WO2016056665A1

WO2016056665A1 - 白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤

Info

Publication number: WO2016056665A1
Application number: PCT/JP2015/078857
Authority: WO
Inventors: 川上　浩; 淳一平橋; 光修大久保; 伸治加賀谷
Original assignee: 学校法人慶應義塾; 株式会社Ｎｒｌファーマ; 川上　浩
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2016-04-14
Also published as: EP3205347A4; JPWO2016056665A1; CN106794218A; US20170296629A1; CA2972397A1; EP3205347A1

Abstract

　本発明は白血球の細胞外トラップ形成を阻害する新規な薬剤を提供することを目的とする。　本発明は、ラクトフェリン断片を含む白血球の細胞外トラップ形成阻害剤及びラクトフェリンを含む白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物を提供する。

Description

白血球の細胞外トラップ形成の阻害剤

　本発明は、ラクトフェリン類似のペプチド断片を有効成分とする白血球の細胞外トラップ形成阻害剤及び白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物に関する。また、本発明は、前記阻害剤又は組成物を用いた白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療する方法に関する。

　ＮＥＴｓ（好中球細胞外トラップ：ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｐｓ）は、細菌感染により好中球が活性化され、分葉核の形態やクロマチンの分布が不明になり、ついで核膜が消失し、クロマチン構造に細胞質や顆粒成分が混在し、細胞膜が破れた際に網状の構造物を放出し、細菌や真菌、寄生虫、ウイルスを捕獲し、抗菌作用を発揮する細胞外構造物である。ＮＥＴｓはＤＮＡを中心とし、ヒストン３（Ｈ３）やエラスターゼがその作用に重要な役割を果たす。ＮＥＴｓ形成は微生物を効率的に殺す抗菌分子を局所に集めることになる。ＮＥＴｓが生じることで好中球は細胞死（ネトーシス）を迎えるが、その分子メカニズムはあまり分かっておらず、ＴＮＦ−α、ＰＭＡ、ＬＰＳ、ＩＬ−８等の刺激により生じ、その際に生じる細胞死は古典的なネクローシスや、カスパーゼの活性化やＤＮＡの断片化といったことが起きるアポトーシスとは異なった形態を示す。ＬＰＳやＰＭＡにより好中球が刺激されると、オートファジーが生じ、同時に活性酸素が生じる。これによって核膜の崩壊、クロマチンの脱凝縮、ヒストンのシトルリン化が生じ、ネトーシスが起こる（非特許文献１及び２）。

　ＮＥＴｓの形成に伴い、好中球から多くのタンパク質、特にアズール顆粒や第２顆粒に含まれる抗菌タンパク質が脱顆粒により分泌され、細胞構造に関わるタンパク質なども分泌されることが報告されている（非特許文献２）。それらのタンパク質はＮＥＴｓ構成タンパク質ともいわれ、好中球エラスターゼ、ヒストン、ミエロペルオキシダーゼ、Ｆ−アクチン、ラクトフェリン、マトリックスメタロプロテアーゼ９、ＬＬ３７、カテプシンＧ、ＢＰＩ、プロテナーゼ３、カルプロテクチン、アズロシジン、ライソザイムＣ、ディフェンシン、カタラーゼ等が報告されている（非特許文献３）。

　ラクトフェリンは好中球の第２顆粒に含まれ、好中球がＮＥＴｓを形成し、最終的に脱顆粒し、周囲に放出される（非特許参考文献１）。
　ラクトフェリンは哺乳動物において良く保存され、その機能に種差はあまりみられない。また、現在は牛乳成分のタンパク質としてその生理活性が注目され、市販されている。ただし、牛乳は、ウシの好中球のＮＥＴｓ形成に対し阻害効果を示さないことが報告されている（非特許文献４）。

　ＮＥＴｓは血栓の増大・成長にも関与し、ＮＥＴｓを放出すると、その中に含まれるヒストンは血小板を凝縮させる作用があり、ＮＥＴｓを基に血小板血栓が形成される。またＮＥＴｓに含まれる好中球エラスターゼやカテプシンＧは、組織因子経路抑制因子を分解し、血液凝固反応を促進する。それらの作用によって微生物などを局所にとどめる役割も示す（非特許文献５）。

　ＮＥＴｓの本来の作用はグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌等の外来微生物を補足し、局所に閉じ込め殺菌することである。このような作用を持つことから感染症において多くみられるが、感染症などが慢性化するにつれて、外来微生物の非存在下においてもＮＥＴｓの形成が見られるという報告もある。慢性かつ難治性の自己免疫疾患の一つである全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）は、自己ＤＮＡや関連タンパク質に対する自己抗体が形成され、それにより組織や臓器に炎症を起こすことが知られている。ＳＬＥの特徴的所見は好中球が障害部位に多数存在することである。ＳＬＥ患者の血清中には抗菌ペプチドＬＬ３７とＮＥＴｓ中のＤＮＡが存在することが知られている（非特許文献６及び７）。これらが自己抗原としてＢ細胞に認識され自己抗体が産生される。また、ＳＬＥ患者の好中球は健常人の好中球に比べてＮＥＴｏｓｉｓを起こしやすい（非特許文献６）。これらの要因が慢性炎症を誘導すると考えられている。また、自己抗体による疾患として抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎においても患者血清中のＩｇＧ分画が健常人のＩｇＧ分画よりも好中球のＮＥＴｓ形成能が約２倍高いことが報告されている（非特許文献８及び９）。
　ＮＥＴｓ形成と疾患との関連が注目されるようになったのは、２００４年のＢｒｉｎｋｍａｎらによる報告（非特許文献１）以来、最近のことであり、今後、ＮＥＴｓ形成が原因となる新たな疾患が明らかにされるであろう。このように、ＮＥＴｓ形成は、生体の感染防御において重要な役割を果たすものであるが、病態によっては、ＮＥＴｓ形成を阻害することが病態の改善に必要な場合も考えられる。

