JPH11290068A - ナチュラルキラ―（ｎｋ）細胞の活性化方法及びその実施手段 - Google Patents
ナチュラルキラ―（ｎｋ）細胞の活性化方法及びその実施手段Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＮＫ細胞の新しい活性化方法を提供するこ
と。 【解決手段】 樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導され
た調製物とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又
はex vivoで接触させることを含む、ＮＫ細胞の活性化
方法。
と。 【解決手段】 樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導され
た調製物とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又
はex vivoで接触させることを含む、ＮＫ細胞の活性化
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学及び免疫学
の分野に関する。本発明はより具体的に言うと、活性化
されたナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）の新しい
調製方法及びこれらの新しい方法の実施手段、特に新し
い樹枝状細胞個体群及び誘導産物に関する。本発明は同
様に、本発明の方法によって得られた活性化された細胞
の、免疫学、免疫療法又さらに一般的にはメディカルバ
イオテクノロジーの分野における使用にも関する。
の分野に関する。本発明はより具体的に言うと、活性化
されたナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）の新しい
調製方法及びこれらの新しい方法の実施手段、特に新し
い樹枝状細胞個体群及び誘導産物に関する。本発明は同
様に、本発明の方法によって得られた活性化された細胞
の、免疫学、免疫療法又さらに一般的にはメディカルバ
イオテクノロジーの分野における使用にも関する。
【０００２】
【従来の技術】ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）
は、腫瘍細胞及びウイルスに対するきわめて早期の防御
ラインを表すリンパ球個体群である。ＮＫ細胞は、ＤＣ
５６及びＤＣ１６マーカーの存在及びＤＣ３マーカーの
欠如によって特徴づけされ得る。ＮＫ細胞は、免疫適合
宿主又は免疫抑制された宿主における原始腫瘍又は転移
性腫瘍の発生防止のため、抗原非特異的抗腫瘍免疫に関
与していた。特に、抗腫瘍免疫監視（原始腫瘍又は転
移）におけるＮＫ細胞の役目は、腫瘍を持ち、しかも高
い用量のＩＬ−２によりＮＫ細胞を刺激することにより
ex vivoで得られた接着性ＮＫ（「Ａ−ＮＫ」）又は非
接着性ＮＫ（「ＮＡ−ＮＫ」）細胞を伴う又は伴わない
ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２／ＩＬ−１５により処理
されたマウスにおいて示唆されてきた。ＮＫ細胞は特
に、腫瘍細胞又は陰性ＭＨＣクラスＩ変異体に対し主要
な役割を果たすと思われる。
は、腫瘍細胞及びウイルスに対するきわめて早期の防御
ラインを表すリンパ球個体群である。ＮＫ細胞は、ＤＣ
５６及びＤＣ１６マーカーの存在及びＤＣ３マーカーの
欠如によって特徴づけされ得る。ＮＫ細胞は、免疫適合
宿主又は免疫抑制された宿主における原始腫瘍又は転移
性腫瘍の発生防止のため、抗原非特異的抗腫瘍免疫に関
与していた。特に、抗腫瘍免疫監視（原始腫瘍又は転
移）におけるＮＫ細胞の役目は、腫瘍を持ち、しかも高
い用量のＩＬ−２によりＮＫ細胞を刺激することにより
ex vivoで得られた接着性ＮＫ（「Ａ−ＮＫ」）又は非
接着性ＮＫ（「ＮＡ−ＮＫ」）細胞を伴う又は伴わない
ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２／ＩＬ−１５により処理
されたマウスにおいて示唆されてきた。ＮＫ細胞は特
に、腫瘍細胞又は陰性ＭＨＣクラスＩ変異体に対し主要
な役割を果たすと思われる。
【０００３】したがって、その抗原非特異的細胞傷害特
性及びその効能のため、ＮＫ細胞は、ガン又は感染症の
治療の養子免疫アプローチの開発のため特に有利なエフ
ェクター細胞の個体群を構成する。この点で、抗腫瘍養
子免疫療法アプローチが、先行技術において記載されて
きた。したがって増大した悪性リンパ腫を持つ患者のよ
うな或る種の適応においては、少ない用量のＩＬ−２を
伴うＡ−ＮＫの投与は、補助的状況において将来性ある
結果をもたらした。ＮＫ細胞は同様に、種々のタイプの
腫瘍の実験的治療のためにも使用されてきており、いく
つかの臨床研究が行われた（Kuppen et al., Int. J Ca
ncer. 56 (1994) 574; Lister et al.,Clin. Cancer Re
s. 1 (1995) 607; Rosenberg et al., N. Engl. J. Me
d. 316 (1987) 889）。
性及びその効能のため、ＮＫ細胞は、ガン又は感染症の
治療の養子免疫アプローチの開発のため特に有利なエフ
ェクター細胞の個体群を構成する。この点で、抗腫瘍養
子免疫療法アプローチが、先行技術において記載されて
きた。したがって増大した悪性リンパ腫を持つ患者のよ
うな或る種の適応においては、少ない用量のＩＬ−２を
伴うＡ−ＮＫの投与は、補助的状況において将来性ある
結果をもたらした。ＮＫ細胞は同様に、種々のタイプの
腫瘍の実験的治療のためにも使用されてきており、いく
つかの臨床研究が行われた（Kuppen et al., Int. J Ca
ncer. 56 (1994) 574; Lister et al.,Clin. Cancer Re
s. 1 (1995) 607; Rosenberg et al., N. Engl. J. Me
d. 316 (1987) 889）。
【０００４】さらに、これらの細胞は同様に、クラスＩ
のＭＨＣの分子を発現しない細胞、より一般的にはＮＫ
細胞に対する感受性を持つ全ての細胞に特異的でない溶
解のためにin vitroで使用することもできる。
のＭＨＣの分子を発現しない細胞、より一般的にはＮＫ
細胞に対する感受性を持つ全ての細胞に特異的でない溶
解のためにin vitroで使用することもできる。
【０００５】しかしながら、（マウス又はヒトの腫瘍の
治療又は感染症のようなその他の疾病の治療のための）
ＮＫ細胞を用いた養子療法又は、これらの細胞のin vit
ro又はin vivoでのその他の全ての使用には、ＮＫ細胞
のex vivoでの拡大及び活性化が関与している。この点
で、ＮＫ細胞の現在の活性化技術は全て、一般に宿主に
より寛容されにくい高い用量でのサイトカインの使用に
基づくものである。実際、現在利用可能なデータは、ex
vivoでＮＫ細胞が、栄養支持体もサイトカインも無し
では存続せず活性化され得ないということを示している
と思われる。
治療又は感染症のようなその他の疾病の治療のための）
ＮＫ細胞を用いた養子療法又は、これらの細胞のin vit
ro又はin vivoでのその他の全ての使用には、ＮＫ細胞
のex vivoでの拡大及び活性化が関与している。この点
で、ＮＫ細胞の現在の活性化技術は全て、一般に宿主に
より寛容されにくい高い用量でのサイトカインの使用に
基づくものである。実際、現在利用可能なデータは、ex
vivoでＮＫ細胞が、栄養支持体もサイトカインも無し
では存続せず活性化され得ないということを示している
と思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、現在のin
vitroでのＮＫ細胞の活性化方法には、ＩＣＡＭ、ＬＦ
Ａ又はＤＣ７０のような接着又は同時刺激因子により著
しく増大され得る活性化である、単独又は組合わせた形
での（或る種の状況において例えばＩＬ−１、ＩＬ−
２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８のような）異なるサイト
カインの存在下でのこれらの細胞の培養が関与する。類
似の要領で、in vivoで、抗腫瘍免疫におけるＮＫ細胞
の効能は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５又はＩＬ−１２、ＩＬ
−１８及びＩＬ−１０といったサイトカインの同時投与
と切り離せないものである。ＩＦＮはまた、ＩＬ−２に
会合した状態で活性化剤の役目も有する。したがって先
行技術において記載された活性化方法は全て、サイトカ
インの使用に依存するものである。ところが、これらの
方法には、特にサイトカインの調製コスト、in vivoで
の応用分野に利用できない数多くのサイトカインの毒
性、さらにはin vivoで使用した場合に数多くの望まし
くない効果が伴う危険性がある数多くのサイトカインの
非特異的性質に関連したいくつかの欠点がある。さらに
「ナチュラルキリング」機能は腫瘍を持つ患者において
変性を受けることが多いことから、ex vivoでの活性化
を目的としてこれらの細胞を採取する可能性は著しく低
下することがある。
vitroでのＮＫ細胞の活性化方法には、ＩＣＡＭ、ＬＦ
Ａ又はＤＣ７０のような接着又は同時刺激因子により著
しく増大され得る活性化である、単独又は組合わせた形
での（或る種の状況において例えばＩＬ−１、ＩＬ−
２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８のような）異なるサイト
カインの存在下でのこれらの細胞の培養が関与する。類
似の要領で、in vivoで、抗腫瘍免疫におけるＮＫ細胞
の効能は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５又はＩＬ−１２、ＩＬ
−１８及びＩＬ−１０といったサイトカインの同時投与
と切り離せないものである。ＩＦＮはまた、ＩＬ−２に
会合した状態で活性化剤の役目も有する。したがって先
行技術において記載された活性化方法は全て、サイトカ
インの使用に依存するものである。ところが、これらの
方法には、特にサイトカインの調製コスト、in vivoで
の応用分野に利用できない数多くのサイトカインの毒
性、さらにはin vivoで使用した場合に数多くの望まし
くない効果が伴う危険性がある数多くのサイトカインの
非特異的性質に関連したいくつかの欠点がある。さらに
「ナチュラルキリング」機能は腫瘍を持つ患者において
変性を受けることが多いことから、ex vivoでの活性化
を目的としてこれらの細胞を採取する可能性は著しく低
下することがある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】したがって、ＮＫ細胞の
新しい活性化方法を入手する必要性が真に存在する。本
出願は、ＮＫ細胞の活性化のための新しい独創的アプロ
ーチを提案することにより、この問題に対し１つの解決
法をもたらす。本出願は特に、初めて、休止状態のＮＫ
細胞をもう１つの細胞個体群で活性化させる可能性を実
証している。本発明は同様に、初めて、サイトカインの
存在に依存せず、したがって先行技術において記載され
てきた欠点を補正できるＮＫ細胞の活性化方法について
記載している。したがって、本出願は、活性化されたＮ
Ｋ細胞の新しい調製方法、及びこれらの新しい方法の実
施手段について記載している。
新しい活性化方法を入手する必要性が真に存在する。本
出願は、ＮＫ細胞の活性化のための新しい独創的アプロ
ーチを提案することにより、この問題に対し１つの解決
法をもたらす。本出願は特に、初めて、休止状態のＮＫ
細胞をもう１つの細胞個体群で活性化させる可能性を実
証している。本発明は同様に、初めて、サイトカインの
存在に依存せず、したがって先行技術において記載され
てきた欠点を補正できるＮＫ細胞の活性化方法について
記載している。したがって、本出願は、活性化されたＮ
Ｋ細胞の新しい調製方法、及びこれらの新しい方法の実
施手段について記載している。
【０００８】
【発明の実施の形態】したがって、本発明の第１の態様
は、樹枝状細胞（ＤＣ）とＮＫ細胞を接触させる工程を
含むＮＫ細胞の活性化方法にある。以下で記すとおり、
接触はin vitro、ex vivo又はin vivoで実施可能であ
る。また接触には、ＮＫ細胞と樹枝状細胞とのin vitro
での共存培養、又はin vitro又はin vivoでの樹枝状細
胞から誘導された調製物、特に樹枝状細胞に由来するＮ
Ｋ細胞の刺激因子又は膜小胞（エキソゾーム）とＮＫ細
胞とのインキュベーション、さらにまた、樹枝状細胞の
invivoでの受身移入、同様に又樹枝状細胞の単数又は複
数の成長因子のin vivoでの投与も含まれる可能性があ
る。
は、樹枝状細胞（ＤＣ）とＮＫ細胞を接触させる工程を
含むＮＫ細胞の活性化方法にある。以下で記すとおり、
接触はin vitro、ex vivo又はin vivoで実施可能であ
る。また接触には、ＮＫ細胞と樹枝状細胞とのin vitro
での共存培養、又はin vitro又はin vivoでの樹枝状細
胞から誘導された調製物、特に樹枝状細胞に由来するＮ
Ｋ細胞の刺激因子又は膜小胞（エキソゾーム）とＮＫ細
胞とのインキュベーション、さらにまた、樹枝状細胞の
invivoでの受身移入、同様に又樹枝状細胞の単数又は複
数の成長因子のin vivoでの投与も含まれる可能性があ
る。
【０００９】本発明のもう１つの態様は、in vitro、ex
vivo又はin vivoでのナチュラルキラー細胞の活性化の
ための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製
物の使用に関する。
vivo又はin vivoでのナチュラルキラー細胞の活性化の
ための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製
物の使用に関する。
【００１０】本発明のもう１つの態様は、in vivoでＮ
Ｋ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製の
ための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製
物の使用に関する。
Ｋ細胞を活性化させることを目的とする組成物の調製の
ための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製
物の使用に関する。
【００１１】本発明のもう１つの態様は、樹枝状細胞及
びＮＫ細胞の共存培養物に関する。
びＮＫ細胞の共存培養物に関する。
【００１２】本発明の補足的態様は、樹枝状細胞に由来
するＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物に関する。
するＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物に関する。
【００１３】本発明のもう１つの態様は、ＮＫ細胞刺激
能力を改善（又は誘発）するための樹枝状細胞触発
（「triggering」）方法、ならびに樹枝状細胞及びそれ
を含む全ての組成物の触発因子に関する。本発明は同様
に、「触発済み樹枝状細胞」（triggered Dendritic Ce
lls」）と呼ばれる新しい樹枝状細胞個体群ならびにそ
れを含む全ての組成物及びそれらの使用に関する。
能力を改善（又は誘発）するための樹枝状細胞触発
（「triggering」）方法、ならびに樹枝状細胞及びそれ
を含む全ての組成物の触発因子に関する。本発明は同様
に、「触発済み樹枝状細胞」（triggered Dendritic Ce
lls」）と呼ばれる新しい樹枝状細胞個体群ならびにそ
れを含む全ての組成物及びそれらの使用に関する。
【００１４】本発明のその他の態様は、特に本発明の方
法により活性化されたＮＫ細胞の亜個体群及びＮＫ細胞
に対する感受性を持つ標的細胞に対する細胞傷害活性を
in vivo又はin vitroで刺激するためのこれらの細胞又
はＮＫ／ＤＣ共存培養の使用である。もう１つの形態に
従うと、本発明は同様に、休止状態のＮＫ細胞のＩＦＮ
ｇの細胞溶解及び分泌活性の著しい増大を可能にする方
法にも関する。
法により活性化されたＮＫ細胞の亜個体群及びＮＫ細胞
に対する感受性を持つ標的細胞に対する細胞傷害活性を
in vivo又はin vitroで刺激するためのこれらの細胞又
はＮＫ／ＤＣ共存培養の使用である。もう１つの形態に
従うと、本発明は同様に、休止状態のＮＫ細胞のＩＦＮ
ｇの細胞溶解及び分泌活性の著しい増大を可能にする方
法にも関する。
【００１５】本発明は同様に、とくに例えば先天的な又
は移植に関連する感染症、腫瘍、自己免疫疾患の治療の
ための新しい治療アプローチにも関する。本発明の方法
には、特に、（ｉ）ex vivoで樹枝状細胞により活性化
されたＮＫ細胞、又は（ii）in situでＮＫ細胞を直接
活性化するための、樹枝状細胞（特に触発済み樹枝状細
胞）又は樹枝状細胞から誘導された調製物、又は（ii
i）ex vivoで同時インキュベーションされた２つの細胞
個体群の受身移入、あるいはまた、（iv）例えばケモカ
イン又はサイトカインと組合せた形で、又は単独で投与
される因子である、ＮＫ細胞を効果的に活性化する能力
を持つようになるような形でin vivoで樹枝状細胞を触
発させるための樹枝状細胞「触発」因子又は樹枝状細胞
成長因子の投与、あるいはまた単独又は組合せた形での
樹枝状細胞の成長因子又はＮＫ細胞刺激因子の投与が関
与する。
は移植に関連する感染症、腫瘍、自己免疫疾患の治療の
ための新しい治療アプローチにも関する。本発明の方法
には、特に、（ｉ）ex vivoで樹枝状細胞により活性化
されたＮＫ細胞、又は（ii）in situでＮＫ細胞を直接
活性化するための、樹枝状細胞（特に触発済み樹枝状細
胞）又は樹枝状細胞から誘導された調製物、又は（ii
i）ex vivoで同時インキュベーションされた２つの細胞
個体群の受身移入、あるいはまた、（iv）例えばケモカ
イン又はサイトカインと組合せた形で、又は単独で投与
される因子である、ＮＫ細胞を効果的に活性化する能力
を持つようになるような形でin vivoで樹枝状細胞を触
発させるための樹枝状細胞「触発」因子又は樹枝状細胞
成長因子の投与、あるいはまた単独又は組合せた形での
樹枝状細胞の成長因子又はＮＫ細胞刺激因子の投与が関
与する。
【００１６】したがって前述のとおり、本発明の第１の
目的は、樹枝状細胞を用いたＮＫ細胞の活性化のための
方法に関する。この方法は特に、樹枝状細胞又は樹枝状
細胞から誘導された調製物の存在下にＮＫ細胞をおくこ
とを含む。本発明は特に、休止状態にあるＮＫ細胞を活
性化させる樹枝状細胞の能力を出願人が実証したことに
由来するものである。
目的は、樹枝状細胞を用いたＮＫ細胞の活性化のための
方法に関する。この方法は特に、樹枝状細胞又は樹枝状
細胞から誘導された調製物の存在下にＮＫ細胞をおくこ
とを含む。本発明は特に、休止状態にあるＮＫ細胞を活
性化させる樹枝状細胞の能力を出願人が実証したことに
由来するものである。
【００１７】本出願において示されている結果は、特
に、樹枝状細胞の存在下で共存培養された休止状態のＮ
Ｋ細胞が存続し、その溶解能力及びＩＦＮγ産生能力が
きわめて強く活性化されるということを実証している。
そのうえ、このようにして得られた活性化された細胞
は、感受性のあるＮＫ標的を溶解するが感受性のあるＬ
ＡＫ標的は溶解せず、こうしてこの活性化現象は、ＩＬ
−２依存性の従来のＬＡＫ現象と区別されることにな
る。本出願は同様に、同種樹枝状細胞が自己由来の樹枝
状細胞と同様に、in vitroでＮＫ細胞を活性化でき、樹
枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の存在下
でのＮＫ細胞の活性化メカニズムには、ＩＬ−１２もＩ
Ｌ−２も、またＩＬ−１５もＩＦＮαも関与しない、と
いうことを立証している。一方、示された結果は同様
に、活性化プロセスにおけるＮＫ細胞と樹枝状細胞膜の
間の相互作用の関与をも示し、この活性化に介入する樹
枝状細胞の膜因子の存在を実証している。得られた結果
は同様に、樹枝状細胞によって産生された膜小胞が同様
にＮＫ細胞を活性化する能力を持つことをも示し、この
ことはすなわち、樹枝状細胞により発現されたＮＫ細胞
の刺激因子が前記ＮＫ細胞内に存在することを表してい
る。
に、樹枝状細胞の存在下で共存培養された休止状態のＮ
Ｋ細胞が存続し、その溶解能力及びＩＦＮγ産生能力が
きわめて強く活性化されるということを実証している。
そのうえ、このようにして得られた活性化された細胞
は、感受性のあるＮＫ標的を溶解するが感受性のあるＬ
ＡＫ標的は溶解せず、こうしてこの活性化現象は、ＩＬ
−２依存性の従来のＬＡＫ現象と区別されることにな
る。本出願は同様に、同種樹枝状細胞が自己由来の樹枝
状細胞と同様に、in vitroでＮＫ細胞を活性化でき、樹
枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の存在下
でのＮＫ細胞の活性化メカニズムには、ＩＬ−１２もＩ
Ｌ−２も、またＩＬ−１５もＩＦＮαも関与しない、と
いうことを立証している。一方、示された結果は同様
に、活性化プロセスにおけるＮＫ細胞と樹枝状細胞膜の
間の相互作用の関与をも示し、この活性化に介入する樹
枝状細胞の膜因子の存在を実証している。得られた結果
は同様に、樹枝状細胞によって産生された膜小胞が同様
にＮＫ細胞を活性化する能力を持つことをも示し、この
ことはすなわち、樹枝状細胞により発現されたＮＫ細胞
の刺激因子が前記ＮＫ細胞内に存在することを表してい
る。
【００１８】樹枝状細胞によるＮＫ細胞のこの活性化が
適切であることはさらにin vivoで、陰性ＭＨＣクラス
Ｉ腫瘍のモデルにおいて実証された。この腫瘍を持つマ
ウスにおいて、樹枝状細胞の拡大のみがＮＫ依存的な腫
瘍の除去を可能にする。さらに、腫瘍を持ちＴ及びＢ細
胞が欠損している免疫抑制された動物への樹枝状細胞の
受身養子移入によって、腫瘍の成長を著しく緩慢にさせ
ることもできる。
適切であることはさらにin vivoで、陰性ＭＨＣクラス
Ｉ腫瘍のモデルにおいて実証された。この腫瘍を持つマ
ウスにおいて、樹枝状細胞の拡大のみがＮＫ依存的な腫
瘍の除去を可能にする。さらに、腫瘍を持ちＴ及びＢ細
胞が欠損している免疫抑制された動物への樹枝状細胞の
受身養子移入によって、腫瘍の成長を著しく緩慢にさせ
ることもできる。
【００１９】したがって、これらの結果は、樹枝状細胞
又は樹枝状細胞から誘導された調製物が、in vitro、ex
vivo又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化を誘発する能力
を有すること、そしてこの活性化がin vitroではＮＫ感
受性細胞の溶解を刺激しin vivoでは宿主生体の自然免
疫を刺激できるようにし、したがって腫瘍、感染細胞又
はその他の病理過程に関与する細胞（自己免疫疾患、移
植片拒絶、移植片対宿主反応など）をin vivoで除去す
ることができることを実証している。
又は樹枝状細胞から誘導された調製物が、in vitro、ex
vivo又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化を誘発する能力
を有すること、そしてこの活性化がin vitroではＮＫ感
受性細胞の溶解を刺激しin vivoでは宿主生体の自然免
疫を刺激できるようにし、したがって腫瘍、感染細胞又
はその他の病理過程に関与する細胞（自己免疫疾患、移
植片拒絶、移植片対宿主反応など）をin vivoで除去す
ることができることを実証している。
【００２０】本発明において得られた結果は、今日ま
で、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＤ
Ｃ７０をコードするトランスフェクタントを除いて、in
vitroでもう１つの細胞型によりＮＫ細胞を活性化させ
ることができるということを示唆した研究がほとんど又
は全くなかったためになお一層驚くべきことである。逆
に、いくつかの研究活動は、ＰＧＥ２を介してＮＫ細胞
のＩＬ−２依存型の活性化に対するマクロファージの阻
害的役割をむしろ示唆しているように思われた。
で、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＤ
Ｃ７０をコードするトランスフェクタントを除いて、in
vitroでもう１つの細胞型によりＮＫ細胞を活性化させ
ることができるということを示唆した研究がほとんど又
は全くなかったためになお一層驚くべきことである。逆
に、いくつかの研究活動は、ＰＧＥ２を介してＮＫ細胞
のＩＬ−２依存型の活性化に対するマクロファージの阻
害的役割をむしろ示唆しているように思われた。
【００２１】本発明は、我々の知るかぎり、サイトカイ
ンに依存せずしかももう１つの細胞個体群又は調製物又
はそれから誘導された因子を用いた、ＮＫ細胞の活性化
を初めて立証したものである。
ンに依存せずしかももう１つの細胞個体群又は調製物又
はそれから誘導された因子を用いた、ＮＫ細胞の活性化
を初めて立証したものである。
【００２２】本発明でいうＮＫ細胞の「活性化」という
語は、特に、ＩＦＮγの産生及び／又はＮＫ細胞の細胞
傷害活性の増大を意味する。これら２つのパラメータ
は、当業者にとっては公知の、例中で示された技術に従
って容易に測定可能である。一般に、本発明に従った活
性化は、全ての個体群を統合してＮＫ細胞の増殖の重大
な増加が伴っておらず、その亜個体群の増殖を誘発する
ことができる。反対にこの活性化には、in vitroでのＮ
Ｋ細胞の生存の著しい増大が伴っている。より具体的に
言うと、本発明の意味におけるＮＫ細胞の活性化は、従
来のサイトカインの使用とは無関係である。「活性化さ
れた」ＮＫ細胞という語は、本発明においては、上記の
特性のうちの少なくとも１つを呈するＮＫ細胞のことを
意味する。
語は、特に、ＩＦＮγの産生及び／又はＮＫ細胞の細胞
傷害活性の増大を意味する。これら２つのパラメータ
は、当業者にとっては公知の、例中で示された技術に従
って容易に測定可能である。一般に、本発明に従った活
性化は、全ての個体群を統合してＮＫ細胞の増殖の重大
な増加が伴っておらず、その亜個体群の増殖を誘発する
ことができる。反対にこの活性化には、in vitroでのＮ
Ｋ細胞の生存の著しい増大が伴っている。より具体的に
言うと、本発明の意味におけるＮＫ細胞の活性化は、従
来のサイトカインの使用とは無関係である。「活性化さ
れた」ＮＫ細胞という語は、本発明においては、上記の
特性のうちの少なくとも１つを呈するＮＫ細胞のことを
意味する。
【００２３】本発明によるＮＫ細胞の活性化方法は、in
vitro、ex vivo又は直接in vivoで実施可能である。
vitro、ex vivo又は直接in vivoで実施可能である。
【００２４】樹枝状細胞（ＤＣ）の存在下でのＮＫの活
性化 第１の特定の実施態様においては、本発明の方法は、成
熟又は未成熟の、自己由来又は同種異系の、好ましくは
触発済みの（triggered）樹枝状細胞とＮＫ細胞の共存
培養による、in vitro又はex vivoでのＮＫ細胞の活性
化を含む。本発明の方法のこの第１の実施態様に従う
と、ＮＫ細胞は樹枝状細胞と共存培養される。この実施
態様では、使用される樹枝状細胞は、自己由来（すなわ
ちＮＫ細胞と同じ実験動物に由来するもの）であっても
よいし、また同種（すなわち同じ種の他の実験動物に由
来するもの）であってもよい。実際、例中に示された結
果は、ＮＫ細胞の活性化が樹枝状細胞の同種性によって
著しい影響を受けないということを示している。これに
より、きわめて有利な形で、ＮＫ細胞の活性化のために
樹枝状細胞の「万能」バンクを使用することが可能とな
る。このようなバンクは、以下に記載されているよう
に、例えば、不死化するような形での樹枝状細胞の修飾
によって構成することができる。この点で、本発明の実
施のためには、好ましくは未成熟のヒト樹枝状細胞から
確立される異なる樹枝状細胞系統を使用することができ
る。それらの使用に先立ち、その特性を改善し薬学的用
途と適合性あるものにするべく、樹枝状細胞を前処理に
付すことも可能である。したがって樹枝状細胞は、ＮＫ
細胞の活性化のためのその使用に先立ち、照射を受ける
ことができる。このような照射により、特に、不死化さ
れた樹枝状細胞のような樹枝状細胞の或る種の個体群に
関連するあらゆる発ガンの危険性を除去することが可能
となる。照射による前処理は、樹枝状細胞及び共存培養
物がin vivoで使用される場合、特に望ましい。樹枝状
細胞のもう１つの前処理は、そのＮＫ細胞刺激活性を改
善する形で、又はデキソゾームの産生を触発する形で、
樹枝状細胞刺激因子（サイトカイン、ケモカイン、熱シ
ョックタンパク質など）の存在下でインキュベーション
することからなる。
性化 第１の特定の実施態様においては、本発明の方法は、成
熟又は未成熟の、自己由来又は同種異系の、好ましくは
触発済みの（triggered）樹枝状細胞とＮＫ細胞の共存
培養による、in vitro又はex vivoでのＮＫ細胞の活性
化を含む。本発明の方法のこの第１の実施態様に従う
と、ＮＫ細胞は樹枝状細胞と共存培養される。この実施
態様では、使用される樹枝状細胞は、自己由来（すなわ
ちＮＫ細胞と同じ実験動物に由来するもの）であっても
よいし、また同種（すなわち同じ種の他の実験動物に由
来するもの）であってもよい。実際、例中に示された結
果は、ＮＫ細胞の活性化が樹枝状細胞の同種性によって
著しい影響を受けないということを示している。これに
より、きわめて有利な形で、ＮＫ細胞の活性化のために
樹枝状細胞の「万能」バンクを使用することが可能とな
る。このようなバンクは、以下に記載されているよう
に、例えば、不死化するような形での樹枝状細胞の修飾
によって構成することができる。この点で、本発明の実
施のためには、好ましくは未成熟のヒト樹枝状細胞から
確立される異なる樹枝状細胞系統を使用することができ
る。それらの使用に先立ち、その特性を改善し薬学的用
途と適合性あるものにするべく、樹枝状細胞を前処理に
付すことも可能である。したがって樹枝状細胞は、ＮＫ
細胞の活性化のためのその使用に先立ち、照射を受ける
