JP5022454B2

JP5022454B2 - 卵巣機能改善剤

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Publication number: JP5022454B2
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Inventors: 壽宏樋口; 徹哉久原
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
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Description

本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤に関する。

近年の癌治療の発展により、治療後の生存率は大幅に向上してきた。中でも抗癌治療に適用される化学療法などの進歩によって、癌患者、特に小児癌や若年者の癌の予後は顕著に改善しており、現在では小児癌症例の約７０％は長期生存が可能である。その結果、癌治療後のＱＯＬ（quality of life）の維持が重要性を増してきた。つまり、患者の治療後の生活レベルを豊かで充実したものにすることが重要となっている。

特に女性患者においては、癌治療による妊孕能（にんようのう）の障害の克服、つまり妊娠、出産することのできる母体の維持、確保が大きなテーマである。最近の晩婚化により、結婚前に癌に罹患する女性の数も増加傾向を示している。

癌治療方法として一般に適用される抗癌化学療法は、性腺の機能障害をもたらすが、その程度は薬剤の種類と量、薬剤の併用方法、患者の年齢によって大きく影響される。一般的に、年齢が高いほど早発卵巣不全（ＰＯＦ）を発症するリスクが高くなる。

早発卵巣不全（ＰＯＦ）とは、一般に40歳未満で高ゴナドトロピン・低エストロゲン血性の続発無月経をきたす症候群を指し、最も重篤な排卵障害による卵巣性無月経といえる。その病因は多岐にわたっているものと思われるが、実地臨床上は、（１）突発性ＰＯＦ（既往に卵巣に対する手術、放射線治療、抗癌化学療法を受けていないもの）、（２）手術・化学療法関連ＰＯＦ（両側卵巣に摘出以外の手術操作あるいは抗癌化学療法を受けたもの）、（３）手術・放射線ＰＯＦ（手術や放射線により去勢されたもの）、と分類することができる（非特許文献１）。

化学療法による消化管や骨髄に対する障害は可逆的であるが、卵巣では不可逆変化が起こりやすい。また、思春期以降、卵の数は胎生期から減少が始まり、出生後も減少が続き、一般的に新たにつくられることはないと考えられている。化学療法はこの卵の減少を促進させるものであり、ほとんどの卵が不可逆変化を受けるとＰＯＦという病態を示すこととなる。すなわち、抗癌化学療法による卵巣機能障害は、この卵の減少を通じて引き起こされて、妊孕能の障害として現れたものである。

化学療法による卵巣機能障害を防いで妊孕能を維持する方法としては、治療前の体外受精による胚の凍結保存と、放射線治療の前の卵巣移動術が臨床的に行われている。しかし、胚の凍結保存には受精が必要なこと、卵巣移動術は体への負担が大きいこと等、いずれの方法も成功率の低さやコスト等から問題点が多い。

ラクトフェリンは、主に母乳中に含まれている分子量約８０キロダルトンの鉄結合性糖蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に対する抗菌作用や、免疫賦活作用、抗腫瘍作用等、様々な作用を持つ乳タンパク質として知られている。ラクトフェリンは乳由来の糖タンパク質であることから、安全性が高く、長期にわたり摂取可能である。また、それ自体は殆ど無味無臭であり、各種の食品・飼料・医薬品の添加物として、汎用性が高い。

これまで、ラクトフェリンについては、炎症、腫瘍等を処置、予防するための薬学的組成物が報告されている（特許文献１）。また、大腸上皮細胞の更新を促進することを特徴とする腸管機能の低下の予防または改善作用を有することが報告されている（特許文献２）。

また、発癌剤を用いた大腸発癌ラットモデルにおいて、ラクトフェリンを摂取させることにより大腸癌の発生頻度が抑制されることが報告されている（非特許文献２）。また、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有するラクトフェリン加水分解混合物を有効成分として含有する薬剤が報告されている（特許文献３）。また、ラクトフェリンの組成物を単独で、あるいは標準的な抗癌療法と組み合わせて投与することにより、過剰増殖性疾患を治療する方法が報告されている（特許文献４）。しかしながら、これらには癌治療における抗癌剤の投与に伴う副作用に対する改善効果については一切報告されていない。
特表２００１−５０４４４７号公報特開２００２−１０４９９２号公報特表２００５−５３３０２９号公報特許第３９９８７０２号ホルモンフロンティア・イン・ジャイネコロジー（HORMONE FRONTIER IN GYNECOLOGY）、メディカルレビュー社、第１３巻第２号、第５７〜６１頁、２００６年フーズ・フード・イングレジエンツ・ジャーナル（Foods Food Ingredients Journal）、第２００巻、第２７〜３５頁、２００２年

