KR100989174B1

KR100989174B1 - 여성 갱년기 증상개선에 효과를 갖는 효모 가수분해물 및 이를 포함하는 식품

Info

Publication number: KR100989174B1
Application number: KR1020100009304A
Authority: KR
Inventors: 배송환; 서형주; 정은영
Original assignee: (주)새롬바이오
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2010-10-20
Also published as: WO2011093599A3; WO2011093599A2

Abstract

본 발명은 효모 가수분해물을 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물, 및 상기 조성물의 제조방법에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 혈중 호르몬을 정상화 시키고 골조직을 개선시키는 등 골다공증, 우울증 등 폐경, 성호르몬 감소, 난소의 기능 저하로 인한 여러 증상 및 질환에 효과적이다.

Description

여성 갱년기 증상개선에 효과를 갖는 효모 가수분해물 및 이를 포함하는 식품{Yeast hydrolysate having improved effect on female climacteric disorder and a food composition comprising thereof}

본 발명은 효모 가수분해물을 이용한 갱년기 또는 폐경기 장애의 개선 또는 예방에 대한 것이다.

최근 의학의 발달과 경제수준의 향상으로 인간의 평균 수명이 길어져, 전 세계적으로 노인 인구가 증가하는 추세이다. 특히 2001년 한국인의 평균 수명은 남성 72.8세, 여성 80세였으나 2006년 남성 75.7세, 여성 82.4세로 빠른 속도로 평균 수명이 증가하고 있으며, 65세 이상 인구가 전체 한국 인구의 9.5 %로 이미 고령화 사회에 접어들었다. 그러므로 전례없이 길어지고 있는 노령기에 대비하여 노인의 건강과 삶의 질 향상을 위한 연구가 요구된다.

특히, 전체 여성의 20% 정도가 그 증상을 겪는 것으로 알려진 갱년기는, 노화 현상의 하나로, 난소의 기능이 점차 감소하는 40세 이후부터 서서히 시작되는데, 여성의 평균 수명이 점차 연장됨에 따라 호르몬 결핍기간은 일생의 1/3 이상을 차지한다는 점이 문제점으로 대두되고 있다. 난소 기능의 감소로 야기된 시상하부-뇌하수체-난소로 이어지는 성선 축의 기능실조가 원인이 되고 이로 인하여 성호르몬, 지질 및 심혈관계 대사, 골대사, 기억 작용 등의 신체 및 정신적인 변화가 나타난다. 갱년기의 시작은 폐경과 더불어 시작되며 폐경기 여성은 호르몬 불균형과 칼슘 결핍 및 체내 산화적 스트레스 증가로 여러 질병의 위험에 처하게 된다. 즉, 폐경기의 에스트로겐 변화로 관상동맥 질환, 골다공증, 알츠하이머 등 질환의 발병률은 급증하게 되고, 특히 폐경기 이후 에스트로겐 감소는 급속한 골 손실을 초래하게 된다.

폐경기 여성을 대상으로 한 호르몬 치료 요법은 인위적으로 에스트로겐을 투여하는 호르몬 보충요법(Hormone Replacement Therapy)이 이용되는데, 이는 에스트로겐을 단독 투여하거나 프로게스테론과 함께 병용 투여하는 것이 일반적이다. 그러나 에스트로겐의 투여는 갱년기 증상을 개선시키기는 하나 유방암 및 자궁암의 발생 위험도를 높이며, 장기간 투여 시 유방암, 정맥혈전증, 고밀도 콜레스테롤 감소, 혈압 상승, 심장 질환 및 담낭질환 발병의 위험이 높아진다고 보고되었다.

이에 본 발명자들은 보다 안전하고 효과적인 에스트로겐 대체 물질을 개발하고자 연구하던 중, 미생물 발효 배지, 건강식품 등의 원료로 이용되는 효모 가수분해물(Bioindustry, 14, 53, 1997)이 난소제거 SD 래트에 있어, 혈중 에스트라디올 및 테스토스테론 수치를 증가시키고 골대사 및 골조직을 개선시키는데 효과가 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 안전하고 효과적인 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 안전하고 효과적인 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.

아울러 본 발명은 효모를 가수분해하는 단계를 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 효모 가수분해물은 폐경, 난소의 기능 감소, 성호르몬의 감소로 인한 갱년기 또는 폐경기 증상을 예방하거나 개선하는데 효과가 있다.

