JP2022533667A - 骨損失疾患の予防、改善または治療のためのｃｈｐ（シクロ－ヒスプロ）および副甲状腺ホルモンを含む組成物の用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、骨損失疾患の予防、改善または治療のためのＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）および副甲状腺ホルモンを含む組成物の用途に関する。【選択図】図１ａ

Description

本発明は、骨損失疾患の予防、改善または治療のためのＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）および副甲状腺ホルモンを含む組成物の用途に関する。

骨の発生、成長および代謝過程には、骨の形成（ｂｏｎｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）と再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）過程が重要な役割をする。骨の形成は、胎生期から始まって骨格が成熟して成長が終わる青壮年期まで持続して２０代から３０代初めまで最大骨量を形成することになる。それから約３０年間は、骨を除去し、さらにこれを補充する骨材形成過程を繰り返すことになり、この際、骨形成と骨吸収が互いにペアになって均衡を維持することになる。この時期が経過した後には、骨吸収による骨損失を骨形成が十分に追いつかず、結局、年０．３～０．５％程度の骨量減少が発生し、特に女性の場合には、閉経初期に年２～３％の相当な骨損失が発生する。

骨組織は、軟骨と骨格系を構成し、機械的機能として支持と筋付着の役割をし、生体器官および骨髄を保護する機能をし、カルシウムとリンイオンの恒常性維持のために、これらを保存する機能を担当する。骨組織は、膠原質、糖タンパク質のような細胞基質と骨芽細胞（造骨細胞；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨細胞および骨細胞などの様々な種類の細胞からなる。

また、骨組織は、骨芽細胞により形成され、破骨細胞により破壊吸収が絶えず繰り返される動的な組織であり、骨粗しょう症は、骨芽細胞と破骨細胞の平衡が崩れて骨吸収が骨形成より亢進されることで誘発される疾患であり、骨組織の石灰が減少して骨の緻密質が薄くなり、そのため、骨髄腔が広くなり、症状が進むにつれて骨が弱くなるので、小さい衝撃でも骨折を起こしやすい。

骨粗しょう症は、その症状自体よりは骨の弱化に伴い容易にもたらされる各種骨折、特に大腿骨骨折または脊椎骨折などが長期間活動を制限して健康な生活を経営できず、結果的に、高齢者の死亡の１５％に対する原因を提供することが知られている。骨量は、遺伝的要因、栄養摂取、ホルモンの変化、運動および生活習慣の差異などの様々な要因によって影響を受け、骨粗しょう症の原因としては、加齢、運動不足、低体重、喫煙、低カルシウム食事、閉経、卵巣切除などが知られている。特に女性の場合、３０歳以降から骨量減少が持続的に進行され、閉経期になると、ホルモン変化によって骨量が急激に減少する。

このように骨粗しょう症は、程度の差はあるが、シニア層、特に閉経期以降の女性にとって避けられない症状であり、先進国では人口が高齢化するにつれて骨粗しょう症およびその治療剤に対する関心が次第に増加している。また、全世界的に骨疾患の治療と関連して約１３００億ドルの市場が形成されていることが知られており、今後さらに増加すると予想されるので、世界的な各研究機関と製薬会社では、骨疾患治療剤の開発に多くの投資をしており、現在骨吸収抑制剤の開発が活発に進行されている。

最近、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、大衆的な骨粗しょう症治療剤として浮上した。骨吸収（ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）を減少させる他の療法とは異なって、ＰＴＨは、骨質量を増加させて、骨密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ＢＭＤ）をさらに増加させる。ＰＴＨは、骨に直接または間接的に多重作用をする。ＰＴＨは、骨から血液内にカルシウム放出率を増加させる。ＰＴＨの慢性効果は、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）および破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）両方の骨細胞の数字を増加させて再形成骨（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｂｏｎｅ）を増加させることである。骨粗しょう症患者に投与されたＰＴＨは、特に、脊椎および股関節部内の骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）内で骨形成の網刺激（ｎｅｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を起こして骨折を非常に減少させる。骨形成は、骨芽細胞がＰＴＨ受容体を有することのようにＰＴＨによる骨芽細胞の刺激により発生するとみなされる。

このような背景下に、本発明者らは、ＰＴＨとともに複合剤として使用するとき、骨損失疾患に対する治療効果を増進させることができる物質を探索し、ＰＴＨをＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）とともに使用する場合、骨芽細胞の分化と骨形成の促進に相乗効果を示すことを確認し、本発明を完成した。