ことができる。このような照射により、特に、不死化さ
れた樹枝状細胞のような樹枝状細胞の或る種の個体群に
関連するあらゆる発ガンの危険性を除去することが可能
となる。照射による前処理は、樹枝状細胞及び共存培養
物がin vivoで使用される場合、特に望ましい。樹枝状
細胞のもう１つの前処理は、そのＮＫ細胞刺激活性を改
善する形で、又はデキソゾームの産生を触発する形で、
樹枝状細胞刺激因子（サイトカイン、ケモカイン、熱シ
ョックタンパク質など）の存在下でインキュベーション
することからなる。
【００２５】触発済み樹枝状細胞（ＤＣ）の調製及び使
用 樹枝状細胞の特に好都合な処理には、触発培地の存在下
でのこれらの細胞の処理が含まれる。実際、本発明は、
きわめて改善されたＮＫ刺激能力を持つ樹枝状細胞の新
しい個体群の産生及び特徴づけについて記載している。
これらのいわゆる「触発済み」樹枝状細胞、それらの調
製及びそれらの使用は、本出願のもう１つの目的を構成
している。「触発（trigger）」という語は、本発明の
意味合いでは、樹枝状細胞内で強いＮＫ細胞刺激能力を
誘発する、その分化段階の変調とは異なるシグナルの存
在下におくことを意味している。したがって「触発培
地」には、一般に、高いＮＫ細胞刺激能力を誘発するシ
グナルを樹枝状細胞に提供することのできる生物学的な
あらゆる物質が含まれる可能性がある。このように処理
された樹枝状細胞は同様に、本出願において「触発済
み」樹枝状細胞（又は「triggered dendritic cells」
を略して「ｔＤＣ」）としても表されている。したがっ
て、本発明の特定の目的は、ＮＫ細胞を刺激するその能
力を改善する（又は誘発する）ことのできる触発培地と
樹枝状細胞とを接触させる工程を含む、樹枝状細胞処理
方法に関する。
用 樹枝状細胞の特に好都合な処理には、触発培地の存在下
でのこれらの細胞の処理が含まれる。実際、本発明は、
きわめて改善されたＮＫ刺激能力を持つ樹枝状細胞の新
しい個体群の産生及び特徴づけについて記載している。
これらのいわゆる「触発済み」樹枝状細胞、それらの調
製及びそれらの使用は、本出願のもう１つの目的を構成
している。「触発（trigger）」という語は、本発明の
意味合いでは、樹枝状細胞内で強いＮＫ細胞刺激能力を
誘発する、その分化段階の変調とは異なるシグナルの存
在下におくことを意味している。したがって「触発培
地」には、一般に、高いＮＫ細胞刺激能力を誘発するシ
グナルを樹枝状細胞に提供することのできる生物学的な
あらゆる物質が含まれる可能性がある。このように処理
された樹枝状細胞は同様に、本出願において「触発済
み」樹枝状細胞（又は「triggered dendritic cells」
を略して「ｔＤＣ」）としても表されている。したがっ
て、本発明の特定の目的は、ＮＫ細胞を刺激するその能
力を改善する（又は誘発する）ことのできる触発培地と
樹枝状細胞とを接触させる工程を含む、樹枝状細胞処理
方法に関する。
【００２６】本発明のもう１つの目的は、樹枝状細胞触
発培地、すなわちＮＫ細胞を刺激する樹枝状細胞の能力
を改善（又は誘発）できるようにする培地にある。本発
明に適した触発培地は、例えば、樹枝状細胞に適切なシ
グナルを提供することのできる細胞、そのような細胞か
ら誘導された調製物、そのような細胞から誘導された因
子、又は好ましくは樹枝状細胞を触発することのできる
好ましくは生物学的なあらゆる物質を含み得る。触発培
地はさらに、好都合には、成長因子及び／又はサイトカ
イン、特にＧＭ−ＣＳＦ及び／又はインターロイキン−
４ならびに場合によっては哺乳動物細胞培地の成分（血
清、ビタミン、アミノ酸など）を含んでいる。樹枝状細
胞の触発のために使用し得る細胞としては、より具体的
には、細胞外基質、特に間質細胞、内皮細胞又は線維芽
細胞を挙げることができる。これらの細胞は、より具体
的にはそれらが分裂段階にあるときに、樹枝状細胞を触
発することができる。例えば肥満細胞腫といったような
或る種の腫瘍細胞についても同様のことが言える。本発
明の特定の実施態様には、触発のための線維芽細胞の使
用が含まれる。実際、出願人は、線維芽細胞が、はるか
に高い効率で樹枝状細胞にＮＫ細胞を刺激させることが
できるということを示した。この点において、これは、
予め又は即時に調製された、活性化された又はされてい
ない一次培養の形質転換された系統の不死化された線維
芽細胞であり得る。好ましくは、触発細胞とＤＣの共存
培養のために用いられる細胞は、分裂段階にあるか又は
分裂可能である。使用可能な線維芽細胞系統としては、
例えば系統ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ−９２９、ＭＲＣ５又はＴ
ＩＢ８０を挙げることができる。
発培地、すなわちＮＫ細胞を刺激する樹枝状細胞の能力
を改善（又は誘発）できるようにする培地にある。本発
明に適した触発培地は、例えば、樹枝状細胞に適切なシ
グナルを提供することのできる細胞、そのような細胞か
ら誘導された調製物、そのような細胞から誘導された因
子、又は好ましくは樹枝状細胞を触発することのできる
好ましくは生物学的なあらゆる物質を含み得る。触発培
地はさらに、好都合には、成長因子及び／又はサイトカ
イン、特にＧＭ−ＣＳＦ及び／又はインターロイキン−
４ならびに場合によっては哺乳動物細胞培地の成分（血
清、ビタミン、アミノ酸など）を含んでいる。樹枝状細
胞の触発のために使用し得る細胞としては、より具体的
には、細胞外基質、特に間質細胞、内皮細胞又は線維芽
細胞を挙げることができる。これらの細胞は、より具体
的にはそれらが分裂段階にあるときに、樹枝状細胞を触
発することができる。例えば肥満細胞腫といったような
或る種の腫瘍細胞についても同様のことが言える。本発
明の特定の実施態様には、触発のための線維芽細胞の使
用が含まれる。実際、出願人は、線維芽細胞が、はるか
に高い効率で樹枝状細胞にＮＫ細胞を刺激させることが
できるということを示した。この点において、これは、
予め又は即時に調製された、活性化された又はされてい
ない一次培養の形質転換された系統の不死化された線維
芽細胞であり得る。好ましくは、触発細胞とＤＣの共存
培養のために用いられる細胞は、分裂段階にあるか又は
分裂可能である。使用可能な線維芽細胞系統としては、
例えば系統ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ−９２９、ＭＲＣ５又はＴ
ＩＢ８０を挙げることができる。
【００２７】この方法の実施のためには、使用される線
維芽細胞（又はその他の細胞）は、樹枝状細胞に対し自
己由来、同種異系又は異種のものであってよい。実際、
驚くべきことに、例の中で紹介されている結果は、ヒト
の樹枝状細胞が異なる種の線維芽細胞、特にマウスの線
維芽細胞によって触発され得るということを示してい
る。この実施態様（in vitroでの共存培養）において
は、触発（処理）は、約０．１〜１００、好ましくは
０．５〜１０、特に１〜５の間で変動するＤＣ／細胞比
で実現され得る。当然のことながら、この比は、当業者
により適合可能である。さらに、この実施態様において
は、好ましくは照射（例えば２０００〜８０００rad）
を受けた細胞が使用される。
維芽細胞（又はその他の細胞）は、樹枝状細胞に対し自
己由来、同種異系又は異種のものであってよい。実際、
驚くべきことに、例の中で紹介されている結果は、ヒト
の樹枝状細胞が異なる種の線維芽細胞、特にマウスの線
維芽細胞によって触発され得るということを示してい
る。この実施態様（in vitroでの共存培養）において
は、触発（処理）は、約０．１〜１００、好ましくは
０．５〜１０、特に１〜５の間で変動するＤＣ／細胞比
で実現され得る。当然のことながら、この比は、当業者
により適合可能である。さらに、この実施態様において
は、好ましくは照射（例えば２０００〜８０００rad）
を受けた細胞が使用される。
【００２８】触発培地としては、完全な細胞の代りに、
それから誘導された調製物又は因子を使用することも可
能である。したがって、例えば、上清、リゼイト、無細
胞調製物、単離された及び／又は精製された因子などを
使用することも可能である。例で紹介された結果は、特
に、線維芽細胞の培養上清が、樹枝状細胞を触発する、
つまり休止状態にあるＮＫ細胞をきわめて効果的に（特
に、より迅速に）活性化する能力を樹枝状細胞に与える
ことができるということを示している。この実施態様に
おいては、例えば、最終容量約３０mlの中で、１０6個
の樹枝状細胞について約１〜２０mlの細胞上清（例えば
線維芽細胞）を使用する。したがって１．５〜３０倍、
好ましくは２〜５倍に希釈された上清を使用することが
可能である。これらの条件は、当然のことながら、使用
される細胞個体群に応じて当業者によって適合されてよ
い。なお、培養上清について上記した活性は、触発の実
現を担当する又は触発を実現するのに充分な、細胞、そ
れも特に線維芽細胞により分泌される可溶性因子の存在
を明らかにしている。したがって、もう１つの触発培地
は、例えば上清の濃縮物／ろ過物、特に、単離及び／又
は精製及び／又は組換え形態での上記の可溶性因子を含
んでいる。したがって、触発培地として、上記の可溶性
因子、又はこの因子を発現する組換え細胞を使用するこ
とが可能である。同様に、ＮＫ細胞の活性化のため樹枝
状細胞を触発することを可能にする、特に生物学的な他
のあらゆる物質を使用することが可能である。
それから誘導された調製物又は因子を使用することも可
能である。したがって、例えば、上清、リゼイト、無細
胞調製物、単離された及び／又は精製された因子などを
使用することも可能である。例で紹介された結果は、特
に、線維芽細胞の培養上清が、樹枝状細胞を触発する、
つまり休止状態にあるＮＫ細胞をきわめて効果的に（特
に、より迅速に）活性化する能力を樹枝状細胞に与える
ことができるということを示している。この実施態様に
おいては、例えば、最終容量約３０mlの中で、１０6個
の樹枝状細胞について約１〜２０mlの細胞上清（例えば
線維芽細胞）を使用する。したがって１．５〜３０倍、
好ましくは２〜５倍に希釈された上清を使用することが
可能である。これらの条件は、当然のことながら、使用
される細胞個体群に応じて当業者によって適合されてよ
い。なお、培養上清について上記した活性は、触発の実
現を担当する又は触発を実現するのに充分な、細胞、そ
れも特に線維芽細胞により分泌される可溶性因子の存在
を明らかにしている。したがって、もう１つの触発培地
は、例えば上清の濃縮物／ろ過物、特に、単離及び／又
は精製及び／又は組換え形態での上記の可溶性因子を含
んでいる。したがって、触発培地として、上記の可溶性
因子、又はこの因子を発現する組換え細胞を使用するこ
とが可能である。同様に、ＮＫ細胞の活性化のため樹枝
状細胞を触発することを可能にする、特に生物学的な他
のあらゆる物質を使用することが可能である。
【００２９】一般に、触発は、１５〜７２時間、より通
常的には約２０〜４８時間に至る可能性のある時間中、
触発培地の存在下で樹枝状細胞のインキュベーションに
よって実現される。樹枝状細胞の「触発された」状態
は、その免疫学的表現型の修飾をひき起こさない。した
がって、未成熟の樹枝状細胞は、触発の後、未成熟状態
にとどまる（ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＣ４０、ＤＣ８０、ＤＣ
８６、ＤＣ８３、ＤＣ１ａの発現）。「触発された」段
階は、異なる形で明らかにできるが、一般的には、例の
中で記載されているとおりin vitroでＮＫ細胞を活性化
する細胞の能力を試験することによって、又は培養上清
内の可能性触発因子を測定することによって明らかにさ
れ得る。なお、ＮＫ細胞の活性化の枠内で、樹枝状細胞
の触発は、ＮＫ細胞の存在下でのインキュベーション又
はこれと同時に実施することができる。上記のとおり、
本発明は同様に、触発済み樹枝状細胞の個体群にも関す
る。したがって、この点で、本発明の目的は、成熟又は
未成熟の、特にヒトの触発済み樹枝状細胞、すなわちＮ
Ｋ細胞刺激能力が、特に未触発樹枝状細胞に比べ少なく
とも２倍高くなった樹枝状細胞を含む組成物にもある。
本発明に従った触発済み樹枝状細胞は、より具体的に言
うと、それが休止状態のＮＫ細胞を活性化すること、そ
して好ましくは細胞外基質の細胞培養物又はその細胞の
上清を含む、上記のとおりの触発因子又は培地の存在下
での成熟又は未成熟の樹枝状細胞の処理により得ること
ができることを特徴とする。
常的には約２０〜４８時間に至る可能性のある時間中、
触発培地の存在下で樹枝状細胞のインキュベーションに
よって実現される。樹枝状細胞の「触発された」状態
は、その免疫学的表現型の修飾をひき起こさない。した
がって、未成熟の樹枝状細胞は、触発の後、未成熟状態
にとどまる（ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＣ４０、ＤＣ８０、ＤＣ
８６、ＤＣ８３、ＤＣ１ａの発現）。「触発された」段
階は、異なる形で明らかにできるが、一般的には、例の
中で記載されているとおりin vitroでＮＫ細胞を活性化
する細胞の能力を試験することによって、又は培養上清
内の可能性触発因子を測定することによって明らかにさ
れ得る。なお、ＮＫ細胞の活性化の枠内で、樹枝状細胞
の触発は、ＮＫ細胞の存在下でのインキュベーション又
はこれと同時に実施することができる。上記のとおり、
本発明は同様に、触発済み樹枝状細胞の個体群にも関す
る。したがって、この点で、本発明の目的は、成熟又は
未成熟の、特にヒトの触発済み樹枝状細胞、すなわちＮ
Ｋ細胞刺激能力が、特に未触発樹枝状細胞に比べ少なく
とも２倍高くなった樹枝状細胞を含む組成物にもある。
本発明に従った触発済み樹枝状細胞は、より具体的に言
うと、それが休止状態のＮＫ細胞を活性化すること、そ
して好ましくは細胞外基質の細胞培養物又はその細胞の
上清を含む、上記のとおりの触発因子又は培地の存在下
での成熟又は未成熟の樹枝状細胞の処理により得ること
ができることを特徴とする。
【００３０】ＤＣ−ＮＫの共存培養 本発明の活性化方法を実施するためには、使用される樹
枝状細胞は、成熟樹枝状細胞（特にマウスの系におい
て）又は好ましくは未成熟樹枝状細胞（ヒト及びマウス
の系において）であってよい。例に示されているよう
に、樹枝状細胞は、上記のように特に触発の後、その成
熟段階の如何に関わらず、ＮＫ細胞を活性化する特性を
有する。活性化がより効率の高いものとなるためには、
好都合には、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の比及び／又
は同時インキュベーション時間のようないくつかのパラ
メータを尊重するのがよい。したがって、出願人により
実現された実験から、invitro又はex vivoでの活性化方
法の最高の成果は、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期
比が０．０１〜１０、好ましくは０．０５〜５の間に含
まれている場合に得られる、ということが立証された。
当然のことながら、当業者は、樹枝状細胞の量が多すぎ
る場合にみられるＮＫ細胞の窒息効果及び樹枝状細胞数
が少なすぎる場合にみられることがある低い活性化レベ
ルを考慮に入れて、使用される細胞個体群に応じてこの
比率を適合させることができる。特に好ましい条件は、
樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期比が０．１〜１の
間、特に約０．１〜０．５の間に含まれている条件であ
る。
枝状細胞は、成熟樹枝状細胞（特にマウスの系におい
て）又は好ましくは未成熟樹枝状細胞（ヒト及びマウス
の系において）であってよい。例に示されているよう
に、樹枝状細胞は、上記のように特に触発の後、その成
熟段階の如何に関わらず、ＮＫ細胞を活性化する特性を
有する。活性化がより効率の高いものとなるためには、
好都合には、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の比及び／又
は同時インキュベーション時間のようないくつかのパラ
メータを尊重するのがよい。したがって、出願人により
実現された実験から、invitro又はex vivoでの活性化方
法の最高の成果は、樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期
比が０．０１〜１０、好ましくは０．０５〜５の間に含
まれている場合に得られる、ということが立証された。
当然のことながら、当業者は、樹枝状細胞の量が多すぎ
る場合にみられるＮＫ細胞の窒息効果及び樹枝状細胞数
が少なすぎる場合にみられることがある低い活性化レベ
ルを考慮に入れて、使用される細胞個体群に応じてこの
比率を適合させることができる。特に好ましい条件は、
樹枝状細胞に対するＮＫ細胞の初期比が０．１〜１の
間、特に約０．１〜０．５の間に含まれている条件であ
る。
【００３１】共存培養時間に関しては、これは当業者に
より、使用される細胞個体群特に樹枝状細胞の成熟及び
触発段階に応じて適合させることができる。一般に、Ｎ
Ｋ細胞の最適な活性化は、共存培養の後約１８時間〜４
８時間の期間中に見られる。好ましくは、樹枝状細胞が
上記のとおりに触発された場合、休止状態にあるＮＫ細
胞の活性化は、２０時間未満の共存培養期間の後で得ら
れる。上記の共存培養期間は、特に、活性化されたＮＫ
細胞の割合と生存可能な細胞の割合の間の最高の組合せ
を得ることを可能にする。この点に関して、樹枝状細胞
による活性化期間中、ＮＫ亜個体群の隔離された特異的
な増殖が起こっている一方で、ＮＫ細胞の有意な包括的
増殖が全く観察されていないこと（係数およそ２）に留
意されたい。そのうえ、特に思いがけず、樹枝状細胞は
培養状態にあるＮＫ細胞の生存に対しプラスの効果を及
ぼすと思われる。このため、本発明の方法は、必ずしも
サイトカインに助けを求める必要なく、改良された収量
で、活性化されたＮＫ細胞を得ることを可能にする。同
様にして、戻りのＮＫ細胞は成熟ＤＣの生存を増大させ
る。in vitroでのＮＫ細胞の活性化及び樹枝状細胞の触
発は、好ましくは滅菌条件下で細胞培養に適したあらゆ
る装置の中で実施することができる。すなわち、特に平
板、培養皿、フラスコ、ガラスびん、袋などが考えられ
る。なお、共存培養は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の培養
に適合させたあらゆる培地の中で実行される。より一般
的に言うと、これは、例えばＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培
地、ＩＭＤＭ培地又はＧＢＥＡ（ＡＩＭＶ、Ｘ−ＶＩＶ
Ｏ）培地などのような哺乳動物細胞の培養向けの市販の
培地であってよい。
より、使用される細胞個体群特に樹枝状細胞の成熟及び
触発段階に応じて適合させることができる。一般に、Ｎ
Ｋ細胞の最適な活性化は、共存培養の後約１８時間〜４
８時間の期間中に見られる。好ましくは、樹枝状細胞が
上記のとおりに触発された場合、休止状態にあるＮＫ細
胞の活性化は、２０時間未満の共存培養期間の後で得ら
れる。上記の共存培養期間は、特に、活性化されたＮＫ
細胞の割合と生存可能な細胞の割合の間の最高の組合せ
を得ることを可能にする。この点に関して、樹枝状細胞
による活性化期間中、ＮＫ亜個体群の隔離された特異的
な増殖が起こっている一方で、ＮＫ細胞の有意な包括的
増殖が全く観察されていないこと（係数およそ２）に留
意されたい。そのうえ、特に思いがけず、樹枝状細胞は
培養状態にあるＮＫ細胞の生存に対しプラスの効果を及
ぼすと思われる。このため、本発明の方法は、必ずしも
サイトカインに助けを求める必要なく、改良された収量
で、活性化されたＮＫ細胞を得ることを可能にする。同
様にして、戻りのＮＫ細胞は成熟ＤＣの生存を増大させ
る。in vitroでのＮＫ細胞の活性化及び樹枝状細胞の触
発は、好ましくは滅菌条件下で細胞培養に適したあらゆ
る装置の中で実施することができる。すなわち、特に平
板、培養皿、フラスコ、ガラスびん、袋などが考えられ
る。なお、共存培養は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の培養
に適合させたあらゆる培地の中で実行される。より一般
的に言うと、これは、例えばＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培
地、ＩＭＤＭ培地又はＧＢＥＡ（ＡＩＭＶ、Ｘ−ＶＩＶ
Ｏ）培地などのような哺乳動物細胞の培養向けの市販の
培地であってよい。
【００３２】本発明の特別な第１の変形形態によると、
ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細
胞と成熟樹枝状細胞の共存培養によって実現される。標
準的な実験においては、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４での処
置により骨髄から誘導され、ＬＰＳで成熟させられた樹
枝状細胞、又は樹枝状細胞の確立された１系統の成熟状
態にある細胞は、１００万個／mlの割合で、その培地の
中に再懸濁される。その後、これらの細胞は、平板又は
他のあらゆる適切な装置で培養に付される。付着段階の
後に得られる休止状態の新鮮なＮＫ細胞（自己由来又は
同種異系）を、１００万個／mlの濃度で適切な培地（例
えば補足されたＲＰＭＩ培地）で再懸濁する。これらを
次に、ＮＫ：ＤＣの初期比が約０．１〜０．３となるよ
うな形で、樹枝状細胞を含む平板に添加する。約１８〜
３６時間で共存培養を収集する。ＮＫ細胞の活性化され
た性質は、上清中のＩＦＮγの産生の測定及び標的細胞
に対する細胞傷害性の測定によって制御される。ＮＫ細
胞も同様に、特徴的マーカー（例えばマウスにおけるＮ
Ｋ１．１Ｄ×５、又はasialo−ＧＭ１）の発現のため及
び細胞死亡率を評価するため、計数（例えばトリパンブ
ルー）され分析（例えばフラックス血球計算法で）され
る。
ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細
胞と成熟樹枝状細胞の共存培養によって実現される。標
準的な実験においては、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４での処
置により骨髄から誘導され、ＬＰＳで成熟させられた樹
枝状細胞、又は樹枝状細胞の確立された１系統の成熟状
態にある細胞は、１００万個／mlの割合で、その培地の
中に再懸濁される。その後、これらの細胞は、平板又は
他のあらゆる適切な装置で培養に付される。付着段階の
後に得られる休止状態の新鮮なＮＫ細胞（自己由来又は
同種異系）を、１００万個／mlの濃度で適切な培地（例
えば補足されたＲＰＭＩ培地）で再懸濁する。これらを
次に、ＮＫ：ＤＣの初期比が約０．１〜０．３となるよ
うな形で、樹枝状細胞を含む平板に添加する。約１８〜
３６時間で共存培養を収集する。ＮＫ細胞の活性化され
た性質は、上清中のＩＦＮγの産生の測定及び標的細胞
に対する細胞傷害性の測定によって制御される。ＮＫ細
胞も同様に、特徴的マーカー（例えばマウスにおけるＮ
Ｋ１．１Ｄ×５、又はasialo−ＧＭ１）の発現のため及
び細胞死亡率を評価するため、計数（例えばトリパンブ
ルー）され分析（例えばフラックス血球計算法で）され
る。
【００３３】本発明の方法の特別なもう１つの変形形態
に従うと、ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化
は、ＮＫ細胞と未成熟細胞の共存培養によって実現され
る。標準的な実験においては、細胞は上記のものと同一
のやり方で処理するが、樹枝状細胞を未成熟段階に維持
するように、成熟培地中でインキュベーションしない。
この実施態様においては、共存培養は、好都合には、Ｎ
Ｋ細胞の最適な活性化を可能にするため、少なくとも３
６〜７２時間維持される。活性化されたＮＫ細胞は、次
に、上記のように分析され制御され得る。
に従うと、ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化
は、ＮＫ細胞と未成熟細胞の共存培養によって実現され
る。標準的な実験においては、細胞は上記のものと同一
のやり方で処理するが、樹枝状細胞を未成熟段階に維持
するように、成熟培地中でインキュベーションしない。
この実施態様においては、共存培養は、好都合には、Ｎ
Ｋ細胞の最適な活性化を可能にするため、少なくとも３
６〜７２時間維持される。活性化されたＮＫ細胞は、次
に、上記のように分析され制御され得る。
【００３４】本発明の方法の好ましい一実施態様では、
ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細
胞と触発済み樹枝状細胞の共存培養によって実現され
る。この実施態様においては、ＮＫ細胞の最適な活性化
を可能にするためには、２０時間未満の共存培養で充分
である。活性化されたＮＫ細胞は、次に以上で記載され
ているとおりに分析及び制御することができる。より好
ましくは、これは、触発培地の存在下で予めインキュベ
ーションされた未成熟樹枝状細胞である。さらに一層好
ましくは、これは、線維芽細胞の存在下で予めインキュ
ベーションされた未成熟樹枝状細胞、又は線維芽細胞の
上清又は線維芽細胞から産生されたタンパク質因子であ
る。ＮＫ細胞がこのように活性化された時点で、ＮＫ細
胞を樹枝状細胞から分離すること、又はＮＫ細胞と樹枝
状細胞の共存培養を直接収獲することが可能である。こ
の点で、本発明は同様に、ＮＫ細胞及び樹枝状細胞、特
にＮＫ細胞と樹枝状細胞の共存培養物を含む組成物をも
その目的としている。前記のとおり、これは、好都合に
は活性化されたＮＫ細胞である。そのうえ、好ましくは
触発された成熟又は未成熟樹枝状細胞であってもよい。
最後に、本発明によるこれらの組成物においては、細胞
個体群は、好ましくは自己由来すなわち同じ生体に由来
している。これらの組成物は、好都合には、分離された
細胞個体群で構成されている。すなわち２つの細胞個体
群は各々少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０
％、特に少なくとも５０％の対応する細胞型（ＮＫ又は
樹枝状細胞）で構成される。なお、本発明に基づく好ま
しい組成物は、一般に少なくとも１０％、好ましくは２
０〜６０％、さらに好ましくは３０〜６０％のＮＫ細胞
そして少なくとも４０％好ましくは４０〜８０％の樹枝
状細胞を含む。本発明は同様に、本出願で記載するとお
り、活性化されたＮＫ細胞を含むあらゆる組成物にも関
する。本発明の組成物は、袋、バイアル、アンプル、注
射器、小びんの適合されたあらゆる装置の中に包装する
ことができ、また以下で記載するとおり（冷所に）保管
されてもよいし、即時使用することもできる。好都合に
は、これらの組成物は、１０4〜１０9個のＮＫ細胞、好
ましくは約１０6〜１０8個（特に人間に投与する場合）
さらには１０5〜１０6個（特にマウスに投与する場合）
のＮＫ細胞を含む。
ＮＫ細胞のin vitro又はex vivoでの活性化は、ＮＫ細
胞と触発済み樹枝状細胞の共存培養によって実現され
る。この実施態様においては、ＮＫ細胞の最適な活性化
を可能にするためには、２０時間未満の共存培養で充分
である。活性化されたＮＫ細胞は、次に以上で記載され
ているとおりに分析及び制御することができる。より好
ましくは、これは、触発培地の存在下で予めインキュベ
ーションされた未成熟樹枝状細胞である。さらに一層好
ましくは、これは、線維芽細胞の存在下で予めインキュ
ベーションされた未成熟樹枝状細胞、又は線維芽細胞の
上清又は線維芽細胞から産生されたタンパク質因子であ
る。ＮＫ細胞がこのように活性化された時点で、ＮＫ細
胞を樹枝状細胞から分離すること、又はＮＫ細胞と樹枝
状細胞の共存培養を直接収獲することが可能である。こ
の点で、本発明は同様に、ＮＫ細胞及び樹枝状細胞、特
にＮＫ細胞と樹枝状細胞の共存培養物を含む組成物をも
その目的としている。前記のとおり、これは、好都合に
は活性化されたＮＫ細胞である。そのうえ、好ましくは
触発された成熟又は未成熟樹枝状細胞であってもよい。
最後に、本発明によるこれらの組成物においては、細胞
個体群は、好ましくは自己由来すなわち同じ生体に由来
している。これらの組成物は、好都合には、分離された
細胞個体群で構成されている。すなわち２つの細胞個体
群は各々少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０
％、特に少なくとも５０％の対応する細胞型（ＮＫ又は
樹枝状細胞）で構成される。なお、本発明に基づく好ま
しい組成物は、一般に少なくとも１０％、好ましくは２
０〜６０％、さらに好ましくは３０〜６０％のＮＫ細胞
そして少なくとも４０％好ましくは４０〜８０％の樹枝
状細胞を含む。本発明は同様に、本出願で記載するとお
り、活性化されたＮＫ細胞を含むあらゆる組成物にも関
する。本発明の組成物は、袋、バイアル、アンプル、注
射器、小びんの適合されたあらゆる装置の中に包装する
ことができ、また以下で記載するとおり（冷所に）保管
されてもよいし、即時使用することもできる。好都合に
は、これらの組成物は、１０4〜１０9個のＮＫ細胞、好
ましくは約１０6〜１０8個（特に人間に投与する場合）
さらには１０5〜１０6個（特にマウスに投与する場合）
のＮＫ細胞を含む。
【００３５】ＤＣから誘導された調製物の存在下でのＮ
Ｋの活性化 もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、樹枝
状細胞から誘導された調製物をＮＫ細胞の存在下におく
ことにより、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞
を活性化することを含む。樹枝状細胞から誘導された調
製物は分離、富化又は精製された形での樹枝状細胞のあ
らゆる調製物又は膜画分、樹枝状細胞の細胞リゼイト、
樹枝状細胞の膜小胞又は樹枝状細胞から誘導された刺激
因子であると考えられる。実際、本出願に例示されてい
るように、ＮＫ細胞の活性化は、完全な樹枝状細胞の存
在下のみならず、この樹枝状細胞の膜調製物、特に膜小
胞（例えばデキソゾーム）、又はタンパク質性の刺激因
子の存在下でも得ることができる。
Ｋの活性化 もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、樹枝