도 1은 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 체중에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 식이섭취에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 장기 무게에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 호르몬에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 골대사에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 골조직 형태에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 효모 가수분해물의 투약이 난소 절제 SD 래트의 뇌조직에 미치는 영향을 나타낸다.

본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 효모를 가수분해하는 단계를 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 효모는 식품으로서 사용되는 효모이면 되고 그 종류가 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대 본 발명의 효모에는 Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces fermentati , Saccharomyces bayanus , Saccharomyces sake , Saccharomyces mandshuricus ,, Saccharomyces anamensis , Saccharomyces formosensis ,. Saccharomyces ellipsoideus , Saccharomyces coreanus 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 Saccharomyces cerevisiae 이다.

본 발명의 효모 가수분해물은 효모에 효소를 가하여 가수분해시킨 것이다. 또한 본 발명의 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물의 제조방법은 효모에 효소를 가하여 가수분해하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 효소는 단백질 분해효소인 것이 바람직하다. 상기 단백질 분해효소로는 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 파파인(Papain), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 뉴트레이즈(Neutrase) 및 프로테아제-A(Protease-A)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하다. 피신, 파파인, 플라보자임, 또는 프로타맥스 등으로 가수분해한 효모 가수분해물의 투약 시보다 효모 브로멜라인 가수분해물을 투약한 때 난소절제 SD 래트의 혈중 에스트라디올, 테스토스테론 및 성장 호르몬의 정상화 효과(난소절제를 하지 않은 SD 래트 수준으로의 회복)가 더욱 좋았는 바, 상기 효소는 브로멜라인인 것이 더욱 바람직하다. 그러나 본 발명의 특징은 효모를 단백질 분해효소로 가수분해한 효모 가수분해물이 난소절제로 인한 생리적 변화를 완충시킨다는 것을 확인한데 있는바, 단백질 분해효소가 다르다 하더라도 효모 가수분해물로 폐경기, 갱년기 증상을 완화, 치료, 예방한다면 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

상기 갱년기 또는 폐경기 장애란, 폐경 또는 급격한 여성호르몬 감소로 인한 장애를 의미하며, 그 증상으로는 우울증, 빈맥, 불안, 안면홍조, 가슴 두근거림, 요실금, 배뇨곤란, 오줌 소태, 재발성 비뇨기계 염증 및 발한 등이 있다. 그러나 여성 호르몬의 급감으로 인한 증상이라면 모두 갱년기 또는 폐경기 장애에 해당하고 상기 증상에 국한되어 생각할 것은 아니다.

또한 본 발명의 효모 가수분해물은 갱년기 또는 폐경기 장애 증상이 나타난 후 투약하여도 좋지만, 여성 호르몬의 감소가 예상 또는 진단되는 경우 미리 복용하는 것도 바람직하다. 본 발명의 효모 가수분해물은 성호르몬 및 성장호르몬의 분비를 촉진함으로써 갱년기 또는 폐경기의 원인이자 현상인 성호르몬 감소를 상쇄할 수 있기 때문이다.

상기 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물이 될 수 있다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 약학적 조성물은 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선에 효과가 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 폐경 또는 여성 호르몬의 급격한 감소에 의한 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는데, 이러한 증상에는 우울증, 빈맥, 불안, 안면홍조, 가슴 두근거림, 요실금, 배뇨곤란, 오줌 소태, 재발성 비뇨기계 염증 또는 발한 등이 있다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 1g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 효모 가수분해물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 건강기능식품을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 40 내지 70 중량%, 바람직하게는 50 내지 60 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물의 상기 효모 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 효모 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 효모 가수분해물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재료 및 방법

효모 브로멜라인 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 브로멜라인(bromelain) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10 k 와 30 k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조하였다.

실험동물

실험 동물은 Nara biotech. (Seoul, Korea)에서 공급받은 10 주령의 암컷 Sprague-Dawley(SD) 계열 흰쥐(250 ± 5 g)를 사용하였다. 실험 동물은 사육케이지(42 × 28 cm)을 이용해 실험실 온도 22-24℃, 습도 60 ± 5%가 유지되며 밤낮 주기(12 시간 light/ 12 시간 dark)가 자동 조절장치에 의해 조절되는 고려대학교 동물실에서 1 주간 예비 사육한 후 난소 절제 시술을 시행하였으며 8 주간 본 연구를 위해 사육되었다.

