KR20230038350A - 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 t 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 생물학적 조성물 - Google Patents
수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 t 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 생물학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함함으로써 각 세포를 단독으로 이용하는 경우에 비해 우수한 항암 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 약학 조성물이 서로 공동 배양된 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 경우 또는 사이토카인이 첨가된 배양액에서 서로 공동 배양된 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 경우, 각 세포를 단독 혹은 단순 혼합으로 이용하는 경우에 비해 우수한 항암 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 한국인에서 사망률 1위를 차지하고 꾸준히 발생률이 증가하고 있는 질병으로 암 환자의 경제활동 중지, 치료비용, 사망 등으로 인해 해마다 한국 경제에 엄청난 손실을 초래하고 있어 적절한 진단 및 치료 방법의 개발이 중요하다. 암의 전통적인 치료법은 수술, 방사선 치료 및 화학적 항암 요법 등이 있으나 방사선 치료 및 화학적 항암 요법의 경우 심한 부작용을 야기하는 문제점이 대두되어 왔으며 암이 재발이 되어 진행된 경우에는 기존의 치료법으로는 치료가 힘들 수도 있다. 본 발명에서는 암의 특징 중의 하나인 면역 세포를 이용하여 암 세포를 사멸시키는 것을 목적으로 하는 치료법 중 하나인 면역세포치료법을 개발하고자 한다.
현재 다양한 암에서 임상 연구 진행 중인 면역세포치료제는 크게 자연 살해 세포, 수지상세포, T 세포 등이 있다. 하지만 극히 일부의 환자만이 위 치료에 반응하여 완전관해를 보이고 대부분의 경우 면역세포치료의 암세포 살상기전을 회피하여 성공률이 높지 않다. 최근 연구에서 자연 살해 세포, 수지상세포 및 T 세포의 각 세포간의 상호작용이 보고되고 있다. 자연 살해 세포는 직간접적인 방법으로 T 세포의 반응을 조절하며 수지상세포가 자연 살해 세포의 세포 융해 기능을 강화시키며 자연 살해 세포가 케모카인을 분비하여 수지상세포의 기능을 보조한다. 또한, 암세포는 자기 인식 마커인 주조직 적합성 복합체를 100% 발현하지는 않는다. 이런 경우는 적응 면역계의 T세포 요법만으로는 안되며 자연 면역계인 자연 살해 세포의 복합 치료가 필요하다. 이러한 상호작용을 살펴보았을 때, 면역세포치료의 병용 치료의 필요성이 대두되어 최근 새로운 임상시험이나 논문에서 복수의 세포치료를 병행하여 그 효과를 관찰한 결과를 보고하고 있다. 그러나 단순히 자연 살해 세포나 T 세포의 단순 배합에 의한 치료는 그 동안 본 발명자들의 연구 결과에는 효과가 크게 없었다. 그러나, 이 세포들의 특수 배양 실험을 통해 좋은 결과를 얻었다. 본 발명에서는 수지상세포, 자연 살해 세포, T 세포를 동시에 병용 처리하여 항암 효과를 발현하고자 한다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 상기 암의 예방 또는 치료 대상으로부터 유래된 것인, 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포의 수의 비율은 0.01:1 내지 0.03:1인 것인, 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포의 수의 비율은 8:1 내지 12:1인 것인, 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 것인, 약학 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 약학 조성물.
7. 위 5에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 약학 조성물.
8. 위 6에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 약학 조성물.
9. 위 6에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL인, 약학 조성물.
10. 위 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포는 서로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
11. 위 10에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포는 0.01:1 내지 0.03:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포는 8:1 내지 12:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
13. 위 10에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 세포 독성 T세포는 0.01:10 내지 0.03:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
14. 위 1에 있어서, 상기 암은 고형암인, 약학 조성물.
15. 위 14에 있어서, 상기 고형암은 대장암, 담관암, 위암, 폐암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포폐암, 비소세포폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 약학 조성물.
16. (a) 암 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 CD14+ 단핵 세포 및 CD14- 단핵 세포를 분리하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 자연 살해 세포를 증폭 배양하는 단계;
(d) 상기 CD14+ 단핵 세포로부터 미성숙 수지상 세포를 분화시키는 단계;
(e) 상기 CD14- 단핵 세포로부터 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 분리하는 단계;
(f) 상기 미성숙 수지상 세포에 상기 암 환자로부터 분리된 종양 항원을 처리하여 성숙 수지상 세포를 수득하는 단계;
(g) 상기 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 상기 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 공동 배양하여 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계; 및
(h) 상기 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계에 이용되지 않은 성숙 수지상 세포, 상기 세포 독성 T 세포 및 상기 자연 살해 세포를 공동 배양하여 사전 활성화(pre-activation)하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
17. 위 16에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 것인, 제조 방법.
18. 위 17에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
19. 위 17에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
20. 위 18에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
21. 위 18에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL인, 제조 방법.
22. 위 16에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상기 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 상기 CD8+ 나이브(naive) T 세포는 1:8 내지 1:12의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
23. 위 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 성숙 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포는 0.01:1 내지 0.03:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
24. 위 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포는 8:1 내지 12:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
25. 위 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 성숙 수지상 세포 및 상기 세포 독성 T세포는 0.01:10 내지 0.03:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
26. 위 16에 있어서, 상기 (h) 단계의 공동 배양은 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 제조 방법.
27. 위 26에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
28. 위 26에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
29. 위 27에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
30. 위 27에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL인, 제조 방법.
31. 위 16에 있어서, 상기 암은 고형암인, 제조 방법.
32. 위 31에 있어서, 상기 고형암은 대장암, 담관암, 위암, 폐암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포폐암, 비소세포폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 제조 방법.
33. 위 16에 있어서, 상기 종양 항원은 상기 암 환자 조직 유래 단백질 추출물 또는 유전체 분석을 통해 수득한 신생 항원 펩타이드인, 제조 방법.
본 발명의 약학 조성물은 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하여, 각 세포를 단독으로 이용하는 경우에 비해 우수한 항암 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 약학 조성물이 서로 공동 배양된 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 경우, 각 세포를 단독 혹은 단순 혼합으로 이용하는 경우에 비해 우수한 항암 효과를 나타낸다.
도 1은 제조예의 제조 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 성숙 수지상 세포에서 미성숙 수지상 세포에 비해 IL-12(p70) 분비량이 증가한 것을 확인한 결과이다.
