DE19961141A1

DE19961141A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung aus Spinnengiften sowie deren Herstellung und Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE19961141A1
Application number: DE19961141A
Authority: DE
Inventors: Dirk Weickmann
Original assignee: MACK GERD R
Current assignee: MACK GERD R
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2001-07-26
Also published as: US20030175261A1; WO2001043754A2; AU2366501A; DE50008032D1; WO2001043754A3; ES2230177T3; US6998389B2; EP1244462A2; ATE277625T1; JP2003517017A; EP1244462B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt pharmazeutische wirksame Substanzen aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae sowie ihre Verwendung in der Medizin.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt, sowie die Herstellung und Verwendung der pharma zeutischen Zusammensetzungen.

Stand der Technik

Bei lokal manifestierten Tumoren ist die möglichst vollständige operative Entfernung des Tumors die derzeit gängigste Therapieform. Der Tumor wird im Vorfeld der Opera tion über bildlich darstellende Verfahren lokalisiert und über einen öffnenden Eingriff manuell herausgeschnitten. Dabei ist der Kontakt der Operationsfläche mit Luft nicht zu verhindern. Aus der Literatur (Stegner H.-E. (1986): Histopathologie der Mammatumo ren. Enke Verlag, Stuttgart; Garbe C., Dummer R., Kaufmann R. und Tielgen W. (1997):
Dermatologische Onkologie. Springer Verlag, Berlin (siehe auch Errata)) ist bekannt, dass durch den Luftkontakt mit einer 93%-igen Metastasierungsrate des Primärtumor gewebes zu rechnen ist.

Weitere Therapieformen zur Tumorbehandlung sind die Chemotherapie, die Be strahlung, Antikörpertherapie, Behandlung mit Zytokinen, Hyperthermie oder die Sauer stofftherapie.

Bei der Chemotherapie von Tumoren werden üblicherweise Zellgifte eingesetzt, um im ganzen Körper verbreitete Tumoren und nach chirurgischer Behandlung lokaler Tumo ren verbliebene Tumorzellen zu behandeln (Römpp, Chemielexikon, 9. Auflage, Band 1, 1989, S. 680). Substanzen, die in der Chemotherapie verwendet werden, sind bei spielsweise alkylierende Substanzen, Antimetabolite, Alkaloide, Antibiotika und Hor mone (Römpp Lexikon, Biotechnologie und Gentechnik, 2. Auflage, 1999, S. 153). Als alkylierende Verbindungen sind beispielweise Cisplatin, Nitrosoharnstoffverbindungen oder Thiotepa bekannt. Weiterhin werden Folsäureantagonisten, z. B. Aminopterin, Py rimidinanaloga, wie Fluorouracile eingesetzt. Als Antibiotika mit hemmender Wirkung auf die DNA-abhängige RNA-Polymerase seien Bleomycin, Doxorubicin oder Mitomycin C genannt. Auch Enzyme, z. B. L-Asparaginase, werden in der Chemotherapie einge setzt.

Nachteile der Chemotherapie sind, daß die Chemotherapeutika nur schwer gezielt ein zusetzen sind und, daß diese Zytostatika äußerst agressive Zellgifte sind, die neben Tumorgewebe auch im großen Maße gesundes Gewebe, einschließlich Leber- und Nie renzellen schädigen. Die auftretenden Nebenwirkungen, wie z. B. Haarausfall, Schwin del, Erbrechen, Magen-Darmblutungen, Kreislaufbeschwerden u. a. sind wegen der systemischen Ausbreitung der Zytostatika nur schwer abzuwägen (Deutsches Krebsfor schungszentrum DKFZ Heidelberg - Focus 19/1995). Diese zahlreichen, gefährlichen und unerwünschten Nebenwirkungen erklären sich vor allem aus der Regenerations hemmung schnell proliferierender Gewebe und betreffen insbesonders das blutbildende System, die Epithelien der Schleimhäute und der Gonaden sowie die Haut und Hautan hangsgebilde. Unter den lebensbedrohlichen Komplikationen stehen Infektionen an erster Stelle gefolgt von Blutungen (Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch 256. Auflage 1990, Seite 1866).

Die Bestrahlung erfolgt mit ionisierender Strahlung, üblicherweise verwendet man E lektronen-, Gamma-, Neutronen- oder Röntgenstrahlen (Zetkin/Schaldach: Lexikon der Medizin, 16. Auflage 1999, Seite 1922/1923 Ullstein Medical). Nachteil der Bestrahlung ist, dass ähnlich wie bei der Chemotherapie eine räumliche Begrenzung nicht möglich ist. Durch die Strahlungshärte werden auch gesunde Zellen nachhaltig geschädigt, vor allem die DNA. Da Krebszellen sich meist schneller als gesunde Zellen teilen, werden die Krebszellen unter normalen Umständen bei der Strahlentherapie als erstes abge tötet. Allerdings besteht dabei die Gefahr eines Strahlenulkus (Pschyrembel - Klini sches Wörterbuch 256, Auflage 1990, Seite 1602).

Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, verbesserte Mittel und Verfahren bereitzu stellen, die für die Tumortherapie und/oder als Begleittherapie, z. B. bei der chirurgisch en/operativen Behandlung von Tumorerkrankungen, eingesetzt werden können und die genannten Nachteile des Stands der Technik nicht aufweisen.

Dies wird erfindungsgemäß durch eine pharmazeutische Zusammensetzung erreicht, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt.

Überdies können vorteilhafterweise weitere Substanzen aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammenset zungen enthalten sein.

Unter den Spinnen der Familie der Sicariidae sind die Gattungen Sicarius, Loxosceles, Scytodes und Drymusa bevorzugt.

Bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, bei denen das Peptidtoxin und/oder die antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Sicarius-, Loxosceles-, Scytodes- und Drymusa-Spinnenarten stammen.

Bevorzugt sind weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen, bei denen das Pep tidtoxin und/oder die antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift der Sicarius-Spin nenarten Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius hahni und Sicarius albospinosus, der Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles reclusa, Loxosceles rufipes und Loxosceles laeta, und/oder der Scytodes-Spinnenarten Scytodes thoracica, Scytodes rufa und Scytodes longipes stammen. Dies hat den Vorteil, daß dadurch das von der Natur ge gebene Zusammenspiel von Peptidtoxinen und dazu antagonistisch wirkenden Sub stanzen eines einzigen Organismus ausgenutzt werden kann.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können das Peptidtoxin oder die hierzu antago nistisch wirkende Substanz aber auch aus einem anderen Organismus stammen oder synthetisch oder gentechnisch hergestellt worden sein. Beispielsweise kann das Pep tidtoxin das Schlangengift Captopril sein oder die antagonistisch wirkende Substanz kann eine Hyaluronidase aus Cobragiften sein.

Die antagonistisch wirkende Substanz ist bevorzugt eine Phospholipase oder eine Hy aluronidase oder eine Kombination beider Substanzen. Weiterhin ist bevorzugt, daß die antagonistisch wirkende Substanz eine Mischung aus im Gift von Spinnen der in dieser Erfindung genannten Arten vorhandenen Phospholipasen und Hyaluronidasen ist.

Bevorzugt werden das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirksame Substanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus dem Spinnengift erhalten, und es ist weiterhin bevorzugt, daß die pharmazeutische Zusammensetzung ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen stammen. Dadurch kann die pharmazeutische Zusammensetzung in ihrer Wirkung vor teilhafterweise auf die zu behandelnde Tumorart und/oder -größe abgestimmt werden.

