WO2005089788A1

WO2005089788A1 - 癌治療のための薬剤

Info

Publication number: WO2005089788A1
Application number: PCT/JP2005/004123
Authority: WO
Inventors: Kiyohiko Hatake; Yasuhito Terui; Yuji Mishima; Akio Yamada; Takuma Sakurai; Takehito Itoh
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2005-09-29
Also published as: DK1726310T3; KR20060095899A; NZ544448A; AU2005224209A1; EP1726310B1; AU2005224209B2; EP1726310A1; CN101444624A; CN101444624B; CN1838965B; US20060204501A1; EP1726310A4; ES2381189T3; HK1093436A1; ATE541581T1; CA2533753A1; KR100773259B1; PT1726310E; JP3998702B2; HK1128113A1

Abstract

　ラクトフェリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有するラクトフェリン加水分解混合物又はラクトフェリン部分ペプチドを、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の有効成分として用いる。

Description

明細書

癌治療のための薬剤

技術分野

[0001] 本発明は、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有するラタトフエリン加水分解混合物、又は当該ラタトフエリン加水分解混合物から分離することが可能なラタトフヱリンの部分ペプチド、若しくは化学合成等によって調製することが可能なラタトフヱリンの部分ペプチドを有効成分として含有する薬剤に関する。さらに詳しくは、抗体医薬に耐性を有する癌細胞への抗体医薬に対する感受性を高める効果を有する薬剤に関する。

背景技術

[0002] 抗体が、特定の抗原を認識し、生体内から異物を排除する仕組みについては、古く力研究されている。一方、治療への抗体の応用は、免疫グロブリン製剤が有名である力力価が不十分であったり、未知の感染源を混入させてしまうなどの問題を抱えていた。

[0003] Milstein及び Kohlerによるモノクローナル抗体の作製技術の発明は、様々な抗体技術に飛躍的な進歩をもたらした。ポストゲノムと呼ばれる今日では、腫瘍細胞や病原因子の持つ特異的な遺伝子やその発現産物が次々と明らかになり、それらを標的とした研究法、あるいはそれらを利用した治療法の開発に、抗体技術が大きく貢献している。そして、今後も抗体技術の発展に大きな期待と注目が集まっている。

[0004] 悪性腫瘍を標的にした抗体医薬は、分子標的治療の分野で、目覚ましい発展を遂げてきた。日本では承認された抗体医薬は未だ 2品目のみではあるが、現在知られているだけでも、悪性リンパ腫（CD20、 HLA-DR、 CD5)、急性骨髄性白血病（CD33、 CD66)、慢性リンパ球性白血病（CD52、 CD20)、急性リンパ球性白血病（CD19、 CD20、 CD22)、多発性骨髄腫（Id-idiotype、 HM1.24)、乳癌（HER2/neu)、上皮性癌 (EGF-R、 VEGF)、大腸癌（17-1A、 CEA)、卵巣癌（CA125)などに対する抗体医薬力 Sある (例えば、非特許文献 1)。

[0005] これら悪性腫瘍に対する抗体医薬の作用機序としては、大きく 3つの機序が考えられている。すなわち、第 1は、抗体が悪性腫瘍の細胞表面に結合すると、腫瘍細胞になんらかのシグナルが伝達され、細胞死を引き起こす機序である。第 2は、生体内に存在するエフェクター細胞（好中球、マクロファージ、 NK細胞など）力抗原抗体反応で腫瘍細胞にとりついた抗体を認識して、細胞傷害活性により、腫瘍細胞を殺す機序である。第 3は、生体内の補体成分が、抗原抗体反応で腫瘍細胞に取りついた抗体を認識して、補体系の活性化経路のうちの、古典経路によって細胞傷害作用を引き起こし、腫瘍細胞を殺すという機序である (例えば、非特許文献 2)。

[0006] 抗体医薬の開発によって、多くの癌患者の命が救われたが、残念ながら、治療を行なう過程で、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難な患者も多数報告されるようになった。そこで、化学療法剤との併用などの治療法が検討されてきたが、副作用を防ぐための加療の制限などの問題を抱えていた (例えば、非特許文献 3)。

