JP2021050160A

JP2021050160A - 自己免疫疾患治療剤

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Publication number: JP2021050160A
Application number: JP2019174234A
Authority: JP
Inventors: 紘太郎松本; Kotaro Matsumoto; 竹内　勤; Tsutomu Takeuchi; 勤竹内; 桂子吉本; Keiko Yoshimoto; 鈴木　勝也; Katsuya Suzuki; 勝也鈴木
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-04-01
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: JP7458049B2

Abstract

【課題】本発明は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）の形成を特徴とする自己免疫疾患に対する治療剤の提供を課題とする。【解決手段】ＣＸＣＬ４によるＮＥＴｓ形成誘導作用を阻害する物質を含む、自己免疫疾患治療剤が提供される。本発明の治療剤は、血小板から分泌され好中球におけるＮＥＴｓ形成を誘導するＣＸＣＬ４の作用を阻害し、ＮＥＴｓの過剰形成を抑制することにより、ＮＥＴｓの形成を特徴とする自己免疫疾患を治療することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、ＣＸＣＬ４阻害性物質を有効成分とする、自己免疫疾患の治療剤に関する。より具体的には、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）の形成過剰を示す自己免疫疾患の治療剤に関する。

自己免疫疾患とは、免疫系の機能に異常が生じ、内因性抗原（自己抗原）に対する抗体の産生などにより免疫系が自己組織を障害することを特徴とする疾患である。自己組織がどのようなメカニズムで免疫原性を有するようになるのかは十分に明らかになっておらず、自己免疫疾患の病因は多くの場合、不明である。

自己免疫疾患は多彩であり、多くの種類の疾患が知られている。また、同じ疾患でも冒された体の部位によって様々な症状を呈することが知られている。

自己免疫疾患の中には、原因がわからないまま発症し、自然に治癒する場合もあるが、多くの場合は慢性化する。原因不明の疾患であるため、根本治療を行うこともできず、長期の療養を必要とすることから、自己免疫疾患はいわゆる難病であると捉えられている。我が国では、悪性関節リウマチ、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症など、多くの自己免疫疾患が指定難病に挙げられている。また、これらの疾患は、障害者総合支援法の対象疾病（難病等）にも指定されており、支援対象とされている。

自己免疫疾患に対しては、通常、薬剤によって症状をコントロールすることが臨床的に行われているが、十分な効果がもたらされないことも多く、より効果的な治療に対する高いニーズが存在する。

好中球細胞外トラップ（Neutrophil Extracellular Traps；ＮＥＴｓ）は、好中球に生じる細胞外構築物であって、血中や末梢組織において認められる。ＮＥＴｓは好中球のクロマチンに由来する繊維により形成される網状の構造物であって、クロマチンに含まれる核酸やタンパク質に加え、好中球から放出された細胞質成分も包含している。

ＮＥＴｓは、細菌感染等により好中球が刺激されることによって形成され、血中や末梢組織において病原性細菌等を捕獲し、殺菌することで生体防御機能を果たすと考えられている。しかし、その形成のメカニズムや生理的な機能についてはまだ不明な点も多い。

生体防御に働く一方で、ＮＥＴｓの過剰形成は悪影響をもたらすことがあることも知られている。例えば、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）といった膠原病においては、ＮＥＴｓ形成が認められており、様々な炎症症状を示す自己免疫疾患においてＮＥＴｓが病態形成に関与していると考えられている。

これまでの研究から、ＮＥＴｓはＳＬＥ等の疾患マーカーとなり得ることや、ＮＥＴｓを標的とする疾患の治療が提案されてきた（非特許文献１、特許文献１及び２）。しかしながら、これまで、ＮＥＴｓ形成の過剰を特徴とする疾患を治療する薬剤として承認された医薬は存在していない。

国際公開第２０１６／０５６６６５号国際公開第２０１６／１１８４７６号

Barnado et al., J. Leukoc. Biol. (2016) vol. 99, pp. 265-278

本発明の課題は、自己免疫疾患、より具体的には、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）の形成過剰を示す自己免疫疾患の治療のために有用な医薬組成物を提供することにある。

本発明者らは、ＡＡＶ等のＮＥＴｓ形成の過剰を特徴とする自己免疫疾患において、好中球によるＮＥＴｓ形成を誘導には血小板の活性化が寄与するとの仮説に基づき、当該仮説の実験的な検証を試みた。そして、さらに研究を鋭意進めたところ、血小板から放出される液性因子がＮＥＴｓ形成を誘導すること、当該液性因子の分子的な実体がケモカイン受容体リガンドの一種であるＣＸＣＬ４であること、及び、ＣＸＣＬ４阻害性物質を投与することにより当該誘導作用を抑制できることを見いだした。そして、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。

より詳細には、本発明は、以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）ＣＸＣＬ４阻害性物質を含有してなる、自己免疫疾患の治療剤。
（２）自己免疫疾患が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である、前記（１）に記載の治療剤。
（３）ＮＥＴｓ形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患が、血管炎症候群、全身性強皮症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（２）に記載の治療剤。
（４）ＮＥＴｓ形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患が、血管炎症候群である、前記（３）に記載の治療剤。
（５）血管炎症候群が小型血管炎又は中型血管炎である、前記（３）又は（４）に記載の治療剤。
（６）血管炎症候群が小型血管炎である、前記（５）に記載の治療剤。
（７）小型血管炎が、ＡＮＣＡ関連血管炎である、前記（５）又は（６）に記載の治療剤。
（８）ＡＮＣＡ関連血管炎が、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、及び好酸球性多発血管炎性肉芽腫症からなる群から選択される疾患である、前記（７）に記載の治療剤。
（９）血管炎症候群が中型血管炎である、前記（５）に記載の治療剤。
（１０）中型血管炎が、結節性多発動脈炎である、前記（５）又は（９）に記載の治療剤。
（１１）非経口投与剤である、前記（１）乃至（１０）のいずれか一に記載の治療剤。
（１２）非経口投与剤が注射剤、点眼剤又は点鼻剤である、前記（１１）に記載の治療剤。
（１３）ＣＸＣＬ４阻害性物質が、抗ＣＸＣＬ４抗体、ＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマー、及びＣＸＣＬ４と特異的に結合する小分子からなる群から選択されるＣＸＣＬ４阻害性物質である、前記（１）乃至（１２）のいずれか一に記載の治療剤。
（１４）ＣＸＣＬ４阻害性物質が、抗ＣＸＣＬ４抗体である、前記（１３）に記載の治療剤。
（１５）抗ＣＸＣＬ４抗体がモノクローナル抗体である、前記（１３）又は（１４）に記載の治療剤。
（１６）抗ＣＸＣＬ４抗体が抗ヒトＣＸＣＬ４抗体である、前記（１３）乃至（１５）のいずれか一に記載の治療剤。
（１７）抗ＣＸＣＬ４抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、前記（１４）乃至（１６）のいずれか一に記載の治療剤。
（１８）抗ＣＸＣＬ４抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗ＣＸＣＬ４抗体の機能性断片である、前記（１３）乃至（１７）のいずれか一に記載の治療剤。

（１９）自己免疫疾患の治療剤製造のための、ＣＸＣＬ４阻害性物質の使用。
（２０）自己免疫疾患が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である、前記（１９）に記載の使用。
（２１）ＣＸＣＬ４阻害性物質が、抗ＣＸＣＬ４抗体、ＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマー、及びＣＸＣＬ４と特異的に結合する小分子からなる群から選択されるＣＸＣＬ４阻害性物質である、前記（１９）又は（２０）に記載の使用。

