JP2016014007A

JP2016014007A - 筋タンパク質合成シグナル活性化剤

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Publication number: JP2016014007A
Application number: JP2015086165A
Authority: JP
Inventors: 秀文北澤; Hidefumi Kitazawa; 宣康太田; Nobuyasu Ota; 浩二郎橋爪; Kojiro Hashizume
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2016-01-28
Anticipated expiration: 2035-04-20
Also published as: JP6496599B2

Abstract

【課題】筋タンパク質の合成シグナルを活性化する筋タンパク質合成シグナル活性化剤、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化を促進するｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進剤、筋量又は筋力を改善する筋量改善剤又は筋力改善剤、及び筋萎縮を抑制する筋萎縮抑制剤を提供する。
【解決手段】少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋タンパク質合成シグナル活性化剤、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、筋タンパク質合成シグナル活性化剤に関する。

生体において、骨格筋は最も重要な運動器の１つであり、骨格筋を収縮又は弛緩させることにより身体活動を行う。また骨格筋は活動するためのエネルギー源として、血液中の糖や脂肪を取り込んで消費する。そのため骨格筋は、最大のエネルギー消費組織でもある。その他にも、骨格筋は関節の安定化や姿勢の保持、血管や臓器等の保護の役割も果たしている。
さらに、交通手段の発達や情報・通信技術の発展に伴う運動不足を原因とする筋量や筋力の低下は、運動機能の低下の原因となる。特に高齢者にとっては、加齢による筋萎縮と相俟って、その後の生活の質（ＱＯＬ）に重大な影響をもたらすと考えられる。筋萎縮、又は筋量や筋力の低下に起因する日常動作中の転倒、及びそれに伴う骨折等は身体活動量の低下を引き起こす。そのため、筋萎縮、又は筋量や筋力の低下は、骨粗しょう症、寝たきり、肥満、代謝障害などの危険性を高める原因であると言われている。

生体内の骨格筋量は、筋タンパク質の合成と分解のバランスにより一定量に保たれており、通常の生活の中で骨格筋量が急激に変動することは考えられない。しかし、加齢に伴い骨格筋量や筋力等の筋機能は低下する。
筋萎縮、又は筋量や筋力の低下を防ぐ手段としては、適度な運動を実践する、あるいはリハビリテーションを実践する等がある。しかし、時間的又は物理的理由、モチベーションの維持の困難さ等から、運動の継続的実践は現実的には難しい。そのため、筋萎縮、又は筋量や筋力の低下を防ぐためのより効果的な方法が望まれている。

一方で、栄養学的アプローチにより運動機能を調節し得る成分の探索が行われている。例えば、分岐鎖アミノ酸の１種であり、筋タンパク質合成作用を有するロイシンと、芳香族アミノ酸の１種であるフェニルアラニン等を併用する組成物が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。しかし、分岐鎖アミノ酸であるロイシンやイソロイシンと、芳香族アミノ酸の１種であるチロシンやチロシン化合物（誘導体）との併用による、筋量又は筋力の改善作用や筋委縮の抑制作用についてはこれまで全く知られていない。

