KR20220145566A - 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물 - Google Patents

키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것으로, 수지상 세포에 키네신 억제제를 처리함에 따라 항원-MHC-I 분자 발현이 오래 유지되는 것을 확인하고, 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포가 T 림프구의 증식 및 활성을 증진시키는 것을 확인함으로서, 키네신 억제제를 포함하는 조성물이 새로운 면역 증진제로 제공된다.

Description

키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물{A composition for enhancing immunity comprising a kinesin inhibitor as an active ingredient}
본 발명은 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것이다.
수지상세포(DC; dendritic cells)는 선천면역과 적응면역을 이어주는 면역계에 존재하는 핵심적인 항원제시 세포(APC; antigen presenting cells)로 여겨지고 있으며, 외부 항원을 인식하여 흡수하고, 림프절로 이동하면서 성숙하며, 주조직적합성복합체 (MHC)와 결합된 항원을 T 림프구에 제시한다. 이러한 과정을 통하여 활성화된 T 림프구는 체액성(항체) 및 세포매개 면역반응을 유도하여 바이러스 감염이나 종양의 제거에 기여한다. 따라서, 수지상 세포의 활성을 효율적으로 조절하면, 감염이나 종양을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다.
수지상 세포는 CD4 T 세포의 Th1, Th2, Treg 세포 및 Th17 세포와 같은 헬퍼 T 세포로의 분화를 자극함으로써 다양한 면역반응을 지휘한다. 초기 T 세포 자극 시 수지상 세포에 의해 분비되는 사이토카인(cytokines)의 잇따른 효과가 T 세포의 분화에서 중요한 역할을 한다. Th1 세포는, 인터페론 감마(IFN-γ) 생산을 통해, 항원 제시 및 세포내 병원체에 대한 면역성을 조절하며, Th2 세포는 IL-4 및 IL-13을 생산하여 특정 체액성 반응 및 기생체에 대한 면역성을 매개한다. Th17 세포는 자가면역 및 조직 염증에서 전염증성 역할을 하는 최근에 확인된 Th-세포 계통을 포함한다. 비록 상이한 수지상 세포 서브셋이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포를 우세하게 유도하는 어느 정도 내재적인 잠재력을 가질 수 있지만, 수지상 세포는 또한 미생물 및 국소적 미세환경으로부터의 신호에 반응하여 상당한 기능적 유연성을 나타낸다.
수지상 세포의 성숙을 유도하는 여러 물질이 보고되어 있으며, 알려진 수지상 세포 성숙 자극제는 CD40 리간드(CD40-L), LPS(lipopolysaccharide) 및 TNF-α를 포함한다. 생체 내 및 시험관 내 모두에서 면역반응 동안 존재하는 사이토카인이 Th1, Th2, Treg 세포 또는 Th17 세포에 대한 반응을 지시하는데 중요한 요소임이 잘 알려져 있다. 일부 보고는 기생체에 의해 생산된 지질과 같은 외부 인자가 숙주 면역성을 기피하기 위한 목적으로 수지상 세포의 기능을 조절할 수 있음을 입증하였다.
수지상 세포에 대한 연구의 중요한 목적은 종양, 감염성 물질 또는 자가면역 질환에 대한 면역반응을 증진시키기 위한 수지상 세포에 기초한 전략의 개발이다. 최근에, 수지상 세포는 종양을 치료하기 위한 많은 임상적 면역치료 프로토콜에서 사용되어 오고 있다. 지금까지, 수지상 세포를 이용한 임상시험에 따르면 아주 강한 임상적 효과는 아닐지라도 임상 면역치료에서 수지상 세포가 병증의 진전에 기여하는 것으로 보인다.
