KR102352715B1

KR102352715B1 - Il-21을 이용한 항원 특이적 cd8+ t 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법

Info

Publication number: KR102352715B1
Application number: KR1020190043138A
Authority: KR
Inventors: 최범규
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2022-01-19
Also published as: KR20200120342A

Abstract

본 발명은 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식을 촉진하거나 대량으로 배양하는 방법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 증식 촉진 또는 대량 배양된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 내지 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물을 제조하는 방법 내지 상기 방법으로 제조된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물에 대한 것이다.
따라서, 본 발명에 따라 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 배양하는 경우 기존 방법에 비하여 상기 T 세포의 증식률이 유의적으로 증가하며, 이때 사용되는 항원 내지 자가암항원의 구체적인 아미노산 서열을 분석할 필요 없어 시간 내지 비용 측면에서 효과적이다. 또한 본 발명은 낮은 농도의 IL-2, IL-21의 첨가 시기 내지 첨가 농도, 기존 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율 또는 말초혈액단핵구(PBMC)의 농도 등 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 및 배양을 최대로 증가시킬 수 있는 최적의 조건을 제공할 수 있다.

Description

IL-21을 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법 {Method for promoting proliferation or mass culture of antigen-specific CD8+ T cell using IL-21}

본 발명은 암 환자의 혈액에서 분리된 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)와 IL-2 및 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량으로 배양하는 방법에 대한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 증식 촉진 또는 대량 배양된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 내지 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.

또한, 본 발명은 암 환자의 혈액에서 분리된 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)와 IL-2 및 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물을 제조하는 방법 내지 상기 방법으로 제조된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물에 대한 것이다.

입양 T 세포 치료법(Adoptive T cell therapy)는 암항원 특이적 T 세포를 분리 및 대량배양하여 암환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 초기연구에서는 암에 대한 특이성 없이 암환자의 혈액이나 암조직의 T 세포를 대량증식시켜 CIK(cytokine-induced killer cells), LAK(lymphokine-activated killer cell) 또는 tumor-infiltrating lymphocyte(TIL)를 생산한 후 암환자에게 투여하였다. 상기 방법의 안전성은 인정되었으나, 유효성은 없었는데 이는 임상시험에 사용된 CIK, LAK 및 TIL 세포들의 암에 대한 특이성이 낮은 것을 원인으로 보고 있다. 이에 암항원 특이적 T 세포를 분리 및 대량배양하기 위한 방법에 대한 연구가 오랫동안 수행되었으며, 암세포에 대한 특이성이 부여될 경우 항암효과는 증가하는 것으로 보고되었다. 그러나 암세포 특이적 T 세포를 사용하여도 재발한 암환자를 완치시키는 비율은 극히 낮은 것으로 나타났다. T 세포치료제의 낮은 효력 문제를 해결하기 위한 방법으로 화학 항암제의 사전투여를 통해 일시적 면역결핍을 유도한 후 T 세포치료제를 투여하는 방법이 사용되고 있다.

현재 개발되었거나 개발 중인 항암 T 세포치료제들은 암항원 특이적 T 세포의 분리 및 대량배양 개념을 필수적으로 포함하고 있다. 모든 T 세포치료제가 암세포 특이적 T 세포의 분리 및 투여라는 동일한 목표를 가지고 있지만, T 세포의 분리 및 대량배양 과정, 배양된 T 세포의 특성은 모두 다르다. 혈액이나 암조직 내 암항원 특이적 T 세포의 비율이 극히 낮기 때문에, 일반적으로 암항원 특이적 T 세포의 분리 전에 이들 세포의 비율을 높이기 위한 증폭과정을 대부분 필요로 한다. 암항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리할 수 있는 가장 대표적인 방법은 MHC I/펩타이드 다중합체(MHC I/peptide multimer)를 이용하여 분리하는 방법이지만, 상기 다중합체는 사용 가능한 범위가 제한적이어서 다양한 환자에게 적용하지는 못하고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 활성화된 T 세포에서만 선택적으로 발현하는 4-1BB의 특성을 이용한 항원 특이적 T 세포분리공정이 개발되었다. 대한민국 등록특허 제10-1503341호는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법에 대한 것으로서, 암 환자의 혈액 내에 존재하는 자가암항원 CD8+ T 세포 에피토프를 선별하여 암 환자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵구 및 IL-2를 이용하여 배양함으로써 4-1BB 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 이론적으로 모든 종류의 암항원에 대해 적용할 수 있다는 장점을 가지고 있지만, 모든 암항원에 대해 HLA-A subtype 별로 CD8+ T 세포가 인식하는 정확한 아미노산 서열(CTL epitope)이 필요하며, 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 배양 성공 확률이 낮다는 단점이 존재한다.

