ES2230177T3 - Composicion farmaceutica que comprende venenos de araña, la produccion de la misma y su utilizacion para el tratamiento de enfermedades tumorales. - Google Patents
Composicion farmaceutica que comprende venenos de araña, la produccion de la misma y su utilizacion para el tratamiento de enfermedades tumorales.Info
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Abstract
Composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales, que contiene en una cantidad farmacéuticamente efectiva: a) como mínimo una toxina peptídica, y b) como mínimo una sustancia de efecto antagónico con respecto a la anterior y/o como mínimo un penetrante, en la que como mínimo la toxina peptídica procede del veneno de arañas de la familia de las Sicariidae, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante proceden del veneno de arañas de la familia de las Sicariidae.
Description
Composición farmacéutica que comprende venenos de
araña, la producción de la misma y su utilización para el
tratamiento de enfermedades tumorales.
La presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que contienen como mínimo una toxina peptídica y como
mínimo una sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o un
penetrante, en una cantidad farmacéuticamente activa, procediendo
como mínimo la toxina peptídica, y opcionalmente la sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante, del veneno
de arañas de la familia de las Sicariidae, así como a la
fabricación y utilización de esas composiciones farmacéuticas.
En el caso de tumores que se manifiestan
localmente, la forma de terapia más corriente actualmente es la
eliminación quirúrgica más completa posible del tumor. En los
preliminares de la operación se localiza el tumor por medio de un
procedimiento de representación gráfica, y se extirpa manualmente
por medio de una intervención para abrir. Aquí no se puede evitar el
contacto con el aire de la superficie en que se realiza la
operación. Es conocido por la literatura especializada (Stegner
H.-E. (1986): Histopathologie der Mammatumoren. Enke Verlag,
Stuttgart; Garbe C., Dummer R., Kaufmann R. y Tielgen W. (1997):
Dermatologische Onkologie. Springer Verlag, Berlin (ver también
Errata)) el hecho de que debido al contacto con el aire hay que
contar con una tasa de metastatización del 93% del tejido del tumor
primario.
Otras formas de terapia para el tratamiento de
tumores son la quimioterapia, la radioterapia, la terapia por
anticuerpos, el tratamiento con citocinas, la hipertermia o la
oxigenoterapia.
En la quimioterapia de tumores se aplican venenos
celulares habituales, con el fin de tratar tumores extendidos por
todo el cuerpo y células tumorales que permanecen tras el
tratamiento quirúrgico de tumores locales (Römpp, Chemielexikon, 9ª
edición, tomo 1, 1989, pág. 680). Son sustancias que se utilizan en
la quimioterapia, por ejemplo, sustancias alquilizantes,
antimetabolitos, alcaloides, antibióticos y hormonas (Römpp Lexikon,
Biotechnologie und Gentechnik, 2ª edición, 1999, pág. 153). Se
conocen como compuestos alquilizantes, por ejemplo, la cisplatina,
los compuestos nitroso-ureicos o la tiotepa. Se
utilizan además antagonistas del ácido fólico, por ejemplo la
aminopterina, y análogos de la pirimidina, como el fluorouracilo. Se
utilizan como antibióticos con acción inhibidora sobre las
polimerasas del RNA dependientes de DNA la bleomicina, la
doxorubicina o la mitomicina C. También se aplican en la
quimioterapia enzimas, por ejemplo
L-asparaginasa.
Constituyen inconvenientes de la quimioterapia el
hecho de que las sustancias quimioterapéuticas sólo muy difícilmente
se pueden utilizar de manera orientada, y el hecho de que esos
citostáticos son venenos celulares extraordinariamente agresivos,
que además del tejido tumoral dañan también en grandes proporciones
tejidos sanos, incluyendo células hepáticas y renales. Los efectos
secundarios que se producen, como por ejemplo caída del cabello,
vértigo, vómitos, hemorragias gastrointestinales y molestias
circulatorias entre otros, debido a la difusión sistémica de los
citostáticos son difíciles de contrapesar (Deutsches
Krebsforschungszentrum DKFZ Heidelberg - Focus 19/1995). Estos
numerosos efectos secundarios, peligrosos e indeseados, se explican
sobre todo a causa de la inhibición de la regeneración de tejidos de
rápida proliferación, y afectan especialmente al sistema
hematopoyético, a los epitelios de las mucosas y de las gónadas, así
como a la piel y a las formaciones anexas a la piel. Entre las
complicaciones que suponen un peligro para la vida se encuentran en
primer lugar las infecciones, seguidas de las hemorragias
(Pschyrembei - Klinisches Wörterbuch, 256ª edición, 1990, página
1866).
La radioterapia tiene lugar con una radiación
ionizante; habitualmente se utilizan rayos de electrones, rayos
gamma, rayos de neutrones o rayos X (Zetkin/Schaldach: Lexikon der
Medizin, 16ª edición, 1999, páginas 1922/1923, Ullstein Medical).
Constituye un inconveniente de la radioterapia el hecho de que,
similarmente a lo que ocurre con la quimioterapia, no es posible una
delimitación espacial. La dureza de la radiación daña también de
forma duradera células sanas, sobre todo su DNA. Puesto que las
células cancerosas se dividen la mayoría de las veces con más
rapidez que las células sanas, en circunstancias normales las
células cancerosas son las primeras que mata la radioterapia. En
este caso existe sin duda el riesgo de una úlcera por irradiación
(Pschyrembei - Klinisches Wörterbuch, 256ª edición, 1990, página
1602).
Constituye por ello un objetivo de esta invención
la preparación de medios y procedimientos perfeccionados que se
puedan utilizar para la terapia de los tumores y/o como terapia
concomitante, por ejemplo en el tratamiento quirúrgico/operatorio de
enfermedades tumorales, y que no presenten los mencionados
inconvenientes del estado actual de la técnica.
Este objetivo se consigue conforme a la invención
por medio de una composición farmacéutica que contiene, en una
cantidad farmacéuticamente activa:
- a)
- como mínimo una toxina peptídica, y
- b)
- como mínimo una sustancia de efecto antagónico con respecto a la anterior y/o como mínimo un penetrante,
en la que como mínimo la toxina
peptídica procede del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante proceden del veneno de arañas
de la familia de las
Sicariidae.
Además de eso, las composiciones farmacéuticas
conforme a la invención pueden contener ventajosamente una o varias
otras sustancias procedentes del veneno de arañas de la familia de
las Sicariidae. En otra forma de realización pueden contener
preferentemente otras sustancias de otros organismos que contienen
venenos.
Entre las arañas de la familia de las
Sicariidae se prefieren los géneros Sicarius,
Loxosceles, Scytodes y Drymusa.
Se prefieren composiciones farmacéuticas en las
que la toxina peptídica, así como la sustancia de efecto antagónico
y/o el penetrante, proceden del veneno de las especies de arañas de
Sicarius, Loxosceles, Scytodes y Drymusa.
Se prefieren, por otra parte, composiciones
farmacéuticas en las que la toxina peptídica, así como la sustancia
de efecto antagónico y/o el penetrante proceden del veneno de las
especies de arañas del género Sicarius: Sicarius oweni,
Sicarius testaceus, Sicarius hahni y Sicarius
albospinosus, de las especies de arañas del género Loxosceles:
Loxosceles reclusa, Loxosceles rufipes y Loxosceles
laeta, y/o de las especies de arañas del género Scytodes:
Scytodes thoracica, Scytodes rufa y Scytodes longipes.
Esto tiene la ventaja de que debido a ello se puede aprovechar el
ejemplo proporcionado por la Naturaleza de toxinas peptídicas y
sustancias de efecto antagónico con respecto a ellas en un único
organismo.
Conforme a la presente invención, sin embargo, la
sustancia de efecto antagónico y/o el penetrante también pueden
proceder de otro organismo, o ser fabricadas sintéticamente o con
técnica genética, o puede estar contenida otra toxina peptídica de
otro organismo: por ejemplo, puede estar contenida como otra toxina
peptídica, el veneno de serpiente Captopril, o la sustancia de
efecto antagónico puede ser una hialuronidasa procedente de venenos
de cobras.
Conforme a la invención la toxina peptídica
utilizada tiene preferentemente un efecto destructor de células.
La sustancia de efecto antagónico y/o el
penetrante son preferentemente una fosfolipasa o una hialuronidasa,
o una combinación de ambas sustancias. También se incluyen conforme
a la invención otras sustancias distintas de las fosfolipasas o las
hialuronidasas que actúan de manera antagónica sobre la toxina
peptídica y/o como penetrantes. Se prefiere además que la sustancia
de efecto antagónico sea una mezcla de fosfolipasas y hialuronidasas
presentes en el veneno de arañas de las especies mencionadas en esta
invención. En otra forma de realización, la sustancia de efecto
antagónico y/o el penetrante son una fosfolipasa y/o una
hialuronidasa de otro organismo distinto de las arañas de la familia
de las Sicariidae, por ejemplo de otras familias de arañas o
de serpientes. Preferiblemente se contienen hialuronidasas de
venenos de serpientes, preferiblemente de venenos de cobras, o
fosfolipasas de Actrataspis bibronil, Bitis arietans o
Vipera aspis zinnikeri. El penetrante es preferiblemente una
fosfolipasa.