（２２）自己免疫疾患の治療方法における使用のための、ＣＸＣＬ４阻害性物質であって、抗ＣＸＣＬ４抗体、ＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマー、及びＣＸＣＬ４と特異的に結合する小分子からなる群から選択される、ＣＸＣＬ４阻害性物質。
（２３）自己免疫疾患が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である、前記（２２）に記載のＣＸＣＬ４阻害性物質。

（２４）有効量のＣＸＣＬ４阻害性物質を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法であって、前記ＣＸＣＬ４阻害性物質が抗ＣＸＣＬ４抗体、ＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマー、及びＣＸＣＬ４と特異的に結合する小分子からなる群から選択される、方法。
（２５）自己免疫疾患が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である、前記（２４）に記載の方法。
（２６）対象が自己免疫疾患を有する患者である、前記（２４）又は（２５）に記載の方法。
（２７）対象が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患を有する患者である、前記（２４）乃至（２６）のいずれか一に記載の方法。
（２８）ＣＸＣＬ４阻害性物質が、抗ＣＸＣＬ４抗体である、前記（２４）乃至（２７）のいずれか一に記載の方法。

本実施形態のＣＸＣＬ４阻害性物質、代表的には、抗ＣＸＣＬ４抗体を有効成分として含む自己免疫疾患の治療剤により、自己免疫疾患の治療を効果的に行うことができる。自己免疫疾患としては、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成過剰の病態を呈する自己免疫疾患が好ましい治療対象疾患となる。より具体的には、血管炎症候群、全身性強皮症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される自己免疫疾患の治療を行うことができる。血管炎症候群の例として、小型血管炎及び中型血管炎が挙げられる。これらのうち、小型血管炎の例としては、ＡＮＣＡ関連血管炎が、中型血管炎の例としては、結節性多発動脈炎を挙げることができる。特に、本実施形態の自己免疫疾患治療剤により、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、及び好酸球性多発血管炎性肉芽腫症からなる群から選択されるＡＮＣＡ関連血管炎の治療を効果的に行うことができる。また、本実施形態のＣＸＣＬ４阻害性物質、代表的には、抗ＣＸＣＬ４抗体を対象に投与する工程を含む方法によれば、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成過剰の病態を呈する自己免疫疾患の治療を行うことができる。

は、９６穴プレート (Corning, 米国)上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ又はＡＡＶ由来）を播種し、２時間培養後、Platelet Rich Plasma （ＰＲＰ；ＨＣ又はＡＡＶ由来）、ＰＲＰを遠心することで血小板を沈降させた上清をPlatelet Poor Plasma （ＰＰＰ；ＨＣ又はＡＡＶ由来）を添加し、共培養を行うことにより、好中球にＮＥＴｓ誘導が起きるかどうか試験した結果を示す。上段の各パネルは、ＮＥＴｓ形成を視覚的確認するために、スライドガラス上の好中球及び／又は血小板を５００ｎMのPicogreen (Thermo Fisher Scientific, 米国）とインキュベートし、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察した結果を示す。パネル（ａ）中のスケールバーは１００μｍを示す。各パネルの拡大率は等しい。各パネルの下には、上から順に、好中球のソース（ＨＣ又はＡＡＶ由来）、ＰＰＰのソース（ＨＣ由来、ＡＡＶ由来、又は不使用（−））、ＰＲＰのソース（ＨＣ由来、ＡＡＶ由来、又は不使用（−））、及びトランズウェル適用の有無（＋／-）を示す。

は、９６穴プレート上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ由来）を播種し、２時間培養後、ＰＲＰ（ＡＡＶ患者、ＳＬＥ患者、ＲＡ患者、又はＨＣ由来）、又はＰＰＰ（ＡＡＶ患者、ＳＬＥ患者、ＲＡ患者、又はＨＣ由来）を添加し、共培養を行うことにより誘導された好中球のＮＥＴｓを定量的に解析した結果を示す。縦軸のＤＮＡ濃度は、ＰＲＰを用いた共培養及びＰＰＰを用いた共培養によって誘導されたＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の差であり、血小板分画によって誘導されたＮＥＴｓの量と対応する。ｎ値はそれぞれサンプル数を示す。また、ｐ値は、ＡＡＶ患者の血小板分画によって誘導されたＮＥＴｓと、ＡＡＶ患者以外のソース由来の血小板分画によって誘導されたＮＥＴｓとの間で有意差検定を行った結果をそれぞれ示す。図中、各プロットは各被験者のデータを示し、水平線は平均値を示す。

は、９６穴プレート上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ由来）を播種し、２時間培養後、ＴＬＲ９リガンドで刺激したＰＲＰ（ＨＣ由来）を添加し、共培養を行うことにより誘導された好中球のＮＥＴｓを定量的に解析した結果を示す。ＴＬＲ９リガンドによる血小板の刺激は、ＰＲＰにＣｐＧ−ＤＮＡ (ＣｐＧ；Novus Biologics, Littleton, 米国) を２０μｇ／ｍＬ添加し、１６−１８時間処理することにより行った。図中、血小板（Platelet）「−」とは、刺激したＰＰＰを添加したことを示す。また、「ＣｐＧｃｏｎｔｒｏｌ」とは、ＴＬＲ９リガンドではないcontrol oligodeoxynucleotides (Novus Biologics, 米国) を意味し、図中最右はＴＬＲ９リガンドに代えてＣｐＧｃｏｎｔｒｏｌが２０μｇ／ｍＬを使用されたことを示す。「ＴＬＲ９ａｎｇａｔｏｎｉｓｔ」とは、ＴＬＲ９アンタゴニストであるヘキサヌクレオチド（ＴＴＡＧＧＧ；ＯＤＮＡ１５１ (Invigogen, 米国)）を意味し、図３上段の右から３本目のバーは、ＴＬＲ９リガンドと共にＴＬＲ９アンタゴニストが使用された場合の結果を示す。図中、水平線と共に示される＊は、水平線の左右端の位置に対応するバーの間で有意差（ｐ＜０．０５）が存在することを示す。

は、図３と同様の系と同様に、好中球（ＨＣ由来）とＰＲＰ（ＨＣ由来）との共培養を行い、培養後の上清に含まれるＣＸＣＬ４を定量的に解析した結果を示す。図中、水平線と共に示される＊は、水平線の左右端の位置に対応するバーの間で有意差（ｐ＜０．０５）が存在することを示す。縦軸のＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、キット（human CXCL4 ELISA kit (R&D Systems, 米国)を用いてＥＬＩＳＡ法で定量的解析をした結果として示されている。

は、９６穴プレート上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ由来）を播種し、２時間培養後、組換え体のＣＸＣＬ４(PeproTech, 米国)を０、２．５、１０又は２０μｇ／ｍＬ添加し、好中球を培養した結果を示す。上段の各パネルは、ＮＥＴｓ形成を視覚的確認するために、スライドガラス上の好中球及び／又は血小板を５００ｎMのPicogreen (Thermo Fisher Scientific, 米国）とインキュベートし、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察した結果を示す。パネル（ａ）中のスケールバーは１００μｍを示す。各パネルの拡大率は等しい。

は、ＡＡＶ患者（ｎ＝１７）及びＨＣ（ｎ＝７）を対象に、各被験者から血漿サンプルを調製し、血漿中ＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、キット（human CXCL4 ELISA kit (R&D Systems, 米国)を用いてＥＬＩＳＡ法で定量的解析をした結果を示す。また、ｐ値（ｐ＝０．０２２）は、ＡＡＶ患者の血漿中ＣＸＣＬ４濃度と、ＨＣ由来の血漿中ＣＸＣＬ４濃度との間で有意差検定を行った結果を示す。図中、各プロットは各被験者のデータを示し、水平線は平均値±標準偏差を示す。