国際公開第２００９／０８８７３８号パンフレット特開２０１２−１３１８１９号公報特開２０１３−１２６４１１号公報

本発明は、筋タンパク質の合成シグナルを活性化する、筋タンパク質合成シグナル活性化剤の提供を課題とする。
また本発明は、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化を促進する、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進剤の提供を課題とする。
また本発明は、筋量又は筋力を改善する、筋量改善剤又は筋力改善剤の提供を課題とする。
また本発明は、筋萎縮を抑制する、筋萎縮抑制剤の提供を課題とする。
また本発明は、筋タンパク質の合成シグナルを非治療的に活性化する、非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法の提供を課題とする。
また本発明は、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化を非治療的に促進する、非治療的ｐ７０Ｓ６キナーゼリン酸化促進方法の提供を課題とする。
また本発明は、筋量又は筋力を非治療的に改善する、非治療的筋量改善方法又は非治療的筋力改善方法の提供を課題とする。
さらに本発明は、筋萎縮を非治療的に抑制する、非治療的筋萎縮抑制方法の提供を課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、分岐鎖アミノ酸であるロイシン及び／又はイソロイシンと、チロシン、チロシン含有ジペプチド、アルキル化チロシンなどのチロシン化合物とを併用して投与又は摂取させることで、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（以下単に「S6K」ともいう）のリン酸化が促進されることを見出した。また、S6Kのリン酸化が促進されると、筋タンパク質の合成シグナルが活性化し、生体における筋量及び筋力の改善がもたらされることが知られている。したがって、S6Kのリン酸化促進作用を示すロイシン及び／又はイソロイシンと、チロシン化合物との併用が、筋タンパク質の合成シグナルを活性化する作用を有すること、筋量及び筋力を改善する作用を有すること、及び筋萎縮を抑制する作用を有することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋タンパク質合成シグナル活性化剤に関する。
また、本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、S6Kのリン酸化促進剤に関する。
また、本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋量改善剤に関する。
また、本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋力改善剤に関する。
また、本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋萎縮抑制剤に関する。
さらに、本発明は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、それぞれを有効量投与又は摂取させる、非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法、非治療的S6Kのリン酸化促進方法、非治療的筋量改善方法、非治療的筋力改善方法、又は非治療的筋萎縮抑制方法に関する。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤は、筋タンパク質の合成シグナルを活性化することができる。
また本発明のS6Kのリン酸化促進剤は、S6Kのリン酸化を促進することができる。
また本発明の筋量改善剤又は筋力改善剤は、筋量又は筋力を改善することができる。
また本発明の筋萎縮抑制剤は、筋萎縮を抑制することができる。
また本発明の非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法は、筋タンパク質の合成シグナルを非治療的に活性化することができる。
また本発明の非治療的S6Kリン酸化促進方法は、S6Kのリン酸化を非治療的に促進することができる。
また本発明の非治療的筋量改善方法又は非治療的筋力改善方法は、筋量又は筋力を非治療的に改善することができる。
さらに本発明の非治療的筋萎縮抑制方法は、筋萎縮を非治療的に抑制することができる。

本明細書において「筋タンパク質合成シグナル」とは、インスリン様増殖因子（以下、単に「IGF」ともいう）シグナル伝達経路に起因する、筋肉におけるタンパク質合成を促進させるシグナルをいう。このIGFシグナル伝達経路は、主にタンパク質のリン酸化によって伝達される。IGFが細胞膜上に存在するIGFレセプターに結合すると、ホスホイノシチド-3-キナーゼ（以下、単に「PI3K」ともいう)が活性化し、活性化されたPI3KがAktをリン酸化する。リン酸化により活性化されたAktのシグナルは、mTOR（mammalian target of rapamycin)、S6Kへとリン酸化によって伝達されていき、最終的にS6リボソームタンパク質やeIF-4A（eukaryotic translation initiation factor 4A）等がリン酸化によって活性化され、翻訳が促進する。また、mTORは翻訳を負に制御する4E-BP1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1）の調節も行っており、活性化したmTORが4E-BP1を抑制することで、eIF-4E（eukaryotic translation initiation factor 4E）による翻訳を促進する。これら一連の過程により翻訳を促進するS6リボソームタンパク質が活性化され、細胞におけるタンパク質の合成が促進される（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，vol．277，p．17657-17662，2002；NATURE CELL BIOLOGY，vol．5，p．87-90，2003；J．Appl．Physiol.，vol．104，p．27-33，2008；Amino Acid，vol．38，p．1533-1539，2010参照）。その結果、生体における筋量及び筋力の改善がもたらされる。
また本明細書において「筋タンパク質合成シグナル活性化」とは、これら一連の過程を亢進することをいう。

本明細書において「S6K」とは、前述のIGFシグナル伝達経路においてmTORの下流に位置するエフェクターであり、IGF-1、EGF（上皮成長因子）、TGF（トランスフォーミング増殖因子）-α、HGF（肝細胞増殖因子）などの増殖因子に応答してリン酸化される。リン酸化されたS6Kは活性化し、細胞におけるタンパク質の合成が促進される（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，vol．277，p．17657-17662，2002；NATURE CELL BIOLOGY，vol．5，p．87-90，2003；J．Appl．Physiol.，vol．104，p．27-33，2008；Amino Acid，vol．38，p．1533-1539，2010参照）。したがって、S6Kのリン酸化が促進されることは、筋タンパク質の合成シグナルが活性化（亢進）し、筋量及び筋力の改善、及び筋委縮の抑制をもたらす。

