JP2001048804A

JP2001048804A - ＴＮＦ−α産生抑制剤

Info

Publication number: JP2001048804A
Application number: JP2000055360A
Authority: JP
Inventors: Motoi Matsuura; 基松浦; Yoshitaka Nakamura; 吉孝中村; Eiji Negishi; 栄志根岸; Makoto Yamaguchi; 真山口; Kiyoshi Kobayashi; 清志小林; Katsuyuki Uchida; 勝幸内田; Hajime Sasaki; 一佐々木; Takaji Yajima; 高二矢島; Tamotsu Kuwata; 有桑田
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2001-02-20

Abstract

(57)【要約】【課題】異常なＴＮＦ-α産生と相関する様々な病態
の、改善、予防、または治療に有効な、経口医薬品、食
品組成物、および経腸栄養剤を提供することを課題とす
る。【解決手段】ラクトフェリンを予め経口投与すること
により、その後のグラム陰性菌などの侵入によるＴＮＦ
-αの異常産生が抑制されることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ＴＮＦ-α産生抑
制剤に関する。また、本発明は、ＴＮＦ-αの産生に起
因する病態の予防、改善、治療、または再発予防のため
の医薬製剤に関する。さらにまた、本発明は、ＴＮＦ-
αの産生に起因する病態の予防、改善、または再発予防
に有用な食品組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ-α）は、活性
化マクロファージなどが産生する代表的なサイトカイン
の一種で、マクロファージを細菌（特にリポ多糖：ＬＰ
Ｓあるいはエンドトキシン）やウイルス、寄生虫などで
刺激したときに産生される。

【０００３】ＴＮＦ-αは、さまざまな免疫・炎症反応
に関与し、種々の炎症性疾患の病態にも深く関わってい
ることが知られている。すなわち、ＴＮＦ-αの異常産
生は、敗血症ショック、全身性エリテマトーデス、慢性
関節リュウマチ、などの膠原病、アレルギー疾患、動脈
硬化、インスリン抵抗性、糖尿病などの代謝性疾患や、
多発性硬化症、移植片対宿主、ウイルス肝炎、HIV感染
などの各種感染症、など多くの病態の重症度と相関して
いる。ＴＮＦ-αとエンドトキシンの相乗作用による敗
血症性ショックは特に重要であり、敗血症性ショック
後、しばしば多臓器不全症に陥る。敗血症（sepsis）と
いう病態は、血中へ細菌が侵入し、それが原因で臓器不
全などを併発し、全身状態が悪化している状態である。
最近、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）という病態が
注目されているが、敗血症はこの概念に包括される。Ｓ
ＩＲＳは、各種の侵襲（手術、重症膵炎、外傷、熱傷、
ショック、敗血症）により、免疫担当細胞、あるいは炎
症細胞が刺激を受け、サイトカインを産生し、それが血
中へ吸収され、全身を循環し、全身的な炎症反応を引き
起こしている状態である。

【０００４】そこで、ＴＮＦ-αの作用を抑制あるいは
阻害する物質は、上記病態の予防、改善、または治療剤
として有用であるとの考えから、ＴＮＦ産生レベルを抑
制する物質、ＴＮＦ受容体に対するアンタゴニスト、あ
るいはＴＮＦに対する抗体など、数多くの特許出願がな
されているこのうち抗ＴＮＦヒト化抗体はすでに実用
化されている。しかしながら、これらの多くは化学物質
であり大なり小なり副作用をもち、また抗ＴＮＦ抗体は
依然として抗原性の問題が残されている。そこで、上述
の作用を有し、かつ、これまでの長い食経験で安全性の
保証された経口摂取可能なＴＮＦ-α産生抑制作用を有
する物質の登場が求められている。

【０００５】哺乳動物の、主として乳汁中に含まれる鉄
結合性の糖タンパク質であるラクトフェリン（以下、
「Ｌｆ」と称する）は、その候補の一つと考えられる。
Ｌｆは、多彩な生物活性（抗菌作用、過酸化脂質生成抑
制作用、鉄吸収調節作用、免疫機能調節作用、細胞増殖
作用、および細菌感染防御作用）を示すことから、Ｌｆ
による、生理学的異常の是正、予防、あるいは治療実験
の試みがなされている(Zimecki, M. et al.: Arch. Imm
unol. Ther. Exp., 46: 231-240, 1998)。

