KR102581230B1 - 항암 관련 유전자 발현이 조절된 자연살해세포 및 이의 용도 - Google Patents

항암 관련 유전자 발현이 조절된 자연살해세포 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

항암 관련 유전자 발현이 조절된 고순도, 고활성의 자연살해세포의 배양방법 및 이의 항암 면역 치료 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 자연살해세포에 의하면, 배양 전후 항암 관련 유전자의 발현이 현저히 증가 또는 감소하며, 자연살해세포의 고유한 특성을 지니면서도 활성 및 증식배수가 현저히 높아 효과적인 항암 면역치료가 가능한 효과가 있다.

Description

항암 관련 유전자 발현이 조절된 자연살해세포 및 이의 용도{Natural killer cells with regulated gene expression of anti-cancer effect and uses thereof}
항암 관련 유전자 발현이 조절된 고순도, 고활성의 자연살해세포의 배양방법 및 이의 항암 면역 치료 용도에 관한 것이다.
현재 전세계적으로 가장 임상적으로 활발한 연구가 진행되고 있는 항암 면역 세포치료제는 T-세포치료제이다. T-세포는 면역세포 중 가장 많고, 높은 항암 면역기능을 갖는 주요 면역세포이나, 타인에게서 제공받은 동종(allogenic) T-세포 사용시 주조직 적합성복합체(major histocompatability complex: MHC)의 제한을 받아 심각한 이식편대숙주병(Graft-versus host disease: GvHD)을 유발할 수 있다.
한편, 자연살해세포(natural killer cell, "NK 세포"라고도 칭함)는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로, 혈액 내 림프구의 약 5 ~ 15%를 차지한다. 자연살해세포는 체내 1차 방어작용(선천성 면역반응)을 대표하는 면역세포로, 체내에 면역기억을 형성하여 장기간 존재하는 T-세포 기반 치료법에 비해 사이토카인 폭풍(cytokine storm) 등의 부작용이 적고, 이식편대숙주병을 유발하지 않아 동종 세포치료제로 사용될 수 있어 기성품(Off-the-Shelf) 형태의 치료제로 개발 가능하며, 항체-의존성 세포 독성(Antibody-dependent cell-mediated cutotoxicity: ADCC)도 유도할 수 있다.
그러나, 이러한 자연살해세포 자체의 치료적 이점, 및 안전성에도 불구하고, 자연살해세포는 T-세포와 달리 배양이 잘 되지 않는 세포로 알려져 있으며, 특히 동종 사용을 위해서는 T-세포의 혼입 없이 고순도의 자연살해세포를 배양하여야 하나 대량 증식이 어렵다는 한계가 있다. 최근 피더 세포(feeder cell) 등을 사용하여 자연살해세포의 대량 배양법이 개발되었으나, 치료제로의 적용 시 상기 피더 세포가 최종 산물에 혼입되어 안전성에 문제를 야기할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 고순도, 고활성의 자연살해세포를 배양하는 방법을 개발하던 중, 백혈구성분 분리채집술 및 폐쇄 시스템을 이용하여 CD3 음성, 및 CD56 양성인 자연살해세포를 추출한 후, 피더(feeder)를 사용하지 않고 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 공여자 혈장을 이용하여 배양하였을 때, 종래의 자연살해세포 제조방법보다 세포 증식력과 살상력이 높고, 고순도의 자연살해세포를 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 1) 인간 말초혈액으로부터 백혈구성분 분리채집술을 통해 단핵구 세포를 분리하는 단계;
2) 상기 분리한 단핵구 세포로부터 CD3-CD56+ 자연살해세포를 수득하는 단계; 및
3) 상기 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포에 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 처리하고, 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 배양액 중에서 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 배양방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물로서,
상기 조성물은 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 방법으로 배양된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 1) 인간 말초혈액으로부터 백혈구성분 분리채집술을 통해 단핵구 세포를 분리하는 단계;
2) 상기 분리한 단핵구 세포로부터 CD3-CD56+ 자연살해세포를 수득하는 단계; 및
3) 상기 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포에 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 처리하고, 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 배양액 중에서 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 배양방법을 제공한다.
본 명세서는 공지의 다른 자연살해세포 배양방법과 상이하고, 본 명세서에 따른 자연살해세포의 배양방법에 따라 배양된 자연살해세포는 99% 이상의 높은 자연살해세포 순도, 300~350배의 증식배수, 및 높은 암세포 살상능을 보이며, 배양 전후 항암 관련 유전자의 발현이 현저히 증가 또는 감소된 세포이다.
본 명세서에서 용어 "자연살해세포(Natural Killer cells)" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte: LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor: CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다.
상기 자연살해세포는 상업적으로 구입하거나, 인간 또는 동물로부터 채취할 수 있으며, 바람직하게는 자연살해세포에 의한 치료를 필요로 하는 인간으로부터 공급받을 수 있다.
자연살해세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체, 태반 또는 탯줄 유래 줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포로부터 생성될 수 있다. 또한 상기 자연살해세포는 생체 내 임의의 조직 공급원으로부터 공급받을 수 있다. 예를 들면 상기 자연살해세포는 생체로부터 채취된 혈액 중에 포함될 수 있다. 상기 혈액은 자연살해세포를 포함하는 혈액이라면 본 명세서의 배양방법에 적용하기 위한 자연살해세포 공급원으로서 이용가능하며, 예를 들면 전혈, 제대혈, 골수, 또는 말초혈액일 수 있다.
상기 자연살해세포는 예를 들면 말초혈액 단핵세포로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵세포이거나 또는 동종(allogenic)으로부터 얻을 수 있다. 따라서, 상기 자연살해세포는 자가(autologous) 또는 동종(allogenic) 자연살해세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)"는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해 세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 백혈구성분 분리채집술(leukapheresis) 또는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 분리할 수 있고, 바람직하게는 백혈구성분 분리채집술을 이용하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "백혈구성분 분리채집술(Leukapheresis)"은 채혈한 혈액에서 백혈구(Leukocytes)를 선택적으로 분리한 후 나머지 성분은 다시 제공자의 혈액으로 돌려주는 방법으로서 대량의 단핵백혈구를 수득할 수 있는 장점이 있다. 상기 방법에 의해 분리된 백혈구의 경우, 피콜-하이팩 밀도구배 분리법(Ficoll-Hypaque density gradient method) 등과 같은 별도의 방법 없이 본 발명에 사용될 수 있다. 백혈구성분 분리채집술을 수행하기 위한 방법 및 장비는 당업계에 공지되어 있다. 백혈구성분 분리채집술 장치의 예는 감브로 비씨티 (GAMBRO BCT)에 의해 제조된 코베스펙트라 (COBESpectra™) 및 박스터 펜월 (Baxter Fenwal)에 의해 제조된 CS3000 플러스 (Plus) 혈액 세포 분리기 (Blood Cell Separator)를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서의 PBMC는 백혈구성분 분리채집술을 시행하여 분리된 것일 수 있다. 일 양상에 따른 배양방법은 상기 백혈구성분 분리채집술을 통해 단핵구 분리 후 이로부터 CD3-CD56+ 자연살해세포를 수득하여 배양함으로써, 전혈에서 분리한 자연살해세포를 배양하는 경우에 비해 높은 enrichment의 자연살해세포 배양이 가능하다. 이러한 이유로, 상기 백혈구성분 분리채집술은 자연살해세포의 순도, 활성, 및 항암 관련 유전자 발현 양상에 영향을 미칠 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폐쇄 시스템"은 새로운 물질의 도입과 같은 배양 과정의 수행 동안 및 세포의 증식, 분화, 활성화 및/또는 분리와 같은 세포 배양 단계의 수행 동안 세포 배양 오염 위험성을 감소시키는 임의의 폐쇄 시스템을 지칭한다. 이러한 시스템은 GMP 또는 GMP 유사 조건("살균")하에 작동되어 임상적으로 적용 가능한 세포 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 폐쇄 시스템으로서 CliniMACS Prodigy® (Mailenyi Biotec GmbH, Germany)가 예시된다. 이 시스템은 WO2009/072003에 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 사용되는 것이 CliniMACS Prodigy®에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서의 CD3-CD56+ 자연살해세포는 백혈구성분 분리채집술로 분리된 PBMC에 대하여 CliniMACS Prodigy® 시스템을 이용하여 수득한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "양성 또는 +"은 세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 NKp44 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "NKp44+"이다. 본 명세서에서 용어, "음성 또는 -"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 면역 활성화 수용체, 세포사멸 유도물질(암세포), 항세포사멸 유도물질(자연살해세포), 케모카인, 케모카인 수용체, 면역증진 인자, 및 항암 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성이 증가되고, 면역 비활성화 수용체, 면역억제 인자, 및 세포사멸 유도물질(자연살해세포)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성이 감소된 자연살해세포일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "항암 관련 유전자"는 상기 나열한 항암 관련 인자를 코딩하는 유전자를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 모세포, 예를 들면, 조혈세포, 또는 자연살해전구세포에 비해, 세포 독성, 또는 자연살해세포의 본연의 면역조절능이 활성화된, 또는 상기한 바와 같은 항암 관련 인자의 발현이 조절된 세포를 의미할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 자연살해세포는 CD3-CD56+이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 면역 활성화 수용체의 발현은 NKG2D, NKp30, NKp44, 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 면역 비활성화 수용체의 발현은 KIR3DL2, 및 Siglec9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 세포사멸 유도물질의 발현은 FASL 및/또는 TRAIL(TNFSF10)의 발현인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 세포사멸 유도물질의 발현은 그랜자임 A(Granzyme A), 그랜자임 K(Granzyme K), 및 퍼포린(Perforin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 케모카인 및/또는 케모카인 수용체의 발현은 CCL1 및/또는 CCR5의 발현인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 항암 보조인자는 DAP10(HCST) 및/또는 IL-2RA의 발현인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 면역증진 인자는 GM-CSF의 발현인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 면역억제 인자는 IL-8(CXCL8) 및/또는 IL-10의 발현인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 세포사멸 유도물질(자연살해세포)는 Noxa의 발현인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 항세포사멸 유도물질(자연살해세포)은 BCL-2의 발현인 것일 수 있다.