韓国公開特許第１０－２００８－００５９４３０号公報

本発明の目的は、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、シクロ－ヒスプロまたはこれの食品学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の治療効果増進用薬学的組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、シクロ－ヒスプロまたはその食品学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の改善効果増進用健康機能食品組成物を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物を有効量でこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患の予防または治療方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、骨損失疾患を予防または治療するための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物の用途を提供することにある。

本発明の他の目的は、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の予防または治療効果を増進させるための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物の用途を提供することにある。

上述した課題を解決するために、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその食品学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

さらに、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の治療効果増進用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその食品学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の改善効果増進用健康機能食品組成物を提供する。

本発明は、また、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物を有効量でこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法を提供する。

本発明は、また、骨損失疾患を予防または治療するための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物の用途を提供する。

本発明は、また、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の予防または治療効果を増進させるための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物の用途を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記副甲状腺ホルモンは、副甲状腺ホルモン_１－３４でありうる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上でありうる。

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものでありうる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別々に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与されてもよい。

本発明のシクロ－ヒスプロおよび副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防、改善または治療用組成物は、骨芽細胞の分化および骨形成の促進に相乗効果を示して骨損失疾患の治療に効果的であり、シクロ－ヒスプロは、副甲状腺ホルモンの骨芽細胞の分化および骨形成促進作用を増進させるので、骨損失疾患の予防、改善または治療に副甲状腺ホルモンを適用する場合、シクロ－ヒスプロを効果増進補助剤として使用できる。

図１ａおよび図１ｂは、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１骨芽細胞の分化時にＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）および副甲状腺ホルモン_１－３４（ｈＰＴＨ_１－３４）の複合処理によるＡＬＰ活性増加効果を示すグラフである。 図２ａは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるＡＬＰ遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｂは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるＢＭＰ２遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｃは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｄは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるオステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｅは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるＲｕｎｘ２遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｆは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるコラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。 図２ｇは、初代骨芽細胞の分化時にＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４の複合処理によるオステオプロテジェリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ,ＯＰＧ）遺伝子の発現増加効果を示すグラフである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

上述したように、本発明者らは、ＰＴＨとともに複合剤として使用するとき、骨損失疾患に対する治療効果を増進させることができる物質を探索し、ＰＴＨをＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）とともに使用する場合、骨芽細胞の分化および骨形成の促進に相乗効果を示すことを確認し、本発明を完成した。

したがって、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその食品学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモンを含む骨損失疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

さらに、本発明は、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の治療効果増進用薬学的組成物；およびシクロ－ヒスプロまたはその食品学的に許容可能な塩を含む副甲状腺ホルモンの骨損失疾患の改善効果増進用健康機能食品組成物を提供する。

本発明において「シクロ－ヒスプロ（Ｃｙｃｌｏ－ＨｉｓＰｒｏ；ＣＨＰ）」は、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＴＲＨ）の代謝産物であるヒスチジン－プロリン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ｐｒｏｌｉｎｅ）から構成された天然型環状ジペプチド（ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）またはＴＲＨ代謝過程とｄｅ ｎｏｖｏで体内で合成される生理活性ジペプチドであって、脳全般と脊髄および消化管などに広く分布する物質をいう。

本発明の組成物において、前記ＣＨＰは、合成して使用したり、市販のものを使用してもよい。また、ＣＨＰが含有された物質、例えば、前立腺抽出物から精製して使用してもよい。

用語「精製された」の使用により、ＣＨＰが前立腺抽出物のような天然由来から得られる形態に比べて濃縮された形態であることを意味しようとする。精製された成分は、これらの天然源から濃縮させたり、または化学的合成方法を通じて得ることができる。

前記「前立腺抽出物（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ）」の主な構成成分は、亜鉛、ＣＨＰ、プロスタグランジン前駆体およびアラキドン酸であり、ＣＨＰが高濃度で含有されていて、ＣＨＰで誘導される骨密度および骨体積比の増加効果と骨芽細胞の分化および骨形成促進効果を合理的に予想できる。

本発明の組成物において、前記「前立腺抽出物」は、ウシまたはブタの前立腺粉末などであってもよく、好ましくは、ＣＨＰの含有量を高めるために脂肪が除去された形態で使用してもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の組成物において、前記「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」は、下記のようなアミノ酸配列を有する分泌型８４個のアミノ酸残基のポリペプチドまたはその断片でありうる：Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ（配列番号１）。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、ウシまたはヒトホルモンの下記Ｎ－末端３４個のアミノ酸からなるＰＴＨ_１－３４でありうる：Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ（配列番号２）。

