용하게 사용할 수 있으며, 나아가 항종양 면역치료 등의 세포 면역치료제의 대중화에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 CCL21 처리에 따른 성숙화된 수지상세포의 림프절로의 이동율을 조사한 결과이고,
(A: 처리 농도, B: 처리 시간)
도 2는 본 발명에 따른 성숙화된 수지상세포의 CCL19에 대한 림프절로의 이동율을 조사한 결과이며,
도 3은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상세포에 대한 CCR7 및 CD38의 발현율을 조사한 결과이고,
도 4는 본 발명의 CCL21 처리에 따른 성숙화된 수지상세포의 림프절로의 이동에 대한 신호전달 체계를 확인한 결과이며,
도 5는 본 발명의 CCL21 처리에 따른 성숙화된 수지상세포에 대한 세포살상 T 세포의 세포 살상능을 조사한 결과이고,
(A: IFNγ 분비세포의 수, B: 세포살상효소에 대한 발현율)
도 6은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상세포에 대한 성숙 수지상세포의 특이적인 단백질 표면인자의 발현율을 조사한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상세포에 대한 IL-12p70, IL-10, IL-23, CCL22의 발현율을 조사한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상세포에 대한 IP-10의 발현율을 조사한 결과이며,
도 9는 IP-10 처리에 따른 본 발명의 성숙화된 수지상세포의 세포살상 T 세포의 세포 살상능을 조사한 결과이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 단핵구로부터 미성숙 수지상세포 및 성숙 수지상세포의 분화유도
건강한 공여자로부터 제공받은 혈액으로부터 lymphoprep(Ficoll-Hypaque)을 이용한 원심분리를 통해 단핵세포(mononuclear cells)를 획득하였고, 이를 다시 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용하여 CD14 양성 단구세포(monocytes)를 수득하였다. 상기 수득된 단구세포를 6-well 플레이트에 1×106 cells의 밀도로 하고, 10% FBS, 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 IMDM 배지를 사용하여 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 GM-CSF(50 ng/㎖)과 IL-4(20 ng/㎖)을 처리하여 6일간 배양한 후 미성숙 수지상 세포로 분화시킨 다음, ‘a-type-1-polarizing cocktail ’ 칵테일[IL-1β(10 ng/㎖), TNFa(50 ng/㎖), IFNα(3000 U/㎖), IFNγ(100 ng/㎖), and polyI:C(20 mg/㎖)]을 처리하고 2일간 배양한 후, 수지상세포를 수득하기 1시간 전 CCL21을 처리하여 수지상세포를 배양한 후 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포를 수득하였다.
[실시예 2] CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포의 림프절로의 이동율 조사
(1) CCL21 처리 농도 및 처리시간에 따른 림프절로의 이동율을 조사
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에 성숙화 유도에 있어, CCL21 처리농도(0, 5, 10, 25, 및 250 ng/mL) 및 25 ng/mL의 CCL21 처리시간(15, 30, 60, 120 min)에 따른 림프절로의 이동율을 하기의 방법으로 조사하였다.
5×104개 성숙 수지상세포를 함유한 100 ㎕의 배양배지를 transwell plate의 upper chamber에 적용하고, bottom chamber에 250 ng/mL의 농도의 CCL19 또는 CCL21을 IMDM 배지에 첨가한 후, 37℃에서 3시간 배양하여 bottom chamber로부터 500 uL를 취하여 이동된 수지상세포의 수를, 60초로 고정된 시간 내에서 유세포 측정기를 이용하여 측정하였다.
그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, CCL21의 처리 농도 및 처리시간에 따른 성숙화된 수지상세포의 림프절로의 이동율은 농도가 증가할수록 용량 의존적으로 이동율이 증가하였고, 처리시간이 길어질수록 림프절로의 수지상세포의 이동율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) CCL19에 대한 세포 이동 및 CCR7, CD38에 대한 발현
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에 대하여 2차림프기관(secondary lymphoid organ)으로의 이동 및 2차림프기관으로의 이동성에 영향을 미치는 세포표면 단백질인 CCR7 및 CD38에 대한 발현을 확인하였다.
그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, 2차림프기관에서 발현하는 CCL19에 반응한 이동성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, CCR7 및 CD38에 대한 발현을 조사한 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, CCL21에 의해 성숙된 수지상세포의 2차림프기관으로의 이동이 CCR7 및 CD38과는 관계가 없음을 확인할 수 있었다.