は、９６穴プレート上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ由来）を播種し、２時間培養後、ＰＲＰ（ＡＡＶ患者由来）を添加し、共培養を行うことにより誘導された好中球のＮＥＴｓを定量的に解析した結果を示す。当該共培養において、ＣＸＣＬ４の機能を阻害する目的で抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体 (Ａｎｔｉ−ＣＸＣＬ４ａｎｔｉｂｏｄｙ；US Biological, 米国) が添加された。また、対照には、抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体に代えて非特異的なＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧが添加された。図中、縦軸は、ImageJ processing software (U. S. National Institutes of Health, 米国)を使用して定量的に解析し、算出したＮＥＴｓ領域（Picogreenの蛍光シグナルの陽性領域）の割合（％）を示す。図中、ｐ値（ｐ＝０．０２９）は、Ａｎｔｉ−ＣＸＣＬ４ａｎｔｉｂｏｄｙ使用時のＮＥＴｓ領域とＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ使用時のＮＥＴｓ領域との間で有意差検定を行った結果を示す。

本発明の自己免疫疾患の治療剤は、ＣＸＣＬ４阻害性物質を有効成分として配合することによって、医薬組成物として調製される。本発明の代表的な自己免疫疾患の治療剤は、ＣＸＣＬ４阻害性物質として抗ＣＸＣＬ４抗体を有効成分として配合することによって、医薬組成物として調製される。

ＣＸＣＬ４は、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーの１つであり、ＰＦ４（Platelet Factor 4）やＳＣＹＢ４とも呼ばれる。また、かつてはオンコスタチンと呼ばれてもいた。それゆえ、本明細書では、ＣＸＣＬ４との用語はＰＦ４、ＳＣＹＢ４及びオンコスタチンと同義とする。

ＣＸＣＬ４タンパク質（以下、単に「ＣＸＣＬ４」と言うことがある。）は活性化された血小板のα顆粒から放出されるケモカインである。ヒトのＣＸＣＬ４成熟タンパク質は７０アミノ酸残基からなるもので、生体内ではホモ４量体の形態をとり、ヘパリンに対して高い結合親和性を有することが知られている。また、ＣＸＣＬ４は血小板の凝集に関与すること、様々なタイプの細胞に対して走化性因子として働くこと、並びに、造血活性、血管新生及びＴ細胞機能に対して阻害的に作用することが知られている。

「ＣＸＣＬ４阻害性物質」とは、本明細書中では、好中球におけるＮＥＴｓ形成に対するＣＸＣＬ４の誘導作用を阻害する活性を有する物質を言い、当該活性を備える限りどのような構造を有する物質でも良い。ＣＸＣＬ４阻害性物質は、代表的には、ＣＸＣＬ４と特異的に結合する物質であって、抗ＣＸＣＬ４抗体、核酸アプタマー、及び小分子からなる群から選択される物質である。ＣＸＣＬ４の誘導作用を阻害する作用機序はどのようなものであっても良く、例えば、ＣＸＣＬ４受容体に対してＣＸＣＬ４と競合的に、又は非競合的に阻害作用を示すことが挙げられる。また、特定のＣＸＣＬ４受容体を介さないで発揮されるＣＸＣＬ４の作用に対して、ＣＸＣＬ４と特異的に結合すること等により、当該作用を阻害することであっても良い。

抗ＣＸＣＬ４抗体は、ＣＸＣＬ４と特異的に結合する物質（イムノグロブリン）であり、好ましくはヒトＣＸＣＬ４と特異的に結合する物質である。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても良い。また、後述のように、抗体の機能性フラグメントであっても良い。

抗ＣＸＣＬ４抗体の調製
本実施形態の治療剤で用いられる抗ＣＸＣＬ４抗体は、公知の標準的な方法によって作製することができる。例えば、７０アミノ酸残基からなるヒトＣＸＣＬ４全長ポリペプチド、又はフラグメントを免疫原として宿主動物に免疫することで抗体産生を惹起することができる。ＣＸＣＬ４フラグメントを用いる場合の免疫原となるポリペプチドの領域は任意に選択できるが、市販品を含め、多くの抗ＣＸＣＬ４抗体の調製例が公表されているので、当該公表された例を参考にすることが好ましい。
免疫原となるポリペプチドは公知の標準的な方法によって製造すれば良く、化学合成することや、組換えタンパク質として生化学的に合成することができる。また、商業的に提供される受託合成サービスを利用することでも入手できる。
免疫原となるポリペプチドは、それ自体を免疫しても良いし、当該ポリペプチドを含む組換え体タンパク質を膜上で提示する再構成膜又は組換え体細胞を免疫しても良い。免疫する宿主動物は特に制限されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ、又はラクダなどの動物種が好ましい。より好ましくはマウス又はラットであり、特に好ましくはマウスである。抗ＣＸＣＬ４抗体を含む抗血清は、公知の標準的な方法によって調製可能である。抗体としては、５種類の免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のいずれのクラスであっても良い。好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、より好ましくはＩｇＧである。

抗ＣＸＣＬ４モノクローナル抗体（抗ＣＸＣＬ４ｍＡｂ）の調製
抗ＣＸＣＬ４ｍＡｂは、前記の調製過程で得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させたのちクローン化してモノクローナル抗体を調製することができる。あるいは、遺伝子工学的な手法により、化学的に合成した抗体遺伝子を大腸菌などに発現させて作製することもできる。抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合方法、融合細胞を含む細胞群から所望の細胞をスクリーニングする方法、スクリーニングにより選抜した細胞を単クローン化する方法、及びクローンからｍＡｂを調製する方法は、いずれも公知の標準的な方法によって実施できる。配列情報に基づいて所望のｍＡｂを合成することも、公知の標準的な方法によって実施できる。

抗体の機能性断片
抗ＣＸＣＬ４抗体は、ＣＸＣＬ４に対して十分な特異性と親和力を示すことができれば、必ずしも免疫グロブリン分子全体の構造が維持されていなくてもよく、抗体の機能的断片（抗原結合性断片）であってもよい。抗体の抗原結合能は、抗体の可変部に支配されているので、免疫グロブリン分子のうち定常領域の部分は必ずしも存在しなくてもよい。従って、本実施形態の抗体の機能的断片としては、免疫グロブリン分子の可変部からなる断片である、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦａｂからＶＬを取り除いたＦｄ、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）及びその二量体であるｄｉａｂｏｄｙを挙げることができる。あるいは、ｓｃＦｖからＶＬを取り除いた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などを用いることができるが、抗体の機能性断片はこれらに限定されない。Ｆｃ領域を含まない抗体フラグメントを利用した場合、免疫複合体がＦｃ受容体と結合して好中球を刺激する可能性を回避できる。本実施形態の治療剤は自己免疫疾患の治療を目的とするため、Ｆｃ領域を含まない抗ＣＸＣＬ４抗体フラグメントは、本実施形態の治療剤の有効成分として好ましい。
抗体の機能性断片は、公知の手法により調製することができる。例えば、免疫グロブリン分子を酵素処理することにより断片化できる。免疫グロブリン分子をパパインにより分解することでＦａｂが得られ、ペプシンにより分解することでＦ（ａｂ’）_２が得られ、Ｆ（ａｂ’）_２を還元処理することによりＦａｂ’が得られる。また、遺伝子工学的手法により、抗体の重鎖可変部（ＶＨ）と軽鎖可変部（ＶＬ）を可動性に富むリンカーペプチドで連結することによりｓｃＦｖを作製することもできる。

