KR20220016670A - 종양 침윤성 림프구로부터 역분화된 줄기세포 기억 t세포를 포함하는 세포치료제 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

종양 침윤성 림프구로부터 역분화된 줄기세포 기억 t세포를 포함하는 세포치료제 조성물 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 침윤성 림프구(TIL)로부터 역분화된 줄기세포 기억 T세포 (TSCM)를 포함하는 세포치료제 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

Description

종양 침윤성 림프구로부터 역분화된 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 세포치료제 조성물 및 그 제조 방법 {Cell therapy composition comprising stem cell memory T cells dedifferentiated from tumor-infiltrating lymphocytes and preparation method thereof}
본 발명은 종양 침윤성 림프구(TIL)로부터 역분화된 줄기세포 기억 T세포 (TSCM)를 포함하는 세포치료제 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
기존의 종양 침윤성 림프구(TIL) 분리법과 배양법은 feeder cell을 사용하거나 cancer tissue의 fragment를 plate에서 배양액에 일주일간 배양함으로써 조직으로부터 빠져 나오는 세포를 배양하는 방법을 사용한다.
기존의 TIL 분리법은 ficoll gradien를 이용하여 분리하더라도, 암 세포 또는 TIL 둘 중 하나 만을 분리해야 하는 문제점이 있었다.
또한, 기존의 TIL 배양법은 irradiated auto 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)나 암 세포와 공배양이 필요한 한계가 있었다.
본 발명의 목적은 종양 침윤성 림프구 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 종양 침윤성 림프구 세포치료제 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
1. 종양 조직에서 종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 암세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 종양 침윤성 림프구를 상기 분리된 암세포와 공배양하는 단계; 및 상기 공배양된 종양 침윤성 림프구를 사이토카인 및 노치 신호전달 (Notch signaling) 활성화제를 포함하는 배지에서 배양하여 리프로그래밍하는 단계;를 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 분리하는 단계는 피콜 밀도 경사 (Ficoll density gradient)를 이용하여 상기 종양 침윤성 림프구 및 환자 암세포를 분리하는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 종양 조직에서 상기 종양 침윤성 림프구와 상기 암세포를 동시에 분리하는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 분리된 종양 침윤성 림프구 및 상기 암세포 중 적어도 어느 하나를 확장 배양하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 배지에서 이루어지는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
6. 위 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체를 포함하는 배지에서 이루어지는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
7. 위 5에 있어서, 상기 항 CD3 항체는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml로 포함되고, 상기 IL-2는 500 IU/ml 내지 1500 IU/ml로 포함되고, 상기 IL-7는 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함되고, 상기 항-4-1BB 항체는 0.1 μg/ml 내지 0.5 μg/ml 로 포함되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
8. 위 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 CD3 항체는 배양 용기에 코팅된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
9. 위 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 10일 내지 25일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
10. 위 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계에서 상기 분리된 암세포는 방사선 처리된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
11. 위 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계는 1일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
12. 위 1에 있어서, 상기 공배양된 세포들 중 CD8+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
13. 위 1에 있어서, 상기 리프로그래밍하는 단계의 상기 공배양된 종양 침윤성 림프구는 CD8+ 표현형을 갖는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
14. 위 1에 있어서, 상기 리프로그래밍하는 단계는 10일 내지 15일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
15. 위 1에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
16. 위 15에 있어서, 상기 IL-2는 500 IU/ml 내지 1500 IU/ml로 포함되고, 상기 IL-7은 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함되고, 상기 IL-15는 10 ng/ml 내지 250 ng/ml로 포함되고, 상기 IL-21은 10 ng/ml 내지 100 ng/ml로 포함되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
17. 위 15에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
18. 위 15에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-7, IL-15 및 IL-21인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
19. 위 1에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
20. 위 1에 있어서, 상기 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제는 DLL1, DLL4 및 GSK3 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
21. 위 20에 있어서, 상기 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제는 DLL4인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
22. 위 21에 있어서, 상기 DLL4는 1 μg/ml 내지 20 μg/ml로 포함되는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
23. 위 21에 있어서, 상기 DLL4는 DLL4-Fc 융합 단백질인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
24. 위 20에 있어서, 상기 DLL1 및 DLL4로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 활성화제가 배양 용기에 코팅된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
25. 위 24에 있어서, 상기 코팅은 상온에서 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
26. 위 1에 있어서, 상기 리프로그래밍된 세포들 중 표현형이 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
27. 위 1에 있어서, 상기 줄기세포 기억 T세포의 표현형은 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ CXCR3+ CD95+ 인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
28. 위 1 내지 27 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 제조된, 줄기세포 기억 T세포.
29. 위 28의 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 세포치료제 조성물.
30. 위 28 의 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명을 통해 종양 침윤성 림프구를 이용한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명을 통해 종양 침윤성 림프구를 이용한 세포치료제 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 emTIL 역분화 통한 scmTIL유도 기술을 나타낸다.
도 2는 T 세포 분화별 마커를 나타낸다.
도 3은 T 세포 분화별 FACS 분포를 나타낸다.
도 4는 TSCM 분화 방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 5는 암 세포에 2Gy, 10Gy로 각각 조사하고 TIL을 이용해 Tscm으로 역분화하는 방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 6은 암 세포에 2Gy, 10Gy로 각각 조사하고 TIL을 이용해 Tscm으로 역분화한 결과를 나타낸다.
도 7은 암 세포에 2Gy, 10Gy로 각각 조사하고 TIL을 이용해 역분화된TSCM 세포의 양을 나타낸다.
도 8은 CA-007 TIL 세포에 7일동안 DLL1 protein과 공배양하여 TSCM 세포를 유도하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 9는 CA-007 TIL 세포에 7일동안 DLL1 protein과 co-culture하여 TSCM 세포가 유도되는지 확인한 FACS 결과이다.
도 10은CA-007 TIL 세포에 7일동안 TWS119 reagent를 처리하여 TSCM 세포를 유도하는 방법을 나타낸 순서도이다.
도 11은 CA-007 TIL 세포에 7일동안 TWS119 reagent를 처리하여 TSCM세포가 유도되는지 확인한 FACS 결과이다.
도 12는 배양 조건을 달리하여 20일 동안 배양하는 방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 13은 배양 조건을 달리하여 20일 동안 배양한 결과를 나타낸다.
도 14는 DLL4 protein 유무에 따른 배양방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 15는 각 조건별 16일 동안의 TSCM 형성 및 IL-21 cytokine의 영향 확인한 결과이다. 도 15 A는 총 16일 동안 CA-007환자의 TIL로부터 TSCM 을 형성하면서 각 조건별로 또는 day 별로 CD45RA+CD62L+ 세포의 증가를 확인한 결과이다. 도 15 B는 TSCM 을 형성하는데 있어서 IL-21 cytokine의 효과를 확인한 실험 결과이다.
도 16은 사이토카인 조건을 달리하여 14일 동안 CA-007 TIL을 배양하는 방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 17은 TSCM 세포 유도 후, 11일 이후부터 CD45RA, CD62L 또는 CD45RA, CD62L, CXCR3 표현형의 변화를 FACS로 확인한 결과의 그래프이다.