状細胞から誘導された調製物をＮＫ細胞の存在下におく
ことにより、in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞
を活性化することを含む。樹枝状細胞から誘導された調
製物は分離、富化又は精製された形での樹枝状細胞のあ
らゆる調製物又は膜画分、樹枝状細胞の細胞リゼイト、
樹枝状細胞の膜小胞又は樹枝状細胞から誘導された刺激
因子であると考えられる。実際、本出願に例示されてい
るように、ＮＫ細胞の活性化は、完全な樹枝状細胞の存
在下のみならず、この樹枝状細胞の膜調製物、特に膜小
胞（例えばデキソゾーム）、又はタンパク質性の刺激因
子の存在下でも得ることができる。
【００３６】第１の変形形態によると、本発明の方法
は、樹枝状細胞により産生された膜小胞の存在下にＮＫ
細胞をおくことにより、in vitro、ex vivo又はin vivo
でＮＫ細胞を活性化することを含む。この点で、樹枝状
細胞がデキソゾームと呼ばれる一般に５０nm〜１００nm
の直径を持つ膜小胞を産生することが実証された（ＦＲ
９７０９００７；ＦＲ９８０１４３７）。ここで本発明
は、これらの小胞が同様にＮＫ細胞刺激活性を備えてい
ることを示している。特に、本出願は、ヒト又はマウス
の樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが、マウスの
ＮＫ細胞を活性化する能力を持つことを示している。そ
のうえ、得られた結果は、この活性化が、未触発樹枝状
細胞によって産生されたデキソゾームについてさえ観察
されるということを示している。好ましくは、この変形
形態の実施のためには、好ましくは自己由来又は同種異
系の未成熟樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが使
用される。in vitro又はex vivoでの使用分野について
は、１００万個のＮＫ細胞について１０〜１００μgの
エキソゾームタンパク質という濃度範囲内でデキソゾー
ムを使用することが好ましい。エキソゾームタンパク質
の量は、例えばブラッドフォード試験によって当業者に
より容易に決定され得る（Annal. Biochem. 72 (1976)
248）。より好ましくは、１０6個のＮＫ細胞につき１５
μg以上、さらに好ましくは１０6個のＮＫ細胞につき２
０μg以上の濃度でデキソゾームを使用する。これらの
濃度は当業者によって適合させることができ、in vivo
での使用に移行し得るものであるということに留意され
たい。特にin vivoでの使用のためには、１回の注射に
つき５０〜１００μgを上回るエキソゾーム用量を使用
することが可能である。
は、樹枝状細胞により産生された膜小胞の存在下にＮＫ
細胞をおくことにより、in vitro、ex vivo又はin vivo
でＮＫ細胞を活性化することを含む。この点で、樹枝状
細胞がデキソゾームと呼ばれる一般に５０nm〜１００nm
の直径を持つ膜小胞を産生することが実証された（ＦＲ
９７０９００７；ＦＲ９８０１４３７）。ここで本発明
は、これらの小胞が同様にＮＫ細胞刺激活性を備えてい
ることを示している。特に、本出願は、ヒト又はマウス
の樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが、マウスの
ＮＫ細胞を活性化する能力を持つことを示している。そ
のうえ、得られた結果は、この活性化が、未触発樹枝状
細胞によって産生されたデキソゾームについてさえ観察
されるということを示している。好ましくは、この変形
形態の実施のためには、好ましくは自己由来又は同種異
系の未成熟樹枝状細胞から産生されるデキソゾームが使
用される。in vitro又はex vivoでの使用分野について
は、１００万個のＮＫ細胞について１０〜１００μgの
エキソゾームタンパク質という濃度範囲内でデキソゾー
ムを使用することが好ましい。エキソゾームタンパク質
の量は、例えばブラッドフォード試験によって当業者に
より容易に決定され得る（Annal. Biochem. 72 (1976)
248）。より好ましくは、１０6個のＮＫ細胞につき１５
μg以上、さらに好ましくは１０6個のＮＫ細胞につき２
０μg以上の濃度でデキソゾームを使用する。これらの
濃度は当業者によって適合させることができ、in vivo
での使用に移行し得るものであるということに留意され
たい。特にin vivoでの使用のためには、１回の注射に
つき５０〜１００μgを上回るエキソゾーム用量を使用
することが可能である。
【００３７】デキソゾームは、例中に示されている例え
ばＦＲ９７０９００７及びＦＲ９８０１４３７のような
出願の中で記載された技術に従って調製可能である。簡
単に言うと、樹枝状細胞は、好ましくは未成熟段階で、
好ましくはデキソゾームの産生に有利に作用する培地の
中で培養される。その後デキソゾームは、遠心分離（特
に７０，０００ｇでの分画超遠心分離）のような方法又
は当業者にとって公知の他のあらゆる技術によって単離
される。デキソゾームはこのように単離され、アリコー
トにされ、保存されるか又はＮＫ細胞の刺激のために即
時使用される。
ばＦＲ９７０９００７及びＦＲ９８０１４３７のような
出願の中で記載された技術に従って調製可能である。簡
単に言うと、樹枝状細胞は、好ましくは未成熟段階で、
好ましくはデキソゾームの産生に有利に作用する培地の
中で培養される。その後デキソゾームは、遠心分離（特
に７０，０００ｇでの分画超遠心分離）のような方法又
は当業者にとって公知の他のあらゆる技術によって単離
される。デキソゾームはこのように単離され、アリコー
トにされ、保存されるか又はＮＫ細胞の刺激のために即
時使用される。
【００３８】もう１つの変形形態に従うと、本発明の方
法は、樹枝状細胞、特に触発済み樹枝状細胞に由来する
刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくことによって、in v
itro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化させるこ
とを含む。本出願の中で示されている結果は、実際、樹
枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化の特異性を例示してお
り、ひいてはこの効果の実現における、樹枝状細胞が産
生又は発現する単数又は複数の因子の関与を示してい
る。この点で、本出願は同様に、「トランスウェル」実
験において、ＮＫ細胞と樹枝状細胞又は樹枝状細胞から
誘導された膜調製物の間の細胞間接触が活性化に必要で
あると思われるということをも示している。したがって
これらの結果は、ＮＫ細胞のこの活性化の原因であるか
又は少なくともこの活性化に必要なものである、デキソ
ゾーム及び樹枝状細胞により（表面で）発現されるＮＫ
細胞の刺激因子の存在を明確に例示している。したがっ
てこの（膜）（同時）刺激因子又はこれを含むあらゆる
無細胞調製物、又はこの因子のあらゆる誘導体又は組換
え型形態ならびに対応する核酸は同様にＮＫ細胞を活性
化するため、特に抗腫瘍又は抗ウイルス免疫化における
使用分野のために、in vitro又はin vivoで使用するこ
ともできる。なお、この因子は、移植片対宿主病又は移
植片拒絶といった或る種の状況下で、競合体、特異的抗
体、さらにはアンチセンスの使用により遮断することが
可能である。
法は、樹枝状細胞、特に触発済み樹枝状細胞に由来する
刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくことによって、in v
itro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を活性化させるこ
とを含む。本出願の中で示されている結果は、実際、樹
枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化の特異性を例示してお
り、ひいてはこの効果の実現における、樹枝状細胞が産
生又は発現する単数又は複数の因子の関与を示してい
る。この点で、本出願は同様に、「トランスウェル」実
験において、ＮＫ細胞と樹枝状細胞又は樹枝状細胞から
誘導された膜調製物の間の細胞間接触が活性化に必要で
あると思われるということをも示している。したがって
これらの結果は、ＮＫ細胞のこの活性化の原因であるか
又は少なくともこの活性化に必要なものである、デキソ
ゾーム及び樹枝状細胞により（表面で）発現されるＮＫ
細胞の刺激因子の存在を明確に例示している。したがっ
てこの（膜）（同時）刺激因子又はこれを含むあらゆる
無細胞調製物、又はこの因子のあらゆる誘導体又は組換
え型形態ならびに対応する核酸は同様にＮＫ細胞を活性
化するため、特に抗腫瘍又は抗ウイルス免疫化における
使用分野のために、in vitro又はin vivoで使用するこ
ともできる。なお、この因子は、移植片対宿主病又は移
植片拒絶といった或る種の状況下で、競合体、特異的抗
体、さらにはアンチセンスの使用により遮断することが
可能である。
【００３９】本発明のもう１つの目的は、同様に、樹枝
状細胞から誘導されたＮＫ細胞の刺激因子、特に樹枝状
細胞によるＮＫ細胞の活性化に関与する膜因子を含む組
成物に関する。「関与する」という語は、この因子が樹
枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化に必要であるか又は少
なくとも、これに参加することを意味している。この組
成物は例えば、前記因子を含む樹枝状細胞の無細胞抽出
物、膜小胞又はこの因子の単離された又は精製されたあ
らゆる形態で構成されている。「誘導された」という語
は、基本的にタンパク質性のこの因子が、特に、細胞溶
解とそれに続くさまざまな遠心分離工程（分画遠心分
離、超遠心分離など）及び／又はクロマトグラフィー、
電気泳動、中和抗体産生及び免疫親和性による分離のた
めのそれらの使用、のような当業者にとって周知のさま
ざまな分離方法によって精製され得るということを表し
ている。これらの技術の各々は、単独か又は組合わされ
た形で、本出願の中で記載されているようなＮＫ細胞の
活性化試験により精製のさまざまな工程に従うことによ
って、活性化に関与する刺激因子を単離するのに使用す
ることができる。この因子の同定のためのもう１つのア
プローチは、樹枝状細胞のＤＮＡバンクの使用及び活性
を有するか又はこの活性を持たない樹枝状細胞の突然変
異体を補完する能力を持つクローンの探求にある。この
展望の下で、（触発済み樹枝状細胞と未触発樹枝状細胞
の間の減算による）ディファレンシャルＤＮＡバンクを
確立することができる。
状細胞から誘導されたＮＫ細胞の刺激因子、特に樹枝状
細胞によるＮＫ細胞の活性化に関与する膜因子を含む組
成物に関する。「関与する」という語は、この因子が樹
枝状細胞によるＮＫ細胞の活性化に必要であるか又は少
なくとも、これに参加することを意味している。この組
成物は例えば、前記因子を含む樹枝状細胞の無細胞抽出
物、膜小胞又はこの因子の単離された又は精製されたあ
らゆる形態で構成されている。「誘導された」という語
は、基本的にタンパク質性のこの因子が、特に、細胞溶
解とそれに続くさまざまな遠心分離工程（分画遠心分
離、超遠心分離など）及び／又はクロマトグラフィー、
電気泳動、中和抗体産生及び免疫親和性による分離のた
めのそれらの使用、のような当業者にとって周知のさま
ざまな分離方法によって精製され得るということを表し
ている。これらの技術の各々は、単独か又は組合わされ
た形で、本出願の中で記載されているようなＮＫ細胞の
活性化試験により精製のさまざまな工程に従うことによ
って、活性化に関与する刺激因子を単離するのに使用す
ることができる。この因子の同定のためのもう１つのア
プローチは、樹枝状細胞のＤＮＡバンクの使用及び活性
を有するか又はこの活性を持たない樹枝状細胞の突然変
異体を補完する能力を持つクローンの探求にある。この
展望の下で、（触発済み樹枝状細胞と未触発樹枝状細胞
の間の減算による）ディファレンシャルＤＮＡバンクを
確立することができる。
【００４０】より一般的な形で、本発明はここで、ＮＫ
細胞と試験組成物の間の膜間接触が関与する、ＮＫを刺
激する能力を持つ因子の調製方法について記載する。よ
り具体的に言うと、本発明は、膜画分を含む生体材料と
ＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生
体材料中に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞
刺激因子の同定及び／又は調製方法に関する。より好ま
しくは、膜画分を含む生体材料は、樹枝状細胞、樹枝状
細胞の細胞下調製物（特に膜小胞）又はポリペプチド産
物をコードする核酸により形質転換される細胞であって
よい。したがってこれは、ヒト由来のＤＮＡバンク、特
に樹枝状細胞のｃＤＮＡバンクにより形質転換された哺
乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞）であり得る。ＮＫ活性
の刺激を誘発するクローンが選択され、それに含まれる
挿入物が分離され精製され特徴づけされる。したがって
この方法は、ＮＫ細胞の刺激因子をコードするあらゆる
核酸のクローニングを可能にする。得られた核酸は、改
変し、発現ベクター内に導入し、タンパク質性の刺激因
子の産生方法の中で使用することができる。
細胞と試験組成物の間の膜間接触が関与する、ＮＫを刺
激する能力を持つ因子の調製方法について記載する。よ
り具体的に言うと、本発明は、膜画分を含む生体材料と
ＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生
体材料中に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞
刺激因子の同定及び／又は調製方法に関する。より好ま
しくは、膜画分を含む生体材料は、樹枝状細胞、樹枝状
細胞の細胞下調製物（特に膜小胞）又はポリペプチド産
物をコードする核酸により形質転換される細胞であって
よい。したがってこれは、ヒト由来のＤＮＡバンク、特
に樹枝状細胞のｃＤＮＡバンクにより形質転換された哺
乳動物細胞（例えばＣＯＳ細胞）であり得る。ＮＫ活性
の刺激を誘発するクローンが選択され、それに含まれる
挿入物が分離され精製され特徴づけされる。したがって
この方法は、ＮＫ細胞の刺激因子をコードするあらゆる
核酸のクローニングを可能にする。得られた核酸は、改
変し、発現ベクター内に導入し、タンパク質性の刺激因
子の産生方法の中で使用することができる。
【００４１】したがって、本発明は、膜画分を含む生体
材料とＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の実
証、及び生体材料内に存在する活性化因子の分離を含
む、ＮＫ細胞の刺激因子の同定及び／又は調製方法にも
関する。したがって本発明の特別な組成物は、成熟樹枝
状細胞膜から又は未成熟樹枝状細胞により産生される膜
小胞から得ることができる基本的にタンパク質性の、Ｄ
Ｃから誘導されたＮＫ細胞の刺激因子を含む。より具体
的な組成物には、ヒトの未成熟樹枝状細胞により産生さ
れるエキソゾームから得ることができ、しかも休止状態
のＮＫ細胞によりガンマインターフェロンの分泌を刺激
することのできる基本的にタンパク質性の因子を含む。
材料とＮＫ細胞個体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の実
証、及び生体材料内に存在する活性化因子の分離を含
む、ＮＫ細胞の刺激因子の同定及び／又は調製方法にも
関する。したがって本発明の特別な組成物は、成熟樹枝
状細胞膜から又は未成熟樹枝状細胞により産生される膜
小胞から得ることができる基本的にタンパク質性の、Ｄ
Ｃから誘導されたＮＫ細胞の刺激因子を含む。より具体
的な組成物には、ヒトの未成熟樹枝状細胞により産生さ
れるエキソゾームから得ることができ、しかも休止状態
のＮＫ細胞によりガンマインターフェロンの分泌を刺激
することのできる基本的にタンパク質性の因子を含む。
【００４２】なお、「誘導された」という語は同様に本
発明の組成物が、特に酵母又は哺乳動物細胞のような培
養中の組換え型細胞から発現された、上で同定された刺
激因子のあらゆる変異体又は組換え型形態を含むことが
できる、ということを表している。この点において、本
発明の組成物は同様に上記のような樹枝状細胞（特に触
発されたもの）の刺激膜因子をコードするあらゆる核酸
を含有することができる。この核酸は、当業者にとって
公知のあらゆる技術によって、特に触発済み樹枝状細胞
のＤＮＡバンクから得ることができる。最後に、本発明
による組成物は同様に、ＮＫ細胞のその他のあらゆる同
時刺激因子、そして特に、上記の刺激因子と組合わされ
てＮＫ細胞を活性化させることのできる全てのリンホカ
イン又はサイトカインを含有することができる。したが
って、特定の一実施態様に従うと、本発明は、樹枝状細
胞から誘導された刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくこ
とによってin vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を
活性化する方法を含む。
発明の組成物が、特に酵母又は哺乳動物細胞のような培
養中の組換え型細胞から発現された、上で同定された刺
激因子のあらゆる変異体又は組換え型形態を含むことが
できる、ということを表している。この点において、本
発明の組成物は同様に上記のような樹枝状細胞（特に触
発されたもの）の刺激膜因子をコードするあらゆる核酸
を含有することができる。この核酸は、当業者にとって
公知のあらゆる技術によって、特に触発済み樹枝状細胞
のＤＮＡバンクから得ることができる。最後に、本発明
による組成物は同様に、ＮＫ細胞のその他のあらゆる同
時刺激因子、そして特に、上記の刺激因子と組合わされ
てＮＫ細胞を活性化させることのできる全てのリンホカ
イン又はサイトカインを含有することができる。したが
って、特定の一実施態様に従うと、本発明は、樹枝状細
胞から誘導された刺激因子の存在下にＮＫ細胞をおくこ
とによってin vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ細胞を
活性化する方法を含む。
【００４３】したがって、本発明はさらに、ＮＫ細胞の
細胞溶解活性の増大あるいはin vivoでのＩＦＮγ及び
／又はＴＮＦαの産生を目的とする組成物の調製のため
の、上記のとおりの刺激因子の使用に関する。本発明は
同様に、１つの生体の自然免疫の増大を目的とした組成
物の調製のための上記のとおりの刺激因子の使用にも関
する。本発明はさらに、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増大
in vitro又はex vivoでのＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα
の産生のための、上記のとおりの刺激因子の使用にも関
する。本発明は同様に、ＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の相
互作用に干渉する（すなわち少なくとも部分的に阻害す
る）能力を持つ化合物の存在下にＮＫ細胞をおくことを
含む、in vitro又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化の負
の制御を行うための方法に関する。このような化合物
は、例えば、刺激因子の可溶形態（可溶性レセプター）
又はその他のあらゆるフラグメント（特に細胞外ドメイ
ン、特に結合部位）、アナログ、アンタゴニスト、競合
体、抗体又は抗体フラグメント、アンチセンスなどを含
むことができる。このような化合物は、前述の刺激因子
からのスクリーニング試験又はＮＫの活性化のあらゆる
直接的又は間接的機能試験において、同定及び／又は特
徴づけすることができる。この点で、本発明は同様に、
休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞、好ましくは触発済
み樹枝状細胞又はデキソゾーム又は上記のとおりのＮＫ
刺激因子と共に、１つの試験化合物又は単数又は複数の
試験組成物を含む組成物をインキュベーションする工
程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程、及び試験化合物
／組成物の不在下で実施された対照実験との関係におい
てＮＫ細胞の活性化を阻害（すなわち削減）する能力を
持つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の
活性化を阻害する能力を持つ化合物の同定及び／又は特
徴づけ方法にも関する。
細胞溶解活性の増大あるいはin vivoでのＩＦＮγ及び
／又はＴＮＦαの産生を目的とする組成物の調製のため
の、上記のとおりの刺激因子の使用に関する。本発明は
同様に、１つの生体の自然免疫の増大を目的とした組成
物の調製のための上記のとおりの刺激因子の使用にも関
する。本発明はさらに、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増大
in vitro又はex vivoでのＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα
の産生のための、上記のとおりの刺激因子の使用にも関
する。本発明は同様に、ＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の相
互作用に干渉する（すなわち少なくとも部分的に阻害す
る）能力を持つ化合物の存在下にＮＫ細胞をおくことを
含む、in vitro又はin vivoでのＮＫ細胞の活性化の負
の制御を行うための方法に関する。このような化合物
は、例えば、刺激因子の可溶形態（可溶性レセプター）
又はその他のあらゆるフラグメント（特に細胞外ドメイ
ン、特に結合部位）、アナログ、アンタゴニスト、競合
体、抗体又は抗体フラグメント、アンチセンスなどを含
むことができる。このような化合物は、前述の刺激因子
からのスクリーニング試験又はＮＫの活性化のあらゆる
直接的又は間接的機能試験において、同定及び／又は特
徴づけすることができる。この点で、本発明は同様に、
休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞、好ましくは触発済
み樹枝状細胞又はデキソゾーム又は上記のとおりのＮＫ
刺激因子と共に、１つの試験化合物又は単数又は複数の
試験組成物を含む組成物をインキュベーションする工
程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程、及び試験化合物
／組成物の不在下で実施された対照実験との関係におい
てＮＫ細胞の活性化を阻害（すなわち削減）する能力を
持つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の
活性化を阻害する能力を持つ化合物の同定及び／又は特
徴づけ方法にも関する。
【００４４】したがって本発明は外用（ex vivo）又は
内用（in vivo）で使用する医薬品又は薬学的組成物と
しての樹枝状細胞によるＮＫのこの活性化の阻害化合物
の使用にも関する。この点で、本発明は同様に、樹枝状
細胞と細胞の間の相互作用と干渉する能力、したがって
樹枝状細胞（又はデキソゾーム）とＮＫ細胞の間の接触
を少なくとも部分的に阻害する能力を持つあらゆる化合
物にも関する。この化合物は上記のとおり、中和抗体、
競合的リガンド、刺激因子の類似体、フラグメント又は
誘導体、全ての化学分子などであり得る。本発明は同様
に、特に移植片拒絶及びＧＶＨの予防といった応用分野
における、in vivo又はin vitroでＮＫ細胞の活性化を
制御するためのこのような化合物の使用にも関する。さ
らに、本発明は同様に、特に Grouard et al. (Nature
384, 364-367, 1996）により記載されているＧＣ−ＤＣ
のような「寛容原性の」表現型を持つ樹枝状細胞又は寛
容原性樹枝状細胞の誘導産物の、ＮＫ細胞活性化阻害の
ための使用にも関する。
内用（in vivo）で使用する医薬品又は薬学的組成物と
しての樹枝状細胞によるＮＫのこの活性化の阻害化合物
の使用にも関する。この点で、本発明は同様に、樹枝状
細胞と細胞の間の相互作用と干渉する能力、したがって
樹枝状細胞（又はデキソゾーム）とＮＫ細胞の間の接触
を少なくとも部分的に阻害する能力を持つあらゆる化合
物にも関する。この化合物は上記のとおり、中和抗体、
競合的リガンド、刺激因子の類似体、フラグメント又は
誘導体、全ての化学分子などであり得る。本発明は同様
に、特に移植片拒絶及びＧＶＨの予防といった応用分野
における、in vivo又はin vitroでＮＫ細胞の活性化を
制御するためのこのような化合物の使用にも関する。さ
らに、本発明は同様に、特に Grouard et al. (Nature
384, 364-367, 1996）により記載されているＧＣ−ＤＣ
のような「寛容原性の」表現型を持つ樹枝状細胞又は寛
容原性樹枝状細胞の誘導産物の、ＮＫ細胞活性化阻害の
ための使用にも関する。
【００４５】in vivoでのＤＣの増大によるＮＫの活性
化 もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、in v
ivoでの樹枝状細胞レベルの上昇による、in vivoでのＮ
Ｋ細胞の活性化を含む。このin vivoでの増大は、実際
にＮＫ細胞のin situ活性化を行い、ひいては特に腫瘍
細胞又は感染細胞に対する生体の自然抗体を強化するこ
とを可能にする。樹枝状細胞レベルのin vivoでの上昇
は、場合によっては触発済みの樹枝状細胞のin vivo投
与（受身移入）によっても、あるいは樹枝状細胞の単数
又は複数の成長及び／又は触発因子のin vivo投与によ
っても更にはそれらを組み合わせた形でも実現できる。
この投与は、例えば注射、好ましくは皮下注射又は全身
注射によって実施される。注射は、好ましくは局部又は
局所注射、特に腫瘍近くのような治療すべき部位又はそ
の近くへの注射である。例中で紹介されている結果は、
特に、腫瘍の部位における未成熟又は成熟の、同種異系
又は自己由来の樹枝状細胞のin vivoでの皮下又は静脈
内注射による投与が、陰性ＭＨＣクラスＩ腫瘍の成長を
低下させ得ることを実証している。注射は一般的には、
１０4〜１０8個、好ましくは１０5個以上１０7個以下の
樹枝状細胞という細胞用量をベースとして実施される。
さらに、注射プロトコルは、状況に応じて（予防用、治
療用、隔離された腫瘍、転移、重大な又は局所的な感染
など）当業者により適合化され得る。したがって、例え
ば数ヵ月にわたり一週間に１〜２回の投与といった反復
した投与により樹枝状細胞の受身移入を行うことが可能
である。
化 もう１つの実施態様においては、本発明の方法は、in v
ivoでの樹枝状細胞レベルの上昇による、in vivoでのＮ
Ｋ細胞の活性化を含む。このin vivoでの増大は、実際
にＮＫ細胞のin situ活性化を行い、ひいては特に腫瘍
細胞又は感染細胞に対する生体の自然抗体を強化するこ
とを可能にする。樹枝状細胞レベルのin vivoでの上昇
は、場合によっては触発済みの樹枝状細胞のin vivo投
与（受身移入）によっても、あるいは樹枝状細胞の単数
又は複数の成長及び／又は触発因子のin vivo投与によ
っても更にはそれらを組み合わせた形でも実現できる。
この投与は、例えば注射、好ましくは皮下注射又は全身
注射によって実施される。注射は、好ましくは局部又は
局所注射、特に腫瘍近くのような治療すべき部位又はそ
の近くへの注射である。例中で紹介されている結果は、
特に、腫瘍の部位における未成熟又は成熟の、同種異系
又は自己由来の樹枝状細胞のin vivoでの皮下又は静脈
内注射による投与が、陰性ＭＨＣクラスＩ腫瘍の成長を
低下させ得ることを実証している。注射は一般的には、
１０4〜１０8個、好ましくは１０5個以上１０7個以下の
樹枝状細胞という細胞用量をベースとして実施される。
さらに、注射プロトコルは、状況に応じて（予防用、治
療用、隔離された腫瘍、転移、重大な又は局所的な感染
など）当業者により適合化され得る。したがって、例え
ば数ヵ月にわたり一週間に１〜２回の投与といった反復
した投与により樹枝状細胞の受身移入を行うことが可能
である。
【００４６】in vivoでの樹枝状細胞の増大は同様に、i
n vivoでの樹枝状細胞成長因子の注射によって実現でき
る。このような因子は例えばLyman S.D et al., (Blood
83,2795-2801, 1994, 早期造血始原細胞のための成長
因子であるマウスFlt３Lのヒトホモログのクローニン
グ）及び Maraskovsky E. et al., (J. Exp. Med. 184.
1953-1962, 1996)によって記載されている化合物Flt３
Ｌ（以下「ＦＬ」化合物と呼ぶ）又はＧＭ−ＣＳＦなど
である。例が示しているとおり、自然免疫（ひいてはＮ
Ｋ細胞の活性）のin vivoでの刺激は、Flt３Ｌを毎日注
射した後に得られる。紹介された結果は、この注射が、
in situでのＮＫの絶対数の増大を生じ、リンパ球様樹
枝状細胞及びＢ７／ＤＣ２８とＩＦＮγのin vivoでの
相互作用に依存する抗腫瘍効果を誘発する。以下で示す
とおり、ＦＬ化合物は好都合に樹枝状細胞触発因子と組
み合わせることができる。したがってこの実施態様は、
in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を増大させるのに特
に有効なアプローチである。このアプローチは好都合に
は、in vivoでのＮＫ細胞の成長因子の同時投与と関連
づけることができる。
n vivoでの樹枝状細胞成長因子の注射によって実現でき
る。このような因子は例えばLyman S.D et al., (Blood
83,2795-2801, 1994, 早期造血始原細胞のための成長
因子であるマウスFlt３Lのヒトホモログのクローニン
グ）及び Maraskovsky E. et al., (J. Exp. Med. 184.