　ＮＥＴｓ形成を阻害する物質として、放出されたＤＮＡ網を分解するために肺炎連鎖球菌や黄色ブドウ球菌などのグラム陽性球菌の連鎖球菌は菌体外にＤＮａｓｅを発現させることが報告されている。また、ヒストンに対する抗体や、スーパーオキシドの産生を抑制するような物質としてジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ）やカタラーゼが報告されている（非特許文献１０）。
　その他、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性がネトーシスに影響すること（非特許文献１１）、好中球がＮＥＴｓを形成して細胞死する現象、すなわちネトーシス、はアポトーシスやネクローシスとは異なるプロセスであること（非特許文献１０）などが知られている。

　乳由来の塩基性タンパク質画分を有効成分としてＩ型糖尿病や関節リウマチの自己免疫疾患を予防するという先行技術があるが（特許文献１）、リンパ球を中心とした免疫細胞の調節や炎症性サイトカインの抑制などに特化した内容であり、ＮＥＴｓ形成阻害作用に関するものではない。これまでのところ、ＮＥＴｓ形成に起因する疾患を治療する薬剤は報告されていない。

特開２００８−１８９６３７

Ｖｏｌｋｅｒ　Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，２００４　Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：１５３２−１５３５Ｑ　Ｒｅｍｉｊｓｅｎら，２０１１，Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１８：５８１−５８８Ｍａｒｅｎ　ｖｏｎ　Ｋｏｅｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅら，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１１：３０７０−３０８０Ｊｏｈｎ　Ｄ．Ｌｉｐｐｏｌｉｓら，２００６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３：２４８−２５５Ｆｕｃｈｓ　ＴＡら，２０１０，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１０７：１５８８０−１５８８５Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｍｏ　ＧＳら，２０１１　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，３：７３ｒａ２０．Ｌａｎｄｅ　Ｒら，２０１１　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ，３：７３ｒａ１９．Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ　Ｋら，２００９，Ｎａｔ　Ｍｅｄ，６：６２３−６２５Ｂｏｓｃｈ　Ｘ，２００９，Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，８：１６５４−１６５６Ｔｏｂｉａｓ　Ａ．Ｆｕｃｈｓら，２００７，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１７６：２３１−２４１Ｋ．Ａｋｏｎｇ−Ｍｏｏｒｅら，２０１２，ＰＬＯＳ　ＯＮＥ，７：ｅ４２９８４内藤眞ら，２０１０，生物試料分析，３３：３２９−３３８

　本発明の目的は、白血球の細胞外トラップ形成によって発症する疾患の根本的な治療薬、特に、長期的に行われる寛解維持（再発抑制）に適する安全かつ有効な治療薬及び治療方法を提供することである。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ラクトフェリン断片がＮＥＴｓ形成の抑制効果を顕著に発揮し、ＮＥＴｓ関連疾患の根本的な治療が可能となることを見出した。

　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］　Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＱであり；
　Ｘ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ａ又はＬであり；
　Ｘ３＝Ｑ、Ｒ、Ｋ、又はＭであり；
　Ｘ４＝Ｗ又はＦであり；
　Ｘ５＝Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｓ又はＥであり；
　Ｘ６＝Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＭであり；
　Ｘ７＝Ｍ、Ｌ又はＩであり；
　Ｘ８＝Ｒ、Ｋ又はＮであり；かつ
　Ｘ９＝Ｋ又はＲである。］
［２］　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓ又はＴである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［３］　前記アミノ酸配列においてＸ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＡである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［４］　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑ、Ｒ又はＫである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［５］　前記アミノ酸配列においてＸ４＝Ｗである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［６］　前記アミノ酸配列においてＸ５＝Ｒである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［７］　前記アミノ酸配列においてＸ６＝Ｒ又はＮである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［８］　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍ又はＬである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［９］　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒ又はＫである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１０］　前記アミノ酸配列においてＸ９＝Ｋである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１１］　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１２］　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１３］　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１４］　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１５］　残基Ｘ１のＮ末端側にさらに残基Ｘ０を含み、Ｘ０＝Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｅ又はＹである、前記［１］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１６］　Ｘ０＝Ａである、前記［１５］に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１７］　残基Ｘ９のＣ末端側にさらなるアミノ酸配列Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０を含む、前記［１］~［１６］のいずれか１項に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１０＝Ｖ、Ｌ、Ｔ、Ａ　好ましくはＸ１０＝Ｖ、Ｌより好ましくはＸ１０＝Ｖであり；
　Ｘ１１＝Ｇ、Ｒ、Ｎ　好ましくはＸ１１＝Ｇ、Ｒ　より好ましくはＸ１１＝Ｇであり；
　Ｘ１２＝Ｇ、Ａ、Ｖ　好ましくはＸ１２＝Ｇ、Ａ　より好ましくはＸ１２＝Ｇであり；
　Ｘ１３＝Ｓ．Ｐ．Ｉ．Ｌ好ましくは　Ｘ１３＝Ｓ、Ｐより好ましくはＸ１３＝Ｓであり；
　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ　好ましくは　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉより好ましくはＸ１４＝Ｖであり；
　Ｘ１５＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｒ　好ましくはＸ１５＝Ｓ、Ｔ　より好ましくはＸ１５＝Ｓであり；
　Ｘ１６＝Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ　好ましくはＸ１６＝Ｉ、Ｖ　より好ましくはＸ＝１であり；
　Ｘ１７＝Ｒ、Ｋ　好ましくはＸ１７＝Ｒであり；
　Ｘ１８＝Ｒ、Ｋ　好ましくはＸ１８＝Ｒであり；
　Ｘ１９＝Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｙ　好ましくはＸ１９＝Ａ、Ｔであり；
　Ｘ２０＝Ｓ、Ｆ好ましくはＸ２０＝Ｓである。］
［１８］　前記ペプチドが配列番号６~１６に示される各アミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、前記［１］~［１４］のいずれか１項に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［１９］　前記ペプチドが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、前記［１］~［１８］のいずれか一項に記載の阻害剤。
［２０］　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、前記［１］~［１９］のいずれか一項に記載の阻害剤。
［２１］　前記白血球が好中球である、前記［１］~［２０］に記載の阻害剤。
［２２］　Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＱであり；
　Ｘ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ａ又はＬであり；
　Ｘ３＝Ｑ、Ｒ、Ｋ、又はＭであり；
　Ｘ４＝Ｗ又はＦであり；
　Ｘ５＝Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｓ又はＥであり；
　Ｘ６＝Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＭであり；
　Ｘ７＝Ｍ、Ｌ又はＩであり；
　Ｘ８＝Ｒ、Ｋ又はＮであり；かつ
　Ｘ９＝Ｋ又はＲである。］
［２３］　前記ペプチドが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、前記［２２］に記載の組成物。
［２４］　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、前記［２２］又は［２３］に記載の組成物。
［２５］　前記白血球が好中球である、前記［２２］又は［２３］に記載の組成物。
［２６］　前記疾患は、血管炎症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）及び播種性血管内凝固からなる群より選択されるいずれか１つである、前記［２２］~［２５］のいずれか一項に記載の組成物。
［２７］　食品の形態にある、前記［２２］~［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
［２８］　注射剤の形態にある、前記［２２］~［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
［２９］　経口投与されるものである、前記［２２］~［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
［３０］　経皮投与されるものである、前記［２２］~［２６］のいずれか一項に記載の組成物。

