WO2014168253A1 - 白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤 - Google Patents

白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤 Download PDF

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lactoferrin
formation
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amino acid
acid sequence
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淳一 平橋
泰照 浦野
光修 大久保
真子 神谷
伸治 加賀谷
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国立大学法人東京大学
株式会社Ｎｒｌファーマ
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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a leukocyte extracellular trap formation inhibitor containing lactoferrin as an active ingredient and a composition for treating diseases related to leukocyte extracellular trap formation.
  • the present invention also relates to a method for treating a disease associated with the formation of an extracellular trap of blood cells using the inhibitor or composition.
  • NETs neutrophil extracellular traps
  • neutrophils are activated by bacterial infection, the morphology of the lobular nucleus and the distribution of chromatin become unknown, and then the nuclear membrane disappears, resulting in a chromatin structure
  • NETs center on DNA, and histone 3 (H3) and elastase play an important role in its action. NETs formation will locally collect antimicrobial molecules that effectively kill microorganisms.
  • Non-patent document 2 proteins from neutrophils, in particular antibacterial proteins contained in azurophilic granules and second granules, are secreted by degranulation, and proteins related to cell structures are also secreted. These proteins are also called NETs constituent proteins, and are neutrophil elastase, histone, myeloperoxidase, F-actin, lactoferrin, matrix metalloprotease 9, LL37, cathepsin G, BPI, proteinase 3, calprotectin, azulocidin, lysozyme C, Defensins, catalases and the like have been reported (Non-patent Document 3).
  • Lactoferrin is contained in the second granule of neutrophils, and neutrophils form NETs, eventually degranulate and released to the surroundings (Non-patent Reference 1). Lactoferrin is well conserved in mammals, and there are few species differences in its function. At present, its physiological activity has attracted attention as a protein of milk components and is commercially available. However, it has been reported that milk does not show an inhibitory effect on NET formation of bovine neutrophils (Non-patent Document 4).
  • NETs are also involved in thrombus growth / growth.
  • histones contained therein condense platelets, and platelet thrombi are formed based on NETs.
  • neutrophil elastase and cathepsin G contained in NETs degrade the tissue factor pathway inhibitory factor and promote blood coagulation reaction. The role which keeps microorganisms etc. locally by the effect
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • Non-patent Documents 6 and 7 It is known that antibacterial peptide LL37 and DNA in NETs exist in the serum of SLE patients (Non-patent Documents 6 and 7). These are recognized as autoantigens by B cells and autoantibodies are produced. In addition, neutrophils of SLE patients are more likely to cause NETosis than neutrophils of healthy individuals (Non-patent Document 6). These factors are believed to induce chronic inflammation. Also in anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) -related vasculitis as a disease caused by autoantibodies, the IgG fraction in the patient's serum has about twice the ability of neutrophils to form NETs than the IgG fraction of healthy individuals Have been reported (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • ANCA anti-neutrophil cytoplasmic antibody
  • Non-Patent Document 1 The relationship between NETs formation and diseases has been noticed recently since the report by Brinkman et al. (Non-Patent Document 1) in 2004, and new diseases caused by NETs formation in the future. Will be revealed. As described above, NETs formation plays an important role in defense against infection in living organisms, but depending on the pathological condition, it may be necessary to inhibit NETs formation to improve the pathological condition.
  • Non-Patent Document 10 myeloperoxidase activity affects netosis (Non-patent Document 11), and the phenomenon that neutrophils form NETs and die, that is, netosis, is a process different from apoptosis and necrosis ( Non-Patent Document 10) is known.
  • Patent Document 1 There is a prior art of preventing autoimmune diseases of type I diabetes and rheumatoid arthritis using a basic protein fraction derived from milk as an active ingredient (Patent Document 1), but regulation of immune cells and inflammatory properties centering on lymphocytes This content is specialized for cytokine suppression and is not related to NETs formation inhibitory action. So far, no drug has been reported to treat diseases caused by NETs formation.
  • An object of the present invention is to provide a fundamental therapeutic agent for diseases caused by the formation of extracellular traps of leukocytes, in particular, a safe and effective therapeutic agent and a therapeutic method suitable for long-term remission maintenance (relapse suppression). That is.
  • lactoferrin exhibits a remarkable effect of suppressing the formation of NETs and can fundamentally treat NETs-related diseases. It was also found that the survival rate was significantly improved in ANCA-related vasculitis model animals, local Schwarzman reaction model animals, and disseminated intravascular coagulation (DIC) model animals with NETs-forming diseases.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • a leukocyte extracellular trap formation inhibitor comprising lactoferrin.
  • the inhibitor according to [1], wherein the lactoferrin is prepared so as to have an amount of 0.001 to 10 g / kg / day.
  • the inhibitor according to [1], wherein the lactoferrin is derived from a human.
  • the inhibitor according to [1], wherein the lactoferrin is a protein according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • A a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5;
  • B The amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 comprises an amino acid sequence in which 1 to 66 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and forms an extracellular trap of leukocytes.
  • a protein having an inhibitory activity (C) a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 and having an activity of inhibiting formation of an extracellular trap of leukocytes [5 Any one of the above [1] to [5], wherein the white blood cell is any one selected from the group consisting of neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, macrophages and mast cells. The inhibitor according to one. [6] The inhibitor according to [5], wherein the leukocytes are neutrophils. [7] A composition for treating a disease associated with extracellular trap formation of leukocytes, comprising lactoferrin.
  • composition according to [7], wherein the lactoferrin is prepared so as to have an amount of 0.001 to 10 g / kg / day.
  • the composition according to [7], wherein the lactoferrin is derived from a human.
  • the composition according to [7], wherein the lactoferrin is the protein according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • A a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5;
  • B The amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 comprises an amino acid sequence in which 1 to 66 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and forms an extracellular trap of leukocytes.
  • a protein having an inhibitory activity (C) a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 and having an activity of inhibiting extracellular trap formation of leukocytes [11 Any one of the above [7] to [10], wherein the leukocyte is any one selected from the group consisting of neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, macrophages and mast cells.
  • the leukocyte is any one selected from the group consisting of neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, macrophages and mast cells.
  • the disease is any one selected from the group consisting of ANCA-related vasculitis, systemic lupus erythematosus, local Schwarzmann reaction, acute kidney injury with ischemia-reperfusion injury (AKI), and disseminated intravascular coagulation.
  • the composition according to any one of [7] to [11], wherein [13] The composition according to any one of [7] to [12], which is in the form of food.
  • the composition according to any one of [7] to [12] which is in the form of an injection.
  • the composition according to any one of [7] to [13] which is administered orally.
  • a method for inhibiting extracellular trap formation of leukocytes comprising administering lactoferrin to a patient.
  • a method for treating a disease associated with formation of an extracellular trap of leukocytes comprising administering lactoferrin to a patient.
  • the present invention can provide a treatment method with few side effects for diseases caused by the formation of extracellular traps of leukocytes. Moreover, since there are few side effects, it has the advantage that it can be used safely in a wide range of patients and patient reserves.
  • the inhibitor and composition of the present invention can be widely used in a wide range of subjects such as elderly people, subjects with reduced immunity such as cancer-bearing patients, cases of complications of infectious diseases, subjects with a history of tuberculosis and the like.
  • a therapeutic agent and a therapeutic method for diseases associated with the formation of leukocyte extracellular traps that have few side effects even when used for a long period of time.
  • it is useful as a relapse inhibitor for a subject after acute phase symptoms have been ameliorated, and as a therapeutic agent when the disease becomes chronic.
  • the present invention provides, as a first aspect, a leukocyte extracellular trap formation inhibitor (hereinafter referred to as “inhibitor of the present invention”) containing lactoferrin.
  • Extracellular traps have been reported to be formed by various leukocytes, such as neutrophils (Brinkmann, V., et al., Science 2004; 303: 1532-1535.), Basophils (Yosefi).
  • the inhibitor of the present invention can condense and / or condense the fiber component, thereby suppressing the release of the fiber component (see FIG. 1-E). Therefore, when the inhibitor of the present invention is used, it is released not only from the neutrophils used in the Examples but also from other leukocytes (for example, basophils, mast cells, monocytes (for example, macrophages) during extracellular trap formation. It can be seen that the fiber components also condense and / or condense, thereby inhibiting the extracellular trap formation of these leukocytes.
  • leukocytes for example, basophils, mast cells, monocytes (for example, macrophages)
  • lactoferrin which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention, is not particularly limited as long as it is derived from mammalian milk. More preferably, it is derived from human milk. Alternatively, lactoferrin may be derived from the neutrophil of the mammal. The amino acid sequences of lactoferrin derived from various mammals are known (see Table 1 below).
  • the lactoferrin used for the inhibitor of the present invention is the protein according to any one selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • A a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5;
  • B The amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 comprises an amino acid sequence in which 1 to 66 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and forms an extracellular trap of leukocytes.
  • the protein described in the above (b) or (c) is typically a naturally occurring variant of any one of the polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 5, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 66 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added examples of the protein having an activity to inhibit trap formation include, for example, 1 to 66, 1 to 65, 1 to 60, 1 to 55 in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • Examples thereof include a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more and having an activity of inhibiting extracellular trap formation of leukocytes. In general, the larger the sequence identity value, the better.
  • leukocytes are derived from organisms forming leukocyte extracellular traps, preferably derived from vertebrates, more preferably It is derived from a mammal. Examples of mammals include humans, cows, horses, goats, sheep, dogs and cats, and more preferably humans.
  • the leukocyte is derived from the above, and is preferably any one selected from the group consisting of neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, macrophages and mast cells. More preferably, it is any one selected from the group consisting of neutrophils, basophils, monocytes, macrophages and mast cells, and more preferably neutrophils.
  • the leukocytes are preferably treated with an extracellular trap formation promoter (paramethoxyamphetamine (PMA), lipopolysaccharide (LPS), etc.) before adding lactoferrin.
  • PMA paramethoxyamphetamine
  • LPS lipopolysaccharide
  • the activity of inhibiting leukocyte extracellular trap formation can be confirmed by collecting the culture supernatant of the above culture system and measuring the DNA concentration in the supernatant.
  • a DNA concentration is mainly due to the DNA released into the culture supernatant when the extracellular trap is formed.
  • the DNA concentration in the supernatant is reduced as compared with the condition in the absence of lactoferrin.
  • the leukocytes are preferably treated with an extracellular trap formation promoter (paramethoxyamphetamine (PMA), lipopolysaccharide (LPS, etc.) before the addition of lactoferrin.
  • the concentration of DNA can be easily measured using a commercially available kit (Picogreen dsDNA assay reagent (P11896 Invitrogen)).
  • Basophils Yosefi, S., et al., Nat Med 2008; 14: 949-953.
  • Mast cells von Kockritz-Brickweed M, et al., Blood 2008; 111: 3070-3080.
  • Monocytes Webster SJ, et al., J Immunol 2010; 185: 2968-2979: for example, macrophages (Chow, OA, et al., Cell Host & Microbe, Volume 8, Issue 5, 445). 454, 18 November 2010)).
  • amino acid sequence of the protein of the present invention one or more (for example, 2 to 9) amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added are any and one or more amino acids in the same sequence.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • lactoferrin used in the present invention may be modified with a compound.
  • lactoferrin may be modified protein (Patent No. 4195486, Patent No. 4261531, International Publication No. WO2009 / 113743), another protein or a fragment thereof (for example, blood stable protein IgG, albumin or It may be a fusion protein (Japanese Patent Application No. 2012-98085) in which a fragment thereof is fused.
  • treatment method of the present invention it is possible to effectively inhibit formation of leukocyte extracellular traps. That is, by using the inhibitor of the present invention, a disease associated with the formation of leukocyte extracellular trap can be treated (hereinafter referred to as “the treatment method of the present invention”).
  • treatment generally means ameliorating the symptoms of humans and non-human mammals.
  • improvement refers to, for example, a case where the degree of the disease is reduced or not worsened compared to the case where lactoferrin is not administered, and also includes the meaning of prevention.
  • the treatment target is an organism suffering from or at risk of suffering from a disease associated with extracellular trap formation of leukocytes, preferably a vertebrate, and more preferably a mammal.
  • mammals include mammals selected from the group consisting of humans, cows, horses, goats, sheep, dogs and cats, more preferably humans.
  • the “disease related to the formation of leukocyte extracellular trap” is not particularly limited as long as an increase in leukocyte extracellular trap formation is observed in the patient.
  • Such diseases include, for example, ANCA-related vasculitis (Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, etc.), acute kidney injury (AKI) with ischemia-reperfusion injury, systemic Systemic lupus erythematosus (SLE), appendicitis, aspergillus infection, pneumonia, pneumococcal infection, necrotizing fasciitis, streptococcal infection, sepsis, preeclampsia, Crohn's disease, schistosomiasis, periodontitis, tuberculosis, breast Inflammation, malaria, cystic fibrosis, and deep vein thrombosis (von Bruhl, ML, et al., J Exp Med.
  • ANCA-related vasculitis Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, etc.
  • Vasculitis syndrome is classified into large vasculitis, medium vasculitis, and small vasculitis depending on the size of the developing blood vessel.
  • NETs-related diseases such as the above-mentioned ANCA-related vasculitis and SLE are classified as small vasculitis, but the severity of nodular polyarteritis, which is medium-sized vasculitis (Guidelines for the diagnosis and treatment of cardiovascular disease (2006-2006) The 2007 Joint Research Group report)), septicemia, and solid cancers are frequently combined with DIC.
  • cytotoxicity due to the formation of extracellular traps (eg NETs) of leukocytes results in vascular endothelial damage, thus resulting in organ dysfunction.
  • extracellular traps for example, NETs
  • Lactoferrin prevents vascular endothelial damage by inhibiting the formation and release / diffusion of leukocyte extracellular traps (for example, NETs), and further shows an organ protective effect by inhibiting the cascade of thrombus formation. It is thought that there is a therapeutic effect.
