KR100997753B1 - 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물에 관한 것으로, 상기 본 발명의 수지상 세포 성숙화 유도 조성물은 미성숙 수지상 세포로부터 성숙 수지상 세포로의 성숙화를 효율적으로 유도할 수 있어, 새로운 수지상 세포의 성숙화 유도체로 사용이 가능하고 종양을 치료하기 위한 새로운 조건의 세포 치료제로 이용 가능할 것이다.

Description

수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{Composite for Inducing Maturation of Dendritic Cell}

본 발명은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물에 관한 것이다.

이제까지 암치료의 대부분은 수술, 항암제 그리고 방사선 치료가 주종을 이루었다. 그러나 이러한 치료는 부작용이 따르고 또한 완치가 어려워 암의 근본적인 치료법은 되지 못하는 실정이다. 특히 전이 암이나 재발 암의 경우 대부분 수술이 불가능하며 화학적 치료제에 저항성을 가지는 경우가 많아 이러한 암환자들을 위한 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

최근에 연구 개발되고 있는 수지상세포를 이용한 암 치료제는 기존의 어떠한 치료제 보다 환자 지향적이며, 기억면역에 의해 장기적으로 효능을 볼 수 있어 동일 암에 대한 전이나 재발 방지에 매우 효과적일 뿐 아니라 안전하며 새로운 항암 면역치료법으로 기대되어 현재 선진국에서 다양한 종류의 암에 대해 치료용 백신으로 개발되고 있다. 특히 수지상세포 백신은 원발암을 수술로 제거한 후 전이 및 재발을 방지할 수 있는 치료제로 사용할 수 있어 암 치료시장에서 상당한 경쟁력을 갖게 될 것이다. 수지상세포 암 백신은 환자별로 맞춤치료의 형태로 생산되며 생산 공정 시 고가의 사이토카인이 대량으로 요구되어 다른 치료제에 비해 고가이기는 하나 암환자의 증가 추세나 국제적 시장성을 고려해 볼 때 충분한 상업적 가치가 있어 선진국을 중심으로 개발에 박차를 가하고 있다.

수지상세포 백신은 세포간의 정교한 인지작용에 의거한 암세포 특이적 면역반응을 유도하여 암세포만을 공격하여 사멸시키는 방법으로 기존 항암치료와 달리 부작용이나 고통이 거의 없는 무독성의 치료방법이다(Barratt-Boyes SM and Figdor CG, Cytotherapy, 6:105, 2004; Grunebach F et al. Cancer Immunol Immunother, 54:517, 2005). 특히 치료기간 동안 입원할 필요가 없고, 정기적으로 병원을 방문하여 백신을 투여 받는 형태이기 때문에 다른 암 치료와 달리 환자의 삶의 질을 저하시키지 않는 장점이 있어 인체 친화적인 차세대 암치료제로 기대를 모으고 있다. 기존의 임상연구사례를 보면 백신 치료 후 단기간의 평가시점까지 종양치료반응을 보이지 않은 환자라 하더라도 이후 다른 항암치료에 대한 반응율이 크게 향상되는 것으로 보고되고 있다. 그러므로 수지상세포 백신 단독치료뿐 아니라 다른 항암치료와 병행할 경우 난치성 암의 치료에 보다 큰 상승효과를 기대할 수 있을 것이다.

수지상 세포는 분화 단계별로 크게 미성숙 및 성숙 수지상 세포로 나누어 볼 수 있다. 수지상 세포는 미성숙 상태로 존재하며 T 세포 활성을 유도하지 못한다. 이 경우 수지상 세포에는 보조자극 인자가 거의 발현되지 않고 있지만 미성숙 수지상 세포는 세포표면에 항원 포획에 필요한 다양한 수용체 분자들을 다량 발현하고 있어 매우 효과적으로 항원을 포획함으로 면역의 초기단계를 담당한다. 또한 다른 항원제시세포와는 달리 MHC(주요 조직 적합성 항원) 발현양이 높아 극소량의 항원도 효과적으로 제시하여 T 세포 활성을 유도할 수 있다. 그 외에도 미성숙 수지상 세포는 외부 항원에 감작되면 이를 Th1와 Th2 세포에 교차 항원제시를 할 수 있어 바이러스 감염 뿐 아니라 죽은 미생물이나 사멸된 세포에 대해서도 세포 독성 T 림프구의 활성을 효과적으로 유도할 수 있다.