도 18은 Gating strategy for the identification of TSCM generated from variable cytokine conditions treated human TILs을 나타낸다. 도 18 A는 IL-2 1000 IU/ml, IL-7 5 ng/ml, IL-15 50 ng/ml, IL-21 50 ng/ml의 조건의 결과를 나타낸다. 도 18 B는 IL-2 1000 IU/ml, IL-7 5 ng/ml, IL-15 200 ng/ml, IL-21 50 ng/ml 조건의 결과를 나타낸다. 도 21 C는 IL-2 1000 IU/ml, IL-7 10 ng/ml, IL-15 50 ng/ml, IL-21 50 ng/ml 조건의 결과를 나타낸다.
도 19는 각 조건별 16일 동안의 TSCM 세포 형성 및 IL-21의 영향 확인한 결과이다. 도 19 A는 14일과 16일 사이에 CD62L와 CCR7의 증가율을 확인한 그래프이다. 도 19 B는 14일과 16일 사이에 CD45RA와 CCR7의 증가율을 확인한 그래프이다.
도 20은 CRC 조직 및 ficoll gradient를 나타낸다.
도 21은 TIL 배양 방법을 간략히 나타낸 순서도이다.
도 22는 대장암 환자로부터 분리한 TIL의 대량 배양 결과를 나타낸다. 도 22 A는 CA-001 환자의 16일 배양 후 세포 수를 나타낸다. 도 22 B는 CA-002 환자의 15일 배양 후 세포 수를 나타낸다.
도 23은 Characterization of TIL of CRC patient를 나타낸다. 도 23 A는 배양한 CRC 환자의 TIL의 기억세포 개체군을 확인한 결과이다. CA-001은 21일, CA-002는 9일, CA-004는 23일, CA-005는 27일, CA-007은 19일, CA-010은 12일 배양한 결과이다. 전체적으로 EM 개체군이 높으며, PBMC에 비해 상대적으로 CM과 효과세포(effector cell) 개체군이 낮은 것으로 보임임을 나타낸다. 도 23 B는 TIL에서의 T 세포 표현형 확인한 결과이다. PBMC에 비해 CD8+ 세포 의 비율이 높았고, 배양 후 4-1BB, PD-1 개체군이 낮게 검출되었음을 나타낸다. 도 23 C는 배양한 CRC 환자 PBMC의 기억세포 개체군을 확인한 결과이다. CA-001은 8일, CA-002는 9일, CA-004는 23일, CA-008는 16일, CA-010은 16일 배양한 결과이다. 전체적으로 EM 개체군이 높았음을 나타낸다. PBMC에 비해 상대적으로 CM과 효과세포(effector cell) 개체군이 낮은 것으로 보인다. 도 23 D는 PBMC에서의 T 세포 표현형 확인한 결과이다.
도 24는 CRC TIL 또는 PBMCs에서 CD8+ T 세포의 IFN-γ유도를 나타낸다. 도 24 A는 CRC TIL 또는 PBMC 세포에서 CD8+ T 세포에 의해 생산되는 IFN-γ 양을 나타낸다. 도 24 B는 IL-12, IL-18에 의해 24시간동안 자극된 CRC CA-004 PBMC의 IFN-γ 생산량을 나타낸다.
도 25는 IL-2, IL-7 및 항 4-1BB 항체 조건에 따른 CA-002 TIL의 배양 방법을 나타낸 순서도이다.
도 26은 IL-7 및 항 4-1BB 항체의 시너지 효과에 의한 TIL 증식의 증가를 나타낸다. 도 26 A는 IL-7 및 항 4-1BB 항체 처리된 TIL의 세포수를 나타낸다. 도 26 B는 Annexin V and PI 항체를 이용하여 살아있는 세포를 검출 분석한 결과를 나타낸다.
도 27은 TIL 분리 및 배양 과정을 나타낸 순서도이다.
도 28은 TIL과 PBMCs의 자가 유래(Autologous) 암세포와 공배양하기 전과 후 표현형 확인한 결과이다. 도 28 A는 자가 유래 암세포와 공배양 전과 후에 PBMC와 TIL의 분화 정도를 FACS 분석한 그래프이다. 도 28 B는 자가 유래 암세포와 공배양 전과 후에 PBMC와 TIL의 표면 마커의 발현을 FACS 분석한 그래프이다.
도 29는 CA-015 독성 분석 결과이다.
도 30은 시험관내(in vitro) CRC TIL 독성을 나타낸다. 도 30 A는 자가 유래 암세포와 72시간 동안 공배양한 CRC TIL의 독성 분석을 나타낸다. 세포는 4 % PFA으로 고정 및 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 도 30 B는 image J program을 이용한 독성의 정량분석 결과이다.
도 31은 TIL을 암세포에 처리하고 추가로 IL12, IL18처리 후 암세포 사멸 촉진한 결과이다.
도 32는 TIL을 암세포에 처리하고 추가로 IL12, IL18처리 후 암세포 사멸 촉진한 결과이다.
도 33은 타가 TIL세포보다 자가 TIL세포를 암세포에 처리시 암 살상 능력 증가를 나타낸 결과이다.
도 34는 타가 TIL세포보다 자가 TIL세포를 암세포에 처리시 암 살상 능력 증가를 나타낸 결과이다.
도 35는 자가TIL 및 타가 TIL을 암세포에 처리 후 IL-12단독, IL18단독, IL12및IL18처리 후 암 살상 능력을 비교한 결과이다. 자가 TIL과 IL12만을 처리하였을때 암 살상능력이 현저히 증가됨을 나타낸다.
도 36은 자가TIL 및 타가 TIL을 암세포에 처리 후 IL-12단독, IL18단독, IL12및IL18처리 후 암 살상 능력을 정량 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적인 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 의미를 따른다.
본 발명은 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법은 종양 조직에서 종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 암세포를 분리하는 단계, 상기 분리된 종양 침윤성 림프구를 상기 분리된 암세포와 공배양하는 단계 및 상기 공배양된 종양 침윤성 림프구를 사이토카인 및 노치 신호전달 (Notch signaling) 활성화제를 포함하는 배지에서 배양하여 리프로그래밍하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)란 종류(腫瘤)를 형성한 종양조직의 내부 또는 주위에 침윤하고 있는 림프구를 말한다. 종류부위에서 채취한 림프구를 IL-2 등의 존재 하에서 배양, 증식하여 같은 환자에 이입하여 종양을 치료할 수 있다.