그룹 설정

난소 절제 시술은 Ketamine(Keara 100 mg/kg)과 2% Xylazine(Rumpun 0.15 ml/kg)로 전신 마취하고 통법에 따라 제모 및 술전 무균 처리(10% povine-iodine scrub followed by 70% alcohol wipe)를 시행하였다. 실험 동물 복측 중앙에 1 cm 가량의 절개를 시행한 뒤 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 난소 절제를 양측으로 시행하였다(ovariectomy). 난소 절제 후 각 장기를 복강내로 재위치 시킨 후 봉합용 실로 층별 봉합을 하고 수술 후 감염 방지를 위해 항생제(cafazolin 50 mg/kg)을 근육에 주사하였다. 시술 1 주일 후 회복 과정을 거쳐 정상 회복된 쥐들만 선택하여 본 실험을 하였다.

연구 그룹은 무작위 추출법에 의해 군당 7 마리씩 4 개군으로 분류하였다(표 1). 실험 대조군은 실험군과 동일한 스트레스를 주기 위하여 난소를 절제하지 않고 개복 시술만 실시한 Sham 대조군(Sham), 난소 절제 시술 한 뒤 시료를 처치 하지 않은 무처치 음성 대조군(OVX)과 복합 에스트로겐(Premina, Dalim biotech., Seoul, Korea)을 처치한 양성 대조군(OVX+E)이 있다. 실험군에는 난소 절제술을 시행한 뒤 효모 가수분해물(Ystrogen)을 0.5 % 음용수에 혼합하여 투여하였으며(OVX+Yst), 양성 대조군(OVX+E)은 복합 에스트로겐을 0.005 % 음용수에 혼합하여 공급하였다. 실험에 참여한 모든 대조군들 및 실험군들의 식이는 AIN-93 기본 식이(Samyang Co., Seoul, Korea)를 이용하였고 음용수와 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

		시술	처치
대조군	Sham:sham-control	Mock-operation	무처치
실험군	OVX:negative control	난소 절제술	무처치
	OVX+E: positive control	난소 절제술	복합 에스트로겐(Premina) 0.0005 %
	OVX+Yst	난소 절제술	효모 가수분해물(Ystrogen) 0.5 %

통계 분석

실험 결과는 SPSS 12.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 평균의 표준오차(standard error of the mean, SEM)를 산출하였다. 실험군 간의 유의성은 ANOVA test 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test 로 구체적인 사후 검증을 실시하였다.

<실시예 2> 효모 가수분해물이 체중 및 식이섭취에 미치는 영향

<실험예 1> 효모 가수분해물이 체중에 미치는 영향

난소 절제 후 4 주까지 OVX 군(2 주; 58.4 g, 4 주; 100.1 g)의 체중 증가는 Sham 군(2 주; 31.1 g, 4 주; 56.8 g)에 비하여 유의하게 높아(p<0.05) 난소 절제 시술 초기에 체중 증가가 촉진됨을 알 수 있었다. 4 주 이후부터는 난소 절제에 대한 체중 증가가 통계적으로 유의하지 않았다.

복합 에스트로겐을 처치한 경우(OVX+E) 처치 초기부터 8 주의 관찰 기간 동안 내내 난소 절제로 인한 체중 증가를 유의적으로 억제시키는 것으로 나타나(p<0.05) 복합 에스트로겐 호르몬 대체 요법에 대한 체중 증가 억제 효과를 알 수 있었다. 그러나 효모 가수분해물(Ystrogen) 0.5% 섭취군의 체중 증가가 매우 높아(p<0.05) 효모 가수분해물은 난소 절제 후 체중 증가의 저해 효능은 없는 것으로 확인되었다(도 1).

<실험예 2> 효모 가수분해물이 식이섭취에 미치는 영향

난소 절제 시술 이후 4 주 동안 난소 절제 시술한 OVX 군은 Sham 군에 비해 일일 식이 섭취가 많았으나(p<0.05), 4 주 이후에는 두 군간의 섭취량이 통계적으로 유사한 것으로 나타났다. 난소 절제 시술 이후 초기의 Sham 군과 OVX 군의 식이 섭취의 차이는 양 대조군의 체중 증가에 영향을 미친 것으로 보인다. 체중 증가가 가장 유의적으로 억제된 것으로 나타난 복합 에스트로겐 처치군(OVX+E)의 경우 계속적으로 가장 적은 양을 섭취하는 것으로 확인되었는데, 특히 5 주까지는 OVX 군에 비하여 섭취량에 상당한 차이가 나타났다(p<0.05). 반면 효모가수분해물(Ystrogen) 섭취군은 매우 높은 식이 섭취량을 나타내어 효모가수분해물(Ystrogen)이 식이 섭취를 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 효모 가수분해물 섭취군의 체중 증가에 영향을 미치는 것으로 보인다. 그러나 4 주 이후부터는 각 대조군들 및 실험군의 식이 섭취량간의 차이가 줄어들기 시작하여, 8 주차에는 식이 섭취량간에 유의한 차이를 보이지 않았다(도 2).