上述のように、化学療法による卵巣機能障害を防いで妊孕能を維持する方法としては、外科手術による方法は患者の負担が非常に大きい。そこで、女性患者の抗癌化学療法による卵巣機能障害を防いで妊孕能を維持する方法としては、外科手術を行うことなく、卵巣を保持したままで、卵巣機能障害を防いで、妊孕能を維持することが、最良の対処方法となるとされており、これを実現することが求められていた。

従って、本発明は、抗癌化学療法による卵巣機能障害を防いで妊孕能を維持する、卵巣機能改善剤を提供することを目的としている。さらに、本発明は、副作用が少なく経口投与が可能な卵巣機能改善剤を提供することを目的としている。

本発明者らは、前記問題点に鑑み、抗癌化学療法による卵巣機能、特に卵巣の卵胞細胞に対する影響について検討した結果、ラクトフェリンを経口投与することにより、化学療法による卵胞細胞の減少が抑制される効果を見い出し、本発明を完成するに至った。

前記課題を解決する本発明は、ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤である。

また、本発明は、卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である、ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤である。

さらに、卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全の改善及び／または治療に用いるものであるラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤である。

従って、本発明は、次の［１］〜［３］にある。
［１］
ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤。
［２］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［１］に記載の卵巣機能改善剤。
［３］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／または治療に用いるものである［２］に記載の卵巣機能改善剤。

さらに、本発明は、次の［４］〜［５］にもある。
［４］
卵巣機能改善が、抗癌化学療法によって生じる卵巣機能障害の改善である、［１］〜［３］の何れかの卵巣機能改善剤。
［５］
卵巣機能改善が、妊孕能の改善である、［１］〜［４］の何れかの卵巣機能改善剤。

すなわち、本発明の卵巣機能改善剤は、好ましい実施の態様において、抗癌剤の投与によって生じる、卵胞細胞の減少抑制剤、排卵促進剤、早発卵巣不全の予防／治療剤、又は妊孕能改善剤である。

さらに、本発明は、次の［６］〜［３２］にもある。
［６］
ラクトフェリンを有効成分として含有する、卵巣機能改善用食品添加剤。
［７］
ラクトフェリンを投与して、卵巣機能を改善する方法。
［８］
卵巣機能改善剤の製造のための、ラクトフェリンの使用。
［９］
有効成分としてのラクトフェリン、及び製薬上許容される担体を含有する、卵巣機能改善剤。
［１０］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［９］に記載の卵巣機能改善剤。
［１１］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［１０］に記載の卵巣機能改善剤。
［１２］
卵巣機能改善剤を製造するためのラクトフェリンの使用。
［１３］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［１２］に記載の使用。
［１４］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［１３］に記載の使用。
［１５］
ラクトフェリンを含有する飲食品からなる卵巣機能改善剤。
［１６］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［１５］に記載の卵巣機能改善剤。
［１７］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［１６］に記載の卵巣機能改善剤。
［１８］
飲食品が、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、サプリメントである［１５］〜［１７］のいずれかに記載の卵巣機能改善剤。
［１９］
卵巣機能改善剤を製造するためのラクトフェリンを含有する飲食品の使用。
［２０］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［１９］に記載の使用。
［２１］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［２０］に記載の使用。
［２２］
飲食品が、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、サプリメントである［１９］〜［２１］のいずれかに記載の使用。
［２３］
ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善用飲食品組成物。
［２４］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［２３］に記載の卵巣機能改善用飲食品組成物。
［２５］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［２４］に記載の卵巣機能改善用飲食品組成物。
［２６］
飲食品組成物が、健康食品組成物、機能性食品組成物、経腸栄養食品組成物、特別用途食品組成物、保健機能食品組成物、特定保健用食品組成物、栄養機能食品組成物、サプリメント組成物である［２３］〜［２５］のいずれかに記載の卵巣機能改善用飲食品組成物。
［２７］
ラクトフェリンを投与することを含む、卵巣機能改善の方法。
［２８］
ラクトフェリンを含む薬剤を投与することを含む、卵巣機能改善の方法。
［２９］
ラクトフェリンを含有する飲食品を投与することを含む、卵巣機能改善の方法。
［３０］
ラクトフェリンの有効量を投与する、［２７］〜［２９］の何れかに記載の卵巣機能改善の方法。
［３１］
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である［２７］〜［３０］の何れかに記載の方法。
［３２］
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである［３１］に記載の方法。

本発明により、ラクトフェリンを有効成分とする卵巣機能改善剤が提供される。本発明の卵巣機能改善剤は従来の医薬品と異なり、歴史的な年月の間、日常的に摂取されている乳由来の成分を有効成分とするものであるために、極めて安全性は高く、長期間連続投与も安心して行うことができ、新たな作用効果を持つ医薬品として、一時的な生理不順から不妊症まで、女性特有の疾患において広範に使用することができる。

