CN106047810A - 一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法 - Google Patents

一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法。体内和体外的研究表明树突状细胞（DCs）和细胞毒T细胞（CTLs）在相互作用中一方面产生刺激性信号激活CTL发挥抗肿瘤、抗病毒的作用，另一方面则产生抑制性信号使免疫反应控制在合理的范围，以免过强的免疫反应对机体造成伤害。基于上述原理，我们利用PD‑1的抑制剂优化DC‑CTL培养体系，并在体外检测该体系培养的CTLs对肿瘤细胞MCF10的特异杀伤活性。结果表明我们改进的培养体系能显著增强CTL对肿瘤细胞MCF10的特异杀伤。该培养体系培养的DC‑CTL可以用于临床肿瘤的免疫细胞治疗。

Description

一种新型DC-CTLs细胞培养体系及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种新型DC-CTLs细胞培养体系及其培养方法，用于细胞免疫治疗领域，但DC和CTL相互作用过程中，DC细胞会表达PD-L1，而激活的CTL细胞会诱导表达PD-1，因而，PD-1/PD-L1途径对CTL的增殖和减弱影响对肿瘤细胞的杀伤作用。基于上述理由，我们在DC-CTL共培养体系中加入PD-1的抑制剂可以阻断PD-1和PD-L1的结合，从而有助于刺激CTL的增殖和对肿瘤的杀伤功能。此外，DC-CTL培养体系的建立过程中需要其它细胞因子，优化了整个培养体系和CTL回输前的处理。
背景技术
癌症问题日趋严峻，癌症的预防与控制面临巨大挑战。世界卫生组织国际癌症研究中心认为，未来癌症发病人数年均将会以3%~5%的速度递增，预计2020年全球将有2000万癌症新发病例，死亡病例将达1400万。据《2012年中国肿瘤登记年报》报告，我国肿瘤发病率和死亡率的概况为：每10万人有 286人患癌，肿瘤发病率随人群年龄逐渐上升，特别是50岁以上随年龄增加而大幅上升，50岁以上占全部发病的80%以上，每年肿瘤死亡人数为140-150万。
常规的肿瘤治疗手段，即手术、放疗和化疗，对于进展性的或晚期肿瘤仍然束手无策，许多肿瘤患者最终死于肿瘤的转移和耐药。由于肿瘤变异的特性，肿瘤对常规放射和化学治疗有明显的反弹效应。例如，当细胞毒性化疗药物将大部分肿瘤细胞摧毁后，少量对这种药物有抗性的细胞仍有能力成为新的肿瘤灶。更糟的是，这种肿瘤对先前有效的治疗不再产生反应，因为肿瘤细胞在细胞毒性药物的选择压力下会产生抗性。即在正常条件下存活而被选择出来的那部分肿瘤细胞导致了肿瘤的复发、发展和转移。因为肿瘤细胞具有很强的遗传可塑性，所以对任何致死性压力的抗性，都可以在肿瘤细胞群体中被进化选择出来。要成功地治疗肿瘤，可能需要多种针对肿瘤细胞不同存活机制的靶向制剂。
通常有两种解决方法：攻击肿瘤细胞本身改变成攻击维持肿瘤生长和存活的环境，或者使免疫系统像对付感染那样去杀伤肿瘤细胞。前一种策略，就其本质而言是被动的，因为肿瘤细胞是被间接的途径所杀伤。例如，抗血管生长治疗阻断肿瘤的血液供应，从而间接地杀伤肿瘤。这种治疗不容易诱导产生抗性，因为肿瘤环境中的基质细胞在基因组上相对稳定。然而，由于其被动型，这种治疗仍然因肿瘤细胞的演化而容易复发，例如抗血管生长治疗中，血管又会再现，可能因为营养和低氧环境导致肿瘤干细胞的产生。与此相反，一种主动的、更具吸引力的策略是，在肿瘤患者中“唤醒”主动免疫反应，使其参与抗肿瘤治疗。这种策略的主要作用是规避肿瘤的异质性，而这种异质性是肿瘤细胞对选择压力反应的结果。在这点上，免疫系统特别适合于清除少量残存的肿瘤细胞，尤其是那种放疗和化疗很难杀灭的静止期细胞或肿瘤干细胞，这有助于延长患者无瘤生存期并提高其生活质量。
目前国内外非常关注免疫细胞治疗肿瘤。从上个世纪的80年代的LAK细胞，到1989年的细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killers, CIKs），肿瘤侵润淋巴细胞（TILs），这些免疫细胞治疗肿瘤无疑为患者的治疗带来了福音。2010年FDA批准DC细胞疫苗治疗前列腺癌具有里程碑意义，世界各国已有200多项治疗各种不同肿瘤的DC疫苗进入临床I、II期。近年来除了DC细胞疫苗外，其他免疫细胞和DCs联合使用用于肿瘤的治疗，如DC-CIK，DC-CTL和DC-NK，其中CIK应用较为广泛，DC-CIKs或CTL较单纯的效应细胞对肿瘤的治疗效果好，主要由于DC和效应细胞CIKs和CD8+T之间的相互作用，增加了效应细胞对肿瘤的特异杀伤和效应细胞的活化。但DC细胞和效应细胞的相互作用非常复杂，不仅存在MHC-I-表位多肽复合物和T细胞受体（TCR）作用的第一信号（signal-1）和共刺激分子和其受体之间的作用的第二信号（signal-2），以及细胞因子刺激的第三信号（signal-3）（参见图1）。