<실시예 3> 효모 가수분해물이 장기 무게에 미치는 영향

실험 종료 시점에서 12 시간 절식시킨 실험 동물을 ethyl ether 로 마취시켜 희생시킨 후 흉강을 열고 대동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 후 체중 g 당 0.1 mg 의 pentobarbital 을 실험동물에게 복강내 주사하여 마취시키고 심장을 통하여 관류고정을 실시하였다. 먼저 heparin 을 10 u/ml 로 혼합한 생리식염수를 150 ml 관류시켜 혈액을 제거하고, 그 즉시 고정액을 관류시켰다. 고정액은 4% paraformaldehyde-lysine-periodate 를 사용하며, 이를 약 500 ml 정도 관류시킨 후 간, 신장, 비장, 자궁 및 뇌를 적출하였다.

적출한 장기는 무게를 측정하고, 측정된 장기 무게는 체중 100 g 에 대하여 상대적인 무게로 나타내었다. 간, 신장, 비장 무게가 실험군 간에 통계적으로 유의하지 않은 것으로 보아 난소 절제 시술은 간, 신장, 비장 등 장기에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 복합 에스트로겐과 효모 가수분해물(Ystrogen) 처치에 따른 차이도 나타나지 않았는바, 이들의 처치로 인하여 장기 무게의 변화가 야기되는 것도 아닌 것으로 판단된다. 그러나 자궁은 난소 절제로 인하여 그 무게가 유의하게 감소하였으며(Sham; 0.27 g/100g BW vs OVX; 0.12 g/100g BW, p<0.05), 복합 에스트로겐 및 효모가수분해물(Ystrogen) 처치 후 각각의 자궁 무게가 약간 상승하였으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다(도 3).

<실시예 4> 효모 가수분해물이 호르몬에 미치는 영향

실험 종료 시점에서 12 시간 절식시킨 실험 동물을 ethyl ether로 마취시켜 희생시킨 후 흉강을 열고 대동맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 즉시 heparin 으로 처리된 시험관에 넣고 4 ℃, 3,000 × g 에서 10 분간 원심 분리하여 상등액인 혈장을 수득하고 분석 시까지 -70 ℃에서 보관하였다.

혈장내 성 호르몬(에스트라디올 및 테스토스테론) 및 성장 호르몬(Growth hormone) 양은 ELISA 법을 이용하여 각각 rat estradiol Elisa kit(Uscn Life Science & Technology Co., Beijing, China), rat testosterone Elisa kit (R&D system Inc., Minneapolis, MN, USA) 및 rat growth hormone Elisa kit(Uscn Life Science & Technology Co.)로 측정하였다.

에스트라디올

혈장내 에스트라디올 수준은 난소 절제 시술 이후 감소하였으나(Sham; 92.7 ng/ml vs OVX; 88.5 ng/ml) 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물의 처치 시 에스트라디올 수준이 Sham 군보다 더 높아졌다(각각 97.0 ng/ml 및 97.9 ng/ml). 그러므로 효모 가수분해물은 에스트라디올 분비를 촉진하는 것으로 보인다(도 4 좌측 상단).

테스토스테론

혈장내 테스토스테론 수준은 난소 절제 시술 이후 감소하였으나 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물의 처치 시 Sham 군보다 더 높아졌는바, 효모 가수분해물은 테스토스테론 분비를 촉진하는 것으로 보인다(도 4 우측 상단). 에스트론겐의 활성을 갖는 물질을 투여시 테스토스테론 감소가 억제되는 것으로 보고되고 있는데, 도 4에서 알 수 있듯이 복합 에스트로겐을 투여한 군인 OVX-E는 테스토스테론의 감소가 억제되는 것으로 확인되었으며 Sham 군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 한편 효모 가수분해물 투여군에서는 테스토스테론이 유의적으로 증가하였다.