本発明の卵巣機能改善剤は、抗癌化学療法によって生じる卵巣機能障害の改善に特に有効である。このために、最近の晩婚化によって、結婚前に癌に罹患する女性の数も増加傾向を示しているという社会の現状からも、大きな意義を有するものである。

図１は、実施例で行った試験の実験スキームを示す図である。図２は、遺伝子mAdamts1の試験結果を示す図である。図３は、遺伝子mSohlh1の試験結果を示す図である。図４は、投与期間終了後の卵巣細胞写真を示す図である。

次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。

[卵巣機能改善効果]
本発明における卵巣機能改善とは、卵巣内に存在する卵胞細胞の減少を抑制し、卵胞細胞の活動を促進することである。
卵胞細胞とは、卵子を含んだ球状の細胞の集合体であり、これらが発育してゆくことにより、排卵が起こり、卵子が放出される。このことから、本発明における卵巣機能改善効果は、排卵の促進効果ということもできる。

卵胞細胞の活動が阻害されると、閉鎖細胞となり、成長が停止して健全な排卵が起こらなくなる。そのため、生理不順、無月経などの原因となる。

つまり、卵胞細胞の活動が促進され、通常時のような発育がみられれば、特に問題なく排卵も起こり、卵巣機能が改善、あるいは治癒したということができる。

本発明における卵巣機能改善効果は、RT−PCR法と卵巣組織の分析によって確認した。RT−PCR法では、卵巣の卵胞細胞の活動に寄与している２つの遺伝子の発現量を定量することによって、ラクトフェリンによる効果を判定した。また、卵巣組織の状態は卵巣の組織標本を作成したものを免疫染色し、細胞形態の観察によって確認した。

本発明において指標とした２つの遺伝子とは、Adamts1及びSohlh1であり、これらを卵胞細胞の成長段階に応じて定量的に評価するための指標とした。
Adamts1はメタロプロテアーゼ（metalloproteinase）をコードする排卵関連遺伝子であり、卵巣の卵胞細胞中の顆粒膜細胞によって発現する。また、卵胞細胞の成長過程における、細胞の発達に必要であることが知られている（非特許文献３）。
また、Adamts1の欠如したマウスでは卵巣の機能障害が発生し、卵胞細胞の発達段階と排卵段階で特に影響することが知られている（非特許文献４）。さらには、Adamts1は卵巣内の血管の新生・誘導に影響することが知られている。

Sohlh1は卵子形成における基本構造のヘリックス−ループ−ヘリックスの転写因子をコードする遺伝子である（非特許文献５）。Sohlh1は原始卵胞細胞中に選択的に発現し、卵胞細胞が第一卵胞細胞や第二卵胞細胞に成長するにつれて、急速に消失することが知られている。

非特許文献３：ディベロップメンタル・バイオロジー（DEVELOPMENTAL BIOLOGY）、第３００巻第２号、第６９９〜７０９頁、２００６年１２月１５日
非特許文献４：ジャーナル・オブ・モレキュラー・エンドクリノロジー（Journal of Molecular Endocrinology）、第３５巻、第３４３〜３５５頁、２００５年
非特許文献５：プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）、第１０３巻第２１号、第８０９０〜８０９５頁、２００６年５月２３日

前記の２種類の遺伝子は、卵巣内の卵胞細胞の正常な成長過程において重要な役割を果たしていると考えられており、これらが発現することで正常な卵巣機能が維持される。
本発明の「卵巣機能改善」は、卵巣内に存在し、卵巣機能に大きな影響を与える遺伝子、Adamts1及びSohlh1の発現量の減少抑制又は維持でもある。

〔早発卵巣不全（ＰＯＦ）改善剤〕
早発卵巣不全（ＰＯＦ）は、出生時より卵胞数が少ない染色体異常と考えられる要因や、放射線治療や化学療法等の要因による、卵胞数が急激に減少してくるなどの卵巣機能障害、具体的には排卵障害による卵巣無月経と規定される。
ここで、本発明におけるラクトフェリンを有効成分とする卵巣機能改善剤は、卵胞細胞の減少抑制効果、卵胞細胞の機能に関与する遺伝子の減少抑制・維持効果、排卵促進効果を有するものであることから、早発卵巣不全の予防又は改善、治療にも優れた効果を発揮し、早発卵巣不全のための医薬として好適に利用することが可能である。
したがって、本発明におけるラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤は、ラクトフェリンを有効成分として含有する早発卵巣不全のための医薬にもある。