일 양상에 따른 배양방법으로 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다:
(a) NKG2D, NKp30, NKp44, 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(b) KIR3DL2, 및 Siglec9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(c) FASL, 및 TRAIL(TNFSF10)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(d) 그랜자임 A(Granzyme A), 그랜자임 K(Granzyme K), 및 퍼포린(Perforin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가; 및
(e) CCL1, 및 CCR5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가.
또한, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (f) 내지 (j)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 추가로 갖는 것일 수 있다:
(f) DAP10(HCST), 및 IL-2RA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(g) GM-CSF(CSF2)의 발현이 증가;
(h) IL-8(CXCL8), 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(i) Noxa(PMAIP1)의 발현이 감소; 및
(j) BCL-2의 발현이 증가.
일 구체예에 있어서, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 활성화 수용체의 발현이 현저히 증가하고, 비활성화 수용체의 발현이 현저히 감소하여, 배양 전 자연살해세포에 비하여 순도, 세포 증식배수, 및 암세포 살상능이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "활성화" 또는 "활성화 수용체"라는 용어는 자극을 받았을 때 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 및 TNF-α) 생산, 세포내 자유 칼슘의 증가, 예를 들어 표적 세포에 대한 용해(lysis) 능력 또는 자연살해세포 증식을 자극하는 능력과 같은 자연살해세포 활성과 연관된 것처럼, 관련 분야에 알려진 어떤 특성 및 활성에서 측정 가능한 증가를 유발하는 자연살해세포 표면의 분자를 의미한다.
상기 자연살해세포 활성화 수용체의 예로는 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, IL-12R, IL-15R, IL-18R 또는 IL-21R 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
자연살해세포의 활성화 수용체는 주로 표적세포가 비정상 상태에 있을 때 발현이 증가하는 리간드들을 인식하여 세포 독성작용을 일으켜 표적세포를 제거한다.
NKG2D는 DNA 손상, 암 발생, 바이러스 감염 시 발현이 증가되는 세포내 분자인 UL16 binding proteins(ULBPs)와 MIC A/B, RAE1, H60, MULT1을 감지하여 세포독성 활성을 제공한다.
NKp30은 BAG6 및 NCR3LG1, B7-H6을 포함한 세포 외 리간드의 결합에 의해 활성화되는 수용체이고, 이들 리간드와 결합하여 세포 독성을 자극한다.
NKp44은 세포 표면의 당단백질 및 프로테오글리칸, 세포 외부로 노출될 수 있는 핵 단백질(nuclear proteins), 세포 외 공간에 방출되거나 세포 외 소포(vesicle)로 이동하는 분자를 리간드로 인식한다. 최근에는 NKp44는 세포외 매트릭스(ECM)-유래 당단백질 또는 성장 인자(growth factors)와 같은 가용성 혈장 단백질(예를 들면, PDGF-DD)을 인식하는 것으로 보고된 바 있다(Cell. 2018 January 25; 172(3): 534-548.e19., Front Immunol. 2019; 10: 719.).
본 명세서에서 용어 "비활성화" 또는 "비활성화 수용체"라는 용어는 자극받았을 때 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 및 TNF-α) 생산, 세포내 자유 칼슘의 증가, 예를 들어 표적 세포를 용해(lysis)하는 능력과 같은 자연살해세포 활성과 연관된 관련 분야에 잘 알려진 어떤 특성 또는 활성을 측정 가능하게 감소시키는 자연살해세포 표면의 분자를 의미한다.
상기 자연살해세포 비활성화 수용체의 예로는 KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, NKG2A, NKG2C, NKG2E, Sigleg9(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 9), 또는 LILRB5 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
FASL, 및 TRAIL은 자연살해세포의 세포독성 및 면역활성화에 관여하는 인자로서, 세포 표면의 수용체에 결합하여 표적 세포의 세포사멸을 유도하는 대표적인 단백질이다.
일 양상에 따른 자연살해세포는 NKp44 및 NKp30의 발현이 각각 1064배, 5.2배까지 현저히 증가하고, KIR3DL2 및 Siglec9의 발현은 현저히 감소하며, FAS-L(FASLG), TRAIL(TNFSF10)의 발현이 적게는 6.1배에서 많게는 24.5배까지 현저히 증가하여, 항암효과가 높아 효율적인 세포치료제로 활용될 수 있을 것으로 전망된다.
T 세포는 크게 CD8 양성인 cytotoxic T 세포(Tc)와 CD4 양성인 helper T 세포(Th)로 구분되며, 상기 Th 세포로부터 분비되는 사이토카인은 Th1 유형과 Th2 유형으로 나누어진다. Th1 세포는 주로 식세포작용에 의한 세포내 방어에 관여하고, IL-2, IL-12, INF-γ, 또는 TNF-α 등의 사이토카인을 주로 생성한다.
한편, Th2 세포는 IL-4, IL-6, IL-8, 또는 TGF-β 등의 사이토카인을 주로 생성하여 T 세포의 활성을 억제하면서 Th1 유형의 사이토카인 생산을 억제시킨다. 따라서, Th1 세포의 활성화 및 Th2 세포의 억제는 항암 면역 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있다.
그 중, IL-10 은 Th2 세포에서 생성되어 Th1 세포의 사이토카인 생성을 방해한다.
IL-8(CXCL8)은 주로 염증반응을 매개하는 염증촉진성(pro-inflammatory) 사이토카인으로서 종양의 CXCR1/2 과 결합하여 암세포의 증식 및 신생혈관의 증식(neoangiogenesis)을 촉진시키는 역할을 하는 호중구들을 염증부위로 유인하는 대표적인 케모카인이다.