수지상 세포의 활성화를 증진시키는 일반적인 방법으로는 병원체 관련 분자패턴(pathogen-recognizing receptor, PRR)의 일종인 toll-like receptor (TLR)을 자극할 수 있는 agonist를 활용하는 방법과 염증성 사이토카인(TNFα, IL-1, IL-6)를 이용하는 방법이 있다. 위와 같은 수지상 세포 활성 방법은 특정 항원에 대한 수지상 세포의 면역반응뿐 아니라, 불필요한 여러가지 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 수지상 세포를 타겟하여 특정 항원에 대한 면역반응만을 특이적으로 증대시킬 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
한국등록특허 제10-1117186호 (2012. 03. 07. 공고)
본 발명의 목적은 신규 면역증진제로서 키네신 단백질에 대한 억제를 통하여 수지상 세포의 활성을 유도하고, 감염 및 종양에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있는 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 면역 증진용 조성물을 포함하는 바이러스 감염증에 대한 면역증진제 또는 암에 대한 면역증진를 제공하는 것이다.
본 발명은 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 포함하는 바이러스 감염증에 대한 면역증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역 증진용 조성물을 포함하는 암에 대한 면역증진용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 수지상 세포에 키네신 억제제를 처리함에 따라 항원-MHC-I 분자 발현이 오래 유지되는 것을 확인하고, 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포가 T 림프구의 증식 및 활성을 증진시키는 것을 확인함으로써, 키네신 억제제를 포함하는 조성물이 새로운 면역 증진제로 제공될 수 있다.
도 1은 수지상 세포의 항원-MHC 분자 발현률을 분석한 결과이다.
도 2는 키네신 억제제의 유무에 따른 수지상 세포의 항원-MHC 분자 발현률을 분석한 결과이다.
도 3은 여러 종류의 키네신 억제제의 유무에 따른 수지상 세포의 항원-MHC 분자 발현률을 분석한 결과이다.
도 4는 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포가 T 림프구의 증식에 미치는 영향을 in vitro에서 분석한 결과이다.
도 5는 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포가 T 림프구의 증식에 미치는 영향을 in vivo에서 분석한 결과이다.
도 6은 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포가 T 림프구의 활성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7은 키네신 억제제의 투여에 따른 인플루엔자 바이러스 특이적 림프구의 반응을 평가한 결과이다.
도 8은 키네신 억제제의 투여에 따른 체액성 면역 반응을 평가한 결과이다.
도 9는 키네신 억제제의 투여에 따른 수지상 세포의 항암 효과를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.
상기 키네신 억제제는 키네신 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 화합물, 항체 또는 결합 단편이거나, 상기 키네신 단백질을 암호화하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다. 구체적으로 상기 키네신 억제제는 BTB-1, 파프로트레인(Paprotrain), 모나스트롤(Monastrol), K858, GSK923295A, MPI-0479605, AZ82 및 Kif15-IN-1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 조성물은 수지상 세포의 MHC-I 분자 발현을 증진시킨다. 상기 키네신 억제제가 처리된 수지상 세포는 T 림프구의 증식을 증진시키고, T 림프구의 활성을 증진시킴으로써 면역 반응을 증진시킨다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 포함하는 바이러스 감염증에 대한 면역증진용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 바이러스 감염증은 인플루엔자 바이러스에 대한 감염증으로, 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H1N2, H2N2, Human B, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H9N2 또는 H10N7의 혈청형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 면역 증진용 조성물을 포함하는 암에 대한 면역증진용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 대상체에 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 동물 모델
본 실험에 사용한 동물모델은 6-7 주령의 야생형 마우스 C57BL6/6를 사용하였으며, ㈜대한바이오링크에서 구입하였다.
2. 시약 및 항체
KIF18A 저해제 (BTB-1)을 Tocris Bioscience에서 구입하였고, Dimethyl Sulfoxide를 용매로 사용하였다. 수지상 세포의 활성화를 위한 LPS와 R848을 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. 수지상 세포의 항원 제시를 위한 항체 OVA 펩타이드 (257-264)는 GenScript에서 구입하였고, LCMV 당단백질 33-41 펩타이드 (GP33)는 Eurogentec에서 구입하였다. 생쥐에서의 항원-항체 반응 확인을 위한 OVA 단백질은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 생쥐의 표지 단백질 (MHC-I, SL8 bound to MHC-I, CD11c, CD8), 사이토카인 (TNF-α, IFN-γ) 항체를 Tonbo Bioscience 혹은 Biolegend에서 구입하였다. T 림프구의 증식을 측정하기 위한 CFSE 세포 증식 추적 염색약을 Tonbo Bioscience에서 구입하였다.