　本発明は、白血球の細胞外トラップ形成により生じる疾患に対し、副作用の少ない治療方法を提供することができる。また、副作用の少なさがゆえに、広範囲の患者及び患者予備群に安心して使用できるという利点を有する。
　本発明の阻害剤及び組成物は、高齢者、担癌患者など免疫の低下した被験者、感染症合併症例、結核既往のある被験者など幅広い被験者層に広く使用できる。また、長期間使用しても副作用の少ない、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の治療薬及び治療方法が提供される。特に、前記疾患に治療において長期的な薬剤の使用が必要な場合、急性期症状が寛解した後の被験者の再発抑制剤として、また、前記疾患が慢性化した場合の治療薬として有用である。

各種動物由来のラクトフェリシンのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ヒトラクトフェリン断片によるＮＥＴｓ形成阻害能を示すグラフである。ヒトラクトフェリン断片によるＮＥＴｓ形成阻害能を示すグラフである。

　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１４年１０月８日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１４−２０７４１５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。

　本明細書において、特に記載のない場合は、塩基配列は、５’末端を左側に、３’末端を右側に記載するものとする。また、アミノ酸配列はアミノ末端（Ｎ末端）を左側に、カルボキシ末端（Ｃ末端）を右側に記載するものとする。
　また、各アミノ酸は以下の通り１文字表記又は３文字表記で示される。

１．白血球の細胞外トラップ形成阻害剤
　本発明は、第１の態様として、ラクトフェリン断片を含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤（以下、「本発明の阻害剤」という）を提供する。
　細胞外トラップは、様々な白血球で形成されることが報告されており、例えば、好中球（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００４；３０３：１５３２−１５３５．）、好塩基球（Ｙｏｕｓｅｆｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２００８；１４：９４９−９５３．）、肥満細胞（ｖｏｎ　Ｋｏｅｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　２００８；１１１：３０７０−３０８０．）、単球（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２０１０；１８５：２９６８−２９７９）：例えば、マクロファージ（Ｃｈｏｗ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｈｏｓｔ　＆　Ｍｉｃｒｏｂｅ，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ｉｓｓｕｅ　５，４４５−４５４，１８　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１０））などで生じることが報告されている。
　これら白血球が形成する細胞外トラップは、ＤＮＡと顆粒タンパク質（ｇｒａｎｕｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を主成分とする線維成分が放出されるという共通の特徴を有していることが報告されている（Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．，ｅｔ　ａｌ，Ａｌｌｅｒｇｙ　６８（２０１３）４０９−４１６）。
　これに対し、本発明の阻害剤は、前記線維成分を凝縮及び／又は縮合させ、これによって同線維成分の放出を抑制することができる。従って、本発明の阻害剤を用いれば、実施例で用いた好中球だけではなく、他の白血球（例えば、好塩基球、肥満細胞、単球（例えば、マクロファージ）から細胞外トラップ形成時に放出される線維成分も凝縮及び／又は縮合させ、それによって、これらの白血球の細胞外トラップ形成を阻害できることが分かる。
　本発明の阻害剤の有効成分であるラクトフェリン断片は、哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒト、ラクダ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラット）の乳由来のものである限り特に限定されないが、好ましくは、ヒトが摂取可能な哺乳動物乳（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒトの乳）に由来するラクトフェリンの断片であり、より好ましくは、ヒトの乳由来のラクトフェリンの断片である。あるいは、ラクトフェリン及びその断片は、前記哺乳動物の好中球に由来するものであってもよい。
　種々の哺乳動物に由来するラクトフェリンのアミノ酸配列が公知である（下記表２参照）。

