DE102004019323A1

DE102004019323A1 - Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen

Info

Publication number: DE102004019323A1
Application number: DE102004019323A
Authority: DE
Inventors: Dirk Weikmann
Original assignee: Toximed GmbH
Current assignee: PATENTPOOL TRUST GMBH, 80331 MUENCHEN, DE
Priority date: 2004-04-21
Filing date: 2004-04-21
Publication date: 2005-11-10
Also published as: WO2005103231A3; WO2005103231A2; DE112005001476A5

Abstract

Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen durch dendritische Zellen, die in Anwesenheit von Leukin kultiviert wurden und beladen sind mit Toxinen, die aus dem Giftcocktail von Spinnen der Gattung Loxosceles, Scytodiae oder Drymusa gewonnen wurden, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zellen.

Description

Für die zum Erhalt des Lebens dienende Aufnahme von Nahrungsmitteln ist jedes Lebewesen auf das Angebot aus dem erreichbaren Pflanzen- und Tierreich angewiesen. Doch hierbei ist nicht alles ohne Gefahr zum Verzehr geeignet.
Viele Pflanzen und Tiere verwenden zum Schutz ihres eigenen Lebens und zum eigenen Nahrungserwerb, auf ihren speziellen Organismus und seine besonderen Bedürfnisse abgestimmte, so genannte biogene, Gifte. Diese biogenen Gifte haben im Laufe langer Entwicklungszeiträume ihren Platz gefunden im Zusammenspiel der verschiedenen Arten von Leben.
Deshalb erkennt auch heute noch jedes erwachsene Wildtier gefährliche Pflanzen und giftige Tiere seiner natürlichen Umgebung.
Dabei können Pflanzen oder Tiere durch die Produktion von Giftstoffen primär giftig wirken oder erst durch die Aufnahme toxischer Substanzen aus der belebten oder unbelebten Umwelt sekundäre Toxizität erhalten.
Die Nutzung dieser biogenen Gifte begann in der Geschichte der Menschheit schon in der Urzeit als sie zur Erlegung von Beutetieren mit vergifteten Waffen diente.
Zur gefahrlosen Anwendung dieser Gifte waren jedoch von Anfang an gewisse Grundkenntnisse über deren Behandlung und Wirksamkeit erforderlich.
Die weiter durchgeführten Versuche, die Zusammensetzung des chemischen Aufbaus biogener Gifte zu entschlüsseln, führten später zur gezielten Suche bestimmter Wirkstoffe als eigentliche Verursacher beobachteter Wirkungen.
Insbesondere nach der von Paracelsus (1493 – 1541) erhobenen Forderung, die Wirkstoffe von Arzneipflanzen zu isolieren, die zur Entwicklung der latrochemie, also der Chemie hinsichtlich ihres ärztlichen Anwendungsbereichs, beitrug, dürften diese Bemühungen verstärkt haben. Vor allem die Kunst des Destillierens von Stoffen wurde in den Dienst der Forschung gestellt und lieferte eine Vielzahl ätherischer Öle und flüchtiger Stoffe. Aber für die Isolierung anderer Wirkstoffe oder gar für deren chemische Aufschlüsselung waren die damals bekannten Methoden unzureichend. Erst zu Beginn des 19. Jahrhunderts war die Entwicklung der technischen Fertigkeiten in der Chemie weit genug fortgeschritten, die Ära der Isolierung von reinen Wirkstoffen aus biologischem Material einzuleiten.
Zunächst nutzte man, zur Abtrennung der gesuchten Wirkstoffe von den Begleitstoffen, die Unterschiede in der Löslichkeit der untersuchten Substanzen in verschiedenen Lösungsmitteln. Beobachtet wurden hierbei, zum Beispiel mit Fällungsmitten, die Unterschiede im Verteilungsverhalten zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen, in der Flüchtigkeit und in der chemischen Reaktivität, Einen gewaltigen Aufschwung in der Trenntechnik, dem Weg zur Ermittlung von Wirkstoffen zur Bekämpfung von Krankheiten, machte die Entwicklung chromatographischer Verfahren in der Mitte des 20. Jahrhunderts möglich. Ausgehend von der Verteilung zwischen einer mobilen und einer stationären flüssigen Phase, von der Adsorption, den Molekülsiebeffekten, dem Ionenaustausch, der Affinität (insbesondere von Proteinen) zu bestimmten chemischen Verbindungen (z.B. Enzymsubstraten) und der Beweglichkeit geladener Moleküle im elektrischen Feld, wurde eine Vielzahl neuer Trenntechniken entwickelt Derzeit werden Tumore, als die gefährlichsten und gefürchtetsten Krankheiten unserer Zeit auf eine sehr radikale und wenig umweltschonende Weise bekämpft. Als einfache kennzeichnende Schlagworte können hier gelten: Stahl, Strahl und Chemotherapie.
Das bedeutet einmal, dass Tumore, falls einigermaßen erreichbar, im Prinzip mit dem Stahl eines Messers herausgeschnitten, durch eine breit gefächerte Bestrahlung verbrannt, oder über eine so genannte Chemotherapie mit, auch gesunde Zellen angreifenden, aggressiven Zytostatika zerstört werden.
Sowohl bei normalen Behandlungen mit dem Skalpell als auch mit ionisierender Strahlung ist eine räumliche Begrenzung des Operationsgebiets nicht möglich. Es werden zwangsläufig auch gesunde Körperzellen vernichtet. Die unerwünschten Nebenwirkungen der Chemotherapie sind allgemein bekannt.
Im Gegensatz hierzu wurde aber auch versucht eine Krebstherapie die ihren Namen verdient auf subtilere Weise zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde auf den reichen Schatz der Natur zurückgegriffen. Es werden hierzu, unter anderen, viele aus giftigen Lebewesen isolierte, stark wirksame Stoffe in therapeutischen Dosen als Arzneistoffe genutzt
So ist aus der DE 199 61 141 A1 ein pharmazeutischer Wirkstoff bekannt, bei dem gefunden wurde, dass Bestandteile der Spinnengifte von Spinnen der Familie Sicaridae zur Behandlung von Tumorerkrankungen verwendet werden können.
Es werden hierbei in der Hauptsache ein Peptidtoxin aus dem Gift dieser Spinnenart, eine weitere aus dem Gift gewonnene antagonistisch wirkende Substanz und/oder eine Kombination dieser Bestandteile medizinisch genutzt.
Es kann dieser Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie parallel bzw. unterstützend zu Tumoroperationen eingesetzt werden und Rest – Tumorgewebe zerstört werden. Bei der Therapie können genetisch veränderte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da der betreffende Wirkstoff die veränderte Oberflächenstruktur solcher Zellen erkennt und komplikationsfrei abtötet. Der Gesamtgiftgehalt dieser Spinnenart, sozusagen ein Cocktail verschiedener Substanzen, ist auf Grund seiner bereits in geringen Dosen letalen Wirkung, nicht pharmazeutisch einsetzbar.
Aus der DE 100 24 383 A1 ist es bekannt, zur Behandlung von Krebs mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen zu verwenden. Die toxischen Substanzen sind hier ausgewählt aus dem Gift von Skolopendern der Gattungen Scolopendra und Herriscolopendra, Schlangen der Gattungen Bitis und Naja, Spinnen der Gattungen Loxosceles, Sicarius und Pholcus, sowie Skorpionen der Gattung Parabuthus und einer Kombination aus einem oder mehreren dieser Toxine.