[0007] 腫瘍細胞の抗体医薬に対する耐性獲得の機序として、補体制御因子と呼ばれる分子（CD46、 CD55、 CD59)の腫瘍細胞表面での発現量が増加して、上記の 3番目の作用機序における補体の古典経路を不活性化することで、抵抗性を獲得しているケースが多数報告されている（例えば、非特許文献 4)。このような機序によって、補体系の細胞障害活性が低下し、結果として標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性が低下することが示唆されている。このように抗体医薬に耐性を有する悪性腫瘍に対する補体系の細胞障害活性を向上させる技術の開発が望まれていた。

[0008] ラタトフエリンは、哺乳動物の乳汁、唾液、涙、精液、種々の粘液等に存在する、非ヘム鉄結合糖蛋白質であり、鉄吸着作用、細胞増殖促進作用、免疫調整作用、および抗菌作用を有する多機能蛋白質である。牛ラ外フェリンは、乳業工場で日常的に取扱う生脱脂乳またはチーズ'ホエーから容易に、かつ大量に得ることができ、商品として直ちに利用することができる。

[0009] ラタトフエリシン (本出願人による登録商標）は、本願発明の発明者等によりゥシ 'ラタトフェリンの酵素加水分解物中から初めて単離された新規なペプチドである（例えば、特許文献 1)。ゥシ 'ラタトフエリンから単離されたラタトフエリシンは、例えば配列番号 2のアミノ酸配列を有している。ラタトフヱリシンは、人および動物の各種疾病の原因となるグラム陽性およびグラム陰性の細菌、酵母等広範囲の微生物に対して低濃度で抗菌作用を有する極めて有用な物質である。臨床上使用されてレ、る抗生物質を含む他の大部分の抗菌剤は、人および動物にとって異物である化学物質であるが、ラタトフヱリシンは、化学物質および化学的に合成されたアミノ酸誘導体を含まない天然のペプチドであるから、人および動物に対して健康的であり、かつ安全である。何故ならば、ラタトフエリシンは、通常摂取している牛乳に含まれるラタトフヱリンの胃ぺプシン分解により人の胃の中で自然に生成されるからである。従って、ラタトフヱリシンは安全な、かつ有効な抗菌剤として例えば、点眼剤、口腔剤、化粧品、皮膚剤、臨床用食品、ペット用製品等の多種多様な商品に利用でき、極めて大きな価値を有している。

従来、ラタトフエリンによる抗腫瘍効果については、抗腫瘍剤（特許文献 2)、非経口用抗腫瘍剤 (特許文献 3)、経口がん転移抑制剤 (特許文献 4)等が開示されてレ、る。これらの技術は、いずれもラタトフヱリンが直接的に腫瘍細胞に作用する効果によるものであって、近年の癌治療において注目されている抗体療法にによる抗体医薬の細胞障害活性を高めることによる抗腫瘍効果とは異なるものである。すなわち、ラタトフエリンの加水分解混合物やラタトフエリンの部分ペプチドに、癌の抗体療法、特に耐性を有する癌の抗体療法において、抗体医薬の細胞障害活性を顕著に高める効果を有することは、従来知られていなかった。

特許文献 1 :特許第 2818056号公報

特許文献 2 :特開昭 63— 51337号公報

特許文献 3：特開平 7 - 309771号公報

特許文献 4 :特開平 10— 59864号公報

非特許文献 1 :最新医学、新津洋司郎*加藤和則著、第 58卷、第 12号、 2003年、 p . 5-12

非特許文献 2 :免疫学最新イラストレイテッド、小安重夫編、木下タロウ著、 2003年、 p. 35-50

非特許文献 3 :血液フロンティア、畠清彦著、第 12卷、 11号、 2002年、 p. 65-71 非特許文献 4 :オンコジーン（Oncogene)、第 22卷、 2003年、 p. 7359-7368 発明の開示

[0011] 本発明は、癌の抗体療法、特に耐性を有する癌の抗体療法において、副作用を示さず、抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有する安全性が高い薬剤、同薬剤を含有する飲食品、又は抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法を提供することを目的としている。

[0012] 本発明者らは、より効果的に抗体医薬の細胞障害活性を高め、治療成績の向上につながる技術に注目する中で、悪性腫瘍の患者において抗体医薬に対する耐性が確認された状態であっても、標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性が高められれば、補体系の細胞障害活性を十分に発揮させることが可能ではなレ、かと考え、鋭意研究開発を重ねた。その結果、抗体と補体による細胞傷害作用を発現する実験系において、ラタトフエリンの加水分解混合物、及び当該ラタトフエリン加水分解混合物から分離することが可能なペプチドが、標的腫瘍細胞に作用して、抗体医薬に対する感受性を増強することを見いだし、本発明を完成させるに至った。