第一信号的产生是病原体感染DC细胞或DC细胞摄取突变或转化细胞后，对抗原进行加工处理，并把抗原表位和主要组织相关性复合物（MHC）结合成MHC/抗原表位复合物，然后成熟的DCs迁徙到类淋巴组织，把抗原信息呈递给辅助性T细胞或交叉递呈给CD8+T细胞，诱导机体对病原体或转化细胞或肿瘤细胞的免疫反应。显然，抗原表位和MHC分子的结合是启动特异免疫反应的关键步骤之一。
多肽免疫治疗的吸引力在于是有效T细胞反应的最小必需原件：MHC-I和/或II表位肽，制备简单方便。但是，当用多肽疫苗观察免疫反应时，有临床疗效的少，表明其免疫原性弱。MHC相关不变链（Ii）的一部分能加强MHC-II表位电荷，导致抗原特异的CD4+Th激活。这一策略的有效性在各种不同的体外体系、动物模型和临床实验中得到了证明。Ii-key杂交技术代表一个安全有效的多肽免疫治疗策略，在临床实验中显示有疗效。
MHC-II在抗原呈递细胞合成后不久，MHC-II异二聚体形成与在内质网的不变链（Ii蛋白）组装，从高尔基复合体转运到内吞作用途径，大部分Ii被低pH液泡中的蛋白酶从MHC-II分子上除去，仅剩下称为II类相关不变链多肽（CLIP）的Ii蛋白水解片断[CresswellP. Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Ann RevImmunol 1994; 12:259–93]。CLIP作为在MHC-II表位-结合沟中的看护者，抑制构象改变[Natarajan SK, Assadi M, Sadegh-Nasseri S. Stable peptide binding to MHCclass II molecule is rapid and is determined by a receptive conformationshaped by prior association with low affinity peptides. J Immunol 1999;162(7):4030–6.]。当外源多肽结合新生的MHCII复合体后，以一个协同的方式除去CLIP。人类的HLA-DM或小鼠的H2-M在CLIP的替代中起关键作用[Denzin LK, Cresswell P. HLA-DMinduces CLIP dissociation from MHC class II alpha beta dimers and facilitatespeptide loading. Cell 1995;82(1):155–65.]。除了替代CLIP外，DM在极短时间内和没有结合表位肽的MHC-II相互作用产生一个接受多肽的构象，在抗原呈递中选择特异多肽/MHC-II 复合体[Denzin LK, Cresswell P. HLA-DM induces CLIP dissociation fromMHC class II alpha beta dimers and facilitates peptide loading. Cell 1995;82(1):155–65.]。最近的研究表明Ii片断在抗原加工、表位和MHC-II分子结合能模拟HLA-DM功能。Ii-key的特性和用它修饰多肽疫苗使其成为加强多肽疫苗的抗原性的候选分子[Chou CL, Mirshahidi S, Su KW, Kim A, Narayan K, Khoruzhenko S, et al. Shortpeptide sequences mimic HLA-DM functions. Mol Immunol 2008;45(7):1935–43.]。早期研究表明Ii（小鼠Ii：77-92：LRMKLPKSAKPVQMR）的一个17氨基酸多肽序列能够大大加强I-E限制的抗原多肽呈递给反应的T细胞杂交瘤[Adams S, Humphreys RE. Invariantchain peptides enhancing or inhibiting the presentation of antigenic peptidesby major histocompatibility complex class II molecules. Eur J Immunol 1995;25(6):1693–702.]