본 발명에서 종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 암세포의 분리는 본 기술 분야에서 통상 쓰이는 방법이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 분리하는 단계는 피콜 밀도 경사 (Ficoll density gradient)를 이용하여 상기 종양 침윤성 림프구 및 환자 암세포를 분리할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포의 분리는 통상의 방법을 사용할 수 있고, 피콜(Ficoll) 방법을 사용할 수 있다. 피콜은 설탕과 에피클로로히드린을 서로 중합시킨 화합물로 일반적으로 약 40만 분자량을 사용한다. 피콜은 물에 녹이면 저점도에서 고밀도에 이르는 용액으로 변하기 때문에 세포, 바이러스 및 세포 소기관 등을 분리하기 위한 밀도기울기를 형성시키는 물질로 사용한다. 말초혈액단핵구의 경우에는 혈액 속에 포함되어 있는 적혈구, 과립성백혈구 (granulocytes) 및 죽은 세포에 비해 가볍고 혈장 (plasma)보다는 무거우므로 분리가 된다.
본 발명의 일 실시예에서, Collagenase 처리 후 ficoll gradient로 암 환경으로부터 TIL만 분리할 수 있다.
본 발명에서 Ficoll gradient에 의한 분리는 1% 내지 10% 농도로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%일 수 있다. 더욱 구체적으로, 4% 내지 6%일 수 있다(도 20 참조).
본 발명의 일 실시예에서, 분리하는 단계는 종양 조직에서 종양 침윤성 림프구와 암세포를 동시 또는 순차적으로 분리하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 종양 침윤성 림프구와 암세포를 동시에 분리하거나, 종양 침윤성 림프구 분리 후 암세포를 분리하거나, 암세포를 분리한 후 종양 침윤성 림프구를 분리할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법은 분리된 종양 침윤성 림프구 및 상기 암세포 중 적어도 어느 하나를 확장 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 배지에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체를 포함하는 배지에서 이루어질 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 항 CD3 항체는 배양 용기에 코팅된 상태일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 확장 배양하는 단계는 1일 내지 30일 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 5 내지 25일 또는 10 내지 25일 동안 수행될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
확장 배양하는 단계는 상기 각 단계가 1회 내지 10회 반복되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성에 따른 배양시 TIL 세포는 예를 들어 50 내지 200배 증폭될 수 있으며, 구체적으로 50 내지 150배, 80 내지 120배 또는 90 내지 110배 증폭될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 공배양하는 단계에서 상기 분리된 암세포는 방사선 처리된 것을 이용할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 공배양하는 단계는 1일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 1 내지 15일 또는 1 내지 10일 동안 수행될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 공배양은 별도의 지지세포(feeder cell) 없이 종양 세포로부터 분리된 암세포를 이용하여 수행될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다. 지지세포는 자가 유래 또는 동종 유래 혈액으로부터 분리된 것일 수 있다. 자가 유래 지지세포를 이용할 경우, 불필요한 자가면역반응이 배제되어 염증 등의 부작용을 최소화할 수 있다. 지지세포는 항-CD3 항체를 포함하는 배지에서 배양된 것일 수 있다.
항 CD-3 항체는 T 세포 수용체(TCR)와 회합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질로서, CD3 분자는 TCR과 비교하여 세포 내 영역이 길고 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당하고 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 항-CD3 항체는 예를 들어, OKT-3, UCHT1, HIT3a 등일 수 있다.
지지세포는 10 Gy 내지 30 Gy의 방사선이 처리된 것일 수 있다. 지지세포를 방사선 처리함으로써, 지지세포를 불활성화시켜 사용 상 안전성을 확보할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법은 공배양된 세포들 중 CD8+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 리프로그래밍하는 단계의 상기 공배양된 종양 침윤성 림프구는 CD8+ 표현형을 갖는 것일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 리프로그래밍하는 단계는 1일 내지 30일 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 5 내지 20일 또는 10 내지 15일 동안 수행될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 리프로그래밍하는 단계에서 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 배지에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, IL-2, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지, IL-7, IL-15 및 IL-21 배지 또는 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21를 포함하는 배지일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 리프로그래밍하는 단계에서 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제 중 DLL1, DLL4, GSK 3 inhibitor 및 GSK3 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함하는 배지에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제는 DLL4일 수 있다. 구체적으로, 상기 DLL4는 DLL4-Fc 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, DLL1 및 DLL4 단백질은 배양 용기에 코팅된 상태일 수 있으며, 상기 코팅은 상온에서 이루어질 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법은 리프로그래밍된 세포들 중 표현형이 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 줄기세포 기억 T세포의 표현형은 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ CXCR3+ CD95+ 일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, TIL 역분화시에 DDL4으로 배양 용기(플레이트(plate) 등) 표면을 코팅하는 경우 TSCM 역분화가 더 효과적으로 진행될 수 있다.
본 발명에서 항 CD3 항체는 1 μg/ml 내지 20 μg/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 1 μg/ml 내지 15 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml 또는 3 μg/ml 내지 8 μg/ml 로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 4 μg/ml 내지 6 μg/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-2는 100 IU/ml 내지 2000 IU/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 100 IU/ml 내지 1500 IU/ml, 500 IU/ml 내지 1500 IU/ml, 700 IU/ml 내지 1300 IU/ml 또는 800 IU/ml 내지 1200 IU/ml으로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 900 IU/ml 내지 1100 IU/ml으로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-7은 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 1 ng/ml 내지 15 ng/ml, 1 ng/ml 내지 10 ng/ml, 2 ng/ml 내지 8 ng/ml로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 4 ng/ml 내지 6 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-12는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 10 ng/ml 내지 40 ng/ml 또는 20 ng/ml 내지 40 ng/ml로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 20 ng/ml 내지 40 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-15는 10 ng/ml 내지 250 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 150 ng/ml 내지 250 ng/ml, 10 ng/ml 내지 200 ng/ml, 10 ng/ml 내지 150 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 40 ng/ml 내지 60 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-18은 1 ng/ml 내지 10 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 1 ng/ml 내지 5 ng/ml, 1 ng/ml 내지 4 ng/ml 또는 2 ng/ml 내지 4 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 IL-21은 10 ng/ml 내지 100 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 10 ng/ml 내지 80 ng/ml, 10 ng/ml 내지 70 ng/ml, 30 ng/ml 내지 70 ng/ml로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 40 ng/ml 내지 60 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 항-4-1BB 항체는 0.1 μg/ml 내지 1.0 μg/ml 로 포함될 수 있다. 구체적으로, 0.2 μg/ml 내지 0.9 μg/ml, 0.3 μg/ml 내지 0.8 μg/ml 또는 0.4 μg/ml 내지 0.7 μg/ml으로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 0.4 μg/ml 내지 0.6 μg/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 DLL4는 1 μg/ml 내지 20 μg/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 1 μg/ml 내지 15 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml 또는 3 μg/ml 내지 8 μg/ml 로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 4 μg/ml 내지 6 μg/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 TWS199는 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함될 수 있다. 구체적으로, 1 ng/ml 내지 15 ng/ml, 1 ng/ml 내지 10 ng/ml, 2 ng/ml 내지 8 ng/ml로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 4 ng/ml 내지 6 ng/ml로 포함될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 배양 방법에 따라 배양하는 경우, 배양된 세포는 TEM 세포일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 사이토카인 IL-12 및 IL-18은 세포에서 IFN-γ의 분비를 증가시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 분리된 CRC 조직은 collagenase 및 hyaluronidase를 2 내지 4시간 동안 37℃로 처리하고, ficoll isolation 한 후, CD3 코팅된 플라스크에서 40분 동안 활성화시키고, 20일 동안 IL-2 (1000 IU/ml), IL-7 (5ng/ml) 및 anti 4-1BB (0.25 μg/ml)을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명은 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법에 의해 제조된 줄기 기억 T 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 줄기세포 기억 T세포 (TSCM)는 줄기 세포와 같은 자가 재생 능력과 기억력 및 이펙터 서브 세트의 전체 스펙트럼을 재구성 할 수 있는 다능한 능력을 가진 기억 림프구를 말한다.