本発明の有効成分として使用するラクトフェリンは市販品であってもよく、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳、ホエー等からイオン交換クロマトグラフィー等の常法により分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属を一部又は完全にキレートさせた金属非飽和ラクトフェリン、または金属飽和ラクトフェリンのいずれであっても可能である。
なお、常法により分離したラクトフェリンとしては、例えばラクトフェリンの含有量が５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、さらに好ましくは８０質量％以上、特に好ましくは９０質量％以上であるものが含まれる。当該分離したラクトフェリンは、本発明の薬剤、具体的には医薬品等に好適に使用することができる。
また、本発明の飲食品、飲食品組成物、食品添加剤等の有効成分として使用されるラクトフェリン分画物としては、乳からラクトフェリン以外の画分を部分的に除去したものであれば、いずれの分画物であってもラクトフェリン分画物として使用することが可能である。ここで、本発明の飲食品、飲食品組成物、食品添加剤等の有効成分として使用されるラクトフェリン分画物は、本発明の飲食品、飲食品組成物、食品添加剤等の有効成分として使用される場合に限って、本発明の飲食品、飲食品組成物、食品添加剤等の有効成分として使用される「ラクトフェリン」として表記することもできる。なお、前記ラクトフェリン分画物としては、例えば哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、若しくは末期乳等の乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳から、糖類を除去した分画物、及びカゼイン、乳清タンパク質等のタンパク質の一部分を除去した分画物等が例示される。

また、組換えＤＮＡ技術により得られる組換え真菌、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産されるヒト・ラクトフェリン等も、同様に本発明に使用することができる。

本発明の薬剤は、公知の方法により種々の態様に製剤化して投与することができ、好適な実施の態様において経口投与することができる。本発明の薬剤の有効成分であるラクトフェリンの投与量は、剤型、症状、年齢、体重等によって異なるが、卵巣障害の予防または治療を効果的に発揮させるためには、好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、特に好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上の割合で投与、好ましくは経口投与することができ、一般に１０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で投与することができる。

本発明の薬剤としては、例えば、ラクトフェリンを薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造できる。製剤化する場合、製剤中のラクトフェリンの含有量は、通常０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。具体的製剤として、錠剤（糖衣錠、腸溶性コ−ティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コ−ティングしたものを含む。）、丸剤、トロ−チ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。

これらの製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニト−ル、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロ−ス、カンゾウ末、ゲンチアナ末など、結合剤としては、澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコ−ル、ポリビニルエ−テル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、エチルセルロ−ス、メチルセルロ−ス、カルボキシメチルセルロ−ス等を例示することができる。

また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウム、結晶セルロ−ス、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を、それぞれ例示することができる。

更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴ−ル等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を、それぞれ例示することができる。

錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、精製セラック、ゼラチン、ソルビト−ル、グリセリン、エチルセルロ−ス、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロ−スアセテ−ト、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−スフタレ−ト、メチルメタクリレ−ト、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。

本発明の薬剤は、それのみで使用してもよいが、その他の卵巣機能維持に効果を有する医薬組成物と併用してもよい。併用によって、卵巣機能維持の効果を高めることができる。
併用する医薬組成物、本発明の薬剤中に有効成分として含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。

また、本発明の薬剤は副作用が殆どないことから、投与対照として、化学療法を受けているＰＯＦ患者のみならず、一般のＰＯＦ患者、一次的な生理不順の女性、不妊症の女性、あるいは女性全般にも好適に使用することができる。

抗癌化学療法を受けている患者を、本発明の薬剤の投与対象とする場合には、抗癌化学療法による抗癌剤と同時期に本発明の薬剤を投与することが好ましく、この期間の投与に加えて、さらに抗癌化学療法を受ける期間前からも本発明の薬剤を投与されること、及び抗癌化学療法を受ける期間後にも本発明の薬剤を投与されることが好ましい。本発明の薬剤は、歴史的な年月の間、日常的に摂取されている乳由来の成分を有効成分とするものであるために、極めて安全性は高く、このような長期間連続投与も安心して行うことができる。

［ラクトフェリンを含有する飲食品からなる卵巣機能改善剤］
本発明の卵巣機能改善剤は、卵巣機能の改善を目的として、ラクトフェリンを含有する飲食品を用いて製造した卵巣機能改善剤として提供することが可能であり、当該卵巣機能改善剤は飲食品の形態であることが好ましい。
また、卵巣機能改善に用いることを目的とした、ラクトフェリンを含有する飲食品組成物を製造することも可能である。
より具体的には、特定保健用食品等に例示されるような健康食品や機能性食品の形態でラクトフェリンを含有する飲食品からなる卵巣機能改善剤、又はラクトフェリンを有効成分とする卵巣機能改善用飲食品組成物等を提供することができる。
すなわち、本発明の飲食品からなる卵巣機能改善剤とは、食品における３つの機能である、一次機能：栄養（生命維持）、二次機能：味覚（嗜好、グルメ）、三次機能：体調調節（体調リズム調節、生体防御、疾病予防、疾病回復、老化防止）のうち、特に、三次機能の効果を発揮させることが可能な飲食品を含むものとして規定することができる。