。序列的C末端删去后，剩余（后来称为Ii-Key）N末端的LRMKLPK多肽, 仍保留了大部分活性[Adams S, Albericio F, Alsina J, Smith ER, Humphreys RE.Biological activity and therapeutic potential of homologs of an Ii peptidewhich regulates antigenic peptide binding to cell surface MHC class IImolecules. Arzneimittelforschung 1997;47(9):1069–77.]。Ii蛋白的这个片断能够与MHC-II分子的别构位点结合，方便以前结合的多肽释放，加强了新的多肽与MHC-II的结合[Xu M, Jackson R, Adams S, Humphreys RE. Studies on activities of invariantchain peptides on releasing or exchanging of antigenic peptides at humanLeukocyte antigen-DR1. Arzneimittelforschung 1999;49(9):791–9.]。为了强化MHC-II表位肽疫苗的能力，Ii-Key/表位杂交体通过Ii-Key核心基序LRMK通过一个简单的多聚亚甲基桥和MHC-II表位的N末端连接而成[Humphreys RE, Adams S, Koldzic G,Nedelescu B, von Hofe E, Xu M. Increasing the potency of MHC class II-presented epitopes by linkage to Ii-Key peptide. Vaccine 2000;18(24):2693–7.]。最初Ii-Key/PGCC (aa 95-104)的杂交体的体外T细胞杂交瘤的增殖研究显示Ii-Key/PGCC (aa 95-104)杂交体刺激PGCC(aa 95-104)T细胞杂交瘤较PGCC(aa 95-104) 表位肽强200-250倍[11]。接下来的研究显示来源不同相关疾病的Th细胞体内外Ii-Key杂交体疫苗的作用[Kallinteris NL, Lu X, Wu S, Hu H, Li Y, Gulfo JV, et al. Ii-Key/MHCclass II epitope hybrid peptide vaccines for HIV. Vaccine 2003;21(27-30):4128–32；Kallinteris NL, Wu S, Lu X, von Hofe E, Humphreys RE, Xu M. Linkageof Ii-Key segment to gp100(46-58) epitope enhances the production of epitope-specific antibodies. Vaccine 2005;23(17-18):2336–8；Kallinteris NL, Wu S, Lu X,Humphreys RE, von Hofe E, Xu M. Enhanced CD4+T-cell response in DR4-transgenic mice to a hybrid peptide linking the Ii-Key segment of theinvariant chain to the melanoma gp100(48-58) MHC class II epitope. JImmunother 2005;28(4):352–8；Xu M, Lu X, Sposato M, Zinckgraf JW, Wu S, vonHofe E. Ii-Key/HPV16 E7 hybrid peptide immunotherapy for HPV16+ cancers.Vaccine 2009;27(34):4641–7；Gillogly ME, Kallinteris NL, Xu M, Gulfo JV,Humphreys RE, Murray