Cancer environment에서는 PD-L1 / PD-1, Treg, CTLA-4, LAG-3, TIM3, TIGIT 등 immune suppressor factor들이 매우 많이 존재하며, Activated T 세포의 수명이 짧아 암을 인식하고 공격하기까지 생존율이 낮다. 반면 암의 antigen을 한번 만난 경험이 있는 TIL을 사용하여 만들어진 TSCM은 cancer environment에서 얻은 TIL 또는 TEM에 비해 수명이 길며, 생존률이 높다. 또한 naive T cell로부터 분화된 TSCM과 같이 암 killing 능력이 다른 기억 세포(memory cell) 보다 뛰어나다.
본 명세서에서 중앙 기억 T 세포 (TCM)는 CD45RO, C-C 케모카인 수용체 유형 7 (CCR7) 및 L- 셀렉틴 (CD62L)을 발현하는 T 세포를 말한다. 중앙 기억 T 세포는 또한 CD44의 중간 내지 높은 발현을 갖는다. 이 기억 소집단은 림프절과 말초 순환에서 일반적으로 발견된다.
본 명세서에서 효과 기억 T 세포 (TEM)는 CD45RO를 발현하지만 CCR7 및 L- 셀렉틴의 발현이 부족한 T 세포를 말하다. 또한 CD44의 중간 내지 높은 발현을 갖는다. 이들 기억 T 세포는 림프절-호밍 수용체가 결여되어 말초 순환 및 조직에서 발견된다. TEMRA는 CD45RA를 재발현하는 말단 분화된 효과 기억 세포를 나타내며, 이는 순진한 T 세포에서 일반적으로 발견되는 마커이다.
본 명세서에서 효과 T 세포는 공동 자극과 같은 자극에 능동적으로 반응하는 여러 T 세포 유형을 포함하는 세포 그룹을 말한다. CD4 +, CD8 + 및 Treg 세포를 포함한다.
본 발명은 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법에 의해 제조된 줄기 기억 T 세포를 포함하는 세포치료제 조성물에 관한 것이다.
세포치료제 조성물은 세포치료제 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
세포치료제 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
세포치료제 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 상기 조성물의 경구투여를 위한, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
세포치료제 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 조성물은 예컨대, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 또는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포치료제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 통상의 방법에 의할 수 있고, 일 예로 경구 및 직장 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.
본 발명은 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 이에 제한되지 않으나, 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 담도암, 신장암, 갑상선암, 신경교종 및 피부암 등일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조되거나, 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 약학적으로 유효한 양의 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기에서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 mg 내지 150mg 또는 0.01 mg내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기에서 “약제학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 암 치료를 필요로 하는 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 통상의 기술자에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말일 수 있다.
기존의 TIL 배양 방법은 하기 표 1과 같다.
TIL culture methods
Feeder culture Auto PBMC (irradiated)
Auto cancer cell
Feeder free culture Fragment (24well plate)
Ficoll isolation Only cancer cell or Only TIL isolation
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실시예 1. 종양 침윤성 림프구(TIL)의 리프로그래밍
1.1. T SCM generation 방법(도 4 참조)
(1) 수술 후 얻은 환자의 종양조직에서 분리한 암세포를 T25 flask(Tumor cell completed media: DMEM F/12 + 10% FBS + 1% Anti-Anti)에 seeding한 후, 다음날 X-ray 방사선 조사를 하였다. (2Gy)
(2) 방사선 조사 직 후, 배양한 TIL과 co-culture를 진행하였다. Co-culture 배양 배지는 Alys505N-0 +10 % FBS + 2 mM L-Glu + 1000 IU/ml IL-2 + 5 ng/ml IL-7 + 50 ng/ml IL-15를 넣은 complete media로 진행하였다.
(3) TIL의 증식에 따라 위의 complete medium을 동일한 volume만큼 add 해주거나 더 큰 flask로 transfer하였다.
(4) 일주일 동안 총 2번 co-culture를 진행하고, 일주일 후 activated TIL을 수득하였다.
(5) Notch signaling을 활성화 시키기 위해 Recombinant human Fc fusion DLL4 protein(Cat#10171-H02H)을 250 μg/ml 농도로 sterile water에 녹이고, working solution 10 μg/ml로 만들었다.
(6) 레트로넥틴(Takara, Cat#T100A)을 10 μl/ml 농도로 sterile water or PBS에 녹이고 -20℃에 보관하였다.
(7) DLL4 protein working solution과 동일한 volume으로 retronectin을 1:1비율로 섞어주었다. (final conc. 5 μl/ml each)
(8) 위의 섞은 DLL4 + 레트로넥틴(retronectin) solution을 12 내지 6well plate에 coating하였다. (1000μl into each well of a 12-well plate)
(9) Coating한 plate는 parafilm으로 감싸 마르지 않도록 하고, RT에서 2시간 동안 두었다.
(10) 2시간 후, PBS는 제거하고 각 plate well volume에 맞게 cell culture media (Alys505N-0 + 10 % Fetal bovine serum + 2 mM L-Glutamine + 1000 IU/ml IL-2 + 5 ng/ml IL-7 + 50 ng/ml IL-15)와 세포를 seeding 해준다(e.g., TIL, Human T cell, Human CD8+ T cell). 세포는 37 ℃, 5% CO2 humid incubator에서 배양하였다.
(11) 2일 마다 새 cytokine이 포함된 새로운 배지 또는 새로운 coating plate에 옮겨주었다.
(12) 배양 9일 후, 새로운 배지와 cytokine을 첨가해줄 때, rhIL-21 (50 ng/ml)도 함께 넣어주었다.
(13) 14일 후, 세포를 수득하여 표현형 (CD45RO-CD45RA+CD62L+CCR7+CXCR3+CD95+)을 FACS로 확인하였다.
1.2. 방사선 조사 세기에 따른 역분화 정도 차이 비교
Activated CD8 T 세포를 얻기 위해 2Gy 또는 10Gy로 조사한 동일한 환자의 primary cancer cells과 TIL을 co-culture 하였다. 7일 동안 co-culture한 후, CD8 T cell만 sorting하여 TSCM 을 유도 하였다. 그 결과, 각각의 x-ray 방사선 세기에 따라서는 TSCM의 비율에는 차이가 없었다(도 5 내지 7 참조).