　ラクトフェリン断片は、完全長ラクトフェリンを断片化して得られるものであれば特に限定されず、酸性アミノ酸残基を多く含む酸性断片（ａｃｉｄｉｃ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）又は塩基性アミノ酸残基を多く含む塩基性断片（ｂａｓｉｃ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）であってもよい。ある実施態様では、ランクトフェリン断片は完全長ラクトフェリンをペプシン分解することにより得られる断片であり、好ましくは塩基性断片であり、さらに別の実施態様ではラクトフェリン断片はラクトフェリシンである。
　ここで酸性アミノ酸残基とは、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）より選択されるアミノ酸残基を意味する。
　また、塩基性アミノ酸残基とは、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）及びリジン（Ｋ）より選択されるアミノ酸残基を意味する。

　ある実施形態では、本発明の阻害剤に使用するペプチドは、以下のアミノ酸配列を含むラクトフェリン断片である。
Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＱであり；
　Ｘ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ａ又はＬであり；
　Ｘ３＝Ｑ、Ｒ、Ｋ、又はＭであり；
　Ｘ４＝Ｗ又はＦであり；
　Ｘ５＝Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｓ又はＥであり；
　Ｘ６＝Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＭであり；
　Ｘ７＝Ｍ、Ｌ又はＩであり；
　Ｘ８＝Ｒ、Ｋ又はＮであり；かつ
　Ｘ９＝Ｋ又はＲである。］

　以下、「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９」からなるアミノ酸配列を「ジェネリック配列」と呼び。また、本発明の阻害剤に使用するペプチド、即ちラクトフェリン断片は、以下、「本発明のＬＦ断片」と呼ぶ。
　ジェネリック配列において、Ｘ１は、好ましくはＸ１＝Ｓ又はＴであり、より好ましくはＸ１＝Ｓである。
　Ｘ２は、好ましくはＸ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＡである。
　Ｘ３は、好ましくはＸ３＝Ｑ、Ｒ又はＫであり、より好ましくはＸ３＝Ｑである。
　Ｘ４は、好ましくはＸ４＝Ｗである。
　Ｘ５は、好ましくはＸ５＝Ｒである。
　Ｘ６は、好ましくはＸ６＝Ｒ又はＮである。
　Ｘ７は、好ましくはＸ７＝Ｍ又はＬであり、より好ましくはＸ７＝Ｍである。
　Ｘ８は、好ましくはＸ８＝Ｒ又はＫであり、より好ましくはＸ８＝Ｒである。
　Ｘ９は、好ましくはＸ９＝Ｋである。

　本発明のＬＦ断片は、場合により「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６」（９マー）又は「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２」（４マー）を含むもの、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　即ち、本発明のＬＦ断片は、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ」（３マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２」（４マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３」（５マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４」（６マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ」（７マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５」（８マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６」（９マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７」（１０マー）、
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８」（１１マー）及び
「Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９」（１２マー）
からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むもの、あるいは同アミノ酸配列からなるものであってもよく、そのいずれの場合であっても白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有する（同活性については下記参照）。
　上記３マー~９マーの各アミノ酸配列においてＸ１~Ｘ９は、上記で述べたとおりである。

　ある実施態様では、本発明のＬＦ断片は、上記ジェネリック配列の残基Ｘ１のＮ末端側にさらに残基Ｘ０を含んでいてもよい。この場合、本発明のＬＦ断片は、以下のアミノ酸配列を含むことになる。
Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１~Ｘ９は、上記で述べたとおりであり、
　Ｘ０＝Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｅ又はＹであり、好ましくは、Ｘ０＝Ａである。］

　あるいは、本発明のＬＦ断片は、上記ジェネリック配列の残基Ｘ９のＣ末端側にさらなるアミノ酸配列Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０を含んでいてもよい。この場合、本発明のＬＦ断片は、以下のアミノ酸配列を含むことになる。
Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１~Ｘ９は、上記で述べたとおりであり、
　Ｘ１０＝Ｖ、Ｌ、Ｔ、Ａ　好ましくはＸ１０＝Ｖ、Ｌより好ましくはＸ１０＝Ｖであり；
　Ｘ１１＝Ｇ、Ｒ、Ｎ　好ましくはＸ１１＝Ｇ、Ｒ　より好ましくはＸ１１＝Ｇであり；
　Ｘ１２＝Ｇ、Ａ、Ｖ　好ましくはＸ１２＝Ｇ、Ａ　より好ましくはＸ１２＝Ｇであり；
　Ｘ１３＝Ｓ．Ｐ．Ｉ．Ｌ好ましくは　Ｘ１３＝Ｓ、Ｐより好ましくはＸ１３＝Ｓであり；
　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ　好ましくは　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉより好ましくはＸ１４＝Ｖであり；
　Ｘ１５＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｒ　好ましくはＸ１５＝Ｓ、Ｔ　より好ましくはＸ１５＝Ｓであり；
　Ｘ１６＝Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ａ　好ましくはＸ１６＝Ｉ、Ｖ　より好ましくはＸ＝Ｉであり；
　Ｘ１７＝Ｒ、Ｋ　好ましくはＸ１７＝Ｒであり；
　Ｘ１８＝Ｒ、Ｋ　好ましくはＸ１８＝Ｒであり；
　Ｘ１９＝Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｙ　好ましくはＸ１９＝Ａ、Ｔであり；
　Ｘ２０＝Ｓ、Ｆ好ましくはＸ２０＝Ｓである。］