성장 호르몬

혈장 내 성장 호르몬 수준 역시 성호르몬들과 마찬가지로 난소 절제 후 감소하였으나 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물(Ystrogen) 처치 후 Sham 군 수준을 회복하였다(도 4 좌측 하단).

<실시예 5> 효모 가수분해물이 골 대사에 미치는 영향

<실험예 1> 골대사 지표 측정

본 발명에서는 골형성 지표로 혈장 alkaline phosphatase(ALP), 칼슘 및 오스테오칼신을 측정하였으며, 골흡수 지표로는 cross-linked telopeptide of type 1 collagen (CTx)를 측정하였다. 혈장 alkaline phosphatase(ALP)와 칼슘은 FUJI DRI-CHEM 3500 로 측정하였으며 오스테오칼신은 rat osteocalcin Elisa kit (Uscn Life Science & Technology Co.)로 측정하였다. 또한 골흡수 지표인 cross-linked telopeptide of type 1 collagen (CTx)는 rat cross-linked C-teminal telopeptide of type 1 collagen Elisa kit (Uscn Life Science & Technology Co.)를 이용하여 ELISA 법으로 측정하였다.

ALP

골대사 지표란 혈액이나 뇨를 이용하여 골대사 동태의 기본인 골형성능 또는 골흡수능을 평가하는 지표를 총칭한다. ALP 는 골아세포에서 분비되는 효소로 임상에서 가장 흔히 이용되는 골형성 지표 중 하나이며, 골다공증, 골연화증 등 골대사 이상에서 증가하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는, 난소 절제로 인하여 ALP 수준이 증가된 것이 확인되었으며(OVX; 301.7 U/l) 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물의 투여 시 ALP 수준이 감소하는 것으로 확인되었다(각각 280.3 U/L 및 273.1 U/L)(도 5 좌측 상단).

칼슘

난소 절제 후 혈중 칼슘이 감소되었으며, 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물 투여 시 칼슘 수준이 증가하였다. 그러나 혈중 칼슘의 변화량 자체는 통계적으로 유의한 수준은 아니었다(도 5 우측 상단).

오스테오칼신

오스테오칼신은 뼈에서 콜라겐 다음으로 많은 단백질로, 칼슘 결합부위로서 사용되는 vitamin K-dependent γ-carboxyglutamic acid (Gla)잔기를 가진 것으로 보아 골무기질화에 관여할 것으로 추측된다. 오스테오칼신은 골아세포에서 형성된 후에 골기질속에 침착되며 새로이 형성되는 오스테오칼신의 일부는 혈액 내로 방출되므로 혈중 농도를 측정하면 골형성 정도를 알 수 있으며, ALP 와 마찬가지로 골대사 이상시 증가하는 특성이 있다.

본 실험에서는 난소 절제 시술이나 복합 에스트로겐 처치는 혈중 오스테오칼신의 수준에 영향을 거의 미치지 않은 것으로 나타났다. 효모 가수분해물 처치군은 난소 절제군(OVX) 및 복합 에스트로겐 처치군에 비하여 혈중 오스테오칼신이 감소하였으나 유의한 수준은 아니었다(OVX; 83.0 ng/ml, OVX+E; 84.1 ng/ml, OVX+Yst; 77.5 ng/ml) (도 5 좌측 하단).

CTx

골흡수 중 콜라겐 분자의 말단 부분이 파골 세포에 의해 분해되어 생성되는 물질 중 하나인 CTx 는 골흡수에 특이성과 감수성이 높은 지표로 알려져 있다. Ctx는 난소 절제 시 증가하였으나(Sham; 30.0 ng/ml vs. OVX; 33.2 ng/ml). 복합 에스트로겐과 효모 가수분해물을 투약시, 난소 절제 이전 수준으로 감소하는 것이 확인되었다(OVX+E; 29.6 ng/ml, OVX+Yst; 29.5ng/ml)(도 5 우측 하단).