本明細書において「筋量改善」とは、筋量の増加、及び筋量の減少の抑制を含む概念である。ここで「筋量増加」とは、筋肉組織中の筋線維断面積若しくは筋線維径が増加すること、又は、例えば、ミオシン重鎖を含む筋タンパク質の合成速度が分解速度を上回ることにより筋組織中のタンパク質含有量が増加し筋質量が増加することをいう。そして、「筋量減少」とは、「筋量増加」とは逆の概念をいう。
また本明細書において、「筋力改善」とは、筋力の増加、及び筋力の減少の抑制を含む概念である。ここで「筋力増加」とは、各筋肉が発揮可能な張力が増加することをいう。そして、「筋力減少」とは、「筋力増加」とは逆の概念をいう。

本明細書において「筋萎縮」とは、筋タンパク質の分解速度が合成速度を上回ることにより筋タンパク質量が減少して筋細胞が減少若しくは縮小し、筋量又は筋力が低下することをいう。筋萎縮は、不活動に起因する重力暴露の低減による廃用性筋萎縮と、筋萎縮性側索硬化症等の疾病による進行性筋萎縮とに大別される。さらに、加齢に伴って起こる加齢性筋減弱症でも、筋萎縮と同様の症状が起きる。したがって、本明細書における「筋萎縮」とは、不活動や加齢、疾病等による筋量又は筋力の低下を包含する。そして「筋萎縮抑制」とは、当該不活動や加齢、疾病等による筋量又は筋力の低下を抑制することをいう。

本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、本明細書において「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
さらに本明細書において「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤は、少なくとも１種のチロシン化合物（以下単に、「チロシン化合物」ともいう）と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸（以下、「本発明で用いる分岐鎖アミノ酸」ともいう）、を有効成分とする。また、本発明の非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法、非治療的S6Kのリン酸化促進方法、非治療的筋量改善方法、及び非治療的筋萎縮抑制方法は、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸それぞれを有効量投与又は摂取させる。

本発明で用いるチロシン化合物は、チロシン単体や、分子内に構成単位としてチロシンを含む化合物から、適宜選択することができる。チロシン化合物の具体例としては、チロシン単体（以下単に、「チロシン」ともいう）；アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン、グリシルチロシンなどの、チロシン含有ジペプチド；メチル化チロシン、ジメチル-L-チロシン、トリメチル-L-チロシン、ジエチル-L-チロシン、2-エチル-6-メチル-L-チロシン、2-イソプロピル-6-メチル-L-チロシン、2,6-ジイソプロピル-L-チロシンなどの、アルキル化チロシン（好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基が置換したチロシン）が挙げられる。これらのうち、チロシン、アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン、及びメチル化チロシンが好ましい。
本発明で用いるチロシン化合物は、市販品であってもよいし、常法に基づき製造することもできる。また、本発明で用いるチロシン化合物は、前記チロシン化合物のいずれか１種でもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明で用いるチロシン、及びチロシン化合物を構成する各種アミノ酸は、L-体、D-体、及びDL-体のいずれであってもよい。しかし、入手容易性の観点から、本発明で用いるチロシン、及びチロシン化合物を構成する各種アミノ酸はそれぞれL-体であることが好ましい。

本発明で用いるロイシン及びイソロイシンは、市販品であってもよいし、常法に基づき製造することもできる。また、本発明で用いる前記分岐鎖アミノ酸は、ロイシン及びイソロイシンのいずれか１種でもよいし、ロイシン及びイソロイシンを組み合わせて用いてもよい。
本発明で用いるロイシン及びイソロイシンは、L-体、D-体、及びDL-体のいずれであってもよい。しかし、入手容易性の観点から、本発明で用いるロイシン及びイソロイシンはそれぞれL-体であることが好ましい。

後述の実施例で実証するように、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸とを併用して投与又は摂取させることで、S6Kのリン酸化が促進される。したがって、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸との併用は、筋タンパク質合成シグナルの活性化、S6Kのリン酸化の促進、筋量又は筋力の改善、筋萎縮の抑制等に有用である。さらにチロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸との併用は、筋量又は筋力の減少や筋萎縮に起因する各種疾病や症状の予防、改善又は治療に有用である。

本発明において、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の各単体をヒト又はヒト以外の動物に摂取させてもよい。あるいは、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をヒト又はヒト以外の動物に摂取させてもよい。

医薬組成物を調製する場合は、通常、前記有効成分と好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として調製する。薬学的に許容される担体とは、一般的に、前記有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体又は液体の、増量剤、希釈剤又はカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール類（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、及びポリエチレングリコール等）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒又は分散媒体などが挙げられる。