　また、別の態様において、本発明のＬＦ断片は、上記ジェネリック配列の残基Ｘ０のＮ末端側及び残基Ｘ２０のＣ末端側のいずれか一方あるいは両方にさらなるアミノ酸配列Ｘを含んでいてもよい。この場合、本発明のＬＦ断片は、以下のアミノ酸配列を含むことになる。
Ｘ−Ｘ０−Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ
［上記アミノ酸配列においてＸ０~Ｘ２０は、上記で述べたとおりであり、
　Ｘは１~１６個の任意のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。］

　さらに別の態様において、本発明のＬＦ断片は、配列番号６~１６に示される各アミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる。ここで、配列番号６~１６は各種動物由来のラクトフェリシンのアミノ酸配列である（以下の表３を参照）。

　図１に示す通り、配列番号６~１６に示すアミノ酸配列は、上記ジェネリック配列によって包括的に表現することができる。

　上記ラクトフェリン断片は、以下の実施例に示す通り、白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を有する。
　ここで、「白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性」において、白血球は、白血球の細胞外トラップを形成する生物に由来するものであり、好ましくは脊椎動物に由来するものであり、さらに好ましくは哺乳動物由来のものである。哺乳動物の例としては、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒト、ラクダ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットが挙げられ、好ましくは、ヒトである。
　また、白血球は、上記由来のものであると同時に、好ましくは、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものであり、より好ましくは、好中球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものであり、さらに好ましくは、好中球である。

　上記ラクトフェリン断片、即ち本発明のＬＦ断片、の存在下及び非存在下で上記白血球を培養して、前記培養系の顕微鏡観察により、本発明のＬＦ断片存在下で細胞外トラップ形成が減少していることを確認することで、白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を確認することができる。
　上記活性の確認試験においては、上記白血球は、本発明のＬＦ断片添加前に、細胞外トラップ形成促進剤（パラメトキシアンフェタミン（ＰＭＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等）で処理されていることが好ましい。

　あるいは、上記培養系の培養上清を回収し、同上清中のＤＮＡ濃度を測定することで白血球の細胞外トラップ形成を阻害する活性を確認することができる。このようなＤＮＡ濃度は、主として細胞外トラップ形成時に培養上清中に放出されたＤＮＡによるものである。
　本発明のＬＦ断片によって細胞外トラップの形成が阻害された場合、上清中のＤＮＡ濃度は、本発明のＬＦ断片非存在下の条件と比べて低下する。
　この場合も、上記白血球は、本発明のＬＦ断片添加前に、細胞外トラップ形成促進剤（パラメトキシアンフェタミン（ＰＭＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ等）で処理されていることが好ましい。
　ＤＮＡの濃度は、市販のキット（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて簡便に測定することができる。

　各白血球の培養条件、細胞外トラップの確認方法については、以下を参照することができる：好中球（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００４；３０３：１５３２−１５３５．）、Ａ．Ｋ　Ｇｕｐｔａ．ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ　２０１０；５８４：３１９３−３１９７，Ｄ　Ｊ　Ｎｏｖｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４（４）：８２７−３４．）、好塩基球（Ｙｏｕｓｅｆｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２００８；１４：９４９−９５３．）、肥満細胞（ｖｏｎ　Ｋｏｃｋｒｉｔｚ−Ｂｌｉｃｋｗｅｄｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　２００８；１１１：３０７０−３０８０．）、単球（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＳＪ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２０１０；１８５：２９６８−２９７９）：例えば、マクロファージ（Ｃｈｏｗ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｈｏｓｔ　＆　Ｍｉｃｒｏｂｅ，Ｖｏｌｕｍｅ　８，Ｉｓｓｕｅ　５，４４５−４５４，１８　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１０））。

　また、本発明のＬＦ断片は、化合物で修飾されたものでもよい。例えば、本発明のＬＦ断片は、ポリエチレングリコールを結合させた修飾タンパク質（特許第４１９５４８６号、特許第４２６１５３１号、国際公開公報ＷＯ２００９／１１３７４３）や、別のタンパク質又はその断片（例えば、血中安定タンパク質ＩｇＧやアルブミン又はその断片等）を融合させた融合タンパク質（特願２０１２−９８０８５号）であってもよい。