キメラ抗体、ヒト化抗体
抗ＣＸＣＬ４ｍＡｂは、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。このような抗体として、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体がある。これらの改変型抗体は、公知の方法により作製可能である。
キメラ抗体は、本実施形態の抗ＣＸＣＬ４ｍＡｂの可変（Ｖ）領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常（Ｃ）領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより調製することができる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植（ＣＤＲグラフト）したものである。その調製は、一般的な遺伝子組換え手法を適用して適宜実施することができる。例えば、マウス抗ＣＸＣＬ４ｍＡｂの各ＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するアミノ酸配列をコードするように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した複数のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成すれば良い。例えば、ＷＯ９８／１３３８８号に記載の方法により行うことができる。ヒト抗体の可変領域のＦＲは、公表されたＤＮＡデータベース等から得ることができる。
キメラ抗体及びヒト化抗体の定常領域としては、ヒト抗体のものを用いることができる。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を用いればよく、軽鎖においては、Ｃκ、Ｃλを用いればよい。
これらのキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における異種抗原性が低下されているため、ヒト生体内での半減期も長く本実施形態の治療剤の有効成分として有用である。

抗ＣＸＣＬ４抗体は、新規に取得されたものに限定されず、公知の抗ＣＸＣＬ４抗体（抗ＰＦ４抗体）を入手又は調製したものでも良い。
市販の抗体の情報は、例えばwww.biocompare.com/antibodies/のウェブサイトなどで検索することにより、当業者は適宜使用できる。例えば、US biological社の抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体や、PeproTech社の抗ヒトＰＦ４ウサギ抗体を代表的な例として挙げることができる。これらの抗体は、ヒトＣＸＣＬ４（ヒトＰＦ４）と特異的に結合することに加え、ＣＸＣＬ４による好中球への作用を中和する活性があることも知られており、本実施形態の治療剤の有効成分として好ましい例である。
抗ＣＸＣＬ４抗体は、多くの文献にも記載されている。例えば、ＥＰ０４５７５３２Ａ１、ＣＮ１０３１７３４１９Ａといった特許文献や、Gao et al. (Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy (2015) vol. 34, pp. 110-115)、Saggin et al. (Thrmb. Haemost. (1992) vol. 67, pp. 137-143)といった学術文献に、具体的に記載されている。これらの記載に基づいて、あるいは、これらに記載される抗体又はハイブリドーマを入手することにより、所望の抗体を調製又は入手することもできる。

ＣＸＣＬ４阻害性物質としてのアプタマー
機能性核酸であるアプタマーは、無数の分子種を含む核酸ライブラリーの中から、「ＳＥＬＥＸ」と呼ばれる方法など、「選択と増幅」を含む一連の過程をｉｎｖｉｔｒｏで繰り返す公知の方法により、標的化合物に特異的に結合する物質として取得することができる（例えば、特開２００６−３２０２８９号公報、特開２００９−２０７４９１号公報、又は特開２００９−１６５３９４号公報参照）。
ＣＸＣＬ４阻害性物質としての核酸アプタマーは、標的化合物としてＣＸＣＬ４、代表的にはヒトＣＸＣＬ４の全長ポリペプチド又はそのフラグメントを採用し、選抜することができる。本実施形態で用いる核酸アプタマーは、標的化合物であるＣＸＣＬ４と特異的に結合し、当該結合によりＣＸＣＬ４阻害性物質として機能する限りどのような結合活性を有するものであってもよいが、ヒトＣＸＣＬ４タンパク質に対して２μＭ以下、好ましくは６００ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す結合能を有する。
ここで、解離定数（Ｋ_Ｄ）は、本明細書では、Ｋ_ｄとＫ_ａとの比（すなわちＫ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られる定数を指すものとし、モル濃度（Ｍ）で表現される。核酸アプタマーのＫ_Ｄ値は、当技術分野において確立された方法を用いて決定することができる。核酸アプタマーのＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いて、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることが挙げられる。

ＣＸＣＬ４阻害性物質としてのＲＮＡアプタマーの調製方法
核酸アプタマーとして、ＲＮＡアプタマーを利用することができる。ＲＮＡアプタマーは、その配列情報に基づいて、化学合成法、又は鋳型ＤＮＡの転写により適宜調製することができる。
核酸の化学合成法は当業者に周知の技法であり、所望の配列からなるＲＮＡを人工的に合成することができる。また、企業の提供する受託合成サービスを利用することもできる。
転写により所望のＲＮＡアプタマーを生じる配列からなるＤＮＡは、その相補鎖ＤＮＡと共に２本鎖ＤＮＡとしてベクターにクローニングすることができる。ベクターには、Ｔ７ＲＮＡプロモーターなど、ＲＮＡ転写のために使用される配列を含めることができる。所望のＲＮＡアプタマーは、ベクターとＴ７ポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼとを使用することにより、ｉｎｖｉｔｒｏで適宜調製することができる。
ＣＸＣＬ４阻害性核酸アプタマーは、ＣＸＣＬ４と同濃度（ｗ／ｖ）又はそれ以下で有意にＮＥＴｓ誘導を抑制するものが望ましい。当該ＣＸＣＬ４阻害性核酸アプタマーの投与態様の例は、本実施形態の治療剤として、血清中でＣＸＣＬ４の生理的濃度と同程度の濃度となるように投与される。

ＣＸＣＬ４阻害性物質としての小分子
ＣＸＣＬ４阻害性物質としての機能性小分子は、種々の構造からなる化合物群を含む化合物ライブラリーの中から選抜することにより、取得することができる。当該化合物ライブラリーとしては、市販される低分子化合物ライブラリーを適宜使用することができる。
具体的には、下記の実施例５に準じたインビトロの実験系によって、好中球によるＮＥＴｓ誘導活性を指標として所望の化合物を選抜、取得することができる。より具体的には、以下の様な手順で実施することができる。

（好中球の単離）
好中球は、任意の動物種の好中球を用いることができる。好ましくは哺乳動物種の好中球であり、より好ましくはヒトの好中球である。ヒト好中球は、健常人（ＨＣ）由来であっても、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ）患者由来等、ＮＥＴｓ形成の過剰を特徴とする自己免疫疾患患者由来であっても良い。ただし、材料の入手容易性等を考慮すればＨＣ由来の好中球を調製して利用することが好ましい。
好中球は、ヘパリン血を材料として、当業者に周知の手法と材料（例えば、Mono-Poly Resolving Medium (DS Pharma Biomedical, 大阪)）を使用して単離することができる。単離した好中球は、細胞培養用の培地（DMEM培地等）に懸濁して使用する。
（血小板の培養）
細胞培養プレート、例えば９６穴プレート上に、１ウェルあたり一定数（例えば、１ｘ１０^５個）の好中球を播種し、一定時間（例えば２時間）培養する。その後、培養系に（１）被検物質（化合物ライブラリー）及びＣＸＣＬ４（例えば、２．５、１０又は２０μｇ／ｍＬ）、（２）ＣＸＣＬ４（陽性対照；２．５、１０又は２０μｇ／ｍＬ）、又は（３）培地（陰性対照）を、（１）〜（３）の各条件で等容量となるように添加し、培養を継続する。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成の視覚的確認は、ライブセルイメージングシステム（Okubo K et al., EBioMedicine. (2016) vol. 10, pp. 204-215）に従って行うことができる。この方法では、スライドガラス上の好中球及び／又は血小板をPicogreen (Thermo Fisher Scientific, 米国）とインキュベートし、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、ＮＥＴｓを検出する。さらに、Picogreenの蛍光シグナルを定量的に解析し、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を算出することで、ＮＥＴｓ誘導能を数値で評価することもできる。
（ＣＸＣＬ４阻害性小分子の取得）
上記（２）の条件で認められるＮＥＴｓ誘導と比較して明らかに（１）の条件で認められたＮＥＴｓ誘導が抑制されていた場合、（１）で使用した化合物ライブラリーにはＣＸＣＬ４阻害性物質（小分子）が含まれている可能性を認め、当該ライブラリーを構成する化合物群を分子種ごとに細分して二次選抜を行う。必要であれば更に三次選抜等を順次実施し、最終的に単一分子種としてのＣＸＣＬ４阻害性物質を単離する。
ＣＸＣＬ４阻害性小分子は、ＣＸＣＬ４と同濃度（ｗ／ｖ）又はそれ以下で有意にＮＥＴｓ誘導を抑制するものが望ましい。当該ＣＸＣＬ４阻害性小分子の投与態様の例は、本実施形態の治療剤として、血清中でＣＸＣＬ４の生理的濃度と同程度の濃度となるように投与される。