일 양상에 따른 자연살해세포는 항암 면역 기능을 저해하는 IL-10 및 IL-8의 발현이 각각 1/100배, 1/1000배로 현저히 감소하여, 효율적인 세포치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에서 용어 "케모카인(chemokine)"은 활성화된 자연살해세포에서 분비되는 물질로, 케모카인은 다양한 염증세포들을 표적 장기로 동원(또는 이주)시킬 수 있다. 케모카인은 아미노산 염기 서열 중 첫 번째 두 개의 N-말단 시스테인(cysteine)의 배열 구조에 따라 4개의 군(C, CC, CXC, CX3X군)으로 분류되며 현재까지 40종 이상의 케모카인과 20종 이상의 케모카인 수용체가 알려져 있다. 특히, 종양과 종양을 둘러싼 숙주의 세포들로 구성되는 종양 미세환경(tumor microenvironment)에서, 종양-연관 숙주세포, 및 암세포는 다양한 케모카인을 분비하며, 그에 따라 항-종양 및 종양촉진 반응 사이의 균형을 매개하는 다양한 유형의 세포가 충원되고 활성화된다. 더 나아가, 화학주성의 역할 이외에도, 케모카인은 종양 세포 성장, 신생혈관 생성 및 전이를 포함하는 다른 종양-관련 과정에도 관여한다.
일 구체예에 있어서, 상기 케모카인 수용체는 CCR 또는 CXCR일 수 있고, 상기 CCR은 CCR1, CCR2, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9 또는 CCR10일 수 있으며, 바람직하게는 CCR2, CCR5, 또는 CCR6일 수 있다. 또한, 상기 케모카인은 CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL22, 또는 CXCL8일 수 있고, 바람직하게는 CCL1일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "CD3-CD56+ 자연살해세포"는 "CD3-CD56+ NK 세포", 또는 "CD3-/CD56+ NK 세포" 와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
상기 CD3-CD56+ 자연살해세포는 동결보존된 후 해동된 상태인 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포는 혈액에서 분리한 후, 동결시킨 다음 이를 다시 해동시켜 자연살해세포 배양에 이용할 수 있다. 상기 동결은 종래의 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 -42℃범위의 제1 동결단계, -42 내지 -15℃범위의 제2동결단계, 및 -15 내지 -120℃범위의 제3 동결단계로 이루어진 동결 방법에 의해 동결될 수 있다. 이 경우, 각 동결단계는 온도 범위 내의 여러 불연속적 온도에서 순차적으로 일정시간 시료를 유지시킴으로써, 각 동결단계의 온도 범위의 상한선 또는 하한선까지 온도를 상승 또는 하강시킬 수 있다. 일 구체예에서, 제1 동결단계는 0℃에서 10~15분, -12℃에서 5~10분, 및 -42℃에서 0.5~1분 동안의 조건으로 동결시키고, 상기 제2 동결단계는 제1 동결단계 후 -25℃에서 1~3분, 및 -15℃에서 1~3분의 조건으로 동결시키며, 상기 제3 동결단계는 제2 동결단계 후 -42℃에서 20~40분 및 -120℃에서 20~50분의 조건으로 동결시키는 과정으로 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제1 동결단계는 4~-40℃범위에서 0.5~5℃/m으로 동결하고, 상기 제2 동결 단계는 제1 동결단계 후 -40~-90℃범위에서 1~10℃/m의 조건으로 동결시키며, 상기 제3 동결단계는 제2 동결단계 후 -90~-120℃범위에서 1~10℃/m의 조건으로 동결시키는 과정으로 이루어질 수 있다. 동결방법의 각 동결단계는 CRF(controlled rate freezer)에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서의 말초혈액 단핵세포를 동결시킬 경우, 분리된 세포를 cryostor CS10 또는 ALyS505NK-EX와 Albumin+DMSO의 혼합액으로 세포를 부유하여 적정한 세포수가 되도록 조절한 후 동결하는 것이 바람직하다. 상기 동결보존된 말초혈액 단핵세포는 해동 후 본 명세서에 따른 자연살해세포의 배양, 및 증식에 제공될 수 있으며, 동결과정을 거침으로써 필요한 시기에 세포배양을 할 수 있다. 본 명세서는 높은 생존율을 유지하며, 활성화된 자연살해세포의 배양방법에 효과적으로 적용할 수 있는 말초혈액 단핵세포의 동결방법과 해동방법을 제공한다.
일 양상에 따른 자연살해세포 배양방법은 감마글로불린(IgG), 및 피브로넥틴의 존재 하에서 CD3-CD56+ 자연살해세포를 배양할 수 있다. 상기 감마글로불린, 및 피브로넥틴 존재 하에서의 배양은 예를 들면, 배양액 중에 감마글로불린, 및 피브로넥틴이 포함되어 있거나, 또는 배양면(세포와 접촉할 수 있는 배양용기의 면)에 감마글로불린, 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에서 세포를 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는 감마글로불린, 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기 안에서 자연살해세포를 배양하는 것일 수 있다. 상기 감마글로불린, 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기는 감마글로불린, 및 피브로넥틴을 함유하는 용액을 가하여 코팅함으로써 제작될 수 있다. 또한 상기 피브로넥틴 대신에 공지된 접착 단백질을 사용할 수 있으며, 예를 들면 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 일 실시예에서 배양용기(예를 들어 T75 플라스크)에 감마글로불린, 및 피브로넥틴이 함유된 용액을 가한 후, 저온(예를 들면 2~4℃)에서 인큐베이션함으로써 감마글로불린, 및 피브로넥틴에 의한 배양 용기의 코팅을 수행할 수 있다.
상기 감마글로불린의 농도는 0.1~1 ng/㎖, 1~10 ng/㎖, 10~100 ng/㎖ 또는 1~100 ng/㎖일 수 있다. 감마글로블린은 자연살해세포의 FcγRIII를 자극하여 자연살해세포를 활성화시킬 수 있다.
상기 피브로넥틴의 농도는 0.1~50 ㎍/㎖, 1~50 ㎍/㎖, 5~50 ㎍/㎖, 10~50 ㎍/㎖일 수 있다. 피브로넥틴은 자연살해세포의 이동을 촉진하여 세포 간의 상호작용을 원활하게 할 수 있다.
상기 배양은 말초혈액 단핵세포를 배양하여 자연살해세포를 배양하는 것일 수 있다.
상기 말초혈액 단핵세포의 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기에서 수행될 수 있으며, 배양액을 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 또한, 배지에 가해지는 PBMC의 농도는 4 x 105~ 5 x 107cells/㎖의 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양기간은 예를 들면 3~28일, 5~25일, 7~23일, 10~18일 또는 10~14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 원하는 자연살해세포 수의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내 또는 범위 밖에서 적절히 설정할 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백(Bag)을 포함할 수 있다.
한편, 자연살해세포를 최대한 증식시키기 위하여 배양은 각 단계별로 배양될 수 있다. 이 경우, 각 배양 단계는 배양액 성분, 배양 용기 및 배양 기간이 동일하거나 다를 수 있으며, 각 단계별 최적의 배양기간을 찾아냄으로써 최종적으로 자연살해세포의 증식이 이루어질 수 있다. 또한 본 명세서는 배양 기간 동안, 플라스크 내에 2~3일 간격으로 배양조성물(또는 배양액)을 추가하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 이로써 자연살해세포의 배양이 효과적으로 이루어지도록 도와주는 역할을 한다.
또 다른 양상은 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물로서,
상기 조성물은 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
일 양상에 따른 자연살해세포 배양방법은 CD3-CD56+ 자연살해세포에 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 처리하고, 이를 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 배양액 중에서 배양할 수 있다. 상기 배양액은 통상의 면역세포 배양용 배지에 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 포함하는 것일 수 있다. 면역 세포 배양용 배지로는 예를 들면, ALyS505NK-EX (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본), RPMI1640 (Life technologies, 미국), x-vivo10 (Lonza, 미국), CellGro SCGM (CellGenix, 독일), KBM (Kohjin bio, 일본) 등의 배양액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양액에 포함되는 IL-2의 농도는 500-5,000 IU/㎖, 600-4,000 IU/㎖, 700-3,000 IU/㎖, 800-2,000 IU/㎖, 900-1,500 IU/㎖, 900~1,200 IU/㎖ 또는 1,000~1,200 IU/㎖ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 IL-2는 자연살해세포의 성장을 촉진시킬 수 있다.