도 3은 성숙 수지상 세포와 공동 배양한 CD8+ naive T 세포에서 공동 배양하지 않은 T 세포에 비해 IFN-γ 발현 정도가 높은 것을 확인한 결과이다.
도 4는 성숙 수지상 세포와 공동 배양하여 활성화된 CD8+ naive T 세포의 배양 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 자연 살해 세포 배양 과정에 따른 activating receptor 또는 inhibitory receptor 발현 세포 군집을 나타낸 것이다.
도 6 내지 10은 실시예 1 내지 실시예 4에서 단독의 수지상 세포, 자연 살해 세포 또는 세포 독성 T 세포를 처리한 경우에 비해 세 가지 세포를 병용 처리한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
도 10 내지 12는 실시예 5(도 10 및 도 11) 및 실시예 6(도 12)에서 단독의 수지상 세포, 자연 살해 세포 또는 세포 독성 T 세포에 비해 세 가지 세포를 병용 처리한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것과 사이토카인 pre-activation을 수행하지 않은 경우에 비해 수행한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
도 2는 성숙 수지상 세포에서 미성숙 수지상 세포에 비해 IL-12(p70) 분비량이 증가한 것을 확인한 결과이다.
도 3은 성숙 수지상 세포와 공동 배양한 CD8+ naive T 세포에서 공동 배양하지 않은 T 세포에 비해 IFN-γ 발현 정도가 높은 것을 확인한 결과이다.
도 4는 성숙 수지상 세포와 공동 배양하여 활성화된 CD8+ naive T 세포의 배양 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 자연 살해 세포 배양 과정에 따른 activating receptor 또는 inhibitory receptor 발현 세포 군집을 나타낸 것이다.
도 6 내지 10은 실시예 1 내지 실시예 4에서 단독의 수지상 세포, 자연 살해 세포 또는 세포 독성 T 세포를 처리한 경우에 비해 세 가지 세포를 병용 처리한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
도 10 내지 12는 실시예 5(도 10 및 도 11) 및 실시예 6(도 12)에서 단독의 수지상 세포, 자연 살해 세포 또는 세포 독성 T 세포에 비해 세 가지 세포를 병용 처리한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것과 사이토카인 pre-activation을 수행하지 않은 경우에 비해 수행한 경우 암 세포 사멸 효과가 우수하다는 것을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함한다.
본 발명의 조성물은 세 종류의 면역 세포를 포함함으로써 각 세포를 단독으로 이용하는 경우나 두 종류의 세포를 이용하는 경우에 비해 우수한 암의 예방 또는 치료 효과가 있다.
수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 상기 암의 예방 또는 치료 대상으로부터 유래된 것일 수 있다.
수지상 세포 및 자연 살해 세포의 수의 비율은 예를 들면, 0.01:1 내지 0.03:1, 0.015:1 내지 0.025:1 또는 0.018:1 내지 0.022:1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포 독성 T세포 및 자연 살해 세포의 수의 비율은 예를 들면, 8:1 내지 12:1, 8.5:1 내지 11.5:1 또는 9:1 내지 11:1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 것일 수 있다. 상기 세 종류의 면역 세포 중 적어도 하나가 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 경우, 보다 우수한 암의 예방 또는 치료 효과가 있다. 사이토카인은 예를 들면, IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인의 농도는 예를 들면, 40 U/mL 내지 5000 U/mL, 60 U/mL 내지 5000 U/mL, 80 U/mL 내지 5000 U/mL, 100 U/mL 내지 5000 U/mL, 200 U/mL 내지 4200 U/mL, 400 U/mL 내지 3200 U/mL, 600 U/mL 내지 2200 U/mL, 800 U/mL 내지 1200 U/mL, 3000 U/mL 내지 5000 U/mL, 3200 U/mL 내지 4800 U/mL, 3500 U/mL 내지 4500 U/mL 또는 3800 U/mL 내지 42000 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인이 IL-2(Interleukin-2)인 경우, IL-2의 농도는 예를 들면, 100 U/mL 내지 5000 U/mL, 200 U/mL 내지 4200 U/mL, 400 U/mL 내지 3200 U/mL, 600 U/mL 내지 2200 U/mL, 800 U/mL 내지 1200 U/mL, 3000 U/mL 내지 5000 U/mL, 3200 U/mL 내지 4800 U/mL, 3500 U/mL 내지 4500 U/mL 또는 3800 U/mL 내지 42000 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인이 IFN-γ(Interferon-γ)인 경우, IFN-γ의 농도는 예를 들면, 40 U/mL 내지 4000 U/mL(2 ng/mL 내지 20 ng/mL), 60 U/mL 내지 3600 U/mL(3 ng/mL 내지 18 ng/mL), 80 U/mL 내지 3200 U/mL(4 ng/mL 내지 16 ng/mL), 100 U/mL 내지 2800 U/mL(5 ng/mL 내지 14 ng/mL) 또는 140 U/mL 내지 2400 U/mL(7 ng/mL 내지 12 ng/mL)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포는 서로 공동 배양된 것일 수 있다. 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 공동 배양하는 경우, 각 세포를 단독 배양 후 병용하여 이용하는 경우에 비해 암의 예방 또는 치료 효과가 우수하다. 수지상 세포 및 자연 살해 세포는 예를 들면, 0.01:1 내지 0.03:1, 0.015:1 내지 0.025:1 또는 0.018:1 내지 0.022:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 독성 T세포 및 자연 살해 세포는 예를 들면, 8:1 내지 12:1, 8.5:1 내지 11.5:1 또는 9:1 내지 11:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 수지상 세포 및 세포 독성 T세포는 예를 들면, 0.01:10 내지 0.03:10, 0.015:10 내지 0.025:10 또는 0.018:10 내지 0.022:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암은 면역 세포를 이용하는 경우 예방 또는 치료 효과가 예상되는 것이라면 제한되지 않고, 예를 들면, 고형암일 수 있다. 고형암은 예를 들면, 대장암, 담관암, 위암, 폐암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포폐암, 비소세포폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "예방"은 전체 예방 뿐만 아니라 병태의 발병 또는 재발병의 가능성의 경미한, 실질적인 또는 큰 감소를 포함하여 예방될 병태 또는 재발생 또는 재발하는 병태의 발병 가능성의 임의의 정도의 감소를 초래하는 예방적 조치를 지칭하고, 가능성 감소의 정도는 적어도 경미한 감소이다.