医薬組成物は、経口により、非経口により、例えば、口腔内に、皮膚に、皮下に、粘膜に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膣内に、肺に、脳内に、眼に、又は鼻腔内に投与される。経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ペレット剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤及び吸入剤などが挙げられる。非経口投与製剤としては、坐剤、保持型浣腸剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、ペッサリー剤、注射剤、口腔洗浄剤、並びに軟膏、クリーム剤、ゲル剤、制御放出パッチ剤及び貼付剤などの皮膚外用剤などが挙げられる。医薬組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、又は標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソーム及びミクロスフェア）の形態で、非経口で投与してもよい。

医薬組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。

前記医薬組成物は、口腔用組成物、外用組成物、内服組成物などの形態で適用することができ、内服組成物の形態で用いることが好ましい。内服組成物には、前記有効成分の他、その形態に応じて通常の内服組成物に用いられる種々の成分を配合することができる。

本発明において、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を食料、飲料、飼料、ペットフードに添加又は配合した食品組成物をヒト又はヒト以外の動物に摂取させてもよい。あるいは、筋タンパク質合成シグナルの活性化、S6Kのリン酸化の促進、筋量の改善、筋力の改善、及び／又は筋萎縮の抑制により治療、予防又は改善しうる疾患又は状態の治療、予防又は改善等をコンセプトとしてその旨を表示した飲食品、すなわち、健康食品、機能性食品、病者用食品及び特定保健用食品などに添加又は配合し、ヒト又はヒト以外の動物に摂取させてもよい。前記の、健康食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品は、具体的には、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。製剤形態の食品は、医薬製剤と同様に製造することができ、前記有効成分と、食品として許容できる担体、例えば適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）等とを混合した後、慣用の手段を用いて製造することができる。さらに、スープ類、ジュース類、乳飲料、茶飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料、スポーツ飲料、ダイエット飲料などの液状食品組成物、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品組成物、パン類、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、ガム、せんべいなどの菓子類、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類等に、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を添加又は配合して、食品組成物を製造することができる。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤における前記有効成分の含有量は適宜決定できる。例えば、本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤の総量中、チロシン化合物の含有量は０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましく、５０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、２．５質量％以下がさらに好ましく、０．００１〜５０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がより好ましく、０．１〜２．５質量％がさらに好ましい。また、本発明で用いる分岐鎖アミノ酸の含有量は０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以下が好ましく、６０質量％以下がより好ましく、４０質量％以下がさらに好ましく、０．００１〜８０質量％が好ましく、０．０１〜６０質量％がより好ましく、０．１〜４０質量％がさらに好ましい。さらに、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸の含有量の総量は０．１質量％以上が好ましく、１質量％以上がより好ましく、１０質量％以上がさらに好ましく、８０質量％以下が好ましく、６０質量％以下がより好ましく、４０質量％以下がさらに好ましく、０．１〜８０質量％が好ましく、１〜６０質量％がより好ましく、１０〜４０質量％がさらに好ましい。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤における、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸との含有量比は適宜決定できる。例えば、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸との含有量比はモル比換算で、（チロシン化合物の含有量）：（本発明で用いる分岐鎖アミノ酸の含有量）＝１：１００〜１００：１が好ましく、３：１００〜１００：３がより好ましく、１：１０〜１０：１がさらに好ましい。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤の投与又は摂取対象は、好ましくは温血脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。本明細書において哺乳動物は、例えば、ヒト、並びにサル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤は、ヒトへの投与に好適である。

本発明の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、及び筋萎縮抑制剤の投与又は摂取対象の具体例としては、筋量又は筋力の改善を望む運動愛好者やアスリート、不活動や加齢、疾病等による筋量や筋力の不足又は低下に悩むヒト（例えば、加齢性筋減弱症（サルコペニア）患者、神経−筋疾患（炎症性筋疾患、内科的疾患に伴うミオパチー、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、ミトコンドリア脳筋症、糖原病等）患者、運動不足者、ベッドレスト者、外科的又は内科的疾患後のリハビリトレーニング中の者）、筋量又は筋力の低下や日常生活の支障の問題はないが体力、筋量又は筋力の維持や向上を所望するヒト、現状では筋量又は筋力の低下の問題はないが将来予想される加齢や不活動等による筋量又は筋力の低下を予防することを所望するヒト、が挙げられる。
ここで、運動愛好家やアスリートとは、身体運動又はスポーツに必要とされる強さ、敏捷性、持久力等の特徴を先天的又は後天的に有する人を指す。特にプロスポーツ選手、アマチュア選手でもスポーツクラブ等に所属し、競技会等への参加を目指す人を指す。
また、筋量や筋力の不足又は低下に悩むヒトとは、日常生活の場面で活動を継続することに困難を感じる人等を示す。