２．治療方法
　本発明の阻害剤を用いることにより、効果的に、白血球の細胞外トラップ形成を阻害することが可能である。つまり、本発明の阻害剤を用いることにより、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療することができる（以下、「本発明の治療方法」という）。
　本明細書において用いる「治療」なる用語は、一般的には、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の症状を改善させることを意味する。また「改善」なる用語は、例えば、本発明のＬＦ断片を投与しない場合と比較して、疾患の程度が軽減する場合及び悪化しない場合を指し、予防という意味をも包含する。
　この場合、治療対象（患者）は、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を患う生物又は患うリスクのある生物であり、好ましくは脊椎動物であり、さらに好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ及びネコからなる群より選択される哺乳動物が挙げられ、さらに好ましくは、ヒトである。
　本発明の治療方法において、「白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患」とは、患者体内で白血球の細胞外トラップ形成の増加が観察される疾患であれば特に限定されない。
　このような疾患としては、例えば、血管炎症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎等）、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、虫垂炎、アスペルギルス感染症、肺炎、肺炎双球菌感染症、壊死性筋膜炎、連鎖球菌感染、敗血症、子癇前症、クローン病、住血吸虫症、歯周炎、結核、乳房炎、マラリア、嚢胞性線維症、並びに深部静脈血栓症（ｖｏｎ　Ｂｒｕｈｌ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２０１２　Ａｐｒ　９；２０９（４）：８１９−３５）、心筋梗塞（ｄｅ　Ｂｏｅｒ，Ｏ．Ｊ．，Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１３　Ｆｅｂ；１０９（２）：２９０−７）、腫瘍関連血栓症塞（Ｄｅｍｅｒｓ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２０１２　Ａｕｇ　７；１０９（３２）：１３０７６−８１）及び播種性血管内凝固（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ＤＩＣ）（Ｔｏｂｉａｓ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２９　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１１，ｖｏｌ．１１８，ｎｏ．１３，ｐ．３７０８−３７１４）などの血栓性疾患等が挙げられる（非特許文献２及び１２）。血管炎症候群はその発症血管のサイズにより、大型血管炎、中型血管炎、小型血管炎と分類されている。上述したＡＮＣＡ関連血管炎、ＳＬＥなどのＮＥＴｓ関連疾患は、小型血管炎に分類されるが、中型血管炎である結節性多発動脈炎の重症化（循環器病の診断と治療に関するガイドライン（２００６−２００７年度合同研究班報告））や敗血症や固形癌においてもＤＩＣを合併することが頻繁にある。　これらの疾患は、白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）形成による細胞毒性が血管内皮障害をもたらし、このため臓器の機能不全が生じる。また上記の血栓性疾患においては白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）形成が引き金となって、血栓形成のカスケードが促進される。本発明のＬＦ断片は白血球の細胞外トラップ（例えばＮＥＴｓ）の形成および放出・拡散を抑制することにより血管内皮障害を予防し、さらには血栓形成のカスケードを抑制することにより臓器保護的作用を示し、上記疾患に治療効果を奏するものと考えられる。
　好ましくは、本発明の治療方法の対象となる疾患は、血管炎症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎等）、全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応及び虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）であり、さらに好ましくは、血中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体価の増加を伴う顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）である。
　なお、ラクトフェリンを用いてＩ型糖尿病や関節リウマチの自己免疫疾患を治療することも報告されているが（特許文献１）、Ｉ型糖尿病や関節リウマチなどの自己免疫疾患では、白血球の細胞外トラップの形成が主たる病因としては考えられていないことから、前記報告に係る治療において、ラクトフェリンは、細胞外トラップ形成を介さずに作用している可能性が高いといえる。
　すなわち、本発明において、ラクトフェリン断片は、全く新規なメカニズム、つまり、白血球の細胞外トラップの形成を阻害するメカニズムにより上記疾患に対する治療作用を示すものといえる。
　ＳＬＥ治療やＡＮＣＡに起因する疾患の治療はステロイドや免疫抑制剤等が使用されているが、これらの治療方法には患者の肉体的負担を伴い（副作用等）、苦痛を強いるほか、他の疾患（感染症）を誘発するリスクが高いという問題がある。
　これに対し、本発明では、従来より食品に含まれるラクトフェリンの断片を有効成分として用いるため、副作用も少なく、患者に苦痛を強いることもなく、他の疾患を誘発するリスクも少ないという利点を有する。

３．組成物
　本発明は別の態様として、本発明のＬＦ断片を含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物（以下、「本発明の組成物」）を提供する。
　ここで、「組成物」なる用語は、本発明において有用な活性成分（本発明のラクトフェリン断片）の調製において用いられる担体等の添加物を含有するものを意味する。
　本発明の組成物において、「本発明のＬＦ断片」及び「白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患」は、上述の通りである。

　本発明の組成物の投与経路は、一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移植が挙げられ、好ましくは経口投与及び静脈投与である。

　本発明の組成物は、カプセル、錠剤、粉末等の固形剤であってもよく、溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤であってもよい。
　本発明の経口投与の場合、組成物は、好ましくは固形剤である。また、注射剤の場合は凍結乾燥手法等を含めた固形剤、もしくは液剤である。経皮投与の場合、組成物は溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤（スプレーを含む）、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤として調製されてもよく、あるいは湿布製剤として調製されてもよい。

　本発明のＬＦ断片は、食品や飼料中に添加して、食品または飼料としてヒトまたはヒト以外の対象動物に摂取させることもできる。このような食品または飼料の製造方法も当業者には公知である。また、溶液製剤として注射剤として製剤化も可能である。
　さらには、本発明のＬＦ断片をそのまま、あるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に添加してもよい。

　本発明のＬＦ断片は、単独で使用してもよく、又は薬理学的に許容可能な他の成分と共に調合してもよい。
　例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口投与用組成物として調製する場合、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法によって製剤化される。この種の組成物には、前記賦形剤の他に、コーティング剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することができる。

　本発明の組成物は、有効成分であるラクトフェリン断片を治療上有効量で含み得る。ここで、「治療上有効量」とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の症状が、ラクトフェリン断片を投与しない場合と比較して、軽減する場合及び悪化しない量を指し、予防において有効な量という意味をも包含する。
　例えば、経口投与の場合、治療上有効量は、０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．００５~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~５ｇ／ｋｇ／日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、治療上有効量として、一日あたり１０ｍｇ~１５，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１２，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~６，０００ｍｇの量である。また、経皮投与の場合、治療上有効量は、０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．００５~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~１０ｇ／ｋｇ／日、０．０１~５ｇ／ｋｇ／日とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、治療上有効量として、一日あたり１０ｍｇ~１５，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１２，０００ｍｇ、１０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~１０，０００ｍｇ、２０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~８，０００ｍｇ、３０ｍｇ~６，０００ｍｇの量である。このような一日あたりの用量を一度にまたは分割して、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患の治療を必要とする患者に投与することができる。
　なお、本発明の組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、腫瘍疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。
　上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても治療効果を奏する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。