Unter dendritischen Zellen versteht man aus Stammzellen ausdifferenzierte, mit Dendriten versehene Zellen des Immunsystems, welche genetisch entartete Zellen aufspüren und zerstören. Die Zerstörung kann beispielsweise über Einpumpen von Immunpeptidtoxinen in die genetisch entartete Zelle mittels der Dendriten nach vorherigem Andocken an diese erfolgen. Dabei übernimmt die dendritische Zelle die Funktion einer Transportzelle. Das Immunpeptidtoxin bewirkt die Lysierung der entarteten Zelle. Bei einem geschwächten Immunsystem reicht die Zahl der im Körper vorhandenen dendritischen Zellen im Zusammenspiel mit dem übrigen Immunsystem nicht mehr aus um entartete Zellen wirksam zu bekämpfen.

Um einen lokal manifesten Tumor zu therapieren kann man in vitro produzierte, patienteneigene dendritische Zellen dem Patienten in den Tumor, bzw. um den Tumor herum, injizieren.

Bevorzugt werden hierzu Stammzellen aus dem Rückenmark verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren geht von menschlichen oder tierischen Stammzellen aus, wobei menschliche Rückenmarkstammzellen bevorzugt sind.

Bevorzugt werden hierbei eigene (autologe) Stammzellen verwendet.

Die Rückenmarkstammzellen werden durch an sich bekannte Verfahren aus dem Rückenmark isoliert. Am häufigsten werden hier Rückenmarkpunktionsverfahren eingesetzt. Das so gewonnene Gewebe kann direkt in Zellkultur genommen werden, wobei jedoch im allgemeinen das entnommene Rückenmark so behandelt wird, dass die Zellen für einen längeren Zeitraum lebensfähig bleiben. Hierzu hat sich eine Schockgefrierbehandlung bestens bewährt. Die derart behandelten Zellen werden dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Entnahme, als auch die Aufbewahrung, erfolgen selbstverständlich unter weitestgehender Sterilität.