<실험예 2> 골조직 형태 측정

희생시킨 쥐들의 대퇴골의 Ward’s triangle 부위를 micro-CT(Skyscan1072, SKYSCAN, Antwerpen, Belgium)로 촬영하였다. 촬영 관전압은 80 kVp, 관전류는 100 μA였으며, 1 mm 알루미늄 여과(filtration)를 이용하였다. 촬영시간은 3,400 ms 이었으며, 23.75 의 확대율로 화소 크기(pixel size)는 11.51 μm 였다. 절단면에 부착된 acrylic tap 을 이용하여 관심용적(volume of interest,VOI)을 설정하였으며, 그 크기는 3 × 3 × 5 mm3 이었다. 개개의 영상에서 골소주와 골수강을 분리하기 위하여 역치값(threshold value)을 150으로 고정하고 3 차원 영상을 재구성하였으며, Micro-CT 로 촬영된 영상들로부터 SkyscanTM CT-analyzer software를 사용하여 골 미세 구조 지표들을 분석하였다. 본 발명에서 이용 분석된 지표들은 골량(BV/TV, cancellous bone volume), 골소주의 평균 수(trabecular number(Tb.N)) 및 골소주 간극(trabecular separation(Tb.Sp))이었다.

골소주 간극

골소주 사이의 평균 거리를 마이크로미터로 표시한 골소주 간극(trabecular separation, Tb.Sp)은 그 수치가 낮을수록 형태학적으로 좋다. 난소 절제 시 골소주 간극이 상승하였으나(OVX; 82.3 μm), 복합 에스트로겐 및 효모 가수분해물을 처리하자 골소주 간극이 감소하였다(각각 77.4 μm 및 77.0 μm). (도 6의 좌측 상단).

골량( Trabecular bone volume fraction )

골부피에 대한 골표면적의 비율(cancellous bone volume, BV/TV)은 골소주를 포함한 전체 골수 면적에서 해면골이 차지하는 퍼센트를 의미하는데 난소 절제로 인하여 약간 감소하였으며(Sham; 57.4 μm vs OVX; 54.0 μm), 복합 에스트로겐 처치로 인해 다소 증가되는 경향을 나타내었으나, 효모 가수분해물의 처리 시 변화가 없었다. 그러나 이러한 BV/TV가 난소 절제 및 복합 에스트로겐 등의 처리에 의하여 통계적으로 유의한 수준으로 변화한 것은 아니었다(도 6의 우측 상단).

골소주의 평균 수

골소주의 평균수(trabecular number, Tb.N)는 난소 절제로 감소하였으며, 복합 에스트로겐의 처치 후 골소주의 평균 수가 약간 증가하였으나 유의한 수준은 아니었다. 그러나 효모 가수분해물을 처리하는 경우 난소 절제군인 OVX 군에 비하여 골소주의 평균 수가 유의적으로 증가하는 것이 확인되었다(p<0.05)(도 6의 좌측 하단).

상기 결과들을 종합하여 볼 때, 효모 가수분해물(Ystrogen)은 골소주의 평균수를 증가시키고 골소주 간극을 감소시키며, 골조직을 향상시키는 경향을 나타내었다.

<실시예 6> 뇌조직 분석

적출한 SD 래트의 뇌를 4% paraformaldehyde-lysine-periodate 고정액에 넣고 4 ℃에서 1 시간 동안 후고정을 실시하였다. 그 후 0.1 M sodium phosphate buffer(PB)로 4 ℃에서 1 시간 동안 수세하고 이어서 20 % phosphate buffered sucrose 용액에 12 내지 48 시간 동안 담가 동결보호를 하였다. 동결보호가 끝난 뇌간조직은 동결박절기를 이용하여 약 40 μm 두께의 관상연속 절편을 만들어, hematoxylin & eosin 염색(H&E) 또는 free floating 방법으로 면역조직화학 염색을 시행하였다. 조직 내의 IgG 를 차폐시킴으로써 2 차 항체의 1 차 항체에 대한 특이성을 향상시킬 목적으로, 1:700으로 희석된 donkey anti-rat IgG(Jackson Immunoresearch Lab Inc., PA, USA)를 0.1M PB 에 1% normal goat serum(Vectastatin) + 0.3% Triton X-100(Sigma from Sigma Chemical Co. MO, USA)이 섞인 용액(PBGT)에 실온에서 한 시간 처리한 후 0.1M PB 에 15 분간 2 회 수세하였다. 1 차 항체인 ChAT(monoclonal rat anti-ChAT, Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany)를 0.1M PB 에 2 mg으로 희석한 다음 이를 PBGT 에 1:10으로 다시 희석하였다. 여기에 조직을 담가 4℃에서 12-24 시간 동안 반응시킨 후 실온에서 0.1M PB 에 같은 방법으로 수세한 다음 2 차 항체인 1:100 으로 희석된 biotinylated donkeyanti-rat IgG 에 실온에서 한 시간 반 가량 반응시켰다. 다시 같은 방법의 수세과정을 거친 후 실온에서 한 시간 가량 peroxidase 가 표지된 ABC 용액에 담가 반응시켰다. 그 후 다시 0.1M PB 로 수세한 후 3-3’-diaminobenzidine 50 mg와 nickel chloride 250 mg를 0.1M PB 50 ml 에 녹인 기질 용액에서 5 분간 반응시킨 후 H₂O₂ 20 μl를 첨가하여 검청색의 착색반응을 약 5 분간 시행한 뒤 0.1M PB 로 여러 차례 수세하고, 조직절편들을 gelatin 이 입혀진 슬라이드 위에 얹어 4℃에서 48 시간 이상 건조시켰다. 통상적인 방법에 따라 에탄올과 xylene 탈수 및 투명화를 거친 후 커버 글라스를 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과는 도 7과 같다. 뇌조직의 병리학적 관찰 결과(도 7), 난소 절제, 복합 에스트로겐 투여 및 효모 가수분해물 투여에 의한 조직학적 낭성 병변은 관찰되지 않았다(도 7의 A:Sham 군, B:OVX 군, C: OVX+E 군, D:OVX+Yst 군).