  • leukocyte extracellular traps for example, NETs
  • the disease targeted by the treatment method of the present invention is ANCA-related vasculitis (Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, etc.) systemic lupus erythematosus, local Schwartzman reaction and false Acute kidney injury (AKI) with blood reperfusion injury, more preferably, microscopic polyangiitis with an increase in blood MPO-ANCA (myeloperoxidase specific anti-neutrophic cytoplasmic antibody) antibody titer, allergic granulomatous Vasculitis or disseminated intravascular coagulation (DIC).
  • ANCA-related vasculitis Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, etc.
  • ANCA-related vasculitis Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, etc
  • lactoferrin is used to treat autoimmune diseases of type I diabetes and rheumatoid arthritis (Patent Document 1).
  • autoimmune diseases such as type I diabetes and rheumatoid arthritis
  • extracellular traps of leukocytes are reported. Since the formation of is not considered as the main etiology, it can be said that in the treatment according to the report, lactoferrin is likely to act without the formation of extracellular traps. That is, in the present invention, lactoferrin exhibits a therapeutic action against the above-mentioned diseases by a completely new mechanism, that is, a mechanism that inhibits the formation of leukocyte extracellular traps.
  • Steroids and immunosuppressants are used for treatment of SLE treatment and diseases caused by ANCA, but these treatment methods involve physical burden on the patient (side effects, etc.) and cause pain and other diseases. There is a problem that the risk of inducing (infection) is high. On the other hand, in the present invention, since lactoferrin contained in food is used as an active ingredient, there are advantages that there are few side effects, no pain is imposed on the patient, and there is less risk of inducing other diseases.
  • composition of the present invention provides a composition for treating a disease associated with the formation of leukocyte extracellular trap (hereinafter, “composition of the present invention”), which contains lactoferrin.
  • composition means one containing an additive such as a carrier used in the preparation of an active ingredient (such as lactoferrin) useful in the present invention.
  • lactoferrin and “disease associated with extracellular trap formation of leukocytes” are as described above.
  • the administration route of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a generally adopted route. Specific examples include oral, sublingual, nasal, transpulmonary, transdigestive tract, and transdermal. , Ophthalmic injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, local injection, and surgical implantation, preferably oral administration and intravenous administration.
  • the composition of the present invention may be a solid agent such as a capsule, a tablet or a powder, or a liquid agent such as a solution, suspension or emulsion, or a semi-liquid preparation such as an ointment, cream or paste.
  • the composition is preferably a solid preparation.
  • it is a solid or liquid including a freeze-drying method.
  • the composition of the present invention is prepared as an enteric preparation for oral administration.
  • Oral ingested lactoferrin is known to be susceptible to pepsin digestion in the stomach, and can be increased in the body transfer rate by using an enteric preparation (Takeuchi et al., Exp Physiol. 2006). Nov; 91 (6): 1033-40.).
  • lactoferrin is unstable to heat when moisture is present, it is desirable to compress the lactoferrin powder in a dry state and coat it with an enteric coating material (NRL formulation patent document: granule patent No. 4050784). , Tablet Patent No. 4592041).
  • Lactoferrin can be added to foods and feeds and consumed by humans or non-human target animals as foods or feeds. Such food or feed production methods are also known to those skilled in the art. In addition, it can be formulated as an injection as a solution formulation. Furthermore, these lactoferrin and lactoferrin degradation products may be added as they are or after they are formulated into nutrients, foods and drinks, and the like.
  • Lactoferrin may be used alone or formulated with other pharmacologically acceptable ingredients.
  • a composition for oral administration such as powder, granule, tablet, capsule, etc.
  • it is formulated by a conventional method using starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts, etc.
  • a coating agent, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a colorant, a fragrance, and the like can be appropriately used for this type of composition. .
  • the composition of the present invention may contain a therapeutically effective amount of the active ingredient lactoferrin.
  • the “therapeutically effective amount” means that the amount of the active ingredient is administered to the subject, thereby reducing the symptoms of the disease associated with the formation of leukocyte extracellular traps compared to when lactoferrin is not administered. It refers to an amount that does not worsen and includes the meaning of an effective amount in prevention.
  • the therapeutically effective amount is 0.001-10 g / kg / day, 0.005-10 g / kg / day, 0.01-10 g / kg / day, 0.01-5 g / kg. / Day.
  • the therapeutically effective amount is generally 10 mg to 15,000 mg, 10 mg to 12,000 mg, 10 mg to 10,000 mg, 20 mg to 10,000 mg, 20 mg to 8,000 mg per day, The amounts are 30 mg to 8,000 mg and 30 mg to 6,000 mg.
  • Such daily doses can be administered once or in portions to patients in need of treatment for diseases associated with extracellular trap formation of leukocytes.
  • the dose and frequency of administration of the composition of the present invention vary depending on various factors such as the subject's species, body weight, sex, age, tumor disease progression, and administration route, but doctors, veterinarians, A person skilled in the art such as a dentist or a pharmacist can determine the dose in consideration of each factor.
  • the above-mentioned therapeutically effective amount, dosage and administration frequency list typical numerical values, and it is fully conceivable that even if a numerical value exceeding or below this value is effective for treatment. Therefore, numerical values exceeding or below the therapeutically effective amount, dosage and administration frequency are also included as the therapeutically effective amount, dosage and administration frequency of the composition of the present invention.
  • Example 1 Inhibitory effect of stimulation of NETs formation on peripheral blood neutrophils of healthy subjects by pretreatment with lactoferrin 1.
  • Isolation method of human neutrophils 15 to 20 ml of peripheral blood was collected from a healthy person for one experiment with an EDTA-containing syringe (needle 18 to 22G). After blood collection, in a 15 ml conical tube containing 3 ml of Mono-Poly Resolving Medium (CatNo. DSBN100, DS Pharma Biochemical Co., Ltd.), gently lay down the lower Mono-Poly Resolving Medium and 3.5 ml of whole blood. Layer.
  • Mono-Poly Resolving Medium CatNo. DSBN100, DS Pharma Biochemical Co., Ltd.
  • a 15 ml conical tube is centrifuged at 400 ⁇ g for 20 minutes in a swinging centrifuge at room temperature (15 to 30 ° C.), and the conical tube is gently taken out. Remove the uppermost brown plasma layer and the lymphocyte / monocyte layer immediately below it with an aspirator. Also, remove the transparent layer below the lymphocyte / monocyte layer as much as possible.
  • a thin pink layer under the clear layer is removed with a Pasteur pipette and phosphate buffered saline (PBS (-); sodium chloride 137 mM, potassium chloride 2.7 mM, hydrogen phosphate to wash neutrophils) Transfer to a test tube containing disodium dodecahydrate 8.1 mM, potassium dihydrogen phosphate 1.47 mM).
  • the test tube containing the neutrophil is centrifuged at 200 ⁇ g for 10 minutes at room temperature (15 to 30 ° C.). Remove the test tube and discard the supernatant. Add 4 ° C sterilized water to the neutrophil in the test tube and leave it on ice for 30 seconds to hemolyze the mixed red blood cells.
  • neutrophil pretreatment method NETs formation inhibition
  • Netosis Netosis induction method [Example 1] described in “1.
  • neutrophils were pretreated. Neutrophils on 8 well- ⁇ slides (Cat. No. ib 80826 Ibidi®) in approximately 400 ⁇ l medium DMEM + 2% human serum Alb (Serum human albumin; Product No. A9080 Sigma + 4 mM L-glutamine)
  • the cells were seeded at 10 5 cells / well, each drug (i) to (v) was added, and a pretreatment was performed at room temperature for 30 minutes.
  • Bovine lactoferrin (bovine lactoferrin, Product No 1233-04124 Lot; KWG6332 WAKO (registered trademark)) (stock; 100 mg / ml) diluted 1/500, 1/5000, 1 / 50,000 times to a final concentration of 200 ⁇ g / ml 20 ⁇ g / ml, 2 ⁇ g / ml, (ii) human lactoferrin (stock; 100 mg / ml, 200 ⁇ l; Cat. No.
  • SIGL6793, SIGMA diluted 1/500, 1/5000, 1 / 50,000 times to a final concentration of 200 ⁇ g / ml ml, 20 ⁇ g / ml, 2 ⁇ g / ml,
  • DPI stock 25 mM, Product No. D2926 Sigma; package insert solvent is DMSO) 1/2500 diluted to a final concentration of 10 ⁇ M
  • Defero Amine Product No.
  • the lifetime of neutrophils in blood is 10 to 12 hours, so the observation of NETs also reaches a peak in 4 to 5 hours, and reaches a plateau after 6 hours.
  • unstimulated NETs formation is 1/8 to 1/7 less than PMA stimulation. Prior to PMA stimulation, when each treatment of “ 2.
  • Neutrophil pretreatment (NETs formation inhibition) and Netosis (NETs formation) induction method ” was performed, bovine lactoferrin and human neutrophils compared to those stimulated with PMA alone
  • NETs formation inhibition a concentration of 2 ⁇ g / ml and 20 ⁇ g / ml
  • SIGMA model number SIGL6793 sphere-derived lactoferrin
  • the ratio of NETs when the plateau was reached was halved
  • the formation of NETs was suppressed to 1/4 for 200 ⁇ g / ml [Fig. 1-A, B].
  • NETs formation was suppressed to 1/3 for DPI, but NETs formation was not suppressed for Deferoxamine and Trientine.
  • Scanning electron microscope observation method is as follows: 1 ⁇ 10 6 eosinophils were added to cell culture cover glass or glass bottom dish, 200 ⁇ g / ml human lactoferrin was added, and NETs were stimulated after pretreatment without addition, and 3 hours later.
  • a 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 2% glutaraldehyde was prefixed at 4 ° C. for 1 hour.
  • the sample is washed with 60%, 70%, 80%, and 95% ethanol while gently shaking for 5 to 10 minutes, and immersed in 100% ethanol for 5 to 10 minutes twice to perform dehydration. Substitute with isoamyl acetate for 10-15 minutes and perform critical point drying.
  • the sample was coated with a sublimated osmium tetroxide layer using an osmium plasma coating machine (OPC80N, Philgen Corporation) and observed with a scanning electron microscope (JSM-6320F, JEOL Ltd.). Unstimulated neutrophils were spherical and no extracellular fibers were observed, but cells collapsed and many fiber components were formed by PMA stimulation. On the other hand, in the neutrophils to which lactoferrin was administered, this fiber component was seen in a bundle, and lactoferrin condensed NETs fibers [FIG. 1-D].
  • Method for measuring DNA concentration in culture supernatant The culture supernatant is recovered, centrifuged at 200 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is transferred to a new microcentrifuge tube. The amount of DNA was measured using a Picogreen dsDNA assay reagent (P11896 Invitrogen) according to the accompanying protocol. When human lactoferrin was pretreated, the DNA concentration in the culture supernatant decreased in a concentration-dependent manner, and the release of DNA by NETs was suppressed [FIG. 1-D].
  • Example 2 Inhibitory effect by lactoferrin after stimulation of NETs formation in peripheral blood neutrophils of healthy volunteers 1.
  • Isolation method of human neutrophils 15 to 20 ml of peripheral blood was collected from a healthy person for one experiment with an EDTA-containing syringe (needle 18 to 22G). After blood collection, in a 15 ml conical tube containing 3 ml of Mono-Poly Resolving Medium (CatNo. DSBN100, DS Pharma Biochemical Co., Ltd.), gently lay down the lower Mono-Poly Resolving Medium and 3.5 ml of whole blood. Layer.
  • Mono-Poly Resolving Medium CatNo. DSBN100, DS Pharma Biochemical Co., Ltd.
  • a 15 ml conical tube is centrifuged at 400 ⁇ g for 20 minutes in a swinging centrifuge at room temperature (15 to 30 ° C.), and the conical tube is gently taken out. Remove the uppermost brown plasma layer and the lymphocyte / monocyte layer immediately below it with an aspirator. Also, remove the transparent layer below the lymphocyte / monocyte layer as much as possible.
  • a thin pink layer under the clear layer is removed with a Pasteur pipette and phosphate buffered saline (PBS (-); sodium chloride 137 mM, potassium chloride 2.7 mM, hydrogen phosphate to wash neutrophils) Transfer to a test tube containing disodium dodecahydrate 8.1 mM, potassium dihydrogen phosphate 1.47 mM).
  • the test tube containing the neutrophil is centrifuged at 200 ⁇ g for 10 minutes at room temperature (15-30 ° C.). Remove the test tube and discard the supernatant. Add 4 ° C sterilized water to the neutrophil in the test tube and leave it on ice for 30 seconds to hemolyze the mixed red blood cells.
  • Method for measuring DNA concentration in culture supernatant The culture supernatant is recovered, centrifuged at 200 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is transferred to a new microcentrifuge tube. The amount of DNA was measured using a Picogreen dsDNA assay reagent (P11896 Invitrogen) according to the accompanying protocol. Similarly to the pretreatment with human lactoferrin, the DNA concentration in the culture supernatant decreased for 1 to 2 hours after stimulation, and the release of DNA by NETs was suppressed [FIG. 2].
  • Example 3 Improving survival rate and survival prolongation of ANCA-related vasculitis model SCG / Kj mice by oral administration of lactoferrin (autoimmune disease model animal) 1.
  • lactoferrin autoimmune disease model animal 1.
  • Production and feeding method of LF-containing mouse breeding feed Standard yeast and lactoferrin-containing breeding feed were commissioned to Oriental Yeast Co., Ltd.
  • Standard feed was standard purified AIN-93M (casein 14.0%, L-cystine 0.18 for nutritional studies for mice and rats published in 1993 by the American Institute of Nutrition.
  • SCG / Kj (Spontaneous Cresogenic Glomerulonephritis-forming mouse / Kinjoh) Improvement of Survival Rate and Survival Prolonged
  • Example 4 Effect of lactoferrin administration on blood MPO-ANCA (myeloperoxidase specific anti-neutrophic cytoplasmic antibody) antibody titer and blood DNA of ANCA-related vasculitis model SCG / Kj mice (autoimmune disease model animal) 1.