GL. Ii-Key/HER-2/neu MHC class-II antigenic epitopevaccine peptide for breast cancer. Cancer Immunol Immunother 2004;53(6):490–6；Voutsas IF, Gritzapis AD, Mahaira LG, Salagianni M, von Hofe E, KallinterisNL, et al. Induction of potent CD4+ T-cell-mediated antitumor responses by ahelper HER-2/neu peptide linked to the Ii-Key moiety of the invariantchain.Int J Cancer 2007; 121(9):2031–41.]。 AE37，是一个HER2表位肽和Ii-key的杂交体，即使没有GM-CSF佐剂下免疫肿瘤患者，能诱导产生CD4+T细胞和抗-HER2免疫反应[Holmes JP, Benavides LC, Gates JD, Carmichael MG, Hueman MT, Mittendorf EA,et al. Results of the first phase I clinical trial of the novel II-key hybridpreventive HER-2/neu peptide (AE37) vaccine. J Clin Oncol 2008;26(20):3426–33；Gates JD, Clifton GT, Benavides LC, Sears AK, Carmichael MG, Hueman MT, etal. Circulating regulatory T-cells (CD4+CD25+FOXP3+) decrease in breastcancer patients after vaccination with a modified MHC class II HER2/neu (AE37)peptide. Vaccine 2010;28(47):7476–82；Perez SA, Kallinteris NL, Bisias S,Tzonis PK, Georgakopoulou K, Varla-Leftherioti M, et al. Results from a phaseI clinical study of the novel Ii-Key/HER-2/neu((aa776-790)) hybrid peptidevaccine in patients with prostate cancer. Clin Cancer Res 2010;16(13):3495–506.]。图2描述了Ii-Key/表位肽和MHC-II结合。表明Ii-Key/抗原表位肽能够“劫持”以前的表位肽，让与Ii-Key融合的抗原表位肽与MHC-II分子结合，无需通过DC细胞对抗原加工处理。
图1显示效应细胞激活后产生共抑制性信号，以减弱因效应细胞过度激活对机体产生的伤害，这种抑制性受体被称为“免疫检查点（immune checkpoint）”。主要有PD-1和共抑制性受体，如CTLA-4，B和T淋巴细胞减弱因子（B and T Lymphocyte Attenuator，BTLA或CD272），Tim-3(T cell Immunoglobulin and Mucin domain-3), LAG-3(LymphocyteActivation Gene-3)等。其中PD-1/PD-L1信号途径是最重要的途径之一，大量证据表明PD-1是一个共抑制受体，在活化的T细胞表达，负调节T细胞功能【Drew M. Pardoll. Theblockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. NATURE REVIEWS |CANCER. 2012, 12(253): 252-264.】。例如，PD-1在抗原-激活的CD8+T细胞高水平表达和CD8+T细胞耗损（T cell exhausion）相关。被耗损的CD8+T细胞渐渐失去效应功能，包括增殖能力、表达如IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的能力，最终导致细胞凋亡。