DE10024384A1 - Herstellung von dendritischen Zellen aus Rückenmarkstammzellen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung dendritischer Zellen, wobei Rückenmarkstammzellen in einem Nährmedium in Anwesenheit der Wachstumsfaktoren GM-CSF und IL-4 und wahlweise zusätzlich in Anwesenheit der Interleukin-Rezeptors sIL-4R wachsen, bis sich dendritische Zellen gebildet haben. Die so hergestellten dendritischen Zellen werden bevorzugt mit Toxinen, Zytokinen und/oder Zytokin-Rezeptoren beladen und zur Behandlung von Tumorpatienten eingesetzt.
Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von dendritischen Zel
len aus Rückenmarkstammzellen über die Zugabe der Wachstums
faktoren GM-CSF und IL-4 sowie wahlweise zusätzlich des Inter
leukin-Rezeptors sIL-4R in vitro zum therapeutischen Einsatz
bei Tumorerkrankungen, bevorzugt Hauttumorerkrankungen.
Unter dendritischen Zellen versteht man aus Stammzellen aus
differenzierte, mit Dendriten versehene Zellen des Immunsys
tems, welche genetisch entartete Zellen aufspüren und zerstö
ren. Die Zerstörung kann beispielsweise über Einpumpen von Im
munpeptidtoxinen in die genetisch entartete Zelle mittels der
Dendriten nach vorherigem Andocken an diese erfolgen. Dabei
übernimmt die dendritische Zelle die Funktion einer Transport
zelle. Das Immunpeptidtoxin bewirkt die Lysierung der entar
teten Zelle.
Bei einem geschwächten Immunstatus reicht die Zahl der im Kör
per vorhandenen dendritischen Zellen im Zusammenspiel mit dem
übrigen Immunsystem nicht mehr aus, entartete Zellen wirksam
zu bekämpfen.
Um einen lokal manifestierten Tumor, bevorzugt Hauttumor, zu
therapieren, kann man in vitro produzierte, patienteneigene
dendritische Zellen dem Patienten in den Tumor bzw. um den Tu
mor herum injizieren. Bevorzugt sind diese dendritischen Zel
len noch mit Zytokinen und/oder Immuntoxinen zusätzlich bela
den. Die Kapazität der Beladung ist bei den herkömmlich, aus
Blutstammzellen hergestellten dendritischen Zellen begrenzt.
Derzeit werden dendritische Zellen aus Blutstammzellen herge
stellt. Die Ausdifferenzierung erfolgt über die Zugabe von
einzelnen Wachstumsfaktoren bzw. Wachstumsfaktorenmischungen
in vitro.
Der Nachteil bei dieser Methode besteht in der nicht einheit
lichen Ausdifferenzierung und des damit verbundenen unter
schiedlichen Basiszellvolumens. Dadurch ist eine Beladung mit
artfremden therapeutisch wirksamen Substanzen (Tier- und Pflan
zengifte) kaum möglich.
Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein verbessertes
Verfahren bereitzustellen, das für die Tumortherapie und/oder
als Begleittherapie z. B. zur herkömmlichen Bestrahlungsthera
pie von Tumorerkrankungen eingesetzt werden kann und die ge
nannten Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist.
Dies wird erfindungsgemäß gelöst durch eine spezifische Aus
wahl des Ausgangsmaterials (Rückenmarkstammzellen) und durch
Verwendung einer spezifischen Kombination von Wachstumsfakto
ren (GM-CSF und IL-4), wahlweise zusätzlich in Kombination mit
dem Interleukin-Rezeptor sIL-4R.
Die so hergestellten dendritischen Zellen zeichnen sich insbe
sondere durch ihre Uniformität aus und sind weiterhin in her
vorragender Weise sowohl quantitativ als auch qualitativ mit
therapeutisch wirksamen Substanzen effizienter beladbar als
die aus dem Stand der Technik aus Blutstammzellen hergestell
ten dendritischen Zellen. Diese Vorteile weisen sie auch ge
genüber aus Rückenmarkstammzellen hergestellten dendritischen
Zellen auf, die ohne Verwendung der hier beschriebenen spezi
fischen Wachstumsfaktorkombination, wahlweise zusätzlich zu
sammen mit dem Interleukin-Rezeptor sIL-4R, hergestellt wur
den.