[0013] すなわち、本発明は、従来知られていたラタトフエリンによる抗腫瘍効果とは本質的に異なり、これまで有効な治療法や薬剤が殆ど見出されていなかった癌に対して、特に有効と考えられている抗体療法において、その抗体医薬の細胞障害活性を増強する効果に基づぐラタトフエリンの加水分解混合物又は当該タトフェリンの加水分解混合物から分離されるラ外フェリンの部分ペプチド、若しくは化学合成等によって調製することが可能なラタトフヱリンの部分ペプチドを有効成分とする新たな薬剤及びその使用に関する。

[0014] 前記課題を解決する本願の第一の発明は、ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するラタトフエリン加水分解物を有効成分として含有する、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤である。

[0015] 前記第一の発明は、以下の 1)一 6)を好ましい態様としている。

1)前記加水分解酵素がペプシンであること。

2)前記ラタトフヱリン加水分解物の分解率が 6— 20%であること。

3)前記ラタトフヱリン加水分解物の数平均分子量が 500— 5000であること。 4)前記癌が、乳癌、 B細胞リンパ腫、又は大腸癌のいずれかであること。

5)前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であること。

6)前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用が、標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性を高める作用であること。

[0016] 前記第一の発明の他の態様は、前記薬剤の製造における、前記ラタトフエリン加水分解物の使用である。また、前記第一の発明の別の態様は、抗体医薬を用いた癌の抗体療法において、前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法であって、前記ラタトフヱリン加水分解物を患者に投与することを特徴とする方法である。

[0017] 前記課題を解決する本願の第二の発明は、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤であって、以下の（a)— (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物を有効成分とする薬剤である。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(b)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36— 60のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつ癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。

(d)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36— 61のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつ癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド

[0018] 前記第二の発明は、以下の 7) 9)を好ましい態様としている。

7)前記癌が、乳癌、 B細胞リンパ腫、又は大腸癌のいずれかであること。

8)前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であること。

9)前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用が、標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性を高める作用であること。

[0019] 前記第二の発明の他の態様は、前記薬剤の製造における、前記ペプチドの使用である。また、前記第二の発明の別の態様は、抗体医薬を用いた癌の抗体療法において、前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法であって、前記ラ外フェリン加水分解物を患者に投与することを特徴とする方法である。

[0020] また本願発明は、前記第一の発明又は第二の発明の薬剤を含有する飲食品を提供する。

[0021] 前記課題を解決する本願の第三の発明は、ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができるラタトフヱリン加水分解物を含有し、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するものであることを特徴とし、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強するために用いられる旨の表示を付した飲食品である。

[0022] 前記課題を解決する本願の第四の発明は、ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができるラタトフヱリン加水分解物及び抗体医薬を有効成分として含有する、癌の抗体療法用の薬剤である。

[0023] 前記第四の発明は、以下の 10)— 14)を好ましい態様としている。

10)前記加水分解酵素がペプシンであること。

11)前記ラタトフエリン加水分解物の分解率が 6— 20%であること。

12)前記ラタトフヱリン加水分解物の数平均分子量が 500— 5000であること。

13)前記抗体医薬が、抗 CD20抗体、抗 HER2モノクローナル抗体、又は抗 17 - 1 A (ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子)抗体であること。

14)前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であること。

[0024] 前記課題を解決する本願の第五の発明は、癌の抗体療法用の薬剤であって、以下の（a)— (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物、及び抗体医薬を有効成分として含有する薬剤である。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(b)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36 60のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつ癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。 (d)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36— 61のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつ癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド

[0025] 前記第五の発明は、以下の 15) 16)を好ましい態様としている。

15)前記抗体医薬が、抗 CD20抗体、抗 HER2モノクローナル抗体、又は抗 17—1A (ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子)抗体であること。

16)前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であること。

[0026] 本発明はラタトフヱリン加水分解混合物、又は当該ラタトフヱリン加水分解混合物から分離することが可能なラ外フェリンの部分ペプチド、若しくは化学合成等によって調製することが可能なラタトフエリンの部分ペプチドを有効成分とする癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤に関するものであって、補体と抗体医薬による細胞障害活性を増強することで、標的になる腫瘍細胞を効率よく殺傷することが可能である。