テリパラチド（ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）とも呼ばれるＰＴＨ（１－３４）は、高度な骨折危険がある骨粗しょう症を病んでいる閉経後の女性の治療のために、Ｉｎｄｉａｎａ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ所在Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社のＦＯＲＴＥＯ（登録商標）の商標名で現在市販中である。

本発明において、用語「骨損失」は、破骨細胞と骨芽細胞の不均衡によってもたらされる骨が失われる症状を意味し、「骨損失疾患」は、前記症状に関連した疾患を全部含むことを意味する。したがって、破骨細胞の活性が過度に高まって骨が失われて骨密度が低くなったり、骨芽細胞の活性が低下して骨の生成が円滑に行われないことによってもたらされる疾患を全部含む。前記骨損失疾患の具体的な例としては、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などがあるが、これらに制限されない。

この際、前記骨粗しょう症は、更年期または閉経期症状の一つであり、女性ホルモンの減少により発生したり、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものでありうる。

本発明において、用語「更年期」は、一般的に生殖能力を有する時期から生殖能力がなくなる時期に転換される時期を意味する。前記更年期は、女性の更年期を言及するのに主に使用されているが、女性の更年期は、閉経期（ｍｅｎｏｐａｕｓｅ）だけでなく、閉経周辺期（ｐｅｒｉｍｅｎｏｐａｕｓｅ）前後の時期を全部含む範囲であり、一般的に４０～６０歳の年齢層に該当する。

本発明のＣＨＰまたはその塩および副甲状腺ホルモンを含む組成物は、骨芽細胞の分化を促進して骨形成を促進することによって、骨損失疾患を予防、改善または治療することができる。

図１ａおよび図１ｂに示されたように、ＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４が併用投与されるときに現れるＡＬＰ活性増加効果は、それぞれ単独で投与されるときに現れるＡＬＰ活性増加効果の合計よりもさらに高いレベルに増加して、ＣＨＰおよび副甲状腺ホルモンの併用投与による骨芽細胞分化促進の相乗効果を確認できた。ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、骨芽細胞の初期分化マーカーであり、ＡＬＰ活性が増加する場合、骨芽細胞の分化が促進されて骨形成が促進される。

本発明の骨損失疾患の予防、改善または治療用組成物において、用語「予防」は、病気または病症の発病を抑制したり遅延させるすべての行為を意味する。本発明においては、骨芽細胞の分化を促進して、骨損失疾患の発病時期を遅延させたり、発病を抑制することを意味する。

本発明の骨損失疾患の予防、改善または治療用組成物において、用語「改善」は、病気または病症状態を好転または有益に変更するすべての行為を意味するものであり、本発明においては、骨芽細胞の分化を促進する作用を通じて骨粗しょう症の症状または歯槽骨欠損のような症状を好転させることを意味する。

本発明の骨損失疾患の予防、改善または治療用組成物において、用語「治療」は、病気または病症の進行を遅延、中断または逆転させるすべての行為を意味するものであり、本発明においては、骨芽細胞の分化を促進する作用を通じて歯槽骨または骨などの損失を中断、軽減、緩和またはなくしたり、逆転させることを意味する。

用語「相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｙ ｅｆｆｅｃｔ）」は、各成分が併用（組み合わせ）投与されるときに発生する効果が、単一成分として単独で投与されるときに発生する効果の合計よりもさらに大きいことをいう［Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｒｅｇｕｌ．，２２：２７－５５，１９８４］。本発明のＣＨＰまたはその塩および副甲状腺ホルモンは、併用投与することによって、骨損失疾患に対する予防、改善または治療効果を上昇させる。

用語「併用投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、化合物または成分が患者に共投与されることを意味する。各化合物または成分が共投与されるというのは、所望の治療効果を得るために、各成分を同じ時間にまたは任意の順序にまたは異なる時間に順次に投与されてもよいことを意味する。

用語「患者」は、ヒト、ウシ、イヌ、ギニアピッグ、ウサギ、ニワトリ、昆虫などを含んで治療が要求される任意の単一個体を意味する。また、任意の疾患の臨床所見を示さない臨床研究試験に参加した任意の対象または力学研究に参加した対象または対照群に使用された対象がその対象に含まれる。