상기 배양액에 포함되는 항-NKp46 항체의 농도는 0.1~10 ㎍/㎖, 0.5~10 ㎍/㎖, 1~10 ㎍/㎖, 또는 5~10 ㎍/㎖일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. NKp46은 자연살해세포의 활성화 수용체로서, 이에 따라 상기 항-NKp46 항체는 NKp46을 자극하여 자연살해세포를 활성화시킬 수 있다.
또한, 상기 배양액에 포함되는 혈장은 자연살해세포 배양을 위해 이용되는 말초혈액 단핵세포를 분리시킨 말초혈액으로부터 얻을 수 있다. 상기 혈장 대신 혈청을 사용할 수 있다.
상기 혈장의 농도는 전체 배양액에 대해 1~20 v/v%, 1~15 v/v%, 2~15 v/v%, 5~15 v/v%, 또는 5~10 v/v% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 자연살해세포 배양용 조성물은 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 기존 자연살해세포 배양 시 암 세포주를 피더 세포로 사용하여 증식율, 및 세포 독성을 향상시키는 방법이 사용되었으나, 암 세포주를 피더 세포로 사용하는 경우 임상 적용 시 중요한 안전성을 보장하기에 어려움이 있고, 배양된 자연살해세포는 특정 암세포에 대한 프라이밍(priming) 특이성이 부여된 자연살해세포라는 한계를 가진다. 또한 배양 후 피더 세포가 완전히 제거되었음을 입증하는 공정의 복잡성을 배제할 수 있고, 피더 세포의 오염의 가능성을 배제하여 안전성을 더욱 높일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 일 양상에 따른 조성물은 피더 세포를 사용하지 않고, IL-2, 항-NKp46 항체, 및 공여자 혈장만을 포함한다. 이를 사용하여 CD3-CD56+ 자연살해세포의 배양 시 오랜 기간 체외(in vitro)에서 배양하여도 세포 증식, 세포 생존율이 현저히 높은 수준으로 안정적인 배양이 가능하다. 뿐만 아니라, 상기 자연살해세포는 현저히 증가된 암세포 살상능력을 나타내면서도, 피더 세포를 포함하지 않아 기존의 자연살해세포와 비교하여 임상적으로도 안전하게 적용이 가능하다.
각 배양 단계의 배양액에는 자연살해세포의 순도, 증식배수, 및 암세포 살상능을 증가시키는 효과를 해치지 않는 것을 조건으로, 적절한 단백질, 사이토카인, 항체, 화합물 그 외의 성분이 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물에 의하여 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다:
(a) NKG2D, NKp30, NKp44, 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(b) KIR3DL2, 및 Siglec9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(c) FASL, 및 TRAIL(TNFSF10)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(d) 그랜자임 A(Granzyme A), 그랜자임 K(Granzyme K), 및 퍼포린(Perforin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가; 및
(e) CCL1, 및 CCR5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가.
또한, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (f) 내지 (j)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 추가로 갖는 것일 수 있다:
(f) DAP10(HCST), 및 IL-2RA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(g) GM-CSF(CSF2)의 발현이 증가;
(h) IL-8(CXCL8), 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(i) Noxa(PMAIP1)의 발현이 감소; 및
(j) BCL-2의 발현이 증가.
일 구체예에 있어서, 상기 혈장은 인간 말초혈액으로부터 분리된 것일 수 있다.
또한, 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 감마글로불린, 및 피브로넥틴을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 발현은 배양 전의 자연살해세포 또는 자연살해세포 세포 집단에 비해 배양 후에 상기 나열된 항암 관련 유전자, 또는 인자를 더 많이 또는 더 적게 발현하는 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 배양된 자연살해세포 또는 자연살해세포 집단은 전체 세포 중 또는 또는 전체 세포 집단 중 상기 인자를 적어도 70% 이상, 적어도 80%이상, 적어도 90%이상, 적어도 95%이상, 적어도 96%이상, 적어도 97%이상, 적어도 99%이상, 또는 100% 발현하는 것일 수 있다. 상기 "% 발현" 또는 "발현율"은 시료 내 총 세포 수 대비 상기 인자 중 하나 이상을 발현하는 자연살해세포의 백분율을 의미하는 것일 수 있다. 상기 세포 또는 세포 집단 중 상기 인자의 발현 또는 발현율은 유세포분석기를 이용하여 검출한 값에 의해 판단할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 명세서는 상기 자연살해세포 배양방법에 의하여 배양된 자연살해세포를 덱스트란 및 알부민을 포함하는 용액에 현탁하여 상기 자연살해세포를 보관하는 단계를 더 포함하여 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 명세서의 자연살해세포 배양방법에 의해 배양된 자연살해세포는 배양 전과 비교하여 99% 이상의 높은 순도, 300~350배의 증식배수, 및 높은 암세포 살상 역가를 보였으며, 세포살상력과 연관이 높은 인자의 발현의 현저한 증가, 염증성 효과기 세포(inflammatory effector cell)를 동원하는 케모카인(chemokine) 수용체 발현의 현저한 증가, 리간드와 결합할 때 자연살해세포를 비활성화시키는 비활성 수용체 발현의 현저한 감소, 자연살해세포의 세포 사멸을 억제하는 유전자의 현저한 증가, 및 이를 촉진하는 유전자의 현저한 감소를 보였다(도 6 및 표 1 참조).
본 명세서에서 상기 자연살해세포는 상기 언급된 항암 관련 인자들을 발현하도록 또는 이들의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소되도록 배양되거나 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 명세서에서 상기 배양은 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 상기에서 언급한 바와 같은 항암 관련 인자들의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소되도록 배양된 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가(increase in activity)", 또는 "증가된 활성(increased activity)"은 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가(increase in activity)", 또는 "증가된 활성(increased activity)"은 주어진 모세포 또는 야생형 세포 또는 배양 전 세포(예를 들면, PBMC) 세포에 비해 더 높은 수준의 단백질, 또는 효소의 활성을 의미한다.
다른 양상은 상기 방법으로 배양된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 세포치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "세포치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식·선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며, 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "질환"은 하나의 병리적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역성 장애, 퇴행성 질환, 세포사멸 관련 질환 및 이식편 거부를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "감염성 질환"은 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등과 같은 유기체에 의한 감염성 질환을 통칭할 수 있다. 예를 들어, HIV(Human Immunodeficiency Virus), EBV(Epstein-Barr virus), HHV(Human Herpes Virus), IAV(Influenza A virus), COV-19 와 같은 바이러스성 감염의 경우, 일 양상에 따른 자연살해세포에서 발현이 증가된 활성화 수용체인 NKp46, NKp44, 또는 NKp30 등이 바이러스의 당단백질(viral glycoprotein)과 결합 및 활성화되어 감염세포의 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 예를 들어 CMV(Cytomegalovirus), EMCV(Encephalomyocarditis virus)와 같은 바이러스성 감염의 경우, 일 양상에 따른 자연살해세포에서 발현이 증가된 FASL, TRAIL 등이 바이러스 감염 세포에서 증가된 세포사멸수용체(death receptor)와 결합하여 감염세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는," "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
상기 투여는 추가적인 항암제 또는 사이토카인 제제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 추가적인 항암제의 예시는 알킬화제 (alkylating agent), 안티메타볼라이트, 방추체 저해제 식물 알칼로이드, 세포 장애성/항종양 항생 물질, 토포이소머라아제 저해약, 항체, 광 증감제 및 키나아제 저해약이 포함될 수 있다. 상기 항암제의 예시는 타겟팅 요법과 종래의 화학 요법에 사용되는 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체의 예시는 알렘투주맙, 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 겜투주맙 오조가마이신, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 퍼투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레사이비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀몰류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙 및 비실리주맙이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "분리된 세포", 예컨대, "분리된 자연살해세포" 등은 세포가 기원하는 조직, 예컨대, 말초혈로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
일 양상에 따른 조성물은 신생물로부터 유래한 종양 또는 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 신생물은 악성 또는 양성일 수 있으며, 암은 원발성 또는 전이성일 수 있고; 신생물 또는 암은 초기 또는 말기일 수 있다. 치료될 수 있는 신생물 또는 암의 비-제한적 예에는 교종, 위장관기질종양, 백혈병, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 후두암, 직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암, 혈액암, 림프종, 및 다발성골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 교종, 위장관기질종양, 백혈병, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 교종은 바람직하게는 신경교종일 수 있으며, 상기 백혈병은 바람직하게는 만성골수단핵구성백혈병일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 일 양상에 따른 자연살해세포는 MML5, HSPG, BAG6, B6-H6 등의 NKp44 리간드, NKp30 리간드의 발현이 높은 암종에서 더욱 효과가 있을 것으로 예상된다. PDGF가 증가된 종양으로는 교종(Glioma), 위장관 기질종양(Gastro-intestinal stromal tumor), 만성골수단핵구성백혈병(chronic myelomonocytic leukemia), 유방암 등이 있으며, 특히 PDGFα는 유방암의 림파선 전이, 높은 조직학적 분화도(high histologic grade), ER/PR negativity, 삼중음성 유방암의 아형(Triple-negative breast subtype)과 연관성이 높은 것으로 보고된다(Breast Cancer Res Treat. 2018; 169(2): 231-241.). 따라서 일 양상에 따른 자연살해세포는 이들 종양에 더욱 효과적일 수 있다.