本発明の非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法、非治療的S6Kのリン酸化促進方法、非治療的筋量改善方法、又は非治療的筋萎縮抑制方法において、前記各有効成分の有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢、素材の活性、投与又は摂取経路、投与又は摂取スケジュール、製剤形態又はその他の要因により適宜決定することができる。例えば、前記有効成分のうち、チロシン化合物の有効量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上、好ましくは１０，０００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下、又は好ましくは１０〜１０，０００ｍｇ、より好ましくは１００〜１，０００ｍｇである。また、本発明で用いる分岐鎖アミノ酸の有効量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上、好ましくは３，０００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下、又は好ましくは１０〜３，０００ｍｇ、より好ましくは１００〜１，０００ｍｇである。そして、チロシン化合物と本発明で用いる分岐鎖アミノ酸との有効量比はモル比換算で、（チロシン化合物の有効量）：（本発明で用いる分岐鎖アミノ酸の有効量）＝１：１００〜１００：１が好ましく、３：１００〜１００：３がより好ましく、１：１０〜１０：１がさらに好ましい。なお前記有効成分は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で摂取・投与させ得る。
本発明において前記有効成分の有効量は、常法によりS6Kのリン酸化活性や筋線維の断面積を測定し、適宜決定することができる。また、前記有効成分の投与又は摂取は、全身投与でもよいし、局所投与でもよい。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、筋萎縮抑制剤、製造方法、方法及び使用を開示する。

＜１＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を有効成分とする、筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。

＜２＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の総量中、前記有効成分のうち少なくとも１種のチロシン化合物の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、５０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは２．５質量％以下、である、前記＜１＞項に記載の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。
＜３＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の総量中、前記有効成分のうち、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。
＜４＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤における、少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸との含有量比がモル比換算で１：１００〜１００：１、好ましくは３：１００〜１００：３、より好ましくは１：１０〜１０：１、である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。
＜５＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤における、前記有効成分の含有量の総量が、０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。
＜６＞前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシン（好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基が置換したチロシン）からなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、より好ましくはチロシン、アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン及びメチル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤。

＜７＞筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤としての、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の使用。
＜８＞筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の製造のための、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の使用。
＜９＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を、筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤として使用する方法。
＜１０＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、を適用する、筋タンパク質合成シグナル活性化方法、S6Kのリン酸化促進方法、筋量改善方法、筋力改善方法、又は筋萎縮抑制方法。
＜１１＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を筋量又は筋力の改善を望む運動愛好者やアスリート、不活動や加齢、疾病等による筋量や筋力の不足又は低下に悩むヒト、筋量又は筋力の低下や日常生活の支障の問題はないが体力、筋量又は筋力の維持や向上を所望するヒト、又は現状では筋量又は筋力の低下の問題はないが将来予想される加齢や不活動等による筋量又は筋力の低下を予防することを所望するヒトに適用する、前記＜９＞又は＜１０＞項に記載の方法。
＜１２＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の総量中、少なくとも１種のチロシン化合物の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、５０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは２．５質量％以下、である、前記＜７＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１３＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の総量中、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜７＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１４＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤における、少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸との含有量比がモル比換算で１：１００〜１００：１、好ましくは３：１００〜１００：３、より好ましくは１：１０〜１０：１、である、前記＜７＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１５＞前記筋タンパク質合成シグナル活性化剤、S6Kのリン酸化促進剤、筋量改善剤、筋力改善剤、又は筋萎縮抑制剤の総量中、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の含有量の総量が、０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜７＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１６＞前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシン（好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基が置換したチロシン）からなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、より好ましくはチロシン、アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン及びメチル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、である、前記＜７＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。