耗损的PD-1+CD8+T细胞在肿瘤的肿瘤侵润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TILs）和慢性病毒性感染得到证明【Badoua C，Hans S, Merillon N,et al. PD-1–Expressing Tumor-Infiltrating T Cells Are a Favorable Prognostic Biomarker in HPV-AssociatedHead and Neck Cancer. Cancer Res.2013;73(1):128-138.Pai S. Adaptive immuneresistance in HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma.OncoImmunology.2013;2:5, e24065. Sznol M and Chen L. Antagonist Antibodies toPD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the Treatment of Advanced Human Cancer. Clin CancerRes. 2013; 19(5): 1021–1034. Bauzon M and Hermiston T. Armed therapeuticviruses – a disruptive therapy on the horizon of cancerimmunotherapy.Frontiers in Immunology.2014; 5:1-10. Lyford-Pike S, Peng S,Young G,et al. Evidence for a role of the PD-1:PD-L1 pathway in immuneresistance of HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. CancerRes. 2013; 73(6): 1733–1741.】。但是，PD-1的表达抑制CD8+T细胞功能的确切机制未完全理解。除了PD-1、CTLA-4免疫检查点外，免疫细胞内在一些细胞因子的作用下存在抑制因子，以免免疫反应对机体造成损害。
无论是DC疫苗还是DC-CTL在体外的培养需要一组细胞因子。细胞因子是一类调节细胞生长、分化、增殖的多肽小分子，其不能直接进入细胞内发挥作用，需通过细胞因子受体介导，经相应信号传导途径发挥其生物学效应。
综上所述，本发明主要是以Ii-Key技术直接把抗原表位肽锚定在DCs的MHC-II分子上，形成MHC-II/Ii-Key-抗原表位肽复合物，避免了DCs对抗原的加工处理，增强了MHC-II和抗原表位的亲合力，也避免了多肽抗原对MHC分子的限制性要求。另外，基于DC和CTL共培养过程中产生的共抑制信号，用免疫检查点PD-1的抑制剂抑制DC-CTL相互作用产生的共抑制信号，并优化CTL回输前的流程，从而增强CTL后续对肿瘤细胞的杀伤活性。在本发明中，我们以乳腺癌为研究对象，但该发明也同样适应于对其他肿瘤和病原体的治疗，该发明经临床研究后可以用于肿瘤的免疫细胞治疗。
发明内容
本发明通过生物信息学方法分析肿瘤的抗原表位肽，然后和Ii-Key融合成Ii-Key-抗原表位多肽，直接将该融合多肽加到培养的DCs，通过Ii-Key将抗原表位肽锚定在DCs表面分子MHC-II后，用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激DCs成熟后，与CTL效应细胞共培养，在培养基中加入PD-1的单克隆抗体，浓度为1μg/ml , 可以大大加强了CTLs对肿瘤细胞（以乳腺癌细胞系MCF-7为例）的特异杀伤作用。在本发明中，我们以乳腺癌为模型，将乳腺癌细胞系（高表达HER2）接种裸鼠，通过我们的方法培养的CTLs对荷瘤小鼠的治疗，能显著抑制肿瘤细胞的生长，大大延长了荷瘤小鼠的总体生存时间（p<0.01）。
本发明的技术方案如下：
一种新的DC-CTLs细胞培养体系，在CTLs细胞的培养体系中加入DCs细胞和PD-1单克隆抗体， PD-1单克隆抗体为GCP级别，浓度为0.5-5μg/ml，优选的浓度为1μg/ml。
所述DCs细胞采用人PBMCs通过IL-4和GM-CSF培养得到。
所述CTLs细胞用免疫磁珠分选后计数后用IL-2诱导得到。
所述CTLs细胞和所述DCs细胞共培养的比例为50：1。