  • Production and feeding method of LF-containing mouse breeding feed Standard yeast and lactoferrin-containing breeding feed were commissioned to Oriental Yeast Co., Ltd. Standard feed was standard purified AIN-93M (casein 14.0%, L-cystine 0.18 for nutritional studies for mice and rats published in 1993 by the American Institute of Nutrition.
  • MPO-ANCA antibody titer 3. Method for measuring MPO-ANCA antibody titer in plasma The measurement of MPO-ANCA antibody titer was performed by ELISA (Ishida-Okawara, A., et al, Chiba University School of Medicine). Nephrol Dial Transplant 2004; 19: 1708-1715). The recombinant mouse MPO is plated on a 96-well ELISA plate (TOYOSHIIMA) at a constant concentration and left at 4 ° C. for 16 hours. After standing, the supernatant is discarded, and 300 to 400 ⁇ l of PBS ( ⁇ ) is added to each well and washed (operate 2 to 3 times).
  • TOYOSHIIMA 96-well ELISA plate
  • Tissue Evaluation Method SCG / Kj mice are euthanized by cervical dislocation, kidney samples are collected by laparotomy, 40% paraffin blocks are prepared, tissue sections are made, Masson Trichrome is stained, and subcutaneous bleeding is tissue Was evaluated scientifically. Infiltrate in 10% formalin solution for 24 hours or longer and fix. Wash formalin with tap water for 1 hour or more, 60% ethanol 1 hour, 70% ethanol 1 hour, 80% ethanol 1 hour, 95% ethanol 1 hour, 100% ethanol 1 hour 3 times, xylene 1 hour 2 times Soak in paraffin (kept at 65 ° C.) for 1 hour three times, and then make a tissue block with embedded Zara.
  • the tissue block is cut at a thickness of 20 to 50 nm using a microtome to obtain a tissue section.
  • the section is attached to a glass slide and deparaffinized. Deparaffinization was performed by gently washing glass slides with completely dried tissue sections 3 times for 5 minutes in xylene, 2 times for 100% ethanol for 1 minute, and 95% ethanol for 80%, 70%, 60% ethanol. In the order of tap water, lightly wash in the same manner, soak in ion exchange water, and then perform Masson Trichrome staining.
  • solution I 90% of 1% Beerich Scarlet, 10 ml of 1% acidic fuchsin, 1 ml of acetic acid
  • solution II 5 g phosphomolybdic acid, 5 g phosphotungstic acid, 200 ml distilled water
  • solution III 2.5 g aniline blue, 2 ml acetic acid, distilled water 100 ml
  • LSR local Shwartzman Reaction
  • the mouse prepared in “1. Production and evaluation of LSR model 1” of the tissue evaluation method [Example 5] was euthanized by cervical dislocation, a skin sample was collected, a 40% paraffin block was prepared, and a tissue section was prepared. Masson Trichrome staining was performed and subcutaneous bleeding was evaluated histologically. Infiltrate in 10% formalin solution for 24 hours or longer and fix. Wash formalin with tap water for 1 hour or more, 60% ethanol 1 hour, 70% ethanol 1 hour, 80% ethanol 1 hour, 95% ethanol 1 hour, 100% ethanol 1 hour 3 times, xylene 1 hour 2 times Soak in paraffin (kept at 65 ° C.) for 1 hour three times, and then make a tissue block with embedded Zara.
  • the tissue block is cut at a thickness of 20 to 50 nm using a microtome to obtain a tissue section.
  • the section is attached to a glass slide and deparaffinized. Deparaffinization was performed by gently washing xylene for 5 minutes 3 times, 100% ethanol for 1 minute twice, and 95% ethanol on a glass slide with a completely dry tissue section, 80%, 70%, 60% ethanol, In the order of tap water, lightly wash in the same manner, soak in ion-exchanged water, and then perform Masson Trichrome staining.
  • solution I 90% of 1% Biebrich Scarlet, 10 ml of 1% acidic fuchsin, 1 ml of acetic acid
  • solution II 5 g phosphomolybdic acid, 5 g phosphotungstic acid, 200 ml distilled water
  • solution III 2.5 g aniline blue, 2 ml acetic acid, distilled water 100 ml
  • Xylene is soaked 3 times for 5 minutes, and the tissue is covered with a cover glass using an encapsulated liquid.
  • the slide glass was dried and observed with a microscope. Similar tissue sections were also stained with hematoxylin and eosin. After deparaffinization, running water was washed with tap water for 3 to 5 minutes and immersed in Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes. Washing was carried out with running water at 25 to 37 ° C. for 3 to 5 minutes and immersed in eosin solution for 5 minutes. Lightly wash with 60%, 70%, 80%, and 95% ethanol, and immerse in 100% ethanol 5 minutes 3 times. Immerse xylene for 5 minutes three times and cover the tissue with a cover glass using the encapsulated liquid. The slide glass was dried and observed with a microscope.
  • Example 6 Effect of Improving Survival and Survival Prolongation of Histone Thrombus (Disseminated Intravascular Coagulation (DIC)) Model Mice by Lactoferrin Tail Vein Administration
  • DIC Different Intravascular Coagulation
  • 100 ⁇ l of physiological saline (n 8) not containing bovine lactoferrin as an untreated symmetric group was administered into the tail vein 30 minutes before histone administration.
  • the Kaplan-Meier method was used to evaluate the survival rate and survival extension after administration of histones.
  • Example 7 Hemostatic effect (bleeding time) on histone thrombus model mice by lactoferrin tail vein administration
  • the hemostatic effect of DIC model mice was examined by administering H9250) into the tail vein at 60 mg / kg (Tobias A, et al., Blood, 2011; 118: p. 3708-3714) (used for survival rate and survival extension). 75% of histones are used).
  • Example 9 Confirmation experiment that inhibition of NETs formation is activity specific to lactoferrin Lactoferrin binds to a negatively charged DNA molecule because its N-terminal part is positively charged. (He J, and Pharmaceutical P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. Nature. 1995; 373: 6516). Therefore, an experiment was conducted to examine whether another type of protein having a molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) close to lactoferrin can inhibit NETs formation. The following proteins were used in the experiment.
  • MW molecular weight
  • pI isoelectric point
  • Angiogenin is known as a tumor angiogenesis factor (Strydom DJ, Fett JW, Lobb RR, Alderman EM, Bethune JL, Riod JF, and Vallee BL. Amino acid sequence. 94.)
  • Lactoperoxidase like lactoferrin, is a heme peroxidase that is contained in mammalian milk at a high concentration (Sharma S, Singh AK, Kausik S, Sinha M, Singh RP, Sharma P, Shirohi H, Kaur P, and Singh TP. Lactoperoxidase structural insights into the function, ligand binding and inhibition.Int J Biochem Mol Biol.2013; 4: 108-28)..
  • FIG. 1 A test result of NETs formation inhibitory effect is shown by adding lactoferrin to healthy human peripheral blood neutrophils 30 minutes before stimulation of NETs formation.
  • bLF bovine lactoferrin
  • bovine lactoferrin 20 ⁇ g A statistically significant difference was obtained with p / 0.01 in the pretreatment of / ml, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001 in the pretreatment with 200 ⁇ g / ml of NETs formation stimulus versus bovine lactoferrin. 10 ⁇ M DPI is used as a positive control.
  • hLF human lactoferrin
  • (C) shows a pre-processed image of human lactoferrin 200 ⁇ g / ml. Extracellular DNA was stained with 500 nM SYTOX green. It can be observed that the release of DNA is inhibited extracellularly by pretreatment with human lactoferrin.
  • (D) Pretreatment was performed with human lactoferrin, and the DNA concentration in the culture supernatant after 3 hours of NETs stimulation was measured. The concentration of DNA secreted extracellularly by NETs stimulation is suppressed in a bovine lactoferrin concentration-dependent manner, and p ⁇ 0.05 in NETs formation stimulation versus human lactoferrin 20 ⁇ g / ml, NETs formation stimulation vs.
  • FIG. 2 The test result of the NETs formation inhibitory effect is shown by adding lactoferrin to peripheral blood neutrophils of healthy persons after stimulation of NETs formation. 200 ⁇ g / ml human lactoferrin pretreated for 30 minutes was used as a control. When 200 ⁇ g / ml human lactoferrin was added 1 hour and 2 hours after NETs stimulation, inhibition of NETs formation was observed (the measurement used the DNA concentration in the culture supernatant). A statistically significant difference of p ⁇ 0.001 was obtained for each of NETs formation stimulus vs. lactoferrin added 1 hour after stimulation, and NETs formation stimulus vs. lactoferrin added 2 hours after stimulation.
  • FIG. 3 shows the test results of the effect of lactoferrin on the survival rate of ANCA model SCG / kj mice that are autoimmune disease models.
  • the survival rate was remarkably improved, and a statistically significant difference was obtained with p ⁇ 0.05.
  • FIG. 4 shows the test results of the effect of lactoferrin administration on SCG / kj mice on blood MPO-ANCA (myeloperoxidase specific anti-neutrophic cytoplasmic antibody) antibody titer, blood DNA, and kidney tissue.
  • MPO-ANCA myeloperoxidase specific anti-neutrophic cytoplasmic antibody
  • FIG. 5 shows test results on the effect of lactoferrin administration on subcutaneous tissues for LSR model 1 mice, which are non-autoimmune disease models.
  • B It is the graph quantified using the evaluation score of subcutaneous bleeding shown in Table 2.
  • the bovine lactoferrin-containing fed group had a lower subcutaneous bleeding score than the non-containing group, and a statistically significant difference was obtained with p ⁇ 0.001.
  • C Evaluation of mouse skin tissue inducing LSR by Masson trichrome staining and estrase staining. Subcutaneous hemorrhage and thrombus formation are suppressed in the bovine lactoferrin-containing fed group. Esterase staining suppresses neutrophil infiltration in the bovine lactoferrin-containing fed group.
  • FIG. 6 shows the test results on the influence of bovine lactoferrin administration on the dorsal subcutaneous air pouch for LSR model 2 mice, which are non-autoimmune disease models.
  • the bovine lactoferrin-containing breeding group showed a decrease in DNA concentration in the washing solution to near the non-stimulated group, and a statistically significant difference was obtained with p ⁇ 0.01.
  • B The figure which dye
  • the release of DNA is hardly seen and the formation of NETs is inhibited as compared with the non-containing breeding feed.
  • FIG. 7 shows the results of evaluation of survival rate and survival extension after administration of histone.
  • the untreated subject group gradually began to die about 20 minutes after histone administration, and became 2 animals after 2 days and 1 animal after 4 days, but all 8 animals survived even after 4 days in the bovine lactoferrin administration group.
  • FIG. 8 shows the hemostatic effect on histone thrombus model mice by lactoferrin tail vein administration.
  • FIG. 9 shows the effect of lactoferrin on the suppression of pulmonary tissue bleeding against a histone thrombus model Compared to the untreated symmetric group, the bovine lactoferrin-administered group showed almost no tissue bleeding, and the lung tissue had the same color as the control group. In the untreated symmetric group, redness of the lung tissue color increased and tissue bleeding was observed.
  • the present invention can provide a treatment method with few side effects for diseases caused by the formation of extracellular traps of leukocytes.
  • it because of its low side effects, it has the advantage that it can be used with peace of mind by a wide range of patients and patient reserves.
  • lactoferrin is different from the mechanism of action reported in the past (Patent Document 1). It can be said that the therapeutic action is shown by a completely new mechanism of action.