＜１７＞筋タンパク質合成シグナル活性化方法、S6Kのリン酸化促進方法、筋量改善方法、又は筋萎縮抑制方法のために用いる、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸。
＜１８＞筋タンパク質合成シグナル活性化薬、S6Kのリン酸化促進薬、筋量改善薬、又は筋萎縮抑制薬の製造のための、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の使用。
＜１９＞生体内脂肪酸の組成、高度不飽和脂肪酸の生成、又は高度不飽和脂肪酸合成遺伝子の発現筋タンパク質合成シグナルの活性化、S6Kのリン酸化の促進、筋量の改善、又は筋萎縮の抑制の非治療的な処置方法のために用いる、少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の使用。
＜２０＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を医薬組成物の形態で適用する、前記＜１９＞項記載の使用。
＜２１＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を内服組成物の形態で適用する、前記＜２０＞項記載の使用。
＜２２＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を食品、飲料、又は飼料の形態で適用する、前記＜１９＞項記載の使用。
＜２３＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を筋量又は筋力の改善を望む運動愛好者やアスリート、不活動や加齢、疾病等による筋量や筋力の不足又は低下に悩むヒト、筋量又は筋力の低下や日常生活の支障の問題はないが体力、筋量又は筋力の維持や向上を所望するヒト、又は現状では筋量又は筋力の低下の問題はないが将来予想される加齢や不活動等による筋量又は筋力の低下を予防することを所望するヒトに適用する、前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項に記載の使用。
＜２４＞少なくとも１種のチロシン化合物の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、５０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは２．５質量％以下、である、前記＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項に記載の使用。
＜２５＞ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の含有量が、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜１８＞〜＜２４＞のいずれか１項に記載の使用。
＜２６＞少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸との含有量比がモル比換算で１：１００〜１００：１、好ましくは３：１００〜１００：３、より好ましくは１：１０〜１０：１、である、前記＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１項に記載の使用。
＜２７＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の含有量の総量が、０．１質量％以上、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、であり、８０質量％以下、好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜１８＞〜＜２６＞のいずれか１項に記載の使用。
＜２８＞前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシン（好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基が置換したチロシン）からなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、より好ましくはチロシン、アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン及びメチル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、である、前記＜１７＞〜＜２７＞のいずれか１項に記載のアミノ酸又は使用。

＜２９＞少なくとも１種のチロシン化合物、並びにロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、それぞれを有効量投与又は摂取する、非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法、非治療的S6Kのリン酸化促進方法、非治療的筋量改善方法、又は非治療的筋萎縮抑制方法。
＜３０＞少なくとも１種のチロシン化合物の有効量が、１日あたり、体重１ｋｇあたり、１０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、であり、１０，０００ｍｇ以下、好ましくは１，０００ｍｇ以下、である、前記＜２９＞項に記載の方法。
＜３１＞ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の有効量が、１日あたり、体重１ｋｇあたり、１０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、であり、３，０００ｍｇ以下、好ましくは１，０００ｍｇ以下、である、前記＜２９＞又は＜３０＞項に記載の方法。
＜３２＞少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の有効量比がモル比換算で、１：１００〜１００：１、好ましくは３：１００〜１００：３、より好ましくは１：１０〜１０：１、である、前記＜２９＞〜＜３１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３３＞前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシン（好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基が置換したチロシン）からなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、より好ましくはチロシン、アラニルチロシン、チロシルアラニン、ロイシルチロシン、チロシルロイシン、チロシルチロシン及びメチル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物、である、前記＜２９＞〜＜３２＞のいずれか１項に記載の方法。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

試験例１ C2C12細胞への各種アミノ酸の投与による、S6Kのリン酸化
マウス筋芽細胞由来のC2C12細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）にて培養を行った。培養したC2C12細胞を９６ｗｅｌｌプレートに６×１０⁴cells／wellとなるように播種し、一晩ＣＯ₂インキュベーター内で培養を行った。翌日、培地をHBSS Bufferに交換し、約４時間、ＣＯ₂インキュベーター内で培養を行った。
終濃度が表１〜１３に示す濃度となるように各種アミノ酸をHBSS Bufferに溶解し、サンプルを調製した。この調製したサンプルを前記細胞と１５分間反応させた。その後Bufferを除去し、３５μＬのLysis Buffer（CelLytic^TM MT Cell Lysis Reagent、ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、１０分間室温で振盪させ細胞を溶解した。

