ES2738287T3

ES2738287T3 - Inhibidor de la formación de trampas extracelulares en leucocitos

Info

Publication number: ES2738287T3
Application number: ES14782228T
Authority: ES
Inventors: Junichi Hirahashi; Yasuteru Urano; Koushu Okubo; Mako Kamiya; Shinji Kagaya
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: JPWO2014168253A1; CN105101989B; CA2911483A1; US20160067315A1; CA2911483C; EP3017824A4; EP3017824B1; JP6327626B2; WO2014168253A1; US20220031813A1; EP3017824A1; CN105101989A

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos, la composición comprende lactoferrina, en donde la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en poliangeítis microscópica, angeítis granulomatosa alérgica, reacción local de Shwartzman, lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión y coagulación intravascular diseminada.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidor de la formación de trampas extracelulares en leucocitos

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos, la composición comprende lactoferrina, en donde la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en poliangeítis microscópica, angeítis granulomatosa alérgica, reacción local de Shwartzman, lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión y coagulación intravascular diseminada.

Antecedentes de la invención

Las NET (trampas extracelulares de neutrófilos) son estructuras extracelulares que liberan estructuras tipo malla, capturan bacterias, eumicetos, helmintos y virus, y exhiben una acción antibacteriana cuando los neutrófilos se activan por la contaminación con bacterias, la forma de los neutrófilos segmentados y la distribución de cromatina son poco claras, luego, la membrana nuclear se extingue, el citoplasma y los componentes granulares existen en la estructura de la cromatina en un estado mixto y la membrana celular se rompe. Las NET implican principalmente ADN, y la histona 3 (H3) y la elastasa desempeñan un papel importante en la acción de las NET. La formación de las NET recoge localmente moléculas antibacterianas que destruyen eficazmente microorganismos. La formación de las NET provoca la NETosis de los neutrófilos, sin embargo, el mecanismo molecular de la misma no se ha aclarado mucho. Las NET se forman por la estimulación de los neutrófilos con TNF-a, PMA, LPS, IL-8 o similares, y la NETosis provocada en el momento de la formación de las NET exhibe una forma diferente de la necrosis o apoptosis conocida clásicamente que provoca la activación de la caspasa o la fragmentación de ADN. Cuando lo neutrófilos son estimulados por LPS o PMA, se provoca autofagia y, al mismo tiempo, se genera oxígeno activado. Esto provoca degradación de la membrana nuclear, descondensación de la cromatina y citrulinación de la histona y, por lo tanto, se provoca NETosis (Documentos no patente 1 y 2).

Se ha documentado que, junto con la formación de las NET, muchas proteínas, especialmente, proteínas antibacterianas contenidas en gránulos azurófilos o gránulos tipo II, se secretan desde los neutrófilos por medio de desgranulación y también se secretan proteínas relacionadas con la estructura (Documento no patente 2). Estas proteínas también se denominan "proteínas constructoras de NET". Se documentan como proteínas de este tipo la elastasa neutrófila, histona, mieloperoxidasa, F-actina, lactoferrina, metaloproteasa de matriz 9, LL37, catepsina G, BPI, proteinasa 3, calprotectina, azurocidina, lisozima C, defensina, catalasa y similares (Documento no patente 3). La lactoferrina está contenida en el gránulo tipo II en los neutrófilos. Los neutrófilos forman las NET y, por último, provocan desgranulación, y la lactoferrina se libera al exterior de los neutrófilos (Documento no patente 1).

La lactoferrina se conserva bien en los mamíferos y existe una pequeña diferencia en la función de la lactoferrina entre diferentes especies de mamífero. Hoy en día, la lactoferrina es objeto de atención como proteína contenida en la leche para la actividad fisiológica de la misma, y está disponible comercialmente. Se debería tener en cuenta que se ha documentado que la leche no tiene un efecto inhibitorio en la formación de las NET de neutrófilos bovinos (Documento no patente 4).

Las NET están implicadas en el aumento de tamaño y crecimiento de los trombos. Cuando se liberan las NET, la histona contenida en las mismas tiene una acción de condensación de las plaquetas. Por lo tanto, los trombos plaquetarios se forman con base en las NET. La elastasa neutrófila o la catepsina G contenidas en las NET degradan el inhibidor de la vía del factor tisular y promueven la reacción de coagulación de la sangre. Las NET desempeñan un papel en el mantenimiento de los microorganismos y similares en un sitio local por medio de una acción de este tipo (Documento no patente 5).

La acción de las NET, que van a exhibir originalmente, es capturar microorganismos externos tales como bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, eumicetos y similares, y confinar y destruir los microorganismos de este tipo en el sitio local. Debido a tener una acción de este tipo, las NET se ven con frecuencia en enfermedades infecciosas. Sin embargo, también se ha documentado que, cuando una enfermedad infecciosa se vuelve crónica, las NET se forman incluso en ausencia de microorganismos externos. Se sabe que el lupus eritematoso sistémico (LES), que es una de las enfermedades autoinmunitarias crónicas y resistentes al tratamiento, forma un anticuerpo contra su propio ADN o proteínas relacionadas y provoca así inflamación en los tejidos u órganos. Un descubrimiento característico con respecto al LES es que muchos neutrófilos están presentes en el sitio de la lesión. Se sabe que, en el suero de un paciente con LES, el péptido antibacteriano LL37 y los ADN existen en las NET (Documentos no patente 6 y 7). Una sustancia de este tipo es reconocida por las células B como un antígeno y se produce así un anticuerpo. Los neutrófilos en un paciente con LES tienen más probabilidades de provocar NETosis que los neutrófilos en una persona sana (Documento no patente 6). Se considera que estos factores inducen una inflamación crónica. Se ha documentado que el fragmento de IgG en el suero de un paciente con una vasculitis asociada al anticuerpo frente al citoplasma de los neutrófilos (ANCA), que es una enfermedad provocada por un anticuerpo, tiene una capacidad para formar las NET de neutrófilos que es aproximadamente el doble de la capacidad de una persona sana (Documentos no patente 8 y 9).

La relación entre la formación de las NET y las enfermedades ha sido el objeto de atención recientemente, más específicamente, desde que se realizó el informe de Brinkman et al. en 2004 (Documento no patente 1). En el futuro, se revelarán novedosamente enfermedades provocadas por la formación de las NET. Aunque la formación de las NET desempeña un papel importante en la protección de un organismo vivo contra una infección, la inhibición de la formación de las NET se considera necesaria para mejorar algunos estados de enfermedades como se describió anteriormente.

Una sustancia que inhibe la formación de las NET, por ejemplo, estreptococo, que es una bacteria grampositiva tal como Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus o similares, se ha documentado que expresa ADNasa extracelularmente. Como sustancias que suprimen la producción de anticuerpos contra histona o superóxido, se han documentado el cloruro de difenilenodonio (DPI) y la catalasa (Documento no patente 10).

Además, se sabe que, por ejemplo, la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) influye en la NETosis (Documento no patente 11) y que el fenómeno en el que los neutrófilos forman las NET y se someten a destrucción, concretamente, NETosis, es un proceso diferente a la apoptosis o necrosis (Documento no patente 10).

Existe una técnica anterior para prevenir una enfermedad autoinmunitaria tal como diabetes tipo I o artritis reumatoide por el uso de fragmentos de proteína básica derivada de la leche como ingrediente activo (Documento patente 1). Esta técnica anterior se especializa en el ajuste de inmunocitos, principalmente, linfocitos, supresión de citocina inflamatoria y similares, pero no con respecto a la acción de inhibición de la formación de las NET.

Hasta ahora, no se ha documentado ningún fármaco terapéutico para una enfermedad provocada por la formación de las NET.

Lista de referencias

Literatura patente

Documento patente 1: Solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2008-189637

Literatura no patente

Documento no patente 1: Volker Brinkmann et al., 2004, Science, 303:1532-1535

Documento no patente 2: Q Remijsen et al., 2011, Cell Death and Differentiation, 18: 581-588

Documento no patente 3: Maren von Koeckritz-Blickwede et al., 2008, Blood, 111:3070-3080

Documento no patente 4: John D. Lippolis et al., 2006, Veterinary Immunology and Immunopathology, 113:248-255 Documento no patente 5: Fuchs TA et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA, 107:15880-15885

Documento no patente 6: Garcia-Romo GS et al., 2011 Sci Transl Med, 3:73ra20

Documento no patente 7: Lande R et al., 2011 Sci Transl Med, 3:73ra19

Documento no patente 8: Kessenbrock K et al., 2009, Nat Med, 6:623-625

Documento no patente 9: Bosch X, 2009, J Am Soc Nephrol, 8:1654-1656

Documento no patente 10: Tobias A. Fuchs et al., 2007, J Cell Biol, 176:231-241

Documento no patente 11: K. Akong-Moore et al., 2012, PLOS ONE, 7:e42984

Documento no patente 12: Makoto Naito et al., 2010, Seibutsu Shiryo Bunseki (Analysis of Biological Samples) 33:329-338

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un fármaco terapéutico fundamental para una enfermedad provocada por la formación de trampas extracelulares de leucocitos, especialmente, un fármaco terapéutico inocuo y eficaz, y también un método terapéutico, adecuado para la conservación de la remisión (supresión de la recaída) realizado durante un largo periodo de tiempo.

Como resultado de estudios activos hechos con el fin de resolver el problema descrito anteriormente, los autores de la presente invención encontraron que la lactoferrina exhibe un efecto supresor significativo en la formación de NET y realiza una terapia fundamental de enfermedades relacionadas con las NET. También se ha encontrado que la presente invención mejora significativamente la tasa de supervivencia de animales modelo para vasculitis asociada a ANCA, reacción local de Shwartzman y coagulación intravascular diseminada (CID), dichas enfermedades son provocadas por la formación de las NET.

La presente invención se define en las reivindicaciones anejas.

También se describe lo siguiente.

[1] Una composición para inhibir la formación de trampas extracelulares de leucocitos, que comprende lactoferrina.

[2] La composición según [1] anterior, en donde la lactoferrina se encuentra en una cantidad de entre 0,001 a 10 g/kg/día.

[3] La composición según [1] anterior, en donde la lactoferrina deriva de seres humanos.

[4] La composición según [1] anterior, en donde la lactoferrina es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (c):

(a) una proteína formada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5;

(b) una proteína formada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, en la que entre 1 a 66 aminoácidos se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden, la proteína tiene actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos; y

(c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 90 % o superior con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, la proteína tiene actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos.

[5] La composición según cualquiera de [1] a [5] anterior, en donde los leucocitos son uno seleccionado de entre el grupo que consiste en neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos.

[6] La composición según [5] anterior, en donde los leucocitos son neutrófilos.

[7] Una composición para tratar una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos, la composición comprende lactoferrina.

[8] La composición según [7] anterior, en donde la lactoferrina se encuentra en una cantidad de entre 0,001 a 10 g/kg/día.

[9] La composición según [7] anterior, en donde la lactoferrina deriva de seres humanos.

[10] La composición según [7] anterior, en donde la lactoferrina es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (c):

[11] La composición según cualquiera de [7] a [10] anterior, en donde los leucocitos son uno seleccionado de entre el grupo que consiste en neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos.

[12] La composición según cualquiera de [7] a [11] anterior, en donde la enfermedad es una seleccionada de entre el grupo que consiste en vasculitis asociada a ANCA, lupus eritematoso sistémico, reacción local de Shwartzman, lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión y coagulación intravascular diseminada.