1.3. Generation cytokine concentration 조건
(1) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (5 ng/ml) + IL-15 (50 ng/ml)
(2) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (5 ng/ml) + IL-15 (50 ng/ml) + IL-21 (50 ng/ml)
(3) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (5 ng/ml) + IL-15 (200 ng/ml)
(4) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (5 ng/ml) + IL-15 (200 ng/ml) + IL-21 (50 ng/ml)
(5) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (10 ng/ml) + IL-15 (50 ng/ml)
(6) IL-2 (1000 IU/ml) + IL-7 (10 ng/ml) + IL-15 (50 ng/ml) + IL-21 (50 ng/ml)
1.4. cytokine concentration에 따른 역분화 정도 차이 비교
(1) cytokine concentration조건별 TSCM 형성 비교
IL-7, IL-15 cytokine의 농도가 만들어지는 TSCM 세포의 역분화에 영향이 있는지 확인하기 위해 IL-7과 IL-15의 양에 변화를 주어 14일동안 TIL을 역분화 배양하였다.
14일 후, 만들어진 TSCM을 FACS로 확인한 결과, 분화 마커로써 CD45RA, CD62L, CCR7, CXCR3를 CD8+ T cell에서 확인하였다. 각각의 조건에서 IL-15 200 ng/ml과 IL-7 10 ng/ml의 농도는 TSCM이 72.28 %, 72.64 %로 크게 차이가 나지 않았지만, IL-7 5 ng/ml, IL-15 50ng/ml 의 조건에서 81.58%로써 가장 높게 나타났다(도 18 참조).
각각의 농도에서 크게 차이가 나진 않았지만 TSCM 이 만들어지는 효율은 IL-7 5 ng/ml, IL-15 50 ng/ml이 가장 좋았다.
(2) IL-21 cytokine의 영향 확인
CD62L와 CD45RA, CCR7은 TSCM 의 분화 마커로써 잘 알려져 있기 때문에 역분화를 유도한 세포에서 발현하는 세포가 얼마나 있는지 확인하기 위해 각각의 마커에 대한 antibody를 사용하여 FACS 분석하였다. 10일에 IL-21을 처리한 실험군에서 14일과 16일 사이 기간 동안 TSCM의 surface marker중 CD62L, CCR7 또는 CD45RA, CCR7의 증가율을 확인하였다. 14일에 비해서 각각의 surface marker positive 세포들이 최소 20% 이상 증가하였고, 세포 수 또한 급격히 증가하는 것을 확인하였다(도 19 참조).
1.5. 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제 조건 변화
1.5.1. DLL4 코팅
(1) 각 조건별 16일 동안의 TSCM 형성 확인
총 16일 동안 CA-007환자의 TIL로부터 TSCM 을 형성하면서 각 조건 별로 또는 날짜 별로 CD45RA+CD62L+ 세포의 증가를 확인하였다(도 15 참조).
CA-007 환자의 조직으로부터 분리한 TIL을 자가유래 암세포와 공배양을 하여 활성화된 CD8+T cell을 얻은 후, TSCM을 유도하였다. 총 16일동안 배양을 진행하였고, 각 날짜 별로 표현형을 FACS로 분석하여 CD45RA+ CD62L+ 세포의 개체군이 어떻게 달라지는지 확인하였다. 5일 이후부터 CD45RA+ CD62L+ 세포가 급격히 증가하기 시작했고 10일에 IL-21을 50 ng/ml로 처리한 후, 14일 이후 또 한번 급격하게 증가하는 것을 확인하였다(도 14 참조).
(2) IL-21 cytokine의 영향 확인
IL-21이 T세포의 분화를 억제한다는 논문내용을 토대로 비교 실험을 진행한 결과, 각각의 cytokine 농도 조건에서 IL-21을 처리한 실험군에서 CD45RA+ CD62L+ 세포의 비율이 더 높게 나타났다(도 15 참조).
1.5.2. DLL1 코팅
CA-007 TIL 세포에 7일동안 DLL1 protein과 co-culture하여 TSCM이 유도되는지 확인하여 FACS로 살펴보았다.
DLL4와 유사한 Notch ligand인 DLL1 protein으로도 TSCM이 유도되는지 확인하기 위해 DLL1 protein과 co-culture하지 않은 실험군과, co-culture한 실험군으로 나누어 11일 동안 배양하였다(도 8 참조).
그 결과 DLL4 protein으로는 TSCM이 유도된 결과에 비해 DLL1 protein으로는 TSCM 이 유도되지 않았다. 결론적으로 Notch ligand 중에서 DLL4 ligand가 Notch receptor와 binding되어야 유도되는 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
1.5.3. TWS199 reagent 코팅
CA-007 TIL 세포에 7일동안 TWS119 reagent를 처리하여 TSCM이 유도되는지 확인하여 FACS로 살펴보았다.
최근 Naive T cell에서 TSCM을 유도하는 방법으로 가장 많이 쓰이는 시약인 TWS119가 분화가 진행된 상태의 CD8 T cell TSCM을 유도할 수 있는지 확인하기 위해 각각의 cytokine 조건과 TWS119를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 그 결과 TWS119는 모든 조건에서 TSCM을 유도하지 못하였다(도 10 및 11 참조).
1.6. 방사선 조사된 자가 유래 원발성 암 세포를 이용한 인간 종양 침윤 림프구의 활성화
원발성 자가 유래 암 세포를 10 % 열 불활성화된 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 DMEM F / 12 배지에서 배양하였다. 공기 중에서 5 % CO2로 가습된 인큐베이터에서 37 ℃에서 모든 세포 배양을 수행하였다. 배양된 암 세포에 5 % FBS를 함유한 DMEM F / 12 배지에서 2Gy를 조사하였다. 방사선 조사된 암 세포를 종양 침윤 림프구(TIL)와 함께 10 % FBS, 2 mM L- 글루타민, 1000 IU / ml IL-2, 5 ng / ml IL-7 및 0.25 μg/ml 항 4-1BB 항체를 함유하는 Alys505N-0 배지에서 7 일 동안 공배양하였다.
1.7. 활성화된 인간 CD8 + T 세포와 DLL4 단백질 및 레트로넥틴 (retronectin) 공동 배양
인간 CD8 + T 세포를 상기 언급된 방법을 사용하여 분류하였다. 노치 신호 전달을 활성화시키기 위해, 활성화된 T 세포를 DLL4 단백질 및 레트로 넥틴과 공동 배양하였다. 인간 CD8 + T 세포 및 DLL4 단백질은 10 일 동안 Alys505N-0 배지에서 인간 IL-2 (1000IU / ml), IL-7 (5ng / ml), IL-15 (50ng / ml)와 공동 배양되었다. 10 일 후, 인간 IL-21 (50 ng / ml)을 4 일 동안 배양 배지에 첨가하였다.