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Abstract

　本発明は白血球の細胞外トラップ形成を阻害する新規な薬剤を提供することを目的とする。　本発明は、ラクトフェリンを含む白血球の細胞外トラップ形成阻害剤及びラクトフェリンを含む白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物を提供する。

Description

白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤
　本発明は、ラクトフェリンを有効成分とする白血球の細胞外トラップ形成阻害剤及び白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物に関する。また、本発明は、前記阻害剤又は組成物を用いた血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療する方法に関する。
　ＮＥＴｓ（好中球細胞外トラップ：ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｐｓ）は、細菌感染により好中球が活性化され、分葉核の形態やクロマチンの分布が不明になり、ついで核膜が消失し、クロマチン構造に細胞質や顆粒成分が混在し、細胞膜が破れた際に網状の構造物を放出し、細菌や真菌、寄生虫、ウイルスを捕獲し、抗菌作用を発揮する細胞外構造物である。ＮＥＴｓはＤＮＡを中心とし、ヒストン３（Ｈ３）やエラスターゼがその作用に重要な役割を果たす。ＮＥＴｓ形成は微生物を効率的に殺す抗菌分子を局所に集めることになる。ＮＥＴｓが生じることで好中球は細胞死（ネトーシス）を迎えるが、その分子メカニズムはあまり分かっておらず、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＬＰＳ、ＩＬ−８等の刺激により生じ、その際に生じる細胞死は古典的なネクローシスや、カスパーゼの活性化やＤＮＡの断片化といったことが起きるアポトーシスとは異なった形態を示す。ＬＰＳやＰＭＡにより好中球が刺激されると、オートファジーが生じ、同時に活性酸素が生じる。これによって核膜の崩壊、クロマチンの脱凝縮、ヒストンのシトルリン化が生じ、ネトーシスが起こる（非特許文献１及び２）。
　ＮＥＴｓの形成に伴い、好中球から多くのタンパク質、特にアズール顆粒や第２顆粒に含まれる抗菌タンパク質が脱顆粒により分泌され、細胞構造に関わるタンパク質なども分泌されることが報告されている（非特許文献２）。それらのタンパク質はＮＥＴｓ構成タンパク質ともいわれ、好中球エラスターゼ、ヒストン、ミエロペルオキシダーゼ、Ｆ−アクチン、ラクトフェリン、マトリックスメタロプロテアーゼ９、ＬＬ３７、カテプシンＧ、ＢＰＩ、プロテナーゼ３、カルプロテクチン、アズロシジン、ライソザイムＣ、ディフェンシン、カタラーゼ等が報告されている（非特許文献３）。
　ラクトフェリンは好中球の第２顆粒に含まれ、好中球がＮＥＴｓを形成し、最終的に脱顆粒し、周囲に放出される（非特許参考文献１）。
　ラクトフェリンは哺乳動物において良く保存され、その機能に種差はあまりみられない。また、現在は牛乳成分のタンパク質としてその生理活性が注目され、市販されている。ただし、牛乳は、ウシの好中球のＮＥＴｓ形成に対し阻害効果を示さないことが報告されている（非特許文献４）。
　ＮＥＴｓは血栓の増大・成長にも関与し、ＮＥＴｓを放出すると、その中に含まれるヒストンは血小板を凝縮させる作用があり、ＮＥＴｓを基に血小板血栓が形成される。またＮＥＴｓに含まれる好中球エラスターゼやカテプシンＧは、組織因子経路抑制因子を分解し、血液凝固反応を促進する。それらの作用によって微生物などを局所にとどめる役割も示す（非特許文献５）。
　ＮＥＴｓの本来の作用はグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌等の外来微生物を補足し、局所に閉じ込め殺菌することである。このような作用を持つことから感染症において多くみられるが、感染症などが慢性化するにつれて、外来微生物の非存在下においてもＮＥＴｓの形成が見られるという報告もある。慢性かつ難治性の自己免疫疾患の一つである全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）は、自己ＤＮＡや関連タンパク質に対する自己抗体が形成され、それにより組織や臓器に炎症を起こすことが知られている。ＳＬＥの特徴的所見は好中球が障害部位に多数存在することである。ＳＬＥ患者の血清中には抗菌ペプチドＬＬ３７とＮＥＴｓ中のＤＮＡが存在することが知られている（非特許文献６及び７）。これらが自己抗原としてＢ細胞に認識され自己抗体が産生される。また、ＳＬＥ患者の好中球は健常人の好中球に比べてＮＥＴｏｓｉｓを起こしやすい（非特許文献６）。これらの要因が慢性炎症を誘導すると考えられている。また、自己抗体による疾患として抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎においても患者血清中のＩｇＧ分画が健常人のＩｇＧ分画よりも好中球のＮＥＴｓ形成能が約２倍高いことが報告されている（非特許文献８及び９）。
　ＮＥＴｓ形成と疾患との関連が注目されるようになったのは、２００４年のＢｒｉｎｋｍａｎらによる報告（非特許文献１）以来、最近のことであり、今後、ＮＥＴｓ形成が原因となる新たな疾患が明らかにされるであろう。このように、ＮＥＴｓ形成は、生体の感染防御において重要な役割を果たすものであるが、病態によっては、ＮＥＴｓ形成を阻害することが病態の改善に必要な場合も考えられる。
　ＮＥＴｓ形成を阻害する物質として、放出されたＤＮＡ網を分解するために肺炎連鎖球菌や黄色ブドウ球菌などのグラム陽性球菌の連鎖球菌は菌体外にＤＮａｓｅを発現させることが報告されている。また、ヒストンに対する抗体や、スーパーオキシドの産生を抑制するような物質としてジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）やカタラーゼが報告されている（非特許文献１０）。
　その他、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性がネトーシスに影響すること（非特許文献１１）、好中球がＮＥＴｓを形成して細胞死する現象、すなわちネトーシス、はアポトーシスやネクローシスとは異なるプロセスであること（非特許文献１０）などが知られている。
　乳由来の塩基性タンパク質画分を有効成分としてＩ型糖尿病や関節リウマチの自己免疫疾患を予防するという先行技術があるが（特許文献１）、リンパ球を中心とした免疫細胞の調節や炎症性サイトカインの抑制などに特化した内容であり、ＮＥＴｓ形成阻害作用に関するものではない。
　これまでのところ、ＮＥＴｓ形成に起因する疾患を治療する薬剤は報告されていない。
特開２００８−１８９６３７
Ｖｏｌｋｅｒ　Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，２００４　Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１５３２−１５３５ Ｑ　Ｒｅｍｉｊｓｅｎら，２０１１，Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１８：５８１−５８８ Ｍａｒｅｎ　ｖｏｎ　Ｋｏｅｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅら，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１１：３０７０−３０８０ Ｊｏｈｎ　Ｄ．Ｌｉｐｐｏｌｉｓら，２００６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３：２４８−２５５ Ｆｕｃｈｓ　ＴＡら，２０１０，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１０７：１５８８０−１５８８５ Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｍｏ　ＧＳら，２０１１　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，３：７３ｒａ２０． Ｌａｎｄｅ　Ｒら，２０１１　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，３：７３ｒａ１９． Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ　Ｋら，２００９，Ｎａｔ　Ｍｅｄ，６：６２３−６２５ Ｂｏｓｃｈ　Ｘ，２００９，Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，８：１６５４−１６５６ Ｔｏｂｉａｓ　Ａ．Ｆｕｃｈｓら，２００７，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１７６：２３１−２４１ Ｋ．Ａｋｏｎｇ−Ｍｏｏｒｅら，２０１２，ＰＬＯＳ　ＯＮＥ，７：ｅ４２９８４ 内藤　眞ら，２０１０，生物試料分析，３３：３２９−３３８
　本発明の目的は、白血球の細胞外トラップ形成によって発症する疾患の根本的な治療薬、特に、長期的に行われる寛解維持（再発抑制）に適する安全かつ有効な治療薬及び治療方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ラクトフェリンがＮＥＴｓ形成の抑制効果を顕著に発揮し、ＮＥＴｓ関連疾患の根本的な治療が可能となることを見出した。またＮＥＴｓ形成疾患のＡＮＣＡ関連血管炎モデル動物、局所シュワルツマン反応モデル動物及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ））モデル動物においても顕著な生存率の改善をもたらすことが分かった。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］　ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤。
［２］　ラクトフェリンが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、前記［１］に記載の阻害剤。
［３］　前記ラクトフェリンはヒト由来のものである、前記［１］に記載の阻害剤。
［４］　前記ラクトフェリンが以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質である、前記［１］に記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質
［５］　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、前記［１］~［５］のいずれか１つに記載の阻害剤。
［６］　前記白血球が好中球である、前記［５］に記載の阻害剤。
［７］　ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物。
［８］　ラクトフェリンが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、前記［７］に記載の組成物。
［９］　前記ラクトフェリンはヒト由来のものである、前記［７］に記載の組成物。
［１０］　前記ラクトフェリンが以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれか１つに記載のタンパク質である、前記［７］に記載の組成物。
（ａ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質
［１１］　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、前記［７］~［１０］のいずれか１つに記載の組成物。
［１２］　前記疾患は、ＡＮＣＡ関連血管炎、全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）及び播種性血管内凝固からなる群より選択されるいずれか１つである、前記［７］~［１１］のいずれか１つに記載の組成物。
［１３］　食品の形態にある、前記［７］~［１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１４］　注射剤の形態にある、前記［７］~［１２］のいずれか１つに記載の組成物。
［１５］　経口投与されるものである、前記［７］~［１３］のいずれか１つに記載の組成物。
［１６］　ラクトフェリンを患者に投与することを含む、白血球の細胞外トラップ形成の阻害方法。
［１７］　ラクトフェリンを患者に投与することを含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の治療方法。
　本発明は、白血球の細胞外トラップ形成により生じる疾患に対し、副作用の少ない治療方法を提供することができる。また、副作用の少なさがゆえに、広範囲の患者及び患者予備軍に安心して使用できるという利点を有する。
　本発明の阻害剤及び組成物は、高齢者、担癌患者など免疫の低下した被験者、感染症合併症例、結核既往のある被験者など幅広い被験者層に広く使用できる。また、長期間使用しても副作用の少ない、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の治療薬及び治療方法が提供される。特に、前記疾患に治療において長期的な薬剤の使用が必要な場合、急性期症状が寛解した後の被験者の再発抑制剤として、また、前記疾患が慢性化した場合の治療薬として有用である。
ウシラクトフェリンによるＮＥＴｓ形成阻害能を示すグラフである。 ヒトラクトフェリンによるＮＥＴｓ形成阻害能を示すグラフである。 ヒトラクトフェリンがＮＥＴｓ形成を阻害する様子を示す蛍光顕微鏡写真である。 ＮＥＴｓに伴うＤＮＡ放出がヒトラクトフェリンにより抑制される効果を示すグラフである。 ＮＥＴｓに伴うＤＮＡ放出がヒトラクトフェリンにより抑制される様子を示す電子顕微鏡写真である。 ＮＥＴｓに伴うＤＮＡ放出がヒトラクトフェリンにより抑制される効果を示すグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＡＮＣＡ関連血管炎モデル動物の生存率が上昇する効果を示すグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＡＮＣＡ関連血管炎モデル動物の血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価が低下する効果を示すグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＡＮＣＡ関連血管炎モデル動物中の血中ＤＮＡ濃度が低下する効果を示すグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＡＮＣＡ関連血管炎モデル動物の腎組織の病態が改善する様子を示す顕微鏡写真である。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＬＳＲモデル動物の皮下出血が改善する様子を示す写真である。 ウシラクトフェリンの経口投与によるＬＳＲモデル動物の皮下出血の改善をスコア化したグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＬＳＲモデル動物の皮膚組織が改善する様子を示す顕微鏡写真である。 ウシラクトフェリンの経口投与によりＬＳＲモデル動物のエアパウチ内のＤＮＡ濃度が低下する効果を示すグラフである。 ウシラクトフェリンの経口投与によるＬＳＲモデル動物のエアパウチ内のＤＮＡ放出が抑制される様子を示す顕微鏡写真である。 ヒストン投与後からの生存率・生存延長の評価の結果を示すグラフである。 ラクトフェリン尾静脈投与によるヒストン血栓モデルマウスに対する止血効果を示すグラフである。 ヒストン血栓モデルに対するラクトフェリンの肺組織出血抑制効果を示す写真である。 ＮＥＴｓ形成阻害がラクトフェリンに特異的な活性であることを示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１３年４月９日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１３−０８１２４３号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．白血球の細胞外トラップ形成阻害剤
　本発明は、第１の態様として、ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤（以下、「本発明の阻害剤」という）を提供する。
　細胞外トラップは、様々な白血球で形成されることが報告されており、例えば、好中球（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００４；３０３：１５３２−１５３５．）、好塩基球（Ｙｏｕｓｅｆｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２００８；１４：９４９−９５３．）、肥満細胞（ｖｏｎ　Ｋｏｅｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　２００８；１１１：３０７０−３０８０．）、単球（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２０１０；１８５：２９６８−２９７９）：例えば、マクロファージ（Ｃｈｏｗ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｈｏｓｔ　＆　Ｍｉｃｒｏｂｅ，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ｉｓｓｕｅ　５，４４５−４５４，１８　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１０））などで生じることが報告されている。