[13] La composición según cualquiera de [7] a [12] anterior, que se encuentra en forma de alimento.

[14] La composición según cualquiera de [7] a [12] anterior, que se encuentra en forma de agente de inyección.

[15] La composición según cualquiera de [7] a [13] anterior, que es administrable por vía oral.

[16] Un método para inhibir la formación de trampas extracelulares de leucocitos, el método comprende administrar lactoferrina a un paciente.

[17] Un método terapéutico para una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos, el método terapéutico comprende administrar lactoferrina a un paciente.

Se describe un método terapéutico con pocos efectos secundarios para una enfermedad provocada por la formación de trampas extracelulares de leucocitos. El método tiene pocos efectos secundarios y, por lo tanto, tiene la ventaja de ser utilizable de manera segura por una amplia gama de pacientes y personas que tienen la posibilidad de convertirse en pacientes.

Las composiciones para inhibición y tratamiento según la presente descripción son utilizables por una amplia gama de sujetos que incluye sujetos con depresión del sistema inmunitario tales como personas mayores, pacientes con cáncer y similares, y sujetos que tienen enfermedades infecciosas o complicaciones o que tuvieron tuberculosis. La presente descripción proporciona un fármaco terapéutico y un método terapéutico para una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos que tienen pocos efectos secundarios, incluso si se utilizan durante un largo periodo de tiempo. Las composiciones para inhibición y tratamiento según la presente descripción son especialmente útiles como fármaco que es utilizable durante un largo periodo de tiempo para tratar las enfermedades descritas anteriormente, como fármaco que suprime la recaída después de un síntoma agudo de un sujeto está en remisión, o como fármaco terapéutico para las enfermedades descritas anteriormente que se vuelven crónicas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1-A es un gráfico que muestra una capacidad de lactoferrina bovina de inhibir la formación de NET.

La Figura 1-B es un gráfico que muestra una capacidad de lactoferrina humana de inhibir la formación de las NET. La Figura 1-C proporciona micrográficos de fluorescencia que muestran cómo la lactoferrina humana inhibe la formación de las NET.

La Figura 1-D es un gráfico que muestra el efecto, proporcionado por lactoferrina humana, de suprimir la liberación de ADN junto con la formación de las NET.

La Figura 1-E proporciona micrográficos de electrones que muestran cómo la lactoferrina humana suprime la liberación de ADN junto con la formación de las NET.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto, proporcionado por lactoferrina humana, de suprimir la liberación de ADN junto con la formación de las NET.

La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto, proporcionado por medio de administración oral de lactoferrina bovina, de aumentar la tasa de supervivencia de animales modelo de vasculitis asociada a ANCA.

La Figura 4-A es un gráfico que muestra el efecto, proporcionado por medio administración oral de lactoferrina bovina, de disminuir el título de anticuerpos de MPO-ANCA en la sangre de animales modelo de vasculitis asociada a ANCA.

La Figura 4-B es un gráfico que muestra el efecto, proporcionado por medio de administración oral de lactoferrina bovina, de disminuir la concentración de ADN en la sangre de animales modelo de vasculitis asociada a ANCA. La Figura 4-C proporciona micrográficos que muestran cómo mejora el estado de enfermedades de tejidos renales de animales modelo de vasculitis asociada a ANCA por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 5-A proporciona fotografías que muestran cómo mejora la hemorragia subcutánea de animales modelo de RLS por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 5-B es un gráfico que muestra, con puntuaciones, la mejora en la hemorragia subcutánea de los animales modelo de RLS realizada por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 5-C proporciona micrográficos que muestran cómo mejoran los tejidos cutáneos de animales modelo de RLS por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 6-A es un gráfico que muestra que la concentración de ADN en bolsas de aire en los animales modelo de RLS disminuye por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 6-B proporciona micrográficos que muestran cómo la liberación de ADN en las bolsas de aire en los animales modelo de RS se suprime por medio de administración oral de lactoferrina bovina.

La Figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de la tasa de supervivencia/prolongación de la vida después de la administración de histona.

La Figura 8 es un gráfico que muestra el efecto de la hemostasia en ratones modelo de trombos inducidos por histona, proporcionado por la administración de lactoferrina en las colas de los mismos.

La Figura 9 proporciona fotografías que muestran el efecto, proporcionado por lactoferrina, de suprimir la hemorragia en los tejidos pulmonares de los ratones modelo de trombos inducidos por histona.

La Figura 10 es un gráfico que muestra que la inhibición de la formación de las NET es una actividad específica a la lactoferrina.

Descripción de las realizaciones

De aquí en adelante, la presente invención se describirá más detalladamente.

1. Composición para inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos

En una primera realización, la presente descripción proporciona una composición que contiene lactoferrina para inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos (de aquí en adelante, denominada como la "composición para inhibición según la presente descripción").

Se ha documentado que las trampas extracelulares se forman por muchos tipos de leucocito. Por ejemplo, se ha documentado que las trampas extracelulares se forman por neutrófilos (Brinkmann, V., et al., Science 2004; 303:1532-1535), granulocitos basófilos (Yousefi, S., et al., Nat Med 2008; 14:949-953), mastocitos (von Koeckritz-Blickwede M, et al., Blood 2008; 111:3070-3080) y monocitos (Webster SJ, et al., J Immunol 2010; 185:2968-2979; por ejemplo, macrófagos (Chow, O.A., et al., Cell Host & Microbe, Volume 8, Issue 5, 445-454, 18 de noviembre 2010)) y similares.

Se ha documentado que las trampas extracelulares formadas por estos tipos de leucocito tienen una característica común de liberar componentes de fibra que contienen principalmente ADN y proteínas de gránulos (Simon, D., et al, Allergy 68 (2013) 409-416).

La composición para inhibición según la presente descripción agrega y/o condensa los componentes de fibra y puede suprimir así la liberación de los componentes de fibra (véase la Figura 1-E). Por lo tanto, se entenderá que ese uso de la composición para inhibición según la presente descripción agrega y/o condensa los componentes de fibra, que, de otro modo, se liberarían desde los neutrófilos utilizados en los ejemplos y también los otros tipos de leucocito (por ejemplo, granulocitos basófilos, mastocitos, monocitos (por ejemplo, macrófagos)) en el momento de la formación de las trampas extracelulares, y puede inhibir así la formación de las trampas extracelulares por medio de estos tipos de leucocito.

La lactoferrina, que es un ingrediente activo de la composición para inhibición según la presente descripción, puede ser cualquier lactoferrina derivada de mamíferos sin limitación específica. Preferiblemente, la lactoferrina deriva de leche de mamífero que es bebible por seres humanos (por ejemplo, leche de vaca, cabra, oveja, humana) y, más preferiblemente, deriva de leche humana. Alternativamente, la lactoferrina puede derivar de neutrófilos de los mamíferos.

Se conocen las secuencias de aminoácidos de lactoferrina derivada de varios tipos de mamífero (véase la Tabla 1 a continuación).

Tabla 1

En una realización, la lactoferrina utilizada para la composición para inhibición según la presente descripción es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (c) de a continuación:

(c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 90 % o superior con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, las proteínas tienen actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos.

La proteína de (b) o (c) anterior es típicamente una variante de cualquier polipéptido de los SEQ ID NO: 1 a 5 que existe de manera natural, pero abarca proteínas que se pueden adquirir artificialmente por el uso de un método de inducción de mutación en un sitio específico descrito en, por ejemplo, "Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)", "Gene, 34, 315 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)", y similares.

En esta especificación, la "proteína formada de cualquier secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, en la que entre 1 a 66 aminoácidos se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden, la proteína tiene actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos" abarca proteínas formadas por cualquier secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, en la que, por ejemplo, entre 1 a 66 residuos de aminoácido, entre 1 a 65 residuos de aminoácido, entre 1 a 60 residuos de aminoácido, entre 1 a 55 residuos de aminoácido, entre 1 a 50 residuos de aminoácido, entre 1 a 49 residuos de aminoácido, entre 1 a 48 residuos de aminoácido, entre 1 a 47 residuos de aminoácido, entre 1 a 46 residuos de aminoácido, entre 1 a 45 residuos de aminoácido, entre 1 a 44 residuos de aminoácido, entre 1 a 43 residuos de aminoácido, entre 1 a 42 residuos de aminoácido, entre 1 a 41, entre 1 a 40 residuos de aminoácido, entre 1 a 39 residuos de aminoácido, entre 1 a 38 residuos de aminoácido, entre 1 a 37 residuos de aminoácido entre 1 a 36 residuos de aminoácido, entre 1 a 35 residuos de aminoácido, entre 1 a 34 residuos de aminoácido entre 1 a 33 residuos de aminoácido, entre 1 a 32 residuos de aminoácido, entre 1 a 31 residuos de aminoácido entre 1 a 30 residuos de aminoácido, entre 1 a 29 residuos de aminoácido, entre 1 a 28 residuos de aminoácido entre 1 a 27 residuos de aminoácido, entre 1 a 26 residuos de aminoácido, entre 1 a 25 residuos de aminoácido entre 1 a 24 residuos de aminoácido, entre 1 a 23 residuos de aminoácido, entre 1 a 22 residuos de aminoácido entre 1 a 21 residuos de aminoácido, entre 1 a 20 residuos de aminoácido, entre 1 a 19 residuos de aminoácido entre 1 a 18 residuos de aminoácido, entre 1 a 17 residuos de aminoácido, entre 1 a 16 residuos de aminoácido entre 1 a 15 residuos de aminoácido, entre 1 a 14 residuos de aminoácido, entre 1 a 13 residuos de aminoácido entre 1 a 12 residuos de aminoácido, entre 1 a 11 residuos de aminoácido, entre 1 a 10 residuos de aminoácido, entre 1 a 9 (entre 1 a varios) residuos de aminoácido, entre 1 a 8 residuos de aminoácido, entre 1 a 7 residuos de aminoácido, entre 1 a 6 residuos de aminoácido, entre 1 a 5 residuos de aminoácido, entre 1 a 4 residuos de aminoácido, entre 1 a 3 residuos de aminoácido, entre 1 a 2 residuos de aminoácido o 1 residuo de aminoácido se elimina, sustituye, inserta y/o añade, las proteínas tienen actividad de inhibición de la formación de las trampas extracelulares de leucocitos. En términos generales, el número de los residuos de aminoácido eliminados, sustituidos, insertados y/o añadidos es preferiblemente tan pequeño como sea posible.

Una proteína de este tipo abarca proteínas que tienen al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,1 %, al menos un 99,2 %, al menos un 99,3 %, al menos un 99,4 %, al menos un 99,5 %, al menos un 99,6 %, al menos un 99,7 %, al menos un 99,8 % o al menos un 99,9 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquier secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5 y las proteínas tienen actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos. En términos generales, el grado de la identidad de secuencia de aminoácidos es preferiblemente tan alto como sea posible.

Con respecto a la "actividad de inhibición de la formación de las trampas extracelulares de leucocitos", los leucocitos derivan de un organismo que forma las trampas extracelulares de leucocitos. Preferiblemente, los leucocitos derivan de vertebrados y, más preferiblemente, derivan de mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen ser humano, vaca, caballo, cabra, oveja, perro y gato. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

Preferiblemente, los leucocitos derivan de los organismos enumerados anteriormente y también son uno seleccionado de entre el grupo que consiste en neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos. Más preferiblemente, los leucocitos son uno seleccionado de entre el grupo que consiste en neutrófilos, granulocitos basófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos. Más preferiblemente, los leucocitos son neutrófilos.