Nachfolgend wird die Erfindung zunächst allgemein und dann an
hand eines Ausführungsbeispiels näher beschrieben. Die Erfindung
ist jedoch nicht auf die in der nachfolgenden Beschrei
bung genannten speziellen Ausführungsformen und auf das Aus
führungsbeispiel beschränkt. Im Rahmen der Beschreibung und
der Patentansprüche können einzelne Ausgestaltungen der Erfin
dung durchaus abgewandelt werden, ohne vom Geist der Erfindung
abzuweichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren geht von menschlichen oder tie
rischen Rückenmarkstammzellen aus, wobei selbstverständlich
menschliche Rückenmarkstammzellen bevorzugt sind. Bevorzugt
handelt es sich um autologe Rückenmarkstammzellen, die nach
der Ausdifferenzierung zu dendritischen Zellen wieder in den
Spender rückgeführt werden.
Die Rückenmarkstammzellen werden durch an sich bekannte Ver
fahren aus dem Rückenmark isoliert. Am häufigsten werden hier
Rückenmarkpunktionsverfahren eingesetzt. Das so gewonnene Ge
webe kann direkt in Zellkultur genommen werden, wobei jedoch
im allgemeinen das entnommene Rückenmark so behandelt wird,
daß die Zellen für einen längeren Zeitraum lebensfähig blei
ben. Hierzu hat sich eine Schockgefrierbehandlung besonders
bewährt. Die derart behandelten Zellen werden dann in flüssi
gem Stickstoff aufbewahrt. Es versteht sich von selbst, daß
sowohl die Entnahme als auch die Aufbewahrung so erfolgen müs
sen, daß eine weitgehende Sterilität sichergestellt ist.
Die Rückenmarkstammzellen werden in übliche Zellkulturgefäße
in einem zum Wachstum geeigneten Medium eingebracht. Übliche,
dem Fachmann bekannte Medien zur Kultivierung von Rückenmark
stammzellen sind einsetzbar. Besonders bewährt hat sich DMEM-
Ham's F-12-Medium in Kombination mit RPMI. Zur Vermeidung von
Kontaminationen werden Antibiotika, bevorzugt Mischungen von
Antibiotika, zugegeben. Einsetzbare Antibiotika sind bei
spielsweise Penicillin und Streptomycin. Weitere Additive sind
Aminosäuren, beispielsweie Glutamin, und fötales Kälberserum
oder Ersatzstoffe hierfür. Die Zellen werden bei einer geeig
neten Temperatur im Brutschrank kultiviert, wobei Körpertempe
ratur von ca. 37°C besonders bevorzugt eingesetzt wird.
Die Zellen werden in Anwesenheit einer spezifischen Wachstums
faktorkombination, nämlich GM-CSF und IL-4, und wahlweise zu
sätzlich des Interleukin-Rezeptors sIL-4R kultiviert. Erfin
dungsgemäß hat sich herausgestellt, daß ausschließlich durch
diese Kombination an Wachstumsfaktoren und wahlweise zusätz
lich des Interleukin-Rezeptors uniforme dendritische Zellen
ausgebildet werden, die besonders effizient mit Wirksubstanzen
beladen werden können, beispielsweise mit Zytokinen, Zytoto
xin-Rezeptoren und zytotoxischen Wirkstoffen. Die zugegebenen
Wachstumsfaktoren und der wahlweise zusätzlich zugegebene In
terleukin-Rezeptor können aus natürlichen Quellen stammen oder
auch rekombinanter Natur sein. Die zugegebenen Wachstumsfak
tormengen können vom Fachmann durch Handversuche ermittelt und
optimiert werden. Im allgemeinen liegt die Menge der zugegebe
nen Wachstumsfaktoren bei 800-1000 U/ml pro Wachstumsfaktor,
wobei sich ein Bereich von ca. 860-950 U/ml als besonders
geeignet herausgestellt hat. Die wahlweise zusätzliche Zugabe
des Interleukin-Rezeptors sIL-4R erfolgt in einer Menge von
500-750 U/ml, weiterhin bevorzugt in einer Menge von 550-
700 U/ml, ebenfalls bevorzugt in einer Menge von 500-600 U/ml.
Um einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung
werden GM-CSF, IL-4 und sIL-4R zur Herstellung der dendriti
schen Zellen aus den Rückmarkstammzellen eingesetzt.