Preferiblemente se obtienen del veneno de arañas
la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico con respecto
a la ella y/o el penetrante por un procedimiento de fraccionamiento,
y es además preferible que la composición farmacéutica contenga una
toxina peptídica y una sustancia de efecto antagónico con respecto a
ella y/o un penetrante procedentes de fracciones diferentes. Por
este medio se puede ajustar la acción de la composición farmacéutica
ventajosamente al tipo o tamaño del tumor que se ha de tratar.
La toxina peptídica y la sustancia de efecto
antagónico con respecto a ella y/o el penetrante se pueden obtener
de la mezcla bruta de venenos de araña (cóctel de veneno de araña)
por medio de procedimientos conocidos por sí mismos. Se prefiere
obtener la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico con
respecto a ella por medio de cromatografía en gel, HPLC,
cromatografía de afinidad y/o cromatografía por intercambio iónico.
De la misma manera se pueden obtener de otros organismos también la
sustancia de efecto antagónico y el penetrante.
Es preferible además que la toxina peptídica y la
sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante
se hallen presentes en la composición farmacéutica en una cantidad
tal que se dé con respecto a las células tumorales un efecto
destructor por parte de la toxina peptídica y de la sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o del penetrante. Se eligen
la proporción o la cantidad de la toxina peptídica y de la sustancia
de efecto antagónico con respecto a ella preferiblemente de tal
manera que se asegure una difusión controlada, temporal y/o
espacialmente, en el tejido que se ha de tratar. Se elige además la
cantidad de tal manera que la toxina peptídica no produzca en los
pacientes a tratar ningún efecto secundario tóxico, o sólo un efecto
mínimo. Las cantidades, por supuesto, también se han de ajustar al
tumor que ha de ser tratado y al paciente a tratar. Las cantidades
adecuadas de las sustancias individuales, y sus proporciones mutuas,
deben ser determinadas por el especialista en el marco de ensayos
con animales y/o de ensayos éticamente justificables realizados
sobre el paciente. La cantidad de penetrante se elige
preferiblemente de tal manera que ese penetrante identifique en gran
medida todas las células degeneradas, y destruya selectivamente, en
combinación con la toxina peptídica, la células tumorales, mientras
las células sanas se conservan en su mayor
parte.
parte.
Es preferible además de eso una composición
farmacéutica en la que se elija la cantidad de toxina peptídica y de
sustancia de efecto antagónico con respecto a ella de tal manera que
se asegure una difusión controlada en el espacio y en el tiempo.
La composición farmacéutica presenta
preferiblemente una cantidad de toxina peptídica y de sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o de penetrante que se elige
en función del tumor que ha de ser tratado.
Es preferible además que la composición
farmacéutica contenga sustancias portadoras y auxiliares habituales.
Es preferible que la composición farmacéutica contenga otros
principios activos, tales como antibióticos, antimicóticos, agentes
contra la tuberculosis, agentes contra los parásitos, citostáticos,
aminoácidos, enzimas que favorecen la cicatrización de las heridas
y/o sustancias inhibidoras de la mitosis. Aquí son preferibles la
penicilina/estreptomicina, la polimixina/gentamicina, la glutamina
(5%), el mitopodozid, el alcaloide de Vinca rosea, la
bromelaina o los bromelains.
La toxina peptídica procedente del veneno de
arañas de la familia de las Sicariidae y la sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante contenidos
en la preparación conforme a la invención se pueden obtener por
medio de procedimientos de aislamiento conocidos por sí mismos. Un
ejemplo preferido de ello es un procedimiento de fraccionamiento.
Las sustancias así conseguidas, y obtenidas en forma pura por un
procedimiento de purificación, pueden ser suministradas entonces
para un uso médico-terapéutico. Seguidamente se
describe con más detalle un procedimiento preferido.
Es posible también obtener la toxina peptídica
del veneno de arañas de la familia de las Sicariidae,
fabricar la sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o
el penetrante en forma recombinante por síntesis química o por medio
de métodos de técnica genética. Como es habitual en el caso de
sustancias químicas, la presente invención comprende también
derivados y sales de las sustancias preparadas conforme a la
invención. Por ejemplo, la toxina peptídica puede comprender una o
varias adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos,
debiendo asegurarse que se conserve el efecto médico conforme a la
invención.
La obtención de la toxina peptídica y de la
sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o del
penetrante tiene lugar por medio de métodos habituales en la técnica
de procesos químicos. Se cuentan entre éstos, en especial, los
procedimientos de fraccionamiento; pero también se pueden utilizar
otros procedimientos, como por ejemplo procedimientos inmunológicos,
para "pescar" las sustancias deseadas en el cóctel completo de
veneno.
Un procedimiento preferido para la fabricación de
una composición farmacéutica conforme a la invención, que contenga
en una cantidad farmacéuticamente activa como mínimo una toxina
peptídica y como mínimo una sustancia de efecto antagónico con
respecto a ella y/o como mínimo un penetrante, en el que la toxina
peptídica proceda del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico
con respecto a la anterior y/o el penetrante procedan del veneno de
arañas de la familia de las Sicariidae, presenta las
siguientes etapas:
- -
- obtención de una mezcla bruta de venenos de araña por procedimientos conocidos por sí mismos, y fraccionamiento de la mezcla con el fin de obtener la toxina peptídica, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante, y opcionalmente otras sustancias, en fracciones lo más separadas posible entre sí;
- -
- combinación de diferentes fracciones de la toxina peptídica con fracciones que contengan sustancias de efecto antagónico con respecto a ella y/o penetrantes, o con sustancias de efecto antagónico y/o penetrantes procedentes de otros organismos, con el fin de obtener una composición farmacéuticamente activa.
El veneno de arañas contiene diferentes toxinas
peptídicas y diferentes sustancias de efecto antagónico con respecto
a ellas y/o penetrantes, y en su caso otros principios activos,
asimismo relevantes desde el punto de vista
médico-terapéutico. Todas estas sustancias se pueden
utilizar terapéuticamente en una preparación farmacéutica en
proporciones determinadas, que ha de determinar el especialista. Los
ensayos que se muestran en los ejemplos de realización conciernen
especialmente a las fracciones 1 a 12, conteniendo también
sustancias terapéuticamente activas las fracciones siguientes del
procedimiento de fraccionamiento descrito aquí en particular. Se
llama la atención sobre el hecho de que el procedimiento de
fraccionamiento solamente muestra a modo de ejemplo una posibilidad
para la obtención de la toxina peptídica y de las sustancias de
efecto antagónico con respecto a ella. Son posibles otras formas de
realización.
En este caso es preferible obtener la mezcla
bruta de venenos de araña de arañas hembra de la familia de las
Sicariidae. Esto resulta ventajoso porque las arañas hembra
de la familia de las Sicariidae producen más veneno que las
arañas macho.
Se prefiere además obtener la mezcla bruta de
venenos de araña por medio de recolección manual. Esto tiene la
ventaja de que constituye una obtención especialmente cuidadosa de
la mezcla bruta de venenos de araña.
En el procedimiento conforme a la invención se
prefiere aparte de eso que la mezcla bruta de venenos de araña se
homogeneice antes del fraccionamiento, y se prefiere además
ultracongelar, y después preferiblemente liofilizar, las fracciones
antes de su elaboración posterior.
Las composiciones farmacéuticas conforme a la
invención son apropiadas para su utilización en medicina.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
utilizar conforme a la invención preferentemente para el tratamiento
de enfermedades tumorales, siendo preferible además un tratamiento
suplementario en operaciones de tumores.
Actualmente hay en todo el mundo unas 35.000
especies de arañas. Con la excepción de unas 300 especies, todas son
animales activamente venenosos, que necesitan su veneno para
capturar presas. Puesto que las arañas sólo tienen una abertura
bucal muy pequeña, han desarrollado enzimas y venenos que digieren
sus presas fuera del cuerpo, de manera que las arañas chupan
alimento licuado. Unas 50 especies de arañas pueden resultar
peligrosas también para el ser humano debido a sus venenos. A pesar
de ello, sobre todo los venenos de estas especies han sido
investigados sólo de manera superficial, o no lo han sido en
absoluto. Los principales componentes de los venenos de las arañas
son:
- Enzimas digestivos
- Aminas biógenas
- Ácidos orgánicos
- Péptidos
- Toxinas peptídicas
Entre las toxinas peptídicas se encuentran los
siguientes grupos de toxinas:
- Cardiotóxicos
- Neurotoxinas
- Hemotoxinas
- Venenos celulares
- Venenos destructores de tejidos
Originalmente, el cóctel completo de veneno de
todos los animales activamente venenosos, por la acción combinada de
diferentes sustancias, lleva a cabo también por lo general una
digestión preliminar de las células animales, y en consecuencia una
modificación orientada de las células originales.