【０００６】Ｌｆの、ＴＮＦ-α産生抑制作用に関して
も数多くの文献が存在する。例えば、ＬＰＳは、グラム
陰性菌外膜の構成因子であり、最もよく知られたサイト
カイン誘導因子であるが、ヒトＬｆは、ＬＰＳで刺激し
た単核細胞からのＩＬ-１、およびＴＮＦ-αの産生を阻
害する（Crouch, S.P.M. et al.: Blood, 80(1): 235-2
40, 1992)、ウシＬｆをマウスに静脈内投与し、その２
４間後にＬＰＳを投与すると、血清中のＴＮＦ-αの濃
度が有意に低下する（Machnicki, M. et al.: Int. J.
Exp. Path., 74: 433-439, 1993）等である。一方、Ｌ
ｆの経口投与では、ウシＬｆを含む市販品のカプセルを
連続１０日間経口摂取（ウシＬｆとして４０ｍｇ/日）
した健常人の血液細胞におけるＴＮＦ-αのＬＰＳ誘導
産生量に与えるＬｆの影響はより小さい(Zimecki, M. e
t al.: Arch. Immunol. Ther. Exp.,46: 231-240, 199
8)等である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＴＮＦ-α
産生の抑制剤、および該ＴＮＦ-αの産生と相関する様
々な病態の、予防、改善、治療、または再発予防に有効
な経口性組成物、および医薬品を提供することを課題と
する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、Ｌｆを予め経口投
与することにより、その後のグラム陰性菌などの侵入に
よる、ＴＮＦ-αの産生が抑制されることを見出した。
そして、ＴＮＦ-αの産生に相関する様々な病態の、改
善、予防、治療、または再発予防に、Ｌｆが有効である
ことが期待され、Ｌｆを有効成分とする上記病態の患者
の病態の改善、予防、治療、または再発予防に有用な経
口性組成物、および医薬品を提供することが可能である
との結論に達し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、（１）ＴＮＦ-α
の産生抑制を必要とする病態の予防、改善、治療、また
は再発予防のための、有効量のラクトフェリンを含有す
る経口性ＴＮＦ-α産生抑制剤、（２）ＴＮＦ-αの産
生に起因する病態の予防、改善、再発予防、または治療
のための有効量のラクトフェリンを含有する経口性医薬
製剤、（３）ＴＮＦ-αの産生に起因する病態の予
防、改善、再発予防のための有効量のラクトフェリンを
含有する経口性組成物、（４）健康食品、機能性食
品、栄養補助食品、特定保健用食品、治療食、経腸栄養
食品である（３）の経口性組成物、（５）ＴＮＦ-α
の産生に起因する病態の予防、改善、再発予防に有用な
経口性組成物を製造するための有効量のラクトフェリン
の使用、（６）経口性組成物が健康食品、機能性食
品、栄養補助食品、特定保健用食品、治療食、経腸栄養
食品である（５）のラクトフェリンの使用、に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】定義 “有効量のラクトフェリン”とは、後述する試験例１〜
７に記載の、ＴＮＦ-α産生を抑制するラクトフェリン
用量から導かれる量を意味する。

【００１１】ＬＰＳは、in vivoにおけるＴＮＦ-αの産
生誘導実験に最もよく用いられている。ＬＰＳを動物に
投与すると、ＴＮＦ-αが広範に産生される。

【００１２】そこで、本発明者らは、Ｌｆの経口投与に
よる、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ-α産生の抑制作用を調べるた
めに、Ｌｆを単回、あるいは連続経口投与し、その後、
ＬＰＳを腹腔投与し、ＴＮＦ-α産生を誘導した後、血
中のＴＮＦ-α量を測定した。結果、図１、および２に
示すように、Ｌｆ投与群は、ＴＮＦ-α濃度の上昇を有
意に抑制していることが認められた。そして、この抑制
作用に対するＬｆの有効濃度を調べた結果、図３に示す
ように、Ｌｆが、0.5〜1.0mg/マウス/day以上で、血中
ＴＮＦ-α濃度の上昇抑制が認められた。Ｌｆは、リピ
ドＡおよびintactなＬＰＳに直接結合することがin vit
oの実験で示されている（Appelmelk, B. J.et al.: Inf
ection and Immunology.62: 2682-2632, 1994)。すなわ
ち、Ｌｆを予め経口投与することによって、グラム陰性
菌外膜の構成因子であるＬＰＳをはじめ、多様な菌体成
分、分泌タンパク質、などによるＴＮＦ-αの望ましく
ない異常産生が抑制され、その結果、ＴＮＦ-αが血中
に吸収され、全身を循環し、全身的な反応（SIRS; syst
emic inflammatory response syndrome)の発症を予防す
るとすることが期待される。本実験では、興味あること
に、ＬＰＳ投与時には、すでに血中には、Ｌｆが検出さ
れず、ＬｆのＴＮＦ-α産生抑制作用が、ＬｆとＬＰＳ
との結合によるものではないことが推察される。