Die Rückenmarkstammzellen werden in übliche Zellkulturgefäße in einem zum Wachstum geeigneten Medium eingebracht. Übliche, dem Fachmann bekannte, Medien zur Kultivierung von Rückenmarkstammzellen sind einsetzbar. Besonders bewährt hat sich DMEM -Ham's F12 – Medium in Kombination mit RPMI.

Zur Vermeidung von Kontaminationen werden Antibiotika , bevorzugt Mischungen von Antibiotika, zugegeben. Einsetzbare Antibiotika sind beispielsweise Penicillin und Streptomycin. Als weitere Additive kommen Aminosäuren, beispielsweise Glutamin, und fötales Kälberserum oder Ersatzstoffe hierfür. in Betracht. Die Zellen werden bei einer geeigneten Temperatur im Brutschrank kultiviert, wobei die Körpertemperatur von ca. 37 °C bevorzugt wird.

Dieser bekannte Wirkstoff wirkt jedoch in vivo in keiner Kombination bei speziellen Tumoren wie:
Nierenzellkarzinomen,

Das Nierenzellkarzinom (auch Nierenkarzinom oder Adenokarzinom der Niere genannt) ist eine Erkrankung, bei der Krebszellen in bestimmten Geweben der Niere gefunden werden. Das Nierenkarzinom ist eine der selteneren Krebsarten. Es tritt bei Männern häufiger auf als bei Frauen.

Die Nieren sind zwei gleichartige Organe die jeweils neben dem Rückgrat liegen. Die Nieren eines Erwachsenen sind etwa 13 cm lang und 8 cm breit und haben eine typische bohnenförmige Form. In jeder Niere befinden sich kleine Röhrchen, durch die das Blut gefiltert und von Abfallstoffen gereinigt wird. Diese werden im Urin ausgeschieden. Der in den Nieren produzierte Urin wird über den Harnleiter in die Blase geleitet , die den Urin auffängt und bis zum Wasserlassen im Körper hält. Das Nierenzellkarzinom ist ein Krebs der Zellschicht , die diese Röhrchen (Tubuli) der Niere auskleidet. Ist er Teil der Niere, in dem der Urin gesammelt und in die Harnleiter befördert wird, das sog. Nierenbecken, oder sind die Harnleiter direkt von Krebs befallen, spricht man Urothelkarzinom (Karzinom des Übergangsepithels) des Nierenbeckens und Harnleiters.

Es ist die Aufgabe des erfindungsgemäßen Wirkstoffs eine komplikationsfreie Abtötung von Tumorzellen, speziell bei Nierenzellkarzinomen zu bewirken.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale in den Ansprüchen 1 bis 3, sowie dem Verfahrensanspruch 23.

Es handelt sich hierbei im Wesentlichen um einen pharmazeutischen Wirkstoff der gebildet wird aus dendritischen Zellen die beladen sind mit Toxinen der im Folgenden genannten Tierarten in Verbindung mit Interleukin.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden aus dem Gift der folgenden Tiergattungen gewonnen:

a) Loxosceles spp. (Einsiedlerspinnen)
b) Scytodiae spp (Speispinnen) und
c) den Drymusa – Spinnenarten

Spinnen der Gattung Loxosceles kommen in den wärmeren bis zu den tropischen Gegenden von Nordamerika, Mittelamerika, Südamerika und der Karibik in etwa 50 Arten vor. In Afrika bis in das Mittelmeergebiet und Südeuropa sind ungefähr 20 Arten zu finden.

Die meist in braunen Tönen gefärbten Tiere erreichen eine Körperlänge (ohne Beine) von 8 bis 15 Millimetern. Diese Spinnen sind vor allem in der Nacht aktiv und sind sehr scheu. Ihr Netz ist unregelmäßig aufgebaut. Als Schutzraum suchen sie sich dunkle Stellen unter Steinen, in deren Ritzen, oder auch unter Laub.

Spinnen der Gattung Scytodidae (Speispinnen) besitzen nur sechs Augen. Ihren Namen verdanken sie ihrer Jagdmethode. Ihre Beute fangen diese Spinnen durch ausgeschleuderte Leimfäden und fesseln sie dann mit in Zickzack – Art angebrachten weiteren Leimfäden.

Die Gattung Drymusa ordnet man systematisch, zusammen mit den Gattungen Loxosceles, Scytodiae und Sicarius unter die Sechsaugenspinnen ein.

Wahlweise kann der erfindungsgemäße Wirkstoff eine zu dem jeweiligen Toxin, bzw. Peptidtoxin, antagonistische bzw. synergistische Substanz und/oder Durchdringungssubstanz aus dem Gesamtgift – Cocktail der betreffenden Tierart enthalten.