Das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz können durch an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen aus dem Spin nengift-Rohgemisch (Spinnengiftcocktail) erhalten werden. Bevorzugt ist, daß das Pep tidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz durch Gelchromatographie, HPLC, Affinitätschromatographie und/oder Ionenaustauschchromatographie erhalten werden.

Bevorzugt ist außerdem, daß das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer solchen Menge in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorlie gen, daß eine bezüglich Tumorzellen selektive Wirkung des Peptidtoxins und der hier zu antagonistisch wirkenden Substanz vorliegt. Das Verhältnis des Peptidtoxins und der hierzu antagonistisch wirkenden Substanz wird bevorzugt so gewählt, das eine in zeitli cher und/oder räumlicher Richtung im zu behandelnden Gewebe kontrollierte Ausbrei tung sichergestellt ist. Weiterhin wird die Menge so gewählt, das das Peptidtoxin keine oder nur eine geringe toxische Nebenwirkung im zu behandelnden Patienten ausübt. Die Mengen sind selbstverständlich auch auf den zu behandelnden Tumor und auf den zu behandelnden Patienten abzustimmen. Die geeignete Menge der einzelnen Sub stanzen und ihr Verhältnis zueinander sind vom Fachmann im Rahmen von Tierversu chen und/oder ethisch vertretbaren Versuchen am Patienten festzulegen.

Weiterhin bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, bei der die Menge an Peptidtoxin und hierzu antagonistisch wirkender Substanz so ausgewählt ist, daß eine räumlich und zeitlich kontrollierte Ausbreitung sichergestellt ist.

Die pharmazeutische Zusammensetzung weist bevorzugt eine Menge an Peptidtoxin und antagonistisch wirkender Substanz auf, die in Abhängigkeit von dem zu behan delnden Tumor gewählt ist.

Es ist weiterhin bevorzugt, daß die pharmazeutische Zusammensetzung übliche Trä ger- und Hilfsstoffe enthält. Bevorzugt ist, daß die pharmazeutische Zusammensetzung weitere Wirkstoffe wie Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Para siten, Zytostatika, Aminosäuren, die Wundheilung begünstigende Enzyme und/oder Mitosehemmstoffe enthält. Bevorzugt sind dabei Penicillin/Streptomycin, Polymy xin/Gentamycin, Glutamin (5%), Mitopodozid, Vinca roselkaloide, Bromelaina oder Bromelains.

In der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung werden das Peptidtoxin und die antagonistisch wirkende Substanz in Kombination miteinander eingesetzt. Es ist aber auch möglich, die Einzelsubstanzen in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu benutzen und sich hierbei die speziellen Wirkungen der Substanzen für eine therapeu tische Anwendung nutzbar zu machen.

Das in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung enthaltende Peptidtoxin und/oder die hierzu antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae kann durch an sich bekannte Isolationsverfahren gewonnen wer den. Ein bevorzugtes Beispiel hierfür ist ein Fraktionierverfahren. Die so gewonnenen und durch Aufreinigungsverfahren in reiner Form erhaltenen Substanzen können dann einer medizinisch-therapeutischen Anwendung zugeführt werden. Ein bevorzugtes Verfahren wird nachfolgend näher beschrieben.

Es ist aber auch möglich, das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Sub stanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae chemisch-synthetisch oder durch gentechnologische Methoden in rekombinanter Form herzustellen. Wie bei che mischen Substanzen üblich umfaßt die vorliegende Erfindung auch Derivate und Salze der erfindungsgemäß bereitgestellten Substanzen. Beispielsweise kann das Peptidtoxin ein oder mehrere Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen von Aminosäuren umfassen, wobei sichergestellt sein muß, daß die erfindungsgemäße medizinische Wir kung beibehalten bleibt.

Die Gewinnung des Peptidtoxins und der hierzu antagonistisch wirkenden Substanz erfolgt durch in der chemischen Verfahrenstechnik übliche Methoden. Hierzu gehören insbesondere Fraktionierverfahren; es sind aber auch andere Verfahren einsetzbar, beispielsweise immunologische Verfahren, um die gewünschten Substanzen aus dem Gesamtgift-Cocktail "herauszufischen".

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeuti schen Zusammensetzung, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt, und der Peptidtoxine und antagonistisch wirkenden Substanzen weist folgende Schritte auf:

- Gewinnen eines Spinnengift-Rohgemischs durch an sich bekannte Verfah ren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; wahlweise
- Kombination verschiedener Fraktionen miteinander oder mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder antagonistisch wirkenden Substanzen, um eine pharmazeutisch wirksame Zusammensetzung zu er halten.

Das Spinnengift enthält verschiedene Peptidtoxine und verschiedene hierzu antagonis tisch wirkende Substanzen und andere, ebenfalls medizinisch-therapeutisch relevante Wirkstoffe. Alle diese Substanzen können in einem bestimmten, vom Fachmann zu be stimmenden Verhältnis in einer pharmazeutischen Zubereitung therapeutisch einge setzt werden. Die in den Ausführungsbeispielen gezeigten Versuche betreffen insbe sondere die Fraktionen 1 bis 12, wobei auch die nachfolgenden Fraktionen des hier speziell beschriebenen Fraktionierverfahrens therapeutisch wirksame Substanzen ent halten. Es wird darauf hingewiesen, daß das Fraktionierverfahren lediglich beispielhaft eine Möglichkeit zur Gewinnung der Peptidtoxine und der hierzu antagonistisch wirken den Substanzen aufzeigt. Weitere Ausgestaltungen sind möglich.

Dabei ist bevorzugt, daß das Spinnengift-Rohgemisch aus weiblichen Spinnen der Fa milie der Sicariidae gewonnen wird. Dies ist vorteilhaft, da weibliche Spinnen der Fami lie der Sicariidae mehr Gift produzieren als männliche Spezies.

Es ist weiterhin bevorzugt, daß das Spinnengift-Rohgemisch durch manuelles Melken erhalten wird. Dies hat den Vorteil einer besonders schonenden Gewinnung des Spin nengift-Rohgemischs.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist überdies bevorzugt, daß das Spinnengift- Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird, und es ist weiterhin bevorzugt, daß die Fraktionen vor der Weiterverarbeitung tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophili siert werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen eignen sich zur Ver wendung in der Medizin.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können erfindungsgemäß bevorzugt zur Behandlung von Tumorerkrankungen verwendet werden, wobei eine unterstützende Behandlung bei Tumoroperationen weiterhin bevorzugt ist.

Bevorzugt ist weiterhin die Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlug von Tumorerkrankungen und weiterhin die Verwendung einer antagonistisch wirkenden Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae in einer pharmazeuti schen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorerkrankungen.

Außerdem sind die Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift von Spinnen der Fa milie der Sicariidae, einer antagonistisch wirkenden Substanz aus dem Gift von Spin nen der Familie der Sicariidae und/oder eine Kombination eines Peptidtoxins und einer antagonistisch wirkenden Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicarii dae in der Medizin erfindungsgemäß vorgesehen.

Beschreibung

Es gibt derzeit weltweit ca. 35000 Arten von Webspinnen. Mit Ausnahme von etwa 300 Arten sind dies alles aktiv giftige Tiere, die ihr Gift zum Beutefang benötigen. Da Spin nen nur eine sehr kleine Mundöffnung haben, entwickelten sie Enzyme und Gifte, die ihre Beutetiere außerhalb des Körpers verdauen, so daß die Spinnen verflüssigte Nah rung einsaugen. Etwa 50 Spinnenarten können durch ihre Gifte auch dem Menschen gefährlich werden. Trotzdem sind vor allem die Gifte dieser Arten nur oberflächlich o der gar nicht erforscht. Die Hauptbestandteile von Spinnengiften sind:

- Verdauungsenzyme
- Biogene Amine
- Organische Säuren
- Peptide
- Peptidtoxine.