또한, 일 구체예에 있어서, 일 양상에 따른 자연살해세포는 케모카인 중 CCL1(318배), 케모카인 수용체 중 CCR5(49.9배)가 현저하게 증가하였다. 이들 발현이 증가된 면역 세포는 단핵구, B-세포, 및 수지상 세포와 같은 다른 효과기 세포들(effector cell)을 동원(recruit)하여 종양세포의 살상에 더욱 유리하며, 특히 CCR5 발현이 증가되면 CCL3/CCL4/CCL5+ 종양 세포에 친화력이 있어 이들 종양의 살상에 더욱 유리하다. CCL5는 전이성/진행된 유방암, 자궁 경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 난소암(Mediators of Inflammation Volume 2014, Article ID 292376) 등에서 발현이 많이 증가되어 있어 CCR5가 증가된 일 양상의 자연살해세포는 상기 종양에 더욱 효과적일 수 있다.
일 구체예에 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회 또는 1,000~100,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
"개체"란 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 면역세포, 또는 그의 활성을 증가시키는 물질은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
일 양상에 따른 자연살해세포에 의하면, 배양 전후 항암 관련 유전자의 발현이 현저히 증가 또는 감소하며, 자연살해세포의 고유한 특성을 지니면서도 활성 및 증식배수가 현저히 높아 효과적인 항암 면역치료가 가능한 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 배양 후 21일차의 표현형을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 배양기간별 세포 수 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 배양 후 21일차의 증식배수 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 배양기간별 생존율 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 E:T 비율에 따른 세포살상능 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 항암 관련 유전자의 발현 변화를 히트맵(heat map)으로 나타낸 도이다. (A) 자연살해세포 수용체 관련 유전자 변화에 따른 군집화(clustering); (B) 사이토카인/케모카인 유전자 변화 군집화; (C) 세포 살상 관련 유전자 변화 군집화.
도 7은 일 구체예에 따른 자연살해세포와 대표적인 인간 NK 세포주의 E:T 비율에 따른 세포살상능을 비교한 도이다.
도 8은 일 구체예에 따른 자연살해세포 투여에 따른 항암 효과를 확인하기 위한 투여 스케줄을 나타낸 도이다.
도 9는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 난소암 마우스 모델에서의 항암 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예. 항암 관련 유전자 발현이 조절된 고순도, 고활성의 자연살해세포의 제조
항암 관련 유전자 발현이 조절된 고순도, 고활성의 자연살해세포를 제조하기 위해 다음과 같이 자연살해세포를 배양하였다.
1. 자연살해세포의 제조
1.1. CD3-CD56+ 자연살해세포의 분리
건강한 공여자 3명(Donor 1, Donor 2, Donor 3)의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC), 및 혈장(300㎖)을 백혈구성분 분리채집술(leukapheresis)을 시행하여 각각 분리하고, 각각의 2 ~ 5 x 1010 (cells)의 분리된 단핵구에서 CliniMACS Prodigy® 시스템을 이용하여 CD3-CD56+ 자연살해세포를 수득하였다.
구체적으로, 백혈구성분 분리채집은 Spectra-Optia (Ver. 11) 성분 채집 장비를 사용하고, 헤파린 (heparin) 3000 U/ACD (acid citrate dextrose) 500mL을 사용하여 14000~16000mL의 혈액을 순환시켰다. 최종적으로 채집된 양은 150~250mL, 채집된 총 백혈구 수는 2~5 x 1010 (cells)였다. 다음으로, CD3-CD56+ 자연살해세포의 제조는 폐쇄 시스템인 CliniMACS Prodigy®를 사용하여 수행되었다. 상기 채집한 혈액 내 백혈구를 출발 물질로 사용하여 T cell fraction (%)을 계산 후, 총 부피에서 T cell 수를 계산하여 T cell이 총 9.5 x 109 (cells)가 되도록 맞추어 넣어주었다. 세포 배양 챔버 내에 항-CD3 단일클론항체가 결합된 마이크로비드 (7.5mL/95mL buffer)를 넣어 반응시켜 4~5시간 후 CD3 음성세포를 수득한 다음 (0.9~1 x 1010 cells), 상기 CD3 음성세포에 항-CD56이 결합된 마이크로비드 (7.5mL/95mL buffer)를 이용하여 양성적으로 분리(positive selection)하여 CD3-CD56+ 자연살해세포를 0.3 ~ 3 x 109 (cells)로 수득하였다.
1.2. CD3-CD56+ 자연살해세포의 동결, 및 해동
실시예 1.1에서 분리한 CD3-CD56+ 자연살해세포를 3 x 108 (cells)/바이얼(vial)로 동결하여 총 3 바이얼을 LN2 탱크로 옮겨 보관하고(-130℃이하), 이후 실험에서 필요시 해동하여 사용하였다.
구체적으로, 실시예 1.1에서 얻어지는 모든 세포 현탁액을 1,500rpm, 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 2 내지 8℃에서 보관해 둔 Cryostor CS10 또는 ALyS505NK-EX+Albumin+DMSO 혼합액으로 수득한 자연살해세포를 부유하여, 세포수가 1~100 Υ106 cells/㎖이 되도록 만들었다. 부유한 세포를 2㎖ 동결 바이얼(cryogenic vial)에 1㎖ 씩 분주한 다음 CRF(controlled rate freezers)를 사용하여 0℃에서 10~15분, -12℃에서 5~10분, 및 -42℃에서 0.5~1분 동안의 조건으로 제1 단계 동결시키고, 제1 동결단계 후 -25℃에서 1~3분, 및 -15℃에서 1~3분의 조건으로 동결시키며, 제2 동결단계 후 -42℃에서 20~40분, 및 -120℃에서 20~50분의 조건으로 동결시키거나, 또는 4~-40℃범위에서 3℃/m으로 제1 단계 동결하고, 제1 동결단계 후 -40~-90℃범위에서 5℃/m의 조건으로 제2 단계 동결시키며, 제2 동결단계 후 -90~-120℃범위에서 5℃/m의 조건으로 동결시켰다. 동결한 세포를 LN2 탱크로 옮겨 보관하였다 (-130℃ 이하).
해동 시에는 히트 블록을 37℃가 되도록 셋팅한 다음, T 플라스크에 10% 혈장(plasma)이 첨가된 배양액을 넣었다. 세포 농도에 따라 배양액 볼륨은 예를 들어 4㎖, 6㎖, 8㎖, 또는 10㎖ 등으로 다양하게 조절해줄 수 있다. 상기 동결 바이얼을 히트 블록에 넣어 동결된 세포를 녹였다. 동결된 세포가 반 정도 녹았을 때, 배양액이 담긴 T 플라스크로 옮겼다. 이어서, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 하루 동안 배양하였다. 배양된 세포를 튜브에 모은 후 Ca/Mg 유리(free) DPBS를 첨가하고 1,500rpm, 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 원심분리에 의해 분리된 세포를 소량의 배양액으로 부유시킨 후 세포수를 측정하였다.