本願において、用語「薬学的に許容可能な」は、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、アレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさないことを言い、前記塩としては、薬剤学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が好ましい。

前記薬学的に許容可能な塩は、有機酸または無機酸を用いて形成された酸付加塩であってもよく、前記有機酸は、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸、イソ酪酸、トリフルオロ酢酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、コハク酸モノアミド、グルタミン酸、酒石酸、シュウ酸、クエン酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、安息香酸、フタル酸、サリチル酸、アントラニル酸、ジクロロ酢酸、アミノオキシ酢酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸またはメタンスルホン酸を含む。無機酸は、例えば、塩酸、臭素酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸またはホウ酸を含む。酸付加塩は、好ましくは、塩酸塩または酢酸塩の形態であってもよく、より好ましくは、塩酸塩の形態であってもよい。

その他にも、更に塩が可能な形態は、ガバ塩、ガバペンチン塩、プレガバリン塩、ニコチン酸塩、アジペート塩、ヘミマロン酸塩、システイン塩、アセチルシステイン塩、メチオニン塩、アルギニン塩、リシン塩、オルニチン塩またはアスパルト酸塩などがある。

また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸などを含んでもよい。非経口投与用担体は、水、好適なオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどを含んでもよい。また、安定化剤および保存剤をさらに含んでもよい。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベンおよびクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、下記の文献に記載されているものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。

本発明の薬学的組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にいかなる方法によっても投与できる。例えば、経口または非経口投与してもよく、非経口投与方法としては、これらに制限されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸内投与であってもよい。

本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路によって経口投与用または非経口投与用製剤に剤形化できる。剤形化する場合には、一つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水またはＰＢＳ）、カーボハイドレイト（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランなど）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント（例えば、アルミニウムヒドロキシド）、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤または界面活性剤、希釈剤または賦形剤を使って調製されてもよい。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液またはカプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の薬学組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン（とうもろこしデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプンなどを含む）、カルシウムカーボネート（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチル－セルロースまたはゼラチンなどを混ぜて調製されてもよい。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合した後、これを粉砕し、好適な補助剤を添加した後、顆粒混合物に加工することによって、錠剤または糖衣錠を収得できる。

単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、頻用される単純希釈剤である水またはリキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤または保存剤などが含まれてもよい。

また、場合によって架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどを崩解剤として添加でき、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含んでもよい。

非経口投与する場合、本発明の薬学組成物は、好適な非経口用担体とともに注射剤、経皮投与剤および鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知となった方法によって剤形化できる。前記注射剤の場合には、必ず滅菌しなければならないし、バクテリアおよび真菌のような微生物の汚染から保護しなければならない。注射剤の場合、好適な担体の例としては、これらに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、好適な担体としては、ハンクス溶液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースのような等張溶液などを使用できる。前記注射剤を微生物の汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような様々な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含んでもよい。また、前記注射剤は、多くの場合、糖またはナトリウムクロリドのような等張剤をさらに含んでもよい。

経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロゾル剤などの形態が含まれる。前記で「経皮投与」は、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して、薬学的組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。

吸入投与剤の場合、本発明によって使用される化合物は、好適な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を使用して、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレーの形態で便利に伝達できる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達するバルブを提供して決定することができる。例えば、吸入器または吹込み機に使用されるゼラチンカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化できる。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学に一般的に公知となった処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。

本発明の薬学的組成物は、シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを有効量で含む場合、好ましい骨損失疾患の予防、改善または治療効果を提供できる。本願において、用語「有効量」は、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を言い、好ましくは、骨損失疾患を予防、改善または治療するのに十分な量をいう。本発明の薬学的組成物にシクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンが０．０１～９９．９％含まれてもよく、残量は薬学的に許容可能な担体が占めることができる。本発明の薬学的組成物に含まれるシクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンの有効量は、組成物が製品化される形態などによって変わる。

本発明の薬学的組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与されもよい。本発明の薬学組成物は、疾患の程度によって有効成分の含有量を異ならせることができる。例えば、シクロ－ヒスプロを基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．００１～１００ｍｇ、さらに好ましくは、０．０１～１０ｍｇの量で投与されるように、１～数回に分けて投与してもよい。しかしながら、前記シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンの用量は、薬学的組成物の投与経路および治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食事および排泄率など多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されることであるから、このような点を考慮して、当該分野における通常の知識を有する者なら前記シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを骨損失疾患の予防、治療または改善のための特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定できる。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路および投与方法に特に制限されない。