1953-1962, 1996)によって記載されている化合物Flt３
Ｌ（以下「ＦＬ」化合物と呼ぶ）又はＧＭ−ＣＳＦなど
である。例が示しているとおり、自然免疫（ひいてはＮ
Ｋ細胞の活性）のin vivoでの刺激は、Flt３Ｌを毎日注
射した後に得られる。紹介された結果は、この注射が、
in situでのＮＫの絶対数の増大を生じ、リンパ球様樹
枝状細胞及びＢ７／ＤＣ２８とＩＦＮγのin vivoでの
相互作用に依存する抗腫瘍効果を誘発する。以下で示す
とおり、ＦＬ化合物は好都合に樹枝状細胞触発因子と組
み合わせることができる。したがってこの実施態様は、
in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を増大させるのに特
に有効なアプローチである。このアプローチは好都合に
は、in vivoでのＮＫ細胞の成長因子の同時投与と関連
づけることができる。
【００４７】したがって、本発明は、in vivoでＮＫ細
胞を活性化させるための組成物を調製するための樹枝状
細胞の使用をも目的としている。本発明は同様に、in v
ivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目
的とする組成物の調製及び活性化されたＮＫ細胞による
ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの産生のための樹枝状細胞
の使用にも関する。以上で記したとおり、この目的で使
用される樹枝状細胞は、特に触発済みの、自己由来又は
同種異系の成熟又は未成熟細胞である。そのうえ、これ
は同様に単数又は複数の抗原に対し感作された樹枝状細
胞であってもよい。本発明は同様に、in vivoでＮＫ細
胞を活性化することを目的とする組成物の調製のため、
ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化す
ることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細胞成
長因子の使用にも関する。成長因子は、好ましくはＦＬ
化合物である。成長因子は好都合には、in vivoでの樹
枝状細胞触発因子と組み合わせることができる。本発明
はさらに、場合によっては樹枝状細胞成長因子及び／又
は単数又は複数のケモカイン又はサイトカインと組合わ
せた状態で、ＮＫ細胞をin vivoで直接活性化するため
の、タンパク質性、より一般的には生物学的な樹枝状細
胞触発因子の使用にも関する。
胞を活性化させるための組成物を調製するための樹枝状
細胞の使用をも目的としている。本発明は同様に、in v
ivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目
的とする組成物の調製及び活性化されたＮＫ細胞による
ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの産生のための樹枝状細胞
の使用にも関する。以上で記したとおり、この目的で使
用される樹枝状細胞は、特に触発済みの、自己由来又は
同種異系の成熟又は未成熟細胞である。そのうえ、これ
は同様に単数又は複数の抗原に対し感作された樹枝状細
胞であってもよい。本発明は同様に、in vivoでＮＫ細
胞を活性化することを目的とする組成物の調製のため、
ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を活性化す
ることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細胞成
長因子の使用にも関する。成長因子は、好ましくはＦＬ
化合物である。成長因子は好都合には、in vivoでの樹
枝状細胞触発因子と組み合わせることができる。本発明
はさらに、場合によっては樹枝状細胞成長因子及び／又
は単数又は複数のケモカイン又はサイトカインと組合わ
せた状態で、ＮＫ細胞をin vivoで直接活性化するため
の、タンパク質性、より一般的には生物学的な樹枝状細
胞触発因子の使用にも関する。
【００４８】本発明の方法の特定の１実施態様において
は、in vivoでの樹枝状細胞レベルの上昇は、先に記載
したようなin vitroで触発された樹枝状細胞も前述の条
件下でin vivo投与すること（受身移入）によって、又
は同様に単数又は複数の樹枝状細胞成長因子及び単数又
は複数の樹枝状細胞触発因子をin vivo投与することに
よっても実現することができる。この実施態様は、投与
された細胞又は化合物がin vivoで触発済み樹枝状細胞
を高レベルで得ることを可能にするかぎりにおいて、in
vivoでのＮＫ細胞の活性化の有効性を改善させること
ができる。この点で、本発明は同様に、同時に又は別々
にあるいは時間的に間隔をおいた形態で使用することを
目的とした、前述のとおりの樹枝状細胞触発因子及び樹
枝状細胞成長因子を少なくとも１つ含む組成物にも関す
る。より具体的に言うと、このような組成物には、ＦＬ
化合物及び可溶性触発因子を含む線維芽細胞から誘導さ
れた調製物が含まれる。さらに具体的には、かかる組成
物には可溶性組換え型因子が含まれる。本発明は同様
に、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とす
る組成物の調製ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解
活性を活性化させることを目的とする組成物の調製のた
めの、このような組成物の使用にも関する。それらの使
用のためには、これらの化合物は、好ましくは等張のあ
らゆる適切な培地（食塩水、緩衝液など）の中に入れ
て、かつ当業者にとって公知のあらゆる装置（アンプ
ル、小びん、チューブ、注射器、袋など）の中に包装す
ることができる。
は、in vivoでの樹枝状細胞レベルの上昇は、先に記載
したようなin vitroで触発された樹枝状細胞も前述の条
件下でin vivo投与すること（受身移入）によって、又
は同様に単数又は複数の樹枝状細胞成長因子及び単数又
は複数の樹枝状細胞触発因子をin vivo投与することに
よっても実現することができる。この実施態様は、投与
された細胞又は化合物がin vivoで触発済み樹枝状細胞
を高レベルで得ることを可能にするかぎりにおいて、in
vivoでのＮＫ細胞の活性化の有効性を改善させること
ができる。この点で、本発明は同様に、同時に又は別々
にあるいは時間的に間隔をおいた形態で使用することを
目的とした、前述のとおりの樹枝状細胞触発因子及び樹
枝状細胞成長因子を少なくとも１つ含む組成物にも関す
る。より具体的に言うと、このような組成物には、ＦＬ
化合物及び可溶性触発因子を含む線維芽細胞から誘導さ
れた調製物が含まれる。さらに具体的には、かかる組成
物には可溶性組換え型因子が含まれる。本発明は同様
に、in vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とす
る組成物の調製ならびにin vivoでＮＫ細胞の細胞溶解
活性を活性化させることを目的とする組成物の調製のた
めの、このような組成物の使用にも関する。それらの使
用のためには、これらの化合物は、好ましくは等張のあ
らゆる適切な培地（食塩水、緩衝液など）の中に入れ
て、かつ当業者にとって公知のあらゆる装置（アンプ
ル、小びん、チューブ、注射器、袋など）の中に包装す
ることができる。
【００４９】休止状態のＮＫ細胞の調製 本発明の実施のためには、ＮＫ細胞は、当業者にとって
公知のさまざまな技術により得ることができる。より具
体的に言うと、これらの細胞は、末梢血の単核細胞から
のさまざまな単離及び富化方法（lymphoprep、leucaph#
r#seなど）により得ることができる。したがって、これ
らの細胞は、Percoll密度勾配（Timonenet al., J. Imm
unol. Methods 51 (1982) 269）、負の枯渇法（Zarling
et al., J. Immunol. 127 (1981) 2527）又はＦＡＣＳ
による分類段階（Lanier et al., J. Immunol. 131 (19
83) 1789）により調製することができる。これらの細胞
は同様にアビジン−ビオチン系を使用したカラム上の免
疫吸着法（Handgretinger et al., J. Clin. Lab. Ana
l. 8 (1994) 443）によって、さらにまた、抗体とグラ
フト化された微粉を用いた免疫選択（Geiselhart et a
l., Nat. Immun. 15(1996-97) 227）により、分離する
ことができる。同様に、場合によって塑性付着方法と組
合わせてこれらの異なる技術の組合せを使用することも
可能である。これらの異なる技術は、好ましくは休止状
態のＮＫ細胞を７０％以上含む、休止状態のＮＫ細胞が
高度に富化された細胞個体群を得ることを可能にする。
より好ましくは、本発明の実施のために使用されるＮＫ
細胞の個体群は、３０％、好都合には５０％を上回るＮ
Ｋ細胞を一般に有している。細胞個体群の純度は、必要
とあらば、抗ＣＤ５６抗体及び／又は抗ＣＤ１６抗体及
び／又は抗ＣＤ３抗体（枯渇）といった特異的抗体を使
用することによって改善することができる。ＮＫ細胞
は、後日使用するために冷凍した形で培地内に保存でき
る。好都合には、ＮＫ細胞は即時調製される、すなわち
獲得後活性化のために使用される。
公知のさまざまな技術により得ることができる。より具
体的に言うと、これらの細胞は、末梢血の単核細胞から
のさまざまな単離及び富化方法（lymphoprep、leucaph#
r#seなど）により得ることができる。したがって、これ
らの細胞は、Percoll密度勾配（Timonenet al., J. Imm
unol. Methods 51 (1982) 269）、負の枯渇法（Zarling
et al., J. Immunol. 127 (1981) 2527）又はＦＡＣＳ
による分類段階（Lanier et al., J. Immunol. 131 (19
83) 1789）により調製することができる。これらの細胞
は同様にアビジン−ビオチン系を使用したカラム上の免
疫吸着法（Handgretinger et al., J. Clin. Lab. Ana
l. 8 (1994) 443）によって、さらにまた、抗体とグラ
フト化された微粉を用いた免疫選択（Geiselhart et a
l., Nat. Immun. 15(1996-97) 227）により、分離する
ことができる。同様に、場合によって塑性付着方法と組
合わせてこれらの異なる技術の組合せを使用することも
可能である。これらの異なる技術は、好ましくは休止状
態のＮＫ細胞を７０％以上含む、休止状態のＮＫ細胞が
高度に富化された細胞個体群を得ることを可能にする。
より好ましくは、本発明の実施のために使用されるＮＫ
細胞の個体群は、３０％、好都合には５０％を上回るＮ
Ｋ細胞を一般に有している。細胞個体群の純度は、必要
とあらば、抗ＣＤ５６抗体及び／又は抗ＣＤ１６抗体及
び／又は抗ＣＤ３抗体（枯渇）といった特異的抗体を使
用することによって改善することができる。ＮＫ細胞
は、後日使用するために冷凍した形で培地内に保存でき
る。好都合には、ＮＫ細胞は即時調製される、すなわち
獲得後活性化のために使用される。
【００５０】樹枝状細胞の調製 本発明の枠内で使用される樹枝状細胞は、異なる技術に
従って調製可能である。これらの細胞は、好ましくは触
発された「生来の」又は単数又は複数の特定の抗原に感
作された、自己由来又は同種異系の、未成熟又は成熟細
胞であってよい。なお、使用される樹枝状細胞は、樹枝
状細胞が富化された細胞培養、さらには基本的に樹枝状
細胞を含む細胞培養であってよい。好都合には、これ
は、当然ヒトの樹枝状細胞である。樹枝状細胞の調製
は、文献中で充分に考証されてきた。したがって、これ
らの細胞が、造血幹細胞又は単球前駆物質から得られる
か、さらにはまた分化形態で直接単離されるものであり
得ることが知られている（Hart, Blood 90 (1997) 3245
で概説）。
従って調製可能である。これらの細胞は、好ましくは触
発された「生来の」又は単数又は複数の特定の抗原に感
作された、自己由来又は同種異系の、未成熟又は成熟細
胞であってよい。なお、使用される樹枝状細胞は、樹枝
状細胞が富化された細胞培養、さらには基本的に樹枝状
細胞を含む細胞培養であってよい。好都合には、これ
は、当然ヒトの樹枝状細胞である。樹枝状細胞の調製
は、文献中で充分に考証されてきた。したがって、これ
らの細胞が、造血幹細胞又は単球前駆物質から得られる
か、さらにはまた分化形態で直接単離されるものであり
得ることが知られている（Hart, Blood 90 (1997) 3245
で概説）。
【００５１】株細胞からの樹枝状細胞の獲得について
は、例えば、マウスにおいてはInabaet al.(J. Exp. Me
d. 176 (1992) 1693）によって、またヒトにおいてはCa
ux etal. (Nature 360 (1992) 258）又はBernhard et a
l. (Cancer Res. 55 (1995)1099）によって例示されて
いる。これらの研究は、特に樹枝状細胞が、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下
での骨髄の培養によって、あるいは、より精確に言う
と、サイトカインの組合せの存在下での培養（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ＋ＴＮＦα±ＩＬ−３及びＩＬ−４又はＣＤ４０Ｌ
で）によって造血幹細胞（ＣＤ３４＋）から産生でき
る、ということを示している。単球前駆物質からの樹枝
状細胞の獲得については、例えばRomani et al. (J.Ex
p. Med. 180 (1994) 83), Sailusto et al. (J. Exp. M
ed. 179 (1994) 1109),Inaba et al. (J. Exp. Med. 17
5 (1992) 1157）さらにまたJansen et al. (J.Exp. Me
d. 170 (1989) 577）によって例示されている。これら
の方法は、基本的に、血液中の単核細胞の採取及びサイ
トカインのさまざまな組合せの存在下での培養に基づい
ている。特定の１つの方法は、例えばインターロイキン
−４＋ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−１３＋ＧＭ
−ＣＳＦといったサイトカインの組合せの存在下で血液
の単球前駆物質を処理することからなる。この技術は、
同様に、Mayordomo et al., 1995（マウス）によっても
例示されている。なお、同様に、直接的にＣＤ４０Ｌ又
はカルシウムチャンネル活性化剤といった薬学的細胞分
化剤により単球前駆物質を処理することも可能である。
は、例えば、マウスにおいてはInabaet al.(J. Exp. Me
d. 176 (1992) 1693）によって、またヒトにおいてはCa
ux etal. (Nature 360 (1992) 258）又はBernhard et a
l. (Cancer Res. 55 (1995)1099）によって例示されて
いる。これらの研究は、特に樹枝状細胞が、顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下
での骨髄の培養によって、あるいは、より精確に言う
と、サイトカインの組合せの存在下での培養（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ＋ＴＮＦα±ＩＬ−３及びＩＬ−４又はＣＤ４０Ｌ
で）によって造血幹細胞（ＣＤ３４＋）から産生でき
る、ということを示している。単球前駆物質からの樹枝
状細胞の獲得については、例えばRomani et al. (J.Ex
p. Med. 180 (1994) 83), Sailusto et al. (J. Exp. M
ed. 179 (1994) 1109),Inaba et al. (J. Exp. Med. 17
5 (1992) 1157）さらにまたJansen et al. (J.Exp. Me
d. 170 (1989) 577）によって例示されている。これら
の方法は、基本的に、血液中の単核細胞の採取及びサイ
トカインのさまざまな組合せの存在下での培養に基づい
ている。特定の１つの方法は、例えばインターロイキン
−４＋ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−１３＋ＧＭ
−ＣＳＦといったサイトカインの組合せの存在下で血液
の単球前駆物質を処理することからなる。この技術は、
同様に、Mayordomo et al., 1995（マウス）によっても
例示されている。なお、同様に、直接的にＣＤ４０Ｌ又
はカルシウムチャンネル活性化剤といった薬学的細胞分
化剤により単球前駆物質を処理することも可能である。
【００５２】樹枝状細胞を得るためのもう１つのアプロ
ーチは、生物学的標本から、すでに分化された樹枝状細
胞を単離することからなる。このアプローチは、例えば
Hsuet al. (Nature Medicine 2 (1996) 52）によって記
載された。この研究班が記載した方法は、基本的に、末
梢血標本を収集し、樹枝状細胞を抽出するような形で異
なる勾配及び遠心分離によりこれらを処理することから
なる。本発明の枠内で優先されている方法は、単球前駆
物質又は骨髄からの樹枝状細胞の産生に基づいている。
これらの方法については、例において示されている。よ
り具体的に言うとＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４又はＧＭ−Ｃ
ＳＦ＋ＩＬ−１３の存在下で（血液又は骨髄の中に含有
されている）単球前駆物質を処理することによって得ら
れる樹枝状細胞を本発明の枠内で使用することが好まし
い。
ーチは、生物学的標本から、すでに分化された樹枝状細
胞を単離することからなる。このアプローチは、例えば
Hsuet al. (Nature Medicine 2 (1996) 52）によって記
載された。この研究班が記載した方法は、基本的に、末
梢血標本を収集し、樹枝状細胞を抽出するような形で異
なる勾配及び遠心分離によりこれらを処理することから
なる。本発明の枠内で優先されている方法は、単球前駆
物質又は骨髄からの樹枝状細胞の産生に基づいている。
これらの方法については、例において示されている。よ
り具体的に言うとＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４又はＧＭ−Ｃ
ＳＦ＋ＩＬ−１３の存在下で（血液又は骨髄の中に含有
されている）単球前駆物質を処理することによって得ら
れる樹枝状細胞を本発明の枠内で使用することが好まし
い。
【００５３】前述のとおり、本発明の実施のためには、
未成熟及び／又は成熟樹枝状細胞を含む樹枝状細胞の個
体群を使用することが可能である。好都合には、好まし
くは触発済みの未成熟樹枝状細胞で主として（すなわち
少なくとも６０％好ましくは７０％）構成された樹枝状
細胞個体群が使用される。樹枝状細胞の未成熟状態は、
それが強い細胞内活性を呈しその表面でＭＨＣのクラス
Ｉ及びIIの分子及びリンパ球同時刺激分子の低いレベル
を発現するような、その発達の早期段階に対応する。な
お、本発明の枠内では、樹枝状細胞系統を使用すること
も同様に可能である。これは、例えば樹枝状細胞内に発
ガン遺伝子を導入することによって産生される不死化さ
れた樹枝状細胞系統であってもよい。かかる系統のマウ
スの例としては、先行技術において記載された以下の系
統が考えられる：すなわち、系統Ｄ１（Winzler et a
l., J. Exp. Med. 185, 317-328, 1997）、系統ＸＳ
（A. Takashima et al., J. Immunol. 1995; Vol. 154:
5128-5135）、 系統 tsＤＣ（Volkmann et al., Eur.
J. Immunol. 26; 2565-72, 1996）。樹枝状細胞系統を
使用することの利点は、異なる実験動物に由来する同種
異系のＮＫ細胞個体群を活性化するため工業的に使用可
能な「ユニバーサル」細胞バンクの構成にある。この実
施態様においては、系統は好ましくは、３０％の触発培
地内で又は最適な触発因子濃度で保持される。
未成熟及び／又は成熟樹枝状細胞を含む樹枝状細胞の個
体群を使用することが可能である。好都合には、好まし
くは触発済みの未成熟樹枝状細胞で主として（すなわち
少なくとも６０％好ましくは７０％）構成された樹枝状
細胞個体群が使用される。樹枝状細胞の未成熟状態は、
それが強い細胞内活性を呈しその表面でＭＨＣのクラス
Ｉ及びIIの分子及びリンパ球同時刺激分子の低いレベル
を発現するような、その発達の早期段階に対応する。な
お、本発明の枠内では、樹枝状細胞系統を使用すること
も同様に可能である。これは、例えば樹枝状細胞内に発
ガン遺伝子を導入することによって産生される不死化さ
れた樹枝状細胞系統であってもよい。かかる系統のマウ
スの例としては、先行技術において記載された以下の系
統が考えられる：すなわち、系統Ｄ１（Winzler et a
l., J. Exp. Med. 185, 317-328, 1997）、系統ＸＳ
（A. Takashima et al., J. Immunol. 1995; Vol. 154:
5128-5135）、 系統 tsＤＣ（Volkmann et al., Eur.
J. Immunol. 26; 2565-72, 1996）。樹枝状細胞系統を
使用することの利点は、異なる実験動物に由来する同種
異系のＮＫ細胞個体群を活性化するため工業的に使用可
能な「ユニバーサル」細胞バンクの構成にある。この実
施態様においては、系統は好ましくは、３０％の触発培
地内で又は最適な触発因子濃度で保持される。
【００５４】樹枝状細胞が調製された時点で、これらを
培養状態に維持すること、さらに一層精製すること、保
存すること、又は直接本発明の実施において使用するこ
と（ＮＫ細胞のin vitro、ex vivo又はin vivoでの活性
化、無細胞抽出物、デキソゾームの産生、膜刺激因子の
獲得）が可能である。さらに、ＮＫ細胞の活性化のため
のそれらの使用に先立って、このように調製された樹枝
状細胞を、１つの抗原又は一群の抗原に対して感作させ
ることができる。樹枝状細胞表面に抗原パターンが存在
することにより、実際、特にin vivoでの使用の場合
に、その免疫原性活性（獲得免疫）を改善（交差プライ
ミングにより）するか又は阻害する（ＫＩＲモードにつ
いて）ことができるだろう。
培養状態に維持すること、さらに一層精製すること、保
存すること、又は直接本発明の実施において使用するこ
と（ＮＫ細胞のin vitro、ex vivo又はin vivoでの活性
化、無細胞抽出物、デキソゾームの産生、膜刺激因子の
獲得）が可能である。さらに、ＮＫ細胞の活性化のため
のそれらの使用に先立って、このように調製された樹枝
状細胞を、１つの抗原又は一群の抗原に対して感作させ
ることができる。樹枝状細胞表面に抗原パターンが存在
することにより、実際、特にin vivoでの使用の場合
に、その免疫原性活性（獲得免疫）を改善（交差プライ
ミングにより）するか又は阻害する（ＫＩＲモードにつ
いて）ことができるだろう。
【００５５】この観点からみると、抗原に対し樹枝状細
胞を感作させるためにさまざまな技術を使用することが
できる。これらの技術には、特に次のものが含まれる：
− 抗原ペプチドと樹枝状細胞の接触（「ペプチドパル
シング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペ
プチドすなわち抗原提示細胞によるその抗原の処理の結
果としてもたらされるような、１つの抗原に由来するペ
プチドと共に、可変的な時間（一般に約３０分〜５時
間）中、樹枝状細胞をインキュベーションすることから
なる。このタイプのアプローチは、例えば、ＨＩＶウイ
ルス、インフルエンザ又はＨＰＶの抗原ペプチドについ
て、又は例えば抗原Muc−１, Mart, Her２/Neuから誘導
されたペプチドについて記載された。（Macatonia et a
l., J.Exp. Med. 169 (1989) 1255; Takahashi et al.,
Int. Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa,
J. Exp. Med. 182 (1995) 255; Ossevoort et al., J.I
mmunother. 18 (1995) 86; 前出のMayordomo et al., ;
Mehta Damani et al.J. Immunol. (1994) 996）。Zitv
ogel et alにより記載された（前出、1996）方法に従っ
て腫瘍細胞の酸性ペプチド溶出液を用いて樹枝状細胞を
インキュベーションすることも同様に可能である。−
単数又は複数の抗原と樹枝状細胞の接触（「抗原パルシ
ング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペプ
チドではなく単数又は複数の完全な抗原を用いて、樹枝
状細胞をインキュベーションすることからなる。この技
術の利点は、抗原が、樹枝状細胞の自然のメカニズムに
よって抗原ペプチドに形質転換され、そのため樹枝状細
胞により提示される結果として得られた抗原ペプチドは
より優れた免疫原性を手に入れることとなるということ
にある。このアプローチについては、例えばInaba et a
l. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631）又はHsu et al.,
(Nature Medicine 2 (1996) 52）によって例示されてい
る。− 単数又は複数の抗原タンパク質複合体と樹枝状
細胞の接触。このアプローチは、前述のものと類似して
いるが、抗原の形質転換及び／又は提示の効率を改善す
ることができる。特に、抗原を可溶形態又はターゲティ
ング要素に複合された形で使用することができ、こうし
て特に、マンノースレセプター又は免疫グロブリンレセ
プター（ＲＦｃ）のような膜レセプター（免疫複合体）
を標的化することが可能となる。また、細胞によるその
食作用又はその侵入を改善するような形で、抗原を粒子
化することも可能である。
胞を感作させるためにさまざまな技術を使用することが
できる。これらの技術には、特に次のものが含まれる：
− 抗原ペプチドと樹枝状細胞の接触（「ペプチドパル
シング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペ
プチドすなわち抗原提示細胞によるその抗原の処理の結
果としてもたらされるような、１つの抗原に由来するペ
プチドと共に、可変的な時間（一般に約３０分〜５時
間）中、樹枝状細胞をインキュベーションすることから
なる。このタイプのアプローチは、例えば、ＨＩＶウイ
ルス、インフルエンザ又はＨＰＶの抗原ペプチドについ
て、又は例えば抗原Muc−１, Mart, Her２/Neuから誘導
されたペプチドについて記載された。（Macatonia et a
l., J.Exp. Med. 169 (1989) 1255; Takahashi et al.,
Int. Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa,
J. Exp. Med. 182 (1995) 255; Ossevoort et al., J.I
mmunother. 18 (1995) 86; 前出のMayordomo et al., ;
Mehta Damani et al.J. Immunol. (1994) 996）。Zitv
ogel et alにより記載された（前出、1996）方法に従っ
て腫瘍細胞の酸性ペプチド溶出液を用いて樹枝状細胞を
インキュベーションすることも同様に可能である。−
単数又は複数の抗原と樹枝状細胞の接触（「抗原パルシ
ング」）。このアプローチは、単数又は複数の抗原ペプ
チドではなく単数又は複数の完全な抗原を用いて、樹枝
状細胞をインキュベーションすることからなる。この技
術の利点は、抗原が、樹枝状細胞の自然のメカニズムに
よって抗原ペプチドに形質転換され、そのため樹枝状細
胞により提示される結果として得られた抗原ペプチドは
より優れた免疫原性を手に入れることとなるということ
にある。このアプローチについては、例えばInaba et a
l. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631）又はHsu et al.,
(Nature Medicine 2 (1996) 52）によって例示されてい
る。− 単数又は複数の抗原タンパク質複合体と樹枝状
細胞の接触。このアプローチは、前述のものと類似して
いるが、抗原の形質転換及び／又は提示の効率を改善す
ることができる。特に、抗原を可溶形態又はターゲティ
ング要素に複合された形で使用することができ、こうし
て特に、マンノースレセプター又は免疫グロブリンレセ
プター（ＲＦｃ）のような膜レセプター（免疫複合体）
を標的化することが可能となる。また、細胞によるその
食作用又はその侵入を改善するような形で、抗原を粒子
化することも可能である。
【００５６】− 抗原又は抗原ペプチドを発現する細胞
（融合ハイブリドーマ様の）又はその膜、リゼート又は
音波処理物と樹枝状細胞の接触。この技術は、細胞又は
細胞膜の融合による抗原又は抗原ペプチドの直接移入に
基づくものである。このアプローチは、例えば樹枝状細
胞と、腫瘍細胞膜の間の融合によって例示された（Zoue
t al., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992) 1, 及
び前出のGilboa.）。 − 抗原又は抗原ペプチドを含む膜小胞（特に上記のと
おりの腫瘍細胞のエキソゾーム）と樹枝状細胞の接触。
本発明において立証されているような、このエキソゾー
ムを使用した樹枝状細胞の感作アプローチは、それが特
定の抗原についての知識を必要とせず、そして投入され
る抗原ペプチドが未変性の固有の立体配座を持つという
点において、特に好都合である。この技術については、
例の中で示されている。 − 抗原又は抗原ペプチドを含有するリポソームと樹枝
状細胞の接触（Nair etal., J. Exp. Med. 175 (1992)
609）。 − 抗原又は抗原ペプチドをコードするｓＲＮＡと樹枝
状細胞の接触（前出のBoczkowsky et. al., 1996.参
照）。 − 抗原又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡ又は（場
合によってはプラスミド，ウイルス又は化学タイプのベ
クター内に取込まれた）タンパク質抗原に結合された核
酸配列と樹枝状細胞の接触。したがって、樹枝状細胞感
作様式は、それに対する防御が求められているウイルス
で樹枝状細胞を感染させることからなる。これについて
は、例えばインフルエンザウイルスに関して記載されて
いる（Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994)
797; 前出のMacatonia et al.,)。もう１つのアプロー
チは、ウイルス又はその他の核酸移入ベクターを用い
て、目的の単数又は複数の抗原又は抗原ペプチドをコー
ドするＤＮＡを送達することからなる。このようなアプ
ローチは、例えば、Arthur et al. (Cancer Gene Thera
py, 1995）又はAlijagle et al. (Eur. J. Immunol. 25
(1995) 3100）によって例示されている。アデノウイル
ス、ＡＡＶ又はレトロウイルスのような或る種のウイル
スが、樹枝状細胞内で核酸を送達するため、この目的で
使用できると思われる。
（融合ハイブリドーマ様の）又はその膜、リゼート又は
音波処理物と樹枝状細胞の接触。この技術は、細胞又は
細胞膜の融合による抗原又は抗原ペプチドの直接移入に
基づくものである。このアプローチは、例えば樹枝状細
胞と、腫瘍細胞膜の間の融合によって例示された（Zoue
t al., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992) 1, 及
び前出のGilboa.）。 − 抗原又は抗原ペプチドを含む膜小胞（特に上記のと