미성숙 수지상 세포는 항원에 감작된 후에는 성숙화 단계를 거치면서 모양과 활성이 급격히 변하여 항원포획에 필요한 분자들은 사라지고 대신 T 세포 활성유도에 필요한 보조 자극인자나 T 세포와의 반응에 필요한 분자들의 발현이 현저히 증가된 성숙 수지상 세포가 된다. 또한 성숙화 단계의 수지상 세포는 CCR7과 같이 임파절로의 이동에 필요한 화학주개성 수용체를 발현하고 이를 통해 부근의 임파절이나 비장으로 이동하여 세포성 면역을 유도한다. 이들은 항원을 포획한 후 1-2일 사이에 보조자극인자들의 발현이 현저히 증가되면서 림프절에서 항원특이 T 세포를 활성화시킨다.

수지상 세포의 세포 치료제는 현재 많이 연구되어지고 있는 분야이다. 수지상 세포의 세포 치료제는 부작용이 없고 안전한 치료용 암 백신으로 알려져 있으나 연구가 많이 진행된 만큼 많은 문제점들도 제기되어 왔다. 최근 연구 결과에 따르면 미성숙 수지상 세포를 세포 치료제로 사용하였을 경우 암을 더 활성화시키는 결과를 나타내기도 하여, 수지상 세포를 이용한 세포 치료제는 충분히 성숙된 성숙 수지상 세포를 이용하여야 한다(대한민국 특허공개 10-2005-7016059). 또한 수지상 세포 치료제는 한 사람 한 사람에 맞추어진 맞춤형 치료제로서 많은 비용이 드는 것도 하나의 문제점이다.

본 발명자들은 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 세균의 플라젤린 및 사이토카인을 미성숙 수지상 세포에 처리한 경우, 기존의 사이토카인 보다 효율적으로 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화 시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 미성숙 수지상 세포를 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물로 처리하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 저렴한 v-FlaB를 이용한 성숙화된 성숙 수지상 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 성숙 수지상 세포를 함유하는 저렴한 고성능의 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물을 제공한다.

본 발명의 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법은 미성숙 수지상 세포를 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus) 유래의 v-FlaB 단백질, 종양괴사인자로 TNF-α 및 인터페론은 IFN-α의 혼합물로 처리하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 세균 플라젤린이 FlaB 단백질인 것을 특징으로 하고, 상기 세균이 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus)인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 종양괴사인자가 TNF-α인 것을 특징으로 하고, 상기 인터페론은 IFN-α 또는 IFN-γ인 것이고, 보다 바람직하게는 IFN-α인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 수지상 세포 성숙화 유도 조성물로서의 플라젤린은, 1 종 이상의 박테리아-유래 플라젤린이 함께 사용될 수도 있다. 또한, 플라젤린 단백질의 전체 또는 이의 일부가 사용될 수 있으며, 플라젤린의 일부가 사용되는 경우, FlaB 단백질이 바람직하다.

또한, 수지상 세포 성숙화 유도 조성물로서 사용되는 플라젤린 또는 이의 일부는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 플라젤린의 변이체는 아미노산 서열에 결실, 삽입, 치환 등의 변화가 있는 단백질로써 플라젤린 변이체가 관절염 유도 보조제로서의 기능을 유지하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능하다. 경우에 따라서는 유도 보조제로서의 기능을 강화시키기 위하여, 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

본 발명은

(a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 미성숙 수지상 세포를 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물로 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계;

를 포함하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 GM-CSF 및 인터루킨-4를 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 세균 플라젤린은 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus) 유래의 v-FlaB 단백질인 것을 특징으로 하며, 상기 v-FlaB 단백질의 처리 농도는 0.1 내지 10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 인터페론은 IFN-α 또는 IFN-γ인 것으로, 보다 바람직하게는 IFN-α인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 유도된 성숙 수지상 세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 CD80, CD83 또는 CD86에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 유도된 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에서는, 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물을 이용하여 단핵구로부터 유도되어진 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화를 유도하였으며, 혈액으로부터 분리되어진 수지상 세포에서도 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물이 성숙화를 유도하는 것을 확인하였다. 여기에 사용되어진 단핵구와 수지상 세포는 건강한 공여자로부터 제공 받은 혈액으로부터 추출한 세포이다.