2. 자연살해세포의 배양
2.1. 피브로넥틴, 및 감마글로불린으로 코팅된 배양 플라스크 준비
15㎖ 튜브에 0.01㎖ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore), 및 0.121㎖ 감마글로불린(#020A1004, 녹십자) 용액을 넣은 다음, Ca/Mg 유리 DPBS을 9.859㎖을 첨가하였다. 제조된 코팅액을 피펫을 이용하여 T75 플라스크(#156499, Nunc)에 넣어 주고 16시간 이상 2~8℃에서 반응시켰다. 세포 배양 전 잔여 코팅액을 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척한 후 제거하였다.
2.2. 자연살해세포의 1차 배양
실시예 1.2에서 동결, 및 해동한 CD3-CD56+ 자연살해세포의 세포 현탁액을 취하여 상기 실시예 2.1에서 제조된 코팅 플라스크에 접종하고, 피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않고, IL-2, 항-NKp46 항체, 및 공여자 혈장을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 3일에서 5일 동안 배양하였다.
2.3. 자연살해세포의 2차 배양
실시예 2.2의 1차 배양 후 인큐베이터에서 세포가 배양되고 있는 T75 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후, 상기 세포와 남은 공여자 혈장 또는 FBS를 추가하여 세포현탁액을 만들고, 배양액이 들어있는 2L CO2 투과성 배양 백(bag)에 세포현탁액을 첨가하였다. 배양액과 세포현탁액이 잘 섞이도록 해준 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 7일에서 14일 동안 배양하여 세포를 증식시켰다. 배양이 끝난 최종 배양액은 원심분리튜브에 담아 여러 번의 원심분리를 통해 세포를 수확하였다.
실험예 1. 자연살해세포의 순도, 및 증식능 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 공여자 2명 유래의 CD3-CD56+ 자연살해세포 2 x 108 (cells)에 대하여 배양 후 8, 14, 및 21일에 각각 세포 수를 확인하였고, CD3 및 CD56 항체로 염색하여 CD3-CD56+인 자연살해세포군의 비율을 공지된 방법으로 FACS 분석하였다.
그 결과, 배양 초기에서부터 CD3-CD56+인 자연살해세포군의 비율은 현저히 높았고(배양 0일차: 96.0%), 배양 기간 중 CD3-CD56+ 자연살해세포의 비율은 계속해서 증가하였다(Donor 1, 및 2의 CD3-CD56+ 평균 자연살해세포 비율; 배양 8일차: 96.4%, 배양 14일차: 98.3%).
특히, 배양 후 21일차에는 CD3-CD56+ NK세포가 각각 99.2%, 99.6%를 차지하여 배양 전 대비 고순도의 자연살해세포로 분포하고 있음을 확인하였다(도 1).
또한, 공여자 2명 유래의 CD3-CD56+ 자연살해세포는 배양 후 14일차에 평균 113±27 배 증식하였고, 배양 후 21일차에는 자연살해세포가 각각 6.9 x 1010, 4.9 x 1010 (cells)로 증식하여 평균 300~350배의 증식배수로 현저히 증가함을 확인하였다(도 2, 도 3). 뿐만 아니라, 21일 동안의 배양 기간 동안 모두 평균 90% 이상의 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다(도 4).
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 자연살해세포는 오랜 기간 체외(in vitro)에서 배양하여도 세포수가 현저히 증가하고, 생존율이 90%에 이를 정도로 안정적으로 배양됨을 알 수 있었다. 또한, 백혈구성분 분리채집 및 CD3-CD56+ 자연살해세포 분리(selection)를 수행하여 배양함에 따라 밀도구배 분리법과 비교하여 다른 불순물을 적게 포함하고, 높은 순도의 자연살해세포를 획득할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2. 자연살해세포의 암세포 살상능 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 자연살해세포의 암세포 살상능을 평가하기 위하여, 배양 21일차의 자연살해세포를 사용하고 자연살해세포에 대한 민감성이 높은 혈액암 세포주 K562를 표적세포로 하여 세포의 살상능을 평가하였다.
먼저, 타겟 암세포(K562)를 수거하여 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 다음 DPBS로 희석하여 세척하고, 세척한 후의 세포 펠렛은 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 부유하였다. 조건 당 1 x 105 의 세포를 준비하고, CFSE(Life technologies) 5μM의 농도로 5% CO2 조건에서 인큐베이터에서 10분간 정치하여 염색하였다. DPBS로 두 번 세척한 다음 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 희석하였다. 활성화 자연살해세포는 타겟 세포와의 E:T 비율 (1:1, 1.25:1, 2.5:1, 5:1, 10:1, 20:1)에 따라 준비하고, 24-웰 플레이트에 타겟 세포와 함께 분주하여 섞어주었다. 4시간 동안 반응을 시키고, 반응이 끝나기 20분 전에 7AAD(7-Aminoactinomycin D)를 처리하였다. 반응이 끝난 후에는 세포를 5 ㎖ FACS 튜브에 수거하고, 유세포 분석기를 통하여 세포의 살상능을 분석하였다.
그 결과, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 E:T=10:1, 및 20:1에서 90% 이상의 현저히 증가된 세포 살상능을 나타내며, 특히 E:T(효력세포:표적세포)의 비율이 1:1 내지 1.25:1에서도 80% 이상의 상당한 살상능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다(도 5).
상기 결과들을 종합해 볼 때, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 상기 실시예에 따른 배양 과정을 통해 순도가 99%를 상회하는 수준으로 증가된 고순도의 자연살해세포이며, 높은 증식효율을 보일 뿐만 아니라, 높은 암세포 살상능을 보임을 확인하였다.
실험예 3. 자연살해세포의 항암 관련 유전자 발현 분석
3.1. 자연살해세포의 항암 관련 유전자의 mRNA 발현 양상 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 공여자 3명 유래의 자연살해세포의 자연살해세포 분리 직후(D0) 및 14일 배양 후(D14)의 자연살해세포의 항암 관련 유전자의 mRNA 발현 양상을 분석하였다.
구체적으로, 배양 전 세포와 배양 후 세포에서 트리졸 분리 방법으로 RNA를 추출하였고, 총 RNA 시퀀싱을 수행하여 mRNA의 발현 양상(Fold change, D14 자연살해세포/D0 자연살해세포)을 확인하였다. 발현 양상은 공여자 3명의 평균값으로 나타내었으며, 보정된 p-value인 q-value가 0.001 이상인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 보았다. 그 결과를 도 6, 및 하기 표 1에 나타내었다.
기능 유전자 증가/감소 Fold change q-value
NKR Activating
Receptor		 NKp44(NCR2) 증가 1064 배 0.000325856
NKp30(NCR3) 증가 5.2 배 0.000163883
Inhibitory
Receptor
/molecule		 KIR3DL2 감소 1/2 0.035349
SIGLEC9 감소 1/20 0.012559253
Activating molecule DAP10 (HCST) 증가 1.7배 0.023375131
IL 2RA 증가 5.6배 0.045398917
Cytotoxicity Necrosis /apoptosis FAS-L(FASLG) 증가 6.1배 0.009639623
Granzyme A
(GZMA)		 증가 6.7 배 0.000217593
Granzyme K (GZMK) 증가 10.7배 0.002030825
Perforin(PRF1) 증가 2.1배 0.002984078
TRAIL/Apo-2L(TNFSF10) 증가 24.5배 0.000134563
Cytokine Pro-inflammation
(anti-tumor)		 GM-CSF(CSF2) 증가 4.1배 0.038705
Anti-inflammation
(immune suppression)		 IL-8(CXCL8) 감소 1/100배 0.004886948
IL 10 감소 1/1000배 0.001149443
chemokine Recruit other effector cells CCL1 증가 318배 0.007551016
CCR5 증가 49.9배 0.000202001
Apoptosis 유도 Noxa (PMAIP1) 감소 3/100배 0.002485492
억제 BCL-2 증가 10.5배 8.51E-05
그 결과, 활성화 수용체인 NKG2D, NKp30, NKp44, 및 NKp46의 증가를 확인하였고, 이 중 NKp44(1064배), NKp30(5.2배)의 증가가 특징적으로 나타남을 확인하였다. 또한, 표적세포의 항체-의존성 세포 독성(Antibody-dependent cell-mediated cutotoxicity: ADCC)을 매개하는 CD16의 경우 배양, 및 동결에도 높은 발현량이 유지됨을 확인하였다.