(3) 포스파리파제 C( phospholipase C, PLC )에 기인한 이동성 조사
상기의 (2)의 결과로부터 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포의 이동성에 대한 원인규명을 하기 위하여 PI3-kinase 저해제인 wortmannin, LY294002, 포스파리파제 C의 저해제인 U73122 및 BAPTA-AM 처리에 따른 수지상세포의 림프절로의 이동율을 상기 (1)의 방법과 동일한 방법으로 조사하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포의 이동은 PI3-kinase 저해제인 wortmannin, LY294002에 기인한 신호가 아니라 포스파리파제 C의 신호전달에 의한 세포내 칼슘이온의 변화에 따른 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3] CCL21 에 의해 성숙화된 수지상세포의 세포독성 T 세포로의 분화
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에 의해 유도된 항원 특이적인 세포살상 T 세포의 특징을 조사하였다.
실험방법은 숫 CD3+ T 세포(2×106 cell)에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 T 세포를 분리하고, HIV-1gp160 또는 흑색종과 연관된 MART-1 펩티드를 탑재한 수지상세포와 3일 동안 공조배양한 후, 10 U/mL의 IL-2와 10 ng/mL의 IL-7을 첨가하여 7일간 배양하였다. 10일 후에 다시 동일한 수지상세포로 10일간 배양한 T 세포를 자극하여 10 ng/mL의 IL-2를 함유한 배양배지 조건하에서 10일간 배양하여 분화된 세포독성 T 세포를 수득하였다.
상기 수득된 항원 특이적인 세포독성 T 세포의 IFNγ 분비세포의 수 및 세포살상효소 즉, Granzyme B, IFNγ, Perforin 및 FasL에 대한 발현을 하기 방법으로 조사하였다.
실험방법은 숫 CD3+ T 세포에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 T 세포를 분리하고 흑색종과 연관된 MART-1 펩티드를 탑재한 수지상세포와 3일 동안 공조배양한 후, 10 ng/mL의 IL-2와 10 ng/mL의 IL-7을 첨가하여 7일간 배양하였다. 10일 후에 다시 동일한 수지상세포로 10일간 배양한 T세포를 자극하여 10 ng/mL의 IL-2를 함유한 배양배지 조건하에서 10일간 배양한 후 세포살상 T 세포의 세포살상능을 조사하기 위해, ELISPOT 분석법을 이용하여 항원 특이적인 세포살상 T 세포에 의한 항원 특이적으로 발현하는 IFN-를 측정하였으며, 세포살상효소의 발현 정도를 분석하기 위하여 세포내 염색(intracellular staining)법을 사용하였다.
그 결과, 도 5에서도 확인할 수 있듯이 CCL21을 처리한 성숙 수지상세포로부터 분화된 세포살상 T 세포가 CCL21이 처리되지 않은 성숙 수지상세포로부터 분화된 세포살상 T 세포보다 세포살상력이 현저히 증가하였으며, 이러한 세포살상력의 증가는 대부분의 세포살상효소의 발현 증가에 기인되며, 특히 IFNγ의 발현이 증가함에 기인한 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 4] 성숙된 수지상 세포의 세포 표면 단백질 인자의 발현 조사
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에서 CD80, CD83, CD86과 같은 성숙 수지상세포 표면 단백질 인자를 PE-나 FITC가 결합된 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석로 측정하였다.
그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, CCL21의 처리에 의해 성숙 수지상세포 표면단백질 인자인 CD80, CD83 및 CD86에 대한 발현 변화는 없는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 5] 성숙된 수지상 세포의 사이토카인 및 케모카인 분비능 조사
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포에서 IL-12p70, IL-10, IL-23 및 CCL22 및 CXCL10(IP-10)을 포함하는 사이토카인 및 케모카인의 분비량을 조사하였다.