　これら白血球が形成する細胞外トラップは、ＤＮＡと顆粒タンパク質（ｇｒａｎｕｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を主成分とする線維成分が放出されるという共通の特徴を有していることが報告されている（Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．，ｅｔ　ａｌ，Ａｌｌｅｒｇｙ　６８（２０１３）４０９−４１６）。
　これに対し、本発明の阻害剤は、前記線維成分を凝縮及び／又は縮合させ、これによって同線維成分の放出を抑制することができる（図１−Ｅ参照）。従って、本発明の阻害剤を用いれば、実施例で用いた好中球だけではなく、他の白血球（例えば、好塩基球、肥満細胞、単球（例えば、マクロファージ）から細胞外トラップ形成時に放出される線維成分も凝縮及び／又は縮合させ、それによって、これらの白血球の細胞外トラップ形成を阻害できることが分かる。
　本発明の阻害剤の有効成分であるラクトフェリンは、哺乳動物乳由来のものである限り特に限定されないが、好ましくは、ヒトが摂取可能な哺乳動物乳（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒトの乳）であり、より好ましくは、ヒトの乳由来である。あるいは、ラクトフェリンは、前記哺乳動物の好中球に由来するものであってもよい。
　種々の哺乳動物に由来するラクトフェリンのアミノ酸配列が公知である（下記表１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　ある実施形態では、本発明の阻害剤に使用するラクトフェリンは、以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれか１つに記載のタンパク質である。
（ａ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質；及び
（ｃ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質
　上記（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号１~５のいずれか１つのポリペプチドの変異体であるが、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ２００１″、″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）″、″Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）″等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　本明細書中、「配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質」としては、配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、例えば、１~６６個、１~６５個、１~６０個、１~５５個、１~５０個、１~４９個、１~４８個、１~４７個、１~４６個、１~４５個、１~４４個、１~４３個、１~４２個、１~４１個、１~４０個、１~３９個、１~３８個、１~３７個、１~３６個、１~３５個、１~３４個、１~３３個、１~３２個、１~３１個、１~３０個、１~２９個、１~２８個、１~２７個、１~２６個、１~２５個、１~２４個、１~２３個、１~２２個、１~２１個、１~２０個、１~１９個、１~１８個、１~１７個、１~１６個、１~１５個、１~１４個、１~１３個、１~１２個、１~１１個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　ここで、「白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性」において、白血球は、白血球の細胞外トラップを形成する生物に由来するものであり、好ましくは脊椎動物に由来するものであり、さらに好ましくは哺乳動物由来のものである。哺乳動物の例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ及びネコが挙げられ、さらに好ましくは、ヒトである。
　また、白血球は、上記由来のものであると同時に、好ましくは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものであり、より好ましくは、好中球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものであり、さらに好ましくは、好中球である。
　上記ラクトフェリンの存在下及び非存在下で上記白血球を培養して、前記培養系の顕微鏡観察により、ラクトフェリン存在下で細胞外トラップ形成が減少していることを確認することで、白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を確認することができる。
　上記白血球は、ラクトフェリン添加前に、細胞外トラップ形成促進剤（パラメトキシアンフェタミン（ＰＭＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等）で処理されていることが好ましい。
　あるいは、上記培養系の培養上清を回収し、同上清中のＤＮＡ濃度を測定することで白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を確認することができる。このようなＤＮＡ濃度は、主として細胞外トラップ形成時に培養上清中に放出されたＤＮＡによるものである。
　ラクトフェリンによって細胞外トラップの形成が阻害された場合、上清中のＤＮＡ濃度は、ラクトフェリン非存在下の条件と比べて低下する。
　この場合も、上記白血球は、ラクトフェリン添加前に、細胞外トラップ形成促進剤（パラメトキシアンフェタミン（ＰＭＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ等）で処理されていることが好ましい。
　ＤＮＡの濃度は、市販のキット（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて簡便に測定することができる。
　各白血球の培養条件、細胞外トラップの確認方法については、以下を参照することができる：好中球（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００４；３０３：１５３２−１５３５．）、Ａ．Ｋ　Ｇｕｐｔａ．ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ　２０１０；５８４：３１９３−３１９７，Ｄ　Ｊ　Ｎｏｖｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４（４）：８２７−３４．）、好塩基球（Ｙｏｕｓｅｆｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２００８；１４：９４９−９５３．）、肥満細胞（ｖｏｎ　Ｋｏｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　２００８；１１１：３０７０−３０８０．）、単球（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２０１０；１８５：２９６８−２９７９）：例えば、マクロファージ（Ｃｈｏｗ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｈｏｓｔ　＆　Ｍｉｃｒｏｂｅ，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ｉｓｓｕｅ　５，４４５−４５４，１８　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１０））。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、２~９個）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　また、本発明で使用するラクトフェリンは、化合物で修飾されたものでもよい。例えば、ラクトフェリンは、ポリエチレングリコールを結合させた修飾タンパク質（特許第４１９５４８６号、特許第４２６１５３１号、国際公開公報ＷＯ２００９／１１３７４３）や、別のタンパク質又はその断片（例えば、血中安定タンパク質ＩｇＧやアルブミン又はその断片等）を融合させた融合タンパク質（特願２０１２−９８０８５号）であってもよい。
２．治療方法
　本発明の阻害剤を用いることにより、効果的に、白血球の細胞外トラップ形成を阻害することが可能である。つまり、本発明の阻害剤を用いることにより、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療することができる（以下、「本発明の治療方法」という）。
　本明細書において用いる「治療」なる用語は、一般的には、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の症状を改善させることを意味する。また「改善」なる用語は、例えば、ラクトフェリンを投与しない場合と比較して、疾患の程度が軽減する場合及び悪化しない場合を指し、予防という意味をも包含する。
　この場合、治療対象（患者）は、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を患う生物又は患うリスクのある生物であり、好ましくは脊椎動物であり、さらに好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ及びネコからなる群より選択される哺乳動物が挙げられ、さらに好ましくは、ヒトである。
　本発明の治療方法において、「白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患」とは、患者体内で白血球の細胞外トラップ形成の増加が観察される疾患であれば特に限定されない。
　このような疾患としては、例えば、ＡＮＣＡ関連血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎等）、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、虫垂炎、アスペルギルス感染症、肺炎、肺炎双球菌感染症、壊死性筋膜炎、連鎖球菌感染、敗血症、子癇前症、クローン病、住血吸虫症、歯周炎、結核、乳房炎、マラリア、嚢胞性線維症、並びに深部静脈血栓症（ｖｏｎ　Ｂｒｕｈｌ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２０１２　Ａｐｒ　９；２０９（４）：８１９−３５）、心筋梗塞（ｄｅ　Ｂｏｅｒ，Ｏ．Ｊ．，Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１３　Ｆｅｂ；１０９（２）：２９０−７）、腫瘍関連血栓症塞（Ｄｅｍｅｒｓ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０１２　Ａｕｇ　７；１０９（３２）：１３０７６−８１）及び播種性血管内凝固（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ＤＩＣ）（Ｔｏｂｉａｓ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２９　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１１，ｖｏｌ．１１８，ｎｏ．１３，ｐ．３７０８−３７１４）などの血栓性疾患等が挙げられる（非特許文献２及び１２）。血管炎症候群はその発症血管のサイズにより、大型血管炎、中型血管炎、小型血管炎と分類されている。上述したＡＮＣＡ関連血管炎、ＳＬＥなどのＮＥＴｓ関連疾患は、小型血管炎に分類されるが、中型血管炎である結節性多発動脈炎の重症化（循環器病の診断と治療に関するガイドライン（２００６−２００７年度合同研究班報告））や敗血症や固形癌においてもＤＩＣを合併することが頻繁にある。これらの疾患は、白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）形成による細胞毒性が血管内皮障害をもたらし、このため臓器の機能不全が生じる。また上記の血栓性疾患においては白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）形成が引き金となって、血栓形成のカスケードが促進される。ラクトフェリンは白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）の形成および放出・拡散を抑制することにより血管内皮障害を予防し、さらには血栓形成のカスケードを抑制することにより臓器保護的作用を示し、上記疾患に治療効果を奏するものと考えられる。
　好ましくは、本発明の治療方法の対象となる疾患は、ＡＮＣＡ関連血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎等）全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応及び虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）であり、さらに好ましくは、血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体価の増加を伴う顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）である。
　なお、ラクトフェリンを用いてＩ型糖尿病や関節リウマチの自己免疫疾患を治療することも報告されているが（特許文献１）、Ｉ型糖尿病や関節リウマチなどの自己免疫疾患では、白血球の細胞外トラップの形成が主たる病因としては考えられていないことから、前記報告に係る治療において、ラクトフェリンは、細胞外トラップ形成を介さずに作用している可能性が高いといえる。
　すなわち、本発明において、ラクトフェリンは、全く新規なメカニズム、つまり、白血球の細胞外トラップの形成を阻害するメカニズムにより上記疾患に対する治療作用を示すものといえる。
　ＳＬＥ治療やＡＮＣＡに起因する疾患の治療はステロイドや免疫抑制剤等が使用されているが、これらの治療方法には患者の肉体的負担を伴い（副作用等）、苦痛を強いるほか、他の疾患（感染症）を誘発するリスクが高いという問題がある。
　これに対し、本発明では、食品に含まれるラクトフェリンを有効成分として用いるため、副作用も少なく、患者に苦痛を強いることもなく、他の疾患を誘発するリスクも少ないという利点を有する。
３．組成物
　本発明は別の態様として、ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物（以下、「本発明の組成物」）を提供する。
　ここで、「組成物」なる用語は、本発明において有用な活性成分（ラクトフェリン等）の調製において用いられる担体等の添加物を含有するものを意味する。
　本発明の組成物において、「ラクトフェリン」及び「白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患」は、上述の通りである。
　本発明の組成物の投与経路は、一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移植が挙げられ、好ましくは経口投与及び静脈投与である。
　本発明の組成物は、カプセル、錠剤、粉末等の固形剤であってもよく、溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤であってもよい。
　本発明の経口投与の場合、組成物は、好ましくは固形剤である。また、注射剤の場合は凍結乾燥手法等を含めた固形剤、もしくは液剤である。
　さらに好ましくは、本発明の組成物は、経口投与の場合は腸溶製剤として調製される。経口的に摂取されたラクトフェリンは、胃内でペプシン消化を受けやすいことが知られており、腸溶製剤とすることにより、体内移行率を高めることができる（Ｔａｋｅｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６　Ｎｏｖ；９１（６）：１０３３−４０．）。この場合、ラクトフェリンは、水分があると熱に不安定であるため、乾燥状態でラクトフェリン粉末を打錠し、腸溶性被覆材でコーティングすることが望ましい（ＮＲＬ製剤特許文献：顆粒剤特許第４０５０７８４号、錠剤特許第４５９２０４１号）。
　ラクトフェリンは、食品や飼料中に添加して、食品または飼料としてヒトまたはヒト以外の対象動物に摂取させることもできる。このような食品または飼料の製造方法も当業者には公知である。また、溶液製剤として注射剤として製剤化も可能である。
　さらには、これらのラクトフェリンやラクトフェリン分解物をそのまま、あるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に添加してもよい。
　ラクトフェリンは、単独で使用してもよく、又は薬理学的に許容可能な他の成分と共に調合してもよい。
　例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口投与用組成物として調製する場合、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法によって製剤化される。この種の組成物には、前記賦形剤の他に、コーティング剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することができる。
　本発明の組成物は、有効成分であるラクトフェリンを治療上有効量で含み得る。ここで、「治療上有効量」とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の症状が、ラクトフェリンを投与しない場合と比較して、軽減する場合及び悪化しない量を指し、予防において有効な量という意味をも包含する。