용어 "치료"는 치유뿐만 아니라 경미한 완화, 실질적인 완화, 주요 완화를 포함하는 임의의 정도의 완화를 포함하여 치료될 병태를 앓고 있는 대상체 또는 환자에게 유리한 효과를 초래하는 처치를 지칭하고, 완화 정도는 적어도 경미한 완화이다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 현탁액, 에멀젼, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 사이토카인과 병용하여 투여될 수 있고, 사이토카인을 먼저 투여한 후 순차적으로 투여될 수 있다. 사이토카인은 예를 들면, IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 사이토카인의 농도는 예를 들면, 200 U/mL 내지 400 U/mL, 220 U/mL 내지 380 U/mL, 240 U/mL 내지 360 U/mL, 260 U/mL 내지 340 U/mL 또는 280 U/mL 내지 320 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조 방법은 하기 (a) 내지 (h) 단계를 포함한다.
(a) 암 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 CD14+ 단핵 세포 및 CD14- 단핵 세포를 분리하는 단계;(c) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 자연 살해 세포를 증폭 배양하는 단계;
(d) 상기 CD14+ 단핵 세포로부터 미성숙 수지상 세포를 분화시키는 단계;
(e) 상기 CD14- 단핵 세포로부터 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 분리하는 단계;
(f) 상기 미성숙 수지상 세포에 상기 암 환자로부터 분리된 종양 항원을 처리하여 성숙 수지상 세포를 수득하는 단계;
(g) 상기 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 상기 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 공동 배양하여 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계; 및
(h) 상기 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계에 이용되지 않은 성숙 수지상 세포, 상기 세포 독성 T 세포 및 상기 자연 살해 세포를 공동 배양하여 사전 활성화(pre-activation)하는 단계.
수지상 세포, 자연 살해 세포, 세포 독성 T 세포 및 암은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(g) 단계에서 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 CD8+ 나이브(naive) T 세포는 1:8 내지 1:12, 1:8.5 내지 1:11.5, 1:9 내지 1:11 또는 1:9.5 내지 1:10.5의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. (g) 단계에 의해 나이브 T 세포는 활성화되어 세포 독성 T 세포를 수득할 수 있다.
(h) 단계에서 성숙 수지상 세포 및 자연 살해 세포는 예를 들면, 0.01:1 내지 0.03:1, 0.015:1 내지 0.025:1 또는 0.018:1 내지 0.022:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. (h) 단계에서 세포 독성 T세포 및 자연 살해 세포는 예를 들면, 8:1 내지 12:1, 8.5:1 내지 11.5:1 또는 9:1 내지 11:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. (h) 단계에서 성숙 수지상 세포 및 세포 독성 T세포는 예를 들면, 0.01:10 내지 0.03:10, 0.015:10 내지 0.025:10 또는 0.018:10 내지 0.022:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(h) 단계의 공동 배양은 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다. (h) 단계에서 성숙 수지상 세포, 세포 독성 T 세포 및 자연 살해 세포를 사이토카인을 포함하는 배지에서 공동 배양하는 경우, 보다 우수한 암의 예방 또는 치료 효과가 있는 약학 조성물을 제조할 수 있다. 사이토카인 예를 들면, IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 사이토카인의 농도는 예를 들면, 40 U/mL 내지 5000 U/mL, 60 U/mL 내지 5000 U/mL, 80 U/mL 내지 5000 U/mL, 100 U/mL 내지 5000 U/mL, 200 U/mL 내지 4200 U/mL, 400 U/mL 내지 3200 U/mL, 600 U/mL 내지 2200 U/mL, 800 U/mL 내지 1200 U/mL, 3000 U/mL 내지 5000 U/mL, 3200 U/mL 내지 4800 U/mL, 3500 U/mL 내지 4500 U/mL 또는 3800 U/mL 내지 42000 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인이 IL-2(Interleukin-2)인 경우, IL-2의 농도는 예를 들면, 100 U/mL 내지 5000 U/mL, 200 U/mL 내지 4200 U/mL, 400 U/mL 내지 3200 U/mL, 600 U/mL 내지 2200 U/mL, 800 U/mL 내지 1200 U/mL, 3000 U/mL 내지 5000 U/mL, 3200 U/mL 내지 4800 U/mL, 3500 U/mL 내지 4500 U/mL 또는 3800 U/mL 내지 42000 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인이 IFN-γ(Interferon-γ)인 경우, IFN-γ의 농도는 예를 들면, 40 U/mL 내지 4000 U/mL(2 ng/mL 내지 20 ng/mL), 60 U/mL 내지 3600 U/mL(3 ng/mL 내지 18 ng/mL), 80 U/mL 내지 3200 U/mL(4 ng/mL 내지 16 ng/mL), 100 U/mL 내지 2800 U/mL(5 ng/mL 내지 14 ng/mL) 또는 140 U/mL 내지 2400 U/mL(7 ng/mL 내지 12 ng/mL)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 약학적 조성물은 예를 들면, 사이토카인과 병용하여 투여될 수 있고, 사이토카인을 먼저 투여한 후 순차적으로 투여될 수 있다. 사이토카인은 예를 들면, IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 사이토카인의 농도는 예를 들면, 200 U/mL 내지 400 U/mL, 220 U/mL 내지 380 U/mL, 240 U/mL 내지 360 U/mL, 260 U/mL 내지 340 U/mL 또는 280 U/mL 내지 320 U/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 항원은 미성숙 수지상 세포를 성숙시킬 수 있는 것이라면 제한되지 않고, 예를 들면, 암 환자 조직 유래 단백질 추출물 또는 유전체 분석을 통해 수득한 신생 항원 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
제조예
본 제조예는 하기 Ⅰ 내지 Ⅴ의 과정에 따라 제조되었다. 도 1은 본 제조예의 제조 과정을 도식화한 것이다. 본 제조예에서는 대장암 환자로부터 수득된 혈액 및 암 세포를 이용하였다.
Ⅰ. 말초 혈액 단핵구 분리
1. 5개의 heparin tube(약 50 ml)에 혈액을 채취한다.
2. 50 ml tube 3개를 준비한다.