Die antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz ist bevorzugt eine Phospholipase oder eine Hyaluronidase oder eine Kombination beider Substanzen. Weiterhin ist bevorzugt, dass die antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz eine Mischung aus den, in anderen Arten, vorhandenen Phospholipasen und Hyaluronidasen und/oder Toxinen ist.

Bevorzugt werden das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch und/oder synergistisch wirksame Substanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus den Gesamtgift – Cocktail erhalten, und es ist weiterhin bevorzugt, dass der pharmazeutische Wirkstoff ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen stammen. Dadurch kann der pharmazeutische Wirkstoff in seiner Wirkung vorteilhafterweise auf die zu behandelnde Tumorart und/oder Tumorgröße abgestimmt werden.

Das Peptidtoxin, und die hierzu antagonistisch und/oder synergistisch wirkende Substanz können durch an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen aus dem Gesamtgift – Rohgemisch erhalten werden. Bevorzugt ist, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz durch Gelchromatographie, HPC, Affinitätschromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie erhalten werden.

Bevorzugt ist außerdem, dass das Peptidtoxin in einer solchen Menge als pharmazeutischer Wirkstoff vorliegt, dass eine bezüglich Tumorzellen zerstörende Wirkung des Wirkstoffs erreicht wird.

Weiterhin werden die benötigten Mengenverhältnisse so gewählt, dass der erfindungsgemäße Wirkstoff keine oder nur eine geringe toxische Wirkung im zu behandelnden Patienten entfaltet. Selbstverständlich sind hierbei die Mengen der pharmazeutischen Wirkstoffe auch auf die Art des zu behandelnden Tumors und die physischen , gegebenenfalls auch psychischen, Gegebenheiten des jeweiligen Patienten abzustimmen. Die für eine solche Abstimmung benötigten Vorversuche sind vom Fachmann im Rahmen von Tierversuchen und/oder ethisch vertretbaren Versuchen am Patienten aufgrund seines fachlichen Wissens und Könnens vorzunehmen.

Weiterhin bevorzugt ist ein pharmazeutischer Wirkstoff, bei dem die Menge an Peptidtoxin und der hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanz eine Menge an Peptidtoxin und antagonistisch oder synergistisch wirkender Substanz aufweist, die in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Tumor gewählt wird.

Es ist weiter bevorzugt, dass der erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoff übliche Träger – und Hilfsstoffe enthält, wie Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Parasiten, Zytostatika, Aminosäuren, die Wundheilung begünstigende Enzyme und/oder Mitosehemmstoffe. Bevorzugt sind hierbei Penicillin/Streptomycin, Polymyxin/Gentalmycin (5%), Mitopodozid, Vinca rosea – Alkaloide, Bromelaina oder Bromelains.

In dem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoff werden das Peptidtoxin und die antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz in Kombination miteinander eingesetzt. Es ist aber auch möglich, die Einzelsubstanzen in pharmazeutischen Wirkstoffen zu benutzen und sich hierbei die speziellen Wirkungen der Substanzen für eine therapeutische Anwendung nutzbar zu machen.

Es ist auch möglich die beschriebenen Wirkstoffe chemisch -synthetisch oder durch gentechnologische Methoden in rekombinierter Form herzustellen. Wie bei chemischen Substanzen üblich, umfasst die vorliegende Erfindung auch Derivate und Salze der erfindungsgemäß bereitgestellten Substanzen. Beispielsweise kann das Peptidtoxin ein oder mehrere Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren umfassen, wobei natürlich sichergestellt sein muss, dass die erfindungsgemäße medizinische Wirkung erhalten bleibt.

Die Gewinnung des beschriebenen Wirkstoffs erfolgt durch in der chemischen Verfahrenstechnik übliche Methoden. Hierzu gehören insbesondere Fraktionierungsverfahren; es sind aber auch andere Verfahren einsetzbar, beispielsweise immunologische Verfahren, um die gewünschten Substanzen aus dem Gesamtgift – Cocktail herauszuholen.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Tieren der oben unter a) bis c). genannten Arten stammen, weist folgende Schritte auf:
Gewinnen eines Gift – Rohgemischs durch an sich bekannte Verfahren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanzen in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; wahlweise Kombination verschiedener Fraktionen miteinander oder mit aus anderen Organismen stammenden Giften oder antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen, um einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff zu erhalten

Die betreffenden Gifte enthalten verschiedene Peptidtoxine und verschiedene hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanzen und andere, ebenfalls medizinisch – therapeutisch relevante Wirkstoffe. Alle diese Substanzen können in einem bestimmten, vom Fachmann zu bestimmenden, Verhältnis in einem medizinischen Wirkstoff therapeutisch eingesetzt werden.