おりの腫瘍細胞のエキソゾーム）と樹枝状細胞の接触。
本発明において立証されているような、このエキソゾー
ムを使用した樹枝状細胞の感作アプローチは、それが特
定の抗原についての知識を必要とせず、そして投入され
る抗原ペプチドが未変性の固有の立体配座を持つという
点において、特に好都合である。この技術については、
例の中で示されている。 − 抗原又は抗原ペプチドを含有するリポソームと樹枝
状細胞の接触（Nair etal., J. Exp. Med. 175 (1992)
609）。 − 抗原又は抗原ペプチドをコードするｓＲＮＡと樹枝
状細胞の接触（前出のBoczkowsky et. al., 1996.参
照）。 − 抗原又は抗原ペプチドをコードするＤＮＡ又は（場
合によってはプラスミド，ウイルス又は化学タイプのベ
クター内に取込まれた）タンパク質抗原に結合された核
酸配列と樹枝状細胞の接触。したがって、樹枝状細胞感
作様式は、それに対する防御が求められているウイルス
で樹枝状細胞を感染させることからなる。これについて
は、例えばインフルエンザウイルスに関して記載されて
いる（Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994)
797; 前出のMacatonia et al.,)。もう１つのアプロー
チは、ウイルス又はその他の核酸移入ベクターを用い
て、目的の単数又は複数の抗原又は抗原ペプチドをコー
ドするＤＮＡを送達することからなる。このようなアプ
ローチは、例えば、Arthur et al. (Cancer Gene Thera
py, 1995）又はAlijagle et al. (Eur. J. Immunol. 25
(1995) 3100）によって例示されている。アデノウイル
ス、ＡＡＶ又はレトロウイルスのような或る種のウイル
スが、樹枝状細胞内で核酸を送達するため、この目的で
使用できると思われる。
【００５７】利用分野 本発明は同様に、特に免疫学、免疫療法又はメディカル
バイオテクノロジーの分野における上記の方法、細胞及
び組成物の使用にも関する。前述のとおり、これらの使
用は、ＮＫ細胞の活性を制御する目的で、in vitro及び
in vivoの両方で数多く存在する。このような使用分野
は特に、ガン又は特にウイルス又はその他の病原体によ
る感染症、自己免疫疾患、移植に関連する疾病（移植片
拒絶、ＧＶＨＤ）、先天性疾患（例えばインターフェロ
ン又はインタロイキン−１２レセプターの欠損）などで
ある。本発明の方法、細胞及び組成物は特に、腫瘍（特
にＭＨＣのクラスＩの分子の発現力が低い腫瘍）又はそ
の他の異常細胞の成長を遅らせさらにはそれを消失させ
るために使用可能である。このタイプの使用分野につい
ては、上記のとおり、細胞組成物（活性化されたＮＫ細
胞、ＮＫ／ＤＣの共存培養物又は樹枝状細胞）は好まし
くは、皮下又は全身注射により局所−局部的に投与可能
である。細胞の用量は、以上においてと同様以下の実験
部分の中でも記されている。本発明は同様に、細胞調製
物の処理、特にＮＫ細胞に対する感受性を持つ細胞の破
壊のためにも同様に使用可能である。本発明は同様に、
組合わせた形で、又は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球
活性の発達に基づく免疫化のアジュバントとしても使用
することもできる。さらに本発明は、in vitro、ex viv
o又はin vivoでＮＫリンパ球個体群の生存を増大させる
ため、ならびに場合によってはＮＫリンパ球亜個体群の
増殖を増大させるための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞の
膜因子の使用にも関する。本発明はさらに、in vitro、
ex vivo又はin vivoでの成熟樹枝状細胞の生存を増大さ
せるための、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞の膜因子の使用にも
関する。
バイオテクノロジーの分野における上記の方法、細胞及
び組成物の使用にも関する。前述のとおり、これらの使
用は、ＮＫ細胞の活性を制御する目的で、in vitro及び
in vivoの両方で数多く存在する。このような使用分野
は特に、ガン又は特にウイルス又はその他の病原体によ
る感染症、自己免疫疾患、移植に関連する疾病（移植片
拒絶、ＧＶＨＤ）、先天性疾患（例えばインターフェロ
ン又はインタロイキン−１２レセプターの欠損）などで
ある。本発明の方法、細胞及び組成物は特に、腫瘍（特
にＭＨＣのクラスＩの分子の発現力が低い腫瘍）又はそ
の他の異常細胞の成長を遅らせさらにはそれを消失させ
るために使用可能である。このタイプの使用分野につい
ては、上記のとおり、細胞組成物（活性化されたＮＫ細
胞、ＮＫ／ＤＣの共存培養物又は樹枝状細胞）は好まし
くは、皮下又は全身注射により局所−局部的に投与可能
である。細胞の用量は、以上においてと同様以下の実験
部分の中でも記されている。本発明は同様に、細胞調製
物の処理、特にＮＫ細胞に対する感受性を持つ細胞の破
壊のためにも同様に使用可能である。本発明は同様に、
組合わせた形で、又は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球
活性の発達に基づく免疫化のアジュバントとしても使用
することもできる。さらに本発明は、in vitro、ex viv
o又はin vivoでＮＫリンパ球個体群の生存を増大させる
ため、ならびに場合によってはＮＫリンパ球亜個体群の
増殖を増大させるための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞の
膜因子の使用にも関する。本発明はさらに、in vitro、
ex vivo又はin vivoでの成熟樹枝状細胞の生存を増大さ
せるための、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞の膜因子の使用にも
関する。
【００５８】本発明のその他の利点は、制限的な意味の
ない例示目的のものとして考えるべきである以下の例を
読むことにより明らかになることだろう。
ない例示目的のものとして考えるべきである以下の例を
読むことにより明らかになることだろう。
【００５９】したがって、本発明のＮＫ細胞の活性化方
法は、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物
とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又はex viv
oで接触させることを含む。このような樹枝状細胞は、
成熟樹枝状細胞であってもよいし、未成熟樹枝状細胞で
あってもよい。また、このような樹枝状細胞及びＮＫ細
胞は、自己由来のものであってもよいし、同種異系のも
のであってもよい。また、このような樹枝状細胞は触発
（トリガー）された細胞であってもよい。前記ＮＫ細胞
に対する樹枝状細胞の比（ＮＫ細胞／樹枝状細胞比）
は、０.０１〜１０好ましくは０.０５〜５の範囲にあ
る。本発明の共存培養物は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の
共存培養物である。本発明の組成物は、活性化された又
は休止状態のＮＫ細胞及び自己由来の樹枝状細胞を含む
組成物である。本発明の組成物は上記の方法により活性
化されたＮＫ細胞の含む組成物である。
法は、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物
とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又はex viv
oで接触させることを含む。このような樹枝状細胞は、
成熟樹枝状細胞であってもよいし、未成熟樹枝状細胞で
あってもよい。また、このような樹枝状細胞及びＮＫ細
胞は、自己由来のものであってもよいし、同種異系のも
のであってもよい。また、このような樹枝状細胞は触発
（トリガー）された細胞であってもよい。前記ＮＫ細胞
に対する樹枝状細胞の比（ＮＫ細胞／樹枝状細胞比）
は、０.０１〜１０好ましくは０.０５〜５の範囲にあ
る。本発明の共存培養物は、樹枝状細胞及びＮＫ細胞の
共存培養物である。本発明の組成物は、活性化された又
は休止状態のＮＫ細胞及び自己由来の樹枝状細胞を含む
組成物である。本発明の組成物は上記の方法により活性
化されたＮＫ細胞の含む組成物である。
【００６０】本発明は、in vitro又はex vivoでＮＫ細
胞を活性化するための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から
誘導された調製物の使用にも関する。本発明は、in viv
oでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の
調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導され
た調製物の使用にも関する。本発明は、in vivoでＮＫ
細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組
成物の調製のための樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導
された調製物の使用にも関する。本発明は、in vivoで
ＮＫ細胞によるＩＦＮγの産生を増大させることを目的
とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細
胞から誘導された調製物の使用にも関する。この使用に
おいて、樹枝状細胞は、成熟樹枝状細胞であってもよい
し、未成熟樹枝状細胞であってもよい。また、この使用
において、樹枝状細胞は、触発された樹枝状細胞である
ことができる。この使用において、樹枝状細胞は、単数
又は複数の抗原に感作されていてもよい。本発明は、in
vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成
物の調製のための、樹枝状細胞の成長因子の使用にも関
する。この使用において、成長因子はＦＬ化合物であ
る。
胞を活性化するための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から
誘導された調製物の使用にも関する。本発明は、in viv
oでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成物の
調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導され
た調製物の使用にも関する。本発明は、in vivoでＮＫ
細胞の細胞溶解活性を活性化させることを目的とする組
成物の調製のための樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導
された調製物の使用にも関する。本発明は、in vivoで
ＮＫ細胞によるＩＦＮγの産生を増大させることを目的
とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は樹枝状細
胞から誘導された調製物の使用にも関する。この使用に
おいて、樹枝状細胞は、成熟樹枝状細胞であってもよい
し、未成熟樹枝状細胞であってもよい。また、この使用
において、樹枝状細胞は、触発された樹枝状細胞である
ことができる。この使用において、樹枝状細胞は、単数
又は複数の抗原に感作されていてもよい。本発明は、in
vivoでＮＫ細胞を活性化させることを目的とする組成
物の調製のための、樹枝状細胞の成長因子の使用にも関
する。この使用において、成長因子はＦＬ化合物であ
る。
【００６１】本発明の組成物は、樹枝状細胞から誘導さ
れた、ＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物である。本発明
の組成物は、樹枝状細胞とＮＫ細胞の間の相互作用に干
渉する能力を持つ化合物を含む組成物である。本発明
は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することを目的とする
組成物の調製のための、上記の因子の使用にも関する。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞の活性化の負の制御を行
うことを目的とする組成物の調製のための上記の化合物
の使用にも関する。本発明の組成物は、腫瘍治療向けの
薬剤の調製のために使用することができる。本発明の組
成物は、感染細胞治療向けの薬剤の調製のために使用す
ることができる。本発明の組成物は、腫瘍又は感染細胞
の治療向けの薬剤の調製のためにも使用することができ
る。本発明の組成物は、移植片拒絶又は移植片対宿主病
（ＧＶＨＤ）の予防処置向けの薬剤の調製のためにも使
用することができる。
れた、ＮＫ細胞の刺激因子を含む組成物である。本発明
の組成物は、樹枝状細胞とＮＫ細胞の間の相互作用に干
渉する能力を持つ化合物を含む組成物である。本発明
は、in vivoでＮＫ細胞を活性化することを目的とする
組成物の調製のための、上記の因子の使用にも関する。
本発明は、in vivoでＮＫ細胞の活性化の負の制御を行
うことを目的とする組成物の調製のための上記の化合物
の使用にも関する。本発明の組成物は、腫瘍治療向けの
薬剤の調製のために使用することができる。本発明の組
成物は、感染細胞治療向けの薬剤の調製のために使用す
ることができる。本発明の組成物は、腫瘍又は感染細胞
の治療向けの薬剤の調製のためにも使用することができ
る。本発明の組成物は、移植片拒絶又は移植片対宿主病
（ＧＶＨＤ）の予防処置向けの薬剤の調製のためにも使
用することができる。
【００６２】本発明は、ＮＫ活性のin situ増大により
陰性又は弱陽性のクラスＩの腫瘍の治療向け組成物を調
製するための、樹枝状細胞成長因子の使用にも関する。
本発明は、ＮＫリンパ球亜個体群の生存又は増殖を増大
させることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細
胞の膜因子の使用にも関する。本発明はまた、成熟樹枝
状細胞の生存を増大させることを目的とする組成物の調
製のためのＮＫ細胞の膜因子の使用にも関する。本発明
は、ＮＫ細胞の活性化を阻害することを目的とする組成
物の調製のための寛容原性表現型の樹枝状細胞又は寛容
原性樹枝状細胞から誘導された産物の使用にも関する。
本発明は、ＮＫ細胞を刺激するその能力を改善する（又
は誘発する）ことを可能にする、触発培地と樹枝状細胞
の接触を含む、樹枝状細胞処理方法にも関する。
陰性又は弱陽性のクラスＩの腫瘍の治療向け組成物を調
製するための、樹枝状細胞成長因子の使用にも関する。
本発明は、ＮＫリンパ球亜個体群の生存又は増殖を増大
させることを目的とする組成物の調製のための樹枝状細
胞の膜因子の使用にも関する。本発明はまた、成熟樹枝
状細胞の生存を増大させることを目的とする組成物の調
製のためのＮＫ細胞の膜因子の使用にも関する。本発明
は、ＮＫ細胞の活性化を阻害することを目的とする組成
物の調製のための寛容原性表現型の樹枝状細胞又は寛容
原性樹枝状細胞から誘導された産物の使用にも関する。
本発明は、ＮＫ細胞を刺激するその能力を改善する（又
は誘発する）ことを可能にする、触発培地と樹枝状細胞
の接触を含む、樹枝状細胞処理方法にも関する。
【００６３】本発明の組成物は、同時に又は時間的に分
離した又は間隔を開けた形態で使用するための、少なく
とも１つの樹枝状細胞触発因子及び樹枝状細胞成長因子
を含む組成物である。本発明の組成物は、特に人間の触
発された樹枝状細胞を含む組成物である。本発明の樹枝
状細胞触発培地は、細胞外基質の細胞、そのような細胞
から誘導された調製物又はそのような細胞から誘導され
た因子含む、樹枝状細胞触発培地である。上記の方法に
おいては、樹枝状細胞から誘導された調製物は膜小胞を
含む。また、上記の方法においては、膜小胞は未成熟樹
枝状細胞から産生される。上記使用においては、樹枝状
細胞から誘導された調製物は膜小胞を含む。
離した又は間隔を開けた形態で使用するための、少なく
とも１つの樹枝状細胞触発因子及び樹枝状細胞成長因子
を含む組成物である。本発明の組成物は、特に人間の触
発された樹枝状細胞を含む組成物である。本発明の樹枝
状細胞触発培地は、細胞外基質の細胞、そのような細胞
から誘導された調製物又はそのような細胞から誘導され
た因子含む、樹枝状細胞触発培地である。上記の方法に
おいては、樹枝状細胞から誘導された調製物は膜小胞を
含む。また、上記の方法においては、膜小胞は未成熟樹
枝状細胞から産生される。上記使用においては、樹枝状
細胞から誘導された調製物は膜小胞を含む。
【００６４】本発明は、in vitro、ex vivo又はin vivo
でＮＫ細胞の活性を刺激するための組成物を調製するた
めの、樹枝状細胞から産生された膜小胞の使用にも関す
る。本発明は、膜分画を含む生体材料及びＮＫ細胞の個
体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生体材料内に
存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞の刺激因子
の同定及び／又は調製方法にも関する。本発明は、試験
化合物或いは単数又は複数の試験化合物を含む組成物
を、休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞又はエキソゾー
ム、又は上記のＮＫ刺激因子と共にインキュベーション
する工程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程及びＮＫ細
胞の活性化を阻害する（すなわち低減させる）能力を持
つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の活
性化を阻害する能力を持つ化合物の同定方法にも関す
る。
でＮＫ細胞の活性を刺激するための組成物を調製するた
めの、樹枝状細胞から産生された膜小胞の使用にも関す
る。本発明は、膜分画を含む生体材料及びＮＫ細胞の個
体群の接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生体材料内に
存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞の刺激因子
の同定及び／又は調製方法にも関する。本発明は、試験
化合物或いは単数又は複数の試験化合物を含む組成物
を、休止状態のＮＫ細胞及び樹枝状細胞又はエキソゾー
ム、又は上記のＮＫ刺激因子と共にインキュベーション
する工程、ＮＫ細胞の活性化を測定する工程及びＮＫ細
胞の活性化を阻害する（すなわち低減させる）能力を持
つ化合物／組成物を選択する工程を含む、ＮＫ細胞の活
性化を阻害する能力を持つ化合物の同定方法にも関す
る。
【００６５】図面の説明 図１ ：未成熟樹枝状細胞はin vitroでＮＫ活性を刺激す
る。ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄から誘導した、すなわち
ＧＭ−ＣＳＦ及びインタロイキン−４で培養した未成熟
自己由来樹枝状細胞を３０％の線維芽細胞Ｌ−９２９の
中で２４時間インキュベーションするか又は照射された
Ｌ−９２９をと共に共存培養した。２４時間後、これら
を計数し、従来の培地（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４）で再
懸濁し、９６ウェルの平板の中で丸底ウェル内で１mlあ
たり１００万個の細胞という濃度で４０〜７２時間、同
じ濃度のＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスの脾臓由来
の休止状態の脾細胞（そのうち１０〜３０％はＮＫ）と
共に同時インキュベーションした。標的細胞ＹＡＣ及び
Ｐ８１５に対する細胞傷害性ならびにＮＫ細胞によるイ
ンターフェロンγの塩析は、「材料と方法」の中で決定
されている。
る。ＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄から誘導した、すなわち
ＧＭ−ＣＳＦ及びインタロイキン−４で培養した未成熟
自己由来樹枝状細胞を３０％の線維芽細胞Ｌ−９２９の
中で２４時間インキュベーションするか又は照射された
Ｌ−９２９をと共に共存培養した。２４時間後、これら
を計数し、従来の培地（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４）で再
懸濁し、９６ウェルの平板の中で丸底ウェル内で１mlあ
たり１００万個の細胞という濃度で４０〜７２時間、同
じ濃度のＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスの脾臓由来
の休止状態の脾細胞（そのうち１０〜３０％はＮＫ）と
共に同時インキュベーションした。標的細胞ＹＡＣ及び
Ｐ８１５に対する細胞傷害性ならびにＮＫ細胞によるイ
ンターフェロンγの塩析は、「材料と方法」の中で決定
されている。
【００６６】図２〜３：成熟樹枝状細胞は、in vitroで
ＮＫ活性を直接刺激する。（図２） 成熟した（動物Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓から誘
導された）脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の細胞溶
解活性をきわめて顕著な形で刺激する。まずはＬ−９２
９（３０％）の上清の存在下で、次にＴＮＦαを含む培
地の中で２４時間インキュベーションした樹枝状細胞
を、４０〜４８時間、１：１の比でＢ６−Rag-/-マウス
又はＳＣＩＤマウスに由来する脾臓の非接着性単核細胞
と共存培養した。生存可能なリンパ球を４時間、クロム
５１の塩析試験の中で細胞ＹＡＣ−１に対し試験した。
結果は、異なるエフェクター細胞/標的細胞比における
特異的溶解の百分率によって表されている。これらの実
験は、５回行われ、結果は同じであった。（図３） 成熟脾臓由来樹枝状細胞は、ＮＫ細胞による
インターフェロンγの産生を刺激する。同系又は同種異
系で異なる濃度比で別々に又は一緒に培養されたＮＫ細
胞又は樹枝状細胞の上清を４８〜７２時間で収集し、Ｅ
ＬＩＳＡによりマウスインターフェロンγの存在につい
て試験した。この図では、ＮＫ：ＤＣの比が実際Ｔ／Ｂ
／Ｍacが枯渇した動物の脾細胞（１０〜３０％の純粋Ｎ
Ｋを含む）：ＤＣの比に対応するという点に留意された
い。対照として別々に培養された樹枝状細胞又はＮＫ細
胞の上清中には、インターフェロンγの痕跡は全くみら
れなかった。
ＮＫ活性を直接刺激する。（図２） 成熟した（動物Ｃ５７ＢＬ／６の脾臓から誘
導された）脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の細胞溶
解活性をきわめて顕著な形で刺激する。まずはＬ−９２
９（３０％）の上清の存在下で、次にＴＮＦαを含む培
地の中で２４時間インキュベーションした樹枝状細胞
を、４０〜４８時間、１：１の比でＢ６−Rag-/-マウス
又はＳＣＩＤマウスに由来する脾臓の非接着性単核細胞
と共存培養した。生存可能なリンパ球を４時間、クロム
５１の塩析試験の中で細胞ＹＡＣ−１に対し試験した。
結果は、異なるエフェクター細胞/標的細胞比における
特異的溶解の百分率によって表されている。これらの実
験は、５回行われ、結果は同じであった。（図３） 成熟脾臓由来樹枝状細胞は、ＮＫ細胞による
インターフェロンγの産生を刺激する。同系又は同種異
系で異なる濃度比で別々に又は一緒に培養されたＮＫ細
胞又は樹枝状細胞の上清を４８〜７２時間で収集し、Ｅ
ＬＩＳＡによりマウスインターフェロンγの存在につい
て試験した。この図では、ＮＫ：ＤＣの比が実際Ｔ／Ｂ
／Ｍacが枯渇した動物の脾細胞（１０〜３０％の純粋Ｎ
Ｋを含む）：ＤＣの比に対応するという点に留意された
い。対照として別々に培養された樹枝状細胞又はＮＫ細
胞の上清中には、インターフェロンγの痕跡は全くみら
れなかった。
【００６７】図４： 活性化には、ＮＫ細胞と樹枝状細
胞の接触が関与している。２つの細胞個体群が多孔質膜
（白い三角形）によって物理的に分離され互いに１mmの
距離のところにある「トランスウェル」系における又は
共存培養（黒い三角形）による、樹枝状細胞系統により
in vitroで活性化されたＮＫ細胞により誘導された標的
細胞（ＹＡＣ−１）の特異的溶解の研究。対照は、ＮＫ
細胞と培養済み樹枝状細胞により別々に表されている。
胞の接触が関与している。２つの細胞個体群が多孔質膜
（白い三角形）によって物理的に分離され互いに１mmの
距離のところにある「トランスウェル」系における又は
共存培養（黒い三角形）による、樹枝状細胞系統により
in vitroで活性化されたＮＫ細胞により誘導された標的
細胞（ＹＡＣ−１）の特異的溶解の研究。対照は、ＮＫ
細胞と培養済み樹枝状細胞により別々に表されている。
【００６８】図５： 腫瘍ＡＫ７を有するＢ６ヌードマ
ウスにおけるＦＬの投与は、腫瘍の成長の著しい抑制を
誘発する。発生２０日目のＡＫ７中皮腫腫瘍を有するＢ
６−ヌードマウスに対し２０日間毎日、１０μgのＦＬ
を投与した。一週間に２回、６０日間にわたり腫瘍の成
長を検査した。５匹のマウスの群についての腫瘍の平均
サイズは図中に標準偏差と共に表されている。この実験
を４回くり返すと、腫瘍成長の抑制は類似していた。Ra
g２ Ｂ６-/-マウスにおいても類似の結果が得られた。
ウスにおけるＦＬの投与は、腫瘍の成長の著しい抑制を
誘発する。発生２０日目のＡＫ７中皮腫腫瘍を有するＢ
６−ヌードマウスに対し２０日間毎日、１０μgのＦＬ
を投与した。一週間に２回、６０日間にわたり腫瘍の成
長を検査した。５匹のマウスの群についての腫瘍の平均
サイズは図中に標準偏差と共に表されている。この実験
を４回くり返すと、腫瘍成長の抑制は類似していた。Ra
g２ Ｂ６-/-マウスにおいても類似の結果が得られた。
【００６９】図６〜７： ＦＬにより誘発される抗腫瘍
効果はＮＫ細胞に依存している。（図６） ＦＬ化合物は、Ｂ６−ベージュマウスにおい
ていかなる効果ももたらさない。発生２０日目のＡＫ７
腫瘍を有するＢ６−ベージュマウスにおいて２０日間毎
日１０μgのＦＬを投与した。一週間に２回、５０日間
にわたり腫瘍の成長を検査した。５匹のマウスの群につ
いての腫瘍の平均サイズは、図に標準偏差と共に表され
ている。この実験を２度くり返し、同一の結果を得た。（図７） ＦＬと同時に抗−ＮＫ１．１を中和するモノ
クローナル抗体の同時投与は、ＦＬの抗腫瘍効果を阻害
する。発生２０日間の腫瘍を有する免疫適格マウスＢ６
に、抗−ＮＫ１．１抗体をマウス一匹につき３００μg
ずつＦＬと同時に毎日同時投与した。ＰＢＳリン酸緩衝
液により処理されたマウスの群は、ベージュマウス及び
ヌードマウス（*）において類似の腫瘍成長速度を呈し
ていた。は、ＦＬのみで処理した動物と比較して、ＮＫ
１．１により枯渇されたマウスの群においてはるかに大
きい腫瘍を表している。この実験を２度再現し、同一の
データを得た。
効果はＮＫ細胞に依存している。（図６） ＦＬ化合物は、Ｂ６−ベージュマウスにおい
ていかなる効果ももたらさない。発生２０日目のＡＫ７
腫瘍を有するＢ６−ベージュマウスにおいて２０日間毎
日１０μgのＦＬを投与した。一週間に２回、５０日間
にわたり腫瘍の成長を検査した。５匹のマウスの群につ
いての腫瘍の平均サイズは、図に標準偏差と共に表され
ている。この実験を２度くり返し、同一の結果を得た。（図７） ＦＬと同時に抗−ＮＫ１．１を中和するモノ
クローナル抗体の同時投与は、ＦＬの抗腫瘍効果を阻害
する。発生２０日間の腫瘍を有する免疫適格マウスＢ６
に、抗−ＮＫ１．１抗体をマウス一匹につき３００μg
ずつＦＬと同時に毎日同時投与した。ＰＢＳリン酸緩衝
液により処理されたマウスの群は、ベージュマウス及び
ヌードマウス（*）において類似の腫瘍成長速度を呈し
ていた。は、ＦＬのみで処理した動物と比較して、ＮＫ
１．１により枯渇されたマウスの群においてはるかに大
きい腫瘍を表している。この実験を２度再現し、同一の
データを得た。
【００７０】図８： ＦＬによる治療には、マウスＢ６
の脾臓において増大したＮＫ活性が伴っている。腫瘍Ａ
Ｋ７を有するマウス又は腫瘍の無いマウスの脾細胞をリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はＦＬで２０日間の処理した後
に調製し、標的細胞としてＹＡＣ−１細胞を使用するク
ロムの塩析試験の中でエフェクター細胞として使用し
た。結果は、異なるエフェクター：標的比での特異的溶
解百分率によって表現されている。各群には、３匹のマ
ウスを含んだ。
の脾臓において増大したＮＫ活性が伴っている。腫瘍Ａ
Ｋ７を有するマウス又は腫瘍の無いマウスの脾細胞をリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はＦＬで２０日間の処理した後
に調製し、標的細胞としてＹＡＣ−１細胞を使用するク
ロムの塩析試験の中でエフェクター細胞として使用し
た。結果は、異なるエフェクター：標的比での特異的溶
解百分率によって表現されている。各群には、３匹のマ
ウスを含んだ。
【００７１】図９〜１２： ＦＬにより誘発されたＮＫ
細胞に依存する抗腫瘍効果における、リンパ球様樹枝状
細胞、Ｂ７／ＣＤ２８の相互作用及び分化に関連したサ
イトカインＴｈ１の役割。（図９） Ｂ６−ヌードマウスにおける抗ＣＤ８α抗体
又は抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験。腫瘍
を有するＢ６ヌードマウスを、「材料及び方法」の中で
記載されるプロトコルに従って抗ＣＤ８α又は抗ＣＤ４
と結びつけた形で又は単独で、ＦＬで処理した。腫瘍の
サイズを、５匹の動物からなる群について一週間に２度
測定した。（*）は抗ＣＤ８α抗体で処理された動物と
比べた、ＦＬの注入を受け枯渇されていないマウスの群
における、著しく小さくなった寸法の腫瘍を表す。これ
らのデータは２回再現され、類似の結果を伴っていた。（図１０） in vivoでのＣＴＬ４Ｉｇの同時投与。
「材料及び方法」の中で記載されているようなマウスの
抗体（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）で、類似の実験を実施した。
（*）は、ＦＬのみで処置された動物と比較した、ＣＴ
ＬＡ４１ｇで処置した動物の群におけるはるかに大きい
サイズの腫瘍を表している。これらのデータは２度再現
され、同じ結果を伴っていた。（図１１） in vivoでの抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２のモ
ノクローナル抗体の同時投与。「材料及び方法」で記載
されているように、抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２抗体を用い
て類似の実験を実施した。抗腫瘍活性の著しい遮断は全
く観察されなかった。これらのデータは２度再現され、
結果は類似していた。（図１２） in vivoでの抗−ＩＦＮ−γモノクローナ
ル抗体の同時投与。抗−ＩＦＮ−γ抗体を用いて、類似
の実験を実施した。（*）は、ＦＬのみで処置された動
物と比べた、抗ＩＦＮγ抗体により処置された群内の著
しい大きいサイズの腫瘍を表している。これらのデータ
は、２度再現され、結果は類似していた。
細胞に依存する抗腫瘍効果における、リンパ球様樹枝状
細胞、Ｂ７／ＣＤ２８の相互作用及び分化に関連したサ
イトカインＴｈ１の役割。（図９） Ｂ６−ヌードマウスにおける抗ＣＤ８α抗体
又は抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験。腫瘍
を有するＢ６ヌードマウスを、「材料及び方法」の中で
記載されるプロトコルに従って抗ＣＤ８α又は抗ＣＤ４
と結びつけた形で又は単独で、ＦＬで処理した。腫瘍の
サイズを、５匹の動物からなる群について一週間に２度
測定した。（*）は抗ＣＤ８α抗体で処理された動物と
比べた、ＦＬの注入を受け枯渇されていないマウスの群
における、著しく小さくなった寸法の腫瘍を表す。これ
らのデータは２回再現され、類似の結果を伴っていた。（図１０） in vivoでのＣＴＬ４Ｉｇの同時投与。
「材料及び方法」の中で記載されているようなマウスの
抗体（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）で、類似の実験を実施した。