이에 기존 공정을 기초로 하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 배양시 그 증식률을 극대화하기 위한 연구가 필요한 실정이며, 특히 IL-21을 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 배양 방법 내지 상기 IL-21을 포함하는 최적의 조건에 대하여는 현재까지 연구되거나 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 배양방법에 있어 그 증식률을 유의적으로 증가시키면서 기존의 배양방법에서 요구되었던 CD8+ T 세포가 인식할 항원의 정확한 아미노산 서열 정보 없이도 항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 대량으로 배양하는 방법을 제공하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 암 환자의 혈액에서 분리된 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)와 IL-2 및 IL-21을 함께 배양하는 경우 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식률이 증가하며, 증식률을 더욱 증가시킬 수 있는 최적의 조건을 수립하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 환자의 혈액에서 분리된 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)와 IL-2 및 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 증식 촉진 또는 대량 배양된 가암항원 특이적 CD8+ T 세포 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 암 환자의 혈액에서 분리된 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)와 IL-2 및 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 암 환자의 혈액에서 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 단계;

b) 상기 단계 a)에서 분리한 자가암항원 및 PBMC와 IL-2를 함께 배지에서 배양하는 단계; 및

c) 상기 단계 b)의 배지에 IL-21을 첨가하는 단계;

를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 암은 폐암, 위선암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 백혈병, 육종, 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 자가암항원은 NY-ESO1, hTERT, WT-1, CEA, CA-125, MUC-1, MART-1 및 MAGE-A3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b)의 PBMC 내의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율은 0.01% 내지 0.3%인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b)의 PBMC 의 세포 수는 10³내지 10⁷cells/1㎖인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b)의 배양은 둥근 바닥(round bottom)에서 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 IL-21은 1 내지 1000ng/㎖의 농도로 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 IL-21은 상기 단계 b)의 배양 시작 후 1일 내지 5일 이내에 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b)의 자가암항원의 펩타이드에 포함되는 아미노산의 길이는 5 내지 50 개인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 자가암항원의 펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 36 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b)의 배지에 상기 단계 a)의 PBMC에서 수득한 항원제시세포(antigen presenting cell)을 추가적으로 첨가하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항원제시세포는 수지상세포(dendritic cell)인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 증식 촉진 또는 대량 배양된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 내지 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 위선암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 백혈병, 육종, 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,

상기 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포는 둥근 바닥(round bottom)에서 배양하기 시작한 후 1일 내지 5일 이내에 1 내지 1000ng/㎖의 IL-21을 첨가하여 배양된 10³내지 10⁷cells/1㎖의 말초혈액단핵구(PBMC)로부터 수득한 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, a) 암 환자의 혈액에서 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 단계;

c) 상기 단계 b)의 배지에 IL-21을 첨가하는 단계;

를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물 제조 방법 내지 상기 방법으로 제조된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명에 따라 IL-21을 이용하여 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 배양하는 경우 기존의 방법에 비하여 상기 T 세포의 증식률이 유의적으로 증가하며, 이때 사용되는 항원 내지 자가암항원의 구체적인 아미노산 서열을 분석할 필요 없어 시간 내지 비용 측면에서 효과적이다. 또한 본 발명은 낮은 농도의 IL-2, IL-21의 첨가 시기 내지 첨가 농도, 기존 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율 또는 말초혈액단핵구(PBMC)의 농도 등 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 및 배양을 최대로 증가시킬 수 있는 최적의 조건을 제공할 수 있다.