Los leucocitos se cultivan en presencia de, o en ausencia de, lactoferrina, y el sistema de cultivo se observa por medio de un microscopio para confirmar que la formación de las trampas extracelulares disminuye en presencia de lactoferrina. Por lo tanto, se puede confirmar que la lactoferrina tiene actividad de inhibición de la formación de las trampas extracelulares de leucocitos.

Preferiblemente, los leucocitos se tratan con un estimulante de la formación de trampas extracelulares (parametoxianfetamina (PMA), lipopolisacárido (LPS), etc.) antes de que la lactoferrina se añada a los mismos. Alternativamente, se recupera el sobrenadante del cultivo del sistema de cultivo y se mide la concentración de ADN en el sobrenadante. De esta manera también, se puede confirmar que la lactoferrina tiene actividad de inhibición de la formación de las trampas extracelulares de leucocitos. La concentración de ADN proviene de los ADN liberados en el sobrenadante del cultivo, principalmente, en el momento de la formación de las trampas extracelulares.

En el caso en el que la formación de las trampas extracelulares se inhibe por medio de lactoferrina, la concentración de ADN en el sobrenadante es inferior que en ausencia de lactoferrina.

En este caso también, es preferible que los leucocitos se traten con un estimulante de la formación de trampas extracelulares (parametoxianfetamina (PMA), lipopolisacárido (LPS), etc.) antes de que la lactoferrina se añada a los mismos.

La concentración de ADN se puede medir simplemente al utilizar un kit disponible comercialmente (reactivo de ensayo Picogreen dsDNA (P11496 Invitrogen)).

Para las condiciones de cultivo de cada tipo de leucocito y el método para confirmar si las trampas extracelulares se habían formado, lo siguiente se puede referir a: neutrofilos (Brinkmann, V., et al., Science 2004; 303:1532-1535), A. K Gupta. FEBS letters 2010; 584:3193-3197, D J Novo. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(4):827-34), granulocitos basófilos (Yousefi, S., et al., Nat Med 2008; 14:949-953), mastocitos (von Kockritz-Blickwede M, et al., Blood 2008; 111:3070-3080), monocitos (Webster SJ, et al., JImmunol 2010; 185:2968-2979: por ejemplo, macrófagos (Chow, O.A., et al., Cell Host & Microbe, Volume 8, Issue 5, 445-454, 18 de noviembre de 2010)).

La expresión proporcionada con respecto a una secuencia de aminoácidos de cada proteína de la presente descripción "una o una pluralidad de (por ejemplo, entre 2 a 9) residuos de aminoácido se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden" indica que uno o una pluralidad de residuos de aminoácido se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden en cualquier posición entre una a una pluralidad de posiciones de la secuencia de aminoácidos. Dos o más entre deleción, sustitución, inserción y adición pueden tener lugar al mismo tiempo.

Los ejemplos de residuos de aminoácidos sustituibles mutuamente se mostrarán a continuación. Los residuos de aminoácido incluidos en el mismo grupo son sustituibles mutuamente. Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina. Ácido 2-aminobutírico, metionina, o-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, ciclohexilalanina; grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosbérico; grupo C: asparagina, glutamina; grupo D: lisina, arginina, ortinina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,3-diaminopropiónico; grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina; grupo F: serina, treonina, homoserina; grupo G: fenilalanina, tirosina.

La lactoferrina utilizada en la presente descripción se puede modificar con un compuesto. Por ejemplo, la lactoferrina puede ser una proteína modificada unida con polietilenglicol (Patente japonesa n.° 4195486, patente japonesa n.° 4261531, publicación internacional WO2009/113743) o una proteína fusionada con otra proteína o un fragmento de la misma (por ejemplo, proteína estable en la sangre, es decir, IgG, albúmina o un fragmento de las mismas, etc.). (Solicitud de patente japonesa n.° 2012-98085).

2. Método terapéutico

Por medio del uso de la composición para inhibición según la presente descripción, la formación de las trampas extracelulares de leucocitos se puede inhibir eficazmente. Concretamente, el uso de la composición para inhibición según la presente descripción puede proporcionar una terapia de una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos (de aquí en adelante, el método terapéutico que utiliza la composición para inhibición según la presente descripción se denominará como el "método terapéutico de la presente descripción").

En esta especificación, el término "terapia" indica generalmente mejora de un síntoma de un ser humano o de un mamífero diferente a un ser humano. El término "mejora" indica que el grado de la enfermedad se alivia o no se deteriora en comparación con el caso en el que, por ejemplo, no se administra la lactoferrina. El término "terapia" abarca también "prevención".

En este caso, el objetivo de la terapia (paciente) es un organismo que padece, o está en riesgo de padecer, una enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos. El objetivo de la terapia es preferiblemente vertebrado y, más preferiblemente, es un mamífero. El mamífero se selecciona de entre el grupo que consiste en ser humano, vaca, caballo, cabra, oveja, perro y gato. El objetivo de la terapia es todavía más preferiblemente un ser humano.

Con respecto al método terapéutico de la presente descripción, la "enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos" puede ser cualquier enfermedad, sin limitación específica, por la que se observa que la formación de las trampas extracelulares de leucocitos aumenta en el cuerpo del paciente.

Las enfermedades de este tipo incluyen, por ejemplo, vasculitis asociada a ANCA (granulomatosis de Wegener, poliangeítis microscópica, angeítis granulomatosa alérgica, etc.) lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión, lupus eritematoso sistémico (LES), apendicitis, aspergilosis, neumonía, infección con Diplococcus pneumoniae, fascitis necrosante, infección con estreptococo, sepsis, preeclampsia, enfermedad de Crohn, esquistosomosis, periodontitis, tuberculosis, mastitis, malaria, fibrosis quística y enfermedades de trombosis tales como trombosis venosa profunda (von Bruhl, M. L., et al., J Exp Med.9 de abril de 2012; 209(4):819-35), infarto de miocardio (de Boer, O. J., Thromb Haemost. Febrero 2013; 109(2):290-7), trombosis relacionada con tumor (Demers, M., Proc Natl Acad Sci USA; 7 de agosto de 2012; 109(32):13076-81), coagulación intravascular diseminada (CID) (Tobias A. et al., blood, 29 de septiembre de 2011, vol. 118, n.° 13, pp. 3708-3714), y similares (Documentos no patente 2 y 12). El síndrome de vasculitis se clasifica en vasculitis de vasos grandes, vasculitis de vasos medianos y vasculitis de vasos pequeños, dependiendo del tamaño del vaso en el que se produce la enfermedad. Las enfermedades relacionadas con las NET tales como vasculitis asociada a ANCA, LES y similares mencionadas anteriormente se clasifican dentro de la vasculitis de vasos pequeños. Sin embargo, la CID se desarrolla con frecuencia junto con un caso grave de poliarteritis nodosa, que es una vasculitis de vasos medianos (Guidelines on diagnosis and therapy of circulatory system diseases (documentado por el equipo de investigación conjunta 2006-2007)), sepsis o cáncer sólido. Con estas enfermedades, la citotoxicidad provocada por la formación de las trampas extracelulares de leucocitos (por ejemplo, NET) provoca disfunción endotelial vascular y provoca así disfunción orgánica. Con las enfermedades de trombosis mencionadas anteriormente, la formación de las trampas extracelulares de leucocitos (por ejemplo, NET) actúa como desencadenante para promover la reacción en cadena de la formación de trombos. Se considera que la lactoferrina suprime la formación y liberación/difusión de las trampas extracelulares de leucocitos (por ejemplo, NET) para prevenir la disfunción endotelial vascular, también suprime la reacción en cadena de la formación de trombosis para proporcionar una acción de protección de los órganos, y tiene así un efecto terapéutico para las enfermedades mencionadas anteriormente.

Las enfermedades que son objetivos del método terapéutico de la presente descripción son, preferiblemente, vasculitis asociada a ANCA (granulomatosis de Wegener, poliangeítis microscópica, angeítis granulomatosa alérgica, etc.) lupus eritematoso sistémico, reacción local de Shwartzman, y lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión; y son, más preferiblemente, poliangeítis microscópica acompañada por un aumento en el título de anticuerpos de MPO-ANCA (anticuerpo frente al citoplasma de los neutrófilos específico de mieloperoxidasa) en la sangre, angeítis granulomatosa alérgica y coagulación intravascular diseminada (CID).

Se ha documentado que la lactoferrina se utiliza para tratar enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes tipo I y artritis reumatoide (Documento patente 1). Sin embargo, las enfermedades autoinmunitarias tales como la diabetes tipo I y artritis reumatoide no se consideran que sean provocadas principalmente por la formación de las trampas extracelulares de leucocitos. Por lo tanto, es sumamente posible que la lactoferrina no actúe por medio de la formación de las trampas extracelulares en la terapia descrita en el informe descrito anteriormente.

Concretamente, según la presente descripción, la lactoferrina exhibe un efecto terapéutico en las enfermedades mencionadas anteriormente por medio de un mecanismo completamente innovador, más específicamente, un mecanismo de inhibición de la formación de las trampas extracelulares de leucocitos.

La terapia de las enfermedades provocadas por LES o ANCA utiliza esteroides, un fármaco inmunosupresor o similares. Un método terapéutico de este tipo tiene problemas de imposición de una carga física (efecto secundario o similar) en el paciente, lo que provoca que el paciente sufra, y tiene un alto riesgo de inducir otra enfermedad (enfermedad infecciosa).

Por el contrario, según la presente descripción, la lactoferrina contenida en alimentos se utiliza como ingrediente activo. Esto es una ventaja en que provoca menos efectos secundarios, lo que no provoca que el paciente sufra, y tiene un menor riesgo de inducir otra enfermedad.

3. Composición

En otra realización, la presente descripción proporciona una composición que contiene lactoferrina para tratar una enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos (de aquí en adelante, denominada como la "composición de la presente descripción").

El término "composición" indica una composición que contiene un aditivo tal como un vehículo o similar utilizado en la preparación de un ingrediente activo útil en la presente descripción (lactoferrina, etc.).

Con respecto a la composición de la presente descripción, la "lactoferrina" y la "enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos" son como se describieron anteriormente.

La vía de administración de la composición de la presente descripción puede ser cualquier vía utilizada generalmente sin limitación específica. Los ejemplos específicos de la vía de administración incluyen administración oral, administración sublingual, administración transnasal, administración pulmonar, administración por medio del tubo digestivo, administración transdérmica, instilación, inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección local e implante quirúrgico. Los ejemplos preferibles de la vía de administración son administración oral e inyección intravenosa.

La composición de la presente descripción se puede proporcionar como una formulación sólida tal como cápsula, comprimido, polvo o similares; una formulación líquida tal como disolución, suspensión, emulsión o similares; o una formulación semilíquida tal como pomada, crema, pasta o similares.

En el caso de que se administre por vía oral, la composición se proporciona preferiblemente como formación sólida. En el caso de que se inyecte, la composición se proporciona preferiblemente como una formulación sólida que abarca una formulación realizada por medio de liofilización o una formulación líquida.