Es ist möglich, die Wachstumsfaktoren und den Rezeptor gleich
zu Beginn der Kultivierung der Rückenmarkstammzellen zu
zugeben. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung
werden jedoch die dendritischen Zellen solange kultiviert, bis
der Boden des Zellkulturgefäßes vollständig mit zumindest einer,
bevorzugt mit bis zu mehreren Zellschichten zugewachsen
ist. Zu diesem Zeitpunkt werden dann die Mischung der Wachs
tumsfaktoren sowie wahlweise zusätzlich sIL-4R zugegeben.
Selbstverständlich ist es notwendig, das Wachstum der Zellen
in regelmäßigen Zeitabständen zu kontrollieren und das Medium
zu wechseln. Die hierzu notwendigen Techniken sind seit langem
bekannt und stehen dem Fachmann zur Verfügung.
Nach einigen, im allgemeinen frühestens nach 24 Stunden, kann
durch mikroskopische Kontrolle die Ausdiffenzierung der Rü
ckenmarkstammzellen zu dendritischen Zellen beobachtet werden.
Die ausdifferenzierten dendritischen Zellen, die mobil sind
und im Gegensatz zu den Rückenmarkstammzellen keine feste Ver
bindung zum Boden des Zellkulturgefäßes besitzen, werden dann
abgesammelt und in ein neues Zellkulturgefäß überführt. Das
alte Zellkulturgefäß wird mit neuem Medium gefüllt, so daß
sich der Diffenzierungsprozess fortsetzen kann. Sobald keine
neuen Rückenmarkstammzellen mehr gebildet werden oder eine
Bildung in ausreichender Anzahl nicht mehr erfolgt, wird die
Kultur verworfen. Die ausdifferenzierten dendritischen Zellen
können in dem neuen Zellkulturgefäß für im allgemeinen mindes
tens weitere drei Wochen kultiviert werden und stehen für the
rapeutische Zwecke zur Verfügung. Es ist aber auch möglich,
die erfindungsgemäß hergestellten dedritischen Zellen nicht
direkt in der Therapie einzusetzen, sondern diese zunächst
tiefgefroren zwischenzulagern und erst kurz vor ihrer Anwen
dung mit den weiteren therapeutisch wirksamen Substanzen in
Kontakt zu bringen, also beispielsweise mit den Toxinen, um
sie hiermit zu beladen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen dendriti
schen Zellen weisen eine vorteilhafte Uniformität auf und kön
nen in besonders günstiger Weise mit Fremdstoffen beladen wer
den. Zu diesen Fremdstoffen zählen beispielsweise Zytokine,
Toxine und Zytokin-Rezeptoren.
Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Zytokine sind die
Interferone IFN-Gamma/INF-Gamma und/oder IFN-Alpha/INF-Alpha
und/oder die Interleukine IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10,
IL-14, IL-17 oder eine Kombination hiervon.
Es hat sich weiterhin herausgestellt, daß die erfindungsgemäß
hergestellten Rückenmarkstammzellen bevorzugt mit Zytokin-
Rezeptoren zu beladen sind. Bevorzugt werden Interleukin-
Rezeptoren eingesetzt. Über noch nicht geklärte Mechanismen
regen die Zytokin-Rezeptoren, bevorzugt Interleukine-
Rezeptoren die Bildung der Interleukine an, so daß eine Bela
dung mit diesen Rezeptoren äußerst sinnvoll ist. Beispiele für
Zytokin-Rezeptoren sind die Interleukin-Rezeptoren, bevorzugt
die Interleukin-Rezeptoren sIL-1R, sIL-2R, sIL-3R, sIL-4R,
sIL-6R, sIL-10R, sIL-14R, sIL-17R. Besonders bevorzugt ist ei
ne Beladung der dendritischen Zellen mit den Interleukin-
Rezeptoren sIL-4R und/oder sIL-6R.