도 1의 (A)는 말초혈액단핵구(PBMC)에서 CMV 특이적 CD8+ T 세포의 배양에 대한 도식 다이어그램을 나타낸다. (B)는 평면 바닥(flat bottom)에서 배양된 PBMC를 배양 시작 후 7, 10 및 12일차에 현미경으로 촬영한 결과를 나타낸다. (C)는 배양 시작 후 14 일째에 평면 바닥(flat) 또는 둥근 바닥(round) 조건에 따른 pCMV+CD8+ T 세포, CD3+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 백분율을 나타낸다. (D)는 배양시작 후 14 일째에 총 pCMV+CD8+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 절대 수를 측정한 결과를 나타낸다. IL-2 또는 IL-21을 각각 단독으로 처리하는 경우에 비하여 IL-2와 함께 IL-21을 처리한 경우 및 둥근 바닥에서 배양하는 경우 pCMV+CD8+ T 세포 내지 CD56+ NK 세포 등 세포 증식률이 유의적으로 증가하였다.
도 2의 (A)는 IL-21의 늦은 처리와 말초혈액단핵구(PBMC)에서 CMV 특이적 CD8+ T 세포의 배양에 대한 도식 다이어그램을 나타낸다. (B)는 배양 시작 후 14 일째에 CD8+ T 세포, CD56+ NK 세포 또는 CD57+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸다. (C)는 배양 시작 후 14 일째에 총 세포수를 나타낸다. (D) 및 (E)는 pCMV+CD8+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 백분율 및 세포수를 나타낸다. IL-21의 첨가시기가 늦어질수록 CD8+ T 세포수 내지 비율은 증가하였으며 NK 세포수 내지 비율은 감소하였다.
도 3은 (A) pCMV^Low 또는 pCMV^High 말초혈액단핵구(PBMC)에서 pCMV+CD8+ T 세포의 배양에 대한 도식 다이어그램을 나타낸다. (B)는 배양 시작 후 14 일째에 pCMV^Low 또는 pCMV^High PBMC의 평면 바닥(flat) 또는 둥근 바닥(round) 조건에 따른 세포 비율을 측정한 결과이다. (C)는 배양 시작 후 14 일째에 pCMV^Low PBMC의 총 세포수 및 pCMV+CD8+ T 세포수를, (D)는 배양 시작 후 14 일째에 pCMV^High PBMC의 총 세포수 및 pCMV+CD8+ T 세포수를 나타낸다. 암 환자 혈액 내의 기존 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 낮을수록 IL-21 첨가에 의하여 CD8+ T 세포가 펩타이드에 민감해져 총 세포수, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 및 세포수가 유의적으로 증가하였다.
도 4의 (A)는 배양 시작 후 14 일째에 말초혈액단구(PBMC)의 첨가 농도(0.5M, 1.0M 및 2.0M)에 따른 pCMV+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. (B)는 배양 시작 후 14 일째에 총 세포 및 pCMV+CD8+ T 세포의 절대 수 및 백분율을 나타낸다. (C)는 CFSE 와 CD8 또는 CD8-양성 세포(CD8 positive cells)가 CFSE 와 pCMV로 플로팅(plotting)된 것을 나타낸다. (D)는 CFSE-CD8+ T 세포 중 pCMV+ 및 pCMV- 세포의 백분율을 (C)로부터 계산한 결과를 나타낸다. PBMC의 농도가 높을수록 IL-21 처리에 의한 pCMV+CD8+ T 세포의 비율이 증가하였다.
도 5의 (A)는 배양 시작 후 14 일째에 pCMV+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. (B)는 배양 시작 후 14 일째에 총 세포 및 pCMV+CD8+ T 세포의 절대 수 및 백분율을 나타낸다. (C)는 CFSE 와 CD8 또는 CD8-양성 세포(CD8 positive cells)가 CFSE 와 pCMV로 플로팅(plotting) 된 것을 나타낸다. (D)는 CFSE-CD8+ T 세포 중 pCMV+ 및 pCMV- 세포의 백분율을 (C)로부터 계산한 결과를 나타낸다. 확장된 CTL 에피토프를 이용하여 PBMC로부터 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 증식을 유도하는 것이 가능하지만, IL-21에 의한 효과는 미미하였다.
도 6의 (A)는 pCMV^High 기증자의 PBMC의 배양 시작 후 14일째에 항원제시시포(DC)의 농도(0.1%, 5% 및 10%)에 따른 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율을 나타낸다. (B)는 pCMV^Low 기증자의 PBMC의 배양 시작 후 14일째에 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율을 나타낸다. (C)는 pCMV^High 기증자의 배양 시작 후 14일째에 총 세포수 및 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 백분율 및 세포수를 나타낸다. (D)는 pCMV^Low 기증자의 배양 시작 후 14일째에 총 세포수 및 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 백분율 및 세포수를 나타낸다. IL-2 및 IL-21이 포함된 배지 조건하에서 DC의 비율이 높을수록 확장된 CTL 펩타이드에 의한 항원 특이적 CD8 T 세포의 증식을 효과적으로 촉진할 수 있다.
도 7은 15 일째 NY-ESO-1 펩타이드 혼합물로 재자극한 4-1BB+CD8+ T 세포의 유동 세포 계측 분석을 나타낸다.
도 8은 NY-ESO-1 펩타이드 혼합물에 대한 Responder의 비율을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 펩타이드 특이적 CD8+ 세포(Peptide-specific CD8 T cell)의 증식 유도시 사용되던 최적화된 9~12-mer 길이의 CTL 에피토프 펩타이드(CTL epitope peptide)는 특정 HLA-A subtype에서만 사용가능하여, 하나의 항원에 대해서도 HLA-A subtype별로 많은 CTL 펩타이드들을 선별해야하기 때문에 시간과 비용이 대량으로 소요된다는 단점이 존재하였다.

본 발명에 따른 IL-21을 이용하여 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 증식률을 높이는 방법은 IL-21을 포함하는데에 최적화된 배양조건을 제공할 수 있다. 또한 종래기술과 달리 최적화된 CTL 에피토프에 대한 연구 없이도 다양한 자가암항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있어 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포반응을 효과적으로 촉진할 수 있다.

본 발명의 ‘항원’은 바이러스 또는 암에 의한 항원을 의미하는데, 본 발명의 외래 바이러스 항원인 9-mer CMV 펩타이드의 서열은 NLVPMVATV(서열번호 1)이며, 29-mer CMV 펩타이드 서열은 PPWQAGILAR-NLVPMVATV-QGQNLKYQEF(서열번호 2)이다. 상기 ‘항원’은 바람직하게 암에 의한 항원을 의미하며, 더욱 바람직하게는 암에 의한 항원 중 자가암항원을 의미하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 ‘CTL 에피토프 펩타이드(CTL epitope peptide)’는 CTL 에피토프 또는 CTL 펩타이드와 동일한 의미이며, CD8+ T 세포가 인식하는 항원의 아미노산 서열을 의미한다.

항원 특이적 CD8+ T 세포, 특히 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 배양하는데에 IL-21을 이용하는 경우 그 증식률을 유의적으로 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 파종세포(seeding cell)로서 말초혈액단핵구(PBMC)를 둥근 바닥(round bottom) 조건에서 배양하고, IL-21을 배양 시작 후 2일차 또는 3일차에 첨가하며, PBMC 내 기존의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율이 낮고, PBMC 세포수가 낮으며, 함께 배양하는 항원제시세포(APC)의 수가 많을수록 항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식률이 유의적으로 증가할 수 있다. 특히, IL-21을 배양 시작 후 2일차 또는 3일차에 첨가하는 경우 CD8+ T 세포 외에 NK 세포 등 다른 세포의 비율 내지 세포수가 낮아져 항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식률을 더욱 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 a) 암 환자의 혈액에서 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 단계;

c) 상기 단계 b)의 배지에 IL-21을 첨가하는 단계;