Unter den Peptidtoxinen finden sich folgende Toxingruppen:

- Herzgifte
- Nervengifte
- Blutgifte
- Zellgifte
- Gewebezerstörende Gifte.

Ursprünglich findet durch den Gesamtgiftcocktail von allen aktiv giftigen Tieren durch das Zusammenwirken verschiedener Substanzen generell auch eine Vorverdauung und damit eine gezielte Ursprungszellenveränderung tierischer Zellen statt.

Bei den in dieser Erfindung verwendeten Spinnenarten finden sich im Giftcocktail Sub stanzen, die zytotoxisch, nekrotisch und apoptotisch wirken (verdauende Wirkung der Gifte). Daneben finden sich auf die lysierend wirkenden Substanzen noch antagonis tisch wirkende Stoppsubstanzen.

Da die Spinne noch verwertbare Nahrung (ganze Proteinstrukturen und intakte Amino säuren) aufnehmen muss, hat sie im Laufe ihrer 350 Millionen Jahre dauernden Evolu tion ihren hochwirksamen Giftcocktail entwickelt. Bei diesem Giftcocktail wird durch das Zusammenspiel von Peptidtoxinen mit dagegen antagonistisch wirkenden Substan zen die räumliche Ausbreitung des Peptidtoxins, von Zeit- und Konzentrationsfaktoren abhängig, durch spezifisch wirkende Enzyme kontrolliert begrenzt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Bestandteile der Spinnengifte von Spinnen der Familie der Sicariidae zur Behandlung von Tumorerkrankungen verwendet werden können.

Der Gesamtgiftcocktail ist auf Grund seiner in bereits geringen Dosen letalen Wirkung, welche auf die Synergismen und Antagonismen verschiedener in diesem Gemisch ent haltenen Substanzen zurückzuführen ist, nicht pharmazeutisch einsetzbar. Als Ab wehrgift von den Spinnen abgegeben, erleidet der Gebissene folgende Symptomatik:
Der Biss wird von über 90 Prozent der Gebissenen nicht wahrgenommen. Nach ca. 90 Minuten findet man um die Bissstelle eine stark nässende, schon durch die Haut maze rierende Lokalnekrose von ca. 3 cm Durchmesser. Nach etwa 2 Stunden bricht örtlich die Bisswunde auf und erste systemische Wirkungen sind feststellbar, wie Kreislaufver sagen und/oder Herzarhythmen. Nach weiteren 2-3 Stunden beginnen die lysierenden Substanzen zu wirken. Der Gebissene verspürt starken Harndrang, wobei der Urin schon blutig ist. Schmerzen breiten sich im gesamten Bauchraum aus durch die or gano-nekrotische Wirkung des Giftes. Die Leber schafft es nicht, Gift in den von der Spinne abgegebenen Konzentrationen und Kombinationen zu metabolisieren. Hat die Spinne beim Biss sehr viel Gift injiziert, schafft der Körper den Abbau nicht mehr und der Patient verstirbt an Nierenversagen in Folge von akuter Blutvergiftung.

Überraschenderweise können jedoch Kombinationen von im Spinnengift enthaltenen Peptidtoxinen und gegengerichteten (hierzu antagonistisch wirkenden) Enzymen in ent sprechenden Konzentrationen und Mengenverhältnissen, wobei zumindest ein Peptid toxin oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt, zur Behandlung von Tumorerkrankungen sowie parallel bzw. unterstützend zu Tumoroperationen eingesetzt werden und (Rest-)- Tumorgewebe zerstört werden. Beispielsweise kann erfindungsgemäß die Zerstörung von bei der Operation nicht erfassten Tumorgewebe sowie die Verhinderung der Lo kaltumor-Metastasenbildung im Organismus erreicht werden. Bei der Therapie können zum einen genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) zerstört werden, da die Ober flächenproteinstruktur solcher Zellen verändert ist und die erfindungsgemäß einge setzten Phospholipasen diese in ihrer Oberflächenstruktur veränderten Tumorzellen erkennen bzw. selektiv binden und lysieren können. Zum anderen kann Gewebe in ge wünschten, örtlich abgegrenzten Bereichen - hier tumorzellprädestinierte Gewe- bebereiche - komplikationsfrei abgetötet werden. Die Funktionsweise basiert auf nati ven, sich gegenseitig beeinflussenden Wirkweisen der Peptidtoxine und der im Gift cocktail vorhandenen hierzu antagonistisch wirkenden Substanzen wie folgt:

- Phospholipasen und Hyaluronidasen sind auch als sogenannte Durchdrin gungsenzyme beschrieben. Dabei verhält es sich so, dass die genannten En zyme über verdauende Funktionen Gewebe für die Peptidtoxine durchlässiger machen. Daneben können sie genetisch defekte Körperzellen (Tumorzellen) er kennen und diese selbst oder durch Infiltration von nekrotisch bzw. zytotoxisch wirkenden Peptiden, die an sie gekoppelt sind, abtöten. In dieser Erfindung sind unter antagonistisch wirkenden Substanzen beispielsweise Phospholipasen und Hyaluronidasen aus Spinnen der Familie der Sicariidae zu verstehen, wobei nicht ausgeschlossen ist, daß weitere antagonistisch wirkende Substanzen in dem Spinnengift vorhanden sind, die erfindungsgemäß ebenfalls einsetzbar sind.
- Humane Phospholipasen, vor allem Typ A-Phospholipasen wären zwar in einer Eigenblutpräparation als Therapie von Vorläuferkrebszellen (genetisch defekte, aber teilungsfähige Zellen) ebenfalls denkbar. Allerdings ist der Immunstatus so schlecht, dass die Menge dieser Phospholipasen nicht äquivalent zur Menge der genetisch defekten Zellen ist (Bisswanger H. (1994): Enzymkinetik. VCH Wein heim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzym Inhibitors, Part A. 271-272 und 383-388, VCH Weinheim; Zollner H. (1993): Handbook of Enzyme Inhibitors, Part B. VCH Weinheim).
- Die Peptidtoxine mit einem Molekulargewicht von ca. 100 kDa besitzen eine ge webezerstörende Wirkung. Auf Grund ihres hohen Molekulargewichtes und ihrer räumlichen Struktur haben sie in Geweben nur eine Ausbreitungstendenz von etwa 100 Zellschichten pro Pikogramm Substanz.

Gegebenenfalls können weitere im Spinnengift-Rohgemisch enthaltene Substanzen die genannten Wirkungen unterstützen.

Um ungewollte Zellzerstörungen zu verhindern, kann erfindungsgemäß in Abhängigkeit von Art und Größe des zu behandelnden Tumors ein Abgleich bezüglich absoluter und relativer Mengen der Bestandteile des Peptidtoxin/Enzymgemisches in vitro an le benden menschlichen Zellen (gesund und tumorös) des zu therapierenden Gewebetyps erfolgen. Hierbei kommt der Beachtung der Ausbreitungstendenz die größte Bedeutung zu. Diese kann im Vergleich der Tumorgewebsfestigkeit zu dem Tumor umgebenden Gewebe in Vorversuchen abgeklärt werden (s. auch Beispiel 2).

Die Wirkweise von Gesamttiergiftcocktails bzw. einzelner daraus säulenchromatogra phisch abgetrennter und über das Molekulargewicht charakterisierter Substanzen kann durch Austestung dieser in entsprechenden gesunden und tumorösen humanen Zelli nien erfolgen.