상기 실시예 1의 CCL21에 의해 성숙화된 수지상세포가 배양 되고 있던 배양액을 분리하고, 성숙화 도중 수지상세포로부터 분비되는 IL-12p70의 양과 48시간 동안 성숙된 수지상세포를 CD40L이 발현되는 J558세포와 공조배양한 후 공조배양도중 분비된 사이토카인 및 케모카인의 양을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 성숙 수지상세포에서 분비되는 사이토카인인 IL-12p70, IL-10, IL-23의 경우 분비의 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었고, 또한, 성숙 수지상세포에서 발현하는 케모카인 중 Th2 세포를 유인하는 CCL22의 분비 역시 변화가 없는 것을 확인할 수 있었지만 반면, Th1 세포를 유인하는 IP-10의 양이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 6] 성숙된 수지상 세포의 IP -10 처리에 따른 세포독성 T 세포의 세포 살상능 조사
상기 실시예 5의 결과로부터 IP-10에 기인한 세포독성 T 세포의 세포 살상능을 확인하기 위하여 표준 수지상세포(sDC)로부터 세포독성 T 세포를 분화시 IP-10 유무에 따른 항원 특이적인 세포독성 T 세포의 IFNγ 분비세포의 수를 하기 방법으로 조사하였다.
실험방법은 숫 CD3+ T 세포에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 T 세포를 분리하고 흑색종과 연관된 MART-1 펩티드를 탑재한 수지상세포 또는 MART-1을 탑재한 수지상세포와 50 ng/mL의 IP-10과 함께 3일 동안 공조배양한 후, 10 ng/mL의 IL-2와 10 ng/mL의 IL-7을 첨가하여 7일간 배양하였다. 10일 후에 다시 동일한 수지상세포로 10일간 배양한 T세포를 자극하여 10 ng/mL의 IL-2를 함유한 배양배지 조건하에서 10일간 배양하였다. 공조 배양하는 동안, 매 2일 마다 50 ng/mL의 IP-10이 공조배양 배지에 첨가되어졌다. 세포살상 T 세포의 세포살상능을 조사하기 위해, ELISPOT 분석법을 이용하여 항원 특이적인 세포살상 T 세포에 의한 항원 특이적으로 발현하는 IFN-를 측정하였다.
그 결과 도 9에서 확인할 수 있듯이, 표준 수지상세포(sDC)로부터 세포독성 T 세포의 분화시 IP-10을 동시에 첨가할 경우, IP-10이 첨가된 표준 수지상세포와 공조배양한 숫 T 세포의 세포살상력은 IP-10을 처리하지 않은 무처리 표준 수지상세포와 공조배양한 숫 T 세포의 세포살상력 보다 현저히 세포 살상능이 증진되는 것을 확인할 수 있었으며, IP-10을 중성화시킬 수 있는 항체인 anti-IP-10을 이용하여, anti-IP-10 없이 CCL21만을 처리한 성숙 수지상세포의 세포살상능이 CCL21을 처리한 성숙 수지상세포 및 anti-IP-10을 함께 공조배양한 숫 T 세포의 세포살상력보다 현저히 증진되었음을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 제2림프기관에서 분비하는 케모카인이 수지상세포로부터 세포독성 T 세포의 유도 및 수지상세포의 제2림프기관으로 이동성이 증진에 효과적일 뿐 아니라 동시에 수지상세포의 기능에 영향을 미쳐 케모카인을 처리한 수지상세포로부터 분화된 세포독성 T 세포의 세포 살상능이 현저히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 케모카인에 의해 성숙화된 수지상세포가 항종양 면역치료 등의 세포 면역치료제로서 사용하기 위한 잠재적 후보가 될 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.

Claims (7)

1) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계;
2) 상기 미성숙 수지상 세포에 항바이러스성 사이토카인, TLR 작동제 또는 이들의 혼합물을 처리하여 미성숙 수지상 세포를 배양하는 단계; 및
3) 유효성분으로 CCL21, CCL19 또는 이들의 혼합물을 함유하는 세포독성 T 세포의 유도 및 수지상세포의 이동성 증진용 조성물을 상기 2) 단계의 미성숙 수지상세포에 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계:
를 포함하는, 수지상세포의 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells)의 살상능 증진방법.
제 1항에 있어서,
상기 3) 단계 후, 성숙화된 수지상세포에 IP-10(Interferon-γ inducible protein-10)을 첨가하여 배양하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 증진방법.
제 1항에 있어서,
상기 3) 단계의 유효성분은 2차림프기관(secondary lymphoid organ)의 이동에 관여하는 케모카인인 것을 특징으로 하는 증진방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 3) 단계의 유효성분은 10 내지 250 ng/㎖ 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 증진방법.
제 1항에 있어서,
상기 2) 단계의 혼합물은 IL-1, TNFα, IFNα, IFNγ, 및 polyI:C의 혼합물인 것을 특징으로 하는 증진방법.
삭제
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