DE10328252A1

DE10328252A1 - Pharmazeutischer Wirkstoff

Info

Publication number: DE10328252A1
Application number: DE10328252A
Authority: DE
Inventors: Dirk Weickmann
Original assignee: Toximed GmbH
Current assignee: Toximed GmbH
Priority date: 2003-06-24
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2005-01-13
Also published as: WO2005002616A1; DE112004001632D2

Abstract

Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie dessen Herstellung aus dem Gift von Spinnen der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 1 und Loxisceles Weickmanni 2.

Description

Für die zum Erhalt des Lebens dienende Aufnahme von Nahrungsmitteln ist jedes Lebewesen auf das Angebot aus dem erreichbarem Pflanzen- und Tierreich angewiesen. Doch hierbei ist nicht alles ohne Gefahr zum Verzehr geeignet. Viele Pflanzen und Tiere verwenden zum Schutz ihres eigenen Lebens und zum eigenen Nahrungserwerb, auf ihren speziellen Organismus und seine besonderen Bedürfnisse abgestimmte, sogenannte biogene, Gifte. Diese biogenen Gifte haben im Laufe langer Entwicklungszeiträume ihren Platz gefunden im Zusammenspiel der verschiedenen Arten von Leben.
Deshalb erkennt auch heute noch jedes erwachsene Wildtier gefährliche Pflanzen und giftige Tiere seiner natürlichen Umgebung.
Dabei können Pflanzen oder Tiere durch die Produktion von Giftstoffen primär giftig wirken oder erst durch die Aufnahme toxischer Substanzen aus der belebten oder unbelebten Umwelt sekundäre Toxizität erhalten.
Die Nutzung dieser biogenen Gifte begann in der Geschichte der Menschheit schon in der Urzeit als sie zur Erlegung von Beutetieren mit vergifteten Waffen diente. Zur gefahrlosen Anwendung dieser Gifte waren jedoch von Anfang an gewisse Grundkenntnisse über deren Behandlung und Wirksamkeit erforderlich. Die weiter durchgeführten Versuche, die Zusammensetzung des chemischen Aufbaus biogener Gifte zu entschlüsseln, führten später zur gezielten Suche bestimmter Wirkstoffe als eigentliche Verursacher beobachteter Wirkungen.
Insbesondere nach der von Paracelsus (1493–1541) erhobenen Forderung, die Wirkstoffe von Arzneipflanzen zu isolieren, die zur Entwicklung der latrochemie, also der Chemie hinsichtlich ihres ärztlichen Anwendungsbereichs, beitrug, dürften diese Bemühungen verstärkt haben. Vor allem die Kunst des Destillierens von Stoffen wurde in den Dienst der Forschung gestellt und lieferte eine Vielzahl ätherischer Öle und flüchtiger Stoffe. Aber für die Isolierung anderer Wirkstoffe oder gar für deren chemische Aufschlüsselung waren die damals bekannten Methoden unzureichend.
Erst zu Beginn des 19. Jahrhunderts war die Entwicklung der technischen Fertigkeiten in der Chemie weit genug fortgeschritten, die Ära der Isolierung von reinen Wirkstoffen aus biologischem Material einzuleiten.
Zunächst nutzte man, zur Abtrennung der gesuchten Wirkstoffe von den Begleitstoffen, die Unterschiede in der Löslichkeit der untersuchten Substanzen in verschiedenen Lösungsmitteln. Beobachtet wurden hierbei, zum Beispiel mit Fällungsmitten, die Unterschiede im Verteilungsverhalten zwischen zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen, in der Flüchtigkeit und in der chemischen Reaktivität.
Einen gewaltigen Aufschwung in der Trenntechnik, dem Weg zur Ermittlung von Wirkstoffen zur Bekämpfung von Krankheiten, machte die Entwicklung chromatographischer Verfahren in der Mitte des 20. Jahrhunderts möglich. Ausgehend von der Verteilung zwischen einer mobilen und einer stationären flüssigen Phase, von der Adsorption, den Molekülsiebeffekten, dem Ionenaustausch, der Affinität (insbesondere von Proteinen) zu bestimmten chemischen Verbindungen (z.B. Enzymsubstraten) und der Beweglichkeit geladener Moleküle im elektrischen Feld, wurde eine Vielzahl neuer Trenntechniken entwickelt
Derzeit werden Tumore, als die gefährlichsten und gefürchtetsten Krankheiten unserer Zeit auf eine sehr radikale und wenig umweltschonende Weise bekämpft. Als einfache kennzeichnende Schlagworte können hier gelten:
Stahl, Strahl und Chemotherapie.
Das bedeutet einmal, dass Tumore, falls einigermaßen erreichbar, im Prinzip mit dem Stahl eines Messers herausgeschnitten, durch eine breitgefächerte Bestrahlung verbrannt, oder über eine sogenannte Chemotherapie mit, auch gesunde Zellen angreifenden, aggressiven Zytostatika zerstört werden.
Sowohl bei normalen Behandlungen mit dem Skalpell als auch mit ionisierender Strahlung ist eine räumliche Begrenzung des Operationsgebiets nicht möglich. Es werden zwangsläufig auch gesunde Körperzellen vernichtet. Die unerwünschten Nebenwirkungen der Chemotherapie sind allgemein bekannt.
Im Gegensatz hierzu wurde aber auch versucht eine Krebstherapie die ihren Namen verdient auf subtilere Weise zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde auf den reichen Schatz der Natur zurückgegriffen.
Es werden hierzu, unter anderen, viele aus giftigen Lebewesen isolierte, stark wirksame Stoffe in therapeutischen Dosen als Arzneistoffe genutzt