En el caso de que se administre por vía oral, la composición de la presente descripción se prepara más preferiblemente como una formulación entérica. Se sabe que la lactoferrina tomada por vía oral se digiere más fácilmente con pepsina en el estómago. La composición preparada como una formulación entérica se ingiere en el cuerpo a una velocidad mayor (Takeuchi et al., Exp Physiol. Noviembre 2006; 91(6):1033-40). En este caso, es deseable que el polvo de lactoferrina se comprima en un estado seco y se recubra con un material de recubrimiento entérico porque la lactoferrina es térmicamente inestable cuando contiene humedad (Patentes japonesas con respecto a la formulación del laboratorio nacional de referencia: patente japonesa n.° 4050784 con respecto a los gránulos, patente japonesa n.° 4592041 con respecto a los comprimidos).

La lactoferrina se puede ingerir por un ser humano o un animal diferente a un ser humano como alimento o pienso como se añade al alimento o pienso. Un método para producir un alimento o pienso de este tipo es conocido por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. La lactoferrina se puede formular también como una formación de disolución, más específicamente, como un agente de inyección.

Alternativamente, una lactoferrina de este tipo o degradación de lactoferrina se puede añadir a un nutriente, alimento, bebida o similares tal como es o en forma de formulación.

La lactoferrina se puede utilizar de manera independiente o en combinación con otro componente farmacológicamente aceptable.

Por ejemplo, una composición como una formulación para administración oral tal como polvo, gránulo, comprimido, cápsula o similares se prepara por medio de un método normal por medio del uso de almidón, lactosa, azúcar blanco, manitol, carboximeticelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica o similares. Para este tipo de composición, otros excipientes de los enumerados anteriormente, un agente de recubrimiento, un ligante, un desintegrante, un tensioactivo, un lubricante, un potenciador de fluidez, un colorante, un material aromatizante o similares es utilizable cuando sea necesario.

La composición de la presente descripción puede contener lactoferrina, que es un ingrediente activo, en una cantidad terapéuticamente eficaz. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de lactoferrina como agente activo que, cuando se administra al objetivo, alivia o no deteriora el síntoma de la enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos en comparación con el caso en el que no se administra lactoferrina. La "cantidad terapéuticamente eficaz" abarca una cantidad que es eficaz para prevención.

En el caso en el que, por ejemplo, la composición se puede administrar por vía oral, la cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra entre 0,001 a 10 g/kg/día, entre 0,005 a 10 g/kg/día, entre 0,01 a 10 g/kg/día o entre 0,01 a 5 g/kg/día. En el caso en el que la composición se administra a un ser humano, la cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra generalmente entre 10 mg a 15.000 mg, entre 10 mg a 12.000 mg, entre 10 mg a 10.000 mg, entre 20 mg a 10.000 mg, entre 20 mg a 8.000 mg, entre 30 mg a 8.000 mg o entre 30 mg a 6.000 mg por día. Una dosis de este tipo por día se puede administrar de una vez o se puede dividir en varias veces a un paciente que necesita terapia de una enfermedad asociada con la formación de las trampas extracelulares de leucocitos.

La dosis y la frecuencia de administración de la composición de la presente descripción varía según varios factores que incluyen la especie, peso corporal, género, edad y grado de avance de la enfermedad tumoral del objetivo, y la vía de administración al objetivo. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica tal como un médico, veterinario, dentista, farmacéutico o similares podría determinar la dosis de administración teniendo en cuenta estos factores.

En lo anterior, los valores típicos se enumeran con respecto a la cantidad terapéuticamente eficaz, y la dosis y frecuencia de administración. Incluso un valor por encima o por debajo de la lista puede ser suficientemente terapéuticamente eficaz. Por lo tanto, incluso un valor por encima o por debajo de la cantidad terapéuticamente eficaz, o la dosis o frecuencia de administración está abarcado en la cantidad terapéuticamente eficaz, o la dosis y frecuencia de administración de la composición de la presente descripción.

Ejemplos

De aquí en adelante, la presente descripción se describirá más detalladamente por medio de los ejemplos. La presente descripción no está limitada por ninguna de las realizaciones descritas en los ejemplos.

[Ejemplo 1] El efecto inhibitorio de la estimulación de la formación de las NET con sangre periférica de voluntarios sanos por medio de lactoferrina pretratada

1. Método de aislamiento de neutrófilos humanos

De personas sanas, se muestrearon entre 15 ml a 20 ml de sangre periférica para un ciclo del experimento con una jeringuilla que contenía EDTA (aguja: entre 18 a 22 G). Después del muestreo sanguíneo, 3 ml de medio de resolución mono-poli (N.° de catálogo DSBN100, DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) contenido en un tubo cónico de 15 ml, y luego 3,5 ml de sangre entera se apilaron cuidadosamente en la capa inferior del medio de resolución mono-poli. El tubo cónico de 15 ml se centrifugó a temperatura ambiente (entre 15 a 30 °C) a 400 * g durante 20 minutos en una centrifugadora de tipo oscilante y, luego, el tubo cónico se retiró cuidadosamente. Una capa de plasma marrón en la capa superior y una capa de linfocitos/monocitos inmediatamente por debajo de la capa de plasma marrón se retiraron por un aspirador o similar. Una capa transparente por debajo de la capa de linfocitos/monocitos se retiró tanto como fuera posible. Una capa rosa palo por debajo de la capa transparente se sacó con una pipeta de Pasteur. Para lavar los neutrófilos, la capa rosa palo se transfirió a un tubo de prueba que contenía disolución salina tamponada con fosfato (PBS(-): 137 mM de cloruro de sodio, 2,7 mM de cloruro de potasio, 8,1 mM de hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato, 1,47 mM de dihidrogenofosfato de potasio). El tubo de prueba que contenía los neutrófilos se centrifugó a temperatura ambiente (entre 15 a 30 °C) a 200 * g durante 10 minutos. El tubo de prueba se sacó y el sobrenadante se descartó. Se añadió agua esterilizada a 4 °C a los neutrófilos en el tubo de prueba y se dejó en hielo durante 30 segundos para provocar hemólisis de los eritrocitos mezclados en la misma. Después de la hemólisis, se añadieron 45 ml de PBS(-) al tubo de prueba, y el tubo de prueba se centrifugó a 200 * g durante 10 minutos. El tubo de prueba se sacó y el sobrenadante se descartó. La precipitación se suspendió en DMEM de cultivo albúmina de suero humano al 2 % (serum human albumin; n.° de producto A9080 Sigma 4 mM de L-glutamina), y se dejó a 8 °C hasta inmediatamente antes de utilizarse. Los neutrófilos se separaron en el número de entre 1 * 106/ml a 1 * 107/ml. La pureza, que se obtuvo por recuento visual de muestra post-cytospin teñida con Giemsa, fue entre un 95 a un 98 %.

2. Método para pretratar los neutrófilos (inhibición de la formación de las NET) y método de inducción de NETosis (formación de las NET)

Aproximadamente 1 hora después del aislamiento de los neutrófilos descritos en “1. Método de aislamiento de neutrófilos humanos" en el Ejemplo 1, los neutrófilos se pretrataron. En un portaobjetos de 8 p pocillos (N.° de catálogo 80826 Ibidi (marca registrada)), los neutrófilos se esparcieron en 400 pl de DMEM de cultivo albúmina de suero humano al 2 % (serum human albumin; n.° de producto A9080 Sigma 4 mM L-glutamina) a una velocidad de aproximadamente 1,0 * 105 células/pocillo. Los fármacos (I) a (V) se añadieron cada uno y se realizó el pretratamiento a temperatura ambiente durante 30 minutos: (I) lactoferrina bovina (N.° de producto 123-04124 Lote: KWG6332 WAKO (marca registrada)) (reserva: 100 mg/ml diluida a 1/500, 1/5000 o 1/50000 para tener concentraciones finales de 200 pg/ml, 20 pg/ml o 2 pg/ml; (II) lactoferrina humana (reserva: 100 mg/ml, 200 pl n.° de catálogo SIGL6793, Sigma) diluida a 1/500, 1/5000 o 1/50000 para tener concentraciones finales de 200 pg/ml, 20 pg/ml o 2 pg/ml; (III) DPI (reserva: 25 mM, n.° de producto D2926 Sigma; documento anexo; disolvente: DMSO) diluido a 1/2500 para tener una concentración final de 10 pM; (IV) deferoxamina (N.° de producto D9533 Sigma) (reserva: 200 mM) diluida a 1/100 para tener una concentración final de 2 mM; (V) trientina (dihidrocloruro de trietilentetramina (N.° de producto de Sigma T5033; Lote: 1354380V; reserva: 100 mM, 100 pl)) (concentración final: 125 pM,12,5 pM, 1,25 pM)). El pretratamiento se realizó cada uno por medio del uso de reactivo en cada concentración. Después del pretratamiento, los neutrófilos se estimularon con PMA (concentración final: 25 nM, reserva: 10 mM en D^mSO; n.° de producto de Sigma P8139).

3. Método y resultados de la observación de NETosis provocada junto con la formación de las NET

Para observar la formación de las NET, se utilizó un microscopio confocal (Leica DMI 6000B, Leica (marca registrada)). Se contó visualmente el número de neutrófilos por medio del microscopio (en todos los experimentos, se utilizó una sonda de HySO^x(concentración final: 500 nM; reserva: 10 mM, proporcionada por el profesor Yasuteru URANO, Bioinformática, Ingeniería Biomédica, Departmento de Medicina Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad de Tokio) (Kenmoku, S., et al., 2007. J Am Chem Soc 129:7313-7318; Setsukinai, K., et al., 2003. J Biol Chem 278:3170-3175) y se contaron las células fluorescentes rojas obtenidas por el uso de la sonda. Para cuantificar las NET, se contó visualmente el número de estructuras tipo malla teñidas con Sytoxgreen (concentración final: 500 nM; reserva: 5 mM, 5 pl, n.° de producto S7020) y TO-PRO-3 (concentración final: 1 pM; reserva: 1 mM; n.° de catálogo T3605 Invitrogen (marca registrada)) y se liberó al exterior de los neutrófilos, con referencia a A. K Gupta. FEBS letters 2010; 584:3193-3197, D J Novo. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44(4):827-34 [Figura 1-C]. Después de que se inyectó el reactivo, para permitir que las células vivas se observaran a 37 °C durante un largo periodo de tiempo se suministró oxígeno para secado, 100 pl de aceite de silicona (AR200 Lote: BCBF0602V ALDRICH Chemistry (marca registrada) 85419) se inyectaron para formar una capa de aceite. El tiempo de observación se estableció entre 1 a 8 horas (4 horas en el caso en el que la duración del periodo de tiempo no se contara hasta que se obtuvo un estado de equilibrio de la formación de las NET) y las muestras en observación se mantuvieron a 37 °C por una caja mantenedora del calor proporcionada con un microscopio. El número de células que se observaron para liberar las NET se dividió por el número total de células en un campo microscópico y el valor obtenido se representó como la velocidad de formación de las NET. En el caso en el que los neutrófilos se estimularon solo con PMA, la formación de las NET alcanzó un pico en entre 2 a 3 horas, y alcanzó una meseta a la cuarta hora o partir de ahí. La formación de las NET alcanzó un pico en entre 4 a 5 horas, y alcanzó una meseta la sexta hora o partir de ahí porque la vida de los neutrófilos en la sangre fue de entre 10 a 12 horas. En el caso en el que los neutrófilos no se estimularon, el número de las NET formadas fue tan pequeño como entre 1/8 a 1/7 del número de las NET formadas en el caso en el que los neutrófilos se estimularon con PMA. En el caso en el que cada uno de los procesos descritos en "2. Método para pretratar los neutrófilos (inhibición de la formación de las NET) y método de inducción de NETosis (formación de las NET)" se realizaron antes de que los neutrófilos se estimularan con PMA, la tasa de las NET formadas en el momento cuando la formación de las NET alcanzó la meseta fue como sigue en comparación con el caso en el que los neutrófilos se estimularon solamente con PMA. En el caso en el que el proceso se realizó con lactoferrina bovina o lactoferrina derivada de neutrófilo humana (N.° de catálogo de Sigma SIGL6793) en una concentración de 2 pg/ml o 20 pg/ml, la tasa de las NET formadas fue la mitad. En el caso en el que el proceso se realizó con lactoferrina bovina o lactoferrina derivada de neutrófilo humana (N.° de catálogo de Sigma SIGL6793) en una concentración de 200 pg/ml, la formación de las NET se suprimió a 1/4 (Figura 1-A y Figura 1-B). En el caso en el que el proceso se realizó con DPI, la formación de las NET se suprimió a 1/3. En el caso en el que el proceso se realizó con deferoxamina o trientina, la formación de las NET no se suprimió.