　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。

ラクトフェリン由来ペプチド断片前処理による健常人末梢血好中球のＮＥＴｓ形成刺激の阻害効果
１．ヒト好中球の単離方法
　健常人からＥＤＴＡ含有注射器（針１８~２２Ｇ）で１回の実験用に１５ｍｌ~２０ｍｌの末梢血を採血した。採血後、３ｍｌのＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＣａｔＮｏ．ＤＳＢＮ１００，ＤＳファーマバイオケミカル株式会社）を入れている１５ｍｌのコニカルチューブの中に、下層のＭｏｎｏ−Ｐｏｌｙ　Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍと全血３．５ｍｌを静かに重層する。１５ｍｌのコニカルチューブを室温（１５~３０℃）でスイング式の遠心分離機で４００×ｇ、２０分間遠心し、コニカルチューブを静かに取り出す。アスピレータ等で最上部の褐色のプラズマ層とその直ぐ下層のリンパ球・単球層を除去する。また、リンパ球・単球層の下層の透明層を可能な限り除く。透明層の下層にある薄いピンク色層をパスツールピペットで取り、好中球を洗浄するためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−）；塩化ナトリウム１３７ｍＭ、塩化カリウム２．７ｍＭ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物８．１ｍＭ、リン酸２水素カリウム１．４７ｍＭ）の入った試験管に移す。好中球の入った試験管を室温（１５~３０℃）で２００×ｇ、１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨てる。試験管に４℃の滅菌水を好中球に加え、３０秒間氷上に静置して、混ざっている赤血球を溶血させる。溶血後、４５ｍｌのＰＢＳ（−）を加えて２００×ｇ、１０分間遠心する。試験管を取り出し、上清を捨て、沈殿物を培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に懸濁させ、使用する直前まで８℃で保存した。分離できた好中球数は１×１０^６個／ｍｌ~１×１０^７個／ｍｌであり、純度に関してはｃｙｔｏｓｐｉｎ後の検体をＧｉｅｍｓａ染色処置し目視でカウントし、９５~９８％であった。

２．好中球の前処置方（ＮＥＴｓ形成阻害）とＮｅｔｏｓｉｓ（ＮＥＴｓ形成）誘導方法
　上記「１．ヒト好中球の単離方法」に記載の好中球単離後から約１時間後に好中球の前処置を行った。８ｗｅｌｌ−μ　スライド（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｉｂ　８０８２６　Ｉｂｉｄｉ（登録商標））に好中球を４００μｌの培地ＤＭＥＭ＋２％ヒト血清Ａｌｂ（Ｓｅｒｕｍ　ｈｕｍａｎ　ａｌｂｕｍｉｎ；Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ．Ａ９０８０　Ｓｉｇｍａ＋４ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に約１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで撒き、ラクトフェリンペプチド断片を添加し３０分間室温で前処置を行った。

３．培養上清中ＤＮＡ濃度測定方法
　培養上清中を回収し、２００×ｇ、１０分間遠心し、上精を新しい微小遠心チューブに移す。ＤＮＡ量の測定はＰｉｃｏｇｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐ１１４９６　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、付随のプロトコルに沿って行った。ヒトラクトフェリンを前処理すると、濃度依存的に培養上清中のＤＮＡ濃度が減少し、ＮＥＴｓによるＤＮＡの放出を抑制された。

４．ウシラクトフェリンからの塩基性ペプチドと酸性ペプチドの調製方法
　ウシラクトフェリンを滅菌水に最終量が５％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、塩酸を用いて水溶液のｐＨ＝２．５　に下げる。その後、ラクトフェリン溶液にペプシン（Ｅ／Ｓ＝１／５０）を加え、３７℃に５分間静置する。ラクトフェリンの加水分解を、水酸化ナトリウムを用いて水溶液のｐＨ＝７．０に調製することで停止させる。ラクトフェリンの塩基性ペプチドはＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０Ｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン）を用いて単離精製した。溶出勾配として、２Ｍ　塩化ナトリウムを加えた　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）を不純物とラクトフェリン未消化物の除去するために、２Ｍ　塩化アンモニウムを加えた　２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）によってラクトフェリンの塩基性ペプチド（配列番号６）を溶出した。
　ラクトフェリンの酸性ペプチド（ＮＣＢＩ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏｓ．３ＩＡＺ＿Ａ，３ＩＢ１＿Ａ、３ＩＢ０＿Ａ、３ＩＢ２＿Ａ、４ＯＱＯ＿Ａ　及び４ＯＱＯ＿Ｂに示す各アミノ酸配列の第３１６~３３２番目のアミノ酸残基からなる各ペプチド）は、Ｆ−ＭＯＣ法（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）に則り、ＡＢＩ　４３３Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ライフテクノロジー社）を用いて化学合成を行った。調製ペプチドのアミノ酸配列はプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−２１Ａ（株式会社島津製作所）により解析した。

５．塩基性ペプチドの調製
　その他の塩基性ペプチド（配列番号６及び７）の調製は株式会社ピーエイチジャパンに委託した。

６．結果
　ラクトフェリン由来の酸性ペプチドはＮＥＴｓを抑制することはなかった。塩基性ペプチド（配列番号６）についてはラクトフェリシンをコードする領域に、阻害効果が認めら得た（図２）。また、ラクトフェリシンをコードするペプチド領域（配列番号６及び７）は、容量依存的にＮＥＴｓ形成を阻害した（図３）。