So ist aus der DE 199 61 141 A1 ein pharmazeutischer Wirkstoff bekannt, bei dem gefunden wurde, dass Bestandteile der Spinnengifte von Spinnen der Familie Sicaridae zur Behandlung von Tumorerkrankungen verwendet werden können. Es werden hierbei in der Hauptsache ein Peptidtoxin aus dem Gift dieser Spinnenart, eine weitere aus dem Gift gewonnene antagonistisch wirkende Substanz und/oder eine Kombination dieser Bestandteile medizinisch genutzt.

Es kann dieser Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie parallel bzw. unterstützend zu Tumoroperationen eingesetzt werden und Rest-Tumorgewebe zerstört werden. Bei der Therapie können genetisch veränderte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da der betreffende Wirkstoff die veränderte Oberflächenstruktur solcher Zellen erkennt und komplikationsfrei abtötet. Der Gesamtgiftgehalt dieser Spinnenart, sozusagen ein Cocktail verschiedener Substanzen, ist auf Grund seiner bereits in geringen Dosen letalen Wirkung, nicht pharmazeutisch einsetzbar.

Dieser bekannte Wirkstoff wirkt jedoch in vivo in keiner Kombination bei Mamma-Ca, das heißt bei Tumoren im Bereich des Brustgewebes. Insbesondere ist keine Wirkung bei Mamma-Ca in Verbindung mit sogenannten P53- bzw. P26-Defekten bekannt.

Es ist deshalb die Aufgabe des erfindungsgemäßen Wirkstoffes eine komplikationsfreie Abtötung von kanzerösen Körperzellen aus dem Bereich des Brustgewebes insbesondere bei P53- bzw. P26-Defekten zu bewirken.

Diese Aufgabe wird von einem Wirkstoff gelöst der die Merkmale der nebengeordneten Ansprüche 1 bis 4 aufweist. Und nach dem verfahren gemäß Anspruch 17 hergestellt wird.

Dies wird im wesentlichen erreicht durch einen pharmazeutischen Wirkstoff, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz aus dem Gift der Tiergattung Loxosceles stammen

Jedoch handelt es sich hierbei nicht um bekannte Arten, die schon einen allgemein bekannten Namen aufweisen, sondern um zwei Arten die vom Erfinder neu entdeckt wurden.

Die Wahl eines betreffenden Namens obliegt hierbei stets demjenigen der diese neue Art beschreibt.

Da es sich eindeutig um Arten der Gattung Loxosceles handelt werden für die beiden neuen Arten die Namen
Loxosceles Weickmanni 1 und
Loxosceles Weickmanni 2
gewählt.

Dies hat den Vorteil, dass dadurch das von der Natur gegebene Zusammenspiel von Peptidtoxinen und dazu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen eines einzigen Organismus ausgenutzt werden kann.

Ihr Auftreten wurde in Nordafrika, genauer in Marokko, Algerien, Lybien, Tunesien und Ägypten beobachtet. Durch das große Vorkommensgebiet gibt es viele verschiedene Giftzusammensetzungen entsprechend den verschiedenen örtlichen Gegebenheiten und Nahrungsangeboten.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können das Peptidtoxin oder die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz aber auch aus einem anderen Organismus stammen oder synthetisch oder gentechnisch hergestellt worden sein. Beispielsweise kann das Peptidtoxin das Schlangengift Captopril sein oder die antagonistisch wirkende Substanz kann eine Hyaluronidase aus Kobragiften oder synergistisch wirkendes Loxosceles (Weickmanni)-Toxin sein.

Die antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz ist bevorzugt eine Phospholipase oder eine Hyaluronidase oder eine Kombination beider Substanzen.

Weiterhin ist bevorzugt, dass die antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz eine Mischung aus den, im Gift von Spinnen und anderen Arten, vorhandenen Phospholipasen und Hyaluronidasen und/oder Toxinen ist.

Bevorzugt werden das Peatidtoxin und die hierzu antagonistisch und/oder synergistisch wirksame Substanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus den Spinnen- giften erhalten, und es ist weiterhin bevorzugt, dass der pharmazeutische Wirkstoff ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen stammen. Dadurch kann der pharmazeutische Wirkstoff in seiner Wirkung vorteilhafterweise auf die zu behandelnde Tumorart und/oder Tumorgröße abgestimmt werden.

Das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch und/oder synergistisch wirkende Substanz können durch an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen aus dem Spinnengift-Rohgemisch (Giftcocktail) erhalten werden. Bevorzugt ist, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz durch Gelchromatographie, HPC, Affinitätschromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie erhalte werden.