En el caso de las especies de arañas utilizadas
en esta invención se encuentran en el cóctel de veneno sustancias
que tienen un efecto citotóxico, necrótico y apoptótico (acción
digestiva de los venenos). Al mismo tiempo se encuentran sustancias
con un efecto lisante sobre las anteriores, entre otras también
frenadores con un efecto antagónico y/o penetrantes.
Puesto que la araña tiene que absorber alimento
todavía aprovechable (estructuras proteínicas enteras y aminoácidos
intactos), ha desarrollado en el curso de su evolución de 350
millones de años de duración su cóctel de veneno de elevada
eficacia. En este cóctel de veneno, la difusión en el espacio de la
toxina peptídica, dependiente de factores temporales y de
concentración, la limitan de manera controlada enzimas de acción
específica gracias a la cooperación de toxinas peptídicas con
sustancias de efecto antagónico con respecto a ellas.
Sorprendentemente se encontró ahora que se pueden
utilizar componentes del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae para el tratamiento de enfermedades tumorales.
El cóctel completo de veneno no se puede utilizar
farmacéuticamente a causa de su efecto letal ya en dosis mínimas,
que hay que atribuir a los sinergismos y antagonismos de diferentes
sustancias contenidas en esta mezcla. Descargada por las arañas como
veneno defensivo, quien ha sufrido la picadura presenta la siguiente
sintomatología:
Más del 90 por ciento de los que han sido picados
no percibe la picadura. Al cabo de unos 90 minutos se encuentra en
torno al lugar de la picadura una necrosis local de unos 3 cm de
diámetro, fuertemente humectante, que va produciendo una maceración
ya a través de la piel. Después de unas 2 horas se abre localmente
la herida de la picadura y se pueden comprobar los primeros efectos
sistémicos, tales como fallos circulatorios y/o arritmias cardíacas.
Transcurridas otras 2-3 horas comienzan a actuar las
sustancias lisantes. La persona que ha sufrido la picadura
experimenta un fuerte deseo de orinar, siendo la orina ya
sanguinolenta. Se extienden los dolores por toda la cavidad
abdominal a causa del efecto necrotizante de órganos del veneno. El
hígado no puede metabolizar veneno en las concentraciones y
combinaciones descargadas por la araña. Si la araña ha inyectado al
picar mucho veneno, el cuerpo no consigue ya degradarlo, y el
paciente muere por insuficiencia renal como consecuencia de una
intoxicación aguda de la sangre.
Sorprendentemente, sin embargo, se pueden
utilizar combinaciones de toxinas peptídicas y de enzimas opuestas
(de efecto antagónico con respecto a ellas) y/o de penetrantes,
contenidos en el veneno de las arañas, en concentraciones y
proporciones cuantitativas adecuadas, procediendo como mínimo la
toxina peptídica, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante, del veneno de arañas de la
familia de las Sicariidae, para el tratamiento de
enfermedades tumorales, y de manera paralela a, o suplementaria de
las operaciones de tumores, y se pueden destruir los tejidos
tumorales (residuales). Por ejemplo, conforme a la invención se
puede conseguir la destrucción de tejido tumoral no abarcado en la
operación, así como impedir la formación de metástasis del tumor
local en el organismo.
Funcionamiento de las sustancias combinadas con
la toxina peptídica:
Efecto antagónico: El tejido puede ser
destruido sin complicaciones conforme a la invención in vitro
en áreas deseadas, determinadas tópicamente, en especial las
predestinadas a desarrollar células tumorales. El modo de funcionar
se basa aquí en funcionamientos nativos, que se influyen
recíprocamente, de las toxinas peptídicas y de las sustancias
presentes en el cóctel de veneno que tienen un efecto antagónico con
respecto a aquéllas. Con la expresión "sustancias de efecto
antagónico" hay que entender conforme a la invención que pueden
digerir o descomponer la toxina peptídica combinada con ellas. En el
ensayo con células humanas se obtuvo el siguiente resultado: Una
parte de la toxina peptídica de efecto destructor de células se
difunde en el cultivo celular más rápidamente que las enzimas que
digieren esa toxina y por consiguiente tienen un efecto antagónico.
Se puede calcular ahora la composición cuantitativa de una
combinación de toxina peptídica y sustancia de efecto antagónico, en
función de la calidad y cantidad del área de tejido que se ha de
lisar, de manera que se consiga una destrucción en el espacio y en
el tiempo controlada. En una simple determinación del peso molecular
por medio de electroforesis no se pueden detectar ya después de la
puesta en contacto en solución en la comparación
antes-después las toxinas peptídicas originalmente
utilizadas (falta la correspondiente banda). En esta invención hay
que entender con la expresión "sustancias de efecto
antagónico", por ejemplo, fosfolipasas y hialuronidasas
procedentes de arañas de la familia de las Sicariidae, no
excluyéndose que se hallen presentes en el veneno de araña otras
sustancias de efecto antagónico que sean asimismo utilizables
conforme a la invención.
Penetración (efecto sinérgico): La
estructura proteínica superficial de las células somáticas
genéticamente defectuosas, o células tumorales, está alterada
(Lottspeich F., Zorbas H. (1998): Bioanalytik. Spektrum Akademischer
Verlag Heidelberg Berlin). Las fosfolipasas y/o hialuronidasas
utilizadas conforme a la invención, y en su caso otras sustancias,
pueden ahora reconocer esas células tumorales de estructura
superficial alterada, o ligarse selectivamente a ellas y lisarlas.
Conforme a la invención esto es aplicable en especial a las
fosfolipasas. Puesto que el estatus inmunológico de las fosfolipasas
solas de origen animal que se utilizan es con frecuencia muy bajo,
como también el de las fosfolipasas humanas de enfermos de cáncer,
se pueden utilizar conforme a la invención, para una aplicación
terapéutica en el tratamiento de enfermedades tumorales,
fosfolipasas de otros organismos, por ejemplo arañas o serpientes.
Experimentalmente se ha demostrado que también las fosfolipasas
extrañas al cuerpo, procedentes de venenos de arañas o de
serpientes, no sólo reconocen las células somáticas humanas
genéticamente defectuosas, sino que son apropiadas también para
infiltrar péptidos con un efecto necrótico o citotóxico acoplados a
ellas. Estos péptidos, en nuestro caso toxinas peptídicas
procedentes de los venenos de la familia de las Sicariidae,
actúan, una vez han llegado a la célula, destruyéndola.
Presumiblemente se trata aquí de apoptosis, ya que después de la
destrucción de las células se puede medir en el medio (sobrenadante)
Caspasa-3, un importante marcador de la
apoptosis.
Con el término "penetrantes" se entienden
conforme a la invención sustancias tales que en combinación con la
toxina peptídica destruyen selectivamente las células tumorales y
conservan en gran parte las células sanas. Con ese término se
entiende también conforme a la invención la capacidad de las
fosfolipasas, hialuronidasas u otras sustancias contenidas en el
veneno de poder reconocer las células degeneradas por su estructura
superficial alterada, de acoplarse a ellas y de poder desagregar al
hacerlo la pared celular, con el fin, por ejemplo, de infiltrar
activamente sustancias acopladas a ellas (preferentemente toxinas
peptídicas con efecto destructor de células) en la célula
degenerada. Hasta aquí los penetrantes utilizados conforme a la
invención, en especial las fosfolipasas, actúan como sustancias
mensajeras y auxiliares (efecto sinérgico). Conforme a la invención,
por lo tanto, con el término "penetración" no se quiere decir
un efecto de incremento de la permeabilidad, con el que en la
literatura especializada se entiende en la mayoría de los casos una
tendencia mejorada a la difusión en los tejidos.
Las toxinas peptídicas con un peso molecular de
aproximadamente 100 kDa poseen un efecto destructor de tejidos. A
causa de su elevado peso molecular y de su estructura espacial
tienen en los tejidos tan sólo una tendencia a la difusión de unas
100 capas de células por picogramo de sustancia.
En su caso pueden apoyar los efectos mencionados
otras sustancias contenidas en la mezcla bruta de venenos de
araña.
Con el fin de evitar destrucciones celulares no
deseadas se puede llevar a cabo in vitro conforme a la
invención, en células humanas vivas (sanas y tumorales) del tipo de
tejido que se ha de someter a terapia, un ajuste respecto a las
cantidades absolutas y relativas de los componentes de la mezcla de
toxina peptídica y enzima en función del tipo y tamaño del tumor a
tratar. Al hacerlo es de la mayor importancia la observación de la
tendencia a la difusión. Ésta se puede averiguar en ensayos
preliminares comparando la solidez del tejido tumoral con la del
tejido que rodea el tumor (ver también ejemplo 2).
El funcionamiento de cócteles completos de veneno
animal o de sustancias individuales separadas de ellos por
cromatografía de columna y caracterizadas por su peso molecular
puede tener lugar por medio de la comprobación de éstas en las
correspondientes líneas celulares humanas sanas y tumorales.