なお、本発明の用途は、「卵巣機能改善用」、「卵巣機能改善のため」という文言で表される用途を含むが、これらの文言そのものに限られるものでなく、これら以外の文言であっても、卵巣機能改善の作用又は効果を表現する文言、卵巣機能が関与する疾患又は症状を予防する作用又は効果、該疾患又は症状の発生リスクを低減する作用又は効果に関する表現を含む文言であれば、本発明の用途の範囲に包含されることは言うまでもない。例えば、「卵胞細胞の減少抑制用」、「卵胞細胞の減少抑制のため」、「早発卵巣不全の予防、改善、又は治療用」、「早発卵巣不全の予防、改善、又は治療のため」、「排卵促進用」、「排卵促進のため」、等の文言で表される用途、これらによる作用又は効果を表現する文言、これらが関与する疾患又は症状を予防する作用又は効果、該疾患又は症状の発生リスクを低減する作用又は効果に関する表現を含む文言もまた、本発明の用途の範囲に包含される。

［ラクトフェリンを含有する飲食品］
本発明の飲食品は、ラクトフェリンを有効成分として含有する。
本発明において、「飲食品」とは、人間が摂取する飲食品の他、人間以外の動物、特にほ乳類が摂取する飼料も含む。
本発明の飲食品におけるラクトフェリンの量は、飲食品の形態によって適宜設定されるが、好ましい実施の態様において、例えば、０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上とすることができる。また本発明の飲食品における当該量の上限は特に制限されないが、好ましい実施の態様において、例えば、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下、さらに好ましく３０質量％以下、さらに好ましく２０質量％以下、さらに好ましく１０質量％以下とすることができる。

本発明の飲食品は、好ましくは機能性飲食品とすることができる。
「機能性飲食品」とは、疾患の予防効果、又は疾患の発生リスクの低減効果が、直接的又は間接的に表示された食品を意味する。例えば、現在、日本においては特定保健用食品、健康補助食品の態様で販売されている食品が挙げられる。
本発明の飲食品の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜、パン類；その他、経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料が挙げられる。
特に、機能性飲食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることが、摂取者が有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。

本発明の飲食品は、「卵巣機能改善」の用途の表示が付された形態とすることが好ましい。すなわち、本発明の飲食品は、例えば、「卵巣機能改善のため」の用途が付された、ラクトフェリンを有効成分として含有する、卵巣機能改善のための飲食品、又は卵巣機能改善用飲食品組成物として販売することが好ましい。既に述べたように、本発明の用途はこれらの文言の表現に限られるものではなく、本発明の用途に包含されるその他の文言の表現の表示が付された形態も、本発明の飲食品の好適な実施の態様に含まれる。

前記「表示」は、需要者に対して前記用途を知らしめる機能を有する全ての表示を含む。すなわち、前記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て前記「表示」に該当する。
また、前記「表示が付された」とは、前記表示と、飲食品（製品）を関連付けて認識させようとする表示行為が存在していることをいう。
表示行為は、需要者が前記用途を直接的に認識できるものであることが好ましい。具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装への前記用途の記載行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類（電磁気的方法により提供されるものを含む）への前記用途の記載行為が例示できる。

一方、表示される内容（表示内容）としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。
例えば、健康食品、機能性飲食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等の表示を例示することができる。特に、厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。
また、本発明の飲食品は、前記用途の表示に加え、前記有効成分の表示、さらには、前記用途と前記有効成分の関連性を示す表示を含むことも好ましい。

本発明の飲食品は、ラクトフェリンを有効成分として配合することで製造することができる。本発明の飲食品は、例えば、前記化合物を飲食品原料に混合して、加工することで製造することができる。
また、本発明の飲食品は、ラクトフェリンを含む獣乳等を原料として、公知の方法により得たラクトフェリン分画物を、飲食品原料とともに加工することで製造することもできる。ラクトフェリン分画物を得る具体的な方法については、本明細書で例示しているとおりである。

また、本発明の飲食品を顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントとする場合には、有効成分であるラクトフェリンを、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等の糖類、及びそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等と共に、製剤化することが好ましい。

［ラクトフェリンを含有する食品添加剤］
本発明の食品添加剤は、ラクトフェリンを有効成分として含有する。
本発明の食品添加剤におけるラクトフェリンの量は適宜設定されるが、好ましくは少なくとも０．０００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００１質量％、さらに好ましくは少なくとも０．００５質量％、特に好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また、本発明の食品添加剤における当該量の上限は特に制限されないが、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。