Bevorzugt ist außerdem, dass das Peptidtoxin in einer solchen Menge als pharmazeutischer Wirkstoff vorliegt, dass eine bezüglich Tumorzellen zerstörende Wirkung des Wirkstoffs erreicht wird.

Weiterhin werden die benötigten Mengenverhältnisse so gewählt, dass das Peptidtoxin keine oder nur eine geringe toxische Wirkung im zu behandelnden Patienten entfaltet. Selbstverständlich sind hierbei die Mengen der pharmazeutischen Wirkstoffe auch auf die Art des zu behandelnden Tumors und die physischen , gegebenenfalls auch psychischen, Gegebenheiten des jeweiligen Patienten abzustimmen. Die für eine solche Abstimmung benötigten Vorversuche sind vom Fachmann im Rahmen von Tierversuchen und/oder ethisch vertretbaren versuchen am Patienten aufgrund seines fachlichen Wissens und Könnens vorzunehmen.

Weiterhin bevorzugt ist ein pharmazeutischer Wirkstoff, bei dem die Menge an Peptidtoxin und hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkender Substanz so ausgewählt ist, dass eine räumlich und zeitlich kontrollierte Ausbreitung sichergestellt ist.

Der pharmazeutische Wirkstoff weist bevorzugt eine Menge an Peptidtoxin und antagonistisch oder synergistisch wirkender Substanz auf, die in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Tumor gewählt wird.

Es ist weiter bevorzugt, dass der erfindungsgemäße pharmazeutische Wirkstoff übliche Träger- und Hilfsstoffe enthält, wie Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Parasiten, Zytostatika, Aminosäuren, die Wundheilung begünstigende Enzyme und/oder Mitosehemmstoffe. Bevorzugt sind hierbei Penicillin/Streptomycin, Polymyxin/Gentalmycin (5%), Mitopodozid, Vinca rosea-Alkaloide, Bromelaina oder Bromelains.

In dem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoff werden das Peptidtoxin und die antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz in Kombination miteinander eingesetzt. Es ist aber auch möglich, die Einzelsubstanzen in pharmazeutischen Wirkstoffen zu benutzen und sich hierbei die speziellen Wirkungen der Substanzen für eine therapeutische Anwendung nutzbar zu machen.

Es ist auch möglich die beschriebenen Wirkstoffe chemisch-synthetisch oder durch gentechnologische Methoden in rekombinierter Form herzustellen. Wie bei chemischen Substanzen üblich, umfasst die vorliegende Erfindung auch Derivate und Salze der erfindungsgemäß bereitgestellten Substanzen. Beispielsweise kann das Peptidtoxin ein oder mehrere Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren umfassen, wobei natürlich sichergestellt sein muss, dass die erfindungsgemäße medizinische Wirkung erhalten bleibt.

Die Gewinnung des beschriebenen Wirkstoffs erfolgt durch in der chemischen Verfahrenstechnik übliche Methoden. Hierzu gehören insbesondere Fraktionierungsverfahren; es sind aber auch andere Verfahren einsetzbar, beispielsweise immunologische Verfahren, um die gewünschten Substanzen aus dem Gesamtgift-Cocktail herauszuholen.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Tieren der oben unter a) bis f) genannten Familien und Gattungen stammen, weist folgende Schritte auf:
Gewinnen eines Gift-Rohgemischs durch an sich bekannte Verfahren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; wahlweise
Kombination verschiedener Fraktionen miteinander oder mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen, um einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff zu erhalten.

Die betreffenden Giftarten enthalten verschiedene Peptidtoxine und verschiedene hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanzen und andere, ebenfalls medizinisch-therapeutisch relevante Wirkstoffe. Alle diese Substanzen können in einem bestimmten, vom Fachmann zu bestimmenden, Verhältnis in einem medizinischen Wirkstoff therapeutisch eingesetzt werden.

Es wird darauf hingewiesen, dass das Fraktionierverfahren lediglich beispielhaft eine Möglichkeit zur Gewinnung der Peptidtoxine und der hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen aufzeigt. Weitere Ausgestaltungen sind möglich.

Dabei ist bevorzugt, dass das verwendete Gift-Rohgemisch aus weiblichen Tieren der genannten Gattung gewonnen wird. Dies ist vorteilhaft, da weibliche Exemplare der verwendeten Arten mehr Gift produzieren als männliche Exemplare. Es ist weiterhin bevorzugt, dass Gewinnung des Gift-Rohgemisches durch manuelles Melken erfolgt. Dies hat den Vorteil einer besonders schonenden Gewinnung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist überdies bevorzugt, dass das Gift-Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird, und es ist weiterhin bevorzugt, dass die Fraktionen vor der Weiterverarbeitung tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert werden.