　本発明は、白血球の細胞外トラップ形成により生じる疾患に対し、副作用の少ない治療方法を提供することができる。また、副作用の低さがゆえに、広範囲の患者及び患者予備群に安心して使用できるという利点を有する。
　また、非自己免疫疾患モデルにおいて本発明による白血球の細胞外トラップ形成阻害能が確認されたことから、本発明において、ラクトフェリン断片は、過去に報告された作用機序（特許文献１）とは異なる、全く新規な作用機序により治療作用を示すといえる。

配列表

Claims

　Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
　で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、白血球の細胞外トラップ形成阻害剤。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１　＝　Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＱであり；
　Ｘ２　＝　Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ａ又はＬであり；
　Ｘ３　＝　Ｑ、Ｒ、Ｋ、又はＭであり；
　Ｘ４　＝　Ｗ又はＦであり；
　Ｘ５　＝　Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｓ又はＥであり；
　Ｘ６　＝　Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＭであり；
　Ｘ７　＝　Ｍ、Ｌ又はＩであり；
　Ｘ８　＝　Ｒ、Ｋ又はＮであり；かつ
　Ｘ９　＝　Ｋ又はＲである。］
　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓ又はＴである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＡである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑ、Ｒ又はＫである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ４＝Ｗである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ５＝Ｒである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ６＝Ｒ又はＮである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍ又はＬである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒ又はＫである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ９＝Ｋである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　残基Ｘ１のＮ末端側にさらに残基Ｘ０を含み、Ｘ０＝Ａ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｅ又はＹである、請求項１に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　Ｘ０＝Ａである、請求項１５に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　残基Ｘ９のＣ末端側にさらなるアミノ酸配列Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０を含む、請求項１~１６のいずれか１項に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１０＝Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＡであり；
　Ｘ１１＝Ｇ、Ｒ又はＮであり；
　Ｘ１２＝Ｇ、Ａ又はＶであり；
　Ｘ１３＝Ｓ、Ｐ、Ｉ又はＬであり；
　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＭであり；
　Ｘ１５＝Ｓ、Ｔ、Ｆ又はＲであり；
　Ｘ１６＝Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＡであり；
　Ｘ１７＝Ｒ又はＫであり；
　Ｘ１８＝Ｒ又はＫであり；
　Ｘ１９＝Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｓ又はＹであり；
　Ｘ２０＝Ｓ又はＦである。］
　前記ペプチドが配列番号６~１６に示される各アミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１~１４のいずれか１項に記載の細胞外トラップ形成阻害剤。
　前記ペプチドが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、請求項１~１８のいずれか一項に記載の阻害剤。
　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項１~１９のいずれか一項に記載の阻害剤。
　前記白血球が好中球である、請求項１~２０に記載の阻害剤。
　Ｘ１−Ｋ−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｑ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、白血球の細胞外トラップ形成に関連する疾患を治療するための組成物。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１＝Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＱであり；
　Ｘ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ａ又はＬであり；
　Ｘ３＝Ｑ、Ｒ、Ｋ、又はＭであり；
　Ｘ４＝Ｗ又はＦであり；
　Ｘ５＝Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｎ、Ｓ又はＥであり；
　Ｘ６＝Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＭであり；
　Ｘ７＝Ｍ、Ｌ又はＩであり；
　Ｘ８＝Ｒ、Ｋ又はＮであり；かつ
　Ｘ９＝Ｋ又はＲである。］
　前記ペプチドが０．００１~１０ｇ／ｋｇ／日の量になるように調製された、請求項２２に記載の組成物。
　前記白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び肥満細胞からなる群から選択されるいずれか１つのものである、請求項２２又は２３に記載の組成物。
　前記白血球が好中球である、請求項２２又は２３に記載の組成物。
　前記疾患は、血管炎症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、全身性エリテマトーデス、局所シュワルツマン反応、虚血再灌流障害を伴う急性腎障害（ＡＫＩ）及び播種性血管内凝固からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項２２~２５のいずれか一項に記載の組成物。
　食品の形態にある、請求項２２~２６のいずれか一項に記載の組成物。
　注射剤の形態にある、請求項２２~２６のいずれか一項に記載の組成物。
　経口投与されるものである、請求項２２~２６のいずれか一項に記載の組成物。
　経皮投与されるものである、請求項２２~２６のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓ又はＴである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ２＝Ｒ、Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＡである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑ、Ｒ又はＫである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ４＝Ｗである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ５＝Ｒである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ６＝Ｒ又はＮである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍ又はＬである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒ又はＫである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ９＝Ｋである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ１＝Ｓである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ３＝Ｑである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ７＝Ｍである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　前記アミノ酸配列においてＸ８＝Ｒである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　残基Ｘ１のＮ末端側にさらに残基Ｘ０を含み、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　Ｘ０＝Ａである、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
　残基Ｘ９のＣ末端側にさらなるアミノ酸配列Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｐ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃ−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０を含む、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。
［上記アミノ酸配列において
　Ｘ１０＝Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＡであり；
　Ｘ１１＝Ｇ、Ｒ又はＮであり；
　Ｘ１２＝Ｇ、Ａ又はＶであり；
　Ｘ１３＝Ｓ、Ｐ、Ｉ又はＬであり；
　Ｘ１４＝Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＭであり；
　Ｘ１５＝Ｓ、Ｔ、Ｆ又はＲであり；
　Ｘ１６＝Ｉ、Ｖ、Ｔ又はＡであり；
　Ｘ１７＝Ｒ又はＫであり；
　Ｘ１８＝Ｒ又はＫであり；
　Ｘ１９＝Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｓ又はＹであり；
　Ｘ２０＝Ｓ又はＦである。］
　前記ペプチドが配列番号６~１６に示される各アミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２２~３０のいずれか一項に記載の組成物。