3. 혈액을 50 ml tube로 옮기고 혈액의 양을 확인한다.
4. tube 벽에 묻지 않도록 주의하면서 두개의 50 ml tube 중간에 각각 15 ml의 Ficoll-pague를 주입한다.
5. 혈액을 혼합하여 Ficoll-paque가 포함된 두 개의 50 ml tube에 각각 동일한 양의 혈액을 Ficoll-pague 솔루션 위에 천천히 띄운다.
6. 2300 rpm, 25분, ACC/DERT-10에서 원심 분리한다.
7. (PBMC 셀 층을 방해하지 않고) 10 ml 내지 15 ml 의 analogous plasma 를 분리하여 15ml tube에 넣고 deep freezer(-80°C) 에 보관한다.
8. 남아 있는 plasma와 버피 코트 층을 세 번째 50ml tube에 넣는다. 가능한 많은 버피 코트 층을 수집하고 tube 안에 buffy ficoll-plague 층에 피펫이 닿지 않도록 해야한다. 이후 원심 분리 과정에 영향을 줄 수 있다.
9. tube의 45ml 눈금에 맞춰지도록 DPBS를 채워준다. 그리고 800 xg, 5분, ACC 44, RT 원심 분리한다.
10. (선택 사항) 만일 tube에 RBC가 있는 경우, RBC를 1-2ml RBC lysis buffer로 5분 내지 10분동안 용해시켜 준다. Media로 중화시키고 800 xg, 5분, ACC 44, RT에서 원심 분리한다.
11. 상층액을 제거하고 1 mL의 DPBS를 tube에 넣고 피펫으로 부드럽게 섞는다. 29 mL의 DPBS를 추가하여 총 부피가 30 mL이 되도록 한다.
12. 셀 카운팅을 한다.
Ⅱ. CD14+ 단핵구 분리 후 미성숙 수지상세포 배양
1. PBMC를 1500 rpm 이상에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 제거한다.
2. 15 mL tube에 총 10 세포 당 80 μL의 P.E 버퍼에 세포 펠렛을 현탁한다. tube에 'ori'로 표시한다.
3. 총 10 셀 당 20 μL의 CD14 마이크로 비드를 추가한다. 잘 섞어 냉장고 (2-8 ℃)에서 15 분 동안 정치한다.
4. autoMACS ™ Pro Separator 기기를 준비하고 프라이밍한다.
5. 15 mL tube 2개를 준비하고 'pos', 'neg'로 라벨링한다.
6. 샘플이 들어 있는 tube(ori tube)와 라벨이 있는 cell fractions (pos tube), 라벨이 없는 세포 fractions (neg tube)을 수집하기 위한 tube를 tube 랙에 넣는다. tube는 tube 랙에 표시된 대로 배열한다. 샘플 포트에 랙을 놓는다.
7. autoMACS™ Pro Separator에 CD14 비드 시약 코드를 입력한다.
8. 시약 포트에 시약 병을 놓는다.
9. 분리 메뉴로 이동하여 분리할 샘플을 강조 표시한다.
10. 원하는 라벨링 시약(CD14 비드)을 선택한다.
11. 샘플의 총 부피를 입력한다(세포를 현탁하는데 사용되는 PE 버퍼의 양).
12. 분리 프로그램 ‘Possel’을 선택한다.
13. 세척 프로그램을 선택하고 실행을 누른다.
14. 분리 과정이 끝나면 랙의 positive fraction 위치에서 CD14+ 단핵세포를 수집한다.
15. 세포를 세고 1500 rpm에서 5분 동안 원심 분리한다.
16. 50 ng/mL의 IL-4와, 50 ng/mL의 GM-CSF가 첨가된 ImmunocultTM-ACF 수지상 세포 media에 펠릿을 현탁한다.
17. 세포를 12-wells (1-2x106 cells/well) 또는 6-well (3-4x106 cells/well) 플레이트에 시드하고 플레이트를 5% CO2, 37℃의 가습 인큐베이터에 넣는다.
18. (day 3) 수지상 세포가 떨어지지 않도록 조심스럽게 인큐베이터에서 플레이트를 제거한다.
19. 플레이트를 원형으로 부드럽게 흔들어 잔해물이 접시 중앙에 정렬되도록 한 다음 피펫으로 잔해물을 제거한다.
20. 배지를 완전히 제거하고 50 ng/mL의 IL-4, 50 ng/mL의 GM-CSF가 첨가된 신선한 ImmunocultTM-ACF 수지상 세포 배지로 교체한다.
21. 배양 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣는다.
22. (day 5 - 종양세포에서 protein lysate 획득) 종양 세포를 카운팅한 후 RPMI 배지에서 6-well culture plate에 2% NaCl 또는 2% HOCl에 세포를 현탁하고 37℃에서 1시간 동안 세포를 배양한다.
23. 세포를 eppendorf tube로 옮기고 5분 동안 1500 rpm에서 원심 분리한다.
24. 상층액을 버리고 DPBS에서 세포를 현탁한다.
25. 1500 rpm에서 5분 간 원심 분리한다.
26. 총 3회 세척을 위해 4번과 5번을 반복한다.
27. ImmunocultTM-ACF 수지상 세포 배지 100-200 ul에 세포를 현탁시킨다.
28. -80℃ 냉장고 또는 액체 질소 가스 탱크에서 6회 동결-해동 주기를 수행한다.
29. eppendorf tube의 세포를 30분 동안 초음파 처리한다.
30. trypan blue exclusion을 통해 latent live tumor cells의 존재를 확인하고 생존 세포가 샘플에 존재하는 경우 생존율이 0%가 될 때까지 세포를 초음파 처리한다.
31. tumor lysate를 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
32. (day 5 - FFPE에서 protein lysate 획득) 10 um 두께의 환자 종양 조직은 병리학과에서 제공받았다(조각 3 ~ 4 개 / e-tube).
33. 탈 파라핀화 용액 (320 ul)을 샘플 tube에 추가한다.
34. 56 ℃에서 3분 동안 배양한다. 볼텍싱 후 스핀다운 해준다.
35. 상층액을 제거한다.
36. (선택 사항) 조직에서 파라핀을 더 제거해야 하는 경우 2단계와 4단계를 반복한다.