La observación por medio de un microscopio electrónico de barrido se realizó como sigue. Los granulocitos oesinófilos se esparcieron en una placa con cubierta de vidrio o de fondo de vidrio para cultivo celular en el número de 1 x 10⁶y se pretrataron con 200 pg/ml de lactoferrina humana o no se pretrataron antes de la estimulación para las NET. Tres horas después, la muestra se inmovilizó previamente con 0,1 M de tampón de ácido fosfórico (pH 7,4) que contenía glutaraldehído al 2 % a 4 °C durante 1 hora. Después, la muestra se inmovilizó posteriormente con 0,1 M de tampón de ácido fosfórico (pH 7,4) que contenía tetróxido de osmio al 1 % a 4 °C durante 1 hora. Después de la inmovilización, la muestra se lavó con etanol al 60 %, con etanol al 70 %, con etanol al 80 % y con etanol al 95 % mientras se agitaba cuidadosamente durante entre 5 a 10 minutos, y se sumergió dos veces en etanol al 100 % durante entre 5 a 10 minutos para deshidratarla. Se realizó secado de punto crítico por medio de sustitución con acetato de isoamilo durante entre 10 a 15 minutos. La mezcla se cubrió con una capa de tetróxido de osmio sublimado por medio del uso de un dispositivo de recubrimiento de plasma de osmio (OPC80N, Filgen, Inc.) y se observó por medio de un microscopio electrónico de barrido (JSM-6320F, JEOL, Ltd.). En el caso en el que los neutrófilos no se estimularon, los neutrófilos se mantuvieron esféricos y no se reconoció fibra extracelular. En el caso en el que los neutrófilos se estimularon con PMA, las células se rompieron y se formaron muchos componentes de fibra. Por el contrario, se observó que los neutrófilos pretratados con lactoferrina formaban componentes de fibra de este tipo en haces. Esto indica que las fibras de las NET se condensaron por la lactoferrina [Figura 1-D].

4. Método para medir la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo

El sobrenadante del cultivo se recuperó y se centrifugó a 200 x g durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo microscópico de centrifugadora. Se midió la cantidad de ADN por medio del uso de un reactivo de ensayo Picogreen dsDNA (P11496 Invitrogen) según el protocolo que lo acompaña. En el caso en el que el pretratamiento se realizó con lactoferrina humana, la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo disminuyó de una manera dependiente de la concentración y se suprimió así la liberación de los ADN por las NET (Figura 1-D).

[Ejemplo 2] Efecto inhibitorio de la lactoferrina después de la estimulación de los neutrófilos para formar las n Et en sangre periférica de un voluntario sano

1. Método de aislamiento de neutrófilos humanos

De un voluntario sano, se muestrearon entre 15 ml a 20 ml de sangre periférica para un ciclo del experimento con una jeringuilla que contenía EDTA (aguja: entre 18 a 22 G). Después del muestreo sanguíneo, 3 ml de medio de resolución mono-poli (N.° de catálogo DSBN100, DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) contenido en un tubo cónico de 15 ml, y luego 3,5 ml de sangre entera se apilaron cuidadosamente en la capa inferior del medio de resolución mono-poli. El tubo cónico de 15 ml se centrifugó a temperatura ambiente (entre 15 a 30 °C) a 400 * g durante 20 minutos en una centrifugadora de tipo oscilante, y, luego, el tubo cónico se retiró cuidadosamente. Una capa de plasma marrón en la capa superior y una capa de linfocitos/monocitos inmediatamente por debajo de la capa de plasma marrón se retiraron por un aspirador o similar. Una capa transparente por debajo de la capa de linfocitos/monocitos se retiró tanto como fuera posible. Una capa rosa palo por debajo de la capa transparente se sacó con una pipeta de Pasteur. Para lavar los neutrófilos, la capa rosa palo se transfirió a un tubo de prueba que contenía disolución salina tamponada con fosfato (PBS(-): 137 mM de cloruro de sodio, 2,7 mM de cloruro de potasio, 8,1 mM de hidrogenofosfato de disodio dodecahidrato, 1,47 mM de dihidrogenofosfato de potasio). El tubo de prueba que contenía los neutrófilos se centrifugó a temperatura ambiente (entre 15 a 30 °C) a 200 * g durante 10 minutos. El tubo de prueba se sacó y el sobrenadante se descartó. Se añadió agua esterilizada a 4 °C a los neutrófilos en el tubo de prueba y se dejó en hielo durante 30 segundos para provocar hemólisis de los eritrocitos mezclados en la misma. Después de la hemólisis, se añadieron 45 ml de PBS(-) al tubo de prueba, y el tubo de prueba se centrifugó a 200 * g durante 10 minutos. El tubo de prueba se sacó y el sobrenadante se descartó. La precipitación se suspendió en DMEM de cultivo albúmina de suero humano al 2 % (serum human albumin; n.° de producto A9080 Sigma 4 mM de L-glutamina), y se dejó a 8 °C hasta inmediatamente antes de utilizarse. Los neutrófilos se separaron en el número de entre 1 * 106/ml a 1 * 107/ml. La pureza, que se obtuvo por recuento visual de muestra post-cytospin teñida con Giemsa, fue entre un 95 a un 98 %.

2. Inducción de NETosis de los neutrófilos (formación de las NET) y método para inhibir la misma

Aproximadamente 1 hora después del aislamiento de los neutrófilos descritos en “1. Método de aislamiento de neutrófilos humanos" en el Ejemplo 2, los neutrófilos se pretrataron. En un portaobjetos Microslide de 8 pocillos (N.° de catálogo ib. 80826 Ibidi (marca registrada)), los neutrófilos se esparcieron en 400 pl de DMEM de cultivo albúmina de suero humano al 2 % (serum human albumin; n.° de producto A9080 Sigma 4 mM L-glutamina) a una velocidad de aproximadamente 1,0 * 105 células/pocillo y se estimularon con PMA (concentración final: 25 nM, reserva: 10 mM en DMSO, n.° de producto de Sigma P8139). 30 minutos antes de la estimulación y cada hora o cada dos horas después de la estimulación, se añadieron 200 pg/ml de lactoferrina humana (reserva: 100 mg/ml, 200 pl; n.° de catálogo SIGL6793, Sigma) para realizar la inhibición [Figura 2].

4. Método para medir la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo

El sobrenadante del cultivo se recuperó y se centrifugó a 200 * g durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo microscópico de centrifugadora. Se midió la cantidad de ADN por medio del uso de un reactivo de ensayo Picogreen dsDNA (P11496 Invitrogen) según el protocolo que lo acompaña. El tratamiento con lactoferrina humana una hora o dos horas después de la estimulación tuvo un efecto similar al pretratamiento previo, y la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo disminuyó, lo que dio lugar a la supresión de la liberación de los ADN por las NET [Figura 2].

[Ejemplo 3] Efecto de mejora en la tasa de supervivencia/prolongación de la vida de ratones SCG/Kj modelo de vasculitis asociada a ANCA (animales modelo de enfermedades autoinmunitarias) por medio de administración oral de lactoferrina

1. Producción de pienso para ratones que contiene LF y método de alimentación de los mismos

La producción de pienso estándar y el pienso que contiene lactoferrina se subcontrataron a Oriental Kobo Kabushiki Kaisha.

El pienso estándar se produjo como sigue. El pienso refinado estándar AIN-93M para investigación nutricional para ratones y ratas que se publicó en 1993 por el Instituto Americano de Nutrición (14 % de caseína, 0,18 % de L-cistina, 46,5692 % de almidón de maíz, 15,5 % de a-almidón de maíz, 10,0 % de sacarosa, 4,0 % de aceite de soja, 5,0 % de polvo de celulosa, 3,5 % de mezcla mineral de AIN-93M, 1,0 % de mezcla de vitaminas AIN-93, 0,25 % de tartrato de colina, 0,0008 % de tert-butilhidroquinona) se solidificó por medio de una granuladora. Se permitió a los ratones tomar el pienso libremente. El pienso que contenía lactoferrina se produjo como sigue. Se mezcló lactoferrina bovina en AIN-93M de modo que tuviera una concentración final de un 2 % y la mezcla se solidificó por una granuladora. Se permitió a los ratones tomar el pienso libremente.

2. Efecto de mejora en la tasa de supervivencia/prolongación de la vida de ratones SCG/Kj (ratones formadores de glomerulonefritis con semilunas espontánea/Kinjoh)

Ratones SCG/Kj hembra de entre seis a siete semanas de edad que tenían glomerulonefritis con semilunas y vasculitis asociada a ANCA se compraron a BioResource Center, Tsukuba Institute, RIKEN, y se les permitió acostumbrarse durante entre 1 a 2 semanas antes de ser utilizados. Los ratones se dividieron en dos grupos. A partir de la octava semana de edad, un grupo de ratones se alimentaron con el pienso que contenía lactoferrina (n = 16) y el otro grupo de ratones se alimentaron con el pienso estándar (n = 16). La tasa de supervivencia/prolongación de la vida se evaluó por medio del uso del método de Kaplan-Meier. El grupo de ratones alimentados con el pienso estándar empezó a morir gradualmente a partir de la novena semana de edad. A la 18a semana de edad, dos ratones estaban vivos. El grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina empezó a morir a partir de la 14a semana de edad, y 11 ratones estaban vivos a la 18a semana de edad, lo que demuestra un efecto de mejora significativo en la tasa de supervivencia/prolongación de la vida (diferencia estadísticamente significativa p = 0,0111 [Figura 3].

[Ejemplo 4] Influencia de la administración de lactoferrina en el título de anticuerpos del MPO-ANCA (anticuerpo frente al citoplasma de los neutrófilos específico de mieloperoxidasa) en la sangre y en el ADN en la sangre de ratones SCG/Kj modelo de vasculitis asociada a ANCA (animales modelo de enfermedades autoinmunitarias)

2. Experimento eficaz del título de anticuerpos de MPO-ANCA y el ADN en la sangre de ratones SCG/Kj modelo de vasculitis asociada a ANCA

Ratones SCG/Kj hembra de al menos 6 semanas de edad se compraron a BioResource Center, Tsukuba Institute, RIKEN, y se utilizaron a partir de la octava semana de edad. Los ratones se dividieron en dos grupos. Un grupo de ratones se alimentaron con el pienso que contenía lactoferrina (n = 8) y el otro grupo de ratones se alimentaron con el pienso estándar (n = 8). Se provocó que los ratones SCG/Kj de entre 8 a 17 semanas de edad inhalaran dietiléter para anestesiarlos y se muestreó la sangre con heparina. La sangre muestreada se transfirió a un tubo microscópico de centrifugadora de 1,5 ml y se centrifugó a 4 °C a 1000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recuperó para utilizarlo como plasma.