Erfindungsgemäß stammt zumindest eine der in den pharmazeutischen Zusammenset zungen enthaltenen Substanzen aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae.

Bevorzugt sind die Gattungen Sicarius, Loxosceles, Scytodes und/oder Drymusa. Im Bereich der Gattung Sicarius können die Sicarius-Spinnenarten Sicarius oweni, Sicari us testaceus, Sicarius hahni und Sicarius albospinosus besonders bevorzugt verwendet werden. Unter den Spinnen der Gattung der Loxosceles sind erfindungsgemäß die Ar ten Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa und/oder Loxosceles laeta einsetzbar. Unter den Spinnen der Gattung der Scytodes sind erfindungsgemäß die Arten Scytodes thoracica, Scytodes rufa und/oder Scytodes longipes einsetzbar.

Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die Peptidtoxine bevorzugt aus dem glei chen Organismus wie die hierzu antagonistisch wirkenden Substanzen und/oder wahl weise enthaltenen weiteren Wirksubstanzen. Auf diese Weise kann das effektive, von der Natur entwickelte Zusammenspiel dieser Substanzen ausgenutzt werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann so erfolgen, daß zunächst ein Spinnengift-Rohgemisch durch an sich bekannte Verfah ren aus den Spinnen gewonnen wird, und eine Fraktionierung des Spinnengift-Rohge mischs durch ebenfalls an sich bekannte Fraktionierungsverfahren zur Auftrennung von Proteinen vorgenommen wird, um die Peptidtoxine und die hierzu antagonistisch wir kenden Substanzen in möglichst voneinander getrennter Form beziehungsweise in ge trennten Fraktionen zu erhalten. Anschließend können zur Herstellung einer pharma zeutischen Zusammensetzung verschiedene Fraktionen kombiniert werden oder ein zelne Fraktionen können mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder hierzu antagonistisch wirkenden Substanzen kombiniert werden. Zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung können auch einzelne Fraktionen verwendet werden. Bevorzugt können als Peptidtoxine auch Schlangengifte, beispielsweise das Grubenottern-Schlangengift Captopril, und als antagonistisch wirkende Substanzen Hyaluronidasen aus Schlangengiften, beispielsweise aus Cobragiften, eingesetzt wer den, jeweils kombiniert mit ein oder mehreren Fraktionen des Sicarius- Spinnengiftcocktails.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, zur Herstellung pharmazeutischer Zusammen setzungen, die Fraktionen auch zusätzlich mit weiteren geeigneten Wirkstoffen und/oder mit in der Pharmazie übliche Träger- und Hilfsstoffen zu kombinieren.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kön nen aus dem Giftcocktail, der über manuelles Melken der oben genannten Spinnenar ten gewonnen werden kann, z. B. über säulenchromatographische Aufreinigung spezifi sche Giftkomponenten (nekrotisch und zytotoxisch wirkende Peptidtoxine) sowie natür liche hierzu antagonistisch wirkende Substanzen (Stoppsubstanzen) vom Phospholipa se- und Hyaluronidase Typ selektiert werden.

Die Analytik zur Differenzierung der in den Fraktionen enthaltenen Komponenten kann über HPLC-MS-MS (z. B. mit einem Gerät der Firma Perkin-Elmer) erfolgen. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den hochmolekularen Substanzen auf Grund ihres MS-MS-analysierten Grundgerüstes um Enzyme vom Phopholipase-und Hyaluronidase-Typ handelt. Neben diesen Enzymen konnten noch Polypeptide gefun den werden, die auf Grund ihrer Herkunft, ihrer Wirkungsweise und ihrer über die MS- MS-Analyse dargestellten, toxischen Gruppen vom NX-, NHX-, NOX- und SX-Typ, als Peptidtoxine zu klassifizieren sind.

Die erfindungsgemäß für die pharmazeutische Zusammensetzung verwendeten Sub stanzen können auf natürlichem Wege von Webspinnen der Gattung Sicarius produ zierte Gifte, die ursprünglich zum Beutefang und zur Vorverdauung tierischen Proteins entwickelt wurden, enthalten. Diese natürliche Wirkweise kann durch eine funktionser haltende, schonende Gewinnung des Giftgrundstoffes (z. B. durch manuelles Melken) erhalten werden.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Melkweisen von Arthropoden mittels eines elektri schen Verfahrens (Weickmann D. (1991): Haltung und Giftigkeit von Sicariidae. Arach nologischer Anzeiger 16 : 12-13; Weickmann D, Burda R. (1994): Electrophoresis of scorpion venoms. Electrophoresis Forum 1994, Abstracts, Technische Universität Mün chen, Okt. 24-26), bei dem den Tieren das Gift über einen elektrischen Impuls, der bei den Tieren die Kontraktion der Giftdrüsen auslöst, entzogen wird (die Tiere sind hierbei bevorzugt unterkühlt), wird gemäß der vorliegenden Erfindung der Giftcocktail über ein manuelles Verfahren, bei dem die Tiere über die Ausnutzung ihres natürlichen Abwehr verhaltens zur Abgabe ihres Giftes stimuliert werden, erhalten.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist eine manuelle Melkweise der Spinnen vorgesehen. Dadurch werden echte, unverfälschte native Gifte erhalten, während im Gegensatz dazu zum Beispiel bei der elektrischen Melkweise durch Elektronenfluss umstrukturierte Substanzen bzw. Moleküle erhalten werden, die in ihrer Wirkweise ge ändert sein können, oder auch Substanzen in den Giften vorhanden sein können, die das Tier sonst nicht abgeben würde. Diese Substanzen können, müssen aber nicht zwingend, die Effizienz der im Giftcocktail enthaltenen medizinisch wirksamen Verbin dungen negativ beeinflussen. Standardmäßig kann eine Analyse und/oder Qualitäts kontrolle des Rohgiftgemischs über elektrophoretische Verfahren erfolgen.

Die folgenden Beispiele zeigen vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung, sollen den Schutzumfang der Erfindung jedoch nicht beschränken.

In den Beispielen und der Beschreibung wird auf die folgenden Figuren Bezug genom men:

Fig. 1 zeigt eine SDS-PAGE-Elektrophorese (5 cm Sammelgel, 15 cm Trenngel, Mole kulargewichtsbereich von 10 bis 200 kDa) von Gesamtgiftcocktails aus Sicarius testa ceus und Sicarius sp. Argentinien. Spuren 1 bis 3 sind Molekulargewichtsstandards, Spuren 4 und 5 sind Gesamtgiftcocktails aus Sicarius testaceus und Spur 6 ist ein Ge samtgiftcocktail von Sicarious sp. Argentinien.

Fig. 2 zeigt die Wirkung eines Sicarius-Gesamtgiftcocktails auf eine Mischkultur von gesunden Hautzellen mit Melanomzellen.

Fig. 3 zeigt eine mikroskopische Aufnahme zur Wirkung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Sic. Tox. 3 + Sic. Enz. 1) auf in einer Brustgewebezellkultur befindli che Mamma-Carcinom-Zellen, 48 Stunden nach Injektion.

Fig. 4 zeigt den gleich Ausschnitt wie Fig. 3, jedoch 72 Stunden nach Injektion der Substanzkombination (Sic. Tox. 3 + Sic. Enz. 1).

Fig. 5 zeigt die selektive Wirkung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung (Sic. Tox. 2 + Sic. Enz. 4) auf in einer Hautzellkultur befindliche Melanomzellen.