37. 100 % 에탄올 (320 ul)을 추가하고 실온에서 3분 동안 배양한다. 11000 xg에서 1분 동안 원심 분리하고 한 번 더 반복한다. 상층액을 제거한다.
38. 95 % 에탄올 (320 ul)을 추가하고 실온에서 3분 동안 배양한다. 11000 xg에서 1분 동안 원심 분리하고 한 번 더 반복한다. 상층액을 제거한다.
39. 70 % 에탄올 (320 ul)을 추가하고 실온에서 3분 동안 배양한다. 11000 xg에서 1분 동안 원심 분리하고 한 번 더 반복한다. 상층액을 제거한다.
40. 0.01 M sodium citrate buffer, pH 6.0 (320 ul)을 tube에 넣고 99-100 ℃의 heating block에서 20분 간 배양한다.
41. 실온에서 20분 동안 식힌다.
42. 11000 xg에서 1 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 제거한다.
43. Tube에 DPBS를 추가하여 클린 벤치에서 다음 단계를 수행한다.
44. 11000 xg에서 1 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 제거한다.
45. DPBS 1mL 에서 11000 xg, 5분 동안 원심 분리한다. 상층액을 제거한다. 이 과정을 총 3회 반복한다.
46. 300-500 ul의 DPBS에 조직을 현탁하고 샘플을 Tube type M (Miltenyi)으로 옮긴다. GentleMAC 조직 해리기를 사용하여 분리하여 단백질 추출을 위한 “protein_01” 설정을 사용하여 단백질을 얻는다.
47. Tube 바닥에 있는 샘플을 수집하기 위해 3분 동안 1500 rpm에서 원심 분리한다.
48. 샘플을 eppendorf tube로 옮기고 10000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한다.
49. 종양 단백질이 포함된 상층액을 다른 tube에 수집한다.
50. Buffer를 다음 과정에 따라 교체한다: ① spin column 을 2 ml collection tube에 끼운다. ② HiPPR detergent removal resin 을 부드럽게 흔들어 섞어 준 뒤 column에 200 ul를 넣어준다. ③ 1500 xg, 1분 동안 원심 분리 후 필터링된 잔여 버퍼를 제거한다. ④ column에 200 ul PBS를 넣고 1500 xg, 1분동안 원심 분리한다. 이 과정을 세 번 반복한다. ⑤ column 아랫부분에 plug를 끼우고 protein sample을 넣어 준 뒤 부드럽게 흔들어 주고, 10분간 상온에서 배양한다. ⑥ plug를 제거 하고 1500 xg, 2분 간 원심 분리한다.
51. 추출된 단백질의 총량을 측정한다. 단백질을 나누어 사용하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
52. 수지상 세포가 흔들리지 않도록 조심스럽게 인큐베이터에서 dish를 빼준다.
53. dish를 원형으로 부드럽게 흔들어 이물질이 dish의 중앙에 정렬되도록 한 다음 피펫으로 이물질을 제거한다.
54. 배지를 완전히 제거하고 50 ng/mL의 IL-4 및 50 ng/mL의 GM-CSF가 보충 된 신선한 ImmunocultTM-ACF 수지상 세포 배지로 교체한다.
55. 50 ug of FFPE tissue protein extract per 106cells을 세포 배양 배지에 추가한다. 또는 위의 'A'섹션에서 얻은 whole cell tumor lysate를 세포에 추가한다. 또는 tumor derived peptide(10 ug/mL)를 세포에 추가한다.
56. 배양 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어준다.
57. 수지상 세포가 빠지지 않도록 조심스럽게 인큐베이터에서 접시를 제거한다.
58. whole tumor lysates of FFPE 또는 tumor specific peptide가 로딩된 수지상 세포를 포함하는 2000 ul의 DC 배지에 20 ul의 DC maturation supplement를 추가한다.
59. 배양 플레이트를 부드럽게 흔든다.
60. 배양 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어준다.
Ⅲ. CD14- 단핵구에서 CD8+ naive T 세포 분리 배양
1. CD14 negative fraction 위치에서 얻은 CD14- PBMC를 수집한다.
2. 세포 수를 센다.
3. 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 완전히 제거한다.
4. PE buffer (40 uL per 107 cells)로 pellet을 현탁한다.
5. naive CD8+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail(10 uL per 107cells)을 첨가하고, 부드럽게 섞어 냉장고(28 ℃)에서 10분 간 배양한다.
6. PE 버퍼를 추가한다(30 uL of PE per 107 cells).
7. 즉시 anti-Biotin Microbeads (20 uL for 107 cells)를 첨가하고, 부드럽게 섞어준 뒤 냉장고 (2-8℃)에서 15분 동안 배양한다.
8. 2 mL PE buffer와 원심 분리기를 1500 rpm에서 5분 동안 추가한다.
9. 상층액을 완전히 흡입하고 500 μL의 PE buffer에 세포를 현탁한다. 15 ml tube에 세포를 옮기고 'ori'로 표시한다.
10. 15 mL tube 2 개를 준비하고 'pos'및 'neg'로 라벨을 지정한다.
11. 샘플이 들어있는 tube (ori tube)와, 라벨이 있는 cell fractions (pos tube), 라벨이 없는 세포 fractions (neg tube)을 수집하기 위한 tube를 tube 랙에 넣는다. tube는 tube 랙에 표시된 대로 배열한다. 샘플 포트에 랙을 놓는다.
12. 분리 메뉴로 이동하여 분리할 샘플을 강조 표시한다.
13. 원하는 라벨링 시약을 선택한다(이 경우 비어 있어야 함).
14. 샘플의 총 부피를 입력한다(세포를 현탁시키는 데 사용되는 PE buffer의 양(500 uL)).
15. 분리 프로그램 'Depl05'를 선택한다.
16. 세척 프로그램을 선택하고 실행을 누른다.
17. 분리 프로세스가 끝나면 랙의 negative fraction 위치에 네거티브 셀을 수집한다.
18. 1500 rpm에서 05분 동안 세포를 원심 분리하고 상층액을 완전히 흡입한다.
19. PE buffer에 세포를 현탁한다(80 uL of PE per 107 cells).
20. CD8 Microbeads (20 uL per 107 cells)를 추가하고 부드럽게 섞어 냉장고 (2-8℃)에서 15분 동안 배양한다.
21. 5분 동안 1500 rpm에서 2 mL PE 버퍼를 추가하여 원심 분리한다.