本発明の一実施形態は、疾患の治療剤（医薬組成物）であって、自己免疫疾患に対する治療用途を特徴とし、その有効成分としてＣＸＣＬ４阻害性物質を有する。また、本発明の別の一態様は、自己免疫疾患の治療剤の製造のための、ＣＸＣＬ４阻害性物質の使用に関する。本発明のまた別の一実施形態は、自己免疫疾患の治療方法における使用のための、ＣＸＣＬ４阻害性物質に関する。本発明のさらに別の一実施形態は、有効量のＣＸＣＬ４阻害性物質を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法に関する。これらの実施形態に共通して、治療標的となる疾患は自己免疫疾患であり、好ましくは好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である。

好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患とは、体液中の好中球がＮＥＴｓを（健常者が通常の生理的条件において示す平均的レベルと比して）有意に高いレベルで呈することが報告されている自己免疫疾患を言う。
具体的には、血管炎症候群、全身性強皮症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスを挙げられるが、これらに限定されるものではない。

血管炎症候群とは、血管炎、全身性血管炎とも呼称されるものであり、血管そのものに炎症を認める疾患の総称である（血管炎症候群の診療ガイドライン（2017年改訂版）、厚生労働省難治性疾患政策研究事業難治性血管炎に関する調査研究班編、2018年）。
血管炎症候群はいくつかのカテゴリーに分類されており、中型血管炎、小型血管炎等のカテゴリーがそれに含まれている。

中型血管炎には、結節性多発動脈炎や川崎病が知られている。

小型血管炎は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、及び免疫複合体性小型血管炎に大別することができる。
これらのうち、ＡＮＣＡ関連血管炎には、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症（旧Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症）、及び好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（旧Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群）が知られている。
また、免疫複合体性小型血管炎には、抗糸球体基底膜抗体病（抗ＧＢＭ病）、クリオグロブリン血症性血管炎、ＩｇＡ血管炎、及び低補体血症性蕁麻疹様血管炎が知られている。

前記の中型血管炎及び小型血管炎にカテゴライズされる血管炎症候群は、炎症性疾患であると同時に自己免疫疾患としての側面も有し、いずれも本実施形態の治療標的となり得る。
本実施形態における治療対象疾患の好ましい例として、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症（Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症）、及び好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群）といったＡＮＣＡ関連血管炎や結節性多発動脈炎を挙げることができる。これらの疾患は、その特徴的な病態の一つとしてＮＥＴｓを形成することが知られている。

対象が前記した血管炎症候群を有する者であるか否かは、各疾患について臨床的に用いられている診断基準に則って判断される。血管炎症候群に関しては、現在の診断基準が前記「血管炎症候群の診療ガイドライン（2017年改訂版）」（厚生労働省難治性疾患政策研究事業難治性血管炎に関する調査研究班編、2018年）に記載されているので、当該診療ガイドラインを参照することで診断可能である。また、ＡＮＣＡ関連血管炎に関しては「ＡＮＣＡ関連血管炎診療ガイドライン 2017」（厚生労働省難治性疾患政策研究事業難治性血管炎に関する調査研究班編、2017年）を参照することもできる。さらに、難病情報センターのウェブサイト等、別の媒体に転載された診断基準を参照することでも良い。本実施形態の治療標的となる疾患を有するか否かについては、各種疾患の診断基準に則ればよく、個々の患者においてＮＥＴｓ形成の過剰があるか否かを個別に確認する必要はない。以下に記載する血管炎症候群以外の疾患に関しても同様である。

全身性強皮症（ＳＳｃ）は、手指から始まる皮膚硬化が全身に及び、舌小帯の短縮や食道や肺などの内臓諸臓器の線維化を特徴とする自己免疫疾患である。
対象が全身性強皮症を有する者であるか否かは、臨床的に用いられている診断基準に則って判断される。全身性強皮症に関しては、現在の診断基準が「全身性強皮症診断基準・重症度分類・診療ガイドライン」（全身性強皮症診断基準・重症度分類・診療ガイドライン委員会、2016年、日皮会誌第126巻第1831-1896頁）に記載されているので、当該ガイドラインを参照することで診断可能である。難病情報センターのウェブサイト等、別の媒体に転載された診断基準を参照することでも良い。全身性強皮症の一病態としてのＮＥＴｓ形成は、例えばMaugeri et al., Sci. Transl. Med. (2018) vol. 10:451に記載されている。

関節リウマチ（ＲＡ）は、関節滑膜を病変の主座とする慢性の炎症性疾患であり、また、自己免疫疾患としても認識されている。
対象が関節リウマチを有する者であるか否かは、臨床的に用いられている診断基準に則って判断される。ＲＡの診断基準では、「１関節以上の腫脹があり、他の疾患では説明できない」ことを前提として、「Ｘ線上で典型的なＲＡの骨びらんが認められる」又は「ＲＡの分類基準（６点以上）を満たす」こととされている。ここでＲＡの分類基準とは、「腫脹又は圧痛のある関節数（診察）」の観点から０〜５点、「血清反応（自己抗体）」の観点から０〜３点、「罹病期間」の観点から０〜１点、「炎症反応」の観点から０〜１点でスコアリングし、各観点のスコアの合計の点数により判断を行う（詳細には、「宮坂信之、日内会誌 (2015) 104巻第2110〜2117頁」を参照）。また、関節リウマチに関しては、「関節リウマチ診療ガイドライン 2014」（日本リウマチ学会監修、メディカルレビュー社）にも詳細な記載があり、これを参照できる。関節リウマチの一病態としてのＮＥＴｓ形成は、例えばKhandpur et al., Sci. Transl. Med.. (2013) vol. 5(178):178ra40に記載されている。

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。発熱、全身倦怠感などの炎症を思わせる症状と、関節、皮膚、腎臓、肺、中枢神経などの様々な症状が一度に、あるいは経過とともに起こることが知られている。
対象がＳＬＥを有する者であるか否かは、臨床的に用いられている診断基準に則って判断される。ＳＬＥに関しては、現在の診断基準が難病情報センターのウェブサイト等に掲載されている。

ＳＬＥの一病態としてのＮＥＴｓ形成は、例えばHakkim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2010) vol. 107, pp. 9813-9818やVillanuevar et al., J. Immunol. (2011) vol. 187, pp. 538-552に記載されている。

本実施形態のＣＸＣＬ４阻害性物質を含有してなる、自己免疫疾患の治療剤の投与経路は特に限定されず、経口投与剤であっても、非経口投与剤であってもよい。
たとえば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、シロップ等の経口投与剤の剤型とすることができる。また、注射剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏、クリーム、ローション、ゲル剤、スプレー剤などの非経口投与剤の剤型とすることもできる。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。

例えば、経口投与用製剤とする場合には、トラガントガム、アラビアガム、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、オリーブ油、大豆油、ＰＥＧ４００等の溶解剤；澱粉、マンニトール、乳糖等の賦形剤；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等を適宜組み合わせて処方することにより製造することができる。