[0027] また、特に抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞障害活性をリカバリーする効果も兼ね備えている。さらに、本発明の耐性を有する癌の治療のための薬剤の有効成分は、牛乳等の比較的安価な原料力得られることから、大量生産することが可能である。

[0028] また、前記有効成分は、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性増強用と表示された飲食品に含有させることによつても、前記薬剤と同様の効果を有する。図面の簡単な説明

[0029] [図 l]Rituximabの Raji細胞に対する細胞障害活性に与える本発明のラタトフエリンカロ水分解混合物及びラタトフヱリン部分ペプチドの影響を示す図。「*」は、 Medium (培養液）に対して t< 0.001であることを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0030] 次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。

[0031] 本発明の癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤、又は癌の抗体療法用の薬剤（以下、単に「本発明の薬剤」と記載することがある。 ) の有効成分は、ラタトフヱリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するラタトフヱリン加水分解物（以下、「ラタトフヱリン加水分解混合物」ともいう。）、又は、以下の（a) （d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物（以下、「ラタトフエリン部分ペプチド」ともいう）である。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。

[0032] 尚、配列番号 2は、配列番号 1のアミノ酸番号 36— 60に相当する。また、配列番号 3は、配列番号 1のアミノ酸番号 36— 61に相当する。

[0033] 本発明において、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬」とは、癌細胞の表面に結合する抗体を有効成分とし、前記抗体が癌細胞に結合することによって癌細胞を殺傷する医薬をいう。抗体医薬の作用としては、癌細胞が増殖するシグナルを阻害すること、細胞死シグナルを活性化することにより癌細胞を殺傷すること、補体依存性細胞障害活性又は抗体依存性細胞障害活性により癌細胞を殺傷すること等を含む。

[0034] 本発明において、「細胞障害活性を増強する」とは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を高める効果、すなわち、抗体医薬の標的になる腫瘍細胞を補体及び/又は抗体医薬が殺傷する作用を増強することに加えて、抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、抗体医薬に対する感受性を高めること、すなわち補体及び/又は抗体医薬による細胞障害活性をリカバリーすることを含む。また、「抗体医薬に耐性を有する」とは、抗体医薬及び又は補体が腫瘍細胞を殺傷する作用（細胞障害活性）に耐性であること、言い換えれば、前記作用が弱いか又は同作用を受けないことをいう。また、抗体医薬に対する耐性は、補体制御因子に起因して生じるものとは限らず、その他の要因で抗体医薬に耐性を有する場合も含まれる。

[0035] 本発明の薬剤の有効成分であるラタトフエリン加水分解混合物及び当該ラタトフエリン加水分解混合物から分離することが可能なラタトフヱリンの部分ペプチド（ラタトフヱリン部分ペプチド）は、ラタトフエリンを出発物質として調製することができる。ラクトフエリンは、市販のラタトフエリンや、哺乳動物（例えば、ヒト、又はゥシ等。）の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホェ一等を原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の常法により、前記原料から分離して得られるラ外フェリンを用いることができる。中でも、工業的規模で製造されている市販のラクトフェリン (例えば、森永乳業社製）を使用することが好適である。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジヱニック動物等で生産したラタトフヱリンを使用することも可能である。

[0036] また、当該ラタトフエリン加水分解混合物から分離することが可能なペプチド (ラタトフェリン部分ペプチド）と同様のアミノ酸配列を有するペプチドは、直接、化学合成、又は遺伝子工学的手法等により調製することも可能である。

[0037] このようなラタトフエリンを使用して、本発明の薬剤の有効成分であるラタトフエリンカロ水分解混合物を調製する方法としては、加水分解酵素等により常法に従ってラタトフヱリンを加水分解する方法が例示される。具体的な方法としては、ラタトフヱリンの加水分解に使用する酵素は、ラ外フェリンを分解し、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド又はその混合物を生成する加水分解酵素であれば、どのような加水分解酵素であってもよレ、。

[0038] 加水分解酵素としては、例えば、ペプシン、パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン、ァスぺノレギノレス'オリゼ（Aspergillus oryzae)由来のプロテアーゼ、ストレプトマイセス.グリセウス（Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼ等が挙げられる。使用する加水分解酵素は 1種でもよぐ 2種以上用いてもよい。 2種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよぐ別々に行ってもよい。本発明においては、特にペプシンを使用することが好ましレ、。また、エンド型プロテアーゼを、ェキソ型加水分解酵素と組み合わせて使用することも可能である。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するように設定することが好ましい。本発明の薬剤の有効成分であるラタトフヱリン加水分解混合物を得るためには、分解率は 6— 20%が好ましぐ 8— 12%が特に好ましい。