４μＬの細胞溶解液をプレート（商品名：AlphaPlate-384 Shallow well、Perkin Elmer社製）に移し、AlphaScreen SureFire p-p70 S6K Assay Kit p-Thr389（商品名、PerkinElmer社製）に附属のAcceptor beads mix ５μＬ添加し、２時間室温で反応させた。２時間後、AlphaScreen SureFire p-p70 S6K Assay Kit p-Thr389（商品名、PerkinElmer社製）に附属のDonor beads mixを２μＬ添加し、一晩室温で反応させた。
翌日、プレートリーダー（商品名：Enspire、PerkinElmer社製）にて励起され生じる発光を測定し、S6Kのリン酸化活性（S6Kのリンカードメイン（Thr389）のリン酸化活性）を評価した。その結果を表１〜１３に示す。なお、S6Kのリン酸化活性は、各種アミノ酸を含有するHBSS Bufferに代えて、アミノ酸を含有しないBSS Bufferを用いた以外は同様にしてC2C12細胞を培養した場合（コントロール）のS6Kのリン酸化活性を１とし、コントロールに対するS6Kのリン酸化活性を活性化倍率として示した。

各種アミノ酸をそれぞれ単独で用いた場合の結果を表１及び２に示す。
表１及び２に示すように、ロイシンを添加した場合S6Kのリン酸化が有意に亢進されたのに対し（試験例１−１２）、ロイシン以外のアミノ酸を添加した場合S6Kのリン酸化は認められなかった。特に、イソロイシン及びチロシンをそれぞれ単独で添加した場合、S6Kのリン酸化の亢進は認められなかった（試験例１−１３、１−１７）。

S6Kのリン酸化を亢進する作用を有するロイシンと、その他のアミノ酸をそれぞれ２．５ｍＭずつ併用して添加した場合の結果を表３及び４に示す。前述したように、ロイシン以外のアミノ酸を添加した場合、S6Kのリン酸化は認められない。これに対し、ロイシンとチロシンを併用した場合、S6Kのリン酸化が相乗的に亢進され、ロイシンを単独で添加した場合よりも活性化倍率が有意に上昇した（試験例２−１７）。
併用するロイシンとチロシンの濃度を０．５ｍＭ、２ｍＭ又は１０ｍＭに代えた場合の結果を表６に示す。表６に示すように、添加するアミノ酸濃度の上昇に伴いS6Kのリン酸化の活性化倍率も上昇した。すなわち、S6Kのリン酸化活性に対する、併用するロイシンとチロシンの濃度依存性も認められた（試験例３−１０〜３−１２）。さらに、チロシンに代えて同じ芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンを用いた場合（試験例３−１３〜３−１５）と比較したところ、ロイシンとチロシンを併用した場合の活性化倍率は有意に上昇した。

一方、単独で用いた場合S6Kのリン酸化の亢進は認められなかったイソロイシンとチロシンと併用した場合の結果を表９に示す。表９に示すように、イソロイシンとチロシンを併用することでS6Kのリン酸化が亢進され、イソロイシンとチロシンをそれぞれ単独で添加した場合よりも活性化倍率が有意に上昇し、S6Kのリン酸化活性に対する併用するイソロイシンとチロシンの濃度依存性も認められた（試験例４−１３〜４−１５）。さらに、チロシンに代えて同じ芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンを用いた場合（試験例４−１６〜４−１８）と比較したところ、イソロイシンとチロシンを併用した場合の活性化倍率は有意に上昇した。

さらに、チロシンと、ロイシン又はイソロイシンの添加量の割合を変えた場合の結果を表１０〜１３に示す。表１０〜１３に示すように、使用するアミノ酸の総量の上昇に伴い、S6Kのリン酸化活性が有意に上昇した。

試験例２ C2C12細胞への各種チロシン化合物の投与による、S6Kのリン酸化
各種アミノ酸に代えて、表１４〜１５に示す各種チロシン化合物を用いた以外は、試験例１と同様にしてS6Kのリン酸化活性を測定した。その結果を下記表に示す。

註
Tyr-Ala：チロシルアラニン
Ala-Tyr：アラニルチロシン
Leu-Tyr：ロイシルチロシン
Tyr-Leu：チロシルロイシン
Tyr-Tyr：チロシルチロシン
Met-Tyr：メチル化チロシン

ロイシンとチロシン化合物とを併用して添加した場合の結果を表１４に示す。表１４に示すように、ロイシンとチロシン化合物とを併用した場合（試験例7-1〜7-6）、ロイシンやチロシン化合物をそれぞれ単独で添加した場合（表１５、試験例8-1〜8-9）よりも活性化倍率が有意に上昇した。