Es wird darauf hingewiesen, dass das Fraktionierverfahren lediglich beispielhaft eine Möglichkeit zur Gewinnung der Peptidtoxine und der hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen aufzeigt. Weitere Ausgestaltungen sind möglich.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist überdies bevorzugt, dass das Gift – Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird, und es ist weiterhin bevorzugt, dass die Fraktionen vor der Weiterverarbeitung tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert werden.

Überraschenderweise können Kombinationen von im Tiergift enthaltenen Peptidtoxinen und gegengerichteten (hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden) Enzymen, bzw. Peptidtoxine in Kombination mit Enzymen, in entsprechenden Konzentrationen und Mengenverhältnissen zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie parallel, bzw. unterstützend, zu Tumoroperationen eingesetzt werden und es kann (Rest –) Tumorgewebe zerstört werden.

Hierbei stammt zumindest ein Peptidtoxin oder zumindest eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Tieren der genannten Gattung.

Beispielsweise kann erfindungsgemäß die Zerstörung von, bei der Operation nicht erfasstem, Tumorgewebe sowie die Verhinderung der Lokaltumor – Metastasenbildung im Organismus erreicht werden. Bei der Therapie können zum einen genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da die Oberflächenproteinstruktur solcher Zellen verändert ist und die erfindungsgemäß eingesetzten Phospholipasen diese in ihrer Oberflächenstruktur veränderten Tumorzellen erkennen bzw. selektiv binden, und lysieren können. Zum anderen kann Gewebe in gewünschten, örtlich abgegrenzten Bereichen – hier tumorzellprädestinierte Gewebebereiche – komplikationsfrei abgetötet werden. Die Funktionsweise basiert auf nativen, sich gegenseitig beeinflussenden Wirkweisen der Peptidtoxine und der im Tiergift vorhandenen hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen wie folgt:
Phospholipasen Hyaluronidasen sind auch als so genannte Durchdringungsenzyme beschrieben. Dabei verhält es sich so, dass die genannten Enzyme über verdauende Funktionen Gewebe für den erfindungsgemäßen Wirkstoff durchlässiger machen. Daneben können sie genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) erkennen und diese selbst oder durch Infiltration von nekrotisch bzw. zytotoxisch wirkenden Peptiden, die an sie gekoppelt sind, abtöten. In dieser Erfindung sind unter antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen beispielsweise Phospholipasen und Hyaluronidasen bzw. Peptidtoxine aus Tieren der genannten Gattungen zu verstehen, wobei nicht ausgeschlossen ist, dass weitere antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanzen im Tiergift vorhanden sind, die erfindungsgemäß ebenfalls einsetzbar sind.
Humane Phospholipasen, vor allem Typ A – Phospholipasen wären zwar in einer Eigenblutpräparation als Therapie von Vorläuferkrebszellen (genetisch defekte, aber teilungsfähige Zellen) ebenfalls denkbar. Allerdings ist der Immunstatus so schlecht , dass die Menge dieser Phospholipasen nicht äquivalent zur Menge der genetisch defekten Zellen ist (Bisswanger H. (1994): Enzymkinetik. VCH Weinheim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzym Inhibitors, Part A. 271 . 272 und 383 – 388, VCH Weinheim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzyme Inhibitors, Part B, VCH Weinheim).

Um ungewollte Zellzerstörungen zu verhindern, kann erfindungsgemäß in Abhängigkeit von Art und Größe des zu behandelnden Tumors ein Abgleich bezüglich absoluter und relativer Mengen der Bestandteile erfindungsgemäßen Wirkstoffes in vitro an lebenden menschlichen Zellen (gesund und tumorös) des zu therapierenden Gewebetyps erfolgen. Hierbei kommt der Beachtung der Ausbreitungstendenz die größte Bedeutung zu. Diese kann im Vergleich der Tumorgewebsfestigkeit zu dem, den Tumor umgebenden, Gewebe in Vorversuchen abgeklärt werden.