3. 세포 배양 및 바이러스 배양
본 실험에 사용한 모든 세포는 37℃에서 5% CO2 인큐베인터에서 배양하였다. MDCK(Madin-Darby Canine kidney) 세포를 MEM 배지(Minimum Essential Medium, GenDEPOT)에서 배양하였다. 수지상 세포 및 T 림프구를 RPMI-1640 with L-glutamine (GenDEPOT) 배지에서 배양하였으며, Melanoma 세포인 B16/OVA(OVA 단백질 발현하는 B16) 세포는 DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GenDEPOT)에서 배양되었다. 모든 세포 배양배지는 10% 태아 소혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, GenDEPOT), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (PS, Wellgene)을 포함하였다. 인플루엔자 A/California/2007 (H1N1) 바이러스의 증폭 및 titration을 MDCK 세포에서 수행되었다.
4. 수지상 세포 분화 및 활성화
생쥐의 다리 벼에서 골수 세포를 분리하였다. 골수 세포는 20 ng/mL 농도의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF, PEPROTECH)가 포함된 RPMI-1640 with L-glutamine (GenDEPOT) 배지에서 수지상 세포로의 분화를 유도하였다. 총 6-8일동안 배양하였으며 3일차 혹은 6일차에 위의 배지를 10 ml씩 각각 첨가하였다. 분화한 수지상 세포를 PBS로 세척하고 TLR4 혹은 TLR7 자극을 각각 1 μg/mL 농도의 LPS와 10 μg/mL의 R848를 48 시간 동안 처리하여 활성을 유도하였다.
5. 유세포 분석
수지상 세포의 항원 발현율 및 T 림프구의 증식과 활성을 확인하기 위해, 형광이 표지된 항체를 사용하였다. 세포의 표지 단백질에 특이적인 항체를 처리하여 4℃에서 20분동안 염색하였다. T 림프구의 증식을 관찰하기 위해 T 림프구를 Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Tonbo Bioscience)로 37℃에서 10분동안 염색하였다. T 림프구 내 사이토카인 염색은 4℃에서 하룻밤동안 Foxp3/Transcription factor staining kit (Tonbo Bioscience)를 세포에 투과시킨 후 TNF-α, IFN-γ 항체를 4℃에서 1시간 동안 처리하여 염색하였다. 유세포 분석기(AttuneTM NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)를 이용하여 결과를 분석하였다.
6. CD8+ T 림프구 증식 ( in vitro )
LCMV 당단백질 33-41 (GP33) 항원을 처리하고, 활성화시킨 수지상 세포와 CFSE로 염색된 GP33 펩타이드 특이적인 T 림프구를 섞은 후, 2일간 배양하였다. T 림프구의 증식을 유세포 분석기로 분석하였다.
7. CD8+ T 림프구 증식 ( in vivo )
수지상 세포에 LPS를 1㎍/ml로, BTB-1을 10 μM, gp33 펩타이드를 1 ㎍/ml의 농도로 처리하고 48 시간 동안 배양한 후, 생쥐에 정맥 주입하였다. 7일 후, 비장과 간에서 세포를 분리하고, CD8 항체와 gp33 펩타이드 테트라머를 4℃에서 20분간 염색하였다. 유세포 분석기를 사용하여 수지상 세포에 의해 제시된 gp33 펩타이드 반응하여 증식한 T 림프구를 분석하였다.
8. 체내 세포독성 T세포 활성 측정 (In vivo CTL killing assay)
수지상 세포에 LPS를 1 ㎍/ml로, BTB-1을 10 μM로 처리하고 24시간 후에 gp33 펩타이드를 1㎍/ml의 농도로 처리하였다. 다시 24 시간이 지난 후, 수지상 세포(1 x 106 cells)를 생쥐에 주입함. 5일 후, 다른 생쥐에서 분리한 비장 세포에 gp33 펩타이드를 처리하거나 처리하지 않은 후, 각각을 다른 농도의 CFSE dye로 37℃에서 10분간 염색하였다. 2 가지 다른 농도로 염색된 비장 세포를 1:1로 섞어서 총 2 x 107 cells를 수지상 세포를 주입하였던 생쥐에 주입하였다. 2 시간 후, 생쥐의 비장 세포를 분리하여 세포 사멸을 분석하였다.