【００１３】クッパー細胞（Kupffer cell）は、肝臓の
類洞腔内に存在する組織マクロファージで、全身のマク
ロファージの約８０％を占める。クッパー細胞は、エン
ドトキシン刺激によってＴＮＦ-αを含む様々なサイト
カイン（ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＬ-１０等）を産生する
（Lichman S.N. et al.: Am. J. Physiol., 275: G39-G
46, 1998; Matsuura, K. et al.: J. Exp. Med., 179:
1671-1676, 1994; Ikejima, K. et al.: Am. J. Physio
l., 274: G669-G676, 1998; Shanker, G. et al.: Lymp
hokine Cytokine Res., 13(6): 377-82, 1994）。ＲＡ
Ｗ２６４細胞は、Abelson 白血病ウイルスで形質転換
したマウスの白血病の単球マクロファージ様細胞である
（J. Immunol., 119: 950, 1977; Tanida, N. et al.:
J. Biochem., 112: 616, 1992）。ＴＨＰ-１細胞は、急
性単球白血病患者（１歳、男性）の末梢血から樹立され
た（Tsuchiya, S. et al.: Int. Cancer, 26: 171, 198
0）。これらの細胞を用いたin vitroの実験系は、生体
内における、エンドトキシンショックによるＴＮＦ-α
産生を再現したものとして利用価値は高い。

【００１４】そこで、本発明者らはこれらの細胞を培養
し、ヒトおよびウシＬｆの炎症抑制効果を、炎症性サイ
トカインの一つであるＴＮＦ-αの産生量を調べること
により評価した。その結果、図４〜図７に示すように、
ヒトＬｆ添加群は、ＴＮＦ-αの産生を顕著に抑制して
いることが認められた。この抑制作用に対するヒトＬｆ
の有効濃度は、10〜100μg/ml以上であった。本発明の
試験例では、ＬｆとＬＰＳとの共存はしておらず、この
効果が、ＬｆとＬＰＳの結合によるものではないことが
推察される。

【００１５】また、本発明者らは、ＬＰＳショックモデ
ルマウスに対し、Ｌｆを腹腔内投与して、Ｌｆが、血中
のＴＮＦ-α濃度上昇を抑制するかどうかを調べた。結
果、図4に示すように、血中のＴＮＦ-α濃度は、ヒトＬ
ｆを投与した群は、ウシＬｆおよびウシ血清アルブミン
を投与した群に比較して、その上昇を抑制していること
が認められた。これらのことより、ヒトＬｆには、ＴＮ
Ｆ-α産生抑制効果があると考えられる。

【００１６】本発明の目的に用いられるＬｆは、ヒトを
含む哺乳動物の乳から公知の方法（例えば、特開平11-2
9600公開公報）で得られる。また、遺伝子組換え技術に
より、組換えＬｆとして得ることもできる（例えば、米
国特許5,571,697）。また、本発明のＬｆは、Ｌｆの生
物活性を有するタンパク質、またはその対立遺伝子変種
を含む。Ｌｆの生物活性とは、Ｌｆの代謝的、または生
理的機能を意味し、類似の活性、または改善された活
性、望ましくない副作用を低減させた活性をも含む。さ
らにＬｆの抗原性活性、免疫原性活性をも含む。また、
上記Ｌｆを、塩酸、クエン酸などにより脱鉄したアポＬ
ｆ、またはアポＬｆを金属でキレートさせた金属飽和ア
ポＬｆも本発明に用いることができる