上述的DC激活的CTLs细胞培养体系用于高表达HER2+的肿瘤患者的免疫细胞治疗。
一种新的DC-CTLs细胞培养方法， DCs细胞用IL-4和GM-CSF诱导制备，DCs细胞培养后的第3天用2μg/ml的AE37脉冲24小时，加入10ng/ml的TNF-α12小时，让DCs细胞成熟后，然后与用IL-2诱导得到的CTLs细胞、PD-1抑制剂单克隆抗体一起共培养， DCs和CTLs的比例为1：50。
采用上述方法培养的DC-CTLs细胞，共培养10天后开始治疗荷瘤（本发明接种MCF-7细胞）裸鼠进行治疗，治疗流程为：第一次免疫细胞的总数为107，隔一天后再回输免疫细胞，继续2次。
上述的DCs-CTLs细胞在治疗肿瘤患者或病毒性疾病中的应用。
本发明的有益效果为：本发明所述DCs细胞先经过Ii-Key/AE37后，与CTLs共培养，强化了CTLs细胞的扩增数量和功能；经过上述处理的CTLs对肿瘤细胞的杀伤活性较其它对照组显著增强（p<0.01）。体内实验进一步证明该处理的DCs激活后的CTLs效应对荷瘤小鼠的肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，显著提高小鼠总体存活时间。 需要说明的是，本发明与CN201410247801.8有几点不同：（1）细胞不同，上一个是用CIK细胞，CIK细胞是异质细胞群，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK、NKT细胞等，这个发明是被免疫磁珠纯化的CTL细胞（主要是CD+T细胞）。（2）抑制剂部分相同，前一个专利是PD-1抑制剂和SOCS1的抑制剂，这个专利抑制剂单一，即PD-1抑制剂。（3）最后但最重要的是，DC-CTL的整个流程被优化，回输前的CTL结合了PD-1的抑制剂，规避了游离的PD-1可能的副作用以及回输的CTL因为免疫微环境中的免疫抑制信号限制CTL功能的发挥，最大限度发挥回输的CTL对特异肿瘤细胞的杀伤活性。
附图说明
图1为DCs细胞和初始/静息T细胞相互作用过程中的主要信号的示意图；
图2为用抗原特异的表位肽和Ii-Key融合后结合DC细胞的示意图；
图3为DCs细胞培养第3天，细胞贴壁成团，部分呈半悬浮状态；
图4 为荧光标记的AE37锚定DCs的激光共聚焦显微镜观察到的图片；
图5 DCs细胞未成熟和成熟的表型分析；
图6 用LDH释放实验分析DC-CTLs细胞对MCF-7的杀伤活性。
具体实施方式
一、树突状细胞（dendritic cells, DCs）细胞的培养
1、DCs细胞的培养
人DCs细胞的培养方法如下：采取健康外周血80毫升，用淋巴细胞分离液分离并得到PBMCs，细胞计数后，按照106细胞/ml铺在细胞培养瓶，4小时候除去悬浮细胞，用含rhuGM-CSF(20 ng/ml，PeproTech)和rhuIL-4(20 ng/ml，PeproTech)的完全培养液进行培养，细胞在培养第2 d弃培养液上清，并用新鲜含rhuGM-CSF 和rhuIL-4 培养基代替，经过24h 培养，没有粘附的粒细胞被去掉。用流式细胞仪分析培养3天DCs的表型，如图3所示。图2表明DCs培养第3天，细胞贴壁成团，同TNF-α处理后部分呈半悬浮状态。
2、 DCs 表型检测
流式细胞仪检测不成熟和成熟DC细胞的表面标记物。调细胞浓度为2×105 /ml，分别加入1 μl FITC 标记的小鼠CD80、CD83、CD86单抗，设立空白对照。4 ℃避光反应30 min，洗涤后上流式细胞仪检测。流式细胞检测操作流程：
1）DCs 细胞培养5d后，离心800 r/min，7 min，弃上清；
2）含2 %牛血清的PBS 洗液1 ml 洗涤2次；
3）分别加标记抗体（CD80，CD83，CD86）1μl 至终浓度为5 mg/L；阴性对照组加入FITC标记羊抗鼠lgG，终浓度为5 mg/L；
4） 4 ℃避光轻度震荡30 min，用1 ml PBS 洗涤2 次；
5）加入400 μl 1 %多聚甲醛进行固定；
6）4 ℃暗处保存，上机分析。
3. AE37锚定DCs