試験例３ラットへの各種アミノ酸の投与による、ヒフク筋におけるS6Kのリン酸化
ＳＤラット（6週齢、雄、日本クレア社より入手）に標準飼料（CE-2、日本クレア社製）を与えて環境馴化させた。その後、体重を基準に５群（対照群、ロイシン（5mmol/kg体重：L）投与群、ロイシン（10mmol/kg体重：H）投与群、ロイシン（5mmol/kg体重：L）＋アラニルチロシン（5mmol/kg体重：L）投与群、ロイシン（10mmol/kg体重：H）＋アラニルチロシン（5mmol/kg体重：L）投与群）に分け、各群のラットに対して１８時間の絶食を行った。
絶食後、水（対照群）、水に溶解したロイシン及び／又はアラニルチロシンを胃ゾンデにより上記に示す量を経口投与し、自由飲水かつ絶食下で３０分間飼育を継続した。

自由摂餌／自由飲水下で各群のラットに対してイソフルラン麻酔を行った。そして、ラットの下腹部大静脈から全採血してからヒフク筋を採取した。その後、すみやかに採取したヒフク筋を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。

ポリトロンホモジナイザー（商品名）を用いて、CelLytic MT Mammalian Tissue Lysis/Extraction Reagent（商品名、SIGMA社製）中でヒフク筋を破砕し、15,000回転、15分、4℃で遠心した。BCA法にて遠心後の上清に含まれるタンパク質を定量し、CelLytic MT Mammalian Tissue Lysis/Extraction Reagent（商品名、SIGMA社製）を用い、各サンプル中のタンパク質濃度が同一となるように調整した。タンパク質の濃度調整を行なった各サンプルにLaemmliサンプルバッファー（商品名、BIO-RAD社製）を加え、熱変性処理（95℃、5分）を行った。

熱変性処理を行ったサンプルを用いてSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEには、タンパク質15μg相当のサンプルを用いた。
SDS-PAGE終了後、ゲル中のタンパク質をPVDF membrane（BIO-RAD社製）に転写し（100V、1時間）、1% fatty acid free BSA（Wako社製）/T-TBSを用いてブロッキングを行った（3時間、室温）。Blocking終了後、S6Kのリン酸化/非リン酸化認識抗体（Cell signaling社製）を1次抗体希釈液（Can get signal；Solution1、TOYOBO社製）にて1,000倍希釈した溶液中で、前記membraneを緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートした。その後、T-TBSにて洗浄し（5分、3回）、anti-Rabbit IgG antibody（Cell signaling社製）を2次抗体希釈液（Can get signal；Solution2、TOYOBO社製）にて2,000倍希釈した溶液中で、前記membraneを緩やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートした。その後、T-TBSにて洗浄し（5分、3回）、ECL Prime Western Blotting Detection System（GE Helthcare社製）で処理後、リン酸化度を算出した。ここでリン酸化度は、化学発光装置（ChemiDoc XRS、Bio-Rad社製）を用いてS6Kのリン酸化/非リン酸化タンパク質のバンドを検出し、デンシトメーターにてそれぞれのバンドを定量し、非リン酸化タンパク質に対するリン酸化タンパク質の割合を求め、リン酸化度とした。
その結果を表１６に示す。

表１６に示すように、ロイシンとアラニルチロシンとを併用して投与することにより、S6Kのリン酸化度が有意に上昇した。

以上のように、少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸とを併用することにより、筋芽細胞やヒフク筋におけるS6Kのリン酸化が顕著に促進された。したがって、上記結果は、少なくとも１種のチロシン化合物と、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸との併用が、筋タンパク質合成シグナルの活性化、筋量又は筋力の改善、及び筋萎縮の抑制に有効であることを示している。

Claims

少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
を有効成分とする、筋タンパク質合成シグナル活性化剤。
少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
を有効成分とする、ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進剤。
少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
を有効成分とする、筋量改善剤。
少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
を有効成分とする、筋力改善剤。
少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
を有効成分とする、筋萎縮抑制剤。
前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物である、請求項１〜５のいずれかに１項記載の剤。
少なくとも１種のチロシン化合物、並びに
ロイシン及びイソロイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸、
それぞれを有効量投与又は摂取させる、非治療的筋タンパク質合成シグナル活性化方法、非治療的ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化促進方法、非治療的筋量改善方法、非治療的筋力改善方法、又は非治療的筋萎縮抑制方法。
前記チロシン化合物が、チロシン、チロシン含有ジペプチド、及びアルキル化チロシンからなる群より選ばれる少なくとも１種のチロシン化合物である、請求項７に記載の方法。