本発明の食品添加剤は、有効成分としてのラクトフェリンの他に、通常使用される賦形剤等の添加剤を含んでいてもよい。また、食品添加剤に通常使用される公知の他の成分を含んでいてもよい。食品添加剤の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、タブレット、液体等、食品添加剤の通常の形態をとることができる。
本発明の食品添加剤は、ラクトフェリンを有効成分として配合することにより製造することができる。本発明の食品添加剤は、例えば、前記有効成分と、所望により前記添加剤又は他の成分と共に製剤化することにより製造することができる。

また、本発明の食品添加剤は、ラクトフェリンを含む獣乳等を原料として、公知の方法により得たラクトフェリン分画物を、前記添加剤や他の成分と共に製剤化することで製造することもできる。ラクトフェリン分画物を得る具体的な方法については、本明細書中で例示しているとおりである。

本発明の食品添加剤は、前述した本発明の飲食品を製造するために用いることができる。飲食品への添加量は、前述した本発明の飲食品における、有効成分としてのラクトフェリンを目安にして適宜調節することができる。
また、本発明の食品添加剤は、「卵巣機能改善用」の用途の表示が付された形態とすることが好ましい。
「表示」及び「表示行為」については、本明細書中で説明しているとおりである。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（ラクトフェリンを配合した錠菓の調製）
次の組成からなる卵巣機能改善効果を有する錠菓を以下の方法により製造した。

ウシ・ラクトフェリン（ミライ社製）２０．０（％）
ビフィドバクテリウム・ロンガム菌末（森永乳業社製）１５．０
ラクチュロース（森永乳業社製）２０．０
還元麦芽糖（東和化成工業社製）２７．６
ソルビトール（日研化学社製）１５．２
グリセリン脂肪酸エステル（理研ビタミン社製）１．８
フレーバー（長谷川香料社製）０．４

ウシ・ラクトフェリン、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌末、ラクチュロース、還元麦芽糖、グリセリン脂肪酸エステル、及びフレーバーを混合し、常法により打錠して１ｇ当たりラクトフェリンを２００ｍｇ含有する錠菓を得た。

［実施例２］
（ラクトフェリンを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤の卵巣機能改善剤を以下の方法により製造した。

ウシ・ラクトフェリン（ミライ社製）３０．０（％）
ソルビトール（東和化成工業社製）１８．０
コーンスターチ（加藤化学社製）１３．０
還元麦芽糖（東和化成工業社製）３６．８
グリセリン脂肪酸エステル（理研ビタミン社製）１．８
フレーバー（長谷川香料社製）０．４

ウシ・ラクトフェリン、ソルビトール、コーンスターチ、還元麦芽糖、グリセリン脂肪酸エステル、及びフレーバーを混合し、常法により打錠して１ｇ当たりラクトフェリンを３００ｍｇ含有する錠剤を得た。

［実施例３］
（カプセル入りラクトフェリンの調製）
乳糖（和光純薬工業社製）４００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）２００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）２００ｇ、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌末（森永乳業社製）６００ｇ、及びラクトフェリン（ミライ社製）６００ｇを、それぞれ５０メッシュ篩（ヤマト科学社製）により篩分けして厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋に取り、転倒混合した。全自動カプセル充填機（Cesere Pedini社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（クオリカプス社製。１号ゼラチンカプセル、Op. Yellow No.6 Body、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、ラクトフェリン８２ｍｇ入りのカプセル剤７０００個を得た。

次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、本発明のラクトフェリンを含有する薬剤における卵巣機能改善効果を確認するために行った。対象として出生３週齢のICRマウス（日本エスエルシー社製、日本チャールズ・リバー社製）を使用した。

（１）試験試料
抗癌剤として一般によく用いられるCyclophosphamide(塩野義製薬社製、商品名：エンドキサン、以下CPMと略すことがある)を使用した。対照群として、生理食塩水（以下、生食、又はsalineと略すことがある）を使用した。
餌として、ラクトフェリン粉末（森永乳業社製、以下、LFと略すことがある）を２重量％混合した、乳蛋白質を含まない粉末状の基礎飼料（日本農産工業社製）を使用した。対照群には、ラクトフェリン粉末の代わりにウシ血清アルブミン粉末（シグマ社製、以下BSAと略すことがある）を使用して、同様に混合、使用した。

（２）投与群
出生３週齢のICRマウスについて投与試料によって１群を１０匹として群分けした。腹腔投与剤と経口投与剤の組み合わせは、「腹腔投与剤／経口投与剤」の順に下記の通りである。試験期間は、ICRマウスが３週齢のときを０週として、そこから２４週間後に終了とした。
１．生理食塩水／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）投与群（対照群）
２．生理食塩水／ラクトフェリン（ＬＦ）投与群
３．CPM（６週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群
４．CPM（６週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群
５．CPM（２２週間経過時まで投与）／BSA投与群
６．CPM（２２週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群