　例えば、経口投与の場合、治療上有効量は、０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．００５~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~５ｇ／ｋｇ／日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、治療上有効量として、一日あたり１０ｍｇ~１５，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１２，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~６，０００ｍｇの量である。このような一日あたりの用量を一度にまたは分割して、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の治療を必要とする患者に投与することができる。
　なお、本発明の組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、腫瘍疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。
　上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても治療効果を奏する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］　ラクトフェリン前処理による健常人末梢血好中球のＮＥＴｓ形成刺激の阻害効果
１．ヒト好中球の単離方法
　健常人からＥＤＴＡ含有注射器（針１８~２２Ｇ）で１回の実験用に１５ｍｌ~２０ｍｌの末梢血を採血した。採血後、３ｍｌのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＣａｔＮｏ．ＤＳＢＮ１００，ＤＳファーマバイオケミカル株式会社）を入れている１５ｍｌのコニカルチューブの中に、下層のＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍと全血３．５ｍｌを静かに重層する。１５ｍｌのコニカルチューブを室温（１５~３０℃）でスイング式の遠心分離機で４００×ｇ、２０分間遠心し、コニカルチューブを静かに取り出す。アスピレータ等で最上部の褐色のプラズマ層とその直ぐ下層のリンパ球・単球層を除去する。また、リンパ球・単球層の下層の透明層を可能な限り除く。透明層の下層にある薄いピンク色層をパスツールピペットで取り、好中球を洗浄するためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−）；塩化ナトリウム１３７ｍＭ、塩化カリウム２．７ｍＭ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物８．１ｍＭ、リン酸２水素カリウム１．４７ｍＭ）の入った試験管に移す。好中球の入った試験管を室温（１５~３０℃）で２００×ｇ、１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨てる。試験管に４℃の滅菌水を好中球に加え、３０秒間氷上に静置して、混ざっている赤血球を溶血させる。溶血後、４５ｍｌのＰＢＳ（−）を加えて２００×ｇ、１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨て、沈殿物を培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に懸濁させ、使用する直前まで８℃で保存した。分離できた好中球数は１×１０６個／ｍｌ~１×１０７個／ｍｌであり、純度に関してはｃｙｔｏｓｐｉｎ後の検体をＧｉｅｍｓａ染色処置し目視でカウントし、９５~９８％であった。
２．好中球の前処置方（ＮＥＴｓ形成阻害）とＮｅｔｏｓｉｓ（ＮＥＴｓ形成）誘導方法
　［実施例１］の「１．ヒト好中球の単離方法」に記載の好中球単離後から約１時間後に好中球の前処置を行った。８ｗｅｌｌ−μスライド（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｉｂ　８０８２６　Ｉｂｉｄｉ（登録商標））に好中球を４００μｌの培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで撒き、（ｉ）~（ｖ）の各薬剤を添加し３０分間室温で前処置を行った。（ｉ）ウシラクトフェリン（ｂｏｖｉｎｅ　ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ　１２３−０４１２４　Ｌｏｔ；ＫＷＧ６３３２　ＷＡＫＯ（登録商標））（ｓｔｏｃｋ；１００ｍｇ／ｍｌ）を１／５００、１／５０００、１／５００００倍希釈し最終濃度２００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、（ｉｉ）ヒトラクトフェリン（ｓｔｏｃｋ；１００ｍｇ／ｍｌ，２００μｌ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＩＧＬ６７９３，ＳＩＧＭＡ）を１／５００、１／５０００、１／５００００倍希釈し最終濃度２００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、（ｉｉｉ）ＤＰＩ（ｓｔｏｃｋ　２５ｍＭ，Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ｄ２９２６　Ｓｉｇｍａ；添付文書溶媒はＤＭＳＯ）を１／２５００希釈し、最終濃度は１０μＭ、（ｉｖ）Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ｄ９５３３　Ｓｉｇｍａ）（ｓｔｏｃｋ；２００ｍＭ）を１／１００倍に希釈し最終濃度２ｍＭ、（ｖ）Ｔｒｉｅｎｔｉｎｅ；Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ；Ｔ５０３３　Ｌｏｔ；１３５４３８０Ｖ，ｓｔｏｃｋ　１００ｍＭ；１００μｌ）最終濃度は１２５μＭ、１２．５μＭ、１．２５μＭを各試薬、濃度毎に前処置を行った。前処置した後にＰＭＡ（最終濃度２５ｎＭ，ｓｔｏｃｋ：１０ｍＭ　ｉｎ　ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ　Ｐｒｏｄ　Ｎｏ．Ｐ８１３９）による好中球刺激をした。
３．ＮＥＴｓ形成に伴う細胞死（Ｎｅｔｏｓｉｓ）の観察方法と結果
　ＮＥＴｓ形成の観察には共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＤＭＩ　６０００Ｂ，Ｌｅｉｃａ（登録商標））を使用した。顕微鏡下に好中球細胞数を目視でカウント（すべての実験でＨｙＳＯｘ（最終濃度５００ｎＭ　ｓｔｏｃｋ；１０ｍＭ，東京大学大学院医学系研究科　生体物理医学専攻　医用生体工学講座生体情報学　浦野泰照教授より提供）のプローブ（Ｋｅｎｍｏｋｕ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，２００７．Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　１２９：７３１３−７３１８：Ｓｅｔｓｕｋｉｎａｉ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，２００３．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２７８：３１７０−３１７５）を使用しており、これによる赤色蛍光細胞をカウント）した。ＮＥＴｓの定量はＡ．Ｋ　Ｇｕｐｔａ．ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ　２０１０；５８４：３１９３−３１９７，Ｄ　Ｊ　Ｎｏｖｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４（４）：８２７−３４．を参考にＳｙｔｏｘｇｒｅｅｎ（最終濃度５００ｎＭ，ｓｔｏｃｋ：５ｍＭ，５μｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ；Ｓ７０２０）、ＴＯ−ＰＲＯ−３（最終濃度１μＭ，ｓｔｏｃｋ；１ｍＭ，Ｃａｔ　Ｎｏ；Ｔ３６０５　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に染色される好中球外へ放出された網状構造物を目視でカウントした［図１−Ｃ］。試薬を注入後、乾燥対策として酸素を通すことで長時間生細胞を３７℃で観察させるため、シリコンオイル（ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ　ＡＲ２００　Ｌｏｔ；ＢＣＢＦ０６０２Ｖ　ＡＬＤＲＩＣＨ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（登録商標）８５４１９）を１００μｌ注入し油層を作成した。観察時間１~８時間（時間経過をＮＥＴｓ形成平衡状態まで追わない場合は４時間）とし、観察中の検体は顕微鏡設置の保温箱により３７℃に一定に保った。ＮＥＴｓ形成率はＮＥＴｓの放出がみられた細胞数を１視野中の全細胞数で除したもので表した。ＰＭＡ単独で刺激を行うと、ＮＥＴｓ形成は２~３時間でピークに達し、４時間以降はプラトーに達する。無刺激の場合は血液中の好中球の寿命が１０~１２時間なのでＮＥＴｓの観測も４~５時間でピークに達し、６時間以降はプラトーに達する。また、無刺激はＰＭＡ刺激と比べてもＮＥＴｓ形成が１／８~１／７と少ない。ＰＭＡ刺激前に前項「２．好中球の前処置方（ＮＥＴｓ形成阻害）とＮｅｔｏｓｉｓ（ＮＥＴｓ形成）誘導方法」の各処置を行うと、ＰＭＡ単独刺激のものと比べ、ウシラクトフェリンとヒト好中球由来ラクトフェリン（ＳＩＧＭＡ　型番　ＳＩＧＬ６７９３）は２μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度ではプラトーに達した時のＮＥＴｓの割合は半減し、２００μｇ／ｍｌに関しては１／４までＮＥＴｓ形成が抑制されていた［図１−Ａ、Ｂ］。ＤＰＩは１／３までＮＥＴｓ形成が抑制されたが、ＤｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅとＴｒｉｅｎｔｉｎｅについてはＮＥＴｓ形成が抑制されなかった。
　走査型電子顕微鏡の観察方法は、細胞培養用カバーガラスかガラスボトムディッシュに好酸球を１×１０６個で２００μｇ／ｍｌヒトラクトフェリン添加、無添加の前処理後にＮＥＴｓ刺激を行い、３時間後に、２％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を４℃で１時間、前固定した。次に、１％　４酸化オスミウムを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を４℃で１時間、後固定した。固定終了後、６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと５~１０分間軽く揺すりながら洗浄し、１００％エタノール５~１０分間、２回浸し、脱水処理を行う。酢酸イソアミルに１０~１５分置換し、臨界点乾燥を行う。オスミウム・プラズマコーティング機（ＯＰＣ８０Ｎ、フィルジェン株式会社）を用いてサンプルを昇華させた４酸化オスミウム層で被膜し、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−６３２０Ｆ、日本電子株式会社）によって観察した。無刺激の好中球は球形が保たれ細胞外線維は認められないが、ＰＭＡ刺激により細胞は崩れ線維成分が多数形成された。一方でラクトフェリン投与を行った好中球ではこの線維成分が束状にみられ、ラクトフェリンがＮＥＴｓの線維を縮合させていた［図１−Ｄ］。
４．培養上清中ＤＮＡ濃度測定方法
　培養上清中を回収し、２００×ｇ、１０分間遠心し、上精を新しい微小遠心チューブに移す。ＤＮＡ量の測定はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、付随のプロトコルに沿って行った。ヒトラクトフェリンを前処理すると、濃度依存的に培養上清中のＤＮＡ濃度が減少し、ＮＥＴｓによるＤＮＡの放出を抑制された［図１−Ｄ］。
［実施例２］　健常人末梢血好中球のＮＥＴｓ形成刺激後のラクトフェリンによる阻害効果
１．ヒト好中球の単離方法
　健常人からＥＤＴＡ含有注射器（針１８~２２Ｇ）で１回の実験用に１５ｍｌ~２０ｍｌの末梢血を採血した。採血後、３ｍｌのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＣａｔＮｏ．ＤＳＢＮ１００，ＤＳファーマバイオケミカル株式会社）を入れている１５ｍｌのコニカルチューブの中に、下層のＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍと全血３．５ｍｌを静かに重層する。１５ｍｌのコニカルチューブを室温（１５~３０℃）でスイング式の遠心分離機で４００×ｇ、２０分間遠心し、コニカルチューブを静かに取り出す。アスピレータ等で最上部の褐色のプラズマ層とその直ぐ下層のリンパ球・単球層を除去する。また、リンパ球・単球層の下層の透明層を可能な限り除く。透明層の下層にある薄いピンク色層をパスツールピペットで取り、好中球を洗浄するためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−）；塩化ナトリウム１３７ｍＭ、塩化カリウム２．７ｍＭ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物８．１ｍＭ、リン酸２水素カリウム１．４７ｍＭ）の入った試験管に移す。好中球の入った試験管を室温（１５~３０℃）で２００×ｇ，１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨てる。試験管に４℃の滅菌水を好中球に加え、３０秒間氷上に静置して、混ざっている赤血球を溶血させる。溶血後、４５ｍｌのＰＢＳ（−）を加えて２００×ｇ、１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨て、沈殿物を培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に懸濁させ、使用する直前まで８℃で保存した。分離できた好中球数は１×１０６個／ｍｌ~１×１０７個／ｍｌであり、純度に関してはｃｙｔｏｓｐｉｎ後の検体をＧｉｅｍｓａ染色処置し目視でカウントし、９５~９８％であった。
２．好中球のＮｅｔｏｓｉｓ（ＮＥＴｓ形成）誘導と阻害方法
　［実施例２］の「１．ヒト好中球の単離方法」に記載の好中球単離後から約１時間後には、好中球の前処置を行った。８ｗｅｌｌ−マイクロスライド（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｉｂ　８０８２６Ｉｂｉｄｉ（登録商標））に好中球を４００μｌの培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで撒き、ＰＭＡ（最終濃度２５ｎＭ，ｓｔｏｃｋ：１０ｍＭ　ｉｎ　ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ　Ｐｒｏｄ　Ｎｏ．Ｐ８１３９）による刺激を行った。刺激３０分前処理と刺激後１、２時間ごとにヒトラクトフェリン（ｓｔｏｃｋ；１００ｍｇ／ｍｌ，２００μｌ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＩＧＬ６７９３，ＳＩＧＭＡ）を２００μｇ／ｍｌ添加し、阻害を行った。
４．培養上清中ＤＮＡ濃度測定方法
　培養上清中を回収し、２００×ｇ、１０分間遠心し、上精を新しい微小遠心チューブに移す。ＤＮＡ量の測定はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、付随のプロトコルにそって行った。ヒトラクトフェリンを前処理と同様に刺激後１、２時間共に培養上清中のＤＮＡ濃度が減少し、ＮＥＴｓによるＤＮＡの放出を抑制された［図２］。
［実施例３］　ラクトフェリン経口投与によるＡＮＣＡ関連血管炎モデルＳＣＧ／Ｋｊマウスに対する生存率・生存延長の改善効果（自己免疫疾患モデル動物）
１．ＬＦ含有マウス飼育餌の製造と摂取方法
　標準飼育餌とラクトフェリン含有飼育餌の製造はオリエンタル酵母株式会社に依頼した。
　標準飼育餌は米国国立栄養研究所（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）から１９９３年に発表されたマウス・ラット用の栄養研究のための標準精製ＡＩＮ−９３Ｍ（カゼイン１４．０％，Ｌ−シスチン０．１８％、コーンスターチ４６．５６９２％、α−コーンスターチ１５．５％、シュークロース１０．０％、大豆油４．０％、セルロースパウダー　５．０％、ＡＩＮ−９３Ｍミネラル混合３．％５、ＡＩＮ−９３ビタミン混合１．０％酒石酸コリン０．２５％、第三ブチルヒドロキノン０．０００８％）をペレッターで固形にし、自由摂取させた。ラクトフェリン含有飼育餌はＡＩＮ−９３Ｍにウシラクトフェリンを最終濃度２％になるように混ぜ、ペレッターで固形にし、自由摂取させた。
２．ＳＣＧ／Ｋｊ（（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　Ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ　Ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ／Ｋｉｎｊｏｈ））の生存率・生存延長の改善効果