를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 단계 a)의 암은 폐암, 위선암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 백혈병, 육종, 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 육종, 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 ‘자가암항원’은 암 환자의 혈액으로부터 직접 분리하여 사용하거나 상용화되어 있는 자가암항원을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 암 환자의 혈액으로부터 직접 분리하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 단계 a)의 자가암항원은 NY-ESO1, hTERT, WT-1, CEA, CA-125, MUC-1, MART-1 및 MAGE-A3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 NY-ESO1은 cancer testis antigen (CTA)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포(germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있지만, 이들 세포에서 어떤 기능을 하는지에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 상기 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암 세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포 사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고; 상기 WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 zinc finger 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다. 상기 MAGE-A3은 melanoma-associated antigen family에 속하는 단백질로 정상세포에서 어떤 기능을 수행하는지에 대해서는 알려진 것이 없지만, 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 상기 단계 b)의 PBMC 내의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율은 유세포분석시 살아있는 전체 PBMC 중에서 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율을 의미하며, 이는 0.01% 내지 0.3%인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.02% 내지 0.2%인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 0.03% 내지 0.1%인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 b)의 PBMC 의 세포 수는 10³내지 10⁷cells/1㎖인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁷cells/1㎖ 인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁷cells/1㎖ 인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 b)의 배양은 평면 바닥(flat bottom) 또는 둥근 바닥(round bottom)에서 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 둥근 바닥(round bottom)에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 c)의 IL-21은 1 내지 1000 ng/㎖의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 5 내지 50 ng/㎖의 농도로 첨가되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 15 내지 40 ng/㎖의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 c)의 IL-21은 상기 단계 b)의 배양 시작 후 1일 내지 5일 이내에 첨가되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1일 내지 4일 이내에 첨가되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 2일 내지 3일 이내에 첨가되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 b)의 자가암항원의 펩타이드에 포함되는 아미노산의 길이는 5 내지 50 개인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 5 내지 40개인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 10 내지 30개인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 자가암항원의 펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 서열번호 4, 7, 9 내지 14, 16, 19, 21 내지 26, 28, 31, 33 내지 36 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 서열번호 10, 13, 22, 25 및 34로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 b)의 배지에 상기 단계 a)의 PBMC에서 수득한 항원제시세포(antigen presenting cell)을 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)는 외부 물질을 세포 내로 이입한 후 항원으로 제시함으로써 T 세포가 제시된 항원을 검사할 수 있도록 하는 세포로서 B세포, 대식세포(macrophage) 또는 수지상 세포(dendritic cell)이 이에 해당할 수 있다. 본 발명의 상기 항원제시세포는 수지상세포(dendritic cell)인 것이 바람직하다.

CD8+ T 세포는 수지상세포, CD4+ T 세포 또는 NK 세포와 같은 다른 세포들에 비해 비교적 단순한 기능을 가지고 있기 때문에, 항암 면역치료시 기대하지 않았던 부작용이 나타날 가능성이 적다.

또한 본 발명은 제1항의 방법으로 증식 촉진 또는 대량 배양된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 암 예방 및 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

또한 본 발명은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,

상기 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포는 둥근 바닥(round bottom)에서 배양하기 시작한 후 1일 내지 5일 이내에 1 내지 1000ng/㎖의 IL-21을 첨가하여 배양된 10³내지 10⁷cells/1㎖의 말초혈액단핵구(PBMC)로부터 수득한 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포는 상기 증식 촉진 또는 대량 배양방법의 대상인 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.

상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 설명은 상기 증식 촉진 또는 대량 배양방법으로 증식 촉진 또는 대량배양된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.

또한 본 발명은 a) 암 환자의 혈액에서 자가암항원 및 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 단계;

c) 상기 단계 b)의 배지에 IL-21을 첨가하는 단계;

를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 제조방법은 상기 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양방법과 동일한 단계들을 포함하므로 설명은 그 기재로 대신한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

IL-21의 항원 특이적 CD8 T 세포 증식 유도

IL-21을 이용하여 항원 특이적 CD8 T 세포(antigen-specific CD8 T cell)의 증식을 유도할 수 있는지 검증하고자 하였다.

구체적으로, 9-mer HLA-A*02-restricted CMV/pp65/MHC I multimer(pCMV; PE-conjugated A0201/NLVPMVATV CMV/pp65 pentamer; Proimmune, Oxford, UK)에 반응하는 CD8 T 세포(CMV/pp65 특이적 CD8 T 세포)를 가진 자원자의 혈액을 연구에 대한 서면동의 후 채혈하여 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하였다. 분리한 PBMC를 3% 자가혈장이 포함된 RPMI1640 배지에 1×10⁶ cells/㎖ 농도로 현탁하였으며, 14㎖ 둥근 원심관(round tube; round bottom culture; BD Bioscience) 또는 T-25 플라스크(flask; flat bottom culture)에 각각 1㎖씩 분주하였다. 각 튜브에 2㎍/㎖ 농도로 상기 CMV 펩타이드를 첨가한 후, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 이틀째, 100 IU/㎖ IL-2(Proleukin, Novartis)와 3% 자가혈장이 포함된 RPMI1640 배지를 1㎖ 씩 각 튜브에 첨가하였다. 배양 7, 9, 11, 13일 차에 각 튜브에서 1㎖ 배지를 제거한 후, 100 IU/㎖ IL-2와 3% 자가혈장이 포함된 새로운 RPMI1640 배지를 1㎖ 첨가하고 배양하여 총 14일간 세포배양 하였다. 이때, 10ng/㎖ IL-21(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 최대 6회(배양 시작 후 0, 2, 7, 9, 11, 및 13일) 첨가하여 지속적으로 IL-21의 효력이 발생하도록한 실험군과, 30ng/㎖ IL-21을 배양 시작 후 2일 차에 첨가하여 일시적으로 IL-21 효력이 발생하도록 한 실험군으로 나누어 실험하였다.