Es gibt derzeit weltweit ca. 35000 Arten von Webspinnen und etwa 1500 Arten von Skorpionen Mit Ausnahme von etwa 300 Arten der Webspinnen sind dies alles aktiv giftige Tiere, die ihr Gift zum Beutefange benötigen. Da Spinnen nur eine sehr kleine Mundöffnung haben, entwickelten sie Enzyme und Gifte, die ihre Beutetiere außerhalb des Körpers verdauen, so dass die Spinnen verflüssigte Nahrung einsaugen. Etwa 50 Spinnenarten und ebenso viele Skorpionarten können durch ihre Gifte auch dem Menschen gefährlich werden. Trotzdem sind vor allem die Gifte dieser Arten nur oberflächlich oder gar nicht erforscht. Die Hauptbestandteile von Spinnen-Skorpiongiften sind:
Verdauungsenzyme
Biogene Amine
Organische Säuren
Peptide
Peptidtoxine

Unter den Peptidtoxinen finden sich folgende Toxingruppen:
Herzgifte
Nervengifte
Blutgifte
Zellgifte
gewebezerstörende Gifte

Ursprünglich findet durch den Gesamtgiftcocktail von allen aktiv giftigen Tieren durch das Zusammenwirken verschiedener Substanzen generell auch eine Vorverdauung und damit eine gezielte Ursprungszellenveränderung tierischer Zellen statt.

Bei den in dieser Erfindung verwendeten Spinnen-, Skorpion-, Tausendfüssler- und Skolpenderarten finden sich im Giftcocktail Substanzen, die zytotoxisch, nekrotisch und/oder apoptotisch wirken (verdauende Wirkung der Gifte). Daneben finden sich auf die lysierend wirkenden Substanzen noch antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Stoppsubstanzen.

Da die Spinne noch verwertbare Nahrung (ganze Proteinstrukturen und intakte Aminosäuren) aufnehmen muss, hat sie im Laufe ihrer 350 Millionen Jahre dauernden Evolution ihren hochwirksamen Giftcocktail entwickelt. Bei diesem Giftcocktail wird durch das Zusammenspiel von Peptidtoxinen mit dagegen antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen die räumliche Ausbreitung des Peptidtoxins, von Zeit- und Konzentrationsfaktoren abhängig, durch spezifisch wirkende Enzyme kontrolliert begrenzt.

Überraschenderweise können jedoch Kombinationen von im Gift enthaltenen Peptidtoxinen und gegengerichteten (hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden) Enzymen bzw. Peptidtoxinen in entsprechenden Konzentrationen und Mengenverhältnissen zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie parallel bzw. unterstützend zu Tumoroperationen eingesetzt werden und (Rest-) Tumorgewebe zerstört werden. Hierbei stammt zumindest ein Peptidtoxin oder zumindest eine hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Tieren der genannten Gattung.

Beispielsweise kann erfindungsgemäß die Zerstörung von bei der Operation nicht erfasstem Tumorgewebe sowie die Verhinderung der Lokaltumor-Metastasenbildung im Organismus erreicht werden. Bei der Therapie können zum einen genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da die Oberflächenproteinstruktur solcher Zellen verändert ist und die erfindungsgemäß eingesetzten Phospholipasen dies in ihrer Oberflächenstruktur veränderten Tumorzellen erkennen bzw. selektiv binden und lysieren können. Zum anderen kann Gewebe in gewünschten, örtlich abgegrenzten Bereichen – hier tumorzellprädestinierte Gewebebereiche – komplikationsfrei abgetötet werden. Die Funktionsweise basiert auf nativen, sich gegenseitig beeinflussenden Wirkweisen der Peptidtoxine und der im Giftcocktail vorhandenen hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen wie folgt:
Phospholipasen Hyaluronidasen sind auch als sogenannte Durchdringungsenzyme beschrieben. Dabei verhält es sich so, dass die genannten Enzyme über verdauende Funktionen Gewebe für die Peptidtoxine durchlässiger machen. Daneben können sie genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) erkennen und diese selbst oder durch Infiltration von nekrotisch bzw. zytotoxisch wirkenden Peptiden, die an sie gekoppelt sind, abtöten. In dieser Erfindung sind unter antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen beispielsweise Phospholipasen und Hyaluranidasen bzw. Peptidtoxinen aus Tieren der genannten Gattungen zu verstehen, wobei nicht ausgeschlossen ist, dass weitere antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanzen in dem Spinnengift vorhanden sind, die erfindungsgemäß ebenfalls einsetzbar sind.
Humane Phospholipasen, vor allem Typ A-Phospholipasen wären zwar in einer Eigenblutpräparation als Therapie von Vorläuferkrebszellen (genetisch defekte, aber teilungsfähige Zellen) ebenfalls denkbar. Allerdings ist der Immunstatus so schlecht , dass die Menge dieser Phospholipasen nicht äguivalent zur Menge der genetisch defekten Zellen ist (Bisswanger H. (1994): Enzymkinetik. VCH Weinheim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzym Inhibitors, Part A. 271 . 272 und 383–388, VCH Weinheim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzyme Inhibitors, Part B, VCH Weinheim).

Die Peptidtoxine mit einem Molekulargewicht von 5–360 kDa besitzen eine gewebezerstörende Wirkung. Auf Grund ihres Molekulargewichts und ihrer räumlichen Struktur haben sie in Geweben nur eine Ausbreitungstendenz von etwa 100 Zellschichten pro Pikogramm. Substanz.

Gegebenfalls können weitere im Spinnen-, Skorpion-, Tausendfüssler- und Skolopender-Rohgemisch enthaltene Substanzen die genannten Wirkungen unterstützen.