3. Método para medir el título de anticuerpos del MPO-ANCA en la sangre

La medición del título de anticuerpos del MPO-ANCA se realizó por medio del uso de ELISA (Ishida-Okawara, A., et al, Nephrol Dial Transplant 2004; 19:1708-1715) proporcionado por el profesor Kazuo SUZUKI, anteriormente en el Departamento de Inmunología y Control de Inflamaciones, Facultad de Medicina, Universidad de Chiba. La MPO recombinante de ratón se esparció en una concentración determinada en una placa de ELISA de 96 pocillos (TOYOSHIMA) y se dejó a 4 °C durante 16 horas. Después de que se dejó la MPO de esta manera, el sobrenadante se descartó y se pusieron entre 300 a 400 pl de PBS(-) en cada pocillo para lavado (la operación se realizó entre 2 a 3 veces). Después del lavado, entre 300 a 400 pl de disolución de PBS(-) al 1 % de albúmina de suero bovino se pusieron en cada pocillo, se dejaron a temperatura ambiente durante 2 horas y, luego, entre 300 a 400 pl de PBS(-) se pusieron en cada pocillo para lavado (la operación se realizó entre 3 a 4 veces). Después de que se dejaron los pocillos de esta manera, suero de ratón diluido 50 veces con PBS(-) se puso en cada pocillo y se reaccionó a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de la reacción, se pusieron entre 300 a 400 pl de PBS(-) en cada pocillo para lavado (la operación se realizó entre 3 a 4 veces).

Después del lavado, anticuerpo IgG anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina diluida 1000 veces con PBS(-) se puso en cada pocillo y se reaccionó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la reacción, se pusieron entre 300 a 400 pl de PBS(-) en cada pocillo para lavado (la operación se realizó entre 2 a 3 veces). Se pusieron 150 |jl de 1 mg/ml de ácido para-nitrofenilfosfórico diluido con PBS(-) en cada pocilio y se reaccionaron durante entre 15 a 30 minutos. Una cantidad equivalente de 0,75 M de disolución acuosa de hidróxido de sodio se puso en cada pocillo para detener la reacción. La medición se realizó a una longitud de onda de 405 nm. Los resultados de la medición realizada por medio del uso de un absorciómetro fueron de modo que el título de anticuerpos medio de MPO-ANCA del grupo de ratones alimentados con el pienso estándar fue 0,283875 y el título de anticuerpos medio de MPO-ANCA del grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina fue 0,15625. Se reconoció que el título de anticuerpos del MPO-ANCA fue inferior con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina. Por lo tanto, se reconoció el efecto terapéutico (diferencia estadísticamente significativa p = 0,0221) [Figura 4-A].

4. Método para medir la concentración de ADN en el plasma

Se midió la cantidad de ADN en el plasma por medio del uso de un reactivo de ensayo Picogreen dsDNA (P11496 Invitrogen) según el protocolo que lo acompaña. El grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina tuvo una cantidad de ADN menor en la sangre que el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina. Esto indica que la liberación de los ADN por las NET se suprimió significativamente con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina (p = 0,046) [Figura 4-B].

5. Método para evaluar tejidos

Los ratones SCG/Kj se sometieron a eutanasia por medio de dislocación cervical y las muestras hepáticas se recogieron por medio de celiotomía. Se creó un bloque de parafina al 40 % y se formaron las secciones de tejido. Se realizó tinción tricrómica de Masson y se evaluó histológicamente la hemorragia subcutánea. Las secciones de tejido se sometieron a ósmosis con disolución de formalina al 10 % durante 24 horas o más para inmovilizarlas. La formalina se lavó con agua corriente durante 1 hora o más. Las secciones de tejido inmovilizadas se sumergieron en etanol al 60 % durante 1 hora, en etanol al 70 % durante 1 hora, en etanol al 80 % durante 1 hora, en etanol al 95 % durante 1 hora, en etanol al 100 % durante 1 hora 3 veces, en xileno durante 1 hora dos veces y en parafina (mantenida a 65 °C) durante 1 hora 3 veces. Entonces, el bloque de tejido se creó con una bandeja de inserción. El bloque de tejido se cortó por medio de un micrótomo en secciones de tejido que tiene cada una un espesor de entre 20 a 50 nm. Las secciones de tejido se pusieron en un portaobjetos de vidrio y se desparafinaron. La desparafinación se realizó como sigue. Las secciones de tejido que estaban completamente secas en el portaobjetos de vidrio se lavaron ligeramente con xileno durante 5 minutos 3 veces, con etanol al 100 % durante 1 minuto dos veces y con etanol al 95 %. Entonces, de manera similar, las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 80 %, con etanol al 70%, con etanol al 60% y con agua corriente en este orden. Entonces, las secciones de tejido se sumergieron en agua de intercambio iónico y, entonces, se trataron con la tinción tricrómica de Masson. Entonces, las secciones de tejido se sumergieron en un líquido mordiente (disolución de ácido tricloroacético al 10 %, disolución de dicromato de potasio al 10 %) durante entre 10 a 15 minutos, se lavaron con agua corriente durante 5 minutos, se sumergieron en una disolución de hematoxilina de hierro (2 g de hematoxilina, 100 ml de etanol al 100 %, 0,5 g de nitrato férrico (III) 9H2O, 100 ml de disolución de ácido hidroclórico al 25 %) durante 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Se utilizó un ácido hidroclórico al 1 % en etanol al 70 % para la separación. Las secciones de tejido se lavaron con agua durante 10 minutos para retirar el color y se sumergieron en agua de intercambio iónico. Las secciones de tejido se sumergieron en líquido I (90 ml de Biebrich Scarlet al 1 %, 10 ml de fucsina ácida al 1 %, 1 ml de ácido acético) durante entre 2 a 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Las secciones de tejido se sumergieron en líquido II (5 g de ácido fosfomolíbdico, 5 g de ácido fosfotúngstico, 200 ml de agua destilada) durante 30 minutos o más, se lavaron ligeramente con agua, se sumergieron en líquido III (2,5 g de azul de anilina, 2 ml de ácido acético, 100 ml de agua destilada) durante 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Las secciones de tejido se sumergieron en ácido acético acuoso al 1 % durante 5 minutos y se lavaron rápidamente con agua. Las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 60 %, con etanol al 70 %, con etanol al 80 % y con etanol al 95 % y, luego, se sumergieron en etanol al 100 % durante 5 minutos 3 veces. Las secciones de tejido se sumergieron en xileno durante 5 minutos 3 veces y se cubrieron con una cubierta de vidrio para su uso como agente montaje. El portaobjetos de vidrio se secó y luego se observó al microscopio. De manera separada, las secciones de tejido similares se tiñeron con hematoxilina-eosina. Después de desparafinarlas, las secciones de tejido se lavaron con agua corriente durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de hematoxilina de Mayer durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron con agua corriente a entre 25 a 37 °C durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de eosina durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 60 %, con etanol al 70 %, con etanol al 80 % y con etanol al 95 % y, luego, se sumergieron en etanol al 100 % durante 5 minutos 3 veces. Las secciones de tejido se sumergieron en xileno durante 5 minutos 3 veces y se cubrieron con una cubierta de vidrio para su uso como agente montaje. El portaobjetos de vidrio se secó y luego se observó al microscopio. Con ambos métodos de tinción, el riñón del grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina fue más leve con respecto a fibrosis intersticial, infiltración celular inflamatoria (superior) y formación de drepanocitos (inferior) de los tejidos que el riñón de los ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina [4-C].

[Ejemplo 5] Efecto terapéutico de la lactoferrina en los ratones modelo de reacción local de Shwartzman (RLS) (ratones modelo de enfermedades no autoinmunitarias)

1. Producción de modelo 1 de RLS y su evaluación 1

Se permitió a ratones C57BL/6j con seis semanas de edad acostumbrarse durante 2 semanas y, a partir de la octava semana de edad, se alimentaron con el pienso que contenía lactoferrina o con pienso de control. A la 10a semana de edad, se disolvió lipopolisacárido (LPS; Sigma) derivado de Escherichia coli en PBS(-) de modo que fuera _ mg/ml.

100 |jg de la disolución resultante se inyectaron por vía subcutánea a cada ratón con una aguja de 30 G. El día en el que la inyección se realizó es estableció como el día 1. Se disolvió TNF-a recombinante de ratón (R&D Systems, Inc., n.° de producto 410-MT) en PBS(-) de modo que fuera 100 jg/ml. 0,3 jg de la disolución resultante se inyectaron por vía subcutánea a cada ratón en el mismo sitio. El día en el que la inyección se realizó es estableció como el día 2. En el día 3, se evaluó la hemorragia del sitio a simple vista. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina, el intervalo de hemorragia subcutánea se suprimió más significativamente que con el grupo de control de ratones alimentados con el pienso de control. La gravedad de la hemorragia subcutánea se observó a simple vista y se evaluó numéricamente con base en el intervalo de hemorragia y el estado de la necrosis como sigue: 0: ninguna; 1: leve; 2: moderada; 3: grave; 4 necrosis central [Tabla 2]. La gravedad del grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina fue significativamente inferior a la del grupo de control de ratones alimentados con el pienso de control (p >0,0001) [Figura 5-A, B].