1.8. 대장암 환자의 조직으로부터 분리한 TIL을 14일 이상 배양하여 얻은 T SCM 세포의 세포 수와 표현형 변화
CA007 TIL을 총 14일동안 배양한 결과 유도된 TSCM은 최종 14일째에는 control에 비해 15배에서 최대 20배까지 세포수가 증가하였다. DLL4 단백질 10 μg을 coating하지 않은 플라스크에서 키운 TIL은 11일 이후 세포가 죽어간 것에 비해, DLL4 단백질을 coating한 플라스크에서는 세포수가 100배 이상 증가하였다. 이러한 결과로 long live가 특징인 TSCM 이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 그리고 CXCR3는 naive T cell과 TSCM을 구분하는 surface marker인데, 11일 이후부터 16일 까지 5일 배양하는 동안 CD45RA+CD62L+은 계속 증가하는 반면에 16일째에 CD45RA+CD62L+CXCR3+ 세포의 비율은 감소하였다. 이 결과로 보아 14일 이후 16일 사이부터 TSCM이 아닌 naive T cell로 역분화된 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 종양 침윤성 림프구의 분리 및 확장 배양
2.1. TIL 분리 방법
(1) 종양 조직을 Tissue lysis medium 10 ml에서 수술용 가위를 사용하여 물리적으로 단편화시켰다. Tissue lysis mediu은 1 mg/ml의 콜라게나제 V (collagenase V, Sigma), 0.0001 g/ml의 히알루로니다제 (hyaluronidase, Sigma), 1 %의 항생제 (Anti-Anti, Gibco)와 5 %의 FBS (hyclone)를 넣은 DMEM F/12 (hyclone)로 조성하였다.
(2) 최소 2시간에서 4시간까지 37 ℃ humidity chamber에서 인큐베이션한 후에, 100 μm cell strainer (Falcon)를 사용하여 단편화되지 않은 큰 종양 조직은 걸러주었다. 추가로 70 μm의 cell strainer (Falcon)로 다시 세포 현탁액을 걸러주었다.
(3) 50 ml 원심분리튜브에 넣고 상온에서 2500 rpm으로 10분간 원심분리를 진행하였다. 다시 5 % FBS가 포함되지 않은 DMEM F/12 배지 8 ml에 세포를 현탁한 후, 70 μm cell strainer로 한번 더 걸러주었다.
(4) 15 ml 원심분리 튜브에 4 ml의 피콜을 넣고, 그 위에 75 % 피콜 4 ml을 얹는다. 그리고 맨 위에 세포 현탁액 4 ml을 천천히 층이 쌓이도록 얹었다. 각각의 층마다 섞이지 않게 하였다. 75 % 피콜은 FBS가 포함되지 않은 DMEM F/12배지 2.5 ml을 피콜 7.5 ml과 혼합하여 사용하였다.
(5) 층을 쌓은 15 ml 원심분리 튜브를 400g에서 30분간 자연 감속으로 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면 원심분리튜브 안에 생기는 두 층을 각각 수득하여 아래 층은 암세포, 위 층은 TIL이라 한다. 각각의 층에 있는 세포를 수득하여 식염수로 1회 세척하였다.
2.2. TIL 확장 배양(도 21 참조)
2.2.1. TIL 확장 배양 방법
(1) 원심분리 후, 다수의 적혈구를 포함하는 경우, RBC lysis buffer (Thermo)를 사용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 암세포와 TIL은 기체 투과성 플레이트 또는 플라스크에서 확장하여 배양하였다.
(2) 암 세포는 DMEM F/12 + 10 % FBS + 1% Anti-Anti를 포함하는 배지에서 확장 배양하였다.
(2) TIL을 배양하기 전에 미리 1X HBSS 5 ml에 Anti-human CD3 antibody (BD)를 5 μg/ml 농도로 6 well plate 또는 T25 flask에 넣고, 37℃incubator에서 4시간 동안 코팅하였다.
(3) 조직으로부터 분리된 TIL이 1X107 미만일 경우, 6 well plate에 seeding하고, 1X107 이상 일 경우, T25 flask에 seeding하였다. Human CD3 antibody로 코팅된 6 well plate에 seeding 할 때, 배지의 total volume은 2 ml로 하고, T25에 seeding 할 때는 total volume을 5ml로 하였다.
2.2.2. 6 well plate 확장 배양 방법
6 well plate 기준으로 10 % Fetal bovine serum (FBS, Gibco) 200 μl, 2mM L-Glutamine (Gibco) 20 μl, 1000 IU/ml IL-2 (Proleukin) 1.12 μl, 5 ng/ml IL-7 (Peprotech) 1 μl, 0.25 μg/ml anti-human n4-1BB Bantibody y(BD) 1μl를 포함한 Alys505N-0 배지와 TIL 세포를 잘 혼합하여 well당 2 ml씩 seeding한다. CD3 antibody와 40분간 반응시키고, scraper로 긁어서 새 plate 또는 새 flask로 옮겨주었다.
배양 5일째, 위와 동일한 배지 volume과 supplement를 넣은 complete media를 2 ml 더해준다. 매일 IL-2, IL-7 및 항 4-1BB 항체를 농도에 맞게 추가해주고, 배지는 2 내지 3일에 한번씩 더해주었다. TIL가 전체 well의 80 % 이상 차지하면 2개의 well 또는 더 큰 flask로 옮겨주었다.
2.2.3. T-25 플라스크 확장 배양 방법
T-25 플라스크에서의 확장 배양은 1X107개 TIL을 각각의 플라스크에서 5 ml의 배지에 현탁하였다. TIL을 1000 IU/ml의 IL-2 및 5 ng/ml IL-7, 5 ug/ml anti human 4-1BB antibody (BD)가 보충된 Alys505N-0 배지로 5 % CO2 하에 37 ℃에서 배양하였다. 2일 마다 사이토카인이 포함된 신선한 배지를 기존배지의 두 배를 넣어주었다. T-150 플라스크까지 배양한 후, 세포를 1L Alys505N-0 배지가 포함된 기체 투과성 백에서 합하여 확장 배양하였다.
2.2.4. TIL 확장 배양 조건
(1) Tissue shipping test
1) 생리 식염수 또는 2) DMEM F/12 + FBS 5 % 이용하였다.
(2) 배양 사이토카인 조건
1) IL-2 (1000 IU/ml)
2) IL-2 + IL-7 (5 ng/ml)
3) IL-2 + IL-12 (30 ng/ml) + IL-18 (3 ng/ml)
4) IL-2 + IL-7 (5 ng/ml) + IL-12 (30 ng/ml) + IL-18 (3 ng/ml)
5) IL-2 + 4-1BB (250 ng/ml)
6) IL-2 + IL-7 (5 ng/ml) + 4-1BB (250 ng/ml)
7) IL-2 (X)
8) IL-2 + IL-15 (50 ng/ml) (x)
(3) Intracellular IFN-γcytokine FACS 분석
1) No treat (x)
2) IL-12 + IL-18 24hr treat (x)
(4) 용기 코팅 조건
CD3 또는 항 4-1BB 항체로 코팅하였다.
(5) 세포 독성 테스트 시간
24시간, 48시간 또는 72시간 동안 실험하였다.
(6) 배양액 내 supplement 종류
Autoplasma 10% 또는 FBS 10 %를 이용하였다.