（*）は、ＦＬのみで処置された動物と比較した、ＣＴ
ＬＡ４１ｇで処置した動物の群におけるはるかに大きい
サイズの腫瘍を表している。これらのデータは２度再現
され、同じ結果を伴っていた。（図１１） in vivoでの抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２のモ
ノクローナル抗体の同時投与。「材料及び方法」で記載
されているように、抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２抗体を用い
て類似の実験を実施した。抗腫瘍活性の著しい遮断は全
く観察されなかった。これらのデータは２度再現され、
結果は類似していた。（図１２） in vivoでの抗−ＩＦＮ−γモノクローナ
ル抗体の同時投与。抗−ＩＦＮ−γ抗体を用いて、類似
の実験を実施した。（*）は、ＦＬのみで処置された動
物と比べた、抗ＩＦＮγ抗体により処置された群内の著
しい大きいサイズの腫瘍を表している。これらのデータ
は、２度再現され、結果は類似していた。
【００７２】図１３〜１４： ＡＫ７腫瘍を有するＢ６
−ヌードマウスにおける脾臓由来の樹枝状細胞の養子移
入：予防的及び治療的抗腫瘍効果。図１３ ： １日目にＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウ
スの体内に直接的腫瘍内皮下注射により未成熟樹枝状細
胞を２００〜５００万個投与した（予防的に）。注射は
１５日間１週間に２度実施された。ｔ−student試験に
従って、腫瘍の成長を検査し、ＰＢＳにより処理された
動物の群（１群５匹のマウス）と比較した。９５％での
有意な結果を１つの（*）で表している。図１４ ： 同上であるが、２０日前から発生したＡＫ７
腫瘍の中に樹枝状細胞を注射した（治療的に）。
−ヌードマウスにおける脾臓由来の樹枝状細胞の養子移
入：予防的及び治療的抗腫瘍効果。図１３ ： １日目にＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウ
スの体内に直接的腫瘍内皮下注射により未成熟樹枝状細
胞を２００〜５００万個投与した（予防的に）。注射は
１５日間１週間に２度実施された。ｔ−student試験に
従って、腫瘍の成長を検査し、ＰＢＳにより処理された
動物の群（１群５匹のマウス）と比較した。９５％での
有意な結果を１つの（*）で表している。図１４ ： 同上であるが、２０日前から発生したＡＫ７
腫瘍の中に樹枝状細胞を注射した（治療的に）。
【００７３】図１５〜１６： 線維芽細胞（Ｌ細胞）又
は上清（ＳＮＬ細胞）の存在下で触発された未成熟の樹
枝状細胞による、健康な又は病気のドナーのＰＢＬから
精製されたヒトＮＫ細胞の活性化。図１５ ： ＩＦＮγ分泌の測定。結果は、少なくとも別
々の３つの実験において反復されてul/ml単位で表され
ている。図１６ ： 遊離クロムの測定による腫瘍標的の細胞溶解
の測定（ｔＤＣ＝触発（又は「トリガー」）済み樹枝状
細胞）。
は上清（ＳＮＬ細胞）の存在下で触発された未成熟の樹
枝状細胞による、健康な又は病気のドナーのＰＢＬから
精製されたヒトＮＫ細胞の活性化。図１５ ： ＩＦＮγ分泌の測定。結果は、少なくとも別
々の３つの実験において反復されてul/ml単位で表され
ている。図１６ ： 遊離クロムの測定による腫瘍標的の細胞溶解
の測定（ｔＤＣ＝触発（又は「トリガー」）済み樹枝状
細胞）。
【００７４】図１７〜２０： マウス樹枝状細胞のエキ
ソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化す
る。図１７ ：ガンマインターフェロンの産生の測定；図１８ ：ＹＡＣ１細胞の細胞溶解の測定；図１９ ：ＮＫ細胞の生存率の測定；図２０ ：in vivoでの腫瘍の平均サイズの測定。Ｄｅｘ
ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導された樹枝状細胞から産生さ
れたデキソゾーム。Ｅ：Ｔ比：標的細胞に対するエフェ
クター細胞の比。ＳＮ ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導され
た樹枝状細胞の直接上清。
ソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化す
る。図１７ ：ガンマインターフェロンの産生の測定；図１８ ：ＹＡＣ１細胞の細胞溶解の測定；図１９ ：ＮＫ細胞の生存率の測定；図２０ ：in vivoでの腫瘍の平均サイズの測定。Ｄｅｘ
ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導された樹枝状細胞から産生さ
れたデキソゾーム。Ｅ：Ｔ比：標的細胞に対するエフェ
クター細胞の比。ＳＮ ＢＭ−ＤＣ：骨髄から誘導され
た樹枝状細胞の直接上清。
【００７５】図２１： ヒト樹枝状細胞のエキソゾーム
（ＤＥＸｈ）は、休止状態のマウスのＮＫ細胞を活性化
させる。Ｄｅｘ ＭＤ−ＤＣ：単球から誘導された樹枝
状細胞から産生された産物。ＳＮ ＭＤ−ＤＣ：単球か
ら誘導された樹枝状細胞の直接上清。
（ＤＥＸｈ）は、休止状態のマウスのＮＫ細胞を活性化
させる。Ｄｅｘ ＭＤ−ＤＣ：単球から誘導された樹枝
状細胞から産生された産物。ＳＮ ＭＤ−ＤＣ：単球か
ら誘導された樹枝状細胞の直接上清。
【００７６】図２２〜２３： ベータ−２−ミクログロ
ブリン（図２２）又はクラスIIのＭＨＣの分子（図２
３）についての「ノックアウト」マウスの樹枝状細胞の
エキソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化
する。Ｂ６ｗｔ：野生型Ｂ６マウス；β２ｍ-/-：ベー
タ−２−ミクログロブリンの遺伝子についての「ノック
アウト」マウス；ＣｌII-/-：クラスIIのＭＨＣの分子
についての「ノックアウト」マウス。
ブリン（図２２）又はクラスIIのＭＨＣの分子（図２
３）についての「ノックアウト」マウスの樹枝状細胞の
エキソゾーム（ＤＥＸｍ）は、マウスＮＫ細胞を活性化
する。Ｂ６ｗｔ：野生型Ｂ６マウス；β２ｍ-/-：ベー
タ−２−ミクログロブリンの遺伝子についての「ノック
アウト」マウス；ＣｌII-/-：クラスIIのＭＨＣの分子
についての「ノックアウト」マウス。
【００７７】図２４〜２５： ＮＫ細胞を刺激するため
の、樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾームの相対
的活性。図２４ ：低い用量又は高い用量のインターロイキン４で
産生された樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾーム
の活性の比較研究。図２５ ：触発済み又は未触発の樹枝状細胞とそれが産生
するデキソゾームの活性の比較研究。
の、樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾームの相対
的活性。図２４ ：低い用量又は高い用量のインターロイキン４で
産生された樹枝状細胞及びそれが産生するデキソゾーム
の活性の比較研究。図２５ ：触発済み又は未触発の樹枝状細胞とそれが産生
するデキソゾームの活性の比較研究。
【００７８】材料及び方法 １．動物 雌マウスＣ５７−ＢＬ／６（Ｂ６）及びＢＡＬＢ／ｃ s
cid／scid（ＳＣＩＤ）は、ジャンヴィエ飼育センター
（Le Genest St-Isle, フランス）から入手した。雌マ
ウスＣ５７／ＢＬ／６−bg/bg（Ｂ６−ベージュ）は、H
arlan UK Limited（Oxon, イギリス）から購入した。雌
マウスＳ５７−ＢＬ／６−Ｂ６−nude（Ｂ６−ヌード）
は、Mollegaard研究・飼育センターＡ／Ｓ（Skensved,
デンマーク）から入手した。雌及び雄のマウスＣ５７Ｂ
Ｌ／６Rag２-/-（Ｂ６−Rag-/-）は、国立科学研究セン
ターの先新技術開発センター（オルレアン、フランス）
から購入した。ＳＣＩＤベージュ及びＢ６−ヌードマウ
スは、病原体のいない条件下に維持した。各実験の初め
で、マウスを月齢別にまとめた（８〜１０週）。
cid／scid（ＳＣＩＤ）は、ジャンヴィエ飼育センター
（Le Genest St-Isle, フランス）から入手した。雌マ
ウスＣ５７／ＢＬ／６−bg/bg（Ｂ６−ベージュ）は、H
arlan UK Limited（Oxon, イギリス）から購入した。雌
マウスＳ５７−ＢＬ／６−Ｂ６−nude（Ｂ６−ヌード）
は、Mollegaard研究・飼育センターＡ／Ｓ（Skensved,
デンマーク）から入手した。雌及び雄のマウスＣ５７Ｂ
Ｌ／６Rag２-/-（Ｂ６−Rag-/-）は、国立科学研究セン
ターの先新技術開発センター（オルレアン、フランス）
から購入した。ＳＣＩＤベージュ及びＢ６−ヌードマウ
スは、病原体のいない条件下に維持した。各実験の初め
で、マウスを月齢別にまとめた（８〜１０週）。
【００７９】２．細胞培養 A. Kane（Brown University, Providence, Rhode Islan
d）により提供された細胞ＡＫ７は、Ｂ６マウスの体内
でクロシドライトアスベスト腹腔内注入により生成され
たマウスの中比腫細胞系統である。この細胞系統を、１
０％の熱処理により不活性化されたウシ胎児血清、１．
０mMのピルビン酸ナトリウム、２mMのＬ−グルタミン、
１０UI/mlのペニシリン、及び１００μg/mlのストレプ
トマイシンを補充したＤＭＥＭ培地の中で維持した。in
vivoでの実験前１ヵ月未満の期間中、腫瘍細胞系統をi
n vitroで維持した。マウスの樹枝状細胞系統を、１０
％の不活性化されたウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミ
ン、５０μMの２βＭＥ，１００Ul/mlのペニシリン、及
び１００μg/mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培
地（「ＩＭＤＭ培地」）の中に維持する。細胞の成熟を
誘発するため、組換え型マウスのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Sys
tems, Abingdon, ＵＫ）を、２４時間１０ng/mlの濃度
で添加した。成熟は、ＬＰＳ（１〜１０μg/ml）の存在
下で細胞をインキュベーションすることによっても誘発
可能である。ＹＡＣ−１細胞系統は、ＮＫ細胞に対する
高い感受性を持つＡ／Ｓｎという状況下のリンパ腫系統
である。Ｐ８１５細胞は、ＮＫ細胞に対する耐性を持つ
ＤＢＡ／２状況下の肥満細胞である。全ての培地及び試
薬は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Life Technologies, Merel
beke, ベルギー）から入手した。
d）により提供された細胞ＡＫ７は、Ｂ６マウスの体内
でクロシドライトアスベスト腹腔内注入により生成され
たマウスの中比腫細胞系統である。この細胞系統を、１
０％の熱処理により不活性化されたウシ胎児血清、１．
０mMのピルビン酸ナトリウム、２mMのＬ−グルタミン、
１０UI/mlのペニシリン、及び１００μg/mlのストレプ
トマイシンを補充したＤＭＥＭ培地の中で維持した。in
vivoでの実験前１ヵ月未満の期間中、腫瘍細胞系統をi
n vitroで維持した。マウスの樹枝状細胞系統を、１０
％の不活性化されたウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミ
ン、５０μMの２βＭＥ，１００Ul/mlのペニシリン、及
び１００μg/mlのストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培
地（「ＩＭＤＭ培地」）の中に維持する。細胞の成熟を
誘発するため、組換え型マウスのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Sys
tems, Abingdon, ＵＫ）を、２４時間１０ng/mlの濃度
で添加した。成熟は、ＬＰＳ（１〜１０μg/ml）の存在
下で細胞をインキュベーションすることによっても誘発
可能である。ＹＡＣ−１細胞系統は、ＮＫ細胞に対する
高い感受性を持つＡ／Ｓｎという状況下のリンパ腫系統
である。Ｐ８１５細胞は、ＮＫ細胞に対する耐性を持つ
ＤＢＡ／２状況下の肥満細胞である。全ての培地及び試
薬は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Life Technologies, Merel
beke, ベルギー）から入手した。
【００８０】３．骨髄から誘導された樹枝状細胞の生成
と培養 マウスの樹枝状細胞は、１０％の子牛胎児血清、Ｌ−グ
ルタミン、必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイ
シン及びβ−２ＭＥを補足したＲＰＭＩ １６４０培地
内で６日間、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養
された骨髄の前駆細胞を分化することに由来するもので
ある。これらの細胞はMayordomo et al.(1996）が記載
したプロトコルに従って得られた。簡単に言うと、骨髄
を、脛骨及び大腿骨から抽出し、リンパ球及びマクロフ
ァージを枯渇させ、ｒｍＩＬ−４及びｒｍＧＭ−ＣＳＦ
（各々１０００Ul/mlずつ）を補足した上記のＲＰＭＩ
１６４０培地の中で２４ウエル（０．２５・１０6細胞
／ml）の培養平板上に播種した。３日目に、全く又はわ
ずかしか接着性を持たない細胞を収穫し、新しい同じ培
地で補足的培養を３日行うため、２４ウエルの培養平板
（０．３・１０6細胞／ml）上に播種した。こうして得
られた樹枝状細胞は、予想された表現型を持つ。こうし
て得られた樹枝状細胞は未成熟細胞である。これらは、
インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦをＴＮＦ−α
（１０ng/ml）及び／又はＬＰＳ（１〜１０μg/ml）と
組合わせた培養での成熟のために誘発され得る。細胞
は、共存培養のため成熟刺激から２４／４８時間後に使
用される。自己由来及び同種異系の樹枝状細胞を共存培
養に使用することができ、効率は同じである。さらに、
成熟及び未成熟樹枝状細胞も区別なく使用できる。
と培養 マウスの樹枝状細胞は、１０％の子牛胎児血清、Ｌ−グ
ルタミン、必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイ
シン及びβ−２ＭＥを補足したＲＰＭＩ １６４０培地
内で６日間、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養
された骨髄の前駆細胞を分化することに由来するもので
ある。これらの細胞はMayordomo et al.(1996）が記載
したプロトコルに従って得られた。簡単に言うと、骨髄
を、脛骨及び大腿骨から抽出し、リンパ球及びマクロフ
ァージを枯渇させ、ｒｍＩＬ−４及びｒｍＧＭ−ＣＳＦ
（各々１０００Ul/mlずつ）を補足した上記のＲＰＭＩ
１６４０培地の中で２４ウエル（０．２５・１０6細胞
／ml）の培養平板上に播種した。３日目に、全く又はわ
ずかしか接着性を持たない細胞を収穫し、新しい同じ培
地で補足的培養を３日行うため、２４ウエルの培養平板
（０．３・１０6細胞／ml）上に播種した。こうして得
られた樹枝状細胞は、予想された表現型を持つ。こうし
て得られた樹枝状細胞は未成熟細胞である。これらは、
インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦをＴＮＦ−α
（１０ng/ml）及び／又はＬＰＳ（１〜１０μg/ml）と
組合わせた培養での成熟のために誘発され得る。細胞
は、共存培養のため成熟刺激から２４／４８時間後に使
用される。自己由来及び同種異系の樹枝状細胞を共存培
養に使用することができ、効率は同じである。さらに、
成熟及び未成熟樹枝状細胞も区別なく使用できる。
【００８１】４．樹枝状細胞の触発 樹枝状細胞は、異なるプロトコルに従って触発させるこ
とができる。例中で使用されている方法の１つは、分裂
中の線維芽細胞（特にＬ−９２９又はＮＩＨ３Ｔ３系統
の細胞）の存在下での樹枝状細胞（成熟又は未成熟）の
共存培養を含む。この共存培養は一般に、２４〜４８時
間維持され、ｔＤＣは約２０時間の共存培養後に得るこ
とができる。もう１つの方法に従うと、樹枝状細胞は、
好都合には分裂中の線維芽細胞（特にＬ−９２９、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３又はＭＲＣ５系統の細胞、ヒトの肺線維芽細胞
の一次培養）の培養上清を含む触発培地の中でインキュ
ベーションされる。以下の例においては、使用される上
清は、３倍に希釈され、培養はＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳ
Ｆを含む培地内で行われた。腫瘍細胞（肥満細胞）の培
養上清を含む培地を触発・培地として使用して、もう１
つの触発実験を実施した。
とができる。例中で使用されている方法の１つは、分裂
中の線維芽細胞（特にＬ−９２９又はＮＩＨ３Ｔ３系統
の細胞）の存在下での樹枝状細胞（成熟又は未成熟）の
共存培養を含む。この共存培養は一般に、２４〜４８時
間維持され、ｔＤＣは約２０時間の共存培養後に得るこ
とができる。もう１つの方法に従うと、樹枝状細胞は、
好都合には分裂中の線維芽細胞（特にＬ−９２９、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３又はＭＲＣ５系統の細胞、ヒトの肺線維芽細胞
の一次培養）の培養上清を含む触発培地の中でインキュ
ベーションされる。以下の例においては、使用される上
清は、３倍に希釈され、培養はＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳ
Ｆを含む培地内で行われた。腫瘍細胞（肥満細胞）の培
養上清を含む培地を触発・培地として使用して、もう１
つの触発実験を実施した。
【００８２】５．ＮＫ細胞の生成 ＮＫ細胞は、３７℃で２〜３時間塑性付着段階の後、Ｓ
ＣＩＤ又はＲag２-/-マウスの脾臓から休止状態で得ら
れる。簡単に言うと、Ｂ６−Ｒag-/-マウス又はＳＣＩ
Ｄマウスの脾臓を上記のとおりにＲＰＭＩ １６４０完
全培地内で解離させ、懸濁状態の細胞培養を生成した。
赤血球の溶解後、細胞を１回洗浄し３７℃で２〜３時間
播種した（２．５・１０6細胞／ml）。その後、非接着
性細胞を収獲し計数した。これらの細胞は基本的に、休
止状態のＮＫ細胞で構成されている。
ＣＩＤ又はＲag２-/-マウスの脾臓から休止状態で得ら
れる。簡単に言うと、Ｂ６−Ｒag-/-マウス又はＳＣＩ
Ｄマウスの脾臓を上記のとおりにＲＰＭＩ １６４０完
全培地内で解離させ、懸濁状態の細胞培養を生成した。
赤血球の溶解後、細胞を１回洗浄し３７℃で２〜３時間
播種した（２．５・１０6細胞／ml）。その後、非接着
性細胞を収獲し計数した。これらの細胞は基本的に、休
止状態のＮＫ細胞で構成されている。
【００８３】６．ＮＫ／ＤＣ共存培養 共存培養のためには、触発済み又は未触発で自己由来又
は同種異系の、未成熟又は成熟樹枝状細胞を収穫し、３
回洗浄し、Ｕ字形の底を持つ９６ウエルの平板内で分離
されたばかりの休止状態のＮＫ細胞（１・１０6個のＮ
Ｋ細胞／ml）に対して異なる混合比で添加した。個別に
インキュベーションした細胞（樹枝状細胞及びＮＫ細
胞）を、対照として類似の濃度で播種した。
は同種異系の、未成熟又は成熟樹枝状細胞を収穫し、３
回洗浄し、Ｕ字形の底を持つ９６ウエルの平板内で分離
されたばかりの休止状態のＮＫ細胞（１・１０6個のＮ
Ｋ細胞／ml）に対して異なる混合比で添加した。個別に
インキュベーションした細胞（樹枝状細胞及びＮＫ細
胞）を、対照として類似の濃度で播種した。
【００８４】７．インターフェロン−γの分泌試験 樹枝状細胞／ＮＫ細胞の共存培養上清を収集し、場合に
よって−７０℃で凍結させる。インターフェロンγの塩
析測定試験は、市販のＥＬＩＳＡキット（Genzyme Cor
p. Cambridge, 米国）を用いて実施した。使用される試
験の検出感度は、５pg/mlに近いものである。ＮＫ細胞
に対する樹枝状細胞の比率を変動させることからなる用
量効果を実施する。
よって−７０℃で凍結させる。インターフェロンγの塩
析測定試験は、市販のＥＬＩＳＡキット（Genzyme Cor
p. Cambridge, 米国）を用いて実施した。使用される試
験の検出感度は、５pg/mlに近いものである。ＮＫ細胞
に対する樹枝状細胞の比率を変動させることからなる用
量効果を実施する。
【００８５】８．ＮＫ細胞の細胞傷害性試験 ＮＫ細胞のin vitro細胞傷害性を、感受性ＮＫ（ＹＡＣ
−１）又は耐性ＮＫ（Ｐ８１５）と標識づけされた標的
のクロム５１塩析という古典的な方法に従って評価す
る。より具体的に言うと、４０〜７２時間インキュベー
ションしたＮＫ／ＤＣ共存培養又は分離培養の細胞を収
集し、リンパ球及び樹枝状細胞を排除するためトリパン
ブルーで標識付けし、計数し、ＹＡＣ−１及びＰ８１５
を標的細胞として使用する細胞傷害性試験の中でエフェ
クター細胞として使用した。標的細胞を、Ｎａ5 1Ｃｒ4
Ｏ（１００μCi／１０6細胞; New England Nuclear）と
共に３７℃で１〜２時間プレインキュベーションし、１
度洗浄し、５％の不活性ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ １６４０培地の中で３７℃で１／２時間インキュベ
ーションした。その後、細胞を３度洗浄し、Ｖ字形の底
を持つ９６のウェルのマイクロタイトレーション平板内
でウェル毎に２・１０3個の細胞の割合で播種した。エ
フェクター細胞と標的細胞は、合計０．２mlの体積内
で、異なるエフェクター／標的比で混合し、３７℃で４
時間インキュベーションした。標的細胞の溶解度を、Lu
ma平板中に移された０．１mlの上清を計数することによ
って測定した。標識づけされた標的細胞のみを含むウェ
ルから自発的塩析を決定し、セトリミド２％を添加する
ことによってクロム５１の最大塩析を決定した。比細胞
傷害性は、以下のように計算された： クロム5 1の塩析
百分率＝１００×（実験的cpmの値−自発的塩析の値）
／（最大塩析のcpmの値−自発的塩析のcpmの値）。in v
ivoでの試験のためには、ＡＫ７細胞を有するか又は腫
瘍の無い２〜３匹のマウスの脾臓を、ＦＬ化合物又はリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）による２０日の処理の後に採取し
た。浸透溶解により赤血球を枯渇させた脾細胞の懸濁物
を直ちに、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細胞を標的として用
いる上記のとおりの細胞傷害性試験の中でエフェクター
細胞として使用した。
−１）又は耐性ＮＫ（Ｐ８１５）と標識づけされた標的
のクロム５１塩析という古典的な方法に従って評価す
る。より具体的に言うと、４０〜７２時間インキュベー
ションしたＮＫ／ＤＣ共存培養又は分離培養の細胞を収
集し、リンパ球及び樹枝状細胞を排除するためトリパン
ブルーで標識付けし、計数し、ＹＡＣ−１及びＰ８１５
を標的細胞として使用する細胞傷害性試験の中でエフェ
クター細胞として使用した。標的細胞を、Ｎａ5 1Ｃｒ4
Ｏ（１００μCi／１０6細胞; New England Nuclear）と
共に３７℃で１〜２時間プレインキュベーションし、１
度洗浄し、５％の不活性ウシ胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ １６４０培地の中で３７℃で１／２時間インキュベ
ーションした。その後、細胞を３度洗浄し、Ｖ字形の底
を持つ９６のウェルのマイクロタイトレーション平板内
でウェル毎に２・１０3個の細胞の割合で播種した。エ
フェクター細胞と標的細胞は、合計０．２mlの体積内
で、異なるエフェクター／標的比で混合し、３７℃で４
時間インキュベーションした。標的細胞の溶解度を、Lu
ma平板中に移された０．１mlの上清を計数することによ
って測定した。標識づけされた標的細胞のみを含むウェ
ルから自発的塩析を決定し、セトリミド２％を添加する
ことによってクロム５１の最大塩析を決定した。比細胞
傷害性は、以下のように計算された： クロム5 1の塩析
百分率＝１００×（実験的cpmの値−自発的塩析の値）
／（最大塩析のcpmの値−自発的塩析のcpmの値）。in v
ivoでの試験のためには、ＡＫ７細胞を有するか又は腫
瘍の無い２〜３匹のマウスの脾臓を、ＦＬ化合物又はリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）による２０日の処理の後に採取し
た。浸透溶解により赤血球を枯渇させた脾細胞の懸濁物
を直ちに、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細胞を標的として用
いる上記のとおりの細胞傷害性試験の中でエフェクター
細胞として使用した。
【００８６】９．ＦＬ化合物によるマウスのin vivo処
置 ０．１mlのＰＢＳの体積中の最低腫瘍発生用量のＡＫ７
細胞（３・１０6個の細胞）をマウスの右脇腹に皮内投
与接種する。ＣＨＯ細胞から誘導されたＦＬ化合物は、
Immunex Corps (Seatle, USA, Lynch et al., Nature M
edecine 3: 625, 1997）により供給された。このサイト
カインを、１mlあたり１００μgでＰＢＳ中に希釈した
形で使用した。発生２０日目のＡＫ７腫瘍（直径約２０
mm2)を合計０．１mlの体積でＦＬ又はＰＢＳ（１０μ
g）を一日一回連続２０日間注射（左脇腹に皮下注射）
することにより処置した。一週間に２度腫瘍の成長につ
いてマウスを検査し、ノギスを用いて、ミリメートル単
位の２つの垂直直径を測定することにより、腫瘍の平均
寸法を例示した。腫瘍の成長率は、ＦＬによる１日目の
処置の後の時間との関係における腫瘍のサイズ（mm2)を
報告することによって決定された。全ての研究は、５匹
の動物からなる群を用いて少なくとも４回実施された。
置 ０．１mlのＰＢＳの体積中の最低腫瘍発生用量のＡＫ７
細胞（３・１０6個の細胞）をマウスの右脇腹に皮内投
与接種する。ＣＨＯ細胞から誘導されたＦＬ化合物は、
Immunex Corps (Seatle, USA, Lynch et al., Nature M
edecine 3: 625, 1997）により供給された。このサイト
カインを、１mlあたり１００μgでＰＢＳ中に希釈した
形で使用した。発生２０日目のＡＫ７腫瘍（直径約２０
mm2)を合計０．１mlの体積でＦＬ又はＰＢＳ（１０μ
g）を一日一回連続２０日間注射（左脇腹に皮下注射）
することにより処置した。一週間に２度腫瘍の成長につ
いてマウスを検査し、ノギスを用いて、ミリメートル単
位の２つの垂直直径を測定することにより、腫瘍の平均
寸法を例示した。腫瘍の成長率は、ＦＬによる１日目の
処置の後の時間との関係における腫瘍のサイズ（mm2)を
報告することによって決定された。全ての研究は、５匹
の動物からなる群を用いて少なくとも４回実施された。
【００８７】１０．in vivoでの抗体による枯渇の実験 枯渇実験においては、抗ＣＤ８α抗体（クローンＹＴＳ
１９１．１．２，ラットのＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４抗体
（クローンＹＴＳ１６９．４．２．１，ラットのＩｇＧ
２ａ）及び抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６，マ
ウスのＩｇＧ２）を使用した。胸腺欠損マウスの体内で
ハイブリドーマを培養し、腹水を前述の技術に従ってま
ずはカプリル酸で次に硫酸アンモニウムでの沈殿により
回収、精製し、ＰＢＳに対し透析し、次に１mg/mlに調
整した（Mckinney, 1987）。図面の説明中に相反する表
示のないかぎり、枯渇は、Ｂ６マウスのＦＬによる処置
の１日目に開始され、連続３日間腹腔内に２００〜３０
０μgのモノクローナル抗体を注射し、その後はＦＬ処
置の間２日に一回注射した。ＦＬ処置の後、モノクロー
ナル抗体を４日の間隔をおいて２回投与する。螢光抗体
を用いてフローサイトメトリーによって平行して行われ
た複数の実験により、観察された枯渇が、ＦＬ処置の９
日目と２０日目で、標的とされた細胞亜個体群について
９９％を上回っていることを確認することができた。Ｂ
７の遮断実験のためには、ＦＬ処置の１０日目と１８日
目の間で２日の間隔をおいてＣＴＬＡ４Ｉｇマウス融合
タンパク質（Hoffman La Roche, ItalyのL. Adoriniに
より提供された）２００μgをマウスに腹腔内注射し
た。内因性ＩＬ−１２の中和研究のためには、ＦＬ処置
の５日目と１７日目の間で３日の間隔を置いて３００μ
gの個別用量で、抗−ｐ４０ＩＬ−１２精製抗体（クロ
ーンＣ−１７−８，ラットのＩｇＧ２ａ）を腹腔内注射
した。内因性インターフェロンγの中和研究のために
は、ＦＬ投与の１０日目、１５日目及び２０日目に、マ
ウス一匹あたり３００μgの抗インターフェロンγ抗体
（ハムスターのＩｇＧ）を腹腔内注射した。全ての実験
は、１群あたりネズミ５匹の割合で、少なくとも２度実
施した。
１９１．１．２，ラットのＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４抗体
（クローンＹＴＳ１６９．４．２．１，ラットのＩｇＧ
２ａ）及び抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６，マ
ウスのＩｇＧ２）を使用した。胸腺欠損マウスの体内で
ハイブリドーマを培養し、腹水を前述の技術に従ってま
ずはカプリル酸で次に硫酸アンモニウムでの沈殿により
回収、精製し、ＰＢＳに対し透析し、次に１mg/mlに調
整した（Mckinney, 1987）。図面の説明中に相反する表
示のないかぎり、枯渇は、Ｂ６マウスのＦＬによる処置
の１日目に開始され、連続３日間腹腔内に２００〜３０
０μgのモノクローナル抗体を注射し、その後はＦＬ処
置の間２日に一回注射した。ＦＬ処置の後、モノクロー
ナル抗体を４日の間隔をおいて２回投与する。螢光抗体
を用いてフローサイトメトリーによって平行して行われ
た複数の実験により、観察された枯渇が、ＦＬ処置の９
日目と２０日目で、標的とされた細胞亜個体群について
９９％を上回っていることを確認することができた。Ｂ
７の遮断実験のためには、ＦＬ処置の１０日目と１８日
目の間で２日の間隔をおいてＣＴＬＡ４Ｉｇマウス融合
タンパク質（Hoffman La Roche, ItalyのL. Adoriniに
より提供された）２００μgをマウスに腹腔内注射し
た。内因性ＩＬ−１２の中和研究のためには、ＦＬ処置
の５日目と１７日目の間で３日の間隔を置いて３００μ
gの個別用量で、抗−ｐ４０ＩＬ−１２精製抗体（クロ
ーンＣ−１７−８，ラットのＩｇＧ２ａ）を腹腔内注射
した。内因性インターフェロンγの中和研究のために
は、ＦＬ投与の１０日目、１５日目及び２０日目に、マ
ウス一匹あたり３００μgの抗インターフェロンγ抗体
（ハムスターのＩｇＧ）を腹腔内注射した。全ての実験
は、１群あたりネズミ５匹の割合で、少なくとも２度実
施した。
【００８８】１１．マウスにおける樹枝状細胞の養子移
入 １日目又は２０日目のＡＫ７腫瘍を有するＢ６−ヌード
マウス又はＳＣＩＤマウスに、２週間、２〜５・１０6
個の未成熟樹枝状細胞を一週間２度の割合で皮下腫瘍内
注射した。１群あたり５匹のマウスを処置した。前述の
とおりに腫瘍の成長を検査した。
入 １日目又は２０日目のＡＫ７腫瘍を有するＢ６−ヌード
マウス又はＳＣＩＤマウスに、２週間、２〜５・１０6
個の未成熟樹枝状細胞を一週間２度の割合で皮下腫瘍内
注射した。１群あたり５匹のマウスを処置した。前述の
とおりに腫瘍の成長を検査した。
【００８９】１２．データの統計学的分析 異なる実験群（標準偏差を伴って平均として示されてい
る）間の差の有意な性質を解釈するため、Fisherの方法
そのものが使用された。樹枝状細胞の受身移入実験を解
釈するため、Studentのｔ試験を用いて２つの群を比較
した。９５％の結果における有意な性質は、個々の実験
各々について表されている。
る）間の差の有意な性質を解釈するため、Fisherの方法
そのものが使用された。樹枝状細胞の受身移入実験を解