【００１７】本発明のＬｆ、およびその生物活性を有す
る変種は、ヒトを含む哺乳動物でのＴＮＦ-αの有害な
作用を、予防、改善、または治療するために、すなわ
ち、過剰、またはＴＮＦ-αが内因的に形成され、ある
いは外部から投与される状態を、処置するために用いら
れる。過剰、または異常なＴＮＦ-α刺激により生じる
疾患として、例えば、癌や感染症における悪液質、アレ
ルギー性、および炎症性疾患、自己免疫疾患、肺循環疾
患、感染症、および骨吸収疾患等、例えば、リウマチ性
関節炎、リウマチ性脊椎炎、変形性関節炎、痛風、敗血
症、敗血症ショック、内毒素ショック、グラム陰性ショ
ック、中毒性ショック症候群、ARDS（急性呼吸困難
症）、肺サルコイドーシス、喘息、珪肺症、悪液質、潰
瘍性大腸炎、クローン病、骨粗鬆症、再灌流後の臓器障
害、中枢神経系の炎症性疾患、例えばマラリア、多発性
硬化症、全脳炎、感染症、例えばＡＩＤＳ、狂牛病、皮
膚の感染疾患、例えば、蕁麻疹、乾せん、アトピー性皮
膚炎、接触性皮膚炎、エリトマトーデス、および尿崩
症、例えば、パーキンソン病の際の神経保護、例えば多
発性梗塞、および卒中発作後の痴呆等、また、髄膜炎、
肝炎、II型糖尿病等が挙げられる。

【００１８】Ｌｆを、本発明の、ＴＮＦ-αの異常、ま
たは過剰産生に起因する様々な病態の症状の予防、改
善、障害された臓器の庇護、機能回復、あるいは治癒後
の予防に用いる場合の好ましい使用形態は、Ｌｆの有効
量の経口摂取である。すなわち、飲食品、栄養補助食
品、特別用途食品（病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉
乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、特定保健用食
品）、経腸栄養剤、医薬部外品、あるいは医薬品等に対
し、Ｌｆの有効量を配合することを含む。

【００１９】栄養による治療を進める主役は治療食であ
る。同じ病名であっても、病期により、また、各患者個
人によっても病態は異なるので、治療食の内容は、この
病態の変化に伴って変わるべきものであり、それは当業
者に公知である。Ｌｆの配合量は、最終組成の少なくと
も１％、望ましくは、５〜４０％である。

【００２０】経腸栄養は、経口、あるいは経鼻的に挿入
したチューブや胃瘻、空腸瘻から栄養を注入する方法で
ある。経腸栄養剤は、現在、成分栄養、低残さ食、天然
食品流動食に分類されるが（山東勤弥,岡田正,“最新内
科学大系第6巻肥満症・臨床栄養”井村裕夫他編,中山書
店,p.289-307, 1995)、本発明はこれらを含む。

【００２１】Ｌｆを食品の一成分として使用した場合、
日常の食生活のなかで、Ｌｆの有効量を安全に摂取する
ことができる。その根拠として、Ｌｆは、ヒト初乳に5
〜10mg/mlの高濃度で含まれており、常乳でも１〜２mg/
mlで含むことから、乳児は、誕生後数日間は、１日約３
g、その後も１日約１gのＬｆを摂取していること（New
Food Industry, 33: 72, 1991)をあげることができる。

【００２２】Ｌｆを医薬品として、ＴＮＦ-αの異常産
生に起因する病態の治癒後に、Ｌｆを投与する場合に
は、Ｌｆの予防剤としての使用形態であり、発症中に使
用するときは、Ｌｆの治療剤としての使用形態である。

【００２３】投与は、動物の種、投与目的、疾患の種
類、症状によって異なり、とくに限定されないが、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤として、直接投与
したり、飼料や飲水に混じて投与することができる。投
与量は、動物の種、投与目的、疾患の種類、症状により
異なり、とくに限定されないが、1〜5000mg/kg、好まし
くは、５〜1000mg/kg、さらに好ましくは10〜200mg/kg
程度である。Ｌｆは、日常摂取されているものであり、
本発明において使用される量では、毒性は知られていな
い。

【００２４】次に試験例を示して、この発明をさらに詳
しく説明する。以下の試験例では、雄性BALB/c マウス
（購入週令：６週令、日本チャールズリバー社、購入時
の体重：21g - 26 g、実験時の体重：25g〜30g）を使用
した。マウスは、群分けし、１週間予備飼育した後、実
験に供した。予備飼育期間中、および実験期間中は、通
常の日照サイクルで飼育し、市販の固形飼料（オリエン
タル酵母社製：MF 飼料）および飲水は自由摂取させ
た。