Tabla 2. Puntuaciones de evaluación, por observación a simple vista, de la hemorragia subcutánea del grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina (n = 16) y el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina (n =15 )

2. Método para evaluar los tejidos

Los ratones producidos en "1. Producción de modelo 1 de RLS y su evaluación 1" en el Ejemplo 5 se sometieron a eutanasia por medio de dislocación cervical y se tomaron muestras de piel. Se creó un bloque de parafina al 40 % y se formaron las secciones de tejido. Se realizó la tinción tricrómica de Masson y se evaluó histológicamente la hemorragia subcutánea. Las secciones de tejido se sometieron a ósmosis con disolución de formalina al 10 % durante 24 horas o más para inmovilizarlas. La formalina se lavó con agua corriente durante 1 hora o más. Las secciones de tejido inmovilizadas se sumergieron en etanol al 60 % durante 1 hora, en etanol al 70 % durante 1 hora, en etanol al 80 % durante 1 hora, en etanol al 95 % durante 1 hora, en etanol al 100 % durante 1 hora 3 veces, en xileno durante 1 hora dos veces y en parafina (mantenida a 65 °C) durante 1 hora 3 veces. Entonces, el bloque de tejido se creó con una bandeja de inserción. El bloque de tejido se cortó por medio de un micrótomo en secciones de tejido que tiene cada una un espesor de entre 20 a 50 nm. Las secciones de tejido se pusieron en un portaobjetos de vidrio y se desparafinaron. La desparafinación se realizó como sigue. Las secciones de tejido que estaban completamente secas en el portaobjetos de vidrio se lavaron ligeramente con xileno durante 5 minutos 3 veces, con etanol al 100 % durante 1 minuto dos veces y con etanol al 95 %. Entonces, de manera similar, las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 80 %, con etanol al 70%, con etanol al 60% y con agua corriente en este orden. Entonces, las secciones de tejido se sumergieron en agua de intercambio iónico y, entonces, se trataron con la tinción tricrómica de Masson. Entonces, las secciones de tejido se sumergieron en una disolución fijadora de tinción (disolución de ácido tricloroacético al 10 %, disolución de dicromato de potasio al 10 %) durante entre 10 a 15 minutos, se lavaron con agua corriente durante 5 minutos, se sumergieron en una disolución de hematoxilina de hierro (2 g de hematoxilina, 100 ml de etanol al 100 %, 0,5 g de nitrato férrico (III) 9H2O, 100 ml de disolución de ácido hidroclórico al 25 %) durante 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Se utilizó una disolución de ácido hidroclórico al 1 % en etanol al 70 % para la separación. Las secciones de tejido se lavaron con agua durante 10 minutos para retirar el color y, luego, se sumergieron en agua de intercambio iónico. Las secciones de tejido se sumergieron en líquido I (90 ml de Biebrich Scarlet al 1 %, 10 ml de fucsina ácida al 1 %, 1 ml de ácido acético) durante entre 2 a 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Las secciones de tejido se sumergieron en líquido II (5 g de ácido fosfomolíbdico, 5 g de ácido fosfotúngstico, 200 ml de agua destilada) durante 30 minutos o más, se lavaron ligeramente con agua, se sumergieron en líquido III (2,5 g de azul de anilina, 2 ml de ácido acético, 100 ml de agua destilada) durante 5 minutos y se lavaron ligeramente con agua. Las secciones de tejido se sumergieron en ácido acético acuoso al 1 % durante 5 minutos y se lavaron rápidamente con agua. Las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 60 %, con etanol al 70 %, con etanol al 80 % y con etanol al 95 % y, luego, se sumergieron en etanol al 100 % durante 5 minutos 3 veces. Las secciones de tejido se sumergieron en xileno durante 5 minutos 3 veces y se cubrieron con una cubierta de vidrio para su uso como agente montaje. El portaobjetos de vidrio se secó y luego se observó al microscopio. De manera separada, las secciones de tejido similares se tiñeron con hematoxilina-eosina. Después de desparafinarlas, las secciones de tejido se lavaron con agua corriente durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de hematoxilina de Mayer durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron con agua corriente a entre 25 a 37 °C durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de eosina durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 60 %, con etanol al 70 %, con etanol al 80 % y con etanol al 95 % y, luego, se sumergieron en etanol al 100 % durante 5 minutos 3 veces. Las secciones de tejido se sumergieron en xileno durante 5 minutos 3 veces y se cubrieron con una cubierta de vidrio para su uso como agente montaje. El portaobjetos de vidrio se secó y luego se observó al microscopio.

En ambos métodos de tinción, las secciones de tejido se trataron finalmente con tinción de esterasa específica (cloroacetato esterasa) en las que solo esterasa en gránulos se tiñó en secciones de tejido de este tipo. Después de desparafinarlas, las secciones de tejido se lavaron con agua corriente durante entre 3 a 5 minutos y se lavaron con agua destilada 3 veces. Las secciones de tejido se secaron a temperatura ambiente durante entre 10 a 30 minutos y se sumergieron en una disolución de reacción de cloroacetato esterasa durante entre 15 a 30 minutos. Las secciones de tejido se lavaron con agua corriente durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de hematoxilina de Mayer durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron con agua corriente a entre 25 a 37 °C durante entre 3 a 5 minutos y se sumergieron en una disolución de eosina durante 5 minutos. Las secciones de tejido se lavaron ligeramente con etanol al 60 %, etanol al 70 %, etanol al 80 % y etanol al 95 % y, luego, se sumergieron en etanol al 100 % durante 5 minutos 3 veces. Las secciones de tejido se sumergieron en xileno durante 5 minutos 3 veces y se cubrieron con una cubierta de vidrio para su uso como agente montaje. El portaobjetos de vidrio se secó y luego se observó al microscopio. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina, la hemorragia subcutánea en la parte superior de la capa muscular y la formación de trombos en los vasos sanguíneos fueran significativas. Por el contrario, con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina, la hemorragia subcutánea y la formación de trombos fueron leves. Se observó que el pienso que contenía lactoferrina suprimía la infiltración neutrofílica en los tejidos subcutáneos [Figura 5-C].

3. Producción de modelo 2 de RLS y su evaluación 2

Una bolsa de aire se creó por vía subcutánea en la parte posterior de cada ratón para inducir RLS y se midió la concentración de ADN en la bolsa de aire y se observaron los neutrófilos. Primero, 5 ml de aire se inyectó por vía subcutánea vigorosamente en la parte posterior con una jeringuilla de 5 ml y una aguja de 30 G. Tres días después, 100 pg de LPS se inyectaron en la bolsa de aire en cada ratón. Veinticuatro horas después, 0,3 pg de TNF-a se inyectaron en la bolsa de aire de cada ratón, y 6 horas después, la bolsa de aire se lavó con 2 ml de PBS(-) esterilizada y se recuperó.

4. Medición de la concentración de ADN en la bolsa de aire (líquido de lavado)

El líquido de lavado muestreado se transfirió a un tubo microscópico de centrifugadora de 1,5 ml y se centrifugó a temperatura ambiente a 6000 g durante 5 minutos. Se midió la cantidad de ADN en el sobrenadante por medio del uso de un reactivo de ensayo Picogreen dsDNA según el protocolo que lo acompaña. El grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina tuvo una cantidad de ADN menor en la sangre que el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina. Esto indica que la liberación de los ^aDⁿpor las NET se suprimió significativamente con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina (p = 0,0015) [Figura 6-A].

5. Observación de la formación de las NET de neutrófilos

Se inmovilizaron los neutrófilos en el líquido de lavado en un portaobjetos de vidrio por medio del uso de Cytospin 2 (Shandon), se tiñeron con 5 pM de DRAQ5 y se observaron al microscopio. El número de los neutrófilos con los que se observó la formación de las NET fue más pequeño con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina que con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina [Figura 6-B].

[Ejemplo 6] Efecto de mejora en la tasa de supervivencia/prolongación de la vida de ratones modelo de trombos inducidos por histona (coagulación intravascular diseminada (CID)) por medio de inyección intravenosa de lactoferrina en las colas de estos

80 mg/kg de histona (Sigma, H9250) disueltos en disolución salina fisiológica y dejados a 37 °C se administraron por vía intravenosa en las colas de ratones C57BL/6 macho con 11 semanas de edad para crear los ratones modelo de CID (Tobias A. et al., blood, 29 de septiembre de 2011, vol. 118, n.° 13, pp. 3708-3714). Como pretratamiento, 20 mg/kg de lactoferrina bovina se administraron por vía intravenosa en las colas de los ratones y, 30 minutos después, la histona se administró por vía intravenosa a las colas de los ratones (n = 8). Esos ratones se marcaron como grupo de ratones proporcionados con terapia con lactoferrina. En las colas de diferentes ratones (n = 8), se les administraron por vía intravenosa 100 pl de disolución salina fisiológica que no contenía lactoferrina bovina y, 30 minutos después, se administró histona por vía intravenosa. Esos ratones se marcaron como grupo de control de ratones proporcionados sin terapia. La tasa de supervivencia/prolongación de la vida después de la administración de histona se evaluó por medio del uso del método de Kaplan-Meier. El grupo de control de ratones proporcionados sin terapia empezó a morir gradualmente aproximadamente 20 minutos después de la administración de histona. Dos días después, dos ratones estaban vivos y, 4 días después, un ratón estaba vivo. Por el contrario, los 8 ratones en el grupo proporcionado con terapia con lactoferrina bovina estaban todos vivos incluso 4 días después. Se observó el efecto de mejora significativo en la tasa de supervivencia/prolongación de la vida (Figura 7; diferencia estadísticamente significativa p=0,0005).

[Ejemplo 7] Efecto de hemostasia en ratones modelo de trombos inducidos por histona (duración del periodo de tiempo de la hemorragia) proporcionados por medio de inyección intravenosa de lactoferrina en las colas de los mismos

Como pretratamiento, 20 mg/kg de lactoferrina bovina se inyectaron por vía intravenosa en las colas de ratones C57BL/6 macho con 11 semanas de edad y, 30 minutos después, 60 mg/kg de histona (Sigma, H9250) disuelta en disolución salina fisiológica y dejada a 37 °C se administraron por vía intravenosa en las colas de los ratones para comprobar el efecto de la hemostasia en los ratones modelo de CID (n = 5) (Tobias A, et al., Blood, 2011; 118: pp.

3708-3714) (se adoptó un 75 % de la cantidad de histona utilizada para mejorar la tasa de supervivencia/prolongación de la vida). Para los ratones del grupo de control sin terapia (n = 5), 100 pl de disolución salina fisiológica que no contenía lactoferrina bovina se administró por vía intravenosa en las colas 30 minutos antes de la administración de histona. Para los ratones de control sanos ( n= 5), se administró disolución salina fisiológica, en lugar de lactoferrina bovina utilizada para el pretratamiento y también en lugar de histona. Veinte minutos después de la administración de histona, la vena de la cola de cada ratón se cortó en una posición a 3 mm del extremo y se sumergió en disolución salina fisiológica a 37 °C. Cada 30 segundos, la sangre se quitó con un papel de filtro y se midió la duración del periodo de tiempo de la hemorragia (en el caso en el que la duración del periodo de tiempo de la hemorragia fue 15 minutos o más, la duración del periodo de tiempo de la hemorragia se registró como 15 minutos y se realizó un tratamiento para la hemostasia) (Fuchs TA, et al., Blood, 2011; 118:3708-3714). Se observó que los ratones del grupo de control proporcionados sin terapia sangraban durante un periodo de tiempo significativamente largo (Figura 8; grupo de control de ratones proporcionados sin terapia frente a grupo de control de ratones sanos; p < 0,0001). Por el contrario, con el grupo de ratones proporcionados con terapia con lactoferrina bovina, la duración del periodo de tiempo de la hemorragia fue significativamente más corta (Figura 8; grupo de ratones proporcionados con terapia con lactoferrina bovina frente a grupo de control de ratones proporcionados sin terapia; p < 0,0001).

[Ejemplo 8] Efecto supresor de la lactoferrina en la hemorragia en tejidos pulmonares de ratones modelo de trombos inducidos por histona

Como pretratamiento, 20 mg/kg de lactoferrina bovina se inyectaron por vía intravenosa en las colas de ratones C57BL/6 macho con 11 semanas de edad y, 30 minutos después, 80 mg/kg de histona (Sigma, H9250) disuelta en disolución salina fisiológica y dejada a 37 °C se administraron por vía intravenosa en las colas de los ratones para crear los ratones modelo de ClD (n = 4) (Tobias A., et al., Blood, 29 de septiembre de 2011; vol. 118: n.° 13, pp.