본 발명의 수지상 세포의 성숙화 유도를 확인하는 방법은 상기 단핵구와 수지상 세포에 성숙화가 유도되는 과정에서 단백질 표면인자의 발현과 사이토카인의 분비 및 T 림프구의 활성을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명에서는, 첫 번째 단계에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물이 단핵구로부터 유도되어진 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화를 유도하는 것을 실험적으로 증명하였으며, 두 번째 단계에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포가 T 림프구를 항암면역에 중요한 Th1형으로 유도하는 것을 실험적으로 증명하였고, 세 번째 단계에서는 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙수지상세포에 의해 유도된 세포살상 T 세포의 기능 및 세포살상능을 실험적으로 증명하였다.

본 발명의 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 방법에 있어서, 상기 세균 플라젤린은 0.1 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하는 것이 바람직하며, 상기 종양괴사인자는 10 내지 100 ng/㎖ 농도로 처리하는 것이 바람직하며, 상기 인터페론은 500 내지 1500 U/㎖ 농도로 처리할 수 있다. 상기 농도 범위 내에서 성숙 수지상 세포 특이적인, 숫 T 세포를 자극하는데 중요한, 단백질 표면인자인 CD80 및 CD86의 발현양이 높게 나타났다. 도 1을 참조한다.

본 발명에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포의 사이토카인 분비능을 확인해 본 결과, 인터루킨-12p70의 분비가 현저히 증가하는 것이 확인되었다. 도 2를 참조한다.

성숙 수지상 세포를 면역세포치료제로 사용하기위한 중요한 조건중에 하나는 성숙된 수지상세포가 임파절로 잘 이동하여 림프절에서 숫 T 세포를 항원특이적 세포살상 T 세포로 유도해야한다.

본 발명에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포의 임파절로의 이동성을 임파절에서 분비하는 케모카인을 이용하여 조사한 결과, 림프절로의 이동성이 사이토카인만으로 성숙된 수지상세포보다 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 도 3을 참조한다.

성숙 수지상 세포의 가장 중요한 특징 중 하나는 숫 T림프구를 항암기능이 월등한 Th1형으로 또는 염증반응이나 자가면역에 필요한 Th2나 Th17형으로 유도하는 능력이 있다는 것이다.

본 발명에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포에 의해 활성화 되어진 T림프구에서 인터페론-감마의 분비가 인터루킨-13의 분비에 비해 현저히 증가되었으며, 표준수지상세포에 비해 Th17형으로의 분화도 현저히 저하됨을 확인할 수 있어, 항암 면역세포치료제로써 우수한 기능을 가진 것을 증명하였다. 도 5와 6을 참조한다.

성숙 수지상세포는, 또한, 숫 T 세포를 항원특이적인 세포살상 T 세포로 유도하는 능력이 있으며, 어떤 조합의 사이토카인으로 제조된 수지상세포인가에 따라 세포살상 T 세포의 능력이 다르다.

본 발명에서 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포는 항원 특이적 세포살상 T 세포의 유도율이 대조군인 표준 수지상세포보다 현저히 우수하였으며(도 7 참조), 항원 특이적 세포살상 T 세포에 의해 분비되는 세포살상 효소들의 분비능 및 분비 세포의 수 또한 현저히 우수한 것을 확인하였다. 도 8 및 도 9를 참조한다.

뿐만 아니라 항원 특이적으로 표적 세포를 살상하는 항원 특이적 세포살상능력이 현저히 우수한 것을 확인 할 수 있었다. 도 10을 참조한다.

본 발명의 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제는 통상의 면역증강제와 함께 사용될 수 있다. 면역증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 말하며 이러한 면역증강제는 항원의 표면적을 증가시키거나, 체내에서 항원의 정체를 연장시켜 면역시스템이 항원에 접근할 수 있도록 하거나, 항원 방출을 지연시키거나, 항원을 대식구에 표적화 시키거나, 대식구를 활성화시키는 등을 포함하는 다양한 메카니즘에 의해 작용하는 것으로 보고되었다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol., 4:369-388). 전형적인 면역증강제에는 프로인트 면역증강제((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS) 등이 있다.

또한 본 발명의 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제는 수술 후, 방사선치료와 병행해서 또는 항암제와 병행해서 사용함으로써 그 효과를 극대화 할 수도 있다.