Fig. 6 zeigt den gleichen Ausschnitt wie Fig. 5, jedoch 3 Stunden nach Injektion.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen

Zur manuellen Melkung wurden subadulte bzw. adulte Weibchen der Sicarius-Spinnen arten Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius hahni oder Sicarius albospinosus mit den Fingern einer Hand in Rückenlage fixiert, dabei mit einer in der anderen Hand be findlichen sterilen Spritze (2 ml Brauninject v. Fa. B. Braun) mit aufgesetzter steriler Kanüle (20 oder 21 v. Becton Dickinson), die Tageszeit spielte keine Rolle, bei einer Raumtemperatur von 21 bis 27 Grad Celsius, bei einer Luftfeuchtigkeit von 50 bis 70%, an den Chelizeren durch Berühren mit der stumpfen Seite der Kanüle zur Abgabe des Giftes stimuliert.

Dabei war es bevorzugt, daß die Stimulationszeit nicht länger als 90 Sekunden dauerte, da ansonsten das Tier einem unnötigen Stress ausgesetzt würde. Nach Erscheinen des Gifttropfens an den Giftklauen, wurde dieser mit der Spritze über die Kanüle aufgezo gen. Für jedes Tier wurde eine neue Spritze mit neuer Kanüle verwendet. Anschließend wurde die Kanüle mit der Kanülenschutzhülle wieder verschlossen. Die verschlossene Spritze samt aufgezogenem Gift wurde direkt anschließend in einen Exsikator ver bracht. Dieser wurde dann für mindestens 12 Stunden in einer Tiefkühltruhe bei min destens minus 14 Grad Celsius aufbewahrt.

Der Spritze mit dem gefrorenen Gesamtgift wurde nach Entnahme aus der Tiefkühltruhe die Kanülenschutzhülle entfernt. Die Kanüle wurde in Lösungsmittel z. B. Proteinlösungsmittel von Fa. Carl Roth Gmbh & Co, KG (Lösungsmittel für Protein- Säulenchromatographie: 0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, 1,92 M Glycin, in destilliertem, deionisiertem Wasser/wegen Denaturierung wird kein SDS im Puffer verwendet) ein getaucht und 1 mL aufgezogen. Dadurch wurde Gift in Lösung erhalten. Im Anschluß wurde die Kanüle entfernt. Die so aufbereiteten einzelnen Giftlösungen in Spritzen (5 Stück) wurden durch Ausdrücken (Ausspritzen) in einem sterilen, sauberen Teflonvial bei Raumtemperatur gesammelt. Das verschlossene Teflonvial wurde anschließend auf einem Vortex ohne Schaumbildung 30 Sekunden lang geschüttelt, wobei eine homoge ne Lösung erhalten wurde.

Nach der Durchmischung wurde die gesamte Lösung über einen Plexiglastrichter (um Kontamination zu vermeiden) in eine stehende transparente Plexiglassäule, die einen Innendurchmesser von 1,5 cm, eine Wandstärke von 2 mm und einer Höhe von 50 cm aufwies und unten konisch bis auf 1,5 mm zulaufend, offen war, gefüllt mit 20 mL Gel (Fa. Sigma/Supelco, AcA 34; Matrix: 3% Acrylamid/ 4% Agarose; Fraktionierungsbe reich (MW): Proteine: 20 bis 350 kDa; Ausschlußgrenze: 750 kDa; Kügelchendurch messer: 60-140 Micrometer), eingebracht. Die so eingebrachte Giftlösung durchlief das Gel und verdrängte dabei den im Gel befindlichen Puffer.

Nach vollständigem Eindringen der Giftlösung in das Gel, wurden zusätzliche 165 mL Lösungsmittel (0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, 1,92 M Glycin) auf die Säule gebracht. Dieses zusätzliche Lösungsmittel verdrängt bei ihrem Durchlauf durch das Gel die darin befindliche Giftlösung. Die ersten 15 mL, die unten aus der Säule liefen, waren Rest puffer und wurden verworfen. Nach diesen 15 mL wurden 40 Fraktionen zu je 4 mL auf gefangen. Die Trennung in jeweils 4 mL war bedingt durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der einzelnen Fraktionen, nachgewiesen durch Elektropho rese, bevorzugt SDS-PAGE. Als Auftragspuffer zum Peptidbindungs- und Proteinschutz wurden Roti Load 1 +2 (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe: SDS-, Glycerol-, Brom phenolblau-, Phosphatpuffer, Roti Load 1 mit Mercaptoethanol, Roti Load 2 ohne Mer captoethanol) verwendet. Die einzelnen Fraktionen wurden in steril sauberen verschraubbaren 5 mL Teflonvials getrennt aufgefangen. Die Qualitätskontrolle der Einzelfraktionen erfolgte mittels Elektrophorese.

Für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen wurden verschie dene Kombinationen der Fraktionen 1 bis 12 verwendet. Diese Fraktionen enthielten Spinnengift-Proteinbestandteile in einem Molekulargewichtsbereich von ca. 75 bis 175 kDa.

Eine SDS-PAGE-Elektrophorese des Gesamtgiftcocktails von Sicarius testaceus ist in Fig. 1 gezeigt.

Um die Struktur der Substanzen aufzuklären, wurden die einzelnen Fraktionen über eine HPLC-MS-MS sowie über eine DAD-UV-Spektrometrie (DAD bzw. DADI: Direct Analysis of Daughter Ions, direkte Analyse von Tochterionen) untersucht. Bekannte Substanzen konnten in höherem Molekulargewichtsbereich (ab 10.000 Da) nicht darge stellt werden. Allerdings deuten die Grundgerüstbestimmungen auf die Zugehörigkeit der Substanzen zum Polypeptidtyp mit toxischen Komponenten (= Polypeptidtoxinen), und andererseits zum Phospholipase- und Hyaluronidase-Typ, hin.

Fraktionen mit gleicher Zusammensetzung können zusammen gesammelt werden. Für die weitere Verarbeitung und Lagerung wurden die einzelnen Fraktionen gefrierge trocknet, bspw. mit folgenden Parametern:
Die zu lyophilisierende Fraktion wurde in einem offenen, mit perforierter Aluminiumfolie locker bedeckten Teflonvial auf minus 22 Grad Celsius gekühlt. Zur sicheren Durchfrie rung der Probe wurde eine Kühlzeit von 11 Stunden eingehalten. Dann wurde ein Va kuum von 0,200 mbar angelegt. Nach Erreichen des Vakuums wurde die Fraktion auf plus 4 Grad Celsius erwärmt und mindestens 24 Stunden unter Aufrechterhaltung des Vakuums auf dieser Temperatur gehalten. Nach dem Gefriertrocknungsvorgang wurde das Teflonvial mit der lyophiliserten Fraktion luftdicht verschraubt. Die Lagerzeit beträgt bei Raumtemperatur ca. 3 Monate, bei plus 7 Grad Celsius ca. 1 Jahr und bei minus 14 Grad Celsius ca. 5 Jahre.

Substanzinhalt, -wirkung und Molekulargewicht der Fraktionen können der folgenden Tabelle entnommen werden.

Tabelle 1

Bei Anwendung der in diesem Beispiel angegebenen Reinigungsparameter waren die ses Elutionsprofil und die Zusammensetzungen der Fraktionen weitgehend reprodu zierbar.