【００２５】ウシＬｆはDMV社、ＬＰＳは、試験例１〜
３についてはDIFCOLABORATORIES社（BE. Coli 0111:B
4)、試験例４〜７についてはLIST BIOLOGICAL LABORATO
REIS INC.、カゼインナトリウムは和光純薬社製を用い
た。

【００２６】［試験例１］Ｌｆ経口投与によるＴＮＦ-
α産生抑制Ａ）単回投与実験は、１）ウシＬｆ投与群、２）カゼインナトリウム
投与群、および３）PB投与群、の３群（１群１０匹）を
設定した。ウシＬｆ、あるいはカゼインナトリウムは、
１０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液(pH 7.
4）（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解した。

【００２７】上記１）〜３）群に対して、Ｌｆ溶液を0.
2ml（5 mg/マウス）、カゼイン-Na溶液0.2ml（5 mg/マ
ウス）、あるいはＰＢＳ0.2 mlを、胃ゾンデを用いて、
経口投与した。投与24時間後に、上記１）〜３）の各群
に対して、ＬＰＳ溶液（生理食塩水に溶解）0.2ml（50
μg/マウス）を腹腔内投与した。90分後、眼窩より採血
し、１時間室温に放置した。遠心分離し、上清を適度に
希釈し、上清中のＴＮＦ-α濃度を、ELISA 測定キット
（アマシャムファルマシア製、[(m)ＴＮＦ-α], mouse,
ELISA system, RPN2718）で測定した。

【００２８】結果を、図１に示す。ウシＬｆ投与群は、
ＰＢＳ投与群に比較して、血中のＴＮＦ-α濃度の上昇
を有意に抑制していることが認められる（危険率1％未
満：Fisher検定）。ＰＢＳ投与群とカゼイン-Na投与群
の間には、若干、ＴＮＦ-α濃度に差が認められるが、
有意ではなく、血中ＴＮＦ-α濃度の上昇抑制が、ウシ
Ｌｆによるものであることが明らかである。

【００２９】Ｂ）連続投与上記１）〜３）群に対して、Ｌｆ溶液を0.2ml（5 mg/マ
ウス/日）、カゼイン-Na溶液0.2ml（5 mg/マウス）、あ
るいはＰＢＳ0.2 mlを、胃ゾンデを用いて、５日間連続
経口投与した以外は、Ａ）のプロトコールにしたがっ
た。結果を図２に示す。ウシＬｆ投与群は、生理食塩水
投与群に比較して、血中のＴＮＦ-α濃度の上昇を有意
に抑制していることが認められる（危険率５％未満：Fi
hser検定）。ＰＢＳ投与群とカゼイン-Na投与群の間に
は、ＴＮＦ-α濃度に差が認められず、血中ＴＮＦ-α濃
度の上昇抑制が、ウシＬｆによるものであることが明ら
かである。

【００３０】［試験例２］各種用量のＬｆ経口投与によ
る血中ＴＮＦ-α濃度上昇抑制実験は、１）各種用量のウシＬｆ投与群（0.25、0.5、
1.0、あるいは5.0 mg/マウス/日の４群）、および２）
ＰＢＳ投与群、の５群（１群１０匹）を設定し、５日間
連続経口投与した以外は、Ａ）のプロトコールにしたが
った。結果を図３に示す。ウシＬｆが1.0、あるいは5.0
mgの群では、有意な血中ＴＮＦ-α濃度の上昇抑制が認
められる（危険率５％未満：Fihser検定）。

【００３１】[試験例３] ヒトＬｆのマクロファージに
おけるＴＮＦ-α産生抑制マクロファージは、骨髄の前駆細胞から成熟分化した血
中単球に由来する。この系列に含まれる細胞としては、
肝のクッパー細胞、肺の肺胞マクロファージ、脳のミク
ログリア腹腔および胸腔内マクロファージ、骨の破骨細
胞などがある。これらのマクロファージは、形態、表面
マーカー、および機能などにおいて多様な形質を示し、
一つのマクロファージで得た知見は、必ずしも他のマク
ロファージには当てはまらない。そこで、マウス由来の
クッパー細胞、ＲＡＷ２６４細胞、およびヒト由来のＴ
ＨＰ-１細胞を用いて、ヒトＬＦのマクロファージの違
いによるＴＮＦ-α産生抑制効果を調べた。