Die Wirkweise von Gesamt – Gift bzw. einzelner, daraus säulenchromatographisch abgetrennter und über das Molekulargewicht charakterisierte, Substanzen kann durch Austestung dieser in entsprechenden gesunden und tumorösen humanen Zell-Linien erfolgen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die Peptidtoxine bevorzugt aus dem gleichen Organismus wie die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen und/oder wahlweise enthaltenen weiteren Wirksubstanzen. Auf diese Weise kann das effektive, von der Natur entwickelte Zusammenspiel oder Gegenspiel dieser Substanzen ausgenutzt werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe kann so erfolgen , dass zunächst ein Gift – Rohgemisch durch an sich bekannte Verfahren gewonnen wird und eine Fraktionierung des Gift – Rohgemisches durch ebenfalls an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen vorgenommen wird. Dies dient dem Zweck die Peptidtoxine und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen in möglichst voneinander getrennter Form beziehungsweise in getrennten Fraktionen zu erhalten. Anschließend können zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs verschiedene Fraktionen kombiniert werden oder einzelne Fraktionen können mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen kombiniert werden. Zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs können auch einzelne Fraktionen verwendet werden. Bevorzugt können als antagonistisch wirkende Substanzen Hyaluronidasen aus Schlangengiften, beispielsweise aus Kobragiften, eingesetzt werden. Dies kann kombiniert werden mit einer oder mehreren Fraktionen aus Substanzen die gewonnen wurden aus Tieren der unter a) bis c) genannten Arten.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, zur Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe, die Fraktionen auch zusätzlich mit weiteren geeigneten Wirkstoffen und/oder mit in der Pharmazie üblichen Träger- und Hilfsstoffen zu kombinieren.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe können aus dem Tiergift z.B. über säulenchromatographische Aufreinigung spezifische Giftkomponenten (nekrotisch und zytotoxisch wirkende Peptidtoxine) sowie natürliche hierzu antagonistisch wirkende Substanzen (Stoppsubstanzen) vom Phospholipase – und Hyaluronidase Typ selektiert werden.

Derzeit ist es nicht möglich, auf Grund der vielfältigen Arten der Pathogenese von Tumorerkrankungen eine umfassende Präventivtherapie anzubieten. So steht bei lokal diagnostizierten Tumoren (primäre oder nachfolgende) die operative Entfernung an erster Stelle. Ein sich hierbei zeigendes Problem ist die Metastasierung, wenn nicht vollständig entferntes Tumorgewebe beim Durchschneiden in Kontakt mit Luft kommt. Dieses Problem kann durch das Aufbringen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Wirkstoffe auf die Schnittflächen bei einer operativen Tumorentfernung gelöst werden. Da die Operation in den allermeisten Fällen nicht die gewünschten Erfolge bringt, ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe als eine, den Patienten schonende, Therapie anzusehen. In so genannten zulässigen ärztlichen Heilversuchen bei austherapierten Patienten zeigten sich positive Ergebnisse.

Die mit den Wirkstoffen aus den unter a) bis c) genannten Tierarten beladenen dendritischen Zellen sind zur Therapie von Tumorerkrankungen, speziell von Nierenzellkarzinomen, einsetzbar. Die dendritischen Zellen können als alleinige Therapie, aber auch als Begleittherapie, ohne die Gefahr der Nachteile der konventionellen Therapie, eingesetzt werden.

Die Beladung der dendritischen Zellen erfolgt mit einer und/oder mehreren toxischen Substanzen aus dem Gift der unter a) bis c) genannten Tierarten.

Es ist aber auch möglich, eine Kombination von mindestens zwei dieser toxischen Substanzen aus den genannten Giften einzusetzen.

Das Gift der oben genannten Tiere enthält einen ganzen Cocktail von Verbindungen, wozu nicht nur Peptidtoxine gehören, sondern auch Toxine mit einer Amidogruppe, die jedoch keine Proteinstruktur aufweisen und beispielsweise ein Molekulargewicht von 30 bis 55 kDa aufweisen. Weiterhin gehören zum Giftcocktail antagonistisch wirkende Substanzen, die eine räumlich und zeitlich kontrollierte Ausbreitung der vom Tier abgegebenen Gifte sicherstellen. Bei den Toxinen handelt es sich bevorzugt um Peptidtoxine. Die Toxine weisen im allgemeinen nekrotische, cytotoxische und/oder apoptotische Eigenschaften auf. Die Toxine können durch an sich bekannte Verfahren aus dem Giftcocktail der Tiere isoliert werden. Da dies jedoch mühsam ist, hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass nach einer Fraktionierung des Giftcocktails auch einzelne, die Toxine enthaltenden Fraktionen zur Beladung der dendritischen Zellen einsetzbar sind. In diesen Fraktionen liegen die Toxine zusammen mit weiteren Substanzen vor. Da die Fraktionen jedoch so ausgewählt sind, dass sie insbesondere die zelltoxisch, apoptotisch und/oder nekrotisch wirkenden Substanzen enthalten, ist eine Aufreinigung der Toxine bis zur vollständigen Reinheit nicht zwingend notwendig.