3708-3714). Para los ratones del grupo de control sin terapia (n = 4), 100 pl de disolución salina fisiológica que no contenía lactoferrina bovina se administró por vía intravenosa en las colas 30 minutos antes de que se administrara histona por vía intravenosa. Para los ratones del grupo de control sanos ( n= 4), se administró disolución salina fisiológica, en lugar de lactoferrina bovina utilizada para el pretratamiento y también en lugar de histona. Diez minutos después de la administración de histona (segunda administración de disolución salina fisiológica), los ratones se sometieron a eutanasia. Los tejidos pulmonares se extrajeron e inmovilizaron por medio del uso de paraformaldehído al 4 %. Con el grupo de ratones proporcionados con terapia con lactoferrina bovina, no se observó que los tejidos sangraran casi nada, a diferencia del grupo de control de ratones proporcionados sin terapia; y los tejidos pulmonares del grupo de ratones proporcionados con terapia con lactoferrina bovina tuvieron un color similar al del grupo de control sano de ratones (Figura 9). Con el grupo de control de ratones proporcionados sin terapia, los tejidos pulmonares fueron más rojizos y se observó que sangraban (Figura 9).

[Ejemplo 9] Experimento para demostrar que la inhibición en la formación de las NET es una actividad específica a la lactoferrina

Se ha documentado que el fragmento N-terminal de la lactoferrina está cargado positivamente y, por lo tanto, se puede unir a una molécula de ADN cargada negativamente (He J, y Furmanski P., Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. Nature. 1995;373(6516):721-4). Por lo tanto, se realizó un experimento para investigar si las proteínas que son de diferentes tipos de lactoferrina pero que eran similares a la lactoferrina en peso molecular (PM) y en el punto isoeléctrico (pl) inhibirían cada una la formación de las NET. Para el experimento, se utilizaron las siguientes proteínas.

Tabla 3

La angiogenina se conoce como factor de angiogénesis tumoral (Strydom DJ, Fett JW, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riordan JF y Vallee BL. La secuencia de aminoácidos de la angiogenina derivada de tumor humana. Biochemistry. 1985; 24:5486-94). La lactoperoxidasa es hemo peroxidasa contenida en la leche de los mamíferos en una alta concentración similar a la lactoferrina (Sharma S, Singh AK, Kaushik S, Sinha M, Singh RP, Sharma P, Sirohi H, Kaur P y Singh TP., Lactoperoxidase: structural insights into the function, ligand binding and inhibition. Int J Biochem Mol Biol. 2013; 4:108-28).

. Preparación de lactoperoxidasa, angiogenina y lactoferrina

Se disolvió proteína bruta aislada de leche bovina en 10 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) y la disolución obtenida se cargó en una columna de SP-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences) equilibrada con el tampón (caudal: 3,0 ml/min). La proteína unida a la columna se lavó con el tampón y se eluyeron lactoperoxidasa, angiogenina y lactoferrina por medio de un gradiente de concentración lineal de cloruro de sodio en el tampón (entre ,3 a 1,0 M).

2. Inhibición de la formación de las NET

La inhibición de la formación de las NET se realizó por medio de medición de la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo de manera similar a la del Ejemplo 2. El experimento se realizó por triplicado en tres sistemas independientes (n = 3).

. Resultados

Ni la lactoperoxidasa ni la angiogenina inhibieron la formación de las NET (FIG. 10; p < 0,01). Esto indica que la inhibición de la formación de las NET por la lactoferrina no es provocada solamente por la carga positiva de las moléculas de lactoferrina, sino que es provocada por la actividad específica a la lactoferrina.

[Descripción de los datos presentados en los dibujos]

La Figura 1 muestra el efecto inhibitorio de la lactoferrina añadida 30 minutos antes de que los neutrófilos en la sangre periférica de voluntarios sanos se estimularan en la formación de las NET. (A) En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 2, 20 o 200 |jg/ml de lactoferrina bovina (representada como "bLF" en todas las figuras), el efecto inhibitorio en la formación de las NET se observó en su manera dependiente de concentración. En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 20 jg/ml de lactoferrina bovina, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,01. En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 200 jg/ml de lactoferrina bovina, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,001. DPI a 10 jM se utilizó como control positivo. (B) En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 2, 20 o 200 jg/ml de lactoferrina humana (representada como "hLF" en todas las figuras), el efecto inhibitorio en la formación de las NET se observó de manera similar a la lactoferrina bovina. Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa p < 0,001. (C) La Figura 1-C muestra imágenes del pretratamiento realizado con 200 jg/ml de lactoferrina humana. Los ADN extracelulares se tiñeron con 500 nM de verde Sytox. Se observó que la liberación de los ADN al exterior de las células se inhibe con el pretratamiento con lactoferrina humana. (D) El pretratamiento se realizó con lactoferrina humana y se midió la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo 3 horas después de que los neutrófilos se estimularan. La concentración de los ADN secretados al exterior de las células por medio de la estimulación realizada para formar las NET se suprimió de una manera dependiente de la concentración de lactoferrina bovina. En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 20 jg/ml de lactoferrina humana, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,05. En el caso en el que el pretratamiento se realizó con 200 jg/ml de lactoferrina humana, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,001. (E) El pretratamiento se realizó con 200 jg/ml de lactoferrina humana y se analizaron los neutrófilos con un microscopio electrónico de barrido 3 horas después de que los neutrófilos se estimularan para formar las NET. La Figura 1-E muestra imágenes obtenidas por medio del microscopio electrónico de barrido. En el caso en el que los neutrófilos no se estimularon, los neutrófilos se mantuvieron esféricos y no se observó la liberación de los ADN. En el caso en el que los neutrófilos se estimularon con PMA, las células se rompieron y se formaron muchos componentes de fibra. Por el contrario, se observó que los neutrófilos pretratados con lactoferrina humana formaban componentes de fibra de este tipo en haces. Esto indica que las fibras de las NET se condensaron.

La Figura 2 muestra el efecto inhibitorio de la lactoferrina en la formación de las NET añadida después de que los neutrófilos en la sangre periférica de voluntarios sanos se estimularan para formar las NET. Los ratones pretratados con 200 |jg/ml de lactoferrina humana 30 minutos antes de que los neutrófilos se estimularan se utilizaron como grupo de control de ratones. Cuando se añadieron 200 jg/ml de lactoferrina una o 2 horas después de que los neutrófilos se estimularan para formar las NET, la formación de las NET se inhibió. (Se midió la concentración de ADN en el sobrenadante del cultivo). En el caso en el que la lactoferrina se añadió 1 hora después de que los neutrófilos se estimularan, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,001. En el caso en el que la lactoferrina se añadió 2 horas después de que los neutrófilos se estimularan, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa de p < 0,001.

La Figura 3 muestra la influencia de la lactoferrina en la tasa de supervivencia de ratones SCG/Kj modelo de ANCA, que son ratones modelo de enfermedades autoinmunitarias. A la octava semana de edad, los ratones se dividieron en un grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina (n = 16) y un grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina bovina (n = 16). La Figura 3 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier hasta la 18a semana de edad. El grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina exhibieron una mejora significativa en la tasa de supervivencia. Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa p < 0,05.

La Figura 4 muestra la influencia de la administración de lactoferrina en el título de anticuerpos del MPO-ANCA (anticuerpo frente al citoplasma de los neutrófilos específico de mieloperoxidasa) en la sangre, en el ADN de la sangre y en los tejidos renales de los ratones SCG/Kj. (A) Los ratones SCG/Kj, concretamente, animales modelo para vasculitis asociada a ANCA, que es una enfermedad provocada por la formación de las NET, produce MPO-ANCA relacionado con la aparición de la enfermedad. El título de anticuerpos del MPO-ANCA de los ratones SCG/kJ con 12 semanas de edad se midió por medio de ELISA. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina (n = 8), el valor fue menor que con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina (n = 8). Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa p < 0,05. (B) Se evaluó el contenido de ADN en la sangre que contenía ADN liberados de los neutrófilos por la formación de las NET. La concentración de ADN en el plasma de ratones SCG/Kj con 13 semanas de edad fue menor con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina (n = 8) que con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina (n = 7). Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa p < 0,05. (C) La influencia de lactoferrina bovina en el riñón de los ratones SCG/Kj se evaluó por medio del uso de la tinción tricrómica de Masson. El riñón del grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina fue más leve con respecto a fibrosis intersticial, infiltración celular inflamatoria (superior) y formación de drepanocitos (inferior) de los tejidos que el riñón de los ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina bovina.

La Figura 5 muestra los resultados de una prueba con respecto a la influencia, en tejidos subcutáneos, de administrar lactoferrina a los ratones del modelo 1 de RLS, que son ratones modelo de enfermedades no autoinmunitarias. (A) Se dividieron ratones C57BL/6j con ocho semanas de edad en un grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina (n = 16) y un grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina bovina (n = 15). Dos semanas después, concretamente, a la 10a semana de edad, LPS (100 jg/ratón) y TNFa (0,3 jg/ratón) se administraron por vía subcutánea a los ratones para inducir rubefacción (hemorragia subcutánea). La Figura 5-A muestra imágenes de una parte de ratones de este tipo. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina, la rubefacción se suprimió significativamente en comparación con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina bovina. (B) La Figura 5-B es un gráfico que muestra los resultados de la cuantización realizada por medio del uso de las puntuaciones de evaluación en la hemorragia subcutánea mostrada en la Tabla 2. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina, las puntuaciones de hemorragia subcutánea fueron menores que con el grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina bovina. Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa p < 0,001. (C) La Figura 5-C muestra los resultados de la evaluación, en los tejidos cutáneos de los ratones en los que se indujo RLS, realizada por medio del uso de tinción tricrómica de Masson y la tinción de esterasa. Con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina, la hemorragia subcutánea y la formación de trombos se suprimieron. Se mostró por medio de tinción de esterasa que la infiltración de neutrófilos se suprimió con el grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía lactoferrina bovina.

La Figura 6 muestra la influencia, en la bolsa de aire proporcionada por vía subcutánea en la parte posterior, de administrar lactoferrina bovina a los ratones del modelo 2 de RLS, que son ratones modelo de enfermedades no autoinmunitarias. (A) Una bolsa de aire se creó por vía subcutánea en la parte posterior de cada uno de los ratones y los ratones se dividieron en un grupo de ratones sin inflamación ni irritación (n = 12; 100 jg/ratón de LPS; 0,3 jg/ratón de TNF-a), un grupo de ratones alimentados con el pienso que no contenía lactoferrina (n = 12; 100 jg/ratón de LPS; 0,3 jg/ratón de TNF-a) y un grupo de ratones alimentados con el pienso que contenía

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la formación de trampas extracelulares de leucocitos, la composición comprende lactoferrina, en donde la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en poliangeítis microscópica, angeítis granulomatosa alérgica, reacción local de Shwartzman, lesión renal aguda (LRA) acompañada por lesión por isquemia-reperfusión y coagulación intravascular diseminada.

2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde la lactoferrina es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en lo siguiente:

(a) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 1 a 5; y

(b) una proteína que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de un 90 % o superior con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 a 5, la proteína deriva de un mamífero y tiene actividad de inhibición de la formación de trampas extracelulares de leucocitos.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la lactoferrina se encuentra en una cantidad de entre 0,001 a 10 g/kg/día.

4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la lactoferrina deriva de seres humanos.

5. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los leucocitos son uno seleccionado de entre el grupo que consiste en neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, monocitos, macrófagos y mastocitos.

6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se encuentra en forma de un agente de inyección.

7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es administrable por vía oral.

8. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se encuentra en forma de alimento.