Um ungewollte Zellzerstörungen zu verhindern, kann erfindungsgemäß in Abhängigkeit von Art und Größe des zu behandelnden Tumors ein Abgleich bezüglich absoluter und relativer Mengen der Bestandteile des Peptidtoxin Enzymgemisches in vitro an lebenden menschlichen Zellen (gesund und tumorös) des zu therapierenden Gewebetyps erfolgen. Hierbei kommt der Beachtung der Ausbreitungstendenz die größte Bedeutung zu. Diese kann im Vergleich der Tumorgewebsfestigkeit zu dem, den Tumor umgebenden, Gewebe in Vorversuchen abgeklärt werden.

Die Wirkweise von Gesamt-Tiergiftcocktails bzw. einzelner daraus säulenchromatographisch abgetrennter und über das Molekulargewicht charakterisierter Substanzen kann durch Austestung dieser in entsprechenden gesunden und tumorösen humanen Zell-Linien erfolgen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die Peptidtoxine bevorzugt aus dem gleichen Organismus wie die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen und/oder wahlweise enthaltenen weiteren Wirksubstanzen. Auf diese Weise kann das effektive, von der Natur entwickelte Zusammenspiel oder Gegenspiel dieser Substanzen ausgenutzt werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe kann so erfolgen, dass zunächst ein Gift-Rohgemisch durch an sich bekannte Verfahren gewonnen wird und eine Fraktionierung des Gift-Rohgemisches durch ebenfalls an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen vorgenommen wird. Dies dient dem Zweck die Peptidtoxine und die hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen in möglichst voneinander getrennter Form beziehungsweise in getrennten Fraktionen zu erhalten. Anschließend können zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs verschiedene Fraktionen kombiniert werden oder einzelne Fraktionen können mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder hierzu antagonistisch oder synergistisch wirkenden Substanzen kombiniert werden. Zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs können auch einzelne Fraktionen verwendet werden. Bevorzugt können als Peptidtoxine auch Schlangengifte, beispielsweise das Grubenottern-Schlangengift Captopril und als antagonistisch wirkende Substanzen Hyaluronidasen aus Schlangengiften, beispielsweise aus Kobragiften, eingesetzt werden. Dies kann kombiniert werden mit einer oder mehreren Fraktionen aus Substanzen die gewonnen wurden aus Spinnen-Tieren der Gattung Loxosceles.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, zur Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe, die Fraktionen auch zusätzlich mit weiteren geeigneten Wirkstoffen und/oder mit in der Pharmazie üblichen Träger- und Hilfsstoffen zu kombinieren.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe können aus dem Giftcocktail, der über manuelles Melken der oben genannten Spinnenarten gewonnen werden kann, z.B. über säulenchromatographische Aufreinigung spezifische Giftkomponenten (nekrotisch und zytotoxisch wirkende Peptidtoxine) sowie natürliche hierzu antagonistisch wirkende Substanzen (Stoppsubstanzen vom Phospholipase- und Hyaluronidase Typ selektiert werden.

Die Analytik zur Differenzierung der in den Fraktionen enthaltenen Komponenten kann über HPLC-MS-MS erfolgen. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den hochmolekularen Substanzen auf Grund ihres MS-MS-analysierten Grundgerüsts um Enzyme vom Phospholipase- und Hyaluronidase-Typ handelt. Neben diesen Enzymen konnten noch Polypeptide gefunden werden, die auf Grund ihrer Herkunft, ihrer Wirkungsweise und ihrer über die MS-MS-Analyse dargestellten, toxischen Gruppen vom NX-, NHX-, NOX- und SX-Typ, als Peptidtoxine zu klassifizieren sind.

Die erfindungsgemäß für den pharmazeutischen Wirkstoff vewendeten Substanzen können auf natürlichem Weg von Spinnen-Tieren der Gattung Loxosceles gewonnen werden. Diese Gifte wurden ursprünglich zum Beutefang und zur Vorverdauung tierischen Proteins entwickelt. Diese natürliche Wirkweise kann durch eine funktionserhaltende, schonende Gewinnung des Giftgrundstoffes (z.B. durch manuelles Melken) erhalten werden.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Melkweisen von Arthropoden mittels eines elektrischen Verfahrens (Weickmann D. (1991): Haltung und Giftigkeit von Sicariidae. Arachnologischer Anzeiger 16, S. 12–13; Weickmann D., Burda R. (1994): Electrophoresis of scorpion venoms. Electrophoresis Forum 1994, Abstracts, Technische Universität München, Okt. 24–26) , bei dem den Tieren das Gift über einen elektrischen Impuls, der bei den Tieren die Kontraktion der Giftdrüsen auslöst, entzogen wird (die Tiere sind hierbei bevorzugt unterkühlt), wird gemäß der vorliegenden Erfindung der Giftcocktail über ein manuelles Verfahren, bei dem die Tiere über die Ausnutzung ihres natürlichen Abwehrverhaltens zur Abgabe ihres Giftes stimuliert werden, erhalten.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist eine manuelle Melkweise der Spinnen vorgesehen. Dadurch werden echte, unverfälschte native Gifte erhalten, während im Gegensatz dazu, zum Beispiel bei der elektrischen Melkweise, durch Elektronenfluss umstrukturierte Substanzen bzw. Moleküle erhalten werden, die in ihrer Wirkweise geändert sein können, oder auch Substanzen in den Giften vorhanden sein können, die das Tier sonst nicht abgeben würde. Diese Substanzen können, müssen aber nicht zwingend, die Effizienz der im Giftcocktail enthaltenen medizinisch wirksamen Verbindung negativ beeinflussen. Standardmäßig kann eine Analyse und/oder Qualitätskontrolle des Rohgiftgemisches über elektrophoretische Verfahren erfolgen.