본 발명에 따른 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론 또는 이들의 혼합물은 미성숙 수지상 세포로부터 성숙 수지상 세포로의 성숙화를 효율적으로 유도할 수 있어, 새로운 수지상 세포의 성숙화 유도체로 사용이 가능하고 종양을 치료하기 위한 새로운 조건의, 상대적으로 저렴한, 세포 치료제로 이용 가능하여 항암면역세포치료의 대중화에 기여할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에 대한 성숙 수지상 세포의 특이적인 단백질 표면인자의 발현을 측정한 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포의 사이토카인 분비능을 조사한 결과이며,
도 3은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포의 림프절로 이동율을 조사한 것이고,
도 4는 본 발명의 성숙화된 수지상 세포가 림프절로 이동에 관여하는 표지인자의 발현을 측정한 결과이며,
도 5는 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에 의해 유도된 TH1 및 TH2로 분화된 T 세포에서 분비하는 IFN-및 IL-13의 발현을 측정한 결과이고,
도 6은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에 의해 유도된 TH17형의 T 세포에서 분비하는 IL-17을 측정한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에 의해 유도된 세포독성 T세포중 항원 특이적 T 세포의 비율을 측정한 결과이고,
도 8은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에서 항원 특이적 CD8+ T 세포내에서 세포용해성 효소의 발현율을 측정한 결과이며,
도 9는 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에서 존재하는 절대적인 항원특이적인 CD8+ T 세포 수 및 항원 특이적 CD8+ T 세포중에 세포용해 효소를 분비하는 T 세포의 수를 조사한 결과이고,
도 10은 본 발명에 따른 성숙화된 수지상 세포에 대한 세포독성 T세포의 항원 특이적 세포살상능을 조사한 결과이다.
(A: IFNg 분비세포의 수 B: 타겟 세포에 대한 세포독성)

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 단핵구로부터 미성숙 수지상세포 및 성숙 수지상세포의 분화유도

건강한 공여자로부터 제공받은 혈액으로부터 lymphoprep(Ficoll-Hypaque)을 이용한 원심분리를 통해 단핵세포(mononuclear cells)를 획득하였고, 이를 다시 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용하여 CD14 양성 단구세포(monocytes)를 수득하였다. 상기 수득된 단구세포를 6-well 플레이트에 1×10⁶ cells의 밀도로 하고, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 IMDM 배지를 사용하여 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 GM-CSF(50 ng/㎖)과 IL-4(20 ng/㎖)을 처리하여 6일간 배양한 후 미성숙 수지상 세포로 분화시킨 다음, ‘gold standard’ 칵테일[IL-1b(25 ng/㎖), TNFa(50 ng/㎖), IL-6 (10 ng/㎖) and PGE₂ (1 ug/㎖)]이나 TNF-α(50 ng/㎖), IFN-α(1000 U/㎖) 및 FlaB(1 ㎍/㎖)을 각각 처리하거나 상기 TNF-α(50 ng/㎖), IFN-α(1000 U/㎖) 및 FlaB(1 ㎍/㎖)의 혼합물 또는 TNF-α 및 IFN-α의 혼합물 또는 TNF-α 및 FlaB의 혼합물 또는 IFN-α 및 FlaB의 혼합물을 처리하고 2일간 배양하여 수지상세포를 성숙시켰다.

[실시예 2] 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론에 의해 성숙된 수지상 세포의 세포 표면 단백질 인자의 변화

단핵구로부터 분화 유도된 미성숙 수지상 세포로부터 상기 실시예 1의 처리물에 따른 성숙화된 수지상 세포에서 CD80, CD83, CD86과 같은 성숙수지상세포 표면 단백질 인자를 PE-나 FITC가 결합된 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석로 측정하였다.

그 결과, 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 성숙화된 수지상 세포는 CD80 및 CD86의 발현이 증가하였다. 반면, 성숙한 수지상 세포 마커 CD83의 발현은 IFN-α, FlaB, IFN-α 및 FlaB의 혼합물을 처리한 성숙화된 수지상 세포의 경우 TNF-α, TNF-α 및 IFN-α의 혼합물, TNF-α 및 FlaB의 혼합물, TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물을 처리하여 성숙화된 수지상 세포에 비해 CD83의 발현이 낮게 나타나, 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 정도가 약한 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 인터페론에 의해 성숙된 수지상 세포의 사이토카인 분비능