　半月体形成性糸球体腎炎及びＡＮＣＡ関連血管炎を発症する６~７週齢の雌ＳＣＧ／Ｋｊマウスを独立行政法人　理化学研究所・筑波研究所・バイオリソースセンターから購入し、１~２週間慣らした後に使用した。８週齢目からラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝１６）、標準飼育餌群（ｎ＝１６）で飼育を行った。生存率・生存延長の評価はカプラン・マイヤー法を用いて評価した。標準飼育餌群では、９週齢から徐々に死に始め、１８週齢には２匹が生存していた。ラクトフェリン含有飼育餌群では１４週齢から死に始め、１８週齢には１１匹生存しており、生存率と生存延長の効果が顕著に見られた（統計的有意差ｐ＝０．０１１１）［図３］。
［実施例４］　ラクトフェリン投与がＡＮＣＡ関連血管炎モデルＳＣＧ／Ｋｊマウスの血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体価と血中ＤＮＡに与える影響（自己免疫疾患モデル動物）
１．ＬＦ含有マウス飼育餌の製造と摂取方法
　標準飼育餌とラクトフェリン含有飼育餌の製造はオリエンタル酵母株式会社に依頼した。
　標準飼育餌は米国国立栄養研究所（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）から１９９３年に発表されたマウス・ラット用の栄養研究のための標準精製ＡＩＮ−９３Ｍ（カゼイン１４．０％，Ｌ−シスチン０．１８％、コーンスターチ４６．５６９２％、α−コーンスターチ１５．５％、シュークロース１０．０％、大豆油４．０％、セルロースパウダー　５．０％、ＡＩＮ−９３Ｍミネラル混合３．％５、ＡＩＮ−９３ビタミン混合１．０％酒石酸コリン０．２５％、第三ブチルヒドロキノン０．０００８％）をペレッターで固形にし、自由摂取させた。ラクトフェリン含有飼育餌はＡＩＮ−９３Ｍにウシラクトフェリンを最終濃度２％になるように混ぜ、ペレッターで固形にし、自由摂取させた。
２．ＡＮＣＡ関連血管炎モデルＳＣＧ／Ｋｊマウスの血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価と血中ＤＮＡへの効果実験
　６週齢以降の雌ＳＣＧ／Ｋｊマウスを独立行政法人　理化学研究所・筑波研究所・バイオリソースセンターから購入し、８週齢から使用した。ラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝８）、標準飼育餌群（ｎ＝８）で飼育を行った。８~１７週齢までのＳＣＧ／Ｋｊにジエチルエーテルによる吸入麻酔を行い、ヘパリン採血を行った。採血した血液は１．５ｍｌの微小遠心チューブに移し、４℃で１０００ｇ、１０分間遠心を行い、上精を回収し、血漿とした。
３．血漿中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価測定方法
　ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の測定は、旧千葉大学　医学研究院　免疫発生・炎症制御学　鈴木和男教授から分与されたＥＬＩＳＡ（Ｉｓｈｉｄａ−Ｏｋａｗａｒａ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ，Ｎｅｐｈｒｏｌ　Ｄｉａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　２００４；１９：１７０８−１７１５）を用いて行った。遺伝子組換え型マウスＭＰＯを一定濃度で９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡプレート（ＴＯＹＯＳＨＩＭＡ）に撒き、４℃に１６時間放置する。放置後、上清を捨て、各ウェルに３００~４００μｌのＰＢＳ（−）を入れ、洗浄する（２~３回操作する）。洗浄後、各ウェルに１％ウシ血清アルブミンＰＢＳ（−）溶液を３００~４００μｌ入れ、室温に２時間放置し、３００~４００μｌのＰＢＳ（−）を入れ、洗浄する（３~４回操作する）。放置後、ＰＢＳ（−）で５０倍に希釈したマウス血清をウェルに入れ、室温に９０分間反応させる。反応後、各ウェルに３００~４００μｌのＰＢＳ（−）を入れ、洗浄する（３~４回操作する）。
　洗浄後、ＰＢＳ（−）で１０００倍に希釈したアルカリファオスファターゼ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を各ウェルに入れ、室温で２時間反応をさせる。反応後、各ウェルに３００~４００μｌのＰＢＳ（−）を入れ、洗浄する（３~４回操作する）。ＰＢＳ（−）で希釈した１ｍｇ／ｍｌのパラ−ニトロフェニルリン酸を１５０μｌ各ウェルに入れ、１５~３０分間反応させ、０．７５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を等量入れ反応を停止させ、４０５ｎｍ波長で測定を行う。吸光度計にて測定した結果、標準飼育餌群は平均０．２８３８７５で、ラクトフェリン含有飼育餌群の平均値は０．１５６２５であり、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の減少が認められ、治療効果が認められた（統計的有意差ｐ＝０．０２２１）［図４−Ａ］。
４．血漿中ＤＮＡ濃度測定方法
　血漿中のＤＮＡ量の測定はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、測定方法は付随のプロトコルに沿って行った。ラクトフェリン含有飼育餌群が非含有餌群と比べ血中ＤＮＡ量が低く、ＮＥＴｓによるＤＮＡの放出が顕著に抑制されていた（ｐ＝０．０４６）［図４−Ｂ］。
５．組織評価方法
　ＳＣＧ／Ｋｊマウスを頚椎脱臼により安楽死させ、開腹により腎臓検体を採取し４０％パラフィンブロックを作製し、組織切片をつくり、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行い、皮下出血を組織学的に評価した。１０％ホルマリン液に２４時間以上浸透させ固定させる。水道水で１時間以上ホルマリンを洗浄し、６０％エタノール１時間、７０％エタノール１時間、８０％エタノール１時間、９５％エタノール１時間、１００％エタノール１時間を３回、キシレン１時間を２回、パラフィン（６５℃に保温）１時間を３回浸し、その後包埋ザラで組織ブロックを作製する。組織ブロックを、ミクロトームを用いて厚さ２０~５０ｎｍで切り、組織切片とする。切片はスライドガラスに張り付け、脱パラフィン処理を行う。脱パラフィン処理は完全に乾いた組織切片の載ったスライドガラスにキシレンに５分間を３回、１００％エタノール１分間を２回、９５％エタノールに軽く洗浄し、８０％、７０％、６０％エタノール、水道水という順で同様に軽く洗浄し、イオン交換水に浸し、次にマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行う。媒染液（１０％トリクロル酢酸水溶液、１０％重クロム酸カリウム水溶液）に１０~１５分浸し、水道水で５分間洗浄、鉄ヘマトキシリン液（２ｇヘマトキシリン１００％エタノール１００ｍｌ溶液、０．５ｇ硝酸第二鉄（ＩＩＩ）・９Ｈ２Ｏ、２５％塩酸１００ｍｌ溶液）に５分浸し、軽く水洗いをする。１％塩酸７０％エタノール溶液で分別を行う。水洗いを１０分間行い色出しし、イオン交換水に浸す、Ｉ液（１％ビーブリッヒスカーレット９０ｍｌ、１％酸性フクシン１０ｍｌ、酢酸１ｍｌ）に２~５分浸し、軽く水洗いを行う。ＩＩ液（５ｇリンモリブデン酸、５ｇリンタングステン酸　蒸留水２００ｍｌ）３０分以上浸し、軽く水洗いを行い、ＩＩＩ液（２．５ｇアニリン青、２ｍｌ酢酸、蒸留水１００ｍｌ）５分浸し、軽く水洗いを行う。１％酢酸水に５分浸し、素早く水洗いをする。６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと軽く洗浄し、１００％エタノール５分３回浸す。キシレン５分を３回浸し、封入液を用いてカバーガラスで組織を覆う。スライドガラスを乾燥させた後に顕微鏡で観察した。また、同様の組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色も行った。脱パラ処理後、水道水で流水洗浄を３~５分間行い、マイヤーヘマトキシリン液に５分間浸した。２５~３７℃の流水で洗浄を３~５分間行い、エオシン液に５分間浸した。６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと軽く洗浄し、１００％エタノール５分３回浸す。キシレン５分を３回浸し、封入液を用いてカバーガラスで組織を覆う。スライドガラスを乾燥させた後に顕微鏡で観察した。どちらの染色方法においても、ラクトフェリン含有飼育餌群の腎臓は非含有餌群と比べ組織の間質線維化、炎症細胞浸潤（ｕｐｐｅｒ）、半月体形成（ｌｏｗｅｒ）が非投与群よりも軽度であった［図４−Ｃ］。
［実施例５］　局所シュワルツマン反応（Ｌｏｃａｌ　Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＳＲ））モデルによるラクトフェリンの治療効果（非自己免疫疾患モデル）
１．ＬＳＲモデル１の作製と評価１
　６週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊを２週間慣らし、８週齢からラクトフェリン含有食餌または対照餌を２週間与えた。１０週齢目に大腸菌由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ）ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に溶解し、マウス１匹当たり１００μｇを３０Ｇ針により皮下注射し、１日目とした。マウス組換え体ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．品番４１０−ＭＴ）を１００μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に溶解し、マウス１匹当たり０．３μｇを同部位に皮下注射し、２日目とした。３日目に、同部位の出血を肉眼的に評価した。ラクトフェリン含有食餌群は対照群と比べ皮下出血の範囲を顕著に抑制した。皮下出血の重症度を出血範囲と壊死所見から肉眼的に０，なし；１，軽症；２，中等症；３，重症；４，中心壊死に分類し点数化したところ［表２］、対照群に比較しラクトフェリン含有食餌群では有意に重症度が低下した（ｐ＜０．０００１）［図５−Ａ、Ｂ］。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２．組織評価方法
　［実施例５］の「１．ＬＳＲモデル１の作製と評価」で作製したマウスを頚椎脱臼により安楽死させ、皮膚検体を採取し４０％パラフィンブロックを作製し、組織切片をつくり、マッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行い、皮下出血を組織学的に評価した。１０％ホルマリン液に２４時間以上浸透させ固定させる。水道水で１時間以上ホルマリンを洗浄し、６０％エタノール１時間、７０％エタノール１時間、８０％エタノール１時間、９５％エタノール１時間、１００％エタノール１時間を３回、キシレン１時間を２回、パラフィン（６５℃に保温）１時間を３回浸し、その後包埋ザラで組織ブロックを作製する。組織ブロックを、ミクロトームを用いて厚さ２０~５０ｎｍで切り、組織切片とする。切片はスライドガラスに張り付け、脱パラフィン処理を行う。脱パラフィン処理は完全に乾いた組織切片の載ったスライドガラスにキシレン５分間を３回、１００％エタノール１分間を２回、９５％エタノールに軽く洗浄し、８０％、７０％、６０％エタノール、水道水という順で同様に軽く洗浄し、イオン交換水に浸し、次にマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ　Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行う。媒染液（１０％トリクロル酢酸水溶液、１０％重クロム酸カリウム水溶液）に１０~１５分浸し、水道水で５分間洗浄、鉄ヘマトキシリン液（２ｇヘマトキシリン１００％エタノール１００ｍｌ溶液、０．５ｇ硝酸第二鉄（ＩＩＩ）・９Ｈ２Ｏ、２５％塩酸１００ｍｌ溶液）に５分浸し、軽く水洗いをする。１％塩酸７０％エタノール溶液で分別を行う。水洗いを１０分間行い色出しし、イオン交換水に浸す、Ｉ液（１％ビーブリッヒスカーレット９０ｍｌ、１％酸性フクシン１０ｍｌ、酢酸１ｍｌ）に２分~５分浸し、軽く水洗いを行う。ＩＩ液（５ｇリンモリブデン酸、５ｇリンタングステン酸　蒸留水２００ｍｌ）３０分以上浸し、軽く水洗いを行い、ＩＩＩ液（２．５ｇアニリン青、２ｍｌ酢酸、蒸留水１００ｍｌ）５分浸し、軽く水洗いを行う。１％酢酸水に５分浸し、素早く水洗いをする。６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと軽く洗浄し、１００％エタノールに５分間、３回浸す。キシレン５分間、３回浸し、封入液を用いてカバーガラスで組織を覆う。スライドガラスを乾燥させた後に顕微鏡で観察した。また、同様の組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色も行った。脱パラ処理後、水道水で流水洗浄を３~５分間行い、マイヤーヘマトキシリン液に５分間浸した。２５~３７℃の流水で洗浄を３~５分間行い、エオシン液に５分間浸した。６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと軽く洗浄し、１００％エタノール５分３回浸す。キシレン５分を３回浸し、封入液を用いてカバーガラスで組織を覆う。スライドガラスを乾燥させた後に顕微鏡で観察した。
　どちらの染色方法においても、最後に、同様の組織切片顆粒球中のエストラーゼのみに染まる特異的エストラーゼ染色法（クロロアセテートエステラーゼ）を行った。脱パラ処理後、水道水で流水洗浄を３~５分間行い、蒸留水で３回洗浄する。組織を室温にて１０~３０分間乾燥させ、クロロアセテートエストラーゼ反応液に室温で１５~３０分間浸す。水道水で流水洗浄を３~５分間行い、マイヤーヘマトキシリン液に５分間浸した。２５~３７℃の流水で洗浄を３~５分間行い、エオシン液に５分間浸した。６０％、７０％、８０％、９５％エタノールと軽く洗浄し、１００％エタノール５分３回浸す。キシレン５分を３回浸し、封入液を用いてカバーガラスで組織を覆う。スライドガラスを乾燥させた後に顕微鏡で観察した。非含有食餌群では筋層上部における皮下出血所見および血管内における血栓形成が著明であるのに対し、ラクトフェリン含有食餌群ではこれらの所見が軽度であり、皮下組織における好中球浸潤がラクトフェリン含有飼育餌群で抑制していることが観察された［図５−Ｃ］。
３．ＬＳＲモデル２の作製と評価２
　背部皮下にエアパウチを作製しＬＳＲを惹起させ、エアパウチ内のＤＮＡ濃度測定および好中球の観察を行った。まずに背部皮下に５ｍｌ用の注射器に３０Ｇ針で勢いよく５ｍｌの空気を皮下に注射し、３日後に一匹あたりＬＰＳ　１００μｇをエアパウチ内に注入した。その２４時間後０．３μｇのＴＮＦ−αをエアパウチ内へ注入しさらに６時間後に２ｍｌの滅菌ＰＢＳ（−）で洗浄し、回収した。
４．エアパウチ（洗浄液）内ＤＮＡ濃度測定
　採取した洗浄液を１．５ｍｌ微小遠心チューブに移し、室温、６０００ｇで５分間遠心し、上澄み中のＤＮＡ濃度をＰｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔを用い、測定方法は付随のプロトコルに沿って行った。ラクトフェリン含有色餌群が非含有色餌群と比べ血中ＤＮＡ量が低く、ＮＥＴｓによるＤＮＡの放出が顕著に抑制されていた（ｐ＝０．００１５）［図６−Ａ］。
５．好中球ＮＥＴｓ形成観察
　洗浄液中の好中球はサイトスピン２（Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いてスライドグラス上に固定し、５μＭ　ＤＲＡＱ５で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。対照群と比較し、ラクトフェリン含有食餌群においてＮＥＴｓ形成が見られる好中球が減少した［図６−Ｂ］。
［実施例６］　ラクトフェリン尾静脈投与によるヒストン血栓（播種性血管内凝固（ＤＩＣ））モデルマウスに対する生存率・生存延長の改善効果
　１１週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生理食塩水に溶解し３７℃に保温したヒストン（ｓｉｇｍａ，Ｈ９２５０）を８０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与することによりＤＩＣモデルマウスを作製した（Ｔｏｂｉａｓ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２９　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１１，ｖｏｌ．１１８，ｎｏ．１３，ｐ．３７０８−３７１４）。前処理としてウシラクトフェリン（ｎ＝８）を２０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与し、その３０分後に、ヒストンを尾静脈内投与し、ラクトフェリン治療群とした。無治療対称群としてウシラクトフェリンが含まれていない生理食塩水（ｎ＝８）１００μｌをヒストン投与３０分前に尾静脈内投与した。ヒストン投与後からの生存率・生存延長の評価はカプラン・マイヤー法を用いて評価した。無治療対象群は、ヒストン投与の約２０分後から徐々に死に始め、、２日後には２匹、４日後に１匹となったが、ウシラクトフェリン投与群は４日たっても、８匹全て生存し、生存率と生存延長の効果が顕著に見られた（図７：統計的有意差ｐ＝０．０００５）。
［実施例７］　ラクトフェリン尾静脈投与によるヒストン血栓モデルマウスに対する止血効果（出血時間）