1. Herstellung erfindungsgemäßer Wirkstoffe
Zur manuellen Melkung wurden subadulte Weibchen der unter a) bis j) genannten Familien und Gattungen mit den Fingern einer Hand in Rückenlage fixiert und durch Berühren mit der stumpfen Seite einer auf eine sterile Spritze aufgesetzten sterilen Kanüle an den Chelizeren zur Abgabe des Giftes stimuliert. Die Raumtemperatur betrug meist etwa 21 bis 27 Grad, die Luftfeuchtigkeit 50% bis 70%. Die Tageszeit spielte keine Rolle.
Dabei war es bevorzugt, dass die Stimulationszeit nicht länger als 90 Sekunden dauerte, da sonst das betreffende Tier einem unnötigen Stress ausgesetzt würde. Nach Erscheinen des Gifttropfens an den Giftklauen wurde dieser mit der Spritze über die Kanüle aufgezogen. Für jedes Tier wurde eine neue Spritze mit neuer Kanüle verwendet. Anschließend wurde die Kanüle mit der Kanülenschutzhülle wieder verschlossen. Die verschlossene Spritze samt aufgezogenem Gift wurde direkt anschließend in einen Exsikator verbracht. Dieser wurde dann für mindestens 12 Stunden in einer Tiefkühltruhe bei mindestens 14 Grad Celsius aufbewahrt. Die Skolopender und Skorpione wurden gemolken wie im Melanom-Patent (Clit. Patente „raum & zeit) beschrieben. Bei der Spritze mit dem gefrorenen Gesamtgift wurde nach Entnahme aus der Tiefkühltruhe die Kanülenschutzhülle entfernt. Die Kanüle wurde in lösungsmittel, z.B. Proteinlösungsmittel (Lösungsmittel für Protein-Säulenchromatographie: 0,25 M Tris/HCL, pH 6,5 bis 7,3, 1,92 M Glycin, in destilliertem, deionisiertem Wasser) eingetaucht und 1 ml aufgezogen. Wegen Denaturierung wird kein SDS im Puffer verwendet. Dadurch wurde Gift in Lösung erhalten. Im Anschluss wurde die Kanüle entfernt. Die so aufbereiteten einzelnen Giftlösungen in Spritzen (5 Stück) wurden durch Ausrücken (Ausspritzen) in einem sterilen, sauberen Teflonvial bei Raumtemperatur gesammelt. Das verschlossene Teflonvial wurde anschließend auf einem Vortex ohne Schaumbildung 30 Sekunden lang geschüttelt, wobei eine homogene Lösung erhalten wurde.
Nach der Durchmischung wurde die gesamte Lösung über einen Plexiglastrichter (um Kontamination zu vermeiden) in eine stehende transparente Plexiglassäule, die einen Innendurchmesser von 1,5 cm, eine Wandstärke von 2 mm und eine Höhe von 50 cm aufwies und unten konisch bis auf 1,5 mm zulaufend, offen war, gefüllt mit 20 mL Gel eingebracht. (Einzelheiten: Aca 34; Matrix 3% Acrylamid 4% Agarose; Fraktionierungsbereich (MW): Proteine : 20 bis 350 kDa; Ausschlussgrenze: 750 kDa; Kügelchendurchmesser: 60–140 Mikrometer). Die so eingebrachte Giftlösung durchlief das Gel und verdrängte dabei den im Gel befindlichen Puffer.
Nach vollständigem Eindringen der Giftlösung in das gel wurden zusätzliche 165 mL Lösungsmittel (0,25 M Tris/HCL, pH 6,5 bis 7,3, 1,92 M Glycin) auf die Säule gebracht. Dieses zusätzliche Lösungsmittel verdrängt bei seinem Durchlauf durch das Gel die darin befindliche Giftlösung. Die ersten 15 ml, die unten aus der Säule liefen, waren Restpuffer und wurden verworfen. Nach diesen 15 ml wurden 40 Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die Trennung in jeweils 4 ml war bedingt durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der einzelnen Fraktionen, nachgewiesen durch Elektrophorese, bevorzugt SDS-PAGE. Als Auftragspuffer zum Peptidbindungs- und Proteinschutz wurde Rot Load 1 + 2 (Carl Roth GmbH & Co KG , Karlsruhe: SDS-, Glycerol-, Bromphenolblau, Phosphatpuffer, Roi Load 1 mit Mercaptoethanol, Roti Load 2 ohne Mercaptoethanol) verwendet. Die einzelnen Fraktionen wurden in steril sauberen verschraubbaren 5 ml Teflonvials getrennt aufgefangen. Die Qualitätskontrolle der Einzelfraktionen erfolgte mittels Elektrophorese.