Die Beladung der dendritischen Zellen mit beispielsweise Toxi
nen ist an sich bekannt. Unter Beladung ist auch die Aufnahme
von Stoffen in die dendritische Zelle zu verstehen, und nicht
nur die bloße Adhäsion der Substanzen an die Zelle. Eine mög
liche Beladungsform ist die Lipofektion. Diese Technik wurde
ursprünglich zur Transformation von Zellen mit fremder DNA o
der RNA eingesetzt. Eine Steigerung der Effizienz der Beladung
kann dadurch erreicht werden, daß an Liposomen Antikörper,
Proteine, Glykolipide usw. gebunden werden, wobei zielgerich
tet Interaktionen von Liposomen und Zelloberflächen beeinflußt
werden. Hierdurch können die Toxine, bevorzugt Peptidtoxine,
Zytokine oder Zytokin-Rezeptoren als "zelleigen" erkannt wer
den und bei den "normalen" Stoffwechselfunktionen in die
dendritische Zelle eingeschleußt werden. Weitere Verfahren zur
Beladung sind Injektion in die Zelle oder Inkubation der Zelle
in einem die Substanzen enthaltenden Medium. Es sei hier verwiesen
z. B. auf Herder (1995), Lexikon der Biochemie und Mole
kularbiologie, Band 2, Spektrum Akademischer Verlag, Heidel
berg.
Ein weiteres Verfahren zur Beladung ist die Laser-Mikroinjek
tion. Dabei werden dendritische Zellen, die in einem die toxi
schen Substanzen enthaltenden Medium vorliegen, für kurze Zeit
mit einem stark fokussierten Laserstrahl behandelt, so daß ein
Loch in der Zellwand entsteht, durch welches das umgebende Me
dium in die Zellen eindringen kann. Die diesem Verfahren
zugrunde liegende Technik der Mikromanipulation von Zellen
oder Zellenverbänden ist bspw. in Schütze K. et al.; Nature
Biotechnology, 16,8: 737-742 (1998), Schütze K. et al.; J.
Cell. Mol. Biol., 44,5: 735-746 (1998), Böhm M. et al.; Ame
ric. J. Pathology; 151,1: 63-67, Ponten F. et al.. Mutation
Research Genomics, 382: 45-55 (1997), Bernsen M. et al.; Lab.
Invest. 78: 1267-1273 (1998) oder Fink L. et al.; Nat. Medici
ne. 4,11: 1329-1333 (1998) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als
toxische Substanzen solche mit zytotoxischer Wirkung, nekroti
scher Wirkung und/oder apoptotischer Wirkung eingesetzt. Be
sonders bevorzugt werden hierbei Substanzen verwendet, die aus
den Giften von Skolopendern, Schlangen, Skorpionen und Spinnen
stammen. Derartig beladene und durch das erfindungsgemäße Ver
fahren hergestellte dendritische Zellen sind insbesondere zur
Therapie von Hautkrebs, beispielsweise Melanomen, einsetzbar.
Bevorzugt handelt es sich dabei um Peptidtoxine der nachfol
genden Tiere: Skolopenderarten Scolopendra morsitans, S. gi
gantea und Hemiscolopendra sp., der Schlangenarten Bitis arie
tans (Puffotter), Bitis gabonica (Gabunotter), Bitis nasicor
nis (Nashornviper) und der kleineren Bitisarten B. atropos, B.
caudalis, B. peringueyi, und der Speikobraarten Naja melano
leuca und Naja pallida, sowie der araneomorphen Einsiedler
spinnenarten Loxosceles laeta, L. spiniceps, L. bergen, L.