유세포 분석은 배양된 세포를 모두 수거하여 FACS buffer(PBS containing 0.1% BSA, 0.02% NaN₃)로 세척한 후, anti-CD8-PE-Cy5와 pCMV-PE로 30분간 염색하였다. T 세포 및 NK 세포의 비율을 측정하기 위해, anti-CD3-PE와 anti-CD56-FITC 로 염색하였다. 상기 anti-CD8-PE-Cy5, pCMV-PE, anti-CD3-PE 및 anti-CD56-FITC은 BD Bioscience(San Jose, CA)에서 구매하였다. 세포수는 평균±SD(*, p <0.05, **, p <0.01, ***, p <0.005)으로 나타냈다.

그 결과, PBMC를 둥근 바닥에서 IL-2와 함께 IL-21을 처리하여 배양하는 경우 세포 증식률이 유의적으로 증가하며, IL-21의 처리 횟수는 세포 증식률에 미치는 영향이 미미한 것을 확인할 수 있었다. T-25(평면 바닥)에 배양된 PBMC은 IL-21을 단독으로 처리하는 경우에는 세포 증식률이 미미한 반면, IL-2와 함께 IL-21을 처리한 경우 세포 증식률이 증가하였다([도 1]의 B). 특히, 배양 14일째에 IL-21만 처리한 경우에는 pCMV⁺CD8⁺ T 세포가 거의 증식하지 않았으며, IL-2 단독 처리한 경우에 비해 IL-2와 함께 IL-21을 처리한 경우 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 부분적으로 감소하였다([도 1]의 C). 또한 배양 14일째에 총 세포수를 계수한 결과, IL-2 단독 처리한 경우에 비해 IL-2와 함께 IL-21을 처리하는 경우, pCMV⁺CD8⁺ T 세포 내지 CD56⁺ NK 세포 등 총 세포수가 2배 이상 증가하였다([도 1]의 D).

최종적으로, 이후 실험에서는 PBMC는 둥근 바닥에서 배양하며, 이때 IL-21은 30 ng/㎖ 농도로 처리하는 것으로 결정하였다.

IL-21의 투여시기와 CD8 T 세포 및 NK 세포 증식과의 관계

IL-21을 투여하는 시기가 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식에 영향을 주는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 1㎖의 PBMC(1×10⁶ 세포)를 14㎖ 둥근 튜브에 도말하고 상기 <실시예 1>과 같이 9-mer CMV/pp65 펩타이드로 자극 하였다. 100IU/㎖ rhIL-2를 함유하는 CM 배지 1㎖를 각 튜브에 첨가하고, 7일, 9일, 11일 및 13일 차에 100㎕/㎖ rhIL-2를 함유하는 신선한 CM 배지로 배지의 절반을 대체 하였다. rhIL-21(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)은 0일, 1일, 2일, 3일 또는 4 일째에 30 ng/㎖ 의 농도로 첨가 하여 세포를 배양한 후([도 2]의 A), 14일째에 CD8+ T 세포와 CD56⁺ NK 세포의 비율을 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 유세포 분석하였다. 세포의 노화도를 측정하기 위해서는 anti-CD57-FITC 항체(BD Bioscience, San Jose, CA)로 염색하였다. 세포 수는 ADAM MC Automated Cell counter(NanoEnTek, Seoul, Korea)로 계수하였으며, 평균±SD(*, p <0.05, **, p <0.01, ***, p <0.005)으로 나타냈다.

그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 IL-21의 첨가시기가 늦춰질수록 CD8+ T 세포의 비율은 증가하며, NK 세포의 비율은 감소하였고, 총 세포수는 감소하였다. pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율과 그 세포수는 IL-21을 2일차 또는 3일차에 첨가할 경우 가장 높았다.

IL-21와 펩타이드 특이적 CD8 T 세포의 비율과의 관계

말초혈액단핵구(PBMC) 내 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율에 따른 IL-21의 효력 차이를 확인하고자 하였다.

구체적으로, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 높은(pCMV^High,0.32%) 자원자와 낮은(pCMV^Low, 0.04%) 자원자의 PBMC에, 9-mer CMV 펩타이드 및 IL-2(100IU/㎖)와 함께 IL-21(30ng/㎖)을 배양 시작 후 2일 차에 첨가하여([도 3]의 A) 평면 바닥(flat bottom) 또는 둥근 바닥(round bottom) 조건에서 14일간 배양한 후 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 및 총 세포수를 계산하였다. 세포수는 평균±SD(*, p <0.05, **, p <0.01, ***, p <0.005)으로 나타냈다.

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 pCMV^Low 의 경우, 평면 바닥 및 둥근 바닥 조건 모두에서 IL-2만을 첨가한 경우에 비하여 IL-2 및 IL-21 첨가시 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 2-4배 증가, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 수가 3-8배 증가 및 총 세포수는 2-4배 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있었다([도 3]의 C).

반면에 pCMV^High 의 경우, 평면 바닥 및 둥근 바닥 조건 모두에서 IL-2 첨가만으로 총 세포수 내지 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율(20% 이상)이 크게 증가하였다. 오히려 IL-2 및 IL-21 첨가시 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 20-30% 감소하여 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 수는 유의적으로 증가하지 못하였다. IL-2 및 IL-21 첨가시 총 세포수는 1.2-1.5배 증가하였다([도 3]의 D).