Conforme a la invención, como mínimo la toxina
peptídica y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico y/o el
penetrante proceden del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae. Se prefieren los géneros Sicarius,
Loxosceles, Scytodes y/o Drymusa. En el ámbito del género
Sicarius se pueden utilizar de manera especialmente
preferente las especies de arañas Sicarius oweni, Sicarius
testaceus, Sicarius hahni y Sicarius albospinosus. Entre
las arañas del género de las Loxosceles se pueden utilizar conforme
a la invención las especies Loxosceles rufescens, Loxosceles
reclusa y/o Loxosceles laeta. Entre las arañas del género
de las Scytodes se pueden utilizar conforme a la invención las
especies Scytodes thoracica, Scytodes rufa y/o Scytodes
longipes.
Conforme a la presente invención las toxinas
peptídicas proceden preferiblemente del mismo organismo que las
sustancias de efecto antagónico con respecto a ellas y/o los
penetrantes y, opcionalmente, otras sustancias activas contenidas.
De esta manera se puede aprovechar el ejemplo efectivo, desarrollado
por la Naturaleza, de esas sustancias.
En otra forma de realización asimismo preferida,
la sustancia de efecto antagónico y/o el penetrante proceden de
otros organismos distintos de las arañas de la familia de las
Sicariidae, por ejemplo de otras familias de arañas,
serpientes, escorpiones o similares. En este caso se pueden contener
frecuentemente cantidades mayores de las mencionadas sustancias. Son
ejemplos de otros organismos de ese tipo las cobras, el
Actrataspis bibronil, el Bitis arietans o la Vipera
aspis zinnikeri.
La fabricación de las composiciones farmacéuticas
conforme a la invención puede tener lugar de tal manera que en
primer lugar se obtiene de las arañas, por procedimientos conocidos
por sí mismos, una mezcla bruta de venenos de araña, y se lleva a
cabo un fraccionamiento de esa mezcla bruta de venenos de araña,
asimismo por procedimientos de fraccionamiento conocidos por sí
mismos, para la separación de proteínas, con el fin de obtener las
toxinas peptídicas y las sustancias de efecto antagónico con
respecto a ellas y/o el penetrante en una forma en que las unas
estén lo más separadas posible de las otras, o en fracciones
separadas. A continuación se pueden combinar, para la fabricación de
una preparación farmacéutica, diferentes fracciones de la toxina
peptídica con fracciones que contengan sustancias de efecto
antagónico con respecto a ella y/o penetrantes, o se pueden combinar
fracciones individuales de la toxina peptídica con sustancias de
efecto antagónico y/o penetrantes procedentes de otros organismos.
Preferentemente pueden estar contenidos también como toxinas
peptídicas, además, venenos de serpientes, por ejemplo el veneno
Captopril del crótalo. Preferentemente se pueden utilizar también
como sustancias de efecto antagónico hialuronidasas procedentes de
venenos de serpientes, por ejemplo de venenos de cobras, y/o como
penetrantes fosfolipasas procedentes de Actrataspis bibronil,
Bitis arietans o Vipera aspis zinnikeri, combinados en
cada caso con una o varias fracciones de la toxina peptídica de
Sicarius.
También es posible conforme a la invención
combinar para la fabricación de composiciones farmacéuticas las
fracciones, adicionalmente, también con otros principios activos
apropiados y/o con sustancias portadoras y auxiliares habituales en
farmacia.
Para la fabricación de las composiciones
farmacéuticas conforme a la invención se pueden seleccionar, por
ejemplo a través de una purificación por cromatografía de columna,
del cóctel de veneno que se ha obtenido de las especies de arañas
antes mencionadas por medio de recolección manual, componentes
específicos del veneno (toxinas peptídicas con un efecto necrótico y
citotóxico), así como sustancias naturales de efecto antagónico con
respecto a ellos (frenadores) y/o penetrantes del tipo de las
fosfolipasas y las hialuronidasas.
La analítica para diferenciar los componentes
contenidos en las fracciones puede llevarse a cabo por medio de
HPLC-MS-MS (por ejemplo, con un
aparato de la empresa Perkin-Elmer). Se ha podido
comprobar en ese caso que en lo que se refiere a las sustancias de
alto peso molecular se trata, a causa de su estructura básica
analizada por MS-MS, de enzimas del tipo de las
fosfolipasas y las hialuronidasas. Además de estas enzimas se han
podido encontrar también polipéptidos, que debido a su origen, a su
funcionamiento, y a sus grupos tóxicos del tipo NX, NHX, NOX y SX,
representados por medio del análisis por MS-MS, se
pueden clasificar como toxinas peptídicas.
Las sustancias utilizadas conforme a la invención
para la composición farmacéutica pueden contener de manera natural
venenos producidos por arañas del género Sicarius, que fueron
desarrollados originariamente para la captura de presas y para la
digestión preliminar de proteína animal. Este funcionamiento natural
se puede conseguir por medio de una obtención cuidadosa, con
conservación de funciones, de la sustancia básica del veneno (por
ejemplo por recolección manual).
Al contrario de las formas convencionales de
recolección en los artrópodos por medio de un procedimiento
eléctrico (Weickmann D. (1991): Haltung und Giftigkeit von
Sicariidae. Arachnologischer Anzeiger
16:12-13; Weickmann D., Burda R. (1994):
Electrophoresis of scorpion venoms. Electrophoresis Forum 1994,
Abstracts, Technische Universität München. Okt.
24-26), en el que se les extrae a los animales el
veneno por medio de un impulso eléctrico que provoca en los animales
la contracción de las glándulas del veneno (al hacerlo los animales
están preferiblemente sometidos a hipotermia), conforme a la
presente invención se obtiene el cóctel de veneno por medio de un
procedimiento manual, en el que se estimula a los animales,
aprovechando su conducta natural de defensa, para que descarguen su
veneno.
Conforme a una forma de realización de la
invención, está prevista una forma de recolección manual en las
arañas. Por este medio se obtienen venenos nativos genuinos, no
adulterados, mientras que al contrario de eso, por ejemplo en la
forma eléctrica de recolección por medio de flujo electrónico, se
obtienen sustancias o moléculas reestructuradas, que pueden tener
modificado su funcionamiento, o también pueden estar presentes en
los venenos sustancias que en otro caso el animal no descargaría.
Estas sustancias pueden, deben aunque no obligatoriamente, influir
negativamente sobre la eficiencia de los compuestos médicamente
activos contenidos en el cóctel de veneno. De manera estándar se
puede llevar a cabo un análisis y/o un control de calidad de la
mezcla bruta de venenos por procedimientos electroforéticos.
Los siguientes ejemplos muestran formas
ventajosas de realización de la invención, pero no deben limitar el
alcance de protección de la invención.
En los ejemplos y en la descripción se hace
referencia a las siguientes figuras:
La figura 1 muestra una electroforesis
SDS-Page (5 cm de gel concentrador, 15 cm de gel
separador, intervalo de peso molecular de 10 a 200 kDa) de cócteles
completos de veneno de Sicarius testaceus y Sicarius sp.
Argentinien. Las pistas 1 a 3 son estándares de peso molecular,
las pistas 4 y 5 son cócteles completos de veneno de Sicarius
testaceus y la pista 6 es un cóctel completo de veneno de
Sicarius sp. Argentinien.
La figura 2 muestra el efecto de un cóctel
completo de veneno de Sicarius sobre un cultivo mixto de
células cutáneas sanas y células de melanoma.
La figura 3 muestra una fotografía microscópica
del efecto de una composición conforme a la invención (tox.Sic.3 +
enz.Sic.1) sobre células de carcinoma de mama que se encuentran en
un cultivo de tejido mamario, 48 horas después de la inyección.
La figura 4 muestra el efecto selectivo de una
composición conforme a la invención (tox.Sic.2 + enz.Sic.4) sobre
células de melanoma que se encuentran en un cultivo de células
cutáneas.
La figura 6 muestra el mismo detalle que la
figura 5, pero 3 horas después de la inyección.
Para la recolección manual se inmovilizaron boca
arriba con los dedos de una mano hembras subadultas o adultas de las
especies de arañas Sicarius Sicarius oweni, Sicarius testaceus,
Sicarius hahni o Sicarius albospinosus, teniendo al mismo
tiempo en la otra mano una jeringuilla estéril 2 ml Brauninject de
la empresa B. Braun) con aguja estéril puesta (20 ó 21 de Becton
Dickinson), la hora del día no tuvo ninguna importancia, a una
temperatura de entre 21 y 27 grados Celsius, con una humedad del
aire de entre 50 y 70%, se realizó una estimulación en los
quelíceros por medio del contacto con el lado romo de la aguja para
la descarga del veneno.
Al hacerlo se prefirió que el tiempo de
estimulación no fuera superior a 90 segundos, ya que en otro caso se
expondría al animal a un estrés innecesario. Después de que
apareciese la gota de veneno en las uñas del veneno, se extrajo ésta
con la jeringuilla a través de la aguja. Para cada animal se utilizó
una nueva jeringuilla con una nueva aguja. A continuación se volvió
a cerrar la aguja con la funda protectora de la aguja. La
jeringuilla cerrada junto con el veneno extraído se llevó
inmediatamente a continuación a un desecador. Éste se conservó
entonces durante como mínimo 12 horas en un arca congeladora a como
mínimo 14 grados Celsius bajo cero.