【００３２】１）マウス由来のクッパー細胞における
ＴＮＦ-α産生抑制このマクロファージは、肝在住型の、いわゆる組織結合
性マクロファージである。ＢＡＬＢ/ｃマウス由来のク
ッパー細胞を用いて、ＬＰＳ誘導によるＴＮＦ-α産生
に対するヒトＬＦの抑制効果を調べた。 1）ヒトＬｆ添加群（ｎ＝５）、および２）カゼインナ
トリウム添加群（ｎ＝５）（対照群）の２群を設定し
た。マウス肝臓よりクッパー細胞を以下のようにして調
製した。マウスを頸椎脱臼によりと殺後、開腹し、門脈
と下大静脈を露出させた。下大静脈を切断し、コラゲナ
ーゼ溶液を門脈から流入し灌流した。肝臓を摘出し、リ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.２）で洗浄し
た。再び肝臓をコラゲナーゼ溶液に移し、メスで細切し
た後、メッシュで濾過し、組織片を除去した。濾液を遠
心分離（５５０ｒｐｍ、２分）し肝細胞を沈澱させ、そ
の上清を別のチューブに移した。上清を遠心分離（１０
００ｒｐｍ、５分）してクッパー細胞および内皮細胞を
回収した。ＰＢＳを添加した後、遠心分離（５５０ｒｐ
ｍ、２分）により細胞凝集物を沈澱させ、その上清を別
のチューブに移した。上清を遠心分離（１０００ｒｐ
ｍ、５分）してクッパー細胞および内皮細胞を回収した
後、適当な密度に培養液（ＲＰＭＩ１６４０/５％ＦＣ
Ｓ）で希釈し、２４ウエル培養プレートに播種し（１×
１０⁵細胞/ウエル）１時間置いた。その後、ウエルをＰ
ＢＳで洗浄し、ウエルに接着しているクッパー細胞を得
た。

【００３３】１）ヒトＬｆ０.１〜１０００μｇ/ｍｌ、
あるいは２）カゼインナトリウム０.１〜１０００μｇ/
ｍｌの濃度で含む新しい培養液を各ウエルに加えた。プ
レートは３７℃ ＣＯ₂インキュベーター中で１８時間培
養した。その後、ＬＰＳを１ｎｇ/ｍｌの濃度で含むＲ
ＰＭＩ-1640培地に交換し、３７℃ ＣＯ₂インキュベー
ター中で４時間培養した。培養後、培養液を適度に希釈
し、培養液中のＴＮＦ-α濃度を、ELISAキット（アマシ
ャムファルマシアバイオテク社製、[(m)ＴＮＦ-α], mo
use, ELISA system, RPN2718）で測定した。結果を図４
に示す。

【００３４】ヒトＬｆを培地に予め添加し、その後ＬＰ
Ｓを培地に添加してＴＮＦ-α産生を誘導すると、ヒト
Ｌｆ添加群の場合には、クッパー細胞によるＴＮＦ-α
産生は、Ｌｆ濃度が１００μｇ/ｍｌまでは、濃度依存
的に抑制されていることが認められる。さらに、この実
験では、ＬｆとＬＰＳとの共存はなく、このヒトＬＦの
抑制効果が、ＬｆとＬＰＳの結合によるものではないこ
とが推察された。

【００３５】２）ヒトＬｆのＲＡＷ２６４細胞培養
系におけるＴＮＦ-α産生抑制ＲＡＷ２６４細胞は、その性質が腹腔内マクロファー
ジや血中のマクロファージに近いとされており、クッパ
ー細胞のような組織結合性マクロファージとは異なるマ
クロファージである。

【００３６】１）と同様に、ヒトＬｆ添加群、および
２）カゼインナトリウム添加群（対照群）、の２群を設
定した。ＲＡＷ２６４（理化学研究所より分譲）は、
試験例３と同様の方法および条件で培養し（１×１０⁵
細胞/ウエル）、培養液中のＴＮＦ-αの濃度を測定し
た。結果を図５に示す。