IL-21 및 PBMC 농도와의 관계

파종세포(Seeding cell), 즉 말초혈액단핵구(PBMC)의 농도에 따른 IL-21의 효과를 분석하고자 하였다.

구체적으로, PBMC 배양시 1×10⁶ cells/1㎖/tube 조건으로 세포를 배양하던 것을, 0.5×10⁶ cells/1㎖/tube(0.5 million; 0.5M), 1×10⁶ cells/1㎖/tube(1.0 million; 1.0M), 2×10⁶ cells/1㎖/tube(2.0 million; 2.0M)조건으로 PBMC의 숫자를 다르게 하여 14일간 배양하여 IL-21에 첨가에 따른 pCMV⁺CD8⁺ T 세포 및 총 세포수를 계산하였다. CFSE dilution assay는 CellTraceTM CFSE Cell Proliferation kit(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 분리된 PBMC를 10 μM CFSE로 5분간 염색하였으며, 염색 후 상기 <실시예 1>와 동일한 방법으로 세포를 배양하였다. 배양 14일째, 모든 세포를 수거하여 anti-CD8-PE-Cy5와 pCMV-PE로 염색하였으며, 유세포분석기 FACSCalibur(BD Bioscience)를 이용하여 분석하였다. 세포수는 평균±SD(*, p <0.05, **, p <0.01, ***, p <0.005)으로 나타냈다.

그 결과, IL-2만을 첨가하여 배양한 경우 파종세포(PBMC)의 농도가 높을수록 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 증가하며, IL-21을 함께 첨가한 경우 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 더욱 높아졌다([도 4]의 A). 총 세포수, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 및 세포수가 유의적으로 증가하였으며, IL-21 첨가에 의해 더욱 유의적으로 증가하였다([도 4]의 B).

특히 최초 배양시 튜브당 PBMC의 수가 2배로 증가할 때마다, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 수는 IL-2만 첨가할 경우에도 3-6배 증가하였으며, IL-21 첨가시 2배 이상 추가 증식을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

PBMC를 CFSE로 표지한 후 CFSE dilution assay을 수행한 결과, 70% 이상의 CD8+ T 세포들이 CFSE^Low 상태로 7-8회 이상 증식하였으며, 증식한 CD8+ T 세포의 비율은 배양시 튜브당 세포의 수와 무관한 것으로 나타났다([도 4]의 C 상단). IL-21을 첨가하여도 증식한 CD8+ T 세포의 비율이 전체적으로 증가할 뿐 튜브당 세포의 수와는 무관한 것으로 나타났다([도 4]의 C 상단).

그러나 CD8+ T 세포 중 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율을 분석한 결과, IL-2 조건하에서 PBMC 세포수가 증가할수록 증식한 전체 CD8 T 세포 중 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 급격히 증가하였다([도 4]의 C 하단).

IL-21 첨가시 0.5M 조건에서는 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 IL-2 실험군의 18.5%에서 40.2%로, 1.0M 조건의 경우 44.7%에서 85.1%로, 2.0M 조건의 경우 63.0%에서 74.4%로 유의적으로 증가하였다([도 4]의 C 하단).

통계적 분석결과, IL-2 조건하에서 튜브당 세포의 수가 증가할수록 전체 CFSE^Low CD8+ T 세포 중 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 증가하였으며, IL-21 첨가시 이러한 현상은 더욱 가속화 되었다([도 4]의 D).

즉, 튜브당 세포수가 낮을수록 증식한 세포 중 IL-21의 첨가에 의하여 증가된 펩타이드 특이적 CD8 T 세포의 비율은 낮고, 방관자 활성화(bystander activation)된 CD8+ T 세포의 비율이 높아졌다. 반면에, 튜브당 세포의 수가 높을수록 IL-21의 첨가에 의하여 증가된 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 비율이 높아져 방관자 활성화(bystander activation)된 CD8+ T 세포의 비율이 낮아졌다.

확장된 CTL 에피토프를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포 증식

확장된 CTL 펩타이드(extended CTL peptide)를 이용하여 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포 증식 유도시 IL-21의 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 9-mer CMV/pp65 CTL 펩타이드(NLVPMVATV)에 좌우로 10개의 아미노산을 추가하여 29-mer CMV 확장된 펩타이드(CMV/pp65485-513 PPWQAGILAR-NLVPMVATV-QGQNLKYQEF; Peptron, Daejeon, Korea)를 제작하였다. PBMC의 농도가 0.5M, 1.0M 또는 2.0M 인 튜브(14㎖)에, 확장된 CMV 펩타이드 및 IL-2와 함께 30ng/㎖ IL-21을 배양 시작 후 2일차에 첨가하여 14일간 배양한 후 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 및 총 세포수 계산하였다. 세포수는 평균±SD(n=3, *, p <0.05, **, p <0.01, ***, p <0.005)으로 나타냈다.

그 결과, IL-2만 첨가한 경우 pCMV⁺CD8⁺ T 세포는 확장된 CMV 펩타이드에 의해 성공적으로 증가하였으며, 배양 세포의 수가 증가할수록 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 증가하는 것으로 나타났으며, IL-21의 추가적 첨가에 의해 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 부분적으로 증가하는 것으로 나타났다([도 5]의 A).