Um die Struktur der Substanzen aufzuklären, wurden die eizelnen Fraktionen über eine HPLC-MS-MS sowie über eine DAD-UV/-Spektrometrie (DAD bzw. DADI: direct Analysis of Daughter Ions, direkte Analyse von Tochterionen) untersucht. Bekannte Substanzen konnten in höherem Molekulargewichtsbereich (ab 10.000 Da) nicht dargestellt werden. Allerdings deuten die Grundgerüstbestimmungen auf die Zugehörigkeit der Substanzen zum Polypeptidtyp mit toxischen Komponenten (= Polypeptidtoxinen) und andererseits zum Phospholipase- und Hyaluronidase-Typ hin.
Fraktionen mit gleicher Zusammensetzung können zusammen gesammelt werden. Für die weitere Verarbeitung und Lagerung wurden die einzelnen Fraktionen gefriergetrocknet bspw. Mit folgenden Parametern:
Die zu lyophilisierende Fraktion wurde in einem offenen, mit perforierter Aluminiumfolie locker bedeckten, Teflonvial auf minus 22 Grad Celsius gekühlt. Zur sicheren Durchfrierung der Probe wurde eine Kühlzeit von 11 Stunden eingehalten. Dann wurde ein Vakuum von 0,200 mbar angelegt. Nach Erreichen des Vakuums wurde die Fraktion auf plus 4 Grad Celsius erwärmt und mindestens 24 Stunden unter Aufrechterhaltung des Vakuums auf dieser Temperatur gehalten. Nach dem Gefriertrocknungsvorgang wurde das Teflonvial mit der lyophilisierten Fraktion luftdicht verschraubt. Die Lagerzeit beträgt bei Raumtemperatur ca. 6 Monate, bei plus 7 Grad Celsius ca. 1 Jahr und bei minus 14 Grad Celsius ca. 15 Jahre.
2. Tumorzellen-zerstörende Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe
Derzeit ist es nicht möglich, auf Grund der vielfältigen Arten der Pathogenese von Tumorerkrankungen eine umfassende Präventivtherapie anzubieten. So steht bei lokal diagnostizierten Tumoren (primäre oder nachfolgende) die operative Entfernung an erster Stelle. Ein sich hierbei zeigendes Problem ist die Metastasierung, wenn nicht vollständig entferntes Tumorgewebe beim Durchschneiden in Kontakt mit Luft kommt. Dieses Problem kann durch das Aufbringen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Wirkstoffe auf die Schnittflächen bei einer operativen Tumorentfernung gelöst werden. Da die Operation in den allermeisten Fällen nicht die gewünschten Erfolge bringt, ist die Anwendug der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Wirkstoffe als eine, den Patienten schonende, Therapie anzusehen. In sogenannten zulässigen ärztlichen Heilversuchen bei austherapierten Patienten zeigten sich positive Ergebnisse. Zu Beginn der Versuchsreihen wurde der gemolkene frische, bzw. gelöste, Gesamtgiftcocktail und dessen Wirkung in Abhängigkeit von der Konzentration auf unterschiedliche Zell-Linien ausgetestet. Dabei konnten keine befriedigenden Ergebnis erreicht werden, da das Gift immer die gesamten Zellkulturen abtötete, wobei die für das Abtöten benötigte Zeit mit zunehmender Konzentration des eingesetzten Gifts abnahm.
Bei langwierigen und eingehenden Versuchen wurde überraschend ermittelt, dass bestimmte Toxine im erfindungsgemäßen Wirkstoff besondere lysierende Wirkungen aufweisen und zwar entsprechend ihren Molekulargewichten.
Es handelt sich hierbei um die Molekulargewichte mit den Werten:
27 und 31 (die betreffende Einheit ist jeweils gemessen in kDa, endsprechend Kilo-Dalton)