parami, L. rufescens, L. reclusa, L. deserta, den Zitterspin
nenarten Pholcus phalangioides, Pholcus opilionides, Pholcus
spp. (RSA), Pholcus spp. (Kuba), Sicarius albospinosus,
S. hahni, S. oweni, S. testaceus, S. spp (Südamerika) sowie der
Dickschwanzskorpionarten Parabuthus transvalllicus, P. granu
losus, P. villosus. Dabei ist es nicht notwendig, daß die Gif
te in Reinform vorliegen. Es ist auch möglich, die Gifte zu
fraktionieren, beispielsweise durch säulenchromatographische
Verfahren, und die dendritischen Zellen mit den Inhaltsstoffen
derjenigen Fraktionen zu beladen, die eine z. B. zytotoxische
Wirkung aufweisen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbei
spiels näher beschrieben:
Bevorzugt sind die menschlichen Rückenmarkstammzellen tiefge
froren in Eppendorf-Probengefäßen (E-cups) mit einem Fassungs
vermögen mit 1 mL. Dabei handelt es sich bevorzugt um eine ge
sättigte Stammzellenlösung (Kochsalzlösung oder Plasma, maxi
mal 50 Mikroliter).
Zur weiteren Verarbeitung werden bevorzugt 750 Mikroliter Me
dium (37 Grad Celsius), bestehend aus 500 mL DMEM-Ham's F-12,
50 mL RPMI 1260, 10 mL Penicilin/Streptomycin, 5 mL Glutamin
und 50 mL FKS zugegeben.
Die so verdünnte Suspension wird anschließend 10-15 Sekunden
auf niederster Stufe auf dem Vortex ohne Schaumbildung zur ho
mogenen Durchmischung geschüttelt.
Direkt danach wird die Suspension in eine 75 cm2 Zellkultur
flasche eingebracht und mit 20 mL des selben Mediums (37 Grad
Celsius) aufgefüllt.
Leichtes zwei- bis dreimaliges manuelles Schwenken zur optima
len Verteilung der in der Suspension befindlichen Rückenmark
stammzellen in der Zellkulturflasche.
Diese Zellkulturflasche wird in einen auf 37 Grad Celsius ein
gestellten Brutschrank eingebracht.
Bevorzugt ist es die angesetzte Zellkultur fünf Tage bei
gleichbleibender Temperatur (37 Grad Celsius) im Brutschrank
zu belassen.
Damit wird ein Festwachsen der Rückenmarkstammzellen am Fla
schenboden ermöglicht.
Die erste Sichtkontrolle unter dem Invert-Mikroskop, ob die
Rückenmarkstammzellen am Flaschenboden angewachsen sind, ist
bevorzugt fünf Tage nach dem Einbringen der Zellkulturflasche
in den Brutschrank.
Bevorzugt ist es, den ersten Mediumwechsel unter sterilen Be
dingungen fünf Tage nach dem Ansetzen der Zellkultur wie folgt
vorzunehmen:
Die Mediumflasche wird so gehalten, dass möglichst viel des darin enthaltenen Mediums ausgegossen wird, ohne die bereits festgewachsenen Zellen mit auszuschwemmen. Evtl. verbliebenes Restmedium wird durch leichtes Aufklopfen des Flaschenhalses auf einer Unterlage entfernt.
Die Mediumflasche wird so gehalten, dass möglichst viel des darin enthaltenen Mediums ausgegossen wird, ohne die bereits festgewachsenen Zellen mit auszuschwemmen. Evtl. verbliebenes Restmedium wird durch leichtes Aufklopfen des Flaschenhalses auf einer Unterlage entfernt.
Das so gesammelte Medium wird verworfen.
Anschließend werden 20 mL neues Medium in die Zellkulturfla
sche vorsichtig eingebracht, ohne die angewachsenen Zellen
vom Zellkulturflaschenboden zu lösen.
Der so beschriebene Mediumwechsel ist jeweils nach 3 bzw. 4
Tagen vorzunehmen, bis mehrere Zellschichten übereinander ge
wachsen sind und sich die ersten Zellen ins überstehende Medi
um lösen.
Das Wachstum der Zellkultur wird vor jedem Mediumwechsel unter
dem Invert-Mikroskop kontrolliert.
Wenn die Flasche mit mehreren Zellschichten am Zellkulturfla
schenboden bewachsen ist, wird der gesamte Überstand von etwa
20 mL zu gleichen Teilen in 4 kleine 25 cm2 Flaschen subkul
tiviert und im Anschluß daran mit 37 Grad Celsius warmem Medi
um aufgefüllt.
Diese Subkulturen werden fünf Tage im Brutschrank bei 37 Grad
Celsius ohne weitere Aktivitäten stehengelassen.