상기 실시예 1로부터 성숙화된 다양한 수지상 세포들에 대하여 세포가 배양 되고 있던 배양액을 분리하고 성숙화 도중 수지상세포로부터 분비되는 IL-12p70의 양과 48시간동안 성숙된 수지상세포를 CD40L이 발현되는 J558세포와 공조배양한 후 공조배양도중 분비된 IL-12p70의 양을 IL-12p70에 특이적인 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 2A에서도 확인할 수 있듯이, 수지상 세포가 성숙하는 동안 분비한 IL-12p70의 양은 대부분의 수지상세포에서 매우 낮았으며, FlaB, TNF-α 및 IFN-α의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서 분비되는 IL-12p70의 양이 다른 수지상세포에서 분비되는 양보다 증가하였다. 뿐만 아니라, 도 2B에서 확인할 수 있듯이, CD40L이 발현되는 J558세포와 공조배양시에, FlaB, TNF-α 및 IFN-α의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포가 다른 수지상세포(특히 TNF-α, IFN-α, 표준 수지상세포)에 비해 분비되는 IL-12p70의 양이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 세균 플라젤린 , 종양괴사인자, 인터페론에 의해 성숙된 수지상 세포의 림프절로 이동

(1) CCR7 리간드 , CCL19 및 CCL21 에 대한 세포 이동능

상기 실시예 1로부터 성숙화된 다양한 수지상 세포들에 대하여 2차 림프 기관으로의 이동을 확인하기 위하여 CCR7 리간드, CCL19 및 CCL21에 대한 세포 이동능을 조사하였다. 5 x 10⁴ 개 성숙 수지상세포를 함유한 100 uL의 배양배지를 transwell plate의 upper chamber에 적용하고, bottom chamber에 250 ng/mL의 농도의 CCL19 또는 CCL21을 600 uL 적용한 후 37℃에서 3시간 배양하여 bottom chamber로부터 500 uL를 취하여 이동된 수지상세포의 수를, 60초로 고정된 시간내에서, 유세포측정기를 이용하여 측정한다.

그 결과 도 3의 결과에서도 확인 할 수 있듯이, TNF-α, IFN-α 및 FlaB 각각을 처리한 성숙화된 수지상 세포와 IFN-α 및 FlaB의 혼합물을 처리하여 성숙화된 수지상 세포의 CCL19 및 CCL21에 반응한 이동성이 매우 낮음을 확인하였다.

반면, TNF-α 및 IFN-α의 혼합물과 IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포의 CCL19 및 CCL21에 반응한 이동성이 현저히 증가하였으며 특히, TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포의 CCL19 및 CCL21에 반응한 이동성이 TNF-α 및 IFN-α의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포의 이동성에 비해 현저히 증가하였다.

(2) CCR7 , CD74 및 CD38 에 대한 발현

상기 실시예 1로부터 성숙화된 다양한 수지상 세포들에 대하여 2차 림프 기관으로의 이동성에 영향을 미치는 세포표면 단백질인 CCR7, CD74 및 CD38에 대한 발현을 확인하였다.

그 결과 도 4의 결과에서 확인할 수 있듯이, 성숙 수지상세포의 림프절로 이동에 관련된 CCR7의 발현이 TNF-α 또는 TNF-α 와 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포와 표준 수지상세포를 제외하고 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포에서 현저히 높았다. 한편, 성숙된 수지상세포의 림프절로 이동을 저해하는 CD74의 발현 또한 TNF-α 또는 TNF-α와 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포에서 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포에서 보다 현저히 높았다.

반면에 성숙된 수지상세포의 림프절로 이동을 촉진하는 CD38의 발현은 TNF-α 와 IFNα의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포를 제외하고, 표준수지상세포를 포함한 다른 조건에 의해 성숙된 수지상세포 보다 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상세포에서 현저히 높았다. 그러므로 도 3과 도 4를 비교했을 때, 성숙된 수지상세포의 제 2림프기관으로 이동성은 CCR7의 발현 정도가 중요하지만 CD74나 CD38의 발현 정도 또한 중요한 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 5] 세균 플라젤린 , 종양괴사인자, 인터페론에 의해 성숙된 수지상 세포에 의한 T 세포 분화