本発明の骨損失疾患予防または治療用薬学的組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療または生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用できる。

本発明の骨損失疾患の予防または治療用薬学的組成物は、また、シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを含む外用剤の剤形で提供できる。このような態様において、本発明の組成物は、骨損失疾患の予防または改善用医薬部外品組成物および前記組成物を含む医薬部外品であってもよい。

前記外用剤は、皮膚または口腔内に直接適用されてもよい。本発明の骨損失疾患の予防または治療用薬学組成物を外用剤として使用する場合、さらに、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤およびゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞など皮膚外用剤に通常的に使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤を含有できる。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入されてもよい。

本発明の組成物が外用剤として提供される場合、これらに制限されるものではないが、液剤、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤などの剤形であってもよい。本発明の一具現例によれば、本発明の医薬部外品は、歯磨き粉、液体歯磨きおよびマウススプレーを含む口腔管理製品、軟膏剤、マスク、湿布剤、貼付剤および経皮吸収剤などを含んでもよい。

本発明のシクロ－ヒスプロを処理する場合、骨芽細胞の分化が促進されたところ、前記有効成分を口腔管理製品に適用する場合、骨芽細胞の分化を促進して歯槽骨疾患の予防または改善に効果がある。したがって、前記医薬部外品組成物は、骨損失の予防または改善のための口腔管理用組成物でありうる。

本発明の組成物を医薬部外品組成物として使用する場合、シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンをそのまま添加したり、他の医薬部外品の成分と共に通常の方法によって適切に使用してもよい。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適合するように決定されてもよい。

本発明の医薬部外品組成物および医薬部外品については、本発明の薬学的組成物および健康機能食品組成物の内容が準用されてもよい。

本発明の健康機能食品組成物において、「食品学的に許容可能な塩」は、本発明の食品学的に許容可能な塩は、食品学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成される酸付加塩または塩基により形成される金属塩が有用である。一例として、遊離酸としては、無機酸と有機酸を使用できる。無機酸としては、塩酸、硫酸、臭素酸、亜硫酸またはリン酸などを使用でき、有機酸としては、クエン酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸などを使用できる。また、金属塩としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を使用できる。しかしながら、必ずこれらに制限されない。

本発明において、用語「健康機能食品」は、「機能性食品」および「健康食品」の意味を全部含む。

本発明において、用語「機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）」は、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ，ＦｏＳＨＵ）と同じ用語であって、栄養供給の他にも、生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学や医療効果が高い食品を意味する。

本発明において用語、「健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）」は、一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｏｄ）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、機能性食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用される。前記食品は、骨損失疾患の改善または回復に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの多様な形態で製造されてもよい。

このような機能性食品の具体的な例として、前記組成物を用いて農産物、畜産物または水産物の特性を生かして変形させると同時に、貯蔵性を良くした加工食品を製造できる。

本発明の健康機能食品組成物は、また、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、食品添加剤（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）および飼料などの形態で製造されてもよく、ヒトまたは家畜をはじめとする動物を取食対象とする。

前記類型の食品組成物は、当業界に公知となった通常の方法によって様々な形態で製造できる。一般食品としては、これらに限定されないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実およびその加工食品（例：果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コンビーフなど）、パン類および麺類（例：うどん、ソバ、ラーメン、スパゲティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チイズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、しょう油、ソースなど）などにシクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを添加して製造できる。

また、栄養補助剤としては、これらに限定されないが、カプセル、タブレット、丸剤などにシクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを添加して製造できる。

また、健康機能食品としては、これらに限定されないが、例えば、前記シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンをお茶、ジュースおよびドリンクの形態で製造して飲用（健康飲料）できるように、液状化、顆粒化、カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、前記シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンを食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用できる。また、前記シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンと骨損失疾患の予防または改善に効果があると知られた公知の活性成分とともに混合して組成物の形態で製造できる。

本発明の食品組成物が健康飲料組成物に用いられる場合、前記健康飲料組成物は、通常の飲料のように、様々な香味剤または天然炭水化物などを更なる成分として含有できる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド；マルトース、スクロースのようなジサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤は、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤；サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用できる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり一般的に約０．０１～０．０４ｇ、好ましくは、約０．０２～０．０３ｇである。

シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンは、骨損失疾患の予防または改善用食品組成物の有効成分として含有されてもよく、その量は、前記予防または改善効果を得るのに有効な量であって、例えば全体組成物の総重量に対して０．０１～１００重量％であることが好ましいが、これに特に限定されるものではない。本発明の食品組成物は、シクロ－ヒスプロまたはその塩および副甲状腺ホルモンとともに骨損失疾患の予防または改善に効果があると知られた他の活性成分と共に混合して製造できる。

前記の他に、本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸塩、アルギン酸、アルギン酸塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有できる。その他、本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有できる。このような成分は、独立して、または混合して使用できる。このような添加剤の割合は、大きく重要なことではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０．０１～０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。

本発明は、また、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物を有効量でこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患の予防または治療方法を提供する。

さらに、本発明は、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法を提供する。

本発明の方法において、用語「個体」は、任意の動物（例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、ギニアピッグまたはげっ歯類）を含むが、これらに限定されない。このような用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、女性／雌性、男性／雄性、成人／成体および新生対象体だけでなく、胎児が含まれるように意図される。患者は、疾患または障害にかかった対象体を指す。患者という用語は、ヒトおよび獣医学対象体を含む。

本発明の方法において、ＣＨＰおよび副甲状腺ホロモンの効果およびその投与経路、投与回数、投与量などを含む構成に関する説明は、前述した通りであるので、その記載を省略する。

本発明の方法において、シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別々に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与されてもよい。例えば、シクロ－ヒスプロまたはその薬学的に許容可能な塩と副甲状腺ホルモンは、共同－製剤化されて組み合わせられた単位投与製剤で同時に投与されたり、別途の製剤として同時にまたは順次に投与されてもよい。

順次に投与される場合、各有効成分は、個別製剤として時間間隔をもって投与されてもよく、投与順序は、医師または当該分野における通常の知識を有する者により決定されてもよい。

本発明は、また、骨損失疾患を予防または治療するための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物の用途を提供する。

本発明は、また、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の予防または治療効果を増進させるための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物の用途を提供する。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、本発明は、様々な変更を加えることができ、様々な形態を有することができるところ、以下で記述する特定の実施例および説明は、本発明の理解を助けるためのものに過ぎず、本発明を特定の開示形態に対して限定しようとするものではない。本発明の範囲は、本発明の思想および技術範囲に含まれるすべての変更、均等物乃至代替物を含むものと理解しなければならない。

［準備例１］
下記実施例において使用したＣＨＰ（シクロ－ヒスプロ）は、Ｂａｃｈｅｍから購入して使用し、ｈＰＴＨ_１－３４（ヒト副甲状腺ホルモン_１－３４）は、Ｔｏｃｒｉｓから購入した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の培養には、Ｇｉｂｃｏ社のＭＥＭα、アスコルビン酸無添加（ｎｏ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）培地とハイクローンのＦＢＳを購入して使用し、分化に使用されたβ－グリセロリン酸（β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とアスコルビン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。細胞溶解（ｌｙｓｉｓ）は、ＴｈｅｒｍｏのＲＩＰＡ溶解バッファーを使用した。ＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）活性を測定するためには、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈのｐＮＰＰ基質溶液を使用し、タンパク質定量は、ＴｈｅｒｍｏのＢＣＡ定量キットを使用した。細胞からのＲＮＡ抽出のためには、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社のＮｕｃｌｅｏＺＯＬを購入し、ｃＤＮＡ合成とリアルタイム（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ分析のためには、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットとｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ製品を購入した。

［準備例２］
頭蓋骨由来初代骨芽細胞（Ｃａｌｖａｒｉａｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）を培養するために、生後１日目のＣ５７ＢＬ／６ ｐｕｐをコアテック社から購入した。細胞分離のためのコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）とジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）は、それぞれＧｉｂｃｏ社とＲｏｃｈｅ社から購入した。

［準備例３］
リアルタイム（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲのためのプライマーは、表１のような塩基配列でＢｉｏｎｅｅｒ社で合成して使用した。

［実施例１］
ＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４の複合投与によるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１骨芽細胞の分化促進および骨形成促進効能の測定

１－１．ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１骨芽細胞の培養条件
１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含有されたＭＥＭα、アスコルビン酸無添加（ｎｏ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）培地を用いてＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を３７℃、５％ＣＯ_２条件のインキュベーターで培養した。骨芽細胞への分化のために、細胞が一杯になったとき、上記の基本培地組成に１０ｍＭのβ－グリセロリン酸と５０μｇ／μｌのアスコルビン酸を添加して使用した。