Después de sacarla del arca congeladora, se quitó
la funda protectora de la aguja de la jeringuilla con el veneno
completo congelado. La aguja se sumergió en disolvente, por ejemplo
disolvente de proteínas de la empresa Carl Roth GmbH & Co, KG
(disolvente para cromatografía de columna de proteínas: Tris/HCl
0,25 M, pH de 6,5 a 7,3, glicina 1,92 M, en agua destilada y
desionizada / a causa de la desnaturalización no se utiliza SDS en
polvo), y se aspiró 1 ml. De esta manera se obtuvo veneno en
solución. A continuación se quitó la aguja. Las soluciones de veneno
individuales preparadas de esa manera en jeringuillas (5 muestras)
se reunieron exprimiendo (jeringando) en un vial de teflón estéril y
limpio a temperatura ambiente. El vial de teflón cerrado se agitó a
continuación durante 30 segundos en un vortex sin formación de
espuma, obteniéndose una solución homogénea.
Después de la mezcla se introdujo toda la
solución a través de un embudo de plexiglás (para evitar la
contaminación) en una columna de plexiglás transparente puesta de
pie, la cual tenía un diámetro interior de 1,5 cm, un espesor de
pared de 2 mm y una altura de 50 cm, y se estrechaba por debajo en
forma de cono hasta 1,5 mm, estaba abierta, llena de 20 ml de gel
(empresa Sigma/Supelco, AcA 34; matriz: 3% de acrilamida/4% de
agarosa, intervalo de fraccionamiento (MW): proteína: de 20 a 350
kDa; límite de exclusión: 750 kDa; diámetro de las esférulas:
60-140 micras). La solución de veneno así
introducida atravesó el gel y al hacerlo empujó el tampón que se
encontraba en el gel.
Después de que la solución de veneno penetrase
completamente en el gel se añadieron a la columna 165 ml adicionales
de disolvente (Tris/HCl 0,25 M, pH de 6,5 a 7,3, glicina 1,92 M).
Este disolvente adicional empujó durante su recorrido a través del
gel la solución de veneno que se encontraba allí. Los primeros 15 ml
que salieron de la columna por debajo eran tampón residual y se
tiraron. Después de esos 15 ml se recogieron 40 fracciones de 4 ml
cada una. La separación en 4 ml en cada caso fue condicionada por
las propiedades físicas y químicas de las fracciones individuales,
determinadas por electroforesis, preferiblemente
SDS-PAGE. Como tampones de recubrimiento para la
protección de enlaces peptídicos y proteínas se utilizaron Roti Load
1+2 (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe: tampón de glicerol,
tampón de azul de bromfenol, tampón de fosfato, Roti Load 1 con
mercaptoetanol, Roti Load 2 sin mercaptoetanol). Las fracciones
individuales se recogieron por separado en viales de teflón de 5 ml
atornillables, estériles y limpios. El control de calidad de las
fracciones individuales se llevó a cabo por electroforesis.
Para las composiciones farmacéuticas conforme a
la invención se utilizaron diferentes combinaciones de las
fracciones 1 a 12. Estas fracciones contenían componentes
proteínicos de veneno de araña con un intervalo de pesos moleculares
de aproximadamente entre 75 y 175 kDa.
En la figura 1 se muestra una electroforesis
SDS-PAGE del cóctel completo de veneno de
Sicarius testaceus.
Con el fin de clarificar la estructura de las
sustancias se investigaron las fracciones individuales por medio de
una espectrometría HPLC-MS-MS y por
medio de una espectrometría DAD-UV (DAD o DADI:
Direct Analysis of Daughter Ions, análisis directo de iones
secundarios). Las sustancias conocidas no pudieron ser representadas
en un intervalo de pesos moleculares más elevado (a partir de 10.000
Da). En efecto, las determinaciones de la estructura básica indican
la pertenencia de las sustancias al tipo de los polipéptidos con
componentes tóxicos (= toxinas polipeptídicas), y por otro lado al
tipo de las fosfolipasas y las hialuronidasas.
Las fracciones con la misma composición se pueden
recoger juntas. Para la elaboración ulterior y el almacenamiento se
liofilizaron las fracciones individuales, por ejemplo con los
siguientes parámetros:
La fracción a liofilizar se enfrió a menos 22
grados Celsius en un vial de teflón abierto, cubierto de manera no
fija con lámina de aluminio perforada. Para una congelación completa
y segura de la muestra se observó un tiempo de enfriamiento de 11
horas. Después se aplicó un vacío de 0,200 mbar. Una vez alcanzado
el vacío se calentó la fracción a más 4 grados Celsius y se tuvo un
mínimo de 24 horas a esa temperatura manteniendo el vacío. Después
del proceso de liofilización se atornilló el vial de teflón con la
fracción liofilizada, cerrándolo de manera hermética al aire. El
tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente es de
aproximadamente 3 meses, a 7 grados Celsius aproximadamente 1 año, y
a 14 grados Celsius bajo cero aproximadamente 5 años.
En la siguiente tabla se pueden consultar las
sustancias del contenido de las fracciones, el efecto de esas
sustancias y el peso molecular de las fracciones.
Aplicando los parámetros de pureza indicados en
este ejemplo, este perfil de la elución y la composición de las
fracciones fueron en gran medida reproducibles.
Las fracciones 13-40 tienen un
peso molecular de hasta aproximadamente 350 kDa. Cuanto mayor es el
peso molecular de esos componentes del veneno, tanto más difícil es
ponerlos en solución para ulteriores investigaciones. Los primeros
ensayos, sin embargo, han mostrado que la fracción residual total
(13-40) puede, por ejemplo, lisar células del
periostio humano. Además de eso, en la comprobación del cóctel de
veneno residual en diferentes líneas de células humanas se puede
observar la degradación del colágeno. Además se obtuvo como
resultado acerca del efecto de la prueba que en ella se pueden
encontrar toxinas para insectos. La parte soluble de estas
fracciones tiene un efecto destructor sobre las líneas de células de
Drosophila, Schistocerca y Locusta. Conforme a estos ensayos
preliminares, ciertamente no es de esperar por el momento que una o
varias de las fracciones 13 a 40 presenten sustancias que puedan ser
utilizadas para composiciones farmacéuticas conforme a la invención,
pero según la invención no se excluye esa posibilidad.
Hasta el momento no es posible, a causa de los
múltiples tipos de patogénesis de las enfermedades tumorales,
ofrecer una terapia preventiva completa. Así, en el caso de tumores
diagnosticados tópicamente (primarios o subsiguientes) ocupa el
primer lugar la extirpación quirúrgica. Un problema que se presenta
aquí es la formación de metástasis, si al efectuar el corte el
tejido tumoral no eliminado por completo entra en contacto con el
aire. Este problema se puede resolver por medio de la aplicación de
composiciones farmacéuticas conforme a la invención sobre las
superficies de corte en la extirpación quirúrgica de un tumor.
Para las series de ensayos que se describen a
continuación se utilizaron las siguientes líneas de células:
- Cultivo celular mixto de Ca de mama: este tipo de células se cultivó extrayéndolo de una mezcla de células tumorales de 11 pacientes, y se observó desde 1989 en cultivos de larga duración y subcultivos.
- Ca de pulmón: 2 líneas celulares (un paciente y una paciente) identificadas por el Laboratorio KKH de Weissenburg y observadas desde 1987, asimismo como cultivo de larga duración y como subcultivo.
- Melanoma maligno: células identificadas de forma segura como tales, recibidas del paciente tras un acuerdo con él, observadas desde 1995, asimismo como cultivo de larga duración y como subcultivo.
- Adenoma de próstata: cultivo celular mixto de 3 pacientes observado desde 1988 en cultivo de larga duración y subcultivo. Hasta la fecha ningún resultado terapéutico in vitro.
- Ca de útero: cultivo celular mixto de 5 pacientes, en cultivo desde agosto de 2000.
- Ca de ovario: cultivo celular mixto de 3 pacientes, en cultivo desde agosto de 2000.
- AdenoCa: cultivo celular mixto de 3 pacientes, en cultivo desde agosto de 2000.
- Metástasis hepáticas: cultivo celular mixto de 2 pacientes, con origen en carcinoma bronquial de células pequeñas como tumor primario, en cultivo desde septiembre de 2000.
- Metástasis pulmonares: cultivo celular mixto de dos pacientes, con origen en Ca de mama como tumor primario; en cultivo desde agosto de 2000.
Al principio de la serie de ensayos se probó el
cóctel completo de veneno recolectado, fresco o disuelto, y su
efecto en función de la concentración sobre diferentes líneas de
células. Al hacerlo no se pudieron alcanzar resultados
satisfactorios, puesto que el veneno destruía siempre los cultivos
celulares enteros, disminuyendo el tiempo necesario para la
destrucción al aumentar la concentración del veneno utilizado.