22. 상층액을 완전히 흡입하고 500 μL의 PE 버퍼에 세포를 현탁한다. 15 ml tube에 세포를 옮기고 'ori'로 표시한다.
23. 15 mL tube 2개를 준비하고 'pos' 및 'neg'로 라벨을 지정한다.
24. 샘플이 들어 있는 tube (ori tube)와, 라벨이 있는 cell fractions (pos tube), 라벨이 없는 세포 fractions (neg tube)을 수집하기 위한 tube를 tube 랙에 넣는다. tube는 tube 랙에 표시된 대로 배열한다. 샘플 포트에 랙을 놓는다.
25. 분리 메뉴로 이동하여 분리할 샘플을 강조 표시한다.
26. 원하는 라벨링 시약을 선택한다(이 경우 공백이어야 함).
27. 샘플의 총 부피를 입력한다(세포를 현탁시키는 데 사용되는 PE 버퍼의 양(500 uL)).
28. 분리 프로그램 ‘Possel’을 선택한다.
29. 세척 프로그램을 선택하고 실행을 누른다.
30. 분리 과정이 끝나면 랙의 positive fraction 위치에 양성 세포를 수집한다. 이것은 naive CD8+ T cells이다.
31. 세포를 세고 2000 units/mL의 IL-2가 첨가된 T 세포 배양 배지에 세포를 현탁한다.
32. 세포를 12-wells(1-2x106 cells/well)에 넣고 37℃, 5% CO2, 가습된 인큐베이터에 플레이트를 넣는다.
33. 조심스럽게 인큐베이터에서 플레이트를 꺼낸다.
34. 조심스럽게 half media(세포 수집을 피하기 위해 맨 위 부분)를 제거하고 4000 unit/mL의 IL-2 (최종 농도는 2000 unit/mL)가 첨가된 새로운 T Cell Media로 교체한다.
35. 배양 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣는다.
Ⅳ. 성숙 수지상 세포와 CD8+ naive T 세포를 공동 배양하여 T 세포 활성화 후 증폭 배양
1. tumor protein를 처리하여 성숙시킨 수지상 세포와 CD8+ naive T 세포를 1X105 개의 세포를 U-bottom 96-well plate에 seeding 후 1X104 개의 성숙 수지상 세포를 넣어 준다.
2. 위 세포들을 플레이트 상에서 250 g에서 3분 동안 원심 분리를 한다.
3. 배양기에서 4일 동안 공동 배양한다.
4. 6000 units의 IL-2가 첨가된 나머지 세포 T 세포 배양 배지를 현탁한다.
5. 피펫으로 세포를 혼합하고 250 g에서 3분 동안 원심 분리한다.
6. 배양기에서 세포를 배양한다.
7. 2일 마다 세포 상태를 확인하고 세포에 따라 half media change를 수행하거나 세포를 나눈다. PRE-REPEAT EXPANSION이 끝날 때까지 프로세스를 반복한다(14일).
8. (day 14) 배양기에서 세포를 부드럽게 제거하고 세포의 현미경 이미지를 찍는다.
9. 세포의 양을 계산해서 보고서를 작성한다.
10. CD8 및 CD4 양성 세포의 양을 측정하여 T 세포의 순도를 확인한다.
11. 세포와 감마선을 조사한 말초 혈액 단핵구를 1:200의 비율로 공동 배양을 시작한다.
12. 2-3일 간격으로 약 14일 동안 half media change를 진행하거나 2배로 split한다.
Ⅴ. 말초 혈액 단핵구를 이용한 자연 살해 세포 배양
1. 자연 살해 세포 증식을 위해 분리된 말초 혈액 단핵구 세포는 방사선 조사된 K562 feeder cell과 IL-2, IL-21 존재 하에 37℃ incubator에서 7일 간 co-culture한다.
2. 배양한 세포의 증식을 위하여 2-3일 간격으로 IL-2와 IL-15를 포함한 배지를 이용하여 dividing이나 media change를 수행하면서 2주 간 배양한다.
3. 획득한 자연 살해 세포의 항암 활성을 확인하기 위하여 K562 cell line을 target으로 CCK-8을 이용한 cytotoxicity와 NK cell의 surface receptor 분석을 수행한다.
예비 실험
위 제조예 제조 과정 중 또는 제조 후 예비 실험을 수행하였다.
Ⅰ. 환자의 조직에서 추출한 항원 또는 펩타이드를 탑재하여 성숙시킨 미성숙 수지상 세포의 IL-12(p70) 분비량 증가
대장암 환자(SDH21028)의 혈액으로부터 CD14 양성 단핵구를 분리 및 미성숙 수지상 세포로 분화 후 미성숙 수지상 세포에 펩타이드를 탑재하여 성숙시켰다.
미성숙 수지상 세포에 펩타이드를 처리한 군 및 처리하지 않은 군에서 성숙 수지상 세포가 분비하는 IL-12(p70)의 분비량을 측정하기 위하여 ELISA를 실시하였다. 그 결과, 펩타이드를 처리하지 않은 군(도 2의 iDC)에 비해 펩타이드를 처리한 군(도 2의 mDC)의 IL-12(p70) 분비 수준이 높은 것을 확인하였다(도 2).
Ⅱ. 성숙 수지상 세포와 공동 배양한 CD8+ naive T 세포의 IFN-γ 발현 정도 증가 및 세포 배양 양상
환자(SDH21028)의 혈액에서 CD8+ naive T 세포를 분리하여 배양 후 성숙 수지상 세포와 공동 배양하였다.
CD8+ naive T 세포 배양 후 성숙 수지상 세포와 공동 배양하지 않은 군 및 공동 배양한 군에서 활성화된 T 세포 마커인 IFN-γ의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 성숙 수지상 세포와 공동 배양하지 않은 군(도 3의 T cell only)에 비해 성숙 수지상 세포와 공동 배양한 군(도 3의 mDC/T cell)의 IFN-γ 발현 정도가 높은 것을 확인하였다(도 3).
CD8+ naive T 세포와 mDC(성숙 수지상 세포)를 공동 배양하여 활성화된 T 세포의 배양 양상을 관찰하였다. 그 결과 성숙 수지상 세포와 공동 배양하지 않은 경우(도 4의 T cell only)에 비해 공동 배양한 경우(도 4의 mDC+TC), 성숙 수지상 세포로 인해 활성화된 T 세포가 군집을 이루며 더 많은 성장을 하는 것을 확인하였다(도 4).