자연살해세포의 NKp44는 암세포의 리간드(ligand)인 MLL5(mixed-lineage leukemia protein-5), HSPG(heparin sulfate proteoglycans), PDGF(Platelet-derived growth factor)와 결합하여 자연살해세포를 활성화시킨다. NKp30은 암세포의 리간드인 BAG6, B6-H6과 결합하여 자연살해세포를 활성화시킨다. 따라서, 일 양상에 따른 자연살해세포는 MML5, HSPG, BAG6, B6-H6 등의 NKp44 리간드, NKp30 리간드의 발현이 높은 암종에서 더욱 효과가 있을 것으로 예상된다. PDGF가 증가된 종양으로는 교종(Glioma), 위장관 기질종양(Gastro-intestinal stromal tumor), 만성골수단핵구성백혈병(chronic myelomonocytic leukemia), 유방암 등이 있으며, 특히 PDGFα는 유방암의 림파선 전이, 높은 조직학적 분화도(high histologic grade), ER/PR negativity, 삼중음성 유방암의 아형(Triple-negative breast subtype)과 연관성이 높은 것으로 보고된다(Breast Cancer Res Treat. 2018; 169(2): 231-241.). 따라서 일 양상에 따른 자연살해세포는 이들 종양에 효과가 있을 것으로 예상된다.
한편, 케모카인 중 CCL1(318배), 케모카인 수용체 중 CCR5(49.9배)가 현저하게 증가하였다. 이들 발현이 증가된 면역 세포는 단핵구, B-세포, 및 수지상 세포와 같은 다른 효과기 세포들(effector cell)을 동원(recruit)하여 종양세포의 살상에 더욱 유리하며, 특히 CCR5 발현이 증가되면 CCL5+ 종양 세포에 친화력이 있어 이들 종양의 살상에 더욱 유리하다. CCL5는 전이성/진행된 유방암, 자궁 경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 난소암(Mediators of Inflammation Volume 2014, Article ID 292376) 등에서 발현이 많이 증가되어 있어 CCR5가 증가된 일 양상의 자연살해세포는 상기 종양에 대한 친화력이 더욱 높을 것으로 예상된다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 자연살해세포의 활성화와 관련된 인자인 NKp44, NKp30과 다른 효과기 세포를 동원하는 케모카인인 CCL1, 케모카인 수용체인 CCR5의 발현이 적게는 5.2배에서 많게는 1064배까지 증가되었으며, 리간드와 결합할 때 자연살해세포를 비활성화시키는 비활성화 수용체 KIR3DL2, Siglec9의 발현은 각각 0.5배, 0.05배로 현저히 감소하였음을 확인하였다. KIR3DL2는 암세포의 리간드인 HLAA3, A11, B27 호모다이머(homodimer) 등과 결합하게 되면 자연살해세포의 INF-γ 생성, 및 암세포 살상능을 감소시킨다. Siglec9 이 암세포의 시알산(sialic acid)과 결합하게 되면 자연살해세포 ITIM 인산화(phosphorylation)가 유도되고 SHP-1, SHP-2을 모이게 해서 세포살상능을 저해하게 된다. 따라서, 이러한 비활성 수용체의 발현이 현저히 감소된 일 양상에 따른 자연살해세포는 암세포 사멸을 더욱 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 자연살해세포의 세포살상능은 크게 2가지 메커니즘을 통해 이루어 지는데 하나는 세포질내 그랜자임, 퍼포린과 같은 과립 물질이 분비되어 암세포를 죽이고, 또 다른 하나는 암세포의 세포사멸수용체(death receptor)인 Fas 또는 TNFR(tumor necrosis factor receptor)을 인지하는 리간드 즉 FASL, 및/또는 TRAIL과의 결합을 통해 암세포의 세포사멸(apoptosis)이 진행된다. 일 양상에 따른 자연살해세포의 경우, 항암 활성(세포살상능)과 관련된 인자인 그랜자임 A(Granzyme A), 그랜자임 K(Granzyme K), 및 퍼포린(Perforin)의 발현 역시 적게는 2.1배에서 많게는 10.7배까지 증가하고, 세포사멸(apoptosis) 증가를 유도하는 FAS-L(FASLG), TRAIL(TNFSF10)의 발현이 적게는 6.1배에서 많게는 24.5배까지 현저히 증가하였음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 자연살해세포의 자체 사멸을 지연시키는 BCL-2의 발현이 10.5배로 현저히 증가하고, 자체 사멸을 촉진하는 Noxa의 발현이 0.03배로 현저히 감소하였다.
3.2. CD3-CD56+ 자연살해세포 분리(selection) 여부에 따른 항암 관련 유전자 발현 양상 차이
실시예 1의 백혈구성분 분리채집술 및 CliniMACS Prodigy® 시스템을 이용한 CD3-CD56+ 분리(selection)를 거쳐 배양한 자연살해세포와, 상기 분리과정을 거치지 않고 배양한 자연살해세포 간 항암 관련 유전자 발현 양상을 비교하기 위하여 CD3-CD56+ 분리하지 않고 배양한 자연살해세포의 mRNA 발현 변화를 분석하였다. 실험예 3과 동일한 방법으로, 배양 전 세포와 배양 후 세포에서 트리졸 분리 방법으로 RNA를 추출하였고, 총 RNA 시퀀싱을 수행하여 mRNA의 발현 양상(Fold change, D14 자연살해세포/D0 자연살해세포)을 확인하였다. 발현 양상은 공여자 3명의 평균값으로 나타내었으며, 보정된 p-value인 q-value가 0.001 이상인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 보았다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
기능 유전자 증가/감소 Fold change q-value
NKR Activating
Receptor		 NKp44(NCR2) 증가 7.2배 -
NKp30(NCR3) 증가 19.3 배 0.028
Cytotoxicity Necrosis /apoptosis FAS-L(FASLG) 증가 16.0 배 0.015
Granzyme A
(GZMA)		 증가 41.9 배 0.01
Granzyme K (GZMK) 증가 5.4 배 0.01
TRAIL/Apo-2L(TNFSF10) 증가 9.7 배 0.09
Cytokine Anti-inflammation
(immune suppression)		 IL-8(CXCL8) - NA(0.11) -
IL 10 - NA(0.11) -
chemokine Recruit other effector cells CCR5 증가 16.75 배 0.015
Apoptosis 유도 Noxa (PMAIP1) - 1.1배 0.5
억제 BCL-2 증가 1.7배 0.09
그 결과, 실시예 1의 백혈구성분 분리채집술 및 CliniMACS Prodigy® 시스템을 이용한 CD3-CD56+ 분리(selection)를 거쳐 배양한 자연살해세포가 그렇지 않은 경우에 비해, 하기와 같은 특징을 가짐을 확인하였다.
a) 활성화 수용체 중 NKp44 발현이 현저히 증가함(1064배 vs. 7.2배).
b) 세포살상능의 경우, 그랜자임 K(10.7배) 및 TNFSF10(24.5배)의 발현이 현저히 증가함. 반면, CD3-CD56+ selection을 하지 않은 경우에는 그랜자임 A의 발현이 현저히 증가함(41.9배).
c) IL-8(1/100배) 및 IL-10(1/1000배)의 발현이 현저히 감소함.
d) 다른 효과기 세포를 동원하는 케모카인 수용체인 CCR5의 발현이 현저히 증가함(49.9배 vs. 16.75배).
e) 자연살해세포의 자체 사멸을 지연시키는 BCL-2의 발현 증가 양상이 뚜렷하고(10.5배), 자체 사멸을 촉진하는 Noxa의 발현 감소 양상이 뚜렷하게 나타남(0.03배).