Ab dem fünften Tag erfolgt jeweils alle drei bzw. vier Tage
der zuvor beschriebene Mediumwechsel mit je 5 mL Medium unter
laufender Mikroskopkontrolle.
Wenn der Zellkulturflaschenboden vollständig mit Zellschichten
bewachsen ist, erfolgt die Zugabe der Wachstumsfaktorenmi
schung in der Menge, dass eine Konzentration von je 900 U/mL
GM-CSF und IL-4 (z. B. von Fa. Biochrom) erreicht wird. Bevor
zugt ist dabei eine Temperatur von 37 Grad Celsius. Die Zugabe
der Wachstumsfaktorenmischung sowie von 700 U/ml sIL-4R er
folgt mittels einer sterilen 2 mL-Pipette.
Die Zellkulturflasche wird leicht manuell geschwenkt ohne die
Zellen vom Boden zu lösen.
Für mindestens 24 Stunden wird die Zellkulturflasche bei 37 Grad
Celsius im Brutschrank gelagert.
Frühestens nach 24 Stunden erfolgt die erste Sichtkontrolle
unter dem Invert-Mikroskop, ob sich schon dendritische Zellen
ausdifferenziert haben, die dann jeweils täglich unter ste
rilsten Bedingungen mittels einer Glas-Pasteur-Pipette mit dem
wenigstmöglichen Medium in eine neue Flasche (25 cm2) mit
schon auf 37 Grad Celsius erwärmten Medium (2 mL) überführt
werden, bis sich in der Ursprungsflasche keine neuen dendriti
schen Zellen mehr bilden.
Der Mediumwechsel für die in der neuen Zellkulturflasche ge
sammelten dendritischen Zellen wird in der Art bevorzugt vor
genommen, dass das alte Medium bis auf 1 mL mit einer Glas-
Pasteur-Pipette unter sterilsten Bedingungen abgesaugt wird,
ohne dendritsche Zellen mitabzusaugen und dann mit 4 mL neuem,
37 Grad Celsius warmen Medium aufgefüllt wird.
Dieser Mediumwechsel wird daran anschließend alle drei bzw.
vier Tage in der beschriebenen Art vorgenommen.
Durch die so gewonnenen dendritischen Zellen mit einer mindes
tens drei Wochen langen Lebensfähigkeit steht eine ausreichen
de Zahl für therapeutische Zwecke zur Verfügung.
3-5 mL einer Kultur dendritischer Zellen (2,5 bis 15 Millionen
dendritische Zellen/5 mL), hergestellt nach dem in dieser Er
findung weiter oben beschriebenem Verfahren, wurden mit 0,5
bis 2,5 mL einer Hautkrebszelllösung (Überstand einer frisch
aufgeklopften reinen menschlichen Hautkrebszellkulturflasche
mit etwa 250.000 Hautkrebszellen/mL Zellmedium. Medium: 500 mL
DMEM-Ham's F-12, 10 mL Penicillin/Streptomycin, 5 mL Glutamin
und 50 mL FBS) versetzt. Anschließend wurden 1 bis 2 mL einer
Lösung, die ca. 150 µg/mL Peptidtoxin der Fraktion 3 aus Lo
xosceles spiniceps enthielten, zugesetzt. Es wurde 24 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde unter der sterilen
Werkbank mit einer vorher autoklavierten Pasteurpipette etwa 4 mL
Mediumüberstand (möglichst ohne dendritische Zellen) abge
nommen und verworfen. Anschließend erfolgte eine weitere Zuga
be von 1 bis 2 mL des Peptidtoxines Lox.Tox. 3 (gleiche Kon
zentration wie bei erster Zugabe), so dass eine Endkonzentra
tion an Peptidtoxin von ca. 100 µg/mL vorlag. Bis zur Verwen
dung der so beladenen dendritischen Zellen werden diese weiter
bei 37°C im Brutschrank inkubiert
Die so hergestellten dendritischen Zellen, insbesondere bela
den mit beispielsweise hautnekrotisch, zytotoxisch und/oder a
poptotisch wirkenden Substanzen, werden in Form einer pharma
zeutischen Zubereitung an den Patienten, bevorzugt an den Pa
tienten, aus dem die Rückenmarkstammzellen gewonnen wurden,
verabreicht. Die Verabreichung der mit Fremdstoffen beladenen
dendritischen Zellen kann in an sich bekannter Weise erfolgen,
beispielsweise durch Injektion oder Infusion. Es ist auch mög
lich, die Zellen in das Tumorgewebe in Form eines Depots zu
implantieren, so daß die mit Wirkstoffen beladenen dendriti