Die Toxine können auch synthetisch hergestellt werden, und es sind auch Abwandlungen der in den genannten Tierarten vorhandenen und erfindungsgemäß zur Beladung der dendritischen Zellen eingesetzten Toxine möglich, also Derivate, die durch chemische Modifikationen der Toxine erhalten wurden. Bei den Peptidtoxinen sind unter Derivate u.a. solche Toxine zu verstehen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren hinzugeführt, deletiert und/oder durch andere Aminosäuren ausgetauscht wurden, wobei natürlich jeweils die toxischen Eigenschaften erhalten bleiben. Es sei darauf hingewiesen, dass ein Toxin nicht nur cytotoxische, sondern auch nekrotische und/oder apoptotische Eigenschaften in sich vereinigen kann.

Die mit den toxischen Substanzen beladenen dendritischen Zellen können zur gezielten Therapie von Tumoren eingesetzt werden. Da die dendritischen Zellen aktiv Tumorzellen suchen und finden und diese mit zellzerstörenden Stoffen angreifen, werden die toxischen Substanzen so ausgewählt, dass sie cytotoxische, nekrotische und/oder apoptotische Eigenschaften aufweisen.

Gerade derartige Substanzen liegen in den Giftcocktails der genannten Tiergattungen vor.

Es ist auch möglich die derart beladenen dendritischen Zellen mit weiteren, für die Tumortherapie einsetzbaren Substanzen zu kombinieren.

Als besonders geeignet hat sich hier erfindungsgemäß Interleukin erwiesen.

Die Zellen werden hierbei in Anwesenheit von reinem Interleukin kultiviert Bevorzugt in Betracht kommen hierbei Interleukin 6, Interleukin 12 und Interleukin 14.

Es hat sich erwiesen, dass durch diese Maßnahmen uniforme dendritische Zellen ausgebildet werden, die besonders effizient mit Wirksubstanzen beladen werden können.

Die Wahl des jeweiligen, am besten geeigneten, Interleukins ist von Fall zu Fall verschieden und kann vom Fachmann durch Versuche ermittelt und optimiert werden.

Die Interleukine sind zu den Zytokinen gehörende Substanzen, die als Signalstoffe des Immunsystems wirken. Sie sind als Mediatorsubstanzen verantwortlich für Induktion und Verlauf der T-Zell vermittelten zytotoxischen Immunreaktion sowie der B – Zell- Aktivierung (Antikörperproduktion)

Interleukin 6 (IL 6) wird von aktivierten T – Zellen, Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen gebildet. Es ist ein Glykoprotein mit MG von 21000 D. Seine wesentliche Funktion ist seine Wirkung als „colony stimulating factor (CSF). Es ist ferner ein Wachstumsfaktor für Plasmazellen, Keratinozyten und Mesangiumzellen. Es induziert die Synthese von Akute – Phase – Proteinen.

Interleukin 12 (IL 12) ist ein die natürlichen Killerzellen stimulierender Faktor.

Interleukin 14 (IL 14) wird von T -Zellen und B – Zellen gebildet und bewirkt eine weitere Proliferation von bereits aktivierten B – Zellen.