【００３７】この場合も、Ｌｆ濃度が１００μｇ/ｍｌ
までは、クッパー細胞の場合と同様にヒトＬＦがＴＮＦ
-α産生抑制作用を有することが認められる。Ｌｆの濃
度が１００μｇ/ｍを越えると、対照群においてもＴＮ
Ｆ-α産生抑制が認められる。

【００３８】３）ヒトＬｆのＴＨＰ-１細胞培養系に
おけるＴＮＦ-α産生抑制１）と同様に、1）ヒトＬｆ添加群、および２）カゼイ
ンナトリウム添加群（対照群）、の２群を設定した。Ｔ
ＨＰ-１細胞（理化学研究所より分譲）をホルボールエ
ステル０.２μMを含む培養液（ＲＰＭＩ-1640/１０％
ＦＣＳ添加）で２日間培養し、マクロファージへと分化
誘導した。分化誘導したＴＨＰ-１細胞は、試験例３
と同様の方法（ＬＰＳの濃度は１００ｎｇ/ｍｌ）で培
養し（１×１０⁵細胞/ウエル）、培養液中のＴＮＦ-α
の濃度を測定した。結果を図６に示す。

【００３９】この場合も、Ｌｆ濃度が１００μｇ/ｍｌ
までは、クッパー細胞、あるいはＲＡＷ２６４細胞の
場合と同様に、ヒトＬＦがＴＮＦ-α産生抑制作用を有
することが認められる。以上の試験結果から、ＬＦは、
マクロファージの由来に関係なくＴＮＦ-α産生を抑制
することが示唆された。

【００４０】[試験例４] Ｌｆの腹腔内投与によるＴ
ＮＦ-αの産生抑制 1）ヒトＬｆ投与群（ｎ＝１０）、2）ウシ血清アルブミ
ン（対照群）（ｎ＝１０）、の２群を設定した。ヒトＬ
ｆ、あるいはウシ血清アルブミンは、１０ｍＭ NaClを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（pH 7.4）に溶
解した。上記各群に対して、ヒトＬｆ溶液０.２ｍｌ
（５０μg/マウス）、ウシ血清アルブミン溶液を０.２
ｍｌ（５０μg/マウス）、をそれぞれ腹腔内投与した。
投与２４時間後に、上記各群に対して、ＬＰＳ溶液（生
理食塩水に溶解）０.２ｍｌ（５０μg/マウス）を腹腔
内投与した。９０分後、眼窩より採血し、１時間室温に
放置した。遠心分離し上清を得た。上清を適度に希釈
し、上清中のＴＮＦ-α濃度を試験例３と同様に測定し
た。結果を図７に示す。ヒトＬｆ投与群は、対照のウシ
血清アルブミン投与群に比較して、血中のＴＮＦ-α濃
度の上昇を有意に抑制していることが認められる（危険
率1％未満：Fisher検定）。なお、ヒトＬｆ投与24時間
後、血中にヒトＬｆが検出されないことから、ヒトＬｆ
のＴＮＦ-α上昇抑制作用は、ヒトＬｆとＬＰＳの結合
によるものではないことが推察される。

【００４１】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明は、これらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００４２】［実施例１］ウシＬｆ（ＤＭＶ社製）50
g、糖類50g、蜂蜜15g、アスコルビン酸１g、クエン酸0.
5g、および香料適量に、水を加えて、総量１kgとし、濾
過滅菌後、ビンに100mlずつ無菌的に充填して、飲食品
タイプの飲料を作製した。

【００４３】［実施例２］ウシＬｆ（ＤＭＶ社製）50
0g、特開平11-116596公報記載の方法で製造した、Ｎ末
端がピロ化されていないホエー由来のペプチド250g、蜂
蜜50g、ビタミン類40g、ミネラル10g、水溶性食物繊維
（マンナン、およびグアガム分解物の混合品）６g、お
よび香料に、水を加えて総量10kgとし、殺菌した後、バ
ックに100mlずつ無菌的に充填し、医薬品としてのドリ
ンク剤を製造した。

【００４４】

【発明の効果】本発明は、異常なＴＮＦ-α産生と相関
する様々な病態の、改善、予防、または治療に有効な、
経口医薬品、食品組成物、および経腸栄養剤を提供する
ことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシＬｆ投与群、カゼイン-Na投与群、およ
びＰＢＳ投与群、の３群に対して、Ｌｆ溶液を0.2ml（5
mg/マウス）、カゼイン-Na溶液0.2ml（5 mg/マウ
ス）、あるいはＰＢＳ0.2 mlを経口投与し、その24時間
後に、各群に対して、ＬＰＳ溶液（生理食塩水に溶解）
0.2ml（50μg/マウス）を腹腔内投与し、そして、90分
後、血中のＴＮＦ-α濃度を測定した結果を示す。図中
のエラーバーは、±１標準誤差を示す。