釈するため、Studentのｔ試験を用いて２つの群を比較
した。９５％の結果における有意な性質は、個々の実験
各々について表されている。
【００９０】
【実施例】以下の例で紹介されている結果は、特に以下
のことを明らかにしている： １） 精製された樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養
は、成熟樹枝状細胞及びＮＫ細胞の生存及びＮＫ細胞の
急速な活性化をひき起こすこと、換言すると、樹枝状細
胞は、その他に知られているものが全くない場合、サイ
トカインを添加することなく、また共存培養内のＩＬ−
２、ＩＬ−１２の検出可能な分泌等を立証することな
く、ＮＫ細胞を、その感受性あるＮＫ天然標的に対しき
わめてＩＮＦγ分泌性が高く殺傷性のあるものにするこ
とを可能にするものであり得ること。 ２） 樹枝状細胞の養子移入あるいは樹枝状細胞のin v
ivoでの直接的拡大は、ＮＫの活性化に起因する重大な
抗腫瘍効果をひき起こすこと。
のことを明らかにしている： １） 精製された樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養
は、成熟樹枝状細胞及びＮＫ細胞の生存及びＮＫ細胞の
急速な活性化をひき起こすこと、換言すると、樹枝状細
胞は、その他に知られているものが全くない場合、サイ
トカインを添加することなく、また共存培養内のＩＬ−
２、ＩＬ−１２の検出可能な分泌等を立証することな
く、ＮＫ細胞を、その感受性あるＮＫ天然標的に対しき
わめてＩＮＦγ分泌性が高く殺傷性のあるものにするこ
とを可能にするものであり得ること。 ２） 樹枝状細胞の養子移入あるいは樹枝状細胞のin v
ivoでの直接的拡大は、ＮＫの活性化に起因する重大な
抗腫瘍効果をひき起こすこと。
【００９１】例１： 樹枝状細胞は、細胞溶解活性及び
in vitroでのＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生
を刺激する。この例は、分化の異なる段階で樹枝状細胞
がin vitroで休止状態のＮＫ細胞を活性化させる特性を
持つことを例示している。細胞傷害活性、インターフェ
ロンγ産生及び増殖について試験を行った。一連の実験
において、同系の骨髄から誘導されたばかりの樹枝状細
胞を、インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下
で培養し、未成熟状態に維持した（材料及び方法を参照
のこと）。未成熟樹枝状細胞を収集し、集中的に洗浄
し、サイトカインが無い状態で完全培地内で、同系のＳ
ＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスで採取されたばかりの脾細
胞から得た非接着性の単核細胞と、約１：１の初期比で
同時インキュベーションした。これらの非接着性脾臓細
胞の３分の１は、モノクローナルＤｘ５抗体又は抗−Ｎ
Ｋ１．１モノクローナル抗体で、陽性標識づけされる。
４０〜７２時間の共存培養後、ＮＫ細胞を計数し、異な
るエフェクター／標的比で、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細
胞に対し４時間、クロム５１の塩析の測定により細胞傷
害性試験において試験した。得られた結果は図１に示さ
れており、これらの樹枝状細胞がＮＫ細胞の細胞溶解活
性の活性化を誘発することを示している。特にこれらの
結果は、次のことを示している： − ２つの細胞型の共存培養が、生存可能なＮＫ細胞の
収獲を可能にすること及び、 − ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比
で同時インキュベーションされる場合、ＹＡＣ−１細胞
の２０〜５０％の特異的溶解が２５〜１００：１という
エフェクター細胞／標的細胞比で得られること。非感染
性のＮＫであるＰ８１５細胞、試験された条件下で溶解
されず、類似の濃度で別々に培養された２つの細胞個体
群（ＮＫ細胞と樹枝状細胞）はいずれも、ＹＡＣ−１細
胞の有意な溶解を誘発しない（図２〜３）。
in vitroでのＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生
を刺激する。この例は、分化の異なる段階で樹枝状細胞
がin vitroで休止状態のＮＫ細胞を活性化させる特性を
持つことを例示している。細胞傷害活性、インターフェ
ロンγ産生及び増殖について試験を行った。一連の実験
において、同系の骨髄から誘導されたばかりの樹枝状細
胞を、インターロイキン−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下
で培養し、未成熟状態に維持した（材料及び方法を参照
のこと）。未成熟樹枝状細胞を収集し、集中的に洗浄
し、サイトカインが無い状態で完全培地内で、同系のＳ
ＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスで採取されたばかりの脾細
胞から得た非接着性の単核細胞と、約１：１の初期比で
同時インキュベーションした。これらの非接着性脾臓細
胞の３分の１は、モノクローナルＤｘ５抗体又は抗−Ｎ
Ｋ１．１モノクローナル抗体で、陽性標識づけされる。
４０〜７２時間の共存培養後、ＮＫ細胞を計数し、異な
るエフェクター／標的比で、ＹＡＣ−１及びＰ８１５細
胞に対し４時間、クロム５１の塩析の測定により細胞傷
害性試験において試験した。得られた結果は図１に示さ
れており、これらの樹枝状細胞がＮＫ細胞の細胞溶解活
性の活性化を誘発することを示している。特にこれらの
結果は、次のことを示している： − ２つの細胞型の共存培養が、生存可能なＮＫ細胞の
収獲を可能にすること及び、 − ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比
で同時インキュベーションされる場合、ＹＡＣ−１細胞
の２０〜５０％の特異的溶解が２５〜１００：１という
エフェクター細胞／標的細胞比で得られること。非感染
性のＮＫであるＰ８１５細胞、試験された条件下で溶解
されず、類似の濃度で別々に培養された２つの細胞個体
群（ＮＫ細胞と樹枝状細胞）はいずれも、ＹＡＣ−１細
胞の有意な溶解を誘発しない（図２〜３）。
【００９２】もう１つの１連の実験では、脾臓の樹枝状
細胞系統が使用された。この系統は、未成熟段階での細
胞の長期にわたる成長及びその触発を可能にする培養条
件下に維持された。この系統は次に、２４時間ＴＮＦα
又はＬＰＳの存在下で成熟へと誘発された。成熟した細
胞は、以前にWinzler et alにより記載されたように、
重大な形態学的変化を呈する。集塊はもはや付着性をも
たず、ＦＡＣＳによる分析は、分子ＤＣ１１Ｃ、Ｉ−Ａ
ｂ、Ｂ７．２及びＤＣ４０の多大な発現を明らかにす
る。これらの成熟樹枝状細胞は上記のものと同じ条件下
で、異なる比率でＢ６−Ｒag-/-マウスにおいて収獲さ
れたばかりの休止状態のＮＫ細胞との４０〜４８時間の
同時インキュベーションにより試験された。得られた結
果は図２〜３に示されている。これらの結果は次のこと
を示している： − ２つの細胞型の共存培養は、別々のＮＫ細胞の培養
の場合に比べはるかに優れた形でウェル内に生存可能な
ＮＫ細胞を収獲することを可能にする（１０〜３０％対
２〜５％）。 − ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比
率で同時インキュベーションされた場合、ＹＡＣ−１細
胞の４０〜６０％の特異的溶解が２５：１という標的細
胞／エフェクター細胞比で得られる。ＮＫ非感受性であ
るＰ８１５細胞は、試験されたあらゆる条件下で溶解さ
れなかった。類似の濃度で培地内で別々に培養された２
つの細胞個体群（ＮＫ細胞及び樹枝状細胞）のいずれ
も、ＹＡＣ−１細胞の有意な溶解を誘発しなかった（図
２）。ＭＣＡ２０５、ＭＣＡ１０１、ＴＳ／Ａ又はＡＫ
７といったようなＭＨＣクラスＩで弱陽性のその他の腫
瘍細胞の分解も、活性化されたＮＫ細胞の存在下で観察
された（結果は示さず）。得られた結果は同様に、ＮＫ
−ＤＣの共存培養上清が、刺激性樹枝状細胞の数に応じ
て減少する有意なレベルのインターフェロンγを含有す
ることをも示している（図３）。これと逆に、別々に培
養されたＮＫ細胞の又は樹枝状細胞の上清の中には、イ
ンターフェロンγは検出できなかった。４０〜７０時間
の共存培養後にチミジンの取込みによって決定されるよ
うに、これらの共存培養条件下では有意な増殖は全く観
察されなかった。したがってこれらの結果は、インター
フェロンγの産生のためと同時に、時としてＫＩＲ効果
を超える腫瘍細胞に対する特異的溶解活性のため、ＮＫ
細胞の活性を刺激する未成熟及び成熟樹枝状細胞の能力
を例示している。
細胞系統が使用された。この系統は、未成熟段階での細
胞の長期にわたる成長及びその触発を可能にする培養条
件下に維持された。この系統は次に、２４時間ＴＮＦα
又はＬＰＳの存在下で成熟へと誘発された。成熟した細
胞は、以前にWinzler et alにより記載されたように、
重大な形態学的変化を呈する。集塊はもはや付着性をも
たず、ＦＡＣＳによる分析は、分子ＤＣ１１Ｃ、Ｉ−Ａ
ｂ、Ｂ７．２及びＤＣ４０の多大な発現を明らかにす
る。これらの成熟樹枝状細胞は上記のものと同じ条件下
で、異なる比率でＢ６−Ｒag-/-マウスにおいて収獲さ
れたばかりの休止状態のＮＫ細胞との４０〜４８時間の
同時インキュベーションにより試験された。得られた結
果は図２〜３に示されている。これらの結果は次のこと
を示している： − ２つの細胞型の共存培養は、別々のＮＫ細胞の培養
の場合に比べはるかに優れた形でウェル内に生存可能な
ＮＫ細胞を収獲することを可能にする（１０〜３０％対
２〜５％）。 − ＮＫ細胞及び樹枝状細胞が０．１〜０．３：１の比
率で同時インキュベーションされた場合、ＹＡＣ−１細
胞の４０〜６０％の特異的溶解が２５：１という標的細
胞／エフェクター細胞比で得られる。ＮＫ非感受性であ
るＰ８１５細胞は、試験されたあらゆる条件下で溶解さ
れなかった。類似の濃度で培地内で別々に培養された２
つの細胞個体群（ＮＫ細胞及び樹枝状細胞）のいずれ
も、ＹＡＣ−１細胞の有意な溶解を誘発しなかった（図
２）。ＭＣＡ２０５、ＭＣＡ１０１、ＴＳ／Ａ又はＡＫ
７といったようなＭＨＣクラスＩで弱陽性のその他の腫
瘍細胞の分解も、活性化されたＮＫ細胞の存在下で観察
された（結果は示さず）。得られた結果は同様に、ＮＫ
−ＤＣの共存培養上清が、刺激性樹枝状細胞の数に応じ
て減少する有意なレベルのインターフェロンγを含有す
ることをも示している（図３）。これと逆に、別々に培
養されたＮＫ細胞の又は樹枝状細胞の上清の中には、イ
ンターフェロンγは検出できなかった。４０〜７０時間
の共存培養後にチミジンの取込みによって決定されるよ
うに、これらの共存培養条件下では有意な増殖は全く観
察されなかった。したがってこれらの結果は、インター
フェロンγの産生のためと同時に、時としてＫＩＲ効果
を超える腫瘍細胞に対する特異的溶解活性のため、ＮＫ
細胞の活性を刺激する未成熟及び成熟樹枝状細胞の能力
を例示している。
【００９３】前述の経験と類似した形で、同種異系細胞
がＮＫ細胞の活性を刺激する能力を有しているというこ
とも立証された。簡単に言うと、０．１〜０．３：１の
ＮＫ：ＤＣ比で成熟樹枝状細胞の存在下で４０〜４８時
間の共存培養によりＳＣＩＤＢＡＬＢ／ｃマウスの非接
着性同種異系脾細胞が活性化された。結果は図２及び３
に紹介されており、これらの同種異系樹枝状細胞がＮＫ
細胞の溶解特性と同時にインターフェロンγの産性をも
活性化するということを示している。これらの結果全体
は、それが骨髄又は脾臓から誘導された樹枝状細胞であ
ろうと樹枝状細胞の確立された系統であろうと、自己由
来又は同種異系の成熟又は未成熟樹枝状細胞が、触発さ
れた時点でＮＫ細胞の溶解活性ならびにＮＫ細胞による
インターフェロンγの産生を共存培養によって有効に活
性化する能力を持つ、ということを明らかに示してい
る。
がＮＫ細胞の活性を刺激する能力を有しているというこ
とも立証された。簡単に言うと、０．１〜０．３：１の
ＮＫ：ＤＣ比で成熟樹枝状細胞の存在下で４０〜４８時
間の共存培養によりＳＣＩＤＢＡＬＢ／ｃマウスの非接
着性同種異系脾細胞が活性化された。結果は図２及び３
に紹介されており、これらの同種異系樹枝状細胞がＮＫ
細胞の溶解特性と同時にインターフェロンγの産性をも
活性化するということを示している。これらの結果全体
は、それが骨髄又は脾臓から誘導された樹枝状細胞であ
ろうと樹枝状細胞の確立された系統であろうと、自己由
来又は同種異系の成熟又は未成熟樹枝状細胞が、触発さ
れた時点でＮＫ細胞の溶解活性ならびにＮＫ細胞による
インターフェロンγの産生を共存培養によって有効に活
性化する能力を持つ、ということを明らかに示してい
る。
【００９４】例２： 樹枝状細胞によるＮＫ細胞の刺激
には、直接的細胞接触が関与する。成熟樹枝状細胞は、
ＮＫ細胞の活性化の原因となり得るＩＬ−１２、ＩＬ−
１５、ＩＦＮα／β又はＴＮＦαのような異なるサイト
カインを分泌するものとして知られている。樹枝状細胞
によるＮＫ細胞の活性化における可溶性因子の考えられ
る関与を決定するためには、「トランスウェル」培養系
が使用された。図４に紹介されている結果は、細胞溶解
活性及び樹枝状細胞に応えたＮＫ細胞によるインターフ
ェロンγの産生が、ＮＫ細胞が樹枝状細胞と接触した状
態で同時インキュベーションされる場合にのみ検出さ
れ、細胞を多孔性膜で分離した場合には検出されないこ
とを示している。したがって、これらの結果は、樹枝状
細胞によるＮＫ細胞の活性化には細胞と細胞の直接的接
触又は相互作用が必要であること、そしてこの活性化
は、樹枝状細胞の膜内に存在する同時刺激因子が関与し
ていることを示している。
には、直接的細胞接触が関与する。成熟樹枝状細胞は、
ＮＫ細胞の活性化の原因となり得るＩＬ−１２、ＩＬ−
１５、ＩＦＮα／β又はＴＮＦαのような異なるサイト
カインを分泌するものとして知られている。樹枝状細胞
によるＮＫ細胞の活性化における可溶性因子の考えられ
る関与を決定するためには、「トランスウェル」培養系
が使用された。図４に紹介されている結果は、細胞溶解
活性及び樹枝状細胞に応えたＮＫ細胞によるインターフ
ェロンγの産生が、ＮＫ細胞が樹枝状細胞と接触した状
態で同時インキュベーションされる場合にのみ検出さ
れ、細胞を多孔性膜で分離した場合には検出されないこ
とを示している。したがって、これらの結果は、樹枝状
細胞によるＮＫ細胞の活性化には細胞と細胞の直接的接
触又は相互作用が必要であること、そしてこの活性化
は、樹枝状細胞の膜内に存在する同時刺激因子が関与し
ていることを示している。
【００９５】例３： ＦＬ化合物による樹枝状細胞系統
の白血球の拡大には、Ｂ６−ヌードマウス又はＲag２Ｂ
６-/-において発生した陰性クラス１の腫瘍の退行が伴
う。ＡＫ７細胞は、脇腹内での長期間の発生後に腹腔内
に自発的に浸透する免疫原性の低いＢ６マウスの同系中
皮腫細胞系統を表す。こうして得られた腫瘍ＡＫ７は、
in vitroできわめて低いレベルのクラスＩの分子を発現
する。Ｂ６−ヌードマウスの体内で発生２０日目の腫瘍
ＡＫ７のＦＬ化合物による処置は、腫瘍成長の過渡的な
抑制そして最終的にin vivoでの有意な成長の遅延を誘
発する（図５参照）。逆にＦＬ化合物は、in vitroでＡ
Ｋ７細胞に対し直接的な細胞傷害性効果を全くもたらさ
ない。in vivoでのこれらの腫瘍効果は、樹枝状細胞系
統の白血球拡大に起因する脾腫及び腺腫が観察された、
ＦＬによる治療の１０日目に観察され始める。腫瘍成長
速度は、ＦＬ処置の停止後５〜１０日目に、樹枝状細胞
の数が減少した時点で通常のリズムをとり戻す。Ｂ６−
ヌード又はＲag２Ｂ６-/-マウスにおいて観察されたＦ
Ｌによって誘発された抗腫瘍効果は、免疫適合マウスに
おいて報告されたものと同じ位顕著であり（図７）、Ｔ
細胞及びＢ細胞のいずれも腫瘍成長の遅延に関与しない
ということを強調している。したがって、これらの結果
は、樹枝状細胞の成長因子の投与が陰性クラスＩ腫瘍の
退行を誘発することを立証している。これらの結果はさ
らに、この効果がＴ細胞又はＢ細胞の活性に起因するも
のでないということをも示している。
の白血球の拡大には、Ｂ６−ヌードマウス又はＲag２Ｂ
６-/-において発生した陰性クラス１の腫瘍の退行が伴
う。ＡＫ７細胞は、脇腹内での長期間の発生後に腹腔内
に自発的に浸透する免疫原性の低いＢ６マウスの同系中
皮腫細胞系統を表す。こうして得られた腫瘍ＡＫ７は、
in vitroできわめて低いレベルのクラスＩの分子を発現
する。Ｂ６−ヌードマウスの体内で発生２０日目の腫瘍
ＡＫ７のＦＬ化合物による処置は、腫瘍成長の過渡的な
抑制そして最終的にin vivoでの有意な成長の遅延を誘
発する（図５参照）。逆にＦＬ化合物は、in vitroでＡ
Ｋ７細胞に対し直接的な細胞傷害性効果を全くもたらさ
ない。in vivoでのこれらの腫瘍効果は、樹枝状細胞系
統の白血球拡大に起因する脾腫及び腺腫が観察された、
ＦＬによる治療の１０日目に観察され始める。腫瘍成長
速度は、ＦＬ処置の停止後５〜１０日目に、樹枝状細胞
の数が減少した時点で通常のリズムをとり戻す。Ｂ６−
ヌード又はＲag２Ｂ６-/-マウスにおいて観察されたＦ
Ｌによって誘発された抗腫瘍効果は、免疫適合マウスに
おいて報告されたものと同じ位顕著であり（図７）、Ｔ
細胞及びＢ細胞のいずれも腫瘍成長の遅延に関与しない
ということを強調している。したがって、これらの結果
は、樹枝状細胞の成長因子の投与が陰性クラスＩ腫瘍の
退行を誘発することを立証している。これらの結果はさ
らに、この効果がＴ細胞又はＢ細胞の活性に起因するも
のでないということをも示している。
【００９６】例４： ＦＬ化合物により媒介される抗腫
瘍効果は、ベージュマウスにおいて観察されず、腫瘍を
持つ免疫適合マウスにおいては、抗ＮＫ１．１モノクロ
ーナル抗体の投与によって遮断される。ＦＬによって誘
発される抗腫瘍効果のメカニズムをより精確に決定する
ような形で、ＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ベージュマウス
を、類似の治療体制に従ってＦＬにより処置した。Ｂ６
−ベージュマウスは、ＦＬの投与にも関わらず、死をひ
き起こすまで漸進的に肥大する中皮腫を呈する（図
６）。ＦＬにより誘発される殺腫瘍活性におけるＮＫ細
胞の関与をより精確に決定するような形で、抗ＮＫ１．
１モノクローナル抗体を使用することによりＢ６−免疫
適合マウスを枯渇させた。図７に紹介されている結果が
示すように、この枯渇は、ＦＬにより誘発された抗腫瘍
効果を完全に無効にするために必要かつ充分なものであ
る。したがって、これらの結果は、抗腫瘍剤としてのＦ
Ｌ化合物の効率においてＮＫ細胞が必要かつ充分な非常
に重要な役割を果たすということを示している。
瘍効果は、ベージュマウスにおいて観察されず、腫瘍を
持つ免疫適合マウスにおいては、抗ＮＫ１．１モノクロ
ーナル抗体の投与によって遮断される。ＦＬによって誘
発される抗腫瘍効果のメカニズムをより精確に決定する
ような形で、ＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ベージュマウス
を、類似の治療体制に従ってＦＬにより処置した。Ｂ６
−ベージュマウスは、ＦＬの投与にも関わらず、死をひ
き起こすまで漸進的に肥大する中皮腫を呈する（図
６）。ＦＬにより誘発される殺腫瘍活性におけるＮＫ細
胞の関与をより精確に決定するような形で、抗ＮＫ１．
１モノクローナル抗体を使用することによりＢ６−免疫
適合マウスを枯渇させた。図７に紹介されている結果が
示すように、この枯渇は、ＦＬにより誘発された抗腫瘍
効果を完全に無効にするために必要かつ充分なものであ
る。したがって、これらの結果は、抗腫瘍剤としてのＦ
Ｌ化合物の効率においてＮＫ細胞が必要かつ充分な非常
に重要な役割を果たすということを示している。
【００９７】例５： ＦＬ化合物は、in vivoで脾臓Ｎ
Ｋ活性を有意な形で増大させる。この例は、in vivoで
ＮＫ細胞の活性を増大させるＦＬ化合物の能力を例示し
ている。脾細胞及びリンパ神経節の単核細胞内でＦＡＣ
Ｓ分析により抗−ＮＫ１．１モノクローナル抗体で陽性
と標識されたＮＫ細胞の絶対数は、腫瘍を呈するマウス
において及び腫瘍無しのマウスにおいて３〜５倍わずか
に増大させられた。腫瘍ＡＫ７を呈する又は呈さないマ
ウスにおいてＦＬ化合物又は食塩水により処置されたＢ
６マウスの２０日目に収獲された脾細胞は、４時間にわ
たるクロム５１の塩析試験においてin vitroでＹＡＣ−
１細胞に対する自発的細胞溶解活性について試験され
た。ヌードマウス又は免疫適合マウスを用いて同時に実
施された異なる実験において、ＮＫ活性の有意な増大が
示されたもののインターフェロンγの産生の有意な増大
は示されず、腫瘍そのものの存在に帰することのできる
有意な効果はなかった（図８）。Ｐ８１５細胞に対して
はいかなる溶解も観察されなかった。そのうえ、血清又
は脾臓のリンパ神経節の単核細胞の培養上清の中のイン
ターフェロンγ及びＴＮＦαについてのサイトカインレ
ベルは、試験された全ての条件において統計的に異なっ
ておらず、ＩＬ−１β及びＩＬ−１２についていかなる
検出可能レベルも観察されなかった。したがってこれら
の結果は、ＦＬ化合物による処置がin vivoでの脾臓内
のＮＫ活性の増大と関連性を持つということを示してい
る。
Ｋ活性を有意な形で増大させる。この例は、in vivoで
ＮＫ細胞の活性を増大させるＦＬ化合物の能力を例示し
ている。脾細胞及びリンパ神経節の単核細胞内でＦＡＣ
Ｓ分析により抗−ＮＫ１．１モノクローナル抗体で陽性
と標識されたＮＫ細胞の絶対数は、腫瘍を呈するマウス
において及び腫瘍無しのマウスにおいて３〜５倍わずか
に増大させられた。腫瘍ＡＫ７を呈する又は呈さないマ
ウスにおいてＦＬ化合物又は食塩水により処置されたＢ
６マウスの２０日目に収獲された脾細胞は、４時間にわ
たるクロム５１の塩析試験においてin vitroでＹＡＣ−
１細胞に対する自発的細胞溶解活性について試験され
た。ヌードマウス又は免疫適合マウスを用いて同時に実
施された異なる実験において、ＮＫ活性の有意な増大が
示されたもののインターフェロンγの産生の有意な増大
は示されず、腫瘍そのものの存在に帰することのできる
有意な効果はなかった（図８）。Ｐ８１５細胞に対して
はいかなる溶解も観察されなかった。そのうえ、血清又
は脾臓のリンパ神経節の単核細胞の培養上清の中のイン
ターフェロンγ及びＴＮＦαについてのサイトカインレ
ベルは、試験された全ての条件において統計的に異なっ
ておらず、ＩＬ−１β及びＩＬ−１２についていかなる
検出可能レベルも観察されなかった。したがってこれら
の結果は、ＦＬ化合物による処置がin vivoでの脾臓内
のＮＫ活性の増大と関連性を持つということを示してい
る。
【００９８】例６： 抗−ＣＤ８αモノクローナル抗体
又はＣＴＬＡ４−Ｉｇモノクローナル抗体の投与による
ヌードマウスの枯渇は、ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果
を有意な形で遮断する。この例は、細胞溶解ＮＫ活性の
周辺増大及びＮＫ依存性の抗腫瘍効果における、ＦＬ化
合物により誘発された骨髄性又はリンパ球様樹枝状細胞
の亜個体群の役割について記載している。リンパ球様樹
枝状細胞は、in vitroでのＳＡＣ＋ＩＦＮγ刺激に反応
してＩＬ−１２を分泌するものとして記載されてきたこ
とから、ＩＬ−１２がＮＫ細胞の刺激因子であるかぎり
において、抗ＣＤ８αモノクローナル抗体を用いた陽性
ＣＤ８αリンパ球様樹枝状細胞（ＤＥＣ２０５＋）の選
択的枯渇が、Ｂ６−ヌードマウスにおいて行われた。枯
渇性モノクローナル抗体の注入は、ＦＬの存在下での分
化された樹枝状細胞（ＦＬ０日目）が現われると直ちに
開始され、高用量でのＦＬ処置の停止後最高１０日間続
行された。ＣＤ８α分子は、Ｂ６−ヌードマウスにおい
てマウスのＮＫ細胞上で発現されず、このため枯渇はリ
ンパ球様樹枝状細胞の亜個体群に標的化されることにな
る。抗−ＣＤ８αモノクローナル抗体で枯渇されたＡＫ
７腫瘍を持つマウスは、枯渇されていない対照マウス又
は抗ＣＤ４抗体の注射を受けたマウスに比べ、ＦＬ処置
に対する反応の有意性が低いものである（図９）。しか
しながら、ＦＬ化合物は、この化合物で処置されていな
い動物に比べて、ＦＬを受けかつ陽性ＣＤ８α細胞が枯
渇したマウスにおいて有効であり続けており、このこと
は、リンパ球様樹枝状細胞が、ＮＫ細胞に依存する抗腫
瘍効果に部分的にのみ関与するということを強調してい
る。ＣＤ４マーカーを発現する骨髄性樹枝状細胞の小さ
な個体群は、これらの抗腫瘍効果に参加しないと思われ
る（図９）。ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果における樹
枝状細胞の非常に重要な役割を確認するため、ＮＫ細胞
による認識のエフェクター段階に関与するものとして知
られている同時刺激分子Ｂ７を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇマウ
ス融合タンパク質の全身的注入を使用して標的化した。
ＣＴＬＡ４−Ｉｇの全投入期間中、腫瘍の成長の抑制に
対するＦＬの効率の統計的に有意な喪失が見られた（図
１０）。反対に、対照実験におけるヒトＩｇＧの注入が
in vivoでのＦＬの効率を変えることはなかった。ＡＫ
７腫瘍がin vitroでＢ７分子を発現しないということを
強調しなければならない。全体として、これらのデータ
は、陽性Ｂ７細胞及び／又は樹枝状細胞が、ＦＬ成長因
子により得られるＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果におい
て不可欠であること示している。
又はＣＴＬＡ４−Ｉｇモノクローナル抗体の投与による
ヌードマウスの枯渇は、ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果
を有意な形で遮断する。この例は、細胞溶解ＮＫ活性の
周辺増大及びＮＫ依存性の抗腫瘍効果における、ＦＬ化
合物により誘発された骨髄性又はリンパ球様樹枝状細胞
の亜個体群の役割について記載している。リンパ球様樹
枝状細胞は、in vitroでのＳＡＣ＋ＩＦＮγ刺激に反応
してＩＬ−１２を分泌するものとして記載されてきたこ
とから、ＩＬ−１２がＮＫ細胞の刺激因子であるかぎり
において、抗ＣＤ８αモノクローナル抗体を用いた陽性
ＣＤ８αリンパ球様樹枝状細胞（ＤＥＣ２０５＋）の選
択的枯渇が、Ｂ６−ヌードマウスにおいて行われた。枯
渇性モノクローナル抗体の注入は、ＦＬの存在下での分
化された樹枝状細胞（ＦＬ０日目）が現われると直ちに
開始され、高用量でのＦＬ処置の停止後最高１０日間続
行された。ＣＤ８α分子は、Ｂ６−ヌードマウスにおい
てマウスのＮＫ細胞上で発現されず、このため枯渇はリ
ンパ球様樹枝状細胞の亜個体群に標的化されることにな
る。抗−ＣＤ８αモノクローナル抗体で枯渇されたＡＫ
７腫瘍を持つマウスは、枯渇されていない対照マウス又
は抗ＣＤ４抗体の注射を受けたマウスに比べ、ＦＬ処置
に対する反応の有意性が低いものである（図９）。しか
しながら、ＦＬ化合物は、この化合物で処置されていな
い動物に比べて、ＦＬを受けかつ陽性ＣＤ８α細胞が枯
渇したマウスにおいて有効であり続けており、このこと
は、リンパ球様樹枝状細胞が、ＮＫ細胞に依存する抗腫
瘍効果に部分的にのみ関与するということを強調してい
る。ＣＤ４マーカーを発現する骨髄性樹枝状細胞の小さ
な個体群は、これらの抗腫瘍効果に参加しないと思われ
る（図９）。ＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果における樹
枝状細胞の非常に重要な役割を確認するため、ＮＫ細胞
による認識のエフェクター段階に関与するものとして知
られている同時刺激分子Ｂ７を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇマウ
ス融合タンパク質の全身的注入を使用して標的化した。
ＣＴＬＡ４−Ｉｇの全投入期間中、腫瘍の成長の抑制に
対するＦＬの効率の統計的に有意な喪失が見られた（図
１０）。反対に、対照実験におけるヒトＩｇＧの注入が
in vivoでのＦＬの効率を変えることはなかった。ＡＫ
７腫瘍がin vitroでＢ７分子を発現しないということを
強調しなければならない。全体として、これらのデータ
は、陽性Ｂ７細胞及び／又は樹枝状細胞が、ＦＬ成長因
子により得られるＮＫ細胞に依存する抗腫瘍効果におい
て不可欠であること示している。
【００９９】例７： インターロイキン１２は、ＦＬに
より誘発されるＮＫ抗腫瘍効果に関与しない。サイトカ
インＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、in vivoでＮＫ活性
を刺激するものとして知られているＴｈ１タイプのＴサ
イトカインである。そのうえ、前述の例で記載されたと
おり、ＩＬ−１２を分泌する能力を持つリンパ球用樹枝
状細胞の亜個体群は、観察された抗腫瘍効果にとって重
要なものである。血清又は単核細胞から誘導された脾臓
又はリンパ節の上清の中のＩＬ−１２レベルは、ＦＬに
よる処置を受けた動物において検出できないものであっ
たが、マウスには、ＦＬ処置の５日目から２０日目に至
るまで抗Ｐ４０ＩＬ−１２中和抗体を注射した。in viv
oでは、ＦＬにより誘発された抗腫瘍効果に対するこれ
らのモノクローナル抗体の阻害効果は全くみられなかっ
た（図１１）。これに対しin vivoでのインターフェロ
ンγの中和により、ＦＬにより媒介された抗腫瘍効果を
過渡的に遮断することが可能となり、このことはすなわ
ち、中皮腫がＩＦＮγ感受性を持つためにＮＫの細胞傷
害性がＩＦＮγにより媒介されることを暗に意味してい
る（図１２）。得られたその他の結果がこれらの観察を
裏づけている。特に、（ｉ）タイプ１のインターフェロ
ンのレセプターについてのノックアウトマウスは、常
に、本発明による樹枝状細胞により活性化可能なＮＫ細
胞を提示する、（ii）これらの共存培養の上清はＣＴＬ
Ｌ２を増殖させず、このことは、これらの条件下で産生
されたＩＬ−２又はＩＬ−１５の不在を証明している、
及び（iii）抗−ＩＦＮγ抗体はin vivoでＦＬ化合物の
活性をほとんど妨げない。
より誘発されるＮＫ抗腫瘍効果に関与しない。サイトカ
インＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、in vivoでＮＫ活性
を刺激するものとして知られているＴｈ１タイプのＴサ
イトカインである。そのうえ、前述の例で記載されたと
おり、ＩＬ−１２を分泌する能力を持つリンパ球用樹枝
状細胞の亜個体群は、観察された抗腫瘍効果にとって重
要なものである。血清又は単核細胞から誘導された脾臓
又はリンパ節の上清の中のＩＬ−１２レベルは、ＦＬに
よる処置を受けた動物において検出できないものであっ
たが、マウスには、ＦＬ処置の５日目から２０日目に至
るまで抗Ｐ４０ＩＬ−１２中和抗体を注射した。in viv
oでは、ＦＬにより誘発された抗腫瘍効果に対するこれ
らのモノクローナル抗体の阻害効果は全くみられなかっ
た（図１１）。これに対しin vivoでのインターフェロ
ンγの中和により、ＦＬにより媒介された抗腫瘍効果を
過渡的に遮断することが可能となり、このことはすなわ
ち、中皮腫がＩＦＮγ感受性を持つためにＮＫの細胞傷
害性がＩＦＮγにより媒介されることを暗に意味してい
る（図１２）。得られたその他の結果がこれらの観察を
裏づけている。特に、（ｉ）タイプ１のインターフェロ
ンのレセプターについてのノックアウトマウスは、常
に、本発明による樹枝状細胞により活性化可能なＮＫ細
胞を提示する、（ii）これらの共存培養の上清はＣＴＬ
Ｌ２を増殖させず、このことは、これらの条件下で産生
されたＩＬ−２又はＩＬ−１５の不在を証明している、
及び（iii）抗−ＩＦＮγ抗体はin vivoでＦＬ化合物の
活性をほとんど妨げない。
【０１００】例８： ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の発
生期又は腫瘍の成長２０日目の樹枝状細胞細胞の養子移
入は、腫瘍の成長に影響を及ぼす。樹枝状細胞の発達し
た個体群の独立したＮＫ活性の増大を報告することので
きる間接的な事象を全て完全に排除するような形で、ま
たＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の対話の直接的in vivo効
果を明確に試験するような形で、強いＮＫ活性を呈する