Die Fraktionen 13-40 besitzen ein Molekulargewicht bis ca. 350 KDa. Je höher mole kular diese Giftbestandteile sind, desto schwieriger sind sie für weitere Untersuchungen in Lösung zu bringen. Erste Versuche haben jedoch gezeigt, dass die Gesamtrestfrak tion (13-40) zum Beispiel menschliche Knochenhautzellen lysieren kann. Weiterhin kann bei der Austestung des Restgiftcocktails an verschiedenen humanen Zellinien der Abbau von Kollagenen beobachtet werden. Ferner gelang über die Wirkung der Nach weis, dass darin Insektotoxine zu finden sind. Der lösliche Teil dieser Fraktionen wirkt auf Drosophila-, Schistocerca- und Locusta-Zellinien zerstörend. Es ist nicht davon auszugehen, daß ein oder mehrere der Fraktionen 13 bis 40 Substanzen aufweisen, die für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können.

Beispiel 2 Tumorzell-zerstörende Wirkung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen

Derzeit ist es nicht möglich, auf Grund der vielfältigen Arten der Pathogenese von Tumorerkrankungen eine umfassende Präventivtherapie anzubieten. So steht bei lokal diagnostizierten Tumoren (primäre oder nachfolgende) die operative Entfernung an erster Stelle. Ein sich hierbei zeigendes Problem ist die Metastasierung, wenn nicht vollständig entferntes Tumorgewebe beim Durchschneiden in Kontakt mit Luft kommt. Dieses Problem kann durch das Aufbringen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zu sammensetzungen auf die Schnittflächen bei einer operativen Tumorentfernung gelöst werden.

Für die im folgenden beschriebenen Versuchsreihen wurden die nachstehenden Tu morzellinien verwendet:
Mamma-Ca- Mischzellenkultur: Dieser Zelltyp wurde aus einem Tumorzellengemisch von 11 Patientinnen herauskultiviert und seit 1989 in Langzeit- und Subkulturen beob achtet.

Lungen-Ca: 2 Zellinien (1 männlicher und 1 weiblicher Patient) vom Labor KKH Weißenburg identifiziert und seit 1987 ebenfalls als Langzeit- und Subkultur beobachtet.

Malig. Melanom: Sicher als diese identifizierte Zellen vom Patienten nach Absprache mit diesem erhalten seit 1995 ebenfalls als Langzeit- und Subkultur beobachtet.

Prostata-Adenom: Mischzellkultur von 3 Patienten seit 1988 in Langzeit- und Subkultur beobachtet. In vitro bisher kein Therapieerfolg.

a) Wirkung des Gesamtgiftcocktails

Zu Beginn der Versuchsreihen wurde der gemolkene frische, bzw. gelöste Gesamtgift cocktail und dessen Wirkung in Abhängigkeit von der Konzentration auf unterschiedli che Zellinien ausgetestet. Dabei konnten keine befriedigenden Ergebnisse erreicht werden, da das Gift immer die gesamten Zellkulturen abtötete, wobei die für das Abtö ten benötigte Zeit mit zunehmender Konzentration des eingesetzten Gifts abnahm.

Die Wirkung des Sicarius-Gesamtgiftcocktails auf eine Mischkultur von gesunden Haut zellen mit Melanomzellen ist in Fig. 2 beispielhaft dargestellt. Das Kulturmedium war DMEM/Ham's F-12. Man erkennt nur vereinzelt helle und dunkle Flecken, die Zellreste darstellen. Dies sind die einzigen Überbleibsel, die am Kulturflaschenboden, etwa 11 Stunden nach Injektion des Gesamtgiftcocktails vorgefunden werden.

b) Wirkung verschiedener Einzel-Fraktionen des Sicarius-Spinnengiftcocktails Versuchsdurchführung

Um die zellzerstörende/n Substanz bzw. Substanzen ausfindig zu machen, wurde der Gesamtgiftcocktail säulenchromatographisch, wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert und eine Molekulargewichtsbestimmung der einzelnen Komponenten über Elektro phorese durchgeführt. Die einzelnen Fraktionen (im Mittel 40) wurden an verwandten Zellkulturlinien, d. h. an gesunden Zellinien, im Vergleich zu den korrespondierenden tumorösen/entarteten Zellen unter gleichen Bedingungen vergleichsweise ausgetestet. Dabei wurden jeweils an bestimmten Bereichen Tumorzellen in Kulturen gesunder Zell linien eingefügt. Anschließend wurden die Fraktionen, gelöst in isotonischer Kochsalz lösung, auf die Bereiche mit Tumorzellen und zum Vergleich auch auf Bereiche mit ge sunden Zellen aufgetragen (injiziert) und die Wirkung auf die behandelten Zellen wurde lichtmikroskopisch verfolgt.

Hierbei konnte beobachtet werden, dass etwa 40% der in den einzelnen Fraktionen befindlichen untersuchten Substanzen gewebezerstörende Wirkung aufweisen. Diese Substanzen können überdies in vitro konzentrationsabhängig bestimmte, mit Tumor zellen bedeckte Bereiche lysieren. Nach Ausschwemmung der Gifte mit dem normalen Mediumwechsel wuchsen diese Bereiche wieder zu. Lediglich bei 1 von 8 Kulturen (12,5%) trat anschließend wieder eine Zellenartung auf.

c) Wirkung von Kombinationen verschiedener Fraktionen des Sicarius Spinnengift cocktails

Wie oben bereits beschrieben, wurde festgestellt, daß es sich bei den antagonistisch wirkenden Substanzen im wesentlichen um die Enzyme von Hyaluronidasen- und Phospholipasen-Typ handelt.

Da diese Enzymtypen auch als Durchdringungsenzyme beschrieben sind und die Phospholipasen im speziellen auch als Immunhilfsstoffe gegen genetisch defekte Zel len im Organismus vorhanden sind, wurden nun Versuche mit Substanzkombinationen aus den Enzymen und Peptidtoxinen durchgeführt. Hierbei wurde wegen der besseren Handhabbarkeit zunächst mit den Fraktionen 1-12 experimentiert. Die Versuche er folgten dabei wie unter Beispiel 2b) beschrieben, jedoch wurden keine Einzelfraktionen eingesetzt sondern Kombinationen von Fraktionen. Lösungsmittelwar wiederum isoto nische Kochsalzlösung.

Pharmazeutische Zusammensetzung mit Substanzkombination 1

Substanzkombination 1 enthielt 10 Gew.-% Sic. Enz. 2, 15 Gew.-% Sic. Tox. 5 und 75 Gew.-% einer isotonischen Kochsalzlösung.

Die Wirkung von Substanzkombination 1 (vgl. auch Tabelle 4, V5) auf in Brustgewebe zellen befindliche Mamma-Ca-Zellen war derart, daß nach Injektion der Substanzkom bination im Bereich der Mamma-Ca-Zellen alle Brustkrebszellen zerstört wurden, wäh rend die gesunden Brustgewebezellen verschont blieben. Überdies wurde beobachtet, daß die durch die Substanzkombination 1 lysierte Fläche wieder zuwuchs.

Durch die molekulare Struktur und die physikalischen Eigenschaften der Substanzkom bination 1 wird die Krebszelle von den Enzymen durch ihre natürlichen Eigenschaften aufgespürt und erkannt. Es kann vermutet werden, daß die Peptidtoxine über deren Eindringen in die Krebszelle die krebszelleigene Kommunikation (Transmitterzerstö rung) vernichten. Auf Grund ihrer Molekularstruktur greifen die meisten der im Sicari ustoxin vorhandenen Peptidtoxine Proteine bzw. proteinähnliche Verbindungen an. Krebszellen haben eine raffinierte Abwehr gegen das körpereigene Immunsystem ihres Wirtes/Trägers entwickelt, bei welcher Botenstoffe wie Interferone, Tumornekrosefakto ren und Zytokine eine wichtige Rolle spielen. Da diese Botenstoffe im flüssigen Medium vorhanden sind, bieten sie eine optimale Angriffsfläche für die ebenfalls im flüssigen Medium eingesetzten Peptidtoxine. Da nachweislich die von den erfindungsgemäßen Peptidtoxinen stark geschädigte Krebszellen nicht mehr teilungsfähig sind und benach barte Krebszellen keine Schutzmechanismen gegen die Peptidtoxine entwickeln kön nen, kann man eine Kommunikationszerstörung der Krebszellen untereinander vermu ten.