<실시예 7> 효모 가수분해물의 제조

<실험예 1> 효모 피신 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 피신(Ficin) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10k 와 30k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

<실험예 2> 효모 파파인 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 파파인(Papain) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10k 와 30k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

<실험예 3> 효모 프로테아제-A 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 프로테아제-A(Protease-A) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10k 와 30k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

<실험예 4> 효모 플라보자임 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 플라보자임(Flavourzym) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10k 와 30k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

<실험예 5> 효모 프로타맥스 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 프로타맥스(Protamax) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10k 와 30k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

<실험예 6> 효모 뉴트레이즈 가수분해물의 제조

효모(Saccharomyces cerevisiae IFO 2346)을 당밀 2%, (NH₄)₂SO₄ 0.6%, MgSO₄·7H₂O 0.1%,KH₂PO₄ 0.2%, K₂HPO₄ 0.03%, NaCl 0.1%를 함유한 배지에서 30 ℃에서 3 일간 배양하였다. 배양하여 얻은 균체를 20 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 뉴트레이즈(Neutrase) 1,000 units 를 가하여 효모 가수분해물을 30 ℃에서 4 시간 동안 원심분리한다. 그 후, 상등액을 회수하고 Hydrosart membrane 10 k 와 30 k(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 분자량이 10 k ~ 30 kKDa인 펩타이드를 분리 및 건조한다.

본 발명의 효모 가수분해물을 포함하는 조성물은 폐경, 난소의 기능 저하, 성호르몬 감소 등으로 인한 갱년기 또는 폐경기 장애를 예방 또는 개선하는데 효과가 있으며, 인체에 무해한바 갱년기 장애의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 것이다.

Claims

효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물.
효모(Saccharomyces cerevisiae) 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 효모 가수분해물은 효모에 단백질 분해효소를 가하여 가수분해시킨 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 단백질 분해효소는 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 파파인(Papain), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 뉴트레이즈(Neutrase) 또는 프로테아제-A(Protease-A)인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 갱년기 또는 폐경기 장애는 안면홍조, 가슴 두근거림, 요실금, 배뇨곤란, 오줌 소태, 재발성 비뇨기계 염증, 골다공증 및 발한으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물.
효모(Saccharomyces cerevisiae)를 가수분해하는 단계를 포함하는, 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법.
효모(Saccharomyces cerevisiae)를 가수분해하는 단계를 포함하는, 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 약학적 조성물의 제조방법.
제 6항에 있어서,
효모를 단백질 분해효소로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법.
제 8항에 있어서,
상기 단백질 분해효소는 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 파파인(Papain), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 뉴트레이즈(Neutrase) 또는 프로테아제-A(Protease-A)인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법.
제 6항에 있어서,
상기 갱년기 또는 폐경기 장애는 안면홍조, 가슴 두근거림, 요실금, 배뇨곤란, 오줌 소태, 재발성 비뇨기계 염증, 골다공증 및 발한으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 갱년기 또는 폐경기 장애의 예방 및 개선용 식품 조성물의 제조방법.