(7) Cell stock 배지
1) Bambanker, 2) Cryostor CS10 또는 3) Alys + FBS + DMSO를 이용하였다.
실시예 3. CRC 환자의 TIL 연구
3.1. CRC 환자의 TIL 분리 및 확장 배양
CRC 환자 수술 후 얻은 종양 조직으로부터 TIL과 암 세포를 분리하기 위해 암 조직에 collagenase type 4을 4시간 동안 반응시키고 TIL을 ficoll gradient 방법으로 분리하였다. CA-001 환자의 TIL은 최초에 1.5X106 만큼의 세포가 분리 되었고, 총 16일 배양 후 1.56X108 만큼 증식하였다. 다른 환자인 CA-002 TIL은 최초에 1.64X107 만큼 분리되었고, 총 15일 배양 후 1.12X109 만큼 증식하였다. 각각의 환자의 TIL에 대해서 100배 또는 70배 증식한 세포를 얻을 수 있었다.
동일한 방법으로 배양한 10명의 환자 중 7명의 TIL을 분리에 성공하였고, 5명의 TIL을 확장 배양에 성공하였다.
3.2. CRC TIL의 intracellular IFN-γcytokine expression level 확인
분리한 TIL을 배양한 후 IFN-γ의 분비능을 확인하기 위해 6 well plate의 한 well당 2X106 씩 배양액 2 ml에 suspension 시켜 seeding 한 뒤, PMA와 BFA, Ionomycin을 4시간 동안 처리하여 세포를 자극시켰다. 자극시킨 세포는 IFN-γ antibody로 염색하여 FACS로 분석하였다. TIL 개체군 중 CD8 T 세포만 분리하여 IFN-γ를 분석했을 때, CA-001 PBMC는 14.39 %, CA-002 TIL은 41.05 %로 TIL이 더 높게 나왔다.
3.3. PBMCs의 CD8 T cell에서 IL-12, IL-18에 의한 intracellular IFN-γ분비할 수 있는 세포 분포 확인
CA-001 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMCs에 6일동안 IL-7, IL-12 및 IL-18을 다양한 조합으로 처리하여 IFN-γ를 유도한 뒤 intracellular IFN-γ FACS 염색을 통해 확인을 하였다.
3.4. CRC 환자의 TIL 세포 특성 분석
배양한 CRC 환자의 TIL의 기억세포 개체군을 확인하였다(도 23 A 참조). CA-001은 21일, CA-002는 9일, CA-004는 23일, CA-005는 27일, CA-007은 19일, CA-010은 12일 배양하였다.
전체적으로 EM 개체군이 높으며, PBMC에 비해 상대적으로 CM과 효과세포(effector cell) 개체군이 낮은 것으로 나타났다.
TIL에서의 T 세포 표현형 확인하였다(도 23 B 참조). PBMC에 비해 CD8+ 세포 의 비율이 높았고, 배양 후 4-1BB, PD-1 개체군이 낮게 검출되었다.
배양한 CRC 환자 PBMC의 기억세포 개체군을 확인하였다(도 23 C 참조). CA-001은 8일, CA-002는 9일, CA-004는 23일, CA-008는 16일, CA-010은 16일 배양하였다. 전체적으로 EM 개체군이 높게 나타났다. PBMC에 비해 상대적으로 CM과 효과 세포(effector cell) 개체군이 낮은 것으로 나타났다. 또한, PBMC에서의 T 세포 표현형 확인하였다(도 23 D 참조).
3.5. CRC 환자의 TIL 세포의 독성 분석
CRC 환자의 조직으로부터 분리한 TIL의 세포독성 능력을 확인하기 위해 intracellular IFN-γFACS staining을 수행하였다. 분리 후 대량 배양법을 통해 14일 이상을 배양한 PBMC 및 TIL의 세포 독성 능력을 확인한 결과, TIL이 PBMC에 비해 높게 나타났고, CA-004의 TIL 보다는 CA-002 TIL의 IFN-γ가 높았다. TIL의 CD8 T cell에서 IFN-γ cytokine 분비는 CA-002 41.05 %, CA-004는 21.43 % 였고, CA-001 PBMC와 CA-004 PBMC는 각각 14.39 %, 4.81 % 였다(도 24 A 참조).
IFN-γ의 분비량이 적은 CA-004 PBMC에 IL-12와 IL-18을 처리한 후, 24시간 후에 FACS 염색하여 확인하였다. IL-12와 IL-18을 처리하지 않은 세포는 4.81 %, 처리한 세포는 7.2 %로 2.39 % 더 높게 나타났다. IL-12와 IL-18을 처리하지 않은 세포보다는 높게 측정되었지만, 다른 CA-001 PBMC 또는 다른 TIL에 비해 현저히 낮게 측정되는 것을 확인하였다. 전체적으로 TIL에 비해 PBMC에서 낮은 분비량을 보였다(도 24 B 참조).
3.6. CRC 환자의 TIL 세포의 표현형 분석
CRC 환자의 TIL의 표현형을 확인하기 위해 조직으로부터 TIL을 분리 후 일정 시간 배양을 거친 세포들을 Flow cytometry analysis로 확인하였다. T 세포의 마커인 CD3를 발현하는 세포들을 gating 하여 분식을 진행한 결과, CRC TIL의 NK 세포의 비율은 7 % 미만으로 매우 낮았고, CD8 T 세포의 비율이 13 %~86 %로 가장 높았다. T 세포 중에서도 immune checkpoint marker인 PD-1은 분리 직후에는 높았지만, 배양 후에는 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 반면에 CRC 환자의 혈액에서 분리한 PBMC는 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 비율은 비슷하였고, NKT 세포가 TIL에 비해 약 높은 비율로 나타났다. T 세포는 분화정도에 따라 수명 및 세포독성이 달라진다. T 세포의 분화 정도를 알아보기 위해 CD45RA, CD62L, CCR7를 사용하여 세포의 분화정도를 FACS로 확인하였다. Central memory (CM; CD45RO+CD45RA-CD62L+), effector memory (EM; CD45RO+CD45RA-CD62L-), effector cells (CD45RO-CD45RA+CD62L-) 세가지 분화형을 확인한 결과, TIL에서는 대체로 EM이 70 %이상으로 가장 높았고, CM과 effector cell의 비율은 환자마다 다르지만 EM보다는 적은 비율을 차지하였다. PBMC 또한 TIL과 유사한 비율로 EM이 가장 높았고, effector cell과 CM은 EM보다 적은 비율로 존재하였다.
3.7. IL-7 및 4-1BB 항체의 CRC 환자의 TIL 세포의 증식 효과 분석
CRC 환자의 조직으로부터 분리한 TIL의 대량배양 방법을 확립하기 위해 세포의 viability 및 증식에 영향을 주는 IL-7 cytokine과 T 세포의 활성화에 영향을 주는 anti 4-1BB antibody를 처리함에 따라 세포 수 증식에 대한 동반상승효과를 확인하였다(도 26 A 참조).