また、非経口投与用製剤とする場合の代表例は、注射剤である。注射用の製剤は、例えば、抗ＣＸＣＬ４抗体又はＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマーであるＣＸＣＬ４阻害性物質を、静脈注射用の生理食塩水又は緩衝液によって溶解又は希釈して調製することができる。ＣＸＣＬ４阻害性物質の溶解度を高めたい場合は、溶媒を変更したり、溶液に含まれる塩を変更したり、塩強度を変更したり、ＣＸＣＬ４阻害性物質をシクロデキストリン類に包接させるなど、公知の手法が適宜利用可能である。ＣＸＣＬ４阻害性物質とともに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法を利用して、皮下、筋肉及び静脈内注射剤を製造することができる。
点眼剤としては、水性点眼剤、非水性点眼剤、懸濁性点眼剤、乳濁性点眼剤、眼軟膏等のいずれでもよい。このような製剤は、投与形態に適した組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体、特に点眼薬に許容される担体、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等を配合し、当業者に公知の（製剤）方法により製造できる。点眼剤を調製する場合、ＣＸＣＬ４阻害性物質を滅菌精製水、生理食塩水等の水性溶剤、又は綿実油、大豆油、ゴマ油、落花生油等の植物油等の非水性溶剤に溶解又は懸濁させ、所定の浸透圧に調整し、濾過滅菌等の滅菌処理を施すことにより行うことができる。点眼剤用の水性基剤としては、等張化剤、緩衝剤及び保存剤のような通常使用される添加剤等が適宜配合される。例えば、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、多価アルコール、糖類等が、緩衝剤としては、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が、保存剤としては、塩酸ベンゼトニウム、塩酸ベンザルコニウム、クロロブタノール等が挙げられる。その他、グリセリン又はポリソリベート８０等の安定剤及びｐＨ調整剤等が必要に応じて配合される。
点鼻剤及びスプレー剤は、ＣＸＣＬ４阻害性物質を含む液状製剤として調製される。点鼻剤は、鼻腔内に適用（滴下）することに適した形状の容器に入れることが望ましい。スプレー剤は、液状製剤と共に噴射剤を含むスプレー容器に収納した形で調製される。噴射剤は炭酸ガス等の気体である。スプレー剤は、表皮のみならず、鼻腔内や口腔内に対して使用しても良く、調製にあたっては使用態様に適した形状のスプレー容器が適宜選択される。

ＣＸＣＬ４阻害性物質を有効成分として含有してなる、自己免疫疾患治療剤の投与形態
本実施形態の自己免疫疾患治療剤の有効成分となる抗ＣＸＣＬ４抗体等のＣＸＣＬ４阻害性物質の有効投与量は、患者の状態、症状など諸事情により適宜変更される。
通常は０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲から適宜決定できる。ただし、全身投与では高用量、局所投与では低用量とするなど、投与形態により調節することができる。
経口投与する場合におけるＣＸＣＬ４阻害性物質の１日分の投与量は、これを１日１回投与するか、又は数回に分けて投与することができる。逆に数日分の用量を１回に投与することにより２日以上毎に１度の投与ペースとすることもできる。注射剤として全身投与する場合におけるＣＸＣＬ４阻害性物質の投与量も、１日１回投与するか、又は１日分を数回に分けて投与することができる。逆に数日分の用量を１回に注射することにより２日以上毎の投与ペースとすることもできる。また、点滴等により継続的に投与することでも良い。点眼剤、点鼻剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル剤、スプレー剤などの非経口投与剤を局所投与をする場合も、外用薬としての治療剤中のＣＸＣＬ４阻害性物質の配合量、局所投与の頻度、及び塗布範囲などは適宜調整できる。いずれの場合も、投与は必ずしも継続的又は定期的に行う必要はなく、症状の変化などに応じて適宜間隔を空けて行うことが可能である。仮に単回の投与で治癒又は寛解すれば、複数回投与を行う必要はない。症状が再発乃至増悪した場合に投与を再開しても良い。

本実施形態の抗ＣＸＣＬ４抗体等のＣＸＣＬ４阻害性物質を有効成分として含有してなる、自己免疫疾患治療剤の投与方法としては、特に限定されるものではないが、治療対象疾患として代表的に例示されるＡＡＶ等の血管炎症候群は、血管に炎症を生じ、体液中の好中球でＮＥＴｓ形成を示すため、静注又は点滴による全身投与が好ましい。ＣＸＣＬ４阻害性物質として抗ＣＸＣＬ抗体や核酸アプタマーを使用する場合には、経口投与によって治療有効量を患部に送達することは困難であると考えられるため、非経口投与が主に選択される。前記の静注や点滴に限定されるものでなく、筋注等の局所投与を行っても良い。
投与期間は、患者の病状に応じて適宜調整できる。投与期間中の投与用量は適宜調整できるが、継続的に一定量を投与するか、又は投与当初のみ比較的高用量で投与した後により少ない維持量の一定投与に移行する投与形態とすることが例示される。

ＣＸＣＬ４阻害性物質と共に使用する成分
本実施形態は、ＣＸＣＬ４により誘導されるＮＥＴｓ形成を抑制することを通じて自己免疫疾患を治療することに関している。このことから、ＣＸＣＬ４と協調して、又はＣＸＣＬ４とは独立にＮＥＴｓ形成に寄与する成分を、ＣＸＣＬ４阻害性物質と組み合わせて使用することもできる。ＣＸＣＬ４阻害性物質と組み合わせて使用する成分は、ＣＸＣＬ４阻害性物質と同時に投与しても、異時に投与しても良く、両者の投与経路は同一であっても互いに異なっても良い。
例えば、ヘパリン、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＴＬＲ９アンタゴニストなどが組合せ用成分として使用し得る。ヘパリンやコンドロイチナーゼＡＢＣは、ＣＸＣＬ４と好中球との結合、又は血小板（ＣＸＣＬ４を含む）と好中球との接触を妨げることが予測され、当該結合又は接触の阻害によってＮＥＴｓ形成誘導を効果的に抑制することが期待される。また、ＴＬＲ９は血小板等に存在し、リガンド（ＣｐＧＤＮＡ）依存的に炎症性反応を惹起するものであり、かつ、後述の実施例で示すように、血小板によるＣＸＣＬ４分泌にも少なくとも部分的な関与を持っている。それゆえ、低分子アンタゴニスト等によってＴＬＲ９の機能を阻害することは、ＣＸＣＬ４依存的又は非依存的な経路によって自己免疫疾患の治療に寄与するものと期待される。
ヘパリン、コンドロイチナーゼＡＢＣ、及びＴＬＲ９アンタゴニストは、単独又は組み合わせて使用して良い。いずれも市販品を購入するか、文献的に記載される手法により入手又は調製できる。それぞれの適用量についても、公知の情報に基づいて適宜決定することができる。例えば、ヘパリンはヘパリンＮａ又はヘパリンＣａとして臨床的に使用されており、これらを静注（点滴でも良い）、皮下注、又は筋注により投与することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。

実施例１血小板由来の液性因子によるＮＥＴｓ誘導
自己免疫疾患患者として、ＡＮＣＡ関連血管炎（ＡＡＶ；ＣＨＣＣ分類基準２０１２改訂に基づく多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）又は顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ））と分類された患者を対象とした。
対照である健常人（ＨＣ）からもサンプルを得た。
本実施例、及び以下の全ての実施例に係る試験は慶應義塾大学医学部倫理委員会による承認を受けたものであり、全ての被験者（患者及び健常人）についてインフォームドコンセントを得て、ヘルシンキ宣言に従って行われた。