9. 불활화된 바이러스를 이용한 마우스 면역화 연구
인플루엔자 바이러스(A/California/2007/H1N1)을 heat block에서 65℃, 10분간 가열하여 불활성화시킨 후, 생쥐에 주입하였다. 바이러스 주입 10분 후, DMSO 또는 KIF18A 저해제 (BTB-1)을 생쥐에 주입하였다. 7일 후, 생쥐의 비장과 폐에서 T 림프구의 사이토카인 발현을 분석하였다. 사이토 카인 발현을 분석하기 위하여 비장 및 폐에서 분리한 세포에 인플루엔자 바이러스 펩타이드인 NP, PA, PB를 1 ㎍/ml, brefeldin A를 2.5 ㎍/ml의 농도로 처리하고 12 시간 후, IFN-gamma 및 TNF-alpha 발현을 유세포 분석기로 분석하였다.
10. 효소면역측정법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)
OVA의 Nunc-Immuno™ MicroWell™ 96-Well Plates에 1코팅한 후, 5% skimmilk solution으로 blocking하였다. 혈청 샘플을 각 well에 넣고 37℃에서 2 시간 배양한 후, Goat anti-mouse IgG Fc antibody를 넣어주었다. Washing buffer로 세척한 후, KPL SureBlueTM TMB substrate (1-component)를 사용하여 발색반응을 진행하고 ELISA reader기를 이용하여 OVA 항체 농도를 결정하였다.
11. 종양의 증식 및 관찰
Melanoma 세포주인 B16/OVA (Murine B16 melanoma expressing ovalbumin) 세포(1 x 106)를 마우스에 피하 주사하였다. 2일 후, 활성화된 수지상세포(5 x 105)를 마우스에 혈관 주사하였다. 모든 개체에서 종양이 관측되는 시점을 기준으로, 종양의 부피를 전자식 캘리퍼 (SAHHE)를 이용해 측정하였다.
실시예 1. 수지상 세포의 항원-MHC 분자 발현률 분석
T 림프구는 항원을 인식할 때, MHC 분자와 결합된 항원만을 인식할 수 있다. 따라서, 항원제시세포에서 항원-MHC 분자의 발현량은 T 림프구의 활성을 좌우한다. 수지상 세포에 LPS 혹은 R848을 처리한 후, MHC-I를 인시하는 항체 또는 항원-MHC-I를 동시에 인식하는 항체를 이용하여 발현률을 분석하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, MHC-I 자체의 발현량이 시간에 따라 증가하는 반면, 항원-MHC-I 분자의 발현량은 시간이 지남에 따라 감소하였다.
실시예 2. KIF18A 저해를 통한 수지상 세포의 항원-MHC-I 발현률 분석
키네신 단백질의 일종인 KIF18A 저해제 (KIF18A, BTB-1)을 수지상 세포에 처리한 후, 항원-MHC-I 분자의 발현량을 분석하였다. 수지상 세포에 LPS 또는 R848 처리와 동시에 KIF18A 저해제(10 μM)와 OVA 펩타이드(1 ug/mL)를 처리하고 72 시간동안 항원(OVA peptide, 257-264, SL8)-MHC-I 발현을 분석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, KIF18A 저해제를 처리하면 항원-MHC-I 분자 발현량이 저해제를 처리하지 않은 세포에 비해 높게 유지됨을 확인하였다. 상기 결과는 KIF18A를 수지상 세포에서 억제할 경우, 항원-MHC-I 분자의 발현을 오래 유지할 수 있음을 입증한다.