schen Zellen kontinuierlich an das umgebende Tumorgewebe abge
geben werden.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen in
vitro,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Rückenmarkstammzellen in einem Nährmedium in
Anwesenheit der Wachstumsfaktoren GM-CSF und IL-4 und
wahlweise zusätzlich des Interleukin-Rezeptors sIL-4R
wachsen läßt, bis sich dendritische Zellen gebildet haben.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß humane Rückenmarkstammzellen eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zugabe der Wachstumsfaktoren und des Interleukin-
Rezeptors nach vollständigem Bewuchs des Zellkulturgefäßes
mit den Rückmarkstammzellen erfolgt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Wachstumsfaktoren in einer Menge von je 800-1000 U/ml
zugegeben werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Wachstumsfaktoren in einer Menge von je 860-950 U/ml
zugegeben werden.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die sich bildenden dendritischen Zellen aus dem
Zellkulturgefäß in periodischen Zeitintervallen entfernt
werden.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Zellkulturmedium DMEM-Ham's F-12, RPMI 1260,
wahlweise supplementiert mit Antibiotika, Glutamin und
FKS, eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Interleukin-Rezeptor in einer Menge von 500-750 U/ml
zugegeben wird.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß sIL-4R in einer Mengen von 550-700 U/ml zugegeben
wird.
10. Dendritische Zellen, hergestellt aus Rückenmarkstamm
zellen unter Verwendung der Wachstumsfaktorenkombination
GM-CSF und IL-4, wahlweise zusätzlich in Kombination mit
dem Interleukin-Rezeptor sIL-4R.
11. Dendritische Zellen nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie mit Zytokinen und/oder Zytokinrezeptoren und/oder
Toxinen beladen sind.
12. Dendritische Zellen nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Toxine Peptidtoxine mit zytotoxischer, nekrotischer und/oder apoptotischer Wirkung aus dem Gift von Skorpionen der Gattung Parabuthus, Skolopendern der Gattungen Scolopendra, Hemiscolopendra, von Schlangen der Gattung Bitis, Naja und/oder Spinnen der Gattungen Loxosceles, Lycosa, Sicarius und/oder Pholcus
und als Zytokine die Interferone IFN-Gamma/INF-Gamma
und/oder IFN-Alpha/INF-Alpha und/oder die Interleukine IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-14, IL-17 oder eine Kombination hiervon
und als Zytokin-Rezeptoren die Interleukin-Rezeptoren sIL- 1R, sIL-2R, sIL-3R, sIL-4R, sIL-6R, sIL-10R, sIL-14R, sIL- 17R oder eine Kombination hiervon eingesetzt werden.
daß als Toxine Peptidtoxine mit zytotoxischer, nekrotischer und/oder apoptotischer Wirkung aus dem Gift von Skorpionen der Gattung Parabuthus, Skolopendern der Gattungen Scolopendra, Hemiscolopendra, von Schlangen der Gattung Bitis, Naja und/oder Spinnen der Gattungen Loxosceles, Lycosa, Sicarius und/oder Pholcus
und als Zytokine die Interferone IFN-Gamma/INF-Gamma
und/oder IFN-Alpha/INF-Alpha und/oder die Interleukine IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-14, IL-17 oder eine Kombination hiervon
und als Zytokin-Rezeptoren die Interleukin-Rezeptoren sIL- 1R, sIL-2R, sIL-3R, sIL-4R, sIL-6R, sIL-10R, sIL-14R, sIL- 17R oder eine Kombination hiervon eingesetzt werden.
13. Verwendung von dendritischen Zellen nach einem oder
mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung von
Tumoren.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Behandlung von
Hauttumoren.
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