Ⅲ. 자연 살해 세포 배양 양상
환자(SDH21028)의 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하여 자연 살해 세포를 배양하였다.
환자의 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 처음 16.3%를 차지하였던 자연 살해 세포 비율이 시간이 지남에 따라 98.8%로 증가하였으며 그 수도 약 251배 증가하였다.
| 24 well | DAY-0 | DAY-14 |
| Purity (%) | 16.3% | 98.8% |
| Fold | 1 | 251.51배 |
| Converted NK cells | 2.45x10^6 | 6.14x10^8 |
또한, 자연 살해 세포 배양 과정을 거치면서 자연 살해 세포의 activating receptor를 발현하는 세포 군집이 증가하였고 inhibitory receptor를 발현하는 세포 군집은 약간 증가한 것을 확인하였다(도 5).
실시예
위 제조예에서 수득한 3가지 면역 세포의 암 세포에 대한 항암 효과를 확인하기 위한 CCK-8 assay를 수행하였다.
Ⅰ. 실시예 1
1. 방법
(1) 세포 접종(cell seeding)
Primary tumor cell을 96 well plate에 1x104 cells/100 ul/well로 seeding 후 24시간 incubation한다.
(2) 면역 세포(Effector cell) 준비 및 사이토카인 pre-activation
Effector cell과 target cell(primary tumor cell)의 개수 비율인 E:T ratio는 다음과 같다: NK cell : DC : T cell : target cell (1 x 104)= 1 : 0.02 : 10 : 1. target cell 1 x 104 cells을 기준으로 각 비율에 해당하는 NK cell, DC, T cell을 준비하였다.
준비된 면역 세포들과 target cell의 공동 배양 전 면역 세포들에 대해 사이토카인 pre-activation을 수행하였다. 세 가지 면역 세포를 6000 unit/ml 농도의 IL-2가 첨가된 phenol red free RPMI에서 24시간 단독 배양하였다. 또한, 세 가지 면역 세포를 함께 4000 unit/ml 또는 6000 unit/ml 농도의 IL-2가 첨가된 phenol red free RPMI에서 24시간 공동 배양하였다.
(3) Effector cell 및 Target cell 공배양(co-culture)
위 (1)에서 수득된 tumor cell에 기존 배양액 100 ul를 제거하고 위 (2)의 세 가지 면역 세포를 단독 또는 공동으로 각 well 당 100 ul 처리한 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
(4) CCK-8 detection
위 (3)의 5가지 군(DC 단독, T cell 단독, NK cell 단독, 4000 unit/ml pre-activation 공동, 6000 unit/ml pre-activation 공동)에 CCK-8 용액을 10 ul 첨가한 후, 30분 동안 37℃의 배양기에서 정치 배양하였다. 그리고 부드럽게 파이펫팅 해준 뒤 2000 rpm에서 3분 동안 원심 분리 후 상층액 70 ul를 새로운 well에 옮겼다. 그리고 450 nm 파장에 대한 발색을 평가하여 세포의 사멸도를 측정하였다.
2. 결과
SDH21029 대장암 환자의 primary cancer cell을 target으로 NK, T, DC의 단독 또는 조합의 세포 독성을 확인하였다(도 6). 각 cell을 단독으로 cancer cell과 co-culture하였을 때, DC, T, NK는 약 18%, 28%, 40%의 세포 독성이 나타났다(도 6의 DC, T 및 NK 군). 4000U/ml IL-2로 pre-activation한 세 가지 면역 세포의 조합 군(도 6의 4000 군)에서는 57%정도의 세포 독성을 확인하였고, 6000U/ml IL-2로 pre-activation한 세 가지 면역 세포의 조합 군(도 6의 6000 군)에서는 47%정도의 세포 독성을 확인하였다. 이 결과를 통해 세가지 cell을 함께 activation한 군에서 더 높은 세포 독성이 나타나는 것을 확인하였다.
Ⅱ. 실시예 2
1. 방법
위 실시예 1의 방법과 동일하되, 실시예 1의 1-(2) 단계의 사이토카인 pre-activation은 모두 4000 unit/ml 농도의 IL-2를 이용하여 수행하였다.
2. 결과
IL-2로 pre-activation한 SDH21032 대장암 환자의 DC, T, NK cell의 단독 또는 조합을 effector cell로 하여 cancer cell에 대한 세포 독성 실험을 진행하였다(도 7). 각 cell을 단독으로 cancer cell과 co-culture하였을 때 T, NK는 약 67%, 91%의 세포 독성이 나타났다(도 7의 T 및 NK 군). 세 가지 세포를 함께 pre-activation한 군(도 7의 Combination 군)에서 가장 높은 세포 독성을 나타냈다.
Ⅲ. 실시예 3
1. 방법
위 실시예 1의 방법과 동일하되, 실시예 1의 1-(2) 단계의 사이토카인 pre-activation은 모두 4000 unit/ml 농도의 IL-2 및 10 ng/ml 농도의 IFN-γ를 이용하여 수행하였다.
2. 결과
IL-2 및 IFN-γ로 pre-activation한 SDH21032 대장암 환자의 DC, T, NK cell의 단독 또는 조합을 effector cell로 하여 cancer cell에 대한 세포 독성 실험을 진행하였다(도 8). 각 cell을 단독으로 cancer cell과 co-culture하였을 때 T, NK는 약 60%, 81%의 세포 독성이 나타났다(도 8의 T 및 NK 군). 세 가지 세포를 함께 pre-activation한 군(도 8의 Combination 군)에서 가장 높은 세포 독성을 나타냈다.
Ⅳ. 실시예 4
1. 방법
위 실시예 1의 방법과 동일하되, 실시예 1의 1-(2) 단계의 사이토카인 pre-activation은 모두 4000 unit/ml 농도의 IL-2 및 10 ng/ml 농도의 IFN-γ를 이용하여 수행하였다.
2. 결과
IL-2와 IFN-γ로 pre-activation한 SDH21028 대장암 환자의 DC, T, NK cell의 단독 또는 조합을 effector cell로 하여 cancer cell에 대한 세포 독성 실험을 진행하였다(도 9). 각 cell을 단독으로 cancer cell과 co-culture하였을 때 T, NK는 약 18%, 49%의 세포 독성이 나타났다(도 9의 T 및 NK 군). 세 가지 세포를 함께 pre-activation한 군(도 9의 Combination 군)에서 가장 높은 세포 독성을 나타냈다.