또한 두 가지 시료를 첨가함으로써 세포의 viability에 영향을 끼치는지 확인 하기 위해 6일동안 daily로 처리하여 annexin V와 PI로 염색하여 FACS 분석한 결과 세포 생존율에는 큰 영향이 없는 것으로 나타났다 (도 26 B 참조).
3.8. Ficoll gradient를 이용한 CRC 환자 혈액에서의 PBMC 분리
Donor Initial cell count (~10 6 ) Final cell count (~10 6 ) Fold change
CA-001 PBMC 16.7 2245 134
CA-001 TIL 1.495 151 101
CA-002 TIL 16.4 1156 70.4
CA-004 PBMC 16.8 1120 66.7
CA-004 TIL 1.80 114 63.3
CA-007 PBMC 14.5 900 62
CA-007 TIL 15.8 196.4 12.4
CA-010 PBMC 10.6 322.4 30.4
CA-010 TIL 2.6 83.6 32
실시예4. TIL과 PBMCs의 자가 유래 암세포와 공배양하기 전과 후 표현형 확인
In vitro에서 배양한 CA-010 PBMC와 TIL을 동일한 환자의 종양 조직으로부터 얻은 cancer cell과 72hr 동안 공배양을 진행하였다. 72시간 후, TIL 및 PBMC를 수득하여 각각의 분화정도와 surface marker의 발현을 Flow cytometry로 확인하였다. PBMC와 TIL에서 공통적으로 공배양후 central memory (CM)이 많이 증가하였고, 그것과 반비례하여 Effector memory (EM)이 대폭 감소하였다. 이 두 memory cell에 비해 SCM과 Effector cell에는 큰 변화가 없었다(도 28 A 참조).
또한 공배양 후 표면 마커(surface marker)를 확인한 결과 상대적으로 CD8 T cells이 감소하고 CD4 T cells이 증가하였고, 4-1BB, PD-1, TIGIT가 공배양 전보다 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그에 비해 TIM-3는 큰 변화가 없었다 (도 28 B 참조).
실시예 5. In vitro에서 TIL의 cytotoxicity 확인
체외에서 대량 배양한 TIL을 동일한 환자의 종양 조직으로부터 얻은 암 세포와 72시간 동안 공배양을 수행하였다. 6 well plate에 cancer cells을 1X105/well로 seeding하고 다음날 Effector 세포 및 Target 세포를 여러 비율(control, 1:1, 2:1, 4:1 및 6:1)로 TIL과 공배양을 하였다. 공배양 후 암세포는 4 % PFA로 fixation 하고, crystal violet으로 염색하여 전체면적 대비 발색면적으로 분석하여 image J로 정량화 하였다. CA-002 TIL과 CA-003 TIL의 결과에서 Effector 세포 및 Target 세포를 4:1 비율로 공배양한 well에서 암세포의 생존율이 현저히 감소하는 것을 확인하였고, CA-003 TIL은 6:1 비율에서 4:1 비율에 비해 더 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
상기 세포 독성은 MHC class I의 antigen 인식에 의한 현상으로 보고 CA-002 TIL에 human MHC class I antibody를 처리한 후 공배양을 진행한 결과 세포 독성이 매우 감소하는 것을 확인하였다. 낮은 ratio에서 저항성을 보이는 CA-014 환자의 cancer cells에서 높은 ratio로 공배양을 진행하였을 때, PBMC 보다 TIL에서 높은 cytotoxicity를 보였다. PBMC에 비해 TIL과 공배양한 well의 cytotoxicity는 Effector 세포 및 Target 세포를 6:1 비율에서 40.8 %, 10:1에서는 61.8 %, 20:1은 67 %, 50:1은 89.5 %로 점점 cancer cells의 live cell 수가 감소하였다.
동일한 방법으로 환자의 전혈에서 분리한 PBMC의 세포독성도 확인해본 결과, 자가 유래 암세포에 대한 세포독성이 매우 높게 나타났다. PBMC의 세포독성은 Effector 세포 및 Target 세포의 1:1 비율에서도 크게 나타났고, CA-010 PBMC는 6:1 비율에서 거의 99 % 암세포 사멸을 유도 하였다(도 30 참조).

Claims (30)

  1. 종양 조직에서 종양 침윤성 림프구 (TIL) 및 암세포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 종양 침윤성 림프구를 상기 분리된 암세포와 공배양하는 단계; 및
    상기 공배양된 종양 침윤성 림프구를 사이토카인 및 노치 신호전달 (Notch signaling) 활성화제를 포함하는 배지에서 배양하여 리프로그래밍하는 단계;
    를 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 (TSCM) 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 분리하는 단계는 피콜 밀도 경사 (Ficoll density gradient)를 이용하여 상기 종양 침윤성 림프구 및 환자 암세포를 분리하는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 종양 조직에서 상기 종양 침윤성 림프구와 상기 암세포를 동시에 분리하는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 분리된 종양 침윤성 림프구 및 상기 암세포 중 적어도 어느 하나를 확장 배양하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 배지에서 이루어지는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 항 CD3 항체, IL-2, IL-7 및 항-4-1BB 항체를 포함하는 배지에서 이루어지는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 항 CD3 항체는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml로 포함되고, 상기 IL-2는 500 IU/ml 내지 1500 IU/ml로 포함되고, 상기 IL-7는 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함되고, 상기 항-4-1BB 항체는 0.1 μg/ml 내지 0.5 μg/ml 로 포함되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 CD3 항체는 배양 용기에 코팅된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 확장 배양하는 단계는 10일 내지 25일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계에서 상기 분리된 암세포는 방사선 처리된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 공배양하는 단계는 1일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 공배양된 세포들 중 CD8+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 리프로그래밍하는 단계의 상기 공배양된 종양 침윤성 림프구는 CD8+ 표현형을 갖는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 리프로그래밍하는 단계는 10일 내지 15일 동안 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 IL-2는 500 IU/ml 내지 1500 IU/ml로 포함되고, 상기 IL-7은 1 ng/ml 내지 20 ng/ml로 포함되고, 상기 IL-15는 10 ng/ml 내지 250 ng/ml로 포함되고, 상기 IL-21은 10 ng/ml 내지 100 ng/ml로 포함되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-7, IL-15 및 IL-21인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  20. 청구항 1에 있어서, 상기 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제는 DLL1, DLL4 및 GSK3 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 노치 신호전달(Notch signaling) 활성화제는 DLL4인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 DLL4는 1 μg/ml 내지 20 μg/ml로 포함되는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 DLL4는 DLL4-Fc 융합 단백질인 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 DLL1 및 DLL4로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 활성화제가 배양 용기에 코팅된 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 코팅은 상온에서 수행되는 것인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  26. 청구항 1에 있어서, 상기 리프로그래밍된 세포들 중 표현형이 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  27. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포 기억 T세포의 표현형은 CD45RO- CD45RA+ CD62L+ CCR7+ CXCR3+ CD95+ 인, 줄기세포 기억 T세포 제조 방법.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 제조된, 줄기세포 기억 T세포.
  29. 청구항 28의 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 세포치료제 조성물.
  30. 청구항 28 의 줄기세포 기억 T세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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