将以FITC-AE37和和Cy5-AE37以浓度1μg/m l加到DCs培养后的三天的培养物中，24小时观察结果。此外，先加Cy5-AE36 12小时，然后加入FITC-AE37后12小时再用荧光显微镜观察结果。结果（图5）表明：DCs细胞在细胞因子IL-4和GM-CSF诱导下形成具有典型特征的树突状的细胞，流式细胞仪分析表达CD40，CD80和CD86。当FITC-AE37和Cy5-AE36均能结合到培养的DCs上，但当Cy5-AE36先加入到DCs培养物后12小时，再加入FITC-AE37后在荧光显微镜下观察发现，红色的荧光减少甚至消失，而绿色的荧光增加，几乎占整个细胞表面的绝大部分（图4）。此外，如果先加入FITC-AE37后加入Cy5-AE36仍然只看见绿色荧光。该结果表明AE37能够“劫持”已经和MHC结合的AE36，DCs无需对锚定抗原进行加工处理，能直接和锚定抗原结合，显然能提高DCs的抗原负载效率。
图4表示的是 AE36、AE37和DCs上的MHC的结合。A：普通光学显微镜下观察到的DCs细胞；B：Cys-AE36和DCs的结合；C：DCs先与Cy5-AE36结合后12小时加入FITC-AE37后12小时观察的DCs；D：DCs先与Cy5-AE36结合后12小时加入FITC-AE37后24小时观察的DCs。
二、杀伤细胞（cytokine-induced killers, CIKs）的培养
1、 单核细胞（PBMC）的分离培养
1） 采取健康人的外周血50ml, 柠檬酸钠抗凝；
2） 取50 ml离心管，加入Ficoll淋巴细胞分离液，静脉血在距分层液界面上1cm处沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，切勿混匀；稀释血与淋巴分离液的柱高之比为1.5：1，且两者总柱高不超过试管2/3；
3） 将离心管置水平离心机内，室温中 2 000 r／min离心20 min。离心后，管内可分为4层：① 上层为血浆、大部分血小板和血液稀释液；② 下层为粒细胞和红细胞；③ 中层为淋巴细胞分离液；④ 分离液与血浆交界部位的灰白色层为单个核细胞层；
4） 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出灰白色单个核细胞，移入另一支无菌离心管；
5） 将所得到PBMC悬液用1倍体积 PBS洗涤1次，1000 r/min离心5min，弃上清；
6）再加入2倍体积的PBS洗涤，悬浮细胞，手工计数板计数，1 000 r/min离心5 min，弃上清，获取底层淋巴细胞；
7）用无血清（FCS）培养液悬浮PBMC，获得终浓度为5x106／ml的悬浮细胞；8）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液， 5min后高倍镜检，死细胞染成蓝色，活细胞不着色，计数200个细胞，计算活细胞百分率，一般细胞活性应在95％以上。
2. CTLs细胞的培养
外周血PBMCs经过Ficoll淋巴细胞分离液分离后得到PBMCs，用含2%BSA的生理盐水洗涤2次后，用免疫磁珠分选CTLs细胞，离心后，调整细胞密度为106/ml, 用含10%的FBS和IL-2（1000IU/ml）的1640培养基继续培养。CTLs培养后的第5天将培养好的DCs以5：1的比例共培养，培养基为用含10%的FBS和IL-2（1000IU/ml）的1640培养基,另外加入PD-1的单克隆抗体，共培养到第10天，收获细胞。用流式细胞仪分析CTLs的表面分子CD3，CD56，CD4，CD8等。
3. 镜下观察CTLs分离后增殖。
显微镜下观察CTLs细胞增殖成熟情况，如图3所示，CTLs加入刺激因子培养24~48h开始出现小的克隆团，72 h达高峰，如出现大量悬浮细胞克隆团,需用滴管吹散，并补充培养液。每天观察2次细胞生长情况，根据细胞克隆团生长情况和培养液颜色补充培养液，该过程不换液，只加液，随着细胞的扩增，传代分瓶。
4. 流式细胞学检测DCs，CTLs表型
在分离培养第3天至第8天，使用流式细胞仪技术检测不成熟和成熟DCs细胞、CTLs细胞的表型。
在上述不同时间收集DCs细胞PBS洗涤一次，1000 r/min 离心10min收集细胞。每管105个细胞分装5测定管，分别加入抗小鼠的单抗CD80(FITC)， CD83(FITC)，CD86(PE)。同型对照为鼠IgG，室温孵育30 min。PBS洗涤1次，加入500μl PBS上流式细胞仪检测分析。利用软件分析数据, 如图5所示。
在上述不同时间收集CTLs细胞PBS洗涤1次，1000 r/min 离心10min收集细胞， 每管105个细胞分装5测定管，分别加入抗小鼠的单抗CD3 (FITC)/CD4 (PE)，CD3 (FITC)/CD8(PE)，CD3 (FITC)/CD56 (PE)。同型对照为鼠IgG，室温孵育30 min。PBS洗涤1次，加入500μlPBS上流式细胞仪检测分析，利用软件分析数据。