Claims

Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Mamma-Ca mit P53- und/oder P26 Defekten, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: a) zumindest ein Peptidtoxin, sowie b) zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest das Peptidtoxin und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus dem Gift von Spinnen der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 1 stammen, und wobei c) das Molekulargewicht des Peptidtoxins 27 kDa beträgt
Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Mamma-Ca mit P53- und/oder P26 Defekten, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: d) zumindest ein Peptidtoxin, sowie e) zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest das Peptidtoxin und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus dem Gift von Spinnen der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 2 stammen, und wobei f) das Molekulargewicht des Peptidtoxins 27 kDa beträgt
Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Mamma-Ca mit P53- und/oder P26 Defekten, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: g) zumindest ein Peptidtoxin, sowie h) zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest das Peptidtoxin und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus dem Gift von Spinnen der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 1 stammen, und wobei i) das Molekulargewicht des Peptidtoxins 31 kDa beträgt
Pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Mamma-Ca mit P53- und/oder P26 Defekten, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge: j) zumindest ein Peptidtoxin, sowie k) zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. synergistisch wirkende Substanz, wobei zumindest das Peptidtoxin und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus dem Gift von Spinnen der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 2 stammen, und wobei l) das Molekulargewicht des Peptidtoxins 31 kDa beträgt
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere weitere Substanzen aus dem Gift der jeweils anderen Familie Loxosceles Weickmanni 1 oder Loxosceles Weickmanni 2 enthalten sind.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die antagonistisch wirkende Substanz bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus einem anderen Organismus stammen als aus Loxosceles Weickmanni 1 bzw. Loxosceles Weickmanni 2.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die antagonistisch wirkende Substanz bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz eine Phospholipase oder eine Hyaluronidase oder eine Kombination beider Substanzen ist.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus dem jeweiligen Gift erhalten wurde.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz durch Gelchromatographie, HPLC, Affinitäts chromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie aus dem jeweiligen Gift erhalten wurde.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptidtoxin und die antagonistisch wirkende Substanz, bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz wie folgt erhalten wurde: Durch Verwendung einer Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 50 cm, die unten konisch bis auf 1,5 mm zuläuft und die mit 20 ml eines Gleichchromatographiegels AcA 34, Matrix: 3% Acrylamid 4% Agarose, Fraktionierbereich 20 bis 350 kDa, Ausschlussgrenze 750 kDa, Kügelchendurchmesser 60–140 um gefüllt ist. Hierbei wurde das entsprechende Gift in 0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, und 1,92 M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser im homogenen Zustand auf das Gel aufgebracht. Wenn die Giftlösung das Gel durchlaufen hat und 165 ml einer Lösung von 0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, und 1,92 M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser aufgebracht wurden und die ersten 15 ml des Durchlaufs verworfen und in je 4 ml Fraktionen gesammelt wurden, befinden sich die Peptidtoxine in den Fraktionen 1, 2, 4, 7, 9 und 10 und die antagonistisch wirkenden Substanzen bzw. die synergistisch wirkenden Substanzen und/oder die Durchdringungssubstanzen in den Fraktionen 3, 5, 6, 8, 11 und 12.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz, bzw. eine synergistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen des jeweiligen Giftes stammen.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge so ausgewählt ist, dass eine räumliche und/oder zeitlich kontrollierte Ausbreitung im Gewebe sichergestellt ist.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehende Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Peptidtoxin und antagonistisch wirkender Substanz bzw. synergistisch wirkender Substanz und/oder Durchdringungssubstanz in Abhängigkeit vom zu behandelnden Tumor gewählt ist.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er übliche Träger- und Hilfsstoffe und/oder weitere Wirkstoffe enthält.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er als übliche Träger- und Hilfsstoffe isotone Lösungen, Eiweißlösungen, Aminosäurelösungen und/oder keimtötende Lösungen, bevorzugt Ringerlösung, 0,9%-ige NaCl-Lösung, Human-Albuminlösung und/oder Glutaminlösung enthält, und dass er als weitere Wirkstoffe Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Parasiten, Aminosäuren, die Wundbehandlung begünstigende Enzyme, Mitosehemmstoffe und/oder Zytostatika enthält.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach einem der vorhergehende Ansprüche. dadurch gekennzeichnet, dass ein Derivat des Peptidtoxins und/oder der antagonistisch wirkenden Substanz bzw. der synergistisch wirkenden Substanz und/oder der Durchgangssubstanz in dem Wirkstoff enthalten ist und/oder das Peptidtoxin und/oder die hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz chemisch-synthetisch oder durch rekombinante biotechnologische Methoden hergestellt ist und sie in ihrer Wirkung dem im Gift der jeweiligen Tiere enthaltenen Toxine oder den hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen und Derivaten hiervon entsprechen.
Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Wirkstoffs, enthaltend in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zumindest ein Peptidtoxin sowie zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende, bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder zumindest eine Durchdringungssubstanz, wobei das Peptidtoxin aus dem Gift von Tieren stammt und wahlweise die hierzu antagonistisch wirkende Substanz bzw. die synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz aus dem Gift von Tieren stammt, mit den folgenden Schritten: Gewinnen eines Tiergift-Rohgemisches durch an sich bekannte Verfahren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin und wahlweise die hierzu antagonistisch bzw. synergistisch wirkende Substanz und/oder die Durchdringungssubstanz und wahlweise weitere Substanzen in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; Kombination verschiedener Fraktionen des Peptidtoxins mit Fraktionen, die hierzu antagonistisch wirkende bzw. synergistisch wirkende Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen enthalten, oder mit aus anderen Organismen stammenden antagonistisch bzw. synergistisch wirkenden Substanzen und/oder Durchdringungssubstanzen, um einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Gift-Rohgemisch aus Tieren gewonnen wird, die aus der Familie Loxoscelidae, Gattung Loxosceles Weickmanni 1 bzw. 2, stammen.
Verfahren nach Anspruch 18; dadurch gekennzeichnet, dass das Gift-Rohgemisch aus jeweils weiblichen Tieren gewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Gift-Rohgemisch durch manuelles Melken gewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Gift-Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion vor der Weiterverarbeitung zu einem pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23 dadurch gekennzeichnet, dass der pharmazeutische Wirkstoff zur Behandlung von Tumorerkrankungen dient und/oder zur unterstützenden Behandlung bei Tumoroperationen verwendet wird.