Claims

Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumoren, insbesondere für Nierenzellkarzinome, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: a) dendritische Zellen, wobei diese beladen sind mit b) Toxinen und/oder wahlweise hierzu synergistisch und/oder antagonistisch wirkenden Stoffen aus dem Giftcocktail von Spinnen der Gattung Loxosceles, und c) wobei die dendritischen Zellen in Anwesenheit von Interleukin kultiviert wurden
Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumoren, insbesondere für Nierenzellkarzinome, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: a) dendritischen Zellen, wobei diese beladen sind mit b) Toxinen und/oder wahlweise hierzu synergistisch und/oder antagonistisch wirkenden Stoffen aus dem Giftcocktail von Spinnen der Gattung Scytodiae, und c) wobei die dendritischen Zellen in Anwesenheit von Interleukin kultiviert wurden.
Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumoren, insbesondere für Nierenzellkarzinome, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: a) dendritische Zellen, wobei diese beladen sind mit b) Toxinen und/oder wahlweise hierzu synergistisch und/oder antagonistisch wirkenden Stoffen aus dem Giftcocktail von Spinnen der Gattung Drymusa, und c) wobei die dendritischen Zellen in Anwesenheit von Interleukin kultiviert wurden
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Interleukin 6 verwendet wird.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Interleukin 12 verwendet wird.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Interleukin 14 verwendet wird.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die dendritischen Zellen menschlichen Ursprungs sind.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Toxine und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus dem jeweiligen Gesamtgift – Cocktail erhalten wurde.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die durch Fraktionierung des Giftcocktails gewonnenen Toxine zusammen mit weiteren, in den einzelnen Fraktionen vorliegenden Substanzen eingesetzt werden, ohne dass eine weitere Aufreinigung erfolgt.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Toxine in Reinform eingesetzt werden.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Toxine in rekombinierter Form vorliegen.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Toxine Peptidtoxine sind.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus dem jeweiligen Gesamtgift – Cocktail erhalten wurde
Pharmazeutischer Wirkstoff nach Anspruch 12 oder 13 dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz durch Gelchromatographie, HPLC, Affinitäts – Chromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie aus dem jeweiligen Gesamtgift – Cocktail erhalten wurde
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz wie folgt erhalten wurde: Durch Verwendung einer Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 50 cm, die unten konisch bis auf 1,5 mm zuläuft und die mit 20 ml eines Gleichchromatographiegels AcA 34, Matrix: 3% Acrylamid 4%Agarose, Fraktionierbereich 20 bis 350 kDa, Ausschlussgrenze 750 kDa, Kügelchendurchmesser 60–140 um gefüllt ist. Hierbei wurde das entsprechende Gift in 0,25M Tris/HCl,pH 6,5 bis 7,3, und 1,92M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser im homogenen Zustand auf das Gel aufgebracht. Wenn die Giftlösung das Gel durchlaufen hat und 165 ml einer Lösung von 0,25 M Tris/HCl,pH 6,5 bis 7,3, und 1,92 M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser aufgebracht wurden und die ersten 15 ml des Durchlaufs verworfen und in je 4 ml Fraktionen gesammelt wurden, befinden sich die Peptidtoxine in den Fraktionen 1,2,4,7,9 und 10 und die antagonistisch wirkenden Substanzen bzw. die synergistisch wirkenden Substanzen und/oder die Durchdringungssubstanzen in den Fraktionen 3,5,6,8,11 und 12.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. eine synergistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen des jeweiligen Gesamtgift – Cocktails stammen.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge so ausgewählt ist, dass eine räumliche und/oder zeitlich kontrollierte Ausbreitung im Gewebe sichergestellt ist.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Peptidtoxin, an antagonistisch wirkender Substanz bzw. synergistisch wirkender Substanz und/oder Durchdringungssubstanz in Abhängigkeit vom zu behandelnden Tumor gewählt ist.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er übliche Träger- und Hilfsstoffe und/oder weitere Wirkstoffe enthält.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er als übliche Träger- und Hilfsstoffe isotone Lösungen, Eiweißlösungen, Aminosäurelösungen und/oder keimtötende Lösungen, bevorzugt Ringerlösung, 0,9% –ige NaCl -Lösung, Human –Albuminlösung und/oder Glutaminlösung enthält, und dass er als weitere Wirkstoffe Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Parasiten, Aminosäuren, die Wundbehandlung begünstigende Enzyme, Mitosehemmstoffe und/oder Zytostatika enthält.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Derivat des Peptidtoxins und/oder der antagonistisch wirkenden Substanz bzw. der synergistisch wirkenden Substanz und/oder der Durchgangssubstanz in dem Wirkstoff enthalten ist und/oder das Peptidtoxin, bzw. die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz chemisch -synthetisch oder durch rekombinante biotechnologische Methoden hergestellt ist und sie in ihrer Wirkung den in dem Gesamtgift – Cocktail der jeweiligen Tiere enthaltenen Wirkstoffe oder den hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen und Derivaten hiervon entsprechen.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für den jeweiligen Anwendungsfall in Vorversuchen die geeignete Art von Interleukin ermittelt wird.
Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs zur Behandlung von Tumoren, insbesondere Nierenzellkarzinome, mit den folgenden Schritten: a) es werden dendritische Zellen in einer pharmazeutisch wirksamen Menge in Anwesenheit von Interleukin kultiviert, b) es werden Toxine und/oder wahlweise hierzu synergistisch und/oder antagonistisch wirkende Substanzen und/oder mindestens eine Durchdringungssubstanz aus dem Giftcocktail von Spinnen der Gattungen Loxosceles, Scytodiae oder Drymusa gewonnen, c) es werden die dendritischen Zellen mit diesen Toxinen und/oder weiteren Substanzen beladen.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen mit denen die dendritischen Zellen beladen werden auf folgende Weise erhalten werden: Gewinnen eines Gesamtgift –Rohgemisches durch an sich bekannte Verfahren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin, bzw. die Enzyme und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz und wahlweise weitere Substanzen in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; Kombination verschiedener Fraktionen des Peptidtoxins bzw. der Enzyme mit Fraktionen, die hierzu antagonistisch wirkende bzw. synergistisch wirkende Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen enthalten, oder mit aus anderen Organismen stammenden antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen, um einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff zu erhalten
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Gesamtgift –Rohgemisch bevorzugt aus jeweils weiblichen Tieren gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Gesamtgift –Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet dass die Fraktion vor der Weiterverarbeitung zu einem pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert wird.