3.3. 일 양상에 따른 자연살해세포와 인간 NK 세포주 간 활성화 수용체의 발현 양상 비교
일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포(pNK)의 활성화 수용체 발현 양상을, 대표적인 인간 NK 세포주인 NK92mi, NK92와 비교하였다. 인간 NK 세포주인 NK92mi와 NK92는 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 구입하였고, 자연살해세포의 대표적인 활성화 수용체인 NKG2D, NKp46, NKp44, NKp30, DNAM-1 및 CD16의 발현 정도를 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
타겟 pNK(n=3) NK92mi(n=3) NK92(n=3)
평균(%) ± SD 평균(%) ± SD 평균(%) ± SD
활성화
수용체		 CD314 (NKG2D) 80.13 79.60 50.17
CD335 (NKp46) 54.77 4.17 1.38
CD336 (NKp44) 95.43 27.27 10.38
CD337 (NKp30) 93.20 83.30 87.13
CD226 (DNAM-1) 99.27 3.58 1.41
CD16 90.60 1.80 23.60
그 결과, 일 양상에 따른 자연살해세포는 대표적인 활성화 수용체인 NKG2D(80.13%), NKp44(95.43%), NKp30(93.20%), DNAM-1(99.27%), 및 CD16(90.60%)이 모두 80~99%의 높은 비율로 발현되었으며, NKp46도 약 55% 정도로 발현율이 높음을 확인하였다. 반면, 인간 NK 세포주인 NK92mi, NK92의 경우 일 양상에 따른 자연살해세포와 비교할 때 활성화 수용체의 발현율이 현저히 낮음을 확인하였다.
실험예 4. 자연살해세포의 세포독성 시험
4.1. 유세포분석을 이용한 세포독성 시험
일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포(pNK)의 세포독성(cytotoxicity)을 유세포분석을 통해 확인하였다. 방사선 동위원소를 사용하지 않고 K562 세포와 같은 부유세포를 활용한 세포독성검사에 유용한 7AAD-CFSE 방법으로 시행하였다. 표적세포로는 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 세포주인 K562, 난소암 세포주(Ovarian cancer cell line)로서 시스플라틴 민감성 세포인 A2780 및 저항성 세포인 A2780cis, 유방암 세포주(Breast cancer cell line)인 MCF7, SKBR3, 및 T47D를 검사 하루 전날부터 배양하여 사용하였다. 효과기 세포(effector cell)은 일 양상에 따른 자연살해세포(pNK)와 함께, 비교군으로서 대표적인 인간 NK 세포주인 NK92mi를 사용하였다.
그 결과, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 대표적인 인간 NK 세포주와 비교하여 혈액암 세포주인 K562에서 뿐만 아니라, 난소암, 유방암과 같은 다양한 고형암에서도 E:T 비율에 따라 암세포 제거능이 현저히 증가함을 확인하였다(도 7).
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 항암 관련 유전자 발현량 및 활성화 수용체의 발현이 현저히 증가함에 따라 암세포 살상효과가 증가됨을 확인하였다.
4.2. 난소암 마우스 모델에서의 항암 활성 평가
일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포(pNK)의 면역항암제로서의 난소암 세포 성장 억제효과를 확인하여 유효성을 평가하였다. 7주령된 NSG 마우스의 지방 패드에 마우스 난소암 세포주 A2780cis를 피하로 2 x 106 (cells)의 양으로 주사하여 A2780cis xenograft 마우스 모델을 제조하였다. 난소암 세포주를 주사한 후, 3일째에 종양이 형성된 마우스를 랜덤 그룹핑하여 시스플라틴(cisplatin)을 1 mg/kg, 1회/week으로 복강내 주사 하는 그룹, 일 양상에 따른 자연살해세포를 1 x 107 (cells), 2회/week으로 정맥 주사하는 그룹, PBS 를 주사하는 control group 으로 구분하여 처리 하였다 (도 8). 난소암 세포주를 주사한 후 매일 종양의 크기 및 체중을 측정하였다.
그 결과, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포를 단독으로 투여하는 경우 대조군 대비 80% 이상의 현저한 암세포 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 반면, 기존 항암제인 시스플라틴을 주사하는 경우 약 55%의 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다 (도 9, A). 한편, 일 양상에 따른 자연살해세포와 시스플라틴 투여군 모두에서 유의한 체중 변화는 관찰되지 않았다 (도 9, B). 마우스 희생후 추출한 종양의 무게는 대조군에 비해 평균 70% 이상 감소, 시스플라틴 투여군에 비해 평균 50% 이상 감소되어 있음을 확인함(도9, C)
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 항암 활성 및 세포 자체의 활성이 증가되고, 자연살해세포의 자체 사멸은 억제되어 체내 생존율은 증가함을 확인하였다. 이와 같은 특징은 백혈구성분 분리채집술 및 CD3-CD56+ 분리를 거쳐 배양하는 경우에 뚜렷하게 나타남을 확인하였다. 또한, 동물모델의 결과에서 알 수 있듯이 일 양상에 따른 배양방법으로 배양한 자연살해세포는 종양의 크기를 현저히 감소시키는 우수한 항암효과를 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 자연살해세포는 건강한 공여자로부터 대량으로 순수 분리하여 배양된 것으로, 기존의 말초혈액 단핵세포를 이용한 배양에 비해 고순도의 자연살해세포 배양으로 안전성이 높고, 암세포 살상효과가 증가되어 효율적인 암 치료를 위한 세포치료제로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 배양 시 피더 세포를 사용하지 않아 임상적으로도 안전성이 담보되므로, 기능이 강화된 새로운 동종 면역 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (18)

1) 인간 말초혈액으로부터 백혈구성분 분리채집술을 통해 단핵구 세포를 분리하는 단계;
2) 상기 분리한 단핵구 세포로부터 폐쇄 시스템을 이용하여 CD3-CD56+ 자연살해세포를 수득하는 단계; 및
3) 상기 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포에 IL-2, 항-NKp46 항체, 및 혈장을 처리하고, 피더 세포(feeder cell)를 포함하지 않는 배양액 중에서 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 배양방법으로서,
상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (a) 내지 (c)의 특성을 갖는 것인, 방법:
(a) KIR3DL2, 및 Siglec9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(b) CCL1, 및 CCR5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가; 및
(c) NKG2D, NKp30, NKp44, 및 NKp46으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가.
청구항 1에 있어서, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (d) 및 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인, 방법:
(d) FASL, 및 TRAIL(TNFSF10)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가; 및
(e) 그랜자임 A(Granzyme A), 그랜자임 K(Granzyme K), 및 퍼포린(Perforin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가.
청구항 2에 있어서, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 하기 (f) 내지 (j)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 추가로 갖는 것인, 방법:
(f) DAP10(HCST), 및 IL-2RA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 증가;
(g) GM-CSF(CSF2)의 발현이 증가;
(h) IL-8(CXCL8), 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현이 감소;
(i) Noxa(PMAIP1)의 발현이 감소; 및
(j) BCL-2의 발현이 증가.
청구항 1에 있어서, 상기 방법에 따라 배양된 자연살해세포는 배양 전 자연살해세포에 비하여 순도, 세포 증식배수, 및 암세포 살상능이 증가된 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 1) 단계는 백혈구성분 분리채집술을 통해 수행되는 것인, 방법.
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청구항 1에 있어서, 상기 3) 단계의 CD3-CD56+ 자연살해세포는 동결 보존된 후 해동된 상태인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 3) 단계의 혈장은 인간 말초혈액으로부터 분리된 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 3) 단계의 배양은 감마글로불린, 및 피브로넥틴의 존재 하에서 배양하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 3) 단계의 배양은 말초혈액 단핵세포를 배양하여 자연살해세포를 배양하는 것인, 방법.
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