통계적 분석 결과, 9-mer 펩타이드에 비해 증가율이 낮지만([도 4]의 B), 29-mer 확장된 CMV 펩타이드로도 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 내지 세포수가 증가하였으며, 튜브당 PBMC의 수를 높일수록 효과적으로 CD8+ T 세포의 증식을 유도하는 것을 확인하였다. 총 세포수 역시 튜브당 PBMC의 수가 증가될수록 늘어나는 것을 확인하였다. 다만 총 세포수, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 및 세포수에 대한 IL-21의 효과는 미미한 것으로 확인되었다([도 5]의 B).

CFSE dilution assay 결과 튜브당 세포의 수를 증가시킬수록 증식한 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율을 증가하였으며([도 5]의 C 상단), 증식한 CD8 T 세포 중 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 높아진 것을 확인할 수 있었다([도 5]의 C 하단). 동일한 조건에 IL-21을 추가적으로 첨가시 부분적인 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율 증가가 발생하였지만([도 5]의 C 하단), 유의미한 차이는 나타나지 않았다([도 5]의 D).

확장된 CTL 펩타이드 및 항원제시세포를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포 증식

IL-21이 포함된 배양조건에서 확장된 CTL 펩타이드(extended CMV peptide)에 의한 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 증식과정에 항원제시세포(APC)를 증가시킬 경우, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 증식을 촉진할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, pCMV^Low 및 pCMV^High 자원자의 말초혈액단핵구(PBMC)를 5×10⁶ cells/㎖ 농도로 5% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 현탁한 후 배양접시에 분주하여, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 한 시간 후 배양접시에 부착되지 않은 세포들을 모두 제거하였으며, 1,000 IU/㎖ GM-CSF, 800 IU/㎖ IL-4, 및 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지를 첨가하여 5일간 배양함으로써 대식세포(monocyte)로부터 수지상세포(monocyte-derived dendritic cell; DC)를 분화시켰다. 배양 5일째 TNF-α(10 ng/㎖), IL-1β(2 ng/㎖), IL-6(1000 U/㎖), PGE-2(1000 ng/㎖; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 첨가하여 하루 더 배양함으로써 수지상세포의 분화를 유도하였다. 상기 GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 은 Peprotech(Rocky Hill, NJ)에서 구매하였다. 동일한 혈액 공여자로부터 새로 분리된 PBMC 1×10⁶ 1㎖/tube에 최종 분화된 DC를 0, 1, 5, 10% 비율로 혼합한 후, 9-mer 또는 29-mer CMV 펩타이드를 2㎍/㎖ 농도로 첨가하여 배양하였다. 배양 2일째, 100 IU/㎖ IL-2 및 30 ng/㎖ IL-21이 포함된 CM 배지 1㎖을 첨가하였다. 배양 7, 9, 11, 13일에 배양상층액 1㎖을 제거한 후 100 IU/㎖ IL-2이 포함된 새로운 CM 배지 1㎖을 첨가하여 14일간 배양하였다. 세포수는 평균±SD(n=3, *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.005)으로 나타냈다.

그 결과, [도 6]의 A에 나타나는 바와 같이 pCMV^High PBMC에 9-mer CMV 펩타이드를 첨가하여 배양한 경우 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율은 45% 수준으로 높게 나타났으며, DC의 첨가비율이 높아져도 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율에는 큰 변화가 없었다. 그러나 29-mer CMV 펩타이드를 첨가하여 배양한 경우, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율은 17% 수준으로 9-mer 펩타이드 첨가시 보다 낮게 나타났지만, DC의 첨가 비율이 증가함에 따라 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율도 꾸준히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[도 6]의 C에 나타나는 바와 같이 pCMV^High PBMC 총 세포수는 DC 비율 증가에 따라 점진적으로 증가하였다. pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율은 29-mer 펩타이드를 첨가한 경우에만 유의적으로 증가하여 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 수 역시 29-mer 펩타이드를 처리한 군에서만 DC의 비율 증가에 따라 유의적으로 증가하였다.

또한, [도 6]의 B에 나타나는 바와 같이 pCMV^Low 의 경우, 9-mer 펩타이드를 첨가한 경우에도 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 DC 비율이 증가함에 따라 증가하였다. 29-mer 펩타이드의 경우에도 DC 비율이 증가함에 따라 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 증가하였다.

[도 6]의 D에 나타나는 바와 같이, PBMC 총세포수의 증가는 9-mer 및 29-mer 펩타이드 모두에서 통계적 유의성은 없었지만, pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 비율이 DC 비율 증가에 따라 유의적으로 증가함에 따라 pCMV⁺CD8⁺ T 세포의 총세포수 역시 DC 비율 증가에 따라 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

IL- 21를 이용한 자가암항원 특이적 T 세포 배양

IL-21이 포함 배양조건과 IL-21이 포함되지 않은 배양조건에서 암 환자의 말초혈액단핵구로부터 NY-ESO1 특이적 CD8 T 세포 배양 성공률을 비교하고자 하였다.

구체적으로, 자가암항원은 하기 [표 1]에서 나타나는 바와 같이 사람의 NY-ESO1 단백질 아미노산 서열을 대상으로 15-mer 아미노산 크기로 10-mer overlapping이 되도록 펩타이드를 합성하여 배양에 사용하였다.

34 종류의 펩타이드 각각에 대해 T 세포반응을 평가하기 위해 필요한 혈액의 양을 줄이기 위해 34종류의 펩타이드를 [표 2]에 모식된 것처럼 매트릭스(matrix) 형식으로 혼합하여 사용하였다. 예를 들어, NY-M1은 세로로 NY#1, NY#2, NY#3, NY#4, NY#5 및 NY#6 펩타이드가 포함된 펩타이드 혼합물(peptide mixture)이며, NY-M7은 가로로 NY#1, NY#7, NY#13, NY#19, NY#25 및 NY#31 펩타이드가 포함된 펩타이드 혼합물이다. 이와 같이 12가지 종류의 펩타이드 혼합물을 사용하는 경우 12회의 T 세포반응 평가만이 필요하므로 혈액 소모량을 줄일 수 있다.