Bei pharmazeutischen Zusammensetzungen, enthaltend Substanzkombination 1, sind die Enzyme in Bezug auf die Gesamtzusammensetzung quantitativ relativ stark ange reichert.

Pharmazeutische Zusammensetzung mit Substanzkombination 2

Substanzkombination 2 enthielt 5 Gew.-% Sic. Enz. 1, 5 Gew.-% Sic. Tox. 3 und 90 Gew.-% isotonische NaCl-Lösung.

Bei Substanzkombination 2 kann eine allgemeine, räumlich optimal zu begrenzende Zellzerstörung erreicht werden. Hierbei können die gewählten Peptidtoxine das bear beitete Gewebe zerstören. Die Beimischung der natürlichen peptidverdauenden En zyme kontrolliert die räumlich und zeitlich zellzerstörende Wirkweise der Peptidtoxine.

Die Wirkung von Substanzkombination 2 auf in einer Brustgewebezellkultur befindliche Mamma-Carcinom-Zellen ist in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Auf der Aufnahme in Fig. 3 sind gesunde Brustgewebezellen erkennbar, die in DMEM/Ham's F-12 Medium ange zogen wurden. In der linken Bildhälfte wuchsen ursprünglich Mamma-Carcinom-Zellen, die durch die Peptid-Enzym-Kombination zerstört wurden und nach 48 Stunden mit dem zweiten Mediumwechsel ausgespült wurden. Die gesunden Zellen wurden nicht beein trächtigt und beginnen, in den entstandenen Freiraum hereinzuwachsen. Fig. 4 zeigt den gleichen Ausschnitt wie Fig. 3, jedoch 72 Stunden nach Injektion. Die linke, ehe mals leere Fläche beginnt wieder mit gesunden Zellen zuzuwachsen (neben dem Kreuz). Zunächst entsteht erkennbar ein loser Zellverband, der dann durch echtes Ge webe wieder ergänzt wird.

Diese Beispiele zeigen, daß die Anwendung der Kombinationen 1 oder 2 abhängig von der Art, Größe und Lokalisation des zu entfernenden Tumors gewählt werden kann. Substanzkombinationen 1 und 2 können auf die Schnittflächen bei Tumoroperationen aufgebracht werden. Die Anwendung von Kombination 1 kann vorteilhaft bei Operatio nen sein, bei denen möglichst wenig gesundes angrenzendes Gewebe zerstört werden soll. Die Anwendung von Substanzkombination 2 kann bei Operationen vorteilhaft sein, bei denen auf das umliegende Gewebe nicht so viel Rücksicht genommen werden muss.

Der Operateur kann sich bei der Mischung der Substanzen in Bezug auf Qualität und Quantität, je nach Art und Lokalität des Tumors, der beispielhaft beigefügten Tabellen 2 und 3 bedienen, die auch eine weitere Substanzkombination 3 enthalten.

Tabelle 2

Tumorart
Substanzmischung
Mamma-Ca	S 1
Lungen-Ca	S 2
Melanom, malig.	S 3
AL=L<S 1 = Sic. Enz. 2 + Sic. Tox.

Tabelle 3

Lösungsverhältnis in isotonischer Kochsalzlösung (M/V)

Versuche zur Wirkungsweise weiterer Substanzkombinationen

In den nachfolgend angegebenen Tabellen 4 bis 7 sind die Wirkungen weiterer Sub stanzkombinationen auf Mamma-Ca-Zellen, Lungen-Ca-Zellen und Melanomzellen dar gestellt. Die Versuche wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die eingesetzten Substanzmengen betrugen bei diesen Versuchen: 2 mg Peptidtoxin und 2 mg Enzym /100 ml 0,9%-iger Kochsalzlösung.

Beispielhaft ist in den Fig. 5 und 6 die Wirkung der Substanzkombination (Sic. Tox. 2 + Sic. Enz. 4) aus Tabelle 7 auf Melanomzellen gezeigt. Die Aufnahme zeigt einen Aus schnitt einer Hautzellkultur, herangezogen in DMEM/Ham's/F12, an der an verschiede nen Stellen Melanomzellen der gleichen Person geimpft wurden, 30 Minuten nach In jektion der Peptidtoxin-Enzymkombination. In der Mitte des Bildes sind noch unregel mäßige Melanomzellen sichtbar, welche alle nach Giftinjektion in Lyse begriffen sind. Vereinzelte runde, gesunde Hautzellen wurden vom Peptidtoxin-Enzymgemisch nicht angegriffen und sind deshalb noch sichtbar. Fig. 6 zeigt den gleichen Ausschnitt wie Fig. 5, jedoch 3 Stunden nach Injektion. Es ist gut erkennbar, daß alle Tumorzellen aufgelöst wurden. An der Grenze vom Tumorbereich zum gesunden Gewebe sind nur noch gesunde Hautzellen erkennbar, und im ehemaligen Tumorbereich sind einzelne gesunde Hautzellen erkennbar.

Es wurde weiterhin festgestellt, daß bei Langzeitkulturen (dickere Zellschicht in vitro) auch eine Zerstörung von Tumorgewebe in unteren Zellschichten erreicht wurde, wenn die Enzyme in höherer Konzentration zugegeben wurden und diese das Gewebe für die Gifte augenscheinlich durchdringbarer und durch ihre Spezifität die genetisch defekten Zellen für das Gift angreifbar machten.

In den Tabellen 4 bis 7 sind die Ergebnisse der Einwirkung verschiedener Substanz kombinationen auf verschiedene Zellinien zusammenfassend dargestellt.

Tabelle 4

Mamma-Ca

Tabelle 5

Mamma-Ca

Tabelle 6

Lungen-Ca

Tabelle 7

Melanomzellen

Beispiel 3 Enzym-Peptidtoxin-Blocktests

Weitere Versuche wurden dahingehend durchgeführt, um zu testen, ob bei vorgegebe ner Konzentration an Peptidtoxin und Enzym, bestimmte Enzymfraktionen bestimmte Peptidtoxin-Fraktionen neutralisierten.

Versuchsdurchführung

Bei den in den nachfolgenden Tabellen 8 und 9 zusammengefaßten Versuchen wurden Brustgewebszellen, Mamma-Ca Zellen, Hautzellen, Stammzeilen, Leberzellen, Lungen zellen und Lungen-Ca Zellen sowie eine PHA-stimulierte Mischzellkultur aus verschie denen Hautzellininen verwendet.

Die untersuchten Zellen wurden mit 3 ml einer Lösung aus 2 mg Enzym/100 ml Medium (DMEM/Ham's F-12 mit ca. 1, 2% Glutamin, 2,5% Penicillin/Streptomycin und 10% feta lem Kälberserum) versetzt. Nach 12 Stunden wurden 3 ml einer Peptidtoxinlösung (2 mg Peptidtoxin/100 ml 0,9%ige Kochsalzlösung) zugegeben. Die Auswirkungen auf die in der Zellkulturflasche befindlichen Zellen wurden lichtmikroskopisch beobachtet.