・方法
（好中球及び血小板の単離）
好中球は、各被験者から採取したヘパリン血を材料として、Mono-Poly Resolving Medium (DS Pharma Biomedical, 大阪)を使用して単離し、DMEM培地に懸濁した。
血小板サンプルは、常法に従い、遠心分離により血小板分画を分取したPlatelet Rich Plasma （ＰＲＰ）、及びＰＲＰを遠心することで血小板を沈降させた上清をPlatelet Poor Plasma （ＰＰＰ）として調製した。ここで、ＰＲＰは、５ｘ１０^５／μＬの血小板を含むように調製された。
（血小板-好中球共培養）
９６穴プレート (Corning, 米国)上に１ウェルあたり１ｘ１０^５個の好中球（ＨＣ又はＡＡＶ由来）を播種し、２時間培養した。その後、ＰＲＰ（ＨＣ又はＡＡＶ由来）、ＰＰＰ（ＨＣ又はＡＡＶ由来）を１０μＬ添加し、１時間共培養を行った（総容量３００μＬ）。
また、血小板と好中球との接触の影響を検討するため、本共培養系において、trans-well assay kit (Corning, 米国)を用い、ＨＣ由来の好中球とＡＡＶ由来の血小板とをポアサイズ０．４μｍの膜で隔てて共培養する試験も併せて行った。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成の視覚的確認は、ライブセルイメージングシステム（Okubo K et al., EBioMedicine. (2016) vol. 10, pp. 204-215）に従って行った。概略としては、スライドガラス上の好中球及び／又は血小板を５００ｎMのPicogreen (Thermo Fisher Scientific, 米国）とインキュベートし、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、ＮＥＴｓを検出する方法である。

・結果
共培養による結果を図１に示す。
図１の（ａ）〜（ｇ）のそれぞれにおいて、上段のパネルは共焦点顕微鏡により観察したPicogreenによる蛍光シグナルを示す。
（ｆ）、及び（ｇ）、すなわち、ＡＡＶ由来の血小板（ＰＲＰ）と共培養を行った場合に強いシグナルが確認され、ＡＡＶ由来の血小板分画によってＮＥＴｓが著明に誘導されることが分かった。一方、（ｄ）と（ａ）及び（ｆ）との比較等により、ＨＣ由来の血小板にはＮＥＴｓ形成を誘導する活性がないことが分かった。
また、トランスウェルを用いて血小板と好中球との直接接触を阻害した条件（ｇ）であってもＮＥＴｓが著名に誘導されたことから、ＡＡＶ由来の血小板は液性因子を介してＮＥＴｓを誘導できることが分かった。さらに、（ｆ）と（ｇ）の比較では前者により強いＮＥＴｓ誘導が認められたことから、液性因子によるＮＥＴｓ誘導と好中球-血小板接触によるＮＥＴｓ誘導の両方が働いていることが示唆された。

実施例２自己免疫疾患患者由来血小板の刺激による好中球のＮＥＴｓ誘導
自己免疫疾患患者として、ＡＡＶ患者（ｎ＝２１）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者（ｎ＝１０）、及び関節リウマチ（ＲＡ）患者（ｎ＝１２）を対象とした。
これらの患者、及び、対照である健常人（ＨＣ）（ｎ＝２０）からサンプルを得た。

・方法
（好中球及び血小板（ＰＲＰ）の単離）
好中球（ＨＣ由来）、並びに、ＰＲＰ（ＡＡＶ患者、ＳＬＥ患者、ＲＡ患者、又はＨＣ由来）及びＰＰＰ（ＡＡＶ患者、ＳＬＥ患者、ＲＡ患者、又はＨＣ由来）は、実施例１と同様の手法で各被験者のサンプルから調製した。
（血小板-好中球共培養）
実施例１と同様に、血小板−好中球共培養を行った。トランスウェルは用いていない。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成は、実施例１と同様、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、検出した。また、Picogreenの蛍光シグナルを定量的に解析し、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。

・結果
結果を図２に示す。
ＰＲＰを用いた共培養、及びＰＰＰを用いた共培養によって誘導されたＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の差を血小板分画によって誘導されたＮＥＴｓとして算出した。ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）の変化は、それぞれ、＋５．６、−０．９０、−０．３７、及び＋０．００２６（順に、ＡＡＶ患者、ＳＬＥ患者、ＲＡ患者、及びＨＣ）であった。
血小板分画によるＮＥＴｓを定量的に評価した結果、ＡＡＶ由来血小板は健常人由来血小板と比較して有意にＮＥＴｓを誘導することが分かった（ｐ＝０．０２５；Mann-Whitney U testによる）。

実施例３ＮＥＴｓ誘導におけるＴＬＲ９シグナル伝達経路の関与
ＡＡＶ由来血小板で特徴的に発現する分子群を網羅的に解析し、同定した分子群のうち、血小板に発現するＴｏｌｌ様受容体（toll-like receptor: ＴＬＲ）はＦＡＣＳ法で解析したところ、血小板上のＴＬＲ９発現陽性率はＡＡＶ患者において健常人よりも上昇していること、及び、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４発現陽性率は健常人と差異がないことが認められた（データは示さず）。
上記の結果から、ＮＥＴｓ誘導におけるＴＬＲ９の関与が示唆されたので、ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−ＤＮＡを用いて血小板を刺激し、実施例１及び２と同様の共培養系においてＮＥＴｓ誘導を検討した。

・方法
（好中球及び血小板（ＰＲＰ）の単離）
ＨＣ由来の好中球、ＰＲＰ及びＰＰＰは、実施例１と同様の手法で各被験者のサンプルから調製した。
（血小板-好中球共培養）
実施例１と同様に、血小板-好中球共培養を行った。トランスウェルは用いていない。ただし、共培養前に、ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−ＤＮＡ (ＣｐＧ；Novus Biologics, Littleton, 米国) を２０μｇ／ｍＬ添加し、１６−１８時間血小板を刺激した。血小板（−）の条件であるＰＰＰにおいても、ＰＲＰと同様の刺激を行い、好中球との共培養に供した。また、一部の系では、２０μｇ／ｍＬのＣｐＧ−ＤＮＡと共に、ＴＬＲ９アンタゴニストであるヘキサヌクレオチド（ＴＴＡＧＧＧ；ＯＤＮＡ１５１ (Invigogen, 米国)）の添加も行った。なお、対照には、ＴＬＲ９リガンドとしての作用を有しないcontrol oligodeoxynucleotides (ＣｐＧｃｏｎｔｒｏｌ；Novus Biologics, 米国) を２０μｇ／ｍＬ添加した。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成は、実施例１と同様、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、検出した。また、Picogreenの蛍光シグナルを定量的に解析し、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。

・結果
結果を図３に示す。
対照、及びＣｐＧ−ＤＮＡ２０μｇ／ｍＬ添加時のＤＮＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、それぞれ、０．１１及び３７であり、ＴＬＲ９リガンド添加による有意なＮＥＴｓ誘導促進効果が認められた（ｐ＜０．０５）。一方、２０μｇ／ｍＬのＣｐＧ−ＤＮＡと共にＴＬＲ９アンタゴニストを添加した場合のＤＮＡ濃度は２３（ｎｇ／ｍＬ）であり、ＣｐＧ−ＤＮＡ誘導性のＤＮＡ放出は有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。
ＴＬＲ９リガンドによってＮＥＴｓ誘導が促進され、ＴＬＲ９アンタゴニストによって当該促進効果が部分的に打ち消された結果から、好中球によるＮＥＴｓ形成には血小板におけるＴＬＲ９シグナル伝達経路が関与していることが分かった。
なお、ＨＣ由来のＰＲＰに代えてＡＡＶ患者由来のＰＲＰを用いた場合にも、ＴＬＲ９リガンド依存的なＮＥＴｓ形成（ＣｐＧ−ＤＮＡ誘導性のＤＮＡ放出）が認められ、ＤＮＡ濃度はＡＡＶ患者由来血小板を用いた方がＨＣ由来血小板を用いた場合よりも顕著に高かった（ｐ＜０．０５；データは示さず）。