１－２．ＣＨＰ、ｈＰＴＨ_１－３４の単独処理と複合処理によるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１骨芽細胞の分化誘導促進
１２ウェルプレートに２．５×１０^５個のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を１ｍｌで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、細胞が一杯になるまで４８時間培養した。骨芽細胞へ分化させるために分化培地に培地を交替し、表２のように、各群別にＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４を当該濃度で処理した。この際、分化に対する陰性対照群である未分化群には、分化培地でなく、基本培地を利用した。すべての群は、処理６時間後に培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、分化培地に交替した。７２時間ごとに培地を交替しながら、各濃度のＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４を処理して、合計１４日間培養した。

１－３．ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、アルカリフォスファターゼ）活性の測定
分化１４日目に、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＲＩＰＡ溶解バッファー１００μｌを各ウェルに入れ、細胞スクレーパー（ｓｃｒａｐｅｒ）を用いて細胞を取り除いた。ピペットを用いて１．５ｍｌチューブに移した後、超音波粉砕機（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、振幅１０、０．５秒パルス、１０回）を用いて粉砕した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液のみを分離した。分離した各溶解物サンプルを１０μｌずつ９６ウェルプレートに入れ、ｐＮＰＰ基質溶液を２００μｌ入れて常温で１時間反応させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。

ＡＬＰ活性値を溶解物のタンパク質濃度で補正するために、各溶解物をＢＣＡ定量法で定量して、４０５ｎｍにおけるＡＬＰ活性吸光度の値を入った総タンパク質量で割った［Ａｂｓ．ＯＤ４０５ｎｍ／μｇ ｏｆ ａｎａｌｙｚｅｄ］。

統計的有意性は、一元分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）統計分析法を使用し、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）事後検定法で対照群との有意性を比較した（＊ｐ＜０．０５）。

実験結果、図１ａおよび図１ｂに示されたように、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰを複合処理した群のＡＬＰ活性が、ｈＰＴＨ_１－３４の単独処理群に比べて増加することを確認した。この結果は、ｈＰＴＨ_１－３４による骨芽細胞の分化と骨形成促進作用が、複合投与されたＣＨＰによりさらに上昇したのと解される。これを通じて、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰの複合投与が骨の健康と骨粗しょう症の治療に相乗効果を示すことを確認した。

［実施例２］
ＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４の複合投与による初代骨芽細胞の分化と骨形成関連遺伝子発現の測定

２－１．初代骨芽細胞の培養
生後１日目のＣ５７ＢＬ／６ ｐｕｐの頭蓋冠（Ｃａｌｖａｒｉａ）のみを分離した。消化培地（Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）（０．１％コラゲナーゼ、０．２％ジスパーゼが添加されたＭＥＭα）に分離した頭蓋冠を入れ、３７℃で振りながら、１５分ずつ５回消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を進めた。最初に消化した溶液（ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は捨てて、２回目から５回目までの消化した溶液（ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を収集した。１，６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養培地（１０％ ＦＢＳが添加されたＭＥＭα）に細胞を懸濁した後、０．２μｍのろ過器（ｓｔｒａｉｎｅｒ）でろ過して、デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。培養培地に得られた細胞を解離し、３７℃、５％ＣＯ_２条件のインキュベーターで３日間培養して使用した。以後、骨芽細胞への分化のためには、細胞が一杯になったとき、前記培養培地の組成に１０ｍＭのβ－グリセロリン酸と５０μｇ／μｌのアスコルビン酸を添加して使用した。

２－２．ＣＨＰ、ｈＰＴＨ_１－３４の単独処理と複合処理による初代骨芽細胞の分化誘導促進
１２ウェルプレートに１×１０^５個の初代骨芽細胞を１ｍｌで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、４８時間培養した。骨芽細胞へ分化させるために、分化培地に培地を交替し、表３のように、各群別にＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４を当該濃度で処理した。この際、分化に対する陰性対照群である未分化群には、分化培地でなく、基本培養培地を利用した。すべての群は、処理６時間後に培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、分化培地に交替した。４８時間ごとに培地を交替しながら、各濃度のＣＨＰとｈＰＴＨ_１－３４を処理し、合計６日間培養した。