（３）試験方法
Cyclophosphamide(CPM)の投与量を２００ｍｇ／ｋｇとして、試験開始時、２週間経過時、４週間経過時、以後同様にして、２週間ごとに腹腔内に反復投与した（図１の上下方向の両矢印の位置が投与時を示す）。図１は、この試験の実験スキームを示す図である。対照群には同量の生理食塩水を使用し、同様の方法にて投与した（図１の幅の広い６本の横棒のうち、上から１本目が、生理食塩水／ＢＳＡ投与群、上から２本目が、生理食塩水／ラクトフェリン投与群を示す）。CPM投与群では、６週間経過時まで隔週で４回投与した群と２２週間経過時まで隔週で１２回投与した群の２群で比較した（図１の幅の広い６本の横棒のうち、上から３本目が、CPM（６週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群、上から４本目が、CPM（６週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群、上から５本目が、CPM（２２週間経過時まで投与）／BSA投与群、上から６本目が、CPM（２２週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群を示す）。CPMを６週間経過時まで投与した群（CPM（６週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群、及びCPM（６週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群）は、８週間経過時からはCPMに代えて生理食塩水（生食、saline）を同様に２週間ごとに腹腔内に反復投与した。なお、CPMを６週間経過時まで投与した群は、開始時から８週間経過時の直前までの８週間の間、CPM投与の影響下においたという意味で、図１の左端、図２及び図３では、ＣＰＭ８ｗと表記した。同様に、CPMを２２週間経過時まで投与した群は、開始時から２４週間後までの２４週間の間、CPM投与の影響下においたという意味で、図１の左端、図２及び図３では、ＣＰＭ２４ｗと表記した。
試験期間中、餌は給餌器に入れておき、常に摂取可能な状態とした。餌の摂取状態は２週間ごとの体重を測定して確認した。
CPMの投与開始から２４週間後に全投与群のマウスを解剖して卵巣を摘出し、各種分析を行った。

（４）分析方法
[ＲＴ−ＰＣＲ法]
摘出した卵巣をトライゾール試薬（Invitrogen社製）を用いてホモジナイズし、全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからFirst Strand ｃＤＮＡ合成キット（GE Helthcare Bioscience社製）を使用してｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲのテンプレートに供した。

定量ＰＣＲであるReal Time PCRを、試薬としてSYBR Premix Ex Taq (タカラバイオ社) 、装置にApplied Biosystems Prism 7000 detection system（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して行った。データは平均値±標準偏差で表示した。測定したAdamts1とSohlh1のforward primer及びreverse primerは配列表に示す。各遺伝子の発現量はactinを用いて標準化した。

[免疫組織形態学分析法]
卵胞細胞の組織学的、形態学的な分析のため、一方の卵巣を４℃にて４％のパラホルムアルデヒドに固定し、これをパラフィン包埋したものから、厚さ４μｍの薄切り標本を作製した。この標本をanti-PCNA mouse monoclonal antibody(mAb)（♯1529,DAKO社製）を用いて染色した。各卵巣の２０番目の薄切標本を写真に撮り、それぞれの卵胞細胞数を測定した。卵巣の容積は各標本の卵巣の直径と、標本の全数から計算した。

[統計分析]
標準化した各ｍＲＮＡレベルの比較は、２グループに対してはマンホイットニー検定を、２グループ以上にはクラスカルウオーリス順位検定を使用した。その結果、ｐ＜０．０５を有意差の基準とした。

[結果]
試験期間中のマウスの重量は、CPM投与群が対照群よりも少なかったが、CPM投与群の間では顕著な差はみられなかった。
遺伝子解析には、ｍＲＮＡ中の排卵関連遺伝子であるAdamts1と、原始卵胞細胞に影響のある遺伝子であるSohlh1の２種類について計測した。

図２は、遺伝子mAdamts1（ｍはマウスを意味する）の試験結果を示す図であり、Ａの棒グラフは、左端から、それぞれ、生理食塩水／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）投与群（saline,BSA群）、生理食塩水／ラクトフェリン（ＬＦ）投与群（saline,LF群）、CPM（６週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群（CPM,BSA群）、CPM（６週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群（CPM,LF群）を示し、Ｂの棒グラフは、左端から、それぞれ、生理食塩水／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）投与群（saline,BSA群）、生理食塩水／ラクトフェリン（ＬＦ）投与群（saline,LF群）、CPM（２２週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群（CPM,BSA群）、CPM（２２週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群（CPM,LF群）を示している。