【図２】ウシＬｆ投与群、カゼイン-Na投与群、およ
びＰＢＳ投与群、の３群に対して、Ｌｆ溶液を0.2ml（5
mg/マウス）、カゼイン-Na溶液0.2ml（5 mg/マウ
ス）、あるいはＰＢＳ0.2 mlを５日間連続経口投与し、
その24時間後に、各群に対して、ＬＰＳ溶液（生理食塩
水に溶解）0.2ml（50μg/マウス）を腹腔内投与し、そ
して、90分後、血中のＴＮＦ-α濃度を測定した結果を
示す。図中のエラーバーは、±１標準誤差を示す。

【図３】ウシＬｆ投与群、およびＰＢＳ投与群、の２
群に対して、ウシＬｆ（0.25、0.5、1.0、あるいは5.0
mg/マウス/日の４群）、および２）ＰＢＳを５日間連続
0.2ml経口投与し、その24時間後に、各群に対して、Ｌ
ＰＳ溶液（生理食塩水に溶解）0.2ml（50μg/マウス）
を腹腔内投与し、そして、90分後、血中のＴＮＦ-α濃
度を測定した結果を示す。図中のエラーバーは、±１標
準誤差を示す。

【図４】マウスクッパー細胞初代培養系におけるＬＰ
ＳによるＴＮＦ-α産生誘導に対する、ヒトＬｆ、およ
びカゼインナトリウムの各濃度（１、１０、１００、お
よび１０００μｇ/ｍｌ）におけるＴＮＦ-α産生抑制効
果を示す図である。

【図５】同じく、ＲＡＷ２６４細胞におけるＴＮＦ-
α産生抑制効果を示す図である。

【図６】同じく、ＴＨＰ-１細胞におけるＴＮＦ-α産
生抑制効果を示す図である。

【図７】Ｌｆのマウス腹腔内投与に対する、ヒトＬ
ｆ、およびウシ血清アルブミン腹腔内投与による血中Ｔ
ＮＦ-α濃度を示す図である。図中のバーは、標準誤差
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 31/04 31/04 37/02 37/02 43/00 43/00 １１１１１１ (72)発明者山口真神奈川県小田原市成田540 明治乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者小林清志神奈川県小田原市成田540 明治乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者内田勝幸神奈川県小田原市成田540 明治乳業株式会社ヘルスサイエンス研究所内 (72)発明者佐々木一神奈川県小田原市成田540 明治乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者矢島高二神奈川県小田原市成田540 明治乳業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者桑田有東京都東村山栄町１−21−３明治乳業株式会社栄養科学研究所内Ｆターム(参考） 4B018 LB08 MD27 ME14 4C084 AA02 BA44 CA38 MA52 NA14 ZA022 ZA152 ZA592 ZA602 ZA612 ZA682 ZA752 ZA822 ZA892 ZA962 ZA972 ZB012 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB312 ZB352 ZC352 ZC552

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＮＦ-αの産生抑制を必要とする病態
の予防、改善、治療、または再発予防のための、有効量
のラクトフェリンを含有する経口性ＴＮＦ-α産生抑制
剤。
【請求項２】ＴＮＦ-αの産生に起因する病態の予
防、改善、再発予防、または治療のための有効量のラク
トフェリンを含有する経口性医薬製剤。
【請求項３】ＴＮＦ-αの産生に起因する病態の予
防、改善、再発予防のための有効量のラクトフェリンを
含有する経口性組成物。
【請求項４】健康食品、機能性食品、栄養補助食品、
特定保健用食品、治療食、経腸栄養食品である請求項３
に記載の経口性組成物。
【請求項５】ＴＮＦ-αの産生に起因する病態の予
防、改善、再発予防に有用な経口性組成物を製造するた
めの有効量のラクトフェリンの使用。
【請求項６】経口性組成物が健康食品、機能性食品、
栄養補助食品、特定保健用食品、治療食、経腸栄養食品
である請求項５に記載のラクトフェリンの使用。