En la figura 2 se representa a modo de ejemplo el
efecto del cóctel completo de veneno de Sicarius sobre un
cultivo mixto de células cutáneas sanas con células de melanoma. El
medio del cultivo era DMEM/Ham's F-12. Se reconocen
solamente manchas aisladas claras y oscuras, que representan los
restos de células. Son esos los únicos vestigios que se encuentran
en el fondo del frasco del cultivo unas 11 horas después de la
inyección del cóctel completo de veneno.
Realización del ensayo:
Para dar con la sustancia o sustancias
destructora/s se fraccionó el cóctel completo de veneno por medio de
cromatografía de columna, tal como se describe en el ejemplo 1, y se
llevó a cabo una determinación del peso molecular de los componentes
individuales por medio de electroforesis. Las fracciones
individuales (por término medio 40) fueron probadas comparativamente
en líneas del cultivo celular emparentadas, esto es, en líneas de
células sanas en comparación con las células correspondientes
tumorales/degeneradas en las mismas condiciones. Al hacerlo se
añadieron en cada caso en determinadas áreas células tumorales a los
cultivos de líneas de células sanas. A continuación se colocaron
(inyectaron) las fracciones, disueltas en una solución isotónica de
sal común, en las áreas con células tumorales, y para la comparación
también en áreas con células sanas, y se hizo un seguimiento con
microscopio óptico del efecto sobre las células tratadas.
Se pudo observar al hacerlo que aproximadamente
el 40% de las sustancias investigadas presentes en las fracciones
individuales presenta un efecto destructor de tejidos. Estas
sustancias pueden lisar además in vitro, dependiendo de la
concentración, determinadas áreas cubiertas de células tumorales.
Después de lavar el veneno con el cambio normal de medio, esas áreas
volvieron a cerrarse. Únicamente en 1 de los 8 cultivos (12,5%) se
produjo de nuevo a continuación una degeneración de las células.
Como ya se ha descrito antes, se comprobó que en
lo que se refiere a las sustancias de efecto antagónico se trata
esencialmente de las enzimas del tipo de las hialuronidasas y las
fosfolipasas.
Puesto que estos tipos de enzima están descritos
también como enzimas de penetración, y las fosfolipasas en especial
están presentes en el organismo también como sustancias inmunizantes
auxiliares contra las células genéticamente defectuosas, se llevaron
a cabo únicamente ensayos con combinaciones de sustancias de las
enzimas y toxinas peptídicas. Se experimentó aquí en primer lugar, a
causa de la mejor manipulabilidad, con las fracciones
1-12. Los ensayos tuvieron lugar como se ha descrito
en el ejemplo 2b), pero no se utilizaron fracciones individuales
sino combinaciones de fracciones. El disolvente fue una vez más una
solución isotónica de sal común.
La combinación de sustancias 1 contenía 10% en
peso de enz.Sic.2, 15% en peso de tox.Sic.5 y 75% en peso de una
solución isotónica de sal común.
El efecto de la combinación de sustancias 1 (cf.
también tabla 4, E 5) en células de Ca de mama que se encontraban en
células de tejido mamario fue de tal tipo que después de la
inyección de esa combinación de sustancias en el área de las células
de Ca de mama se destruyeron todas las células mamarias cancerosas,
mientras que las células de tejido mamario sanas fueron respetadas.
Se observó además que la superficie lisada por la combinación de
sustancias 1 volvía a crecer.
Debido a la estructura molecular y las
propiedades físicas de la combinación de sustancias 1, las enzimas,
a causa de sus propiedades naturales, rastrean y reconocen la célula
cancerosa. Se puede suponer que las toxinas peptídicas destruyen la
comunicación propia de las células cancerosas (destrucción de los
transmisores) al penetrar en la célula cancerosa. A causa de su
estructura molecular, la mayor parte de las toxinas peptídicas
presentes en la toxina de Sicarius atacan a las proteínas o a
compuestos similares a las proteínas. Las células cancerosas han
desarrollado una refinada defensa contra el sistema inmunológico
propio del cuerpo de su huésped/portador, en el que tienen una
importante función sustancias mensajeras como el interferón,
factores de necrosis de tumores y citocinas. Puesto que estas
sustancias mensajeras están presentes en un medio fluido, ofrecen
una superficie de ataque óptima a las toxinas peptídicas, utilizadas
asimismo en un medio fluido. Puesto que, según se puede comprobar,
las células cancerosas fuertemente dañadas por las toxinas
peptídicas conforme a la invención ya no son capaces de dividirse, y
las células cancerosas vecinas no pueden desarrollar mecanismos de
defensa contra las toxinas peptídicas, es de suponer que se ha
destruido la comunicación de las células cancerosas entre sí.
En el caso de las composiciones farmacéuticas que
contienen la combinación de sustancias 1, las enzimas se encuentran
relativamente muy concentradas desde el punto de vista cuantitativo
en relación con la composición total.
La combinación de sustancias 2 contenía 5% en
peso de enz.Sic.1, 1,5% en peso de tox.Sic.3 y 90% en peso de
solución isotónica de NaCl.
En el caso de la combinación de sustancias 2 se
puede conseguir una destrucción general de células óptima para ser
limitada espacialmente. Aquí las toxinas peptídicas elegidas pueden
destruir el tejido tratado. La adición de las enzimas naturales que
digieren péptidos controla el funcionamiento espacial y
temporalmente destructivo de la toxina peptídica.
En las figuras 3 y 4 se muestra el efecto de la
combinación de sustancias 2 sobre células de carcinoma de mama que
se encontraban en un cultivo de células de tejido mamario. En la
fotografía de la figura 3 se pueden reconoces células de tejido
mamario sanas, que se cultivaron en medio DMEM/Ham's
F-12. En la mitad izquierda de la imagen crecían al
principio células de carcinoma de mama, que han sido destruidas por
la combinación péptido-enzima y que se han lavado
transcurridas 48 horas con el segundo cambio de medio. Las células
sanas no han sido dañadas y empiezan a crecer hacia el interior del
espacio libre que se ha formado. La figura 4 muestra el mismo
detalle que la figura 3, pero 72 horas después de la inyección. La
superficie de la izquierda, anteriormente vacía, empieza de nuevo a
cerrarse con células sanas. (junto a la cruz). En primer lugar se
forma de manera reconocible una unión suelta de células, que después
se vuelve a completar con auténtico tejido.
Estos ejemplos muestran que se puede elegir la
utilización de las combinaciones 1 ó 2 en función del tipo, tamaño y
localización del tumor que se ha de eliminar. Las combinaciones de
sustancias 1 y 2 se pueden aplicar sobre las superficies de corte en
operaciones de tumores. La utilización de la combinación 1 puede
resultar ventajosa en operaciones en las que se ha de destruir
cuanto menos tejido sano colindante sea posible. La utilización de
la combinación de sustancias 2 puede resultar ventajosa en
operaciones en las que no se debe tomar tanto en consideración el
tejido circundante.
El cirujano puede hacer uso, al mezclar las
sustancias en relación con su calidad y cantidad, según el tipo y
localización del tumor, de las tablas 2 y 3, incluidas a modo de
ejemplo, las cuales contiene también otra combinación de sustancias
3.
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En las tablas 4 a 12 que se detallan a
continuación se representan los efectos de otras combinaciones de
sustancias sobre células de Ca de mama, células de Ca de pulmón,
células de melanoma, células de Ca de útero, células de Ca de
ovario, células de adenoCa, metástasis hepáticas con origen en
carcinoma bronquial de células pequeñas como tumor primario, y
metástasis pulmonares con origen en Ca de mama como tumor primario.
Los ensayos se llevaron a cabo como se ha descrito antes. Las
cantidades de sustancias utilizadas fueron en estos ensayos: 2 mg de
toxina peptídica y 2 mg de enzima / 100 ml de solución de sal común
al 0,9%.
A modo de ejemplo se muestra en las figuras 5 y 6
el efecto de la combinación de sustancias (tox.Sic.2 + enz.Sic.4) de
la tabla 7 sobre células de melanoma. La fotografía muestra un
detalle de un cultivo de células cutáneas, cultivadas en
DMEM/Ham's/F12, en el que en diferentes lugares se inocularon
células de melanoma de la misma persona, 30 minutos después de
inyectar la combinación toxina peptídica-enzima. En
el centro de la imagen se pueden ver todavía células irregulares de
melanoma, todas las cuales están en vías de lisis después de la
inyección de veneno. Las células cutáneas redondas aisladas, sanas,
no fueron atacadas por la mezcla toxina
peptídica-enzima, y por eso son todavía visibles. La
figura 6 muestra el mismo detalle de la figura 5, pero 3 horas
después de la inyección. Se puede reconocer fácilmente que se han
disuelto todas las células tumorales. En la frontera entre el área
tumoral y el tejido sano solamente se pueden reconocer todavía
células cutáneas sanas, y en la antigua área tumoral se pueden
reconocer células cutáneas sanas aisladas.