상기 실시예 1의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB를 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포의 숫 CD4+ T 세포와 공동배양에 따른 TH1, TH2, TH17 세포들로 분화에 미치는 영향을 조사하였다. 숫 CD4+ T 세포는 음성분리(negative selection) 키트를 이용하여 분리하였으며, 표준 수지상세포가 대조군으로 사용되었다. 분리된 2 x 10⁴개의 숫 CD4+ T 세포가 동수의 각각의 수지상세포와 37℃에서 5일 동안 공조배양 되고 이후, 10 ng/mL 농도의 IL-2를 첨가하여 총 12일간 37℃에서 배양한 후 각각 1 x 10⁶ 세포들을 PMA와 Ionomycin으로 24시간 동안 자극하여 그 배양액내에 분비된 IFN-, IL-13 및 IL-17이 각각에 특이적인 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 5 및 도 6의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 표준수지상세포에 비해 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서 TH1의 분화를 촉진하는 IFNγ의 발현은 현저히 높았으나, TH2의 분화를 촉진하는 IL-13 및 TH17의 분화를 촉진하는 IL-17의 발현 모두 현저히 낮은 것을 확인하였다. 이는 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포가 자가면역반응이나 염증반응에 더 특이적인 표준 수지상세포에 비해 항암면역반응에 더 특이적이고 강력하게 반응한다는 것을 암시한다.

[ 실시예 6] 세균 플라젤린 , 종양괴사인자, 인터페론에 의해 성숙된 수지상 세포에 의해 유도된 세포살상 T 세포의 특성 및 세포살상능

상기 실시예 1의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에 의해 유도된 항원 특이적인 세포살상 T 세포의 특징을 조사하였다.

실험방법은 숫 CD3+ T 세포에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 T 세포를 분리하고 흑색종과 연관된 MART-1 펩티드를 탑재한 수지상세포와 3일 동안 공조배양한 후, 10 ng/mL의 IL-2와 10 ng/mL의 IL-7을 첨가하여 7일간 배양하였다. 10일 후에 다시 동일한 수지상세포로 10일간 배양한 T세포를 자극하여 10 ng/mL의 IL-2를 함유한 배양배지 조건하에서 10일간 배양한 후 MART-1에 대한 사량체(tetramer)를 이용하여 항원에 특이적인 세포살상 CD8+ T 세포의 양을 분석하였고, 세포용해성 효소의 발현을 조사하기 위해 IFN-, FasL, Granzyme B, perforin에 특이적인 단클론항체를 이용하여 세포살상 CD8+ T 세포내의 이들 효소들의 발현을 조사하였다.

또한, 세포살상 T 세포의 세포살상능을 조사하기 위해, ELISPOT 분석법을 이용하여 항원 특이적인 세포살상 T 세포에 의한 항원 특이적으로 발현하는 IFN-를 측정하였으며, 전체적인 세포살상능을 조사하기 위해 ⁵¹Cr으로 표지된, MART-1을 탑재한 T2세포를 세포살상 T 세포와 5시간 동안 공조배양한 후 배지내로 방출된 ⁵¹Cr의 양을 측정하였다.

그 결과 도 7에서도 확인할 수 있듯이, ‘gold standard’ 칵테일을 처리한 성숙화된 수지상 세포에서 보다 본 발명의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서 유도된 항원 특이적 세포살상 CD8+ T 세포의 양이 50% 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 세포용해성 효소 즉.Granzyme B, IFNg, Perforin 및 FasL에 대한 발현을 조사한 결과 도 8에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서의 세포용해성 효소의 발현이 현저히 높게 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 항원 특이적인 세포살상 CD8+ T 세포의 수가, 표준 수지상세포에 의해 유도된 것과 비교했을 때 도 9에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에 의해 약 2배 이상 증가하였으며, 세포용해성 효소를 발현하는 항원 특이적인 세포살상 CD8+ T 세포의 수 또한 적어도 3배 내지 5배 이상 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

마직막으로 항원 특이적인 세포살상 T 세포의 IFNg 분비세포의 수를 조사한 결과 도 10에서도 확인할 수 있듯이, TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서 ‘gold standard’ 칵테일을 처리한 성숙화된 수지상 세포에서 보다 적어도 7배 이상이 증가된 것을 확인할 수 있었고, 표적 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과 본 발명의 TNF-α, IFN-α 및 FlaB의 혼합물에 의해 성숙된 수지상 세포에서 유도된 세포독성 T세포가 8배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

1. 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 및 인터페론의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 유효성분은 FlaB 단백질, TNF-α, 및 IFN-α의 혼합물인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 FlaB 단백질은 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물.
4. 삭제
5. (a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및
   (b) 상기 미성숙 수지상 세포를 세균 플라젤린, 종양괴사인자, 및 인터페론의 혼합물로 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계;
   를 포함하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 (a) 단계는 GM-CSF 및 인터루킨-4를 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 혼합물은 FlaB 단백질, TNF-α, 및 IFN-α의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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