実施例４ＮＥＴｓ誘導におけるＴＬＲ９−ＣＸＣＬ４経路の関与
好中球によるＮＥＴｓ形成を促進するＴＬＲ９シグナル伝達経路が、血小板由来のどのような液性因子と関連するか解析したところ、液性因子の一種であるＣＸＣＬ４の関与が示唆されたので、実施例３の共培養系における培養上清中のＣＸＣＬ４濃度の定量的解析を行った。

・方法
（好中球及び血小板（ＰＲＰ）の単離）
ＨＣ由来の好中球及びＰＲＰは、実施例３と同様の手法で各被験者のサンプルから調製した。
（血小板-好中球共培養）
実施例３と同様に、血小板-好中球共培養を行った。共培養前に、ＣｐＧ−ＤＮＡを２０μｇ／ｍＬ添加し、血小板を刺激した。また、一部の系では、ＣｐＧ−ＤＮＡと共に、ＴＬＲ９アンタゴニストの添加も行った。対照には、ＣｐＧｃｏｎｔｒｏｌを２０μｇ／ｍＬ添加した。
（培養上清中のＣＸＣＬ４濃度の定量的解析）
ＣＸＣＬ４濃度の定量的解析には、ＥＬＩＳＡ法（human CXCL4 ELISA kit (R&D Systems, 米国)を用い、キットの指示に従ってＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）を定量した。

・結果
結果を図４に示す。
対照、及びＣｐＧ−ＤＮＡ２０μｇ／ｍＬ添加時のＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、それぞれ、３．１及び１６であり、ＴＬＲ９リガンドによる有意なＣＸＣＬ４分泌促進が認められた（ｐ＝０．０２８）。一方、２０μｇ／ｍＬのＣｐＧ−ＤＮＡと共にＴＬＲ９アンタゴニストを添加した場合のＣＸＣＬ４濃度は１１（ｎｇ／ｍＬ）であり、ＣｐＧ−ＤＮＡ誘導性のＣＸＣＬ４分泌促進の抑制が認められた（ｐ＜０．０５）。
これらの結果から、好中球によるＮＥＴｓ形成には血小板におけるＴＬＲ９−ＣＸＣＬ４経路が関与しており、ＴＬＲ９が血小板におけるＣＸＣＬ４分泌を（少なくとも部分的に）促進し、ひいては好中球によるＮＥＴｓ形成に寄与することが分かった。

実施例５ＣＸＣＬ４によるＮＥＴｓ形成促進
ＣＸＣＬ４が液性因子として好中球のＮＥＴｓ形成を促進することを検討するため、ＨＣ由来の好中球に様々な濃度のＣＸＣＬ４を添加し、ＮＥＴｓ誘導効果を顕微鏡観察により評価した。

・方法
（好中球の単離）
ＨＣ由来の好中球は、実施例１と同様の手法で各被験者のサンプルから調製した。
（血小板の培養）
実施例１の培養系において、血小板を添加することに代えて組換え体のＣＸＣＬ４(PeproTech, 米国)を０、２．５、１０又は２０μｇ／ｍＬ添加し、好中球を培養した。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成は、実施例１と同様、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、検出した。

・結果
結果を図５に示す。
細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡの存在を示すPicogreen由来の蛍光シグナルは、ＣＸＣＬ４濃度の上昇に従って増強された。これにより、ＣＸＣＬ４は好中球によるＮＥＴｓ形成を直接誘導しすること、及びこの誘導効果はＣＸＣＬ４の濃度依存的であることが分かった。

実施例６ＡＡＶにおけるＣＸＣＬ４の測定
ＡＡＶ患者及び健常人における血漿中ＣＸＣＬ４濃度をＥＬＩＳＡ法で測定し、比較した。

・方法
（培養上清中のＣＸＣＬ４濃度の定量的解析）
ＡＡＶ患者（ｎ＝１７）及びＨＣ（ｎ＝７）について、各被験者から血漿サンプルを調製し、血漿中ＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、実施例４と同様に、ＥＬＩＳＡ法により定量した。

・結果
結果を図６に示す。図中のプロットは各被験者の測定値を示す。
ＡＡＶ患者における平均ＣＸＣＬ４濃度（ｎｇ／ｍＬ）は９１であり、ＨＣにおける平均濃度２８と比較して有意に高かった（ｐ＝０．０２２）。

実施例７抗ＣＸＣＬ４抗体によるＮＥＴｓ形成の阻害
液性因子であるＣＸＣＬ４の機能を阻害することで好中球によるＮＥＴｓ形成を阻害することができるか検討した。

・方法
（好中球及び血小板（ＰＲＰ）の単離）
ＨＣ由来の好中球及びＡＡＶ患者由来のＰＲＰは、実施例１と同様の手法で各被験者のサンプルから調製した。
（血小板-好中球共培養）
実施例１と同様に、血小板-好中球共培養を行った。トランスウェルは用いていない。ただし、共培養時に、ＣＸＣＬ４の機能を阻害する目的で０．４ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体 (US Biological, 米国) を添加した。また、対照には、抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体に代えて非特異的なＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧを添加した。
（ＮＥＴｓ形成の解析）
ＮＥＴｓ形成は、実施例１と同様、細胞外に放出された二本鎖ＤＮＡ（Picogreenラベルされたｄｓ−ＤＮＡ）を共焦点顕微鏡によって観察することにより、検出した。また、Picogreenの蛍光シグナルの陽性領域は、ImageJ processing software (U. S. National Institutes of Health, 米国)を使用して定量的に解析し、算出した。

・結果
結果を図７に示す。
ＮＥＴｓ形成を示すPicogreenの蛍光シグナル陽性領域の割合（％）は、抗ヒトＣＸＣＬ４ウサギ抗体添加時が０．１０であるのに対し、対照では２．０であり、ＡＡＶ患者由来の血小板によるＮＥＴｓ形成誘導活性は抗ＣＸＣＬ４抗体の添加によって有意に抑制されることが示された（ｐ＝０．０２９）。
これらの実施例で示された結果から、ＣＸＣＬ４、又はＣＸＣＬ４及びＴＬＲ９の組み合わせは、ＮＥＴｓ形成の過剰を特徴とする自己免疫疾患（ＡＡＶ等）の治療標的となることが理解された。特に、肺病変を有するＡＡＶ患者ではＴＬＲ９陽性の血小板が認められる（データは示さず）ことから、ＣＸＣＬ４、又はＣＸＣＬ４及びＴＬＲ９を阻害することは、肺病変を有するＡＡＶの治療に特に好適であることが示唆された。そして、ＣＸＣＬ４を阻害する具体的手段として、抗ＣＸＣＬ４抗体の添加が有用であり、抗ＣＸＣＬ４抗体が自己免疫疾患治療剤となり得ることが理解された。

本発明のＣＸＣＬ４阻害剤は、好中球によるＮＥＴｓ形成を抑制することを通じて自己免疫疾患の治療に使用できることから、産業上の利用可能性を有する。

Claims

ＣＸＣＬ４阻害性物質を含有してなる、自己免疫疾患の治療剤。
自己免疫疾患が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患である、請求項１に記載の治療剤。
ＮＥＴｓ形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患が、血管炎症候群、全身性強皮症、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスからなる群から選択される自己免疫疾患である、請求項２に記載の治療剤。
ＮＥＴｓ形成の過剰の病態を呈する自己免疫疾患が、ＡＮＣＡ関連血管炎である、請求項２又は３に記載の治療剤。
ＣＸＣＬ４阻害性物質が、抗ＣＸＣＬ４抗体、ＣＸＣＬ４と特異的に結合するアプタマー、及びＣＸＣＬ４と特異的に結合する小分子からなる群から選択されるＣＸＣＬ４阻害性物質である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の治療剤。