Se comprobó además que en los cultivos de larga
duración (capa de células más espesa in vitro) también se
consiguió una destrucción de tejido tumoral en las capas inferiores
de células cuando las enzimas se añadieron en una concentración más
alta e hicieron evidentemente más penetrable el tejido para el
veneno, y debido a su especificidad convirtieron las células
genéticamente defectuosas en atacables por el veneno.
En las tablas 4 a 12 se representan de manera
resumida los resultados del efecto de diferentes combinaciones de
sustancias sobre diferentes líneas de células.
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Se llevaron a cabo otros ensayos con el fin de
comprobar si en una concentración prefijada de toxina peptídica y
enzima determinadas fracciones de enzima neutralizaban determinadas
fracciones de toxina peptídica.
Realización del ensayo:
En los ensayos resumidos en las siguientes tablas
13 y 14 se utilizaron células de tejido mamario, células de Ca de
mama, células cutáneas, células madre, células hepáticas, células
pulmonares y células de Ca de pulmón, así como un cultivo celular
mixto, estimulado con PHA, de diferentes líneas de células
cutáneas.
Las células investigadas se mezclaron con 3 ml de
una solución de 2 mg de enzima en 100 ml de medio (DMEM/ Ham's
F-12 con aprox. 1,2% de glutamina, 2,5% de
penicilina/estreptomicina y 10% de suero fetal bovino).
Transcurridas 12 horas se añadieron 3 ml de una solución de toxina
peptídica (2 mg de toxina peptídica en 100 ml de solución de sal
común al 0,9%). Se observaron con microscopio óptico los efectos
sobre las células que se encontraban en el frasco de cultivo
celular.
Cuando tuvo lugar una neutralización/bloqueo de
las toxinas peptídicas se reconoció en el hecho de que la toxina
peptídica no tuvo ningún efecto reconocible sobre las células que se
encontraban en el cultivo porque fue neutralizada inmediatamente por
la enzima. En otro caso se produjo una destrucción o lisis de las
células.
Los resultados representados de forma resumida en
las siguientes tablas indican que en las concentraciones elegidas y
las líneas celulares antes indicadas determinadas enzimas
neutralizan siempre específicamente las mismas toxinas peptídicas.
En estas proporciones de concentración una utilización de estas
combinaciones en las líneas celulares mencionadas parece, así pues,
ventajosa, ya que por este medio se puede evitar una amplia
extensión espacial de la toxina peptídica. Cuando se modifican las
concentraciones de enzima y toxina peptídica y se utilizan otras
líneas de células los resultados pueden ser diferentes.
Tablas 13 y
14
\vskip1.000000\baselineskip
En ensayos ulteriores se pudo determinar que
también se pueden utilizar como antagonistas para toxinas concretas
de Sicarius fosfolipasas específicas del cóctel completo de
veneno de serpientes.
Es sabido que también se encuentran enzimas del
tipo de la hialuronidasa y la fosfolipasa (por ej., fosfolipasa A1,
fosfolipasa D-B, fosfolipasa E) en el cóctel
completo de veneno de serpientes (Hankin E.H. (1899): The action of
cobra poison on the blood (Path & Bact). Original in II. of
Path. and Bact. 1897 / Hankin E.H. (1900): The haemolitic action of
snake toxins and toxic p. sera, 450. Med. Gazette / Dennys G.W.P.
(1916): Experiments with snake venoms and some important notes. Med.
Gazette / Ardeshire K. (1918): Bite from Echis
carinata-recovery (corr.). Med. Gazette / Neuberg
Rosenberg (1907): Lipolyse, Agglutination und Hämolyse. B. kl. W. /
Lamb and Hunter (1904-1907): Action of venoms of
different species of poisonous snakes and the nervous system. Lancet
/ Lindemann W. (1898): Über die Sekretionserscheinungen der
Giftdrüse der Kreuzotter. Arch. f. mikr. Anat.) y ensayos propios
(Burda R., Richter R., Schrottenloher E., Weickmann D. (2001):
Visueller Schnellnachweis für Enzyme in Schlangengiften unter
Zuhilfenahme eines Schwarzwei\betafilmes, en prensa).
Puesto que los venenos de serpiente se pueden
obtener en cantidades mayores y las enzimas contenidas en los mismos
tienen una más fuerte representación porcentual, se probó el efecto
antagónico de fracciones individuales de enzima procedentes de
venenos de serpientes sobre las toxinas de Sicarius. Al
hacerlo se consiguieron los siguientes resultados:
Tox.Sic. se define en cada caso como
antes.
Enz.Atractaspis1 representa una
fosfolipasa del tipo A procedente del veneno del Atractaspis
bibronil.
Fos.Bit.A2 representa la fosfolipasa A2
procedente de los venenos de las poblaciones oscuras sudafricanas de
Bitis arietans (eventualmente otra especie, propuesta como
antes la Bitis lachesis).
Fos.Bit.D representa la fosfolipasa D
procedente de los venenos de las poblaciones oscuras sudafricanas de
Bitis arietans (eventualmente otra especie, propuesta como
antes la Bitis lachesis).
Fos.Vip.asp.A1 representa la fosfolipasa
procedente de los venenos de la Vipera aspis zinnikeri.
Aquí se probó, entre otras, una toxina de la
Sicarius oweni con aproximadamente 69 kDa, la cual presenta
propiedades destructoras de Ca de mama semejantes a las de la
tox.Sic.1 con aprox. 72 kDa y la tox.Sic.5 con aprox. 124 kDa de
Sicarius testaceus. Como fosfolipasa para la combinación
resulta apropiada la fracción de enzima que en la Sicarius
oweni circula a través de la columna después de aprox.
21-24 ml. La designación de las fracciones se
realizó como en el caso de Sicarius testaceus.
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\vskip1.000000\baselineskip
Aquí se utilizó de manera especial para células
de Ca de pulmón de células grandes una toxina peptídica procedente
del cóctel completo de veneno con aproximadamente 95 kDa y, como
fosfolipasa, la fracción de enzima que en el caso de la
Loxosceles laeta circula a través de la columna después de
37-40 ml.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La enz.Sic.2, tal como se ha descrito antes, es
selectiva para células de Ca de mama (ver combinación de sustancias
1 y tabla 4). Por otro lado, se ha descrito también la enz.Sic.2
como bloqueadora de la tox.Sic.5 (ver tabla 13). Las tablas 4 y 13,
sin embargo, se basan en dos ensayos completamente diferentes:
La tabla 4 describe la combinación en relación
con la destrucción selectiva de células tumorales in vitro.
Aquí las cosas ocurren de tal modo que la enz.Sic.2 encuentra las
células de cáncer de mama degeneradas, desagrega la pared celular y
la hace accesible a la toxina peptídica, de manera que la tox.Sic.5
puede infiltrarse en las células y destruirlas. Aquí las dos
sustancias no se mezclan entre sí hasta poco antes de su adición al
cultivo celular.
La tabla 13 describe ciertamente la misma
combinación de sustancias utilizadas, pero mezcladas con una
separación temporal de 12 horas (primero la enz.Sic.2, después la
tox.Sic.5).
Los resultados de estos ensayos no se
contradicen, ya que no se puede comparar la combinación conforme al
ensayo 5, tabla 4, con la prueba de bloqueo
enzima-péptido con desplazamiento en el tiempo, aquí
descrita, conforme a la tabla 8. Evidentemente, la enz.Sic.2 también
tiene, en las condiciones de la prueba de bloqueo
enzima-péptido, un efecto antagónico con respecto a
la tox.Sic.5.
Se puede decir en general que en lo que respecta
a las hialuronidasas y fosfolipasas se trata en cada caso de un
grupo o familia de enzimas (Cantore G., Bettini S. (1958):
Contributo allo studio dell azione farmacologica dell veneno di
L. tredecimguttatus Rossi. II Azione sulla musculatura
bronchiale. Riv. Parasit. 19:297), dentro del cual los miembros
individuales presentan diferentes funcionamientos en relación con la
calidad de las sustancias que se han de degradar.
Hasta el momento se han descrito esas
hialuronidasas y fosfolipasas como enzimas de penetración (Heitz J.,
Norment B. (1974): Characteristics of an alcaline phosphatase
activity in brown recluse venom. Toxicon 12:181 / Bemheimer A.,
et al (1985): Comparative toxinologie of Loxosceles
reclusa and Corynebacterium pseudotuberculosis. Science
228:590-591).
En el marco de esta invención se ha evidenciado
que componentes individuales utilizados de estos grupos de enzimas
actúan antagónicamente sobre las toxinas peptídicas utilizadas,
limitándose la difusión temporal y espacial de la toxina
peptídica.
La comprobación del efecto antagónico se llevó a
cabo a través de la determinación del peso molecular de las
sustancias utilizadas en una comparación
antes-después por medio de la electroforesis que ya
hemos descrito. En el caso de un efecto antagónico falta la banda de
la toxina peptídica, antes presente.