실시예 3. 다른 종류의 키네신 저해제의 항원-MHC-I 발현 조절 효능 분석
상기 실시예 2에서 키네신 단백질 중 하나인 KIF18A의 저해가 수지상 세포의 항원-MHC-I 분자의 발현을 조절하는 것을 밝혔으므로, 다른 종류의 키네신 단백질도 항원-MHC-I 분자의 발현에 영향을 미치는지를 분석하였다. 수지상 세포에 LPS, 키네신 저해제(KIF20A-i, Paprotrain; KIF11-i-1, Monastrol; KIF11-i-2, K858; KIF10-i, GSK923295A; Mps1, MPI-0479605; KIFC1-i, AZ82; KIF15-I, Kif15-IN-1), OVA 펩타이드(257-264, SL8)를 처리 2일 후, 항원-MHC-I과 CD86(수지상 세포 활성인자) 발현을 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 7종의 키네신 저해제 중 KIF20A 저해제(Paprotrain)가 수지상 세포의 항원-MHC-I 분자의 발현을 특이적으로 증가시킴을 확인하였다. 상기 결과는 KIF20A가 수지상 세포의 항원 제시능력을 증대시킬 수 있는 타겟이 될 수 있음을 입증한다.
실시예 4. KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포에 의한 T 림프구 증식 ( in vitro ) 분석
상기 실시예 3에서 KIF18A 저해제를 처리하면, 처리하지 않은 경우에 비해 항원-MHC-I 분자의 발현량이 오랫동안 유지됨을 관찰하였다. 이를 바탕으로, KIF18A를 처리한 수지상 세포가 T 림프구의 증식을 증대할 수 있는 지 분석하였다. 수지상 세포에 LPS 또는 R848과 KIF18A 저해제를 함께 처리하고, LCMV 당단백질 33-41 (GP33) 펩타이드를 1 μg/ml의 농도로 처리하였다. 48 시간 후에 GP33 특이적인 T 림프구를 P14 유전자 변형 생쥐로부터 분리하여 CFSE로 염색한 후, 1:10 비율 (수지상 세포:T 림프구)로 함께 48 시간 동안 배양하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포가 그렇지 않은 경우보다 항원 특이적인 T 림프구의 증식을 in vitro에서 증가시킴을 관측하였다. 상기 결과는 KIF18A의 활성을 억제하면, 수지상 세포의 T 림프구의 증식 능력이 증가함을 입증한다.
실시예 5. KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포에 의한 T 림프구 증식 ( in vivo ) 분석
상기 실시예 4의 T 림프구 증식 실험 결과가 in vivo에서 재현이 되는지를 확인하였다. 수지상 세포에 LPS와, gp33 펩타이드, KIF18A 저해제를 48시간 동안 처리한 후, 생쥐 꼬리 혈관으로 주입함. 7일 후, 생쥐의 비장과 간에서 gp33 펩타이드에 특이적인 T 림프구의 비율을 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포를 주입한 생쥐에서 저해제를 처리하지 않은 생쥐에 비해 gp33 펩타이드 특이적인 T 림프구의 비율이 높게 나타났다. 상기 결과는 수지상 세포에 KIF18A 저해제를 처리하면 마우스 체내에서 항원에 특이적인 T 림프구의 증식이 더 많이 발생하는 것을 입증한다.
실시예 6. Kinesin 저해제를 처리한 수지상 세포에 의한 T 림프구 활성 평가
KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포에 의해 T 림프구의 활성이 증가는지를 확인하였다. 수지상 세포에 LPS와 KIF18A 저해제를 처리하고 24시간 뒤에 gp33 펩타이드를 처리하여 총 48시간 동안 처리한 후, 생쥐 꼬리 혈관으로 주입함. 5일 후, In vivo CTL killing assay를 수행하여 T 림프구의 활성도를 측정하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 히스토그램에서 왼쪽 peak는 gp33 펩타이드를 처리하지 않은 비장 세포, 오른쪽 peak는 gp33 펩타이드를 처리한 비장 세포를 나타내었다. 대조군에 비해서 KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포를 주입한 경우에 gp33 펩타이드를 처리한 비장 세포의 비율이 확연히 감소하였다. 상기 결과는 세포에 KIF18A 저해제를 처리하여 마우스 체내에 주입하면, 저해제를 처리하지 않은 경우에 비하여, 항원 특이적인 T 림프구의 활성이 더 높음을 입증한다.