Ⅴ. 실시예 5
1. 방법
위 실시예 1의 방법과 동일하되, 실시예 1의 1-(2) 단계의 사이토카인 pre-activation은 모두 4000 unit/ml 농도의 IL-2를 이용하여 수행하였고, 사이토카인 pre-activation을 수행하지 않은 세 가지 면역 세포의 조합 군을 추가하였다.
2. 결과
SDH21054 대장암 환자의 cancer cell을 target으로 DC, T, NK cell의 combination therapy assay를 수행하였다. 전날 pre-activated된 단독 cells(도 10의 Pre-activated DC, T 및 NK 군) 중 T와 NK가 비슷한 세포 독성을 보였고, 세가지 cell을 함께 pre-activation한 군(도 10의 Pre-activated DCTNK 군)에서 가장 높은 세포 독성을 확인하였다. 또한 pre-activation하지 않은 cell의 combination 군(도 10의 Non DCTNK 군)은 약 20%의 세포 독성을 확인하였다.
Ⅵ. 실시예 6
1. 방법
위 실시예 1의 방법과 동일하되, 실시예 1의 1-(2) 단계의 사이토카인 pre-activation은 모두 4000 unit/ml 농도의 IL-2를 이용하여 수행하였고, 사이토카인 pre-activation을 수행하지 않은 세 가지 면역 세포의 조합 군을 추가하였다. 또한 실시예 1의 1-(3) 단계의 target cell과의 공동 배양 시 300 unit/ml 농도의 IL-2를 처리한 뒤 배양하였다. 실험은 총 2회 수행하였다.
2-1. 결과 1
SDH21054 대장암 환자의 cancer cell을 target으로 DC, T, NK cell의 combination therapy assay를 수행하였다. 전날 pre-activated된 단독 cells(도 11의 Pre-activated DC, T 및 NK 군) 중 T와 NK가 비슷한 세포 독성을 보였고, 세가지 cell을 함께 pre-activation한 군(도 11의 Pre-activated DCTNK 군)에서 약 80%의 가장 높은 세포 독성을 확인하였다. 또한 pre-activation하지 않은 cell의 combination 군(도 11의 Non DCTNK 군)에서 약 55%의 세포 독성을 확인하였다.
2-2. 결과 2
SDH21054 대장암 환자의 cancer cell을 target으로 DC, T, NK cell의 combination therapy assay를 수행하였다. 전날 pre-activated된 단독 cells(도 12의 Pre-activated DC, T 및 NK 군) 중 T와 NK가 비슷한 세포 독성을 보였고, 세가지 cell을 함께 pre-activation한 군(도 12의 Pre-activated DCTNK 군)에서 약 80%의 가장 높은 세포 독성을 확인하였다. 또한 pre-activation하지 않은 cell의 combination 군(도 12의 Non DCTNK 군)에서 약 55%의 세포 독성을 확인하였다.
Claims (33)
- 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 상기 암의 예방 또는 치료 대상으로부터 유래된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포의 수의 비율은 0.01:1 내지 0.03:1인 것인, 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포의 수의 비율은 8:1 내지 12:1인 것인, 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 약학 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 약학 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 약학 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL인, 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포는 서로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포는 0.01:1 내지 0.03:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포는 8:1 내지 12:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 수지상 세포 및 상기 세포 독성 T세포는 0.01:10 내지 0.03:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암은 고형암인, 약학 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 고형암은 대장암, 담관암, 위암, 폐암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포폐암, 비소세포폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 약학 조성물.
- (a) 암 환자의 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 CD14+ 단핵 세포 및 CD14- 단핵 세포를 분리하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계에서 분리된 PBMC로부터 자연 살해 세포를 증폭 배양하는 단계;
(d) 상기 CD14+ 단핵 세포로부터 미성숙 수지상 세포를 분화시키는 단계;
(e) 상기 CD14- 단핵 세포로부터 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 분리하는 단계;
(f) 상기 미성숙 수지상 세포에 상기 암 환자로부터 분리된 종양 항원을 처리하여 성숙 수지상 세포를 수득하는 단계;
(g) 상기 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 상기 CD8+ 나이브(naive) T 세포를 공동 배양하여 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계; 및
(h) 상기 세포 독성 T 세포를 수득하는 단계에 이용되지 않은 성숙 수지상 세포, 상기 세포 독성 T 세포 및 상기 자연 살해 세포를 공동 배양하여 사전 활성화(pre-activation)하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 수지상 세포, 상기 자연 살해 세포 및 상기 세포 독성 T 세포 중 적어도 하나는 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양된 것인, 제조 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL 인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 (g) 단계에서 상기 수득된 성숙 수지상 세포의 일부 및 상기 CD8+ 나이브(naive) T 세포는 1:8 내지 1:12의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 성숙 수지상 세포 및 상기 자연 살해 세포는 0.01:1 내지 0.03:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 세포 독성 T세포 및 상기 자연 살해 세포는 8:1 내지 12:1의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 (h) 단계에서 상기 성숙 수지상 세포 및 상기 세포 독성 T세포는 0.01:10 내지 0.03:10의 세포 수의 비율로 공동 배양된 것인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 (h) 단계의 공동 배양은 사이토카인을 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 제조 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2(Interleukin-2), IFN-γ(Interferon-γ), IL-15, IL-7, IL-21 및 4-1BB 리간드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 제조 방법.
- 청구항 26에 있어서, 상기 사이토카인의 농도는 40 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 IL-2(Interleukin-2)의 농도는 100 U/mL 내지 5000 U/mL인, 제조 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 IFN-γ(Interferon-γ)의 농도는 40 U/mL 내지 4000 U/mL 인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 암은 고형암인, 제조 방법.
- 청구항 31에 있어서, 상기 고형암은 대장암, 담관암, 위암, 폐암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포폐암, 비소세포폐암, 육종, 신경아교종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 제조 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 종양 항원은 상기 암 환자 조직 유래 단백질 추출물 또는 유전체 분석을 통해 수득한 신생 항원 펩타이드인, 제조 방법.
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