En un ensayo con un cultivo celular mixto de Ca
de mama y células de tejido mamario sanas se pudo comprobar, después
de la adición dirigida de tox.Sic.1 por medio de jeringuilla muy
fina en zonas marcadas ricas en células de Ca de mama, lo
siguiente:
La tox.Sic.1 se difunde anularmente en torno a la
zona de la inyección a lo largo de unas 10 horas de manera
relativamente regular. En este proceso se lisan tanto las células
sanas como las células tumorales. Este proceso se puede observar con
facilidad a través de un microscopio invertido. Transcurridas esas
10 horas se produce una clara desaceleración de la velocidad de
difusión de la tox.Sic.1, pudiéndose observar ulteriormente bajo el
microscopio invertido el efecto destructor específico de la
tox.Sic.1 a intervalos de 1, 2 y 7 días, ya que el área de la
destrucción de células seguía aumentando a esas alturas.
Como ya se ha representado en las tablas 13 y 14,
la tox.Sic.1 se combinó con 6 diferentes enzimas de Sicarius.
Al hacerlo se pudo constatar que al añadir enz.Sic.3 el efecto
lisante de células de la tox.Sic.1 se detenía por completo después
de 9 horas. La electroforesis del medio y de un lisado de células no
produjo ninguna banda en los 72 kDa (peso molecular de la
tox.Sic.1).
Por medio de una prueba de Ouchterlony modificada
se pudo representar además un "efecto antígeno/anticuerpo" de
la enz.Sic.3 sobre la tox.Sic.1, esto es, un enlace de la enz.Sic.3
con la tox.Sic.1. Se pudo observar adicionalmente que después de la
neutralización de la tox.Sic.1 por la enz.Sic.3 las áreas lisadas
volvían a cerrarse.
Claims (26)
1. Composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades tumorales, que contiene en una cantidad
farmacéuticamente efectiva:
- a)
- como mínimo una toxina peptídica, y
- b)
- como mínimo una sustancia de efecto antagónico con respecto a la anterior y/o como mínimo un penetrante,
en la que como mínimo la toxina
peptídica procede del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante proceden del veneno de arañas
de la familia de las
Sicariidae.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que contiene
una o varias otras sustancias procedentes del veneno de arañas de la
familia de las Sicariidae.
3. Composición farmacéutica según las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada por el hecho de que la
toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico con respecto a
ella y/o el penetrante proceden del veneno de las especies de arañas
de Sicarius, Loxosceles, Scytodes y/o Drymusa.
4. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que las especies de arañas de Sicarius son Sicarius oweni,
Sicarius testaceus, Sicarius hahni y Sicarius
albospinosus; las especies de arañas de Loxosceles son
Loxosceles rufescens, Loxosceles reclusa y Loxosceles
laeta; y/o las especies de arañas de Scytodes son Scytodes
thoracica, Scytodes rufa y Scytodes longipes.
5. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que la sustancia de efecto antagónico y/o la enzima penetrante
proceden de un organismo diferente de las arañas de la familia de
las Sicariidae.
6. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que contiene además como toxina peptídica, como mínimo, un veneno
de serpiente, preferentemente el veneno Captopril del crótalo.
7. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que contiene como sustancia de efecto antagónico y/o como
penetrante, como mínimo, una hialuronidasa procedente de venenos de
serpientes, preferentemente de venenos de cobras, o como mínimo una
fosfolipasa procedente de Actrataspis bibronil, Bitis
arietans o Vipera aspis zinnikeri.
8. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que la sustancia de efecto antagónico y/o el penetrante son una
fosfolipasa o una hialuronidasa o una combinación de ambas
sustancias.
9. Composición farmacéutica según una o varias de
las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el hecho
de que el penetrante es una fosfolipasa.
10. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante se han obtenido del veneno de
arañas por medio de un procedimiento de fraccionamiento.
11. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante se han obtenido del veneno de
arañas por medio de cromatografía en gel, HPLC, cromatografía de
afinidad y/o cromatografía por intercambio iónico.
12. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante se han obtenido de la
siguiente manera:
- utilizando una columna con un diámetro interior de 1,5 cm y una altura de 50 cm, que por debajo se estrecha en forma de cono hasta 1,5 mm y que está llena de 20 ml de un gel para cromatografía en gel AcA 34, matriz: 3% de acrilamida / 4% de agarosa, intervalo de fraccionamiento: de 20 a 350 kDa, límite de exclusión: 750 kDa, diámetro de las esférulas: 60-140 \mum, se añade sobre el gel, en un estado homogéneo, veneno de araña procedente de Sicarius oweni, Sicarius testaceus, Sicarius hahni o Sicarius albospinosus en Tris/HCl 0,25 M, pH de 6,5 a 7,3, y glicina 1,92 M, en agua destilada y desionizada, y, cuando la solución de veneno ha recorrido el gel, y se han añadido 165 ml de una solución de Tris/HCl 0,25 M, pH de 6,5 a 7,3, y glicina 1,92 M en agua destilada y desionizada, y han sido expulsados los primeros 15 ml de eluato, y se han reunido fracciones de 4 ml cada una, las toxinas peptídicas se encuentran en las fracciones 1, 2, 4, 7, 9 y 10, y las sustancias de efecto antagónico y/o los penetrantes se encuentran en las fracciones 3, 5, 6, 8, 11 y 12.
13. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que contiene una toxina peptídica y una sustancia de efecto
antagónico con respecto a ella y/o un penetrante que proceden de
diferentes fracciones del veneno de araña.
14. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la toxina peptídica y la sustancia de efecto antagónico
con respecto a ella y/o el penetrante están presentes en una
cantidad tal que se da con respecto a las células tumorales un
efecto destructor por parte de la toxina peptídica y la sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante.
15. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la cantidad se elige de tal manera que queda asegurada
una difusión en el tejido controlada en el espacio y/o en el
tiempo.
16. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la cantidad de toxina peptídica y de sustancia de
efecto antagónico y/o de penetrante se elige dependiendo del tumor
que ha de ser tratado.
17. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que contiene sustancias portadoras y auxiliares habituales
y/o otros principios activos.
18. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que contiene, como sustancias portadoras y auxiliares
habituales, soluciones isotónicas, soluciones de proteínas,
soluciones de aminoácidos y/o soluciones germicidas, preferentemente
solución de Ringer, solución de NaCl al 0,9%, solución de albúmina
humana y/o solución de glutamina, y por el hecho de que contiene,
como otros principios activos, antibióticos, antimicóticos, agentes
contra la tuberculosis, agentes contra los parásitos, aminoácidos,
enzimas que favorecen la cicatrización de las heridas, sustancias
inhibidoras de la mitosis y/o citostáticos.
19. Composición farmacéutica según una o varias
de las anteriores reivindicaciones, caracterizada por el
hecho de que la preparación farmacéutica contiene un derivado de la
toxina peptídica y/o de la sustancia de efecto antagónico y/o del
penetrante, y/o de que la toxina peptídica y/o la sustancia de
efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante se fabrican
por síntesis química o por métodos biotecnológicos recombinantes, se
corresponden en cuanto a su acción con las toxinas contenidas en el
veneno de arañas de la familia Sicariidae, o con las
sustancias de efecto antagónico con respecto a las anteriores y/o
con los penetrantes, y sus derivados.
20. Procedimiento para la fabricación de una
composición farmacéutica que contiene, en cantidad farmacéuticamente
activa, como mínimo una toxina peptídica y como mínimo una sustancia
de efecto antagónico con respecto a ella y/o como mínimo un
penetrante, en el que la toxina peptídica procede del veneno de
arañas de la familia de las Sicariidae, y opcionalmente la
sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante
proceden del veneno de arañas de la familia de las
Sicariidae, con las siguientes etapas:
- -
- obtención de una mezcla bruta de venenos de araña por procedimientos conocidos por sí mismos, y fraccionamiento de la mezcla con el fin de obtener la toxina peptídica, y opcionalmente la sustancia de efecto antagónico con respecto a ella y/o el penetrante, y opcionalmente otras sustancias, en fracciones lo más separadas entre sí que sea posible;
- -
- combinación de diferentes fracciones de la toxina peptídica con fracciones que contienen sustancias de efecto antagónico con respecto a ella y/o penetrantes, o con sustancias de efecto antagónico y/o penetrantes procedentes de otros organismos, con el fin de obtener una composición farmacéuticamente activa.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
caracterizado por el hecho de que la mezcla bruta de venenos
de araña se obtiene de arañas hembra de la familia de las
Sicariidae.
22. Procedimiento según las reivindicaciones 20 y
21, caracterizado por el hecho de que la mezcla bruta de
venenos de araña se obtiene por medio de recolección manual.
23. Procedimiento según una o varias de las
anteriores reivindicaciones, caracterizado por el hecho de
que la mezcla bruta de venenos de araña se homogeneiza antes del
fraccionamiento.
24. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 20 a 23, caracterizado por el hecho de que
antes de su elaboración posterior para convertirlas en una
composición farmacéutica, las fracciones se ultracongelan, y después
preferiblemente se liofilizan.
25. Utilización de composiciones farmacéuticas
según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19 en medicina.
\newpage
26. Utilización de composiciones farmacéuticas
según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19 para el
tratamiento de enfermedades tumorales y/o para el tratamiento
suplementario en operaciones de tumores.
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