Wenn eine Neutralisation/Abblockung der Peptidtoxine erfolgte, wurde dies daran er kannt, daß das Peptidtoxin keine erkennbare Wirkung auf die in der Kultur befindlichen Zellen hatte, da es sofort durch das Enzym neutralisiert wurde. Andernfalls erfolgte eine Zerstörung/Lyse der Zellen.

Die in den nachfolgenden Tabellen zusammenfassend dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei den gewählten Konzentrationen und den oben angegebenen Zelli nien bestimmte Enzyme spezifisch immer die gleichen Peptidtoxine neutralisieren. Bei diesen Konzentrationsverhältnissen scheint eine Verwendung dieser Kombinationen bei den genannten Zellinien also vorteilhaft, da dadurch eine weite räumliche Ausdehnung der Peptidtoxine vermieden werden kann. Bei Änderung der Enzym- und Peptidkon zentration und bei Verwendung anderer Zellinien können die Ergebnisse jedoch anders ausfallen.

Tabellen 8 und 9

Enzym-Peptidtoxin-Blocktests

Tabelle 8

Tabelle 9

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere weitere Substanzen aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae enthalten sind.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidtoxin und/oder die antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Sicarius-, Loxosceles-, Scytodes- und/oder Drymusa-Spinnenarten stammen.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sicarius-Spinnenarten Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius hahni und Sicarius albospinosus, die Loxosceles-Spinnenarten Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa und Loxosceles laeta, und/oder die Scytodes-Spinnenarten Scytodes thoracica, Scytodes rufa und Scytodes longipes sind.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidtoxin zumindest ein Schlangengift, bevorzugt das Grubenottern- Schlangengift Captopril, enthalten ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als antagonistisch wirkende Substanz zumindest eine Hyaluronidase aus Schlangengiften, bevorzugt aus Cobragiften, enthalten ist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die antagonistisch wirkende Substanz eine Phospholipase oder eine Hyaluronidase oder eine Kombination beider Substanzen ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirksame Substanz durch ein Fraktionierungsverfahren aus dem Spinnengift erhalten wurden.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz durch Gelchromatographie, HPLC, Affinitätschromatographie und/oder Ionenaus tauschchromatographie aus dem Spinnengift erhalten wurden.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidtoxin und die antagonistisch wirkende Substanz wie folgt erhalten wurden:
bei Verwendung einer Säule mit einem Innendurchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 50 cm, die unten konisch bis auf 1,5 mm zuläuft und die mit 20 ml eines Gelchromatographiegels AcA 34, Matrix: 3% Acrylamid/4% Agarose, Fraktionierbereich: 20 bis 350 kDa, Ausschlußgrenze: 750kDa, Kügelchendurchmesser 60-140 µm gefüllt ist, Spinnengift aus Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius hahni oder Sicarius albospinosus in 0,25M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, und 1,92M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser im homogenen Zustand auf das Gel aufgebracht wurde, wenn die Giftlösung das Gel durchlaufen hat und 165 ml einer Lösung von 0,25 M Tris/HCl, pH 6,5 bis 7,3, und 1,92M Glycin in destilliertem, deionisiertem Wasser aufgebracht wurden und die ersten 15 ml des Durchlaufs verworfen wurden und je 4 ml Fraktionen gesammelt werden, sich die Peptidtoxine in den Fraktionen 1, 2, 4, 7, 9 und 10 und sich die antagonistisch wirkenden Substanzen in den Fraktionen 3, 5, 6, 8, 11 und 12 befinden.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptidtoxin und eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz enthält, die aus verschiedenen Fraktionen des Spinnengifts stammen.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer solchen Menge vorliegen, daß eine bezüglich Tumorzellen selektive Wirkung des Peptidtoxins und der hierzu antagonistisch wirkenden Substanz vorliegt.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge so ausgewählt ist, daß eine räumlich und/oder zeitlich kontrollierte Ausbreitung im Gewebe sichergestellt ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die antagonistisch wirkende Substanz eine Mischung aus im Gift vorhandenen Phospholipasen und Hyaluronidasen ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Peptidtoxin und antagonistisch wirkender Substanz in Abhängigkeit vom zu behandelnden Tumor gewählt ist.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie übliche Träger- und Hilfsstoffe und/oder weitere Wirkstoffe enthält.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als übliche Träger- und Hilfsstoffe isotone Lösungen, Eiweißlösungen, Aminosäurelösungen und/oder keimtötende Lösungen, bevorzugt Ringerlösung, 0,9%-ige NaCl-Lösung, Human-Albuminlösung und/oder Glutaminlösung, enthält, und daß sie als weitere Wirkstoffe Antibiotika, Antimykotika, Antituberkulotika, Mittel gegen Parasiten, Aminosäuren, die Wundheilung begünstigende Enzyme, Mitosehemmstoffe und/oder Zytostatika enthält.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Derivat des Peptidtoxins und/oder der antagonistisch wirkenden Substanz in der pharmazeutischen Zubereitung enthalten ist und/oder das Peptidtoxin und/oder die hierzu antagonistisch wirkende Substanz chemisch-synthetisch oder durch rekombinante biotechnologische Methoden hergestellt ist und sie in ihrer Wirkung dem im Gift von Spinnen der Familie Sicariidae enthaltenen Toxinen oder den hierzu antagonistisch wirkenden Substanzen und Derivaten hiervon entsprechen.

19. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine hierzu antagonistisch wirkende Substanz in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, wobei zumindest ein Peptidtoxin und/oder zumindest eine antagonistisch wirkende Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae stammt, und des Peptidtoxins und der antagonistisch wirkenden Substanz mit den folgenden Schritten:

- Gewinnen eines Spinnengift-Rohgemischs durch an sich bekannte Verfahren sowie Fraktionierung der Mischung, um das Peptidtoxin und die hierzu antagonistisch wirkende Substanz und wahlweise die weiteren Substanzen in möglichst voneinander getrennten Fraktionen zu erhalten; wahlweise
- Kombination verschiedener Fraktionen miteinander oder mit aus anderen Organismen stammenden Peptidtoxinen oder antagonistisch wirkenden Substanzen, um eine pharmazeutisch wirksame Zusammensetzung zu erhalten.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Spinnengift-Rohgemisch aus weiblichen Spinnen der Familie der Sicariidae gewonnen wird.

21. Verfahren nach den Ansprüchen 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Spinnengift-Rohgemisch durch manuelles Melken erhalten wird.

22. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Spinnengift-Rohgemisch vor der Fraktionierung homogenisiert wird.

23. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionen vor der Weiterverarbeitung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung tiefgekühlt und weiter bevorzugt lyophilisiert werden.

24. Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18 in der Medizin.

25. Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18 zur Behandlung von Tumorerkrankungen.

26. Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18 zur unterstützenden Behandlung bei Tumoroperationen.

27. Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae zur Behandlung von Tumorerkrankungen.

28. Verwendung einer zum Peptidtoxin antagonistisch wirkenden Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae zur Behandlung von Tumorerkrankungen.

29. Verwendung eines Peptidtoxins aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae in der Medizin.

30. Verwendung einer antagonistisch wirkenden Substanz aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae in der Medizin.

31. Verwendung einer Kombination eines Peptidtoxins und einer hierzu antagonistisch wirkenden Substanz, je aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae, in der Medizin.

32. Peptidtoxine und hierzu antagonistisch wirkende Substanzen, erhalten aus dem Gift von Spinnen der Familie der Sicariidae.