２－３．細胞内ＲＮＡ抽出
分化６日目に、培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＮｕｃｌｅｏＺＯＬ ５００μＬを入れ、細胞を溶解させた。次に、ＮｕｃｌｅｏＺＯＬのトータルＲＮＡ分離（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）プロトコルによってＲＮＡを抽出し、１μｇのＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）でｃＤＮＡを合成した。

２－４．骨芽細胞の分化と骨形成関連遺伝子発現の分析
合成したｃＤＮＡを各遺伝子に該当する正方向／逆方向プライマーセットを用いてｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘでリアルタイム（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲを進めて分析した。各遺伝子の発現値は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－ａｃｔｉｎの発現値で割って補正した。統計的有意性は、一元分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）統計分析法を使用し、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）事後検定法で対照群との有意性を比較した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。

実験結果、図２ａに示されたように、骨芽細胞の分化の代表的マーカーであるＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）遺伝子の発現は、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰを複合処理した群において対照群に比べて顕著に増加し、ＣＨＰおよびｈＰＴＨ_１－３４の単独処理群に比べて顕著に増加したことを確認した。これを通じて、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰの複合投与により初代骨芽細胞の分化と骨形成促進作用が顕著に増加したことが分かる。

図２ｂおよび図２ｃに示されたように、骨芽細胞が分化することで分泌されるＢＭＰ２とオステオカルシン遺伝子も、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰを複合処理した群において有意に増加することを確認した。これを通じて、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰの複合投与により初代骨芽細胞の分化が、対照群と比較して有意なレベルで顕著に促進されたことが分かる。

図２ｄおよび図２ｅに示されたように、骨芽細胞の分化と骨形成作用に関与する転写因子であるオステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）とＲｕｎｘ２遺伝子の発現も、対照群に比べてｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰを複合処理した群において顕著に増加したことを確認した。そして、図２ｆおよび図２ｇに示されたように、骨芽細胞の分化と骨形成作用のシグナル伝達を受けて増加するコラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）とオステオプロテジェリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ,ＯＰＧ）遺伝子の発現も、対照群に比べてｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰを複合処理した群において有意なレベルに近く増加する傾向性が現れた。

上記のような結果を通じて、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰの複合投与は、初代骨芽細胞の分化と骨形成促進作用においてそれぞれの単独投与で予想される効果を超える相乗効果を示すことを確認した。したがって、ｈＰＴＨ_１－３４とＣＨＰの複合投与が、骨の健康と骨粗しょう症をはじめとする骨損失疾患の治療に予想しない優れた治療効能があることが分かる。

Claims (27)

1. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および
   副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む、骨損失疾患の予防または治療用薬学的組成物。
2. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の薬学的組成物。
4. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
5. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその食品学的に許容可能な塩；および
   副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む、骨損失疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
6. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、健康機能食品組成物。
7. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項５に記載の健康機能食品組成物。
8. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項７に記載の健康機能食品組成物。
9. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の骨損失疾患の治療効果増進用薬学的組成物。
10. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその食品学的に許容可能な塩を含む、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の骨損失疾患の改善効果増進用健康機能食品組成物。
11. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物を有効量でこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患の予防または治療方法。
12. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、請求項１１に記載の骨損失疾患の予防または治療方法。
13. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項１１に記載の骨損失疾患の予防または治療方法。
14. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項１３に記載の骨損失疾患の予防または治療方法。
15. シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をこれを必要とする個体に投与することを含む、骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法。
16. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、請求項１５に記載の骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法。
17. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項１５に記載の骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法。
18. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項１７に記載の骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法。
19. 前記シクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別々に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与される、請求項１５に記載の骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモンの治療効果増進方法。
20. 骨損失疾患を予防または治療するための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩；および副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む組成物の用途。
21. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、請求項２０に記載の用途。
22. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項２０に記載の用途。
23. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項２２に記載の用途。
24. 骨損失疾患に対する副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の予防または治療効果を増進させるための薬剤の製造時にシクロ－ヒスプロ（ＣＨＰ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物の用途。
25. 前記副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、副甲状腺ホルモン_１－３４（ＰＴＨ_１－３４）である、請求項２４に記載の用途。
26. 前記骨損失疾患は、骨粗しょう症、パジェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、歯槽骨欠損、骨軟化症および腎性骨形成異常症（ｒｅｎａｌ ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選はれたいずれか一つ以上である、請求項２４に記載の用途。
27. 前記骨粗しょう症は、女性ホルモンの減少、骨芽細胞の破壊または活性抑制により発生するものである、請求項２６に記載の用途。
    

Images