자궁경부암, 난소암 및 유방암 환자의 혈액으로부터 PBMC를 분리하여, 1×10⁶ cells/㎖로 RPMI1640 배지에 현탁하였으며 3% 자가혈장 각 펩타이드가 1 ㎍/㎖ 농도가 되도록 5-6개의 펩타이드들을 포함한 펩타이드 혼합물을 튜브에 첨가하여 [도 3]의 A와 같이 배양하였다. IL-21을 첨가효과를 확인하기 위해 배양 이틀째 IL-2만을 포함한 배지를 첨가한 경우와, 30ng/㎖ IL-21을 추가로 포함된 배지를 첨가한 경우로 나누어 세포를 14일간 배양하였다.

배양 14일째 각 튜브의 세포를 수거하여 RPMI1640으로 두 번 세척한 후, 3% 자가혈장 및 100 IU/㎖ IL-2가 포함된 RPMI1640 배지 1㎖에 현탁하였으며, 배양에 사용한 동일한 펩타이드 혼합물(각 펩타이드의 농도는 2㎍/㎖)를 첨가하였다. 세포 현탁액을 각 웰(24 well culture plate)에 분주한 후, CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양하여 펩타이드 특이적으로 재활성화를 유도하였다.

배양 15일째 각 웰의 세포를 수거하여 anti-CD8-PE-Cy5와 anti-4-1BB-PE로 염색하여 4-1BB+CD8+ T 세포의 비율을 유세포분석함으로써, 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 비율을 확인하였다. 4-1BB+CD8 T 세포가 검출된 경우는 responder로 검출되지 않은 경우는 non-responder로 판독하였다(도 7).

그 결과, NY-M2(M#2), NY-M4(M#4), NY-M6(M#6), NY-M8(M#8) 및 NY-M11(M#11)의 펩타이드 혼합물에서 4-1BB+CD8 T 세포가 검출되어 responder 그룹으로 분류하였다. 따라서 상기 responsder 펩타이드 혼합물에서 2가지 이상의 펩타이드 혼합물에 공통적으로 포함되어 있는 NY#8, NY#11, NY#20, NY#23 및 NY#32가 4-1BB+CD8 T 세포 발현과 관련이 있을 것(responding peptide)으로 판단하였다.

또한, 제공받은 총 49명의 환자의 혈액을 IL-2만 첨가한 경우와 IL-21을 함께 첨가한 경우로 나누어 NY-ESO-1 특이적 T 세포배양 평가에 사용하였다.

그 결과, [도 8]에 나타나는 바와 같이 IL-2만을 첨가한 경우 27명 중 5명에서 4-1BB+CD8 T 세포가 확인되었으며(18.5%), IL-2 및 IL-21을 첨가한 경우 22명 중 약 6명 정도에서 4-1BB+CD8+ T 세포가 확인되었다(27.2%). 따라서 IL-21을 첨가하여 T 세포를 배양할 경우 NY-ESO1 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포반응을 강화시킬 수 있는 것으로 판단하였다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Method for promoting proliferation or mass culture of antigen-specific CD8+ T cell using IL-21 <130> 1063420 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-mer CMV peptide <400> 1 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 29-mer CMV peptide <400> 2 Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val 1 5 10 15 Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe 20 25 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#1 <400> 3 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#2 <400> 4 Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Gly Pro Gly Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#3 <400> 5 Ser Thr Gly Asp Ala Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT 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Gly Ala 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#11 <400> 13 Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro His 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#12 <400> 14 Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#13 <400> 15 Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#14 <400> 16 Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#15 <400> 17 Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#16 <400> 18 Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#17 <400> 19 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#18 <400> 20 Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#19 <400> 21 Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#20 <400> 22 Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#21 <400> 23 Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#22 <400> 24 Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#23 <400> 25 Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#24 <400> 26 Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#25 <400> 27 Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#26 <400> 28 Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#27 <400> 29 Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#28 <400> 30 Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#29 <400> 31 Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NY#30 <400> 32 Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys 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Claims

a) 암 환자의 혈액에서 말초혈액단핵구(PBMC)를 분리하는 단계;
b) 자가암항원, 상기 단계 a)에서 분리한 1.0×10⁶ 내지 2.0×10⁶cells/1㎖의 PBMC 및 IL-2를 함께 배지에서 배양하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 배양 시작 후 2 내지 3일 이내에 배지에 IL-21을 첨가하는 단계;
를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 증식 촉진 또는 대량 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 암은 폐암, 위선암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 백혈병, 육종, 자궁경부암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 자가암항원은 NY-ESO1, hTERT, WT-1, CEA, CA-125, MUC-1, MART-1 및 MAGE-A3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 PBMC 내의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율은 0.01% 내지 0.3%인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 배양은 둥근 바닥(round bottom)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 IL-21은 1 내지 1000ng/㎖의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 자가암항원의 펩타이드에 포함되는 아미노산의 길이는 5 내지 50 개인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 자가암항원의 펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 36로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 배지에 상기 단계 a)의 PBMC에서 수득한 항원제시세포(antigen presenting cell)을 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 항원제시세포는 수지상세포(dendritic cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
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