　１１週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに前処理としてウシラクトフェリン（ｎ＝５）を２０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与し、その３０分後、生理食塩水に溶解し３７℃に保温したヒストン（ｓｉｇｍａ，Ｈ９２５０）を６０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与することによりＤＩＣモデルマウスの止血効果を調べた（Ｔｏｂｉａｓ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１；１１８：ｐ．３７０８−３７１４）（生存率・生存延長に使用したヒストンの７５％量を採用）。無治療対称群としてウシラクトフェリンが含まれていない生理食塩水（ｎ＝５）１００μｌをヒストン投与３０分前に尾静脈内投与した。健常コントロール群（ｎ＝５）としてウシラクトフェリンの前処理とヒストン処理の代わりに、各々、生理食塩水を用いた。ヒストン投与２０分後に尾静脈を末端から３ｍｍで切断して３７℃の生理食塩水に浸し、３０秒毎に濾紙で血液を拭い出血時間を測定した（出血時間が１５分以上掛る場合は１５分として止血処置を行った）（Ｆｕｃｈｓ　ＴＡ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１；１１８：３７０８−３７１４）。無治療対称群では著しい出血時間延長が見られたが（図８：無治療対称群対健常コントロール：Ｐ＜０．０００１）、ウシラクトフェリン投与群は有意に出血時間を短縮した（図８：ウシラクトフェリン投与群対無治療対称群：Ｐ＜０．０００１）。
［実施例８］　ヒストン血栓モデルに対するラクトフェリンの肺組織出血抑制効果
　１１週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに前処理としてウシラクトフェリン（ｎ＝４）を２０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与し、その３０分後、生理食塩水に溶解し３７℃に保温したヒストン（ｓｉｇｍａ，Ｈ９２５０）を８０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与することによりＤＩＣモデルマウスを作製したＴｏｂｉａｓ　Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２９　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１１，；ｖｏｌ．１１８：ｎｏ．１３，ｐ．３７０８−３７１４）。無治療対称群としてウシラクトフェリンが含まれていない生理食塩水（ｎ＝４）１００μｌをヒストン投与３０分前に尾静脈内投与した。健常コントロール（ｎ＝４）としてウシラクトフェリンの前処理とヒストン処理の代わりに、各々、生理食塩水を用いた。ヒストン（２回目の生理食塩水）投与１０分後にマウスを安楽死させ、肺組織を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを用いて肺組織を固定した。無治療対称群と比べ、ウシラクトフェリン投与群は組織出血が殆ど見られず、肺組織はコントロール群と同じような色彩であった（図９）。無治療対称群は、肺組織色の赤みが増加し、組織出血が見られた（図９）。
［実施例９］　ＮＥＴｓ形成阻害がラクトフェリンに特異的な活性であることの確認実験
　ラクトフェリンは、そのＮ末端部分が正に帯電していることから、負の電荷を持つＤＮＡ分子と結合することができると報告されている（Ｈｅ　Ｊ，ａｎｄ　Ｆｕｒｍａｎｓｋｉ　Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ　ｔｏ　ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９５；３７３（６５１６）：７２１−４．）。そこで、ラクトフェリンに近い分子量（ＭＷ）及び等電点（ｐＩ）を有する別の種類のタンパク質により、ＮＥＴｓ形成を阻害することができるかどうかを検討する実験を行った。実験には以下のタンパク質を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　アンジオジェニンは腫瘍血管新生因子として知られ（Ｓｔｒｙｄｏｍ　ＤＪ，Ｆｅｔｔ　ＪＷ，Ｌｏｂｂ　ＲＲ，Ａｌｄｅｒｍａｎ　ＥＭ，Ｂｅｔｈｕｎｅ　ＪＬ，Ｒｉｏｒｄａｎ　ＪＦ，ａｎｄ　Ｖａｌｌｅｅ　ＢＬ．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８５；２４：５４８６−９４．）、ラクトペロシキダーゼはラクトフェリンと同様、哺乳動物の乳に高濃度で含まれるヘムペロキシダーゼである（Ｓｈａｒｍａ　Ｓ，Ｓｉｎｇｈ　ＡＫ，Ｋａｕｓｈｉｋ　Ｓ，Ｓｉｎｈａ　Ｍ，Ｓｉｎｇｈ　ＲＰ，Ｓｈａｒｍａ　Ｐ，Ｓｉｒｏｈｉ　Ｈ，Ｋａｕｒ　Ｐ，ａｎｄ　Ｓｉｎｇｈ　ＴＰ．Ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｌｉｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２０１３；４：１０８−２８．）。
１．ラクトペロキシダーゼ、アンジオジェニン及びラクトフェリンの調製
　ウシの乳から単離した粗タンパク質を１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、得られた溶液を同バッファーで平衡化したＳＰ−セファロースカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にローディングした（流速毎分３．０ｍｌ）。カラムに結合したタンパク質を前記バッファーで洗浄し、同バッファー中の塩化ナトリウム直線濃度勾配（０．３~１．０Ｍ）によってラクトペロキシダーゼ、アンジオジェニン及びラクトフェリンを溶出した。
２．ＮＥＴｓ形成阻害
　ＮＥＴｓ形成阻害は、［実施例２］と同様の手法で培養上清中のＤＮＡ濃度を測定することにより行った。実験は、３つの独立した系で重複して行った（ｎ＝３）。
３．結果
　ラクトペロキシダーゼ及びアンジオジェニンはＮＥＴｓ形成を阻害することはできなかった（図１０：ｐ＜０．０１）。これは、ラクトフェリンによるＮＥＴｓ形成阻害が、単にラクトフェリン分子の正電荷のみにより生じているものではなく、ラクトフェリンに固有の活性によるものであることを示している。
［図のデータの説明］
［図１］健常人末梢血好中球をＮＥＴｓ形成刺激の３０分前にラクトフェリンを添加し、ＮＥＴｓ形成阻害効果の試験結果を示す。（Ａ）ウシラクトフェリン（今後全図面中「ｂＬＦ」と表記）を２、２０、２００μｇ／ｍｌで前処理を行うと、濃度依存的にＮＥＴｓ形成阻害効果が見られ、ＮＥＴｓ形成刺激　対　ウシラクトフェリン２０μｇ／ｍｌの前処理ではｐ＜０．０１、ＮＥＴｓ形成刺激　対　ウシラクトフェリン２００μｇ／ｍｌの前処理ではｐ＜０．００１と統計的有意差が得られた。１０μＭ　ＤＰＩはポジティブコントロールとして使用。（Ｂ）ヒトラクトフェリン（今後前図面中「ｈＬＦ」と表記）を２、２０、２００μｇ／ｍｌで前処理を行うと、ウシラクトフェリンと同様にＮＥＴｓ形成阻害効果が見られ、ｐ＜０．００１と統計的有意差が得られた。（Ｃ）ヒトラクトフェリン２００μｇ／ｍｌの前処理画像を示す。細胞外のＤＮＡは５００ｎＭ　ＳＹＴＯＸ　ｇｒｅｅｎで染色した。ヒトラクトフェリン前処理により細胞外にＤＮＡの放出が阻害されていることが観察できる。（Ｄ）ヒトラクトフェリンで前処理を行い、ＮＥＴｓ刺激３時間後の培養上清中のＤＮＡ濃度を測定した。ＮＥＴｓ刺激により細胞外に分泌されたＤＮＡ濃度がウシラクトフェリンの濃度依存的に抑制され、ＮＥＴｓ形成刺激対ヒトラクトフェリン２０μｇ／ｍｌの前処理ではｐ＜０．０５、ＮＥＴｓ形成刺激対ヒトラクトフェリン２００μｇ／ｍｌの前処理ではｐ＜０．００１と統計的有意差が得られた。（Ｅ）ヒトラクトフェリン２００μｇ／ｍｌで前処理を行い、ＮＥＴｓ刺激３時間後の好中球を電子顕微鏡により分析した走査型電子顕微鏡の画像を示す。無刺激の好中球は球形が保たれＤＮＡの放出がみられないが、ＰＭＡ刺激により細胞は崩れ線維成分が形成された。一方でヒトラクトフェリン前処理を行った好中球ではこの線維成分が束状になり、ＮＥＴｓの線維を縮合させている。
［図２］健常人末梢血好中球をＮＥＴｓ形成刺激後にラクトフェリンを添加し、ＮＥＴｓ形成阻害効果の試験結果を示す。２００μｇ／ｍｌヒトラクトフェリン３０分前処理をおこなったものをコントロールとした。ＮＥＴｓ刺激後、１時間、２時間後に２００μｇ／ｍｌヒトラクトフェリンを添加したところ、ＮＥＴｓ形成阻害が認められた（測定は培養上清中のＤＮＡ濃度を用いた）。ＮＥＴｓ形成刺激　対　刺激１時間後ラクトフェリンを添加したものと、ＮＥＴｓ形成刺激　対　刺激２時間後ラクトフェリンを添加したものと、各々ｐ＜０．００１と統計的有意差が得られた。
［図３］自己免疫疾患モデルであるＡＮＣＡモデルＳＣＧ／ｋｊマウスの生存率に及ぼすラクトフェリンの影響についての試験結果を示す。生後８週齢からウシラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝１６）とウシラクトフェリン非含有飼育餌群（ｎ＝１６）に分け、１８週齢までのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。ラクトフェリン含有飼育餌群が顕著に生存率の改善が見られ、ｐ＜０．０５と統計的有意差が得られた。
［図４］ＳＣＧ／ｋｊマウスに対するラクトフェリン投与が血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体価と血中ＤＮＡ、腎臓組織に与える影響についての試験結果を示す。（Ａ）ＮＥＴｓ形成疾患の一つであるＡＮＣＡ血管炎モデル動物ＳＣＧ／ｋｊマウスは疾患発症に関わるＭＰＯ−ＡＮＣＡを生産する。１２週齢でのＳＣＧ／ｋｊのＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定するとウシラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝８）ではウシラクトフェリン非含有飼育餌群（ｎ＝８）よりも低値であり、ｐ＜０．０５と統計的有意差が得られた。（Ｂ）ＮＥＴｓ形成により好中球から放出されるＤＮＡを含んだ血液中のＤＮＡ含量を評価した。１３週齢でのＳＣＧ／ｋｊの血漿中ＤＮＡ濃度はラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝８）ではウシラクトフェリン非含有飼育餌群（ｎ＝７）よりも低値でありｐ＜０．０５と統計的有意差が得られた。（Ｃ）ウシラクトフェリンによるＳＣＧ／ｋｊマウスの腎臓に与える影響をマッソントリクロ—ム染色を用いて評価した。ウシラクトフェリン含有飼育餌群の腎臓は非含有餌群と比べ組織の間質線維化、炎症細胞浸潤（ｕｐｐｅｒ）、半月体形成（ｌｏｗｅｒ）が非含有餌群よりも軽度であった。
［図５］非自己免疫疾患モデルであるＬＳＲモデル１マウスに対するラクトフェリン投与が皮下組織に与える影響についての試験結果を示す。（Ａ）８週齢のＣ５７ＢＬ／６ｊにウシラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝１６）と非含有餌群（ｎ＝１５）に分け、２週間後の１０週例目にＬＰＳ（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ）およびＴＮＦα（０．３μｇ／ｍｏｕｓｅ）を皮下注射し、皮膚の発赤（皮下出血）を惹起したマウスの一部の画像。ウシラクトフェリン含有飼育餌群は非含有餌群に比較し皮膚発赤が著明に抑制されている。（Ｂ）表２に示す皮下出血の評価スコアを用いて定量したグラフである。ウシラクトフェリン含有飼育餌群は非含有餌群と比べ皮下出血スコアが低値であり、ｐ＜０．００１と統計的有意差が得られた。（Ｃ）ＬＳＲを惹起したマウス皮膚組織のマッソントリクロ—ム染色とエストラーゼ染色による評価。ウシラクトフェリン含有飼育餌群において皮下出血および血栓形成が抑制されている。エステラーゼ染色により好中球浸潤がウシラクトフェリン含有飼育餌群で抑制されている。
［図６］非自己免疫疾患モデルであるＬＳＲモデル２マウスに対するウシラクトフェリン投与が背部皮下エアパウチ内に与える影響についての試験結果を示す。
（Ａ）マウスの背部皮下にエアパウチを作製し、炎症刺激なし群（ｎ＝１２：１００μｇ／匹のＬＰＳ：０．３μｇ／匹のＴＮＦ−α）、非含有飼育餌群（ｎ＝１２：１００μｇ／匹のＬＰＳ：０．３μｇ／匹のＴＮＦ−α）、及びラクトフェリン含有飼育餌群（ｎ＝１２）に分け、エアパウチ内を洗浄し、洗浄液中のＤＮＡ濃度を測定した。非含有飼育餌群と比べウシラクトフェリン含有飼育餌群は無刺激群近くまで洗浄液中のＤＮＡ濃度が減少し、ｐ＜０．０１と統計的有意差が得られた。（Ｂ）エアパウチ洗浄液中の好中球のＤＮＡをＤＲＡＱ５により染色した図。ウシラクトフェリン含有飼育餌群は非含有飼育餌と比べ、ＤＮＡの放出が殆ど見られず、ＮＥＴｓ形成が阻害されている。
［図７］ヒストン投与後からの生存率・生存延長の評価の結果を示す。無治療対象群は、ヒストン投与の約２０分後から徐々に死に始め、２日後には２匹、４日後に１匹となったが、ウシラクトフェリン投与群は４日たっても、８匹全て生存し、生存率と生存延長の効果が顕著に見られた（統計的有意差ｐ＝０．０００５）。
［図８］ラクトフェリン尾静脈投与によるヒストン血栓モデルマウスに対する止血効果を示す。無治療対称群では著しい出血時間延長が見られたが（無治療対称群対健常コントロール：Ｐ＜０．０００１）、ウシラクトフェリン投与群は有意に出血時間を短縮した（ウシラクトフェリン投与群対無治療対称群：Ｐ＜０．０００１）。
［図９］ヒストン血栓モデルに対するラクトフェリンの肺組織出血抑制効果を示す。無治療対称群と比べ、ウシラクトフェリン投与群は組織出血が殆ど見られず、肺組織はコントロール群と同じような色彩であった。無治療対称群は、肺組織色の赤みが増加し、組織出血が見られた。
［図１０］ＮＥＴｓ形成阻害がラクトフェリンに特異的な活性であることを示す。ＮＥＴｓ形成はラクトフェリンだけが阻害することができ、ラクトペロキシダーゼ及びアンジオジェニンはＮＥＴｓ形成を阻害することはできなかった（図１０：ｎ＝３，ｐ＜０．０１）。
　本発明は、白血球の細胞外トラップ形成により生じる疾患に対し、副作用の少ない治療方法を提供することができる。また、副作用の低さがゆえに、広範囲の患者及び患者予備軍に安心して使用できるという利点を有する。
　また、非自己免疫疾患モデルにおいて本発明による白血球の細胞外トラップ形成阻害能が確認されたことから、本発明において、ラクトフェリンは、過去に報告された作用機序（特許文献１）とは異なる、全く新規な作用機序により治療作用を示すといえる。
配列表

Claims (15)

  1. 　ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤。
  2. 　ラクトフェリンが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、請求項１に記載の阻害剤。
  3. 　前記ラクトフェリンはヒト由来のものである、請求項１に記載の阻害剤。
  4. 　前記ラクトフェリンが以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質である、請求項１に記載の阻害剤。
    　（ａ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
    　（ｂ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質；
    　（ｃ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質
  5. 　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項１~５のいずれか一項に記載の阻害剤。
  6. 　前記白血球が好中球である、請求項５に記載の阻害剤。
  7. 　ラクトフェリンを含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物。
  8. 　ラクトフェリンが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、請求項７に記載の組成物。
  9. 　前記ラクトフェリンはヒト由来のものである、請求項７に記載の組成物。
  10. 　前記ラクトフェリンが以下の（ａ）~（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれか１つに記載のタンパク質である、請求項７に記載の組成物。
    　（ａ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるタンパク質；
    　（ｂ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列において、１~６６個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質；
    　（ｃ）配列番号１~５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有するタンパク質
  11. 　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項７~１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 　前記疾患は、ＡＮＣＡ関連血管炎、全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）及び播種性血管内凝固からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項７~１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 　食品の形態にある、請求項７~１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　注射剤の形態にある、請求項７~１２のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 　経口投与されるものである、請求項７~１３のいずれか一項に記載の組成物。
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