실시예 7. 인플루엔자 바이러스 특이적인 T 림프구 반응 평가
KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포에 의해서 항원에 특이적인 T 림프구의 증식 및 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로, KIF18A를 처리한 수지상 세포를 사용하지 않고, 저해제를 직접 생쥐에 주입하여, 바이러스에 특이적인 T 림프구의 활성을 분석하였다. 인플루엔자 바이러스는 heat block에서 열을 가하여 불활성화시킨 후, 생쥐로 주입함. 10분 후, KIF18A 저해제 또는 DMSO를 생쥐에 주입하였다. 7일 후, 생쥐의 비장과 폐에서 세포를 분리하여, 인플루엔자 바이러스 펩타이드인 NP, PA, PB를 12시간동안 자극한 후, 유세포 분석기를 사이토카인 발현을 분석하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, KIF18A 저해제를 생쥐에 주입하면 인플루엔자 항원에 반응하여 IFN-gamma와 TNF-alpha를 생산하는 T 림프구의 비율이 증가함을 확인하였다. 상기 결과는 KIF18A 저해제를 포함한 용액을 비강 내로 직접 주입한 경우에도 항원에 특이적인 T 림프구의 활성을 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 8. Kinesin 저해제를 처리한 후 체액성(항체) 면역 반응 분석
KIF18A 저해제 처리에 의해 체액성 면역반응(항체)이 증가하는지를 평가하였다. 생쥐에 OVA와 R848 (TLR7 agonist), KIF18A 저해제를 섞은 혼합물을 비강 내로 주입하였다. 10일과 17일 후, 동일한 방법으로 생쥐에 주입하였다. 첫 주입 21일, 38일 후, 생쥐의 혈청에서 OVA에 특이적으로 반응하는 항체량을 효소면역측정법(ELISA)을 통해 진행하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, KIF18를 주입하지 않은 생쥐의 혈청에 비해 KIF18A를 주입한 생쥐의 혈청에서 21일(A)과 38일(B)차 모두에서 OVA 특이적 항체의 농도가 높음을 확인하였다. 상기 결과는 KIF18A 저해제를 이용하여 면역화를 진행한 마우스에서 항원 특이적인 체액성 면역반응이 높게 나타나는 것을 입증한다.
실시예 9. Kinesin 저해제가 처리된 수지상 세포의 항암 효과 분석
수지상 세포에 KIF18A 저해제를 처리한 후, 항암 효과를 분석하였다. 수지상 세포에 TLR4 자극과 함께 KIF18A 저해제를 48시간 처리하였다. 수지상 세포가 종양 세포주 B16/OVA를 특이적으로 인식할 수 있도록 OVA 펩타이드(257-264)를 1 μg/mL 농도로 24 시간 처리하였다. 종양의 성장을 관측하기 위해 야생형 생쥐에 종양 세포를 1 x 106개 피하 주사한 후, 2일 뒤에 위의 수지상 세포를 5 x 105개 혈과 주사함. 종양을 주사 6일 후부터 종양의 부피 (길이*너비2*0.52)를 측정하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 종양의 부피와 생존율을 관측한 결과, KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포를 처리한 실험군에서 종양의 부피가 대조군에 비해 감소하였고 (B), 치사율이 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 KIF18A 저해제를 처리한 수지상 세포가 항암 효과를 나타냄을 입증한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (9)

  1. 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키네신 억제제는 키네신 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 화합물, 항체 또는 결합 단편이거나, 상기 키네신 단백질을 암호화 하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 키네신 억제제는 BTB-1, 파프로트레인(Paprotrain), 모나스트롤(Monastrol), K858, GSK923295A, MPI-0479605, AZ82 및 Kif15-IN-1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수지상 세포의 MHC-I 분자 발현을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 수지상 세포는 T 림프구의 증식을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 수지상 세포는 T 림프구의 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역 증진용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 면역 증진용 조성물을 포함하는 바이러스 감염증에 대한 면역증진용 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 면역 증진용 조성물을 포함하는 암에 대한 면역증진용 약학적 조성물.
  9. 대상체에 키네신 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법.
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