図３は、遺伝子mSohlh1（ｍはマウスを意味する）の試験結果を示す図である。Ｃの棒グラフは、左端から、それぞれ、生理食塩水／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）投与群（saline,BSA群）、生理食塩水／ラクトフェリン（ＬＦ）投与群（saline,LF群）、CPM（２２週間経過時まで投与）／ＢＳＡ投与群（CPM,BSA群）、CPM（２２週間経過時まで投与）／ラクトフェリン投与群（CPM,LF群）を示している。

CPM投与群は、生理食塩水投与群と比較すると、Adamts1及びSohlh1の発現が有意に抑制された（図２のＡ及びＢ、図３のＣにおいて、それぞれ、saline,BSA群とCPM,BSA群とを比較して参照）。
しかし、ラクトフェリンの経口投与を行うと、CPM投与による卵胞細胞のAdamts1の減少は有意に改善された（図２のＡ及びＢにおいて、それぞれ、CPM,BSA群とCPM,LF群とを比較して参照）。CPMを６週目まで投与した群（ＣＰＭ８ｗ）、及びCPMを２２週目まで投与した群（ＣＰＭ２４ｗ）では共に、ラクトフェリンによるAdamts1の減少抑制効果が有意に観察された。
同様に、ラクトフェリンの経口投与を行うと、CPM投与による卵胞細胞のSohlh1の減少も抑制された（図３のＣにおいて、CPM,BSA群とCPM,LF群とを比較して参照）。CPMを２２週目まで投与した群（ＣＰＭ２４ｗ）では、ラクトフェリンによるSohlh1の減少抑制効果が観察された。

また、上記各群の２４週間経過後の卵巣組織の状態をＰＣＮＡ染色によって免疫組織化学的に観察した。得られた卵巣組織写真を図４に示す。対照群（生理食塩水／ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）投与群）では、卵胞細胞が、原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞、成熟卵胞が混在し、正常な状態で細胞分裂が起こっている（図４のa参照）。
一方、CPM／ＢＳＡ投与群では、卵巣の顕著な繊維化、萎縮がみられ、卵胞細胞がほとんど残存していなかった（図４のb参照）。また、発育の停止した閉鎖卵胞が多く観察された（図４のbの矢印部分参照）。CPM／ラクトフェリン投与群でも、同様の繊維化、萎縮がみられたが、少数の卵胞細胞が確認された（図４のc1〜c3参照）。さらに、CPM／ラクトフェリン投与群では、卵胞細胞には、原始卵胞、一次卵胞、二次卵胞の存在が確認され、中には、成長細胞も存在した（図４のc3の矢印部分参照）。
これらの結果より、CPM／ラクトフェリン投与群は、CPM／BSA投与群と比較して卵母細胞核や周囲の顆粒細胞に対しての障害を顕著に抑制していることが判明した。

また、ＰＣＮＡ染色による２４週間経過後の卵巣組織の標本について卵胞細胞の細胞数を計測した（表１）。細胞数の計測は、各卵巣標本の２０番目の薄切標本に含まれる卵胞細胞の細胞数を各発育段階の細胞ごとに計測して、その平均をとった。CPM／BSA投与群では、原始細胞、一次細胞・二次細胞、成熟細胞の各発育段階の細胞は、それぞれ平均して、０．０個、０．０個、１．０個が観察され、すなわち、ほとんど卵胞細胞が存在しなかった。
一方、CPM／LF投与群では、原始細胞、一次細胞・二次細胞、成熟細胞の各発育段階の細胞は、それぞれ平均して、３．６個、１．４個、３．０個が観察された。すなわち、CPM／LF投与群は、各成長段階において、卵胞細胞の活動が確認され、CPM／BSA投与群と比較して、明らかに多くの卵胞細胞が活動しており、特に原始細胞、成熟細胞についてはこの差は統計的に有意であった。このように、数値上からもラクトフェリンが卵胞細胞の減少抑制効果を有することを確認することができた。

すなわち、ラクトフェリンによる卵胞細胞の減少抑制が確認されたことから、卵巣機能改善に有効であることが示された。

本発明による、卵巣機能改善剤は、従来の医薬品と異なり、乳由来の成分を有効成分とするものであって、副作用が殆どなく、長期間の投与が可能であり、医薬品として好適に使用することができる。
さらに、本発明には、卵巣機能の改善を目的に、ラクトフェリンを含有する飲食品を用いて製造した卵巣機能改善剤を特定保健用食品等に例示されるような健康食品や機能性食品の形態として提供することも可能である。

Claims

ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤。
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である請求項１に記載の卵巣機能改善剤。
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／または治療に用いるものである請求項２に記載の卵巣機能改善剤。
卵巣機能改善剤を製造するためのラクトフェリンの使用。
卵巣機能改善が卵胞細胞の減少抑制である請求項４に記載の使用。
卵胞細胞の減少抑制が早発卵巣不全（ＰＯＦ）の改善及び／又は治療に用いるものである請求項５に記載の使用。