ものとして知られているＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ヌード
又はＳＣＩＤマウスに、ＡＫ７から１日目又は２０日目
以降２週間にわたり週２度の割合で未成熟樹枝状細胞を
２００〜５００万個皮下注射により受身移入させた。結
果は、図１３及び１４に示されており、対照群と比べ
て、樹枝状細胞により処置されたマウスの群における腫
瘍の成長の有意な遅延を示している。これらの結果は、
in vivoでのＮＫ細胞の活性の刺激における樹枝状細胞
の役目を明確に示している。
生期又は腫瘍の成長２０日目の樹枝状細胞細胞の養子移
入は、腫瘍の成長に影響を及ぼす。樹枝状細胞の発達し
た個体群の独立したＮＫ活性の増大を報告することので
きる間接的な事象を全て完全に排除するような形で、ま
たＮＫ細胞と樹枝状細胞の間の対話の直接的in vivo効
果を明確に試験するような形で、強いＮＫ活性を呈する
ものとして知られているＡＫ７腫瘍を持つＢ６−ヌード
又はＳＣＩＤマウスに、ＡＫ７から１日目又は２０日目
以降２週間にわたり週２度の割合で未成熟樹枝状細胞を
２００〜５００万個皮下注射により受身移入させた。結
果は、図１３及び１４に示されており、対照群と比べ
て、樹枝状細胞により処置されたマウスの群における腫
瘍の成長の有意な遅延を示している。これらの結果は、
in vivoでのＮＫ細胞の活性の刺激における樹枝状細胞
の役目を明確に示している。
【０１０１】例９： 異種間触発培地による未成熟樹枝
状細胞の触発 この例は、未成熟樹枝状細胞が、異種間培地の中で（因
子の存在下で）触発され得ること、そして、触発がその
成熟段階を改変しないことを例示する。８日間ＩＬ−４
＋ＧＭ−ＣＳＭ（ＣＭ）内で単球から誘導された５×１
０6個の未成熟ＤＣ（ＭＤ−ＤＣ）を、以下のものの存
在下で２４〜４８時間（８日目〜１０日目）培養した： − ４８時間培養された１０×１０6個の線維芽細胞Ｌ
−９２９の上清に対応する触発培地（最終培地の１／
３）及びＣＭ（最終培地の２／３）からなる培地； − 又は照射（５０００rads）を受けた１×１０6個の
線維芽細胞Ｌ−９２９の存在下で、ＣＭ培地内で。 ４８時間のインキュベーションの後、ＭＤ−ＤＣを回収
し、単独で又は、健康なドナーの血液から負の免疫的選
択により精製された同種異系のヒトＮＫ細胞の存在下で
共存培養した（培養比：１ＮＫに対し２ＤＣ，ＮＫ濃度
０．３×１０６個／ｍｌ）。その後ＤＣ／ＮＫの共存培
養又はＤＣ単独又はＮＣ単独の上清をＥＬＩＳＡにて評
価し、ＩＦＮγを測定した。これと並行して、共存培養
細胞を回収し、番号づけし、クロムを含む標的５１Ｃｒ
上に置いてそれらの溶解能を４時間にわたり評価した。
得られた結果は図１５〜１６に示されている。これらの
結果は明らかに、ＩＦＮγの分泌及び休止状態のＮＫ細
胞の溶解活性を活性化する触発済み未成熟樹枝状細胞の
高い能力を示している。
状細胞の触発 この例は、未成熟樹枝状細胞が、異種間培地の中で（因
子の存在下で）触発され得ること、そして、触発がその
成熟段階を改変しないことを例示する。８日間ＩＬ−４
＋ＧＭ−ＣＳＭ（ＣＭ）内で単球から誘導された５×１
０6個の未成熟ＤＣ（ＭＤ−ＤＣ）を、以下のものの存
在下で２４〜４８時間（８日目〜１０日目）培養した： − ４８時間培養された１０×１０6個の線維芽細胞Ｌ
−９２９の上清に対応する触発培地（最終培地の１／
３）及びＣＭ（最終培地の２／３）からなる培地； − 又は照射（５０００rads）を受けた１×１０6個の
線維芽細胞Ｌ−９２９の存在下で、ＣＭ培地内で。 ４８時間のインキュベーションの後、ＭＤ−ＤＣを回収
し、単独で又は、健康なドナーの血液から負の免疫的選
択により精製された同種異系のヒトＮＫ細胞の存在下で
共存培養した（培養比：１ＮＫに対し２ＤＣ，ＮＫ濃度
０．３×１０６個／ｍｌ）。その後ＤＣ／ＮＫの共存培
養又はＤＣ単独又はＮＣ単独の上清をＥＬＩＳＡにて評
価し、ＩＦＮγを測定した。これと並行して、共存培養
細胞を回収し、番号づけし、クロムを含む標的５１Ｃｒ
上に置いてそれらの溶解能を４時間にわたり評価した。
得られた結果は図１５〜１６に示されている。これらの
結果は明らかに、ＩＦＮγの分泌及び休止状態のＮＫ細
胞の溶解活性を活性化する触発済み未成熟樹枝状細胞の
高い能力を示している。
【０１０２】例１０： 樹枝状細胞から誘導された調製
物によるＮＫ細胞の活性化。この例は、樹枝状細胞から
誘導された調製物をＮＫ細胞の活性化のために使用でき
ることを例示する。特に、この例は、樹枝状細胞から産
生された膜小胞（又はデキソゾーム）がＮＫ細胞を活性
化することを示している。この例では、ＡＩＭＶ＋Peni
Strepto＋Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ＋１０００IU/
mlのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦという標準培地内で、転
移性腫瘍（黒色腫、骨髄腫、リンパ腫）を持つ被験者又
は健康な被験者の単球の接着性画分から、ヒトＭＤ−Ｄ
Ｃ細胞を培養した。５日目又は６日目に培地を交換し、
次に２４〜４８時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベ
ーションしたこれらのＭＤ−ＤＣの上清を０.２μmのフ
ィルターに通し、デキソゾームを分離するため７０，０
００ｇで超遠心分離した。材料及び方法（項目３及び
４）で記載されているとおりに、マウスのＢＭ−ＤＣを
培養し触発した。そのうえ、骨髄前駆体も代替的に１０
００IU/mlのＧＭ−ＣＳＦ単独にて培養した。ＤＣを６
日目まで培養し、デキソゾーム（ＤＥＸｍ）が由来する
培養物の上清を３日目から６日目まで蓄積させた。これ
らを次に、例えば特許出願ＦＲ９７０９００７及びＦＲ
９８０１４３７に記載されている手順に従って、又は示
差的超遠心分離により回収する。マウス及びヒトのＮＫ
細胞を、材料及び方法（項目５）で記載されているとお
りに収集した。ＮＫ細胞をデキソゾームの存在下におく
ためには、ＳＣＩＤ／ＢＡＬＢｃマウスの脾臓のＮＫ細
胞を、１５０万個／mlの濃度で円錐形の底を持つ９５ウ
ェルの平板内でインキュベーションした（これらの脾細
胞は３０％のＤＸ５＋ＮＫを含有する）。その後、デキ
ソゾームをウェルあたりエキソゾームタンパク質１０〜
２０μg（Bradford試験）の割合で添加し、細胞傷害性
（ＹＡＣ−１細胞に対する）及びインターフェロンγの
産生（マウス、ＩＦＮｇ、ＥＬＩＳＡで試験された上
清）試験を行うため、１８〜２０時間目に細胞を回収し
た。細胞傷害性及びインターフェロン測定試験を、材料
及び方法（項目７及び８）の中で記載されているとおり
に実施した。
物によるＮＫ細胞の活性化。この例は、樹枝状細胞から
誘導された調製物をＮＫ細胞の活性化のために使用でき
ることを例示する。特に、この例は、樹枝状細胞から産
生された膜小胞（又はデキソゾーム）がＮＫ細胞を活性
化することを示している。この例では、ＡＩＭＶ＋Peni
Strepto＋Ｌ−グルタミン＋１０％ＦＣＳ＋１０００IU/
mlのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦという標準培地内で、転
移性腫瘍（黒色腫、骨髄腫、リンパ腫）を持つ被験者又
は健康な被験者の単球の接着性画分から、ヒトＭＤ−Ｄ
Ｃ細胞を培養した。５日目又は６日目に培地を交換し、
次に２４〜４８時間３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベ
ーションしたこれらのＭＤ−ＤＣの上清を０.２μmのフ
ィルターに通し、デキソゾームを分離するため７０，０
００ｇで超遠心分離した。材料及び方法（項目３及び
４）で記載されているとおりに、マウスのＢＭ−ＤＣを
培養し触発した。そのうえ、骨髄前駆体も代替的に１０
００IU/mlのＧＭ−ＣＳＦ単独にて培養した。ＤＣを６
日目まで培養し、デキソゾーム（ＤＥＸｍ）が由来する
培養物の上清を３日目から６日目まで蓄積させた。これ
らを次に、例えば特許出願ＦＲ９７０９００７及びＦＲ
９８０１４３７に記載されている手順に従って、又は示
差的超遠心分離により回収する。マウス及びヒトのＮＫ
細胞を、材料及び方法（項目５）で記載されているとお
りに収集した。ＮＫ細胞をデキソゾームの存在下におく
ためには、ＳＣＩＤ／ＢＡＬＢｃマウスの脾臓のＮＫ細
胞を、１５０万個／mlの濃度で円錐形の底を持つ９５ウ
ェルの平板内でインキュベーションした（これらの脾細
胞は３０％のＤＸ５＋ＮＫを含有する）。その後、デキ
ソゾームをウェルあたりエキソゾームタンパク質１０〜
２０μg（Bradford試験）の割合で添加し、細胞傷害性
（ＹＡＣ−１細胞に対する）及びインターフェロンγの
産生（マウス、ＩＦＮｇ、ＥＬＩＳＡで試験された上
清）試験を行うため、１８〜２０時間目に細胞を回収し
た。細胞傷害性及びインターフェロン測定試験を、材料
及び方法（項目７及び８）の中で記載されているとおり
に実施した。
【０１０３】得られた結果は、図１７〜２５で示されて
いる。これらの結果は、未成熟で未触発の樹枝状細胞か
ら産生されたデキソゾームによるきわめて顕著な活性化
である、樹枝状細胞デキソゾームによるＮＫ細胞の活性
化を明確に示している。さらに、観察された活性化は、
ヒトデキソゾームがマウスＮＫ細胞を活性化することか
ら、種のバリアを交叉させる。より具体的に言うと、図
１７は、ＤＸ５＋ＮＫ１００万個あたり約２０μgの用
量で、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ内で培養されたマウス樹
枝状細胞（ＢＭ−ＤＣ）に由来するエキソゾーム調製物
により刺激されるＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスのＮＫ
（３０〜４０％のＤＸ５＋細胞すなわちＮＫ細胞を含む
脾細胞）によるマウスＩＦＮγの産生を示している。こ
の用量では、大部分のケースにおいてＢＭ−ＤＣの直接
的上清がＮＫの活性化に対し大きな影響を持つことはな
いのに対し、エキソゾームは、休止状態のＮＫの基本的
細胞傷害性（図１８）ならびにそのin vitroでの生存
（図１９）をも増大させる。図２０に示された結果はさ
らに、デキソゾームの投与後に「ヌード」マウスにおい
て腫瘍ＡＫ７の平均サイズが減少することを示している
ことから、in vivoでのこの活性を確認している。した
がって、これらの結果は、未成熟樹枝状細胞のエキソゾ
ームがＮＫの活性を刺激することを示す。これらの結果
は、同様に、活性化レベルがデキソゾームの濃度により
影響されること、そしてＮＫ細胞１０6個あたり１０μg
以上の用量が、in vitro及びex vivoでの活性化にとっ
て好ましいことをも示している。
いる。これらの結果は、未成熟で未触発の樹枝状細胞か
ら産生されたデキソゾームによるきわめて顕著な活性化
である、樹枝状細胞デキソゾームによるＮＫ細胞の活性
化を明確に示している。さらに、観察された活性化は、
ヒトデキソゾームがマウスＮＫ細胞を活性化することか
ら、種のバリアを交叉させる。より具体的に言うと、図
１７は、ＤＸ５＋ＮＫ１００万個あたり約２０μgの用
量で、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ内で培養されたマウス樹
枝状細胞（ＢＭ−ＤＣ）に由来するエキソゾーム調製物
により刺激されるＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウスのＮＫ
（３０〜４０％のＤＸ５＋細胞すなわちＮＫ細胞を含む
脾細胞）によるマウスＩＦＮγの産生を示している。こ
の用量では、大部分のケースにおいてＢＭ−ＤＣの直接
的上清がＮＫの活性化に対し大きな影響を持つことはな
いのに対し、エキソゾームは、休止状態のＮＫの基本的
細胞傷害性（図１８）ならびにそのin vitroでの生存
（図１９）をも増大させる。図２０に示された結果はさ
らに、デキソゾームの投与後に「ヌード」マウスにおい
て腫瘍ＡＫ７の平均サイズが減少することを示している
ことから、in vivoでのこの活性を確認している。した
がって、これらの結果は、未成熟樹枝状細胞のエキソゾ
ームがＮＫの活性を刺激することを示す。これらの結果
は、同様に、活性化レベルがデキソゾームの濃度により
影響されること、そしてＮＫ細胞１０6個あたり１０μg
以上の用量が、in vitro及びex vivoでの活性化にとっ
て好ましいことをも示している。
【０１０４】なお、図２１に示されている結果は、ヒト
樹枝状細胞のデキソゾームについてのこれらの観察を確
認している。この実験において、ＭＤ−ＤＣは約９日間
ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦの中で培養された。基本的に未
成熟状態にあるこれらの細胞により分泌されたエキソゾ
ーム（ＤＥＸｈ）は、７日目から９日目まで又は６日目
から８日目まで回収された。これらのヒトデキソゾーム
（ＤＥＸｈ）は、マウスＮＫ細胞の存在下で前述の条件
で、ＮＫ細胞１００万個あたり２０〜４０μgの用量で
インキュベーションされた。得られた結果は、ＩＦＮγ
の産生の刺激を示し、ＮＫ細胞の活性化を明らかにして
いる。なお、図２２〜２３に示されている結果は、ベー
タ２−ミクログロブリン（古典的又は類似のクラスＩの
ＭＨＣ分子）の遺伝子又はクラスIIのＭＨＣの分子が欠
損したマウス（「ノックアウト」）から由来するマウス
ＤＣのエキソゾームが、ＩＦＮγの産生のために休止状
態のＮＫを刺激するその能力を保持する、ということを
示している。これらの結果は、（ｉ）デキソゾームの刺
激活性を確認し、（ii）刺激因子が（ＫＩＲｓ−キラー
阻害レセプター、小又はＫＩＲｌ−キラー阻害レセプタ
ー、長の系統群のいくつかの要素とは異なり）クラスＩ
のＭＨＣの分子であると思われない、ということを表し
ている。得られた結果は特に、ベータ２ミクログロブリ
ン-/-Ｋ.Ｏ（図２２）又はクラスII. Ｋ.Ｏ.マウス（図
２３）に由来するＤＣのデキソゾームで刺激されたＮＫ
によるＩＦＮ−γの産生が強いことを示す。ＮＫの刺激
は、同様に、樹枝状細胞全体を使用することによっても
観察された。
樹枝状細胞のデキソゾームについてのこれらの観察を確
認している。この実験において、ＭＤ−ＤＣは約９日間
ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦの中で培養された。基本的に未
成熟状態にあるこれらの細胞により分泌されたエキソゾ
ーム（ＤＥＸｈ）は、７日目から９日目まで又は６日目
から８日目まで回収された。これらのヒトデキソゾーム
（ＤＥＸｈ）は、マウスＮＫ細胞の存在下で前述の条件
で、ＮＫ細胞１００万個あたり２０〜４０μgの用量で
インキュベーションされた。得られた結果は、ＩＦＮγ
の産生の刺激を示し、ＮＫ細胞の活性化を明らかにして
いる。なお、図２２〜２３に示されている結果は、ベー
タ２−ミクログロブリン（古典的又は類似のクラスＩの
ＭＨＣ分子）の遺伝子又はクラスIIのＭＨＣの分子が欠
損したマウス（「ノックアウト」）から由来するマウス
ＤＣのエキソゾームが、ＩＦＮγの産生のために休止状
態のＮＫを刺激するその能力を保持する、ということを
示している。これらの結果は、（ｉ）デキソゾームの刺
激活性を確認し、（ii）刺激因子が（ＫＩＲｓ−キラー
阻害レセプター、小又はＫＩＲｌ−キラー阻害レセプタ
ー、長の系統群のいくつかの要素とは異なり）クラスＩ
のＭＨＣの分子であると思われない、ということを表し
ている。得られた結果は特に、ベータ２ミクログロブリ
ン-/-Ｋ.Ｏ（図２２）又はクラスII. Ｋ.Ｏ.マウス（図
２３）に由来するＤＣのデキソゾームで刺激されたＮＫ
によるＩＦＮ−γの産生が強いことを示す。ＮＫの刺激
は、同様に、樹枝状細胞全体を使用することによっても
観察された。
【０１０５】最後に、図２４〜２５は、樹枝状細胞の刺
激活性とそれが分泌するエキソゾームの間の或る種の相
関関係を示す。したがって、示されている結果は、活性
のきわめて高い樹枝状細胞（例えば成熟、場合によって
は触発済み）が、より活性の低いデキソゾームを分泌す
ることを示している。逆に、より低い活性を示す樹枝状
細胞（例えば未成熟で未触発の樹枝状細胞）はきわめて
活性の高いデキソゾームを分泌する。したがってこれら
の要素は樹枝状細胞の状態に応じて、内部膜小胞から外
部原形質膜までの刺激因子の移入を示唆している。より
具体的に言うと、図２４は、ＧＭ−ＣＳＦ及び低用量の
インターロイキン−４（１×）の存在下で培養されたＤ
Ｃのエキソゾームが、ＧＭ−ＣＳＦ及び高用量のＩＬ−
４（５×）の存在下で培養されたＤＣに由来するそのホ
モログに比べ、はるかに有意にＮＫを刺激するのに対
し、それらが誘導されたＤＣについては状況は逆であ
る、ということを示している。同様に、図２５は（Ｌ９
２９の上清中で）触発済みＢＭ−ＤＣ細胞により分泌さ
れたマウスのエキソゾームが、未触発のＢＭ−ＤＣに由
来するそのホモログほど有意にＮＫを刺激せず、それら
が由来したＤＣについては状況が逆転するということを
示している。これに匹敵する結果が、ヒト樹枝状細胞を
用いても得られた。
激活性とそれが分泌するエキソゾームの間の或る種の相
関関係を示す。したがって、示されている結果は、活性
のきわめて高い樹枝状細胞（例えば成熟、場合によって
は触発済み）が、より活性の低いデキソゾームを分泌す
ることを示している。逆に、より低い活性を示す樹枝状
細胞（例えば未成熟で未触発の樹枝状細胞）はきわめて
活性の高いデキソゾームを分泌する。したがってこれら
の要素は樹枝状細胞の状態に応じて、内部膜小胞から外
部原形質膜までの刺激因子の移入を示唆している。より
具体的に言うと、図２４は、ＧＭ−ＣＳＦ及び低用量の
インターロイキン−４（１×）の存在下で培養されたＤ
Ｃのエキソゾームが、ＧＭ−ＣＳＦ及び高用量のＩＬ−
４（５×）の存在下で培養されたＤＣに由来するそのホ
モログに比べ、はるかに有意にＮＫを刺激するのに対
し、それらが誘導されたＤＣについては状況は逆であ
る、ということを示している。同様に、図２５は（Ｌ９
２９の上清中で）触発済みＢＭ−ＤＣ細胞により分泌さ
れたマウスのエキソゾームが、未触発のＢＭ−ＤＣに由
来するそのホモログほど有意にＮＫを刺激せず、それら
が由来したＤＣについては状況が逆転するということを
示している。これに匹敵する結果が、ヒト樹枝状細胞を
用いても得られた。
【０１０６】したがってこれらの結果全体は、（ｉ）デ
キソゾームが休止状態のＮＫ細胞の活性を刺激する能力
を持つこと、（ii）最も活性の高いデキソゾームは、よ
り活性の低いつまり不活性の（そして場合によっては未
触発の）樹枝状細胞により産生されると思われること、
（iii）デキソゾームによる活性化が種のバリアを交叉
させること、（iv）ＮＫ活性化の原因となる刺激因子が
ＤＥＸの表面にあり、同時刺激（もう１つの膜因子又は
サイトカイン）を伴って又は伴わずに直接ＮＫに提示さ
れること、そして（ｖ）刺激因子は、クラスＩのＭＨＣ
分子であると思われないことを示している。したがって
これらの結果は、in vitro、ex vivo又はin vivoでのＮ
Ｋの活性化のためのデキソゾームの使用を支持してい
る。
キソゾームが休止状態のＮＫ細胞の活性を刺激する能力
を持つこと、（ii）最も活性の高いデキソゾームは、よ
り活性の低いつまり不活性の（そして場合によっては未
触発の）樹枝状細胞により産生されると思われること、
（iii）デキソゾームによる活性化が種のバリアを交叉
させること、（iv）ＮＫ活性化の原因となる刺激因子が
ＤＥＸの表面にあり、同時刺激（もう１つの膜因子又は
サイトカイン）を伴って又は伴わずに直接ＮＫに提示さ
れること、そして（ｖ）刺激因子は、クラスＩのＭＨＣ
分子であると思われないことを示している。したがって
これらの結果は、in vitro、ex vivo又はin vivoでのＮ
Ｋの活性化のためのデキソゾームの使用を支持してい
る。
【図１】未成熟樹枝状細胞はin vitroでＮＫ活性を刺激
することを示す。
することを示す。
【図２】成熟した脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞の
細胞溶解活性を刺激することを示す。
細胞溶解活性を刺激することを示す。
【図３】成熟した脾臓由来の樹枝状細胞は、ＮＫ細胞に
よるＩＦＮγの産生を刺激することを示す。
よるＩＦＮγの産生を刺激することを示す。
【図４】活性化にはＮＫ細胞と樹枝状細胞の接触が関与
することを示す。
することを示す。
【図５】腫瘍ＡＫ７を有するＢ６ヌードマウスにおける
ＦＬの投与は腫瘍の成長の抑制を誘発することを示す。
ＦＬの投与は腫瘍の成長の抑制を誘発することを示す。
【図６】ＦＬにより誘発される抗腫瘍効果はＮＫ細胞に
依存することを示す。
依存することを示す。
【図７】ＦＬにより誘発される抗腫瘍効果はＮＫ細胞に
依存することを示す。
依存することを示す。
【図８】ＦＬによる治療にはマウスＢ６の脾臓において
増大したＮＫ活性を伴うことを示す。
増大したＮＫ活性を伴うことを示す。
【図９】Ｂ６ヌードマウスにおける抗ＣＤ８α抗体また
は抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験を示す
は抗ＣＤ４抗体を用いたin vivoでの枯渇実験を示す
【図１０】in vivoでのＣＴＬ４Ｉｇの同時投与を示
す。
す。
【図１１】in vivoでの抗ｐ４０−ｍＩＬ−１２のモノ
クローナル抗体の同時投与を示す。
クローナル抗体の同時投与を示す。
【図１２】in vivoでの抗ＩＦＮγモノクローナル抗体
の同時投与を示す。
の同時投与を示す。
【図１３】ＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウスにおけ
る脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の予防的抗腫瘍効果
を示す。
る脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の予防的抗腫瘍効果
を示す。
【図１４】ＡＫ７腫瘍を有するＢ６ヌードマウスにおけ
る脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の治療的抗腫瘍効果
を示す。
る脾臓由来の樹枝状細胞の養子移入の治療的抗腫瘍効果
を示す。
【図１５】触発された未成熟樹枝状細胞による、ヒトＮ
Ｋ細胞の活性化（ＩＦＮγの測定）。
Ｋ細胞の活性化（ＩＦＮγの測定）。
【図１６】触発された未成熟樹枝状細胞による、ヒトＮ
Ｋ細胞の活性化（遊離クロムの測定）。
Ｋ細胞の活性化（遊離クロムの測定）。
【図１７】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウス
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＩＦＮγの測定）。
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＩＦＮγの測定）。
【図１８】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウス
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＹＡＣ１細胞の細胞
溶解の測定）。
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＹＡＣ１細胞の細胞
溶解の測定）。
【図１９】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウス
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＮＫ細胞の生存率の
測定）。
ＮＫ細胞を活性化することを示す（ＮＫ細胞の生存率の
測定）。
【図２０】マウス樹枝状細胞のエキソゾームは、マウス
ＮＫ細胞を活性化することを示す（in vivoでの腫瘍の
平均サイズの測定）。
ＮＫ細胞を活性化することを示す（in vivoでの腫瘍の
平均サイズの測定）。
【図２１】ヒト樹枝状細胞のエキソゾームは休止状態の
マウスのＮＫ細胞を活性化させることを示す。
マウスのＮＫ細胞を活性化させることを示す。
【図２２】β−２−ミクログロブリンについてのＫＯマ
ウスの樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活
性化することを示す。
ウスの樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活
性化することを示す。
【図２３】クラスIIＭＨＣ分子についてのＫＯマウスの
樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活性化す
ることを示す。
樹枝状細胞のエキソゾームはマウスＮＫ細胞を活性化す
ることを示す。
【図２４】低用量または高用量のＩＬ−４で産生された
樹枝状細胞と、それが産生するデキソゾームの活性の比
較を示す。
樹枝状細胞と、それが産生するデキソゾームの活性の比
較を示す。
【図２５】触発済みまたは未触発の樹枝状細胞と、それ
が産生するデキソゾームの活性の比較を示す。
が産生するデキソゾームの活性の比較を示す。
Claims (42)
- 【請求項１】 樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導され
た調製物とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をin vitro又
はex vivoで接触させることを含むことを特徴とする、
ＮＫ細胞の活性化方法。 - 【請求項２】 樹枝状細胞が成熟樹枝状細胞である請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 樹枝状細胞が未成熟樹枝状細胞である請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 樹枝状細胞及びＮＫ細胞が自己由来のも
のである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 樹枝状細胞及びＮＫ細胞が同種異系のも
のである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 樹枝状細胞が触発された細胞である請求
項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 ＮＫ細胞に対する樹枝状細胞の比（ＮＫ
細胞／樹枝状細胞比）が０．０１〜１０好ましくは０．
０５〜５の範囲にある請求項１〜６のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項８】 樹枝状細胞及びＮＫ細胞の共存培養物。
- 【請求項９】 活性化された又は休止状態のＮＫ細胞及
び自己由来の樹枝状細胞を含む組成物。 - 【請求項１０】 請求項１に記載の方法により活性化さ
れたＮＫ細胞を含む組成物。 - 【請求項１１】 in vitro又はex vivoでＮＫ細胞を活
性化するための、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導さ
れた調製物の使用。 - 【請求項１２】 in vivoでＮＫ細胞を活性化させるこ
とを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞又は
樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。 - 【請求項１３】 in vivoでＮＫ細胞の細胞溶解活性を
活性化させることを目的とする組成物の調製のための樹
枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の使用。 - 【請求項１４】 in vivoでＮＫ細胞によるＩＦＮγの
産生を増大させることを目的とする組成物の調製のため
の、樹枝状細胞又は樹枝状細胞から誘導された調製物の
使用。 - 【請求項１５】 樹枝状細胞が成熟樹枝状細胞である請
求項１１〜１４に記載の使用。 - 【請求項１６】 樹枝状細胞が未成熟樹枝状細胞である
請求項１１〜１４に記載の使用。 - 【請求項１７】 樹枝状細胞が触発された樹枝状細胞で
ある請求項１１〜１６に記載の使用。 - 【請求項１８】 樹枝状細胞が単数又は複数の抗原に感
作されている請求項１１〜１７に記載の使用。 - 【請求項１９】 in vivoでＮＫ細胞を活性化させるこ
とを目的とする組成物の調製のための、樹枝状細胞の成
長因子の使用。 - 【請求項２０】 成長因子がＦＬ化合物である請求項１
９に記載の使用。 - 【請求項２１】 樹枝状細胞から誘導された、ＮＫ細胞
の刺激因子を含む組成物。 - 【請求項２２】 樹枝状細胞とＮＫ細胞の間の相互作用
に干渉する能力を持つ化合物を含む組成物。 - 【請求項２３】 in vivoでＮＫ細胞を活性化すること
を目的とする組成物の調製のための、請求項２１に記載
の因子の使用。 - 【請求項２４】 in vivoでＮＫ細胞の活性化の負の制
御を行うことを目的とする組成物の調製のための請求項
２２に記載の化合物の使用。 - 【請求項２５】 腫瘍治療用薬剤の調製のための、樹枝
状細胞又は請求項９又は１０に記載の組成物の使用。 - 【請求項２６】 感染細胞治療用薬剤の調製のための、
樹枝状細胞又は請求項９又は１０に記載の組成物の使
用。 - 【請求項２７】 腫瘍又は感染細胞の治療用薬剤の調製
のための請求項２１に記載の組成物の使用。 - 【請求項２８】 移植片拒絶又は移植片対宿主病（ＧＶ
ＨＤ）の予防処置用薬剤の調製のための、請求項２２に
記載の組成物の使用。 - 【請求項２９】 ＮＫ活性のin situ増大により陰性又
は弱陽性のクラスＩの腫瘍の治療用組成物を調製するた
めの、樹枝状細胞成長因子の使用。 - 【請求項３０】 ＮＫリンパ球亜個体群の生存又は増殖
を増大させることを目的とする組成物の調製のための樹
枝状細胞の膜因子の使用。 - 【請求項３１】 成熟樹枝状細胞の生存を増大させるこ
とを目的とする組成物の調製のためのＮＫ細胞の膜因子
の使用。 - 【請求項３２】 ＮＫ細胞の活性化を阻害することを目
的とする組成物の調製のための寛容原性表現型の樹枝状
細胞又は寛容原性樹枝状細胞から誘導された産物の使
用。 - 【請求項３３】 ＮＫ細胞を刺激するその能力を改善す
る（又は誘発する）ことができる、触発培地と樹枝状細
胞の接触を含む、樹枝状細胞処理方法。 - 【請求項３４】 同時に又は時間的に分離した又は間隔
をあけた形態で使用するための、少なくとも１つの樹枝
状細胞触発因子及び樹枝状細胞成長因子を含む組成物。 - 【請求項３５】 特に人間の触発された樹枝状細胞を含
む組成物。 - 【請求項３６】 細胞外基質の細胞、そのような細胞か
ら誘導された調製物又はそのような細胞から誘導された
因子を含むことを特徴とする、樹枝状細胞触発培地。 - 【請求項３７】 樹枝状細胞から誘導された調製物が膜
小胞を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３８】 膜小胞が未成熟樹枝状細胞から産生さ
れる請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 樹枝状細胞から誘導された調製物が、
膜小胞を含む請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の
使用。 - 【請求項４０】 in vitro、ex vivo又はin vivoでＮＫ
細胞の活性を刺激するための組成物を調製するための、
樹枝状細胞から産生された膜小胞の使用。 - 【請求項４１】 膜画分を含む生体材料とＮＫ細胞の個
体群との接触、ＮＫ細胞の活性化の立証及び生体材料内
に存在する活性化因子の分離を含む、ＮＫ細胞の刺激因
子の同定及び／又は調製方法。 - 【請求項４２】 試験化合物あるいは単数又は複数の試
験化合物を含む組成物を、休止状態のＮＫ細胞及び樹枝
状細胞又はエキソゾーム、又は請求項２１に記載のＮＫ
刺激因子と共にインキュベーションする工程、ＮＫ細胞
の活性化を測定する工程及びＮＫ細胞の活性化を阻害す
る（すなわち低減させる）能力を持つ化合物／組成物を
選択する工程を含む、ＮＫ細胞の活性化を阻害する能力
を持つ化合物の同定方法。
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