结果表明用一组细胞因子可以在体外培养CTLs细胞和DCs细胞。DCs细胞成熟后其表面标记分子CD83和CD80显著增加，而CD14则显著减少，但CD40和CD86变化不明显。CTLs的表型为CD3+CD4-CD8+。
三、DC-CTLs共培养体系
DCs细胞和CTLs细胞的培养按照前面的方法，在DCs细胞培养的第3天，AE37（1μg/ml）加到DCs细胞培养液24小时，随后用TNF-α感染DCs过夜，而后与培养的CTLs细胞以1：50比例混合，继续培养5天。
四、DC-CTLs在体内和体外强化对靶细胞的杀伤作用
为了证明AE37锚定的DCs能够强化CTLs细胞对靶细胞的杀伤，我们以对乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象。
1. DCs细胞和CIKs细胞的培养同前。
2. DCs细胞培养的第3天加入AE37（1μg/ml），以HBsAg的R187
(aa183-191) (FLLTRILTI) 作为对照，加入多肽的浓度为1μg/ml,24小时后，用TNF-α刺激DC细胞成熟，然后与已培养5天的CTLs混合，比例为1：50，继续培养5天，然后以不同比例的DC-CTLs细胞和靶细胞MCF-7细胞混合培养，混合比例为30：1；50：1和100：1，24小时后用试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
为了检测自发的LDH活性，设培养孔中只有靶细胞没有效应细胞作为对照，检测最大释放的乳酸脱氢酶（LDH）的活性。培养孔中加Triton X-100 (1%质量百分含量)表示最大释放活性。乳酸脱氢酶活性的计算公式为：(LDHtest–LDHspont)/(LDH total –LDHspont)]x 100（Shan, B.E., J.S. Hao, Q.X.. Li,and M.Tagawa.Antitumor Activity andImmune Enhancement of Murine Interleukin-23 Expressed in Murine ColonCarcinoma Cells Cellular & Molecular Immunology. 2006；3(1), 49-57）。公式中LDHtest、LDHspont和LDH total分别代表试验孔、自发释放孔和最大释放孔。实验设三个复孔，具体结果如图6所示，结果表明DC-CTL对靶细胞MCF-7的杀伤活性。从图可以看出DC-CTL（anti-PD-1）对MCF-7细胞的杀伤活性显著高于其他对照组，DC-CTL组比单纯的CTL对靶细胞杀伤也存在显著性差异（p<0.05）.效应细胞与靶细胞的比例为50：1。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列方法或产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (7)

1.一种新的DC-CTLs细胞培养体系，其特征在于，在CTLs细胞的培养体系中加入DCs细胞和PD-1单克隆抗体， PD-1单克隆抗体为GCP级别，浓度为0.5-5μ g/ml。
2.如权利要求1所述的DC-CTLs细胞培养体系，其特征在于，PD-1单克隆抗体浓度为1μg/ml。
3.如权利要求1所述的DC-CTLs细胞培养体系，其特征在于，所述DCs细胞用IL-4和GM-CSF刺激培养得到。
4.如权利要求1所述的DC-CTLs细胞培养体系，其特征在于，所述CTLs细胞用免疫磁珠分选后计数后用IL-2诱导得到。
5.如权利要求1所述的DC-CTLs细胞培养体系，其特征在于，所述CTLs细胞和所述DCs细胞共培养的比例为50：1。
6.如权利要求1-5任一项所述的DC-CTLs细胞培养体系用于高表达HER2+的肿瘤患者的免疫细胞治疗。
7.一种新的DC-CTLs细胞培养方法，其特征在于， DCs细胞用IL-4和GM-CSF诱导制备，DCs细胞培养后的第3天用2μg/ml的AE37脉冲24小时，加入10ng/ml的TNF-α12小时，让DCs细胞成熟后，然后与用IL-2诱导得到的CTLs细胞、PD-1单克隆抗体一起共培养， DCs和CTLs的比例为1：50。
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