[0039] 尚、蛋白質の分解率は、例えば、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第 102頁、株式会社光琳、昭和 59年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法 (満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第 547ページ、養賢堂、 1970 年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から次式により算出すること力 Sできる。

[0040] 分解率（％) = (ホルモール態窒素量/全窒素量） X 100

[0041] 分解率が好ましい値に達したら、酵素反応を停止すればよい。酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、 80— 130 °Cの温度範囲で 30分間一 2秒間の保持時間で行うことができる。得られた反応液はクェン酸等の酸により pHを 5. 5— 7の範囲に調整することが好ましい。尚、ラタトフヱリン加水分解混合物に不溶物がある場合は、遠心するか、または濾過するかの方法によりそれらを除去することができる。

[0042] 本発明において、ラタトフヱリン加水分解混合物の数平均分子量は、 500 5000 であること力 S好ましく、特に 1000— 4000カ好ましレヽ。

尚、数平均分子量（Number Average of Molecular Weight)は、例えば文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第 116— 119頁、株式会社東京化学同人、 1978年）に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。

すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量 (以下、 Mnと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖 iの分子量が Miであり、その分子数を Niとすると、次の式により定義される。

[数 1]

このようにして得られたラタトフヱリン加水分解混合物は、そのまま本発明の薬剤の有効成分として利用することが可能であり、また常法により凍結乾燥または噴霧乾燥して粉末として保存することもできる。さらに、本発明の薬剤の他の有効成分であるラタトフェリン部分ペプチドの製造に利用することもできる。また、ラタトフエリン加水分解混合物は、上記のようにして得られるラタトフヱリンの加水分解産物に、ラタトフエリン部分ペプチドを加えたものであってもよい。

[0043] 前記ラタトフエリン部分ペプチドとして具体的には、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配歹 1Jのうち、アミノ酸番号 36— 60のアミノ酸配列からなるペプチド、もしくは、ァミノ酸番号 36 61のアミノ酸配列（配列番号 2)からなるペプチドが挙げられる。以下、アミノ酸番号 36— 60のアミノ酸配列（配列番号 3)力なるペプチドをラタトフエリン F -F 、前記アミノ酸番号 36— 61のアミノ酸配列からなるペプチドをラタトフエリン F

36 60 36

-A と記載すること力 Sある。

61

[0044] 尚、ラタトフヱリン F -F 及びラクトフヱリン F — A の両者を含むものを有効成分と

36 60 36 61

する場合は、ラタトフエリン F — F 及びラタトフエリン F — A の混合比は、ラタトフエリ

36 60 36 61

ン F — F ：ラクトフエリン F — A = 1 : 20— 20 : 1が好ましぐ中でもラクトフエリン F -

36 60 36 61 36

F ：ラクトフエリン F — A = 1 : 10— 2 : 3が特に好ましい。

60 36 61

[0045] ラタトフエリン部分ペプチド、具体的にはラクトフエリン F -F 及び/又はラクトフエリ

36 60

ン F — A は、例えば、前記のようにして調製したラタトフヱリン加水分解混合物を出

36 61

発物質として、特開平 5-238948号公報に記載されたラタトフヱリシンの製造方法に従って調製することができる。また、ラタトフエリン F -F 及び/又はラタトフエリン F

36 60 36

- A は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36— 60及び/又は

61

アミノ酸番号 36— 61を有するペプチドであれば、化学合成によって合成ペプチドを製造する方法、及び遺伝子組換え技術等を利用した遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法、などによっても調製されたものであってもよい。例えば、遺伝子工学的手法を用いた方法としては、該領域を含むァミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含む cDNAを铸型として PCR等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。

[0046] また、通常の遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、 1又は複数の位置での 1又は複数の塩基の置換、欠失、揷入、付加、又は逆位等の変異が存在することがあり、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じている場合がある。本発明に用いることができるラタトフエリン F — F 及

36 60 びラタトフエリン F -A には、耐性を有する癌の抗体療法において抗体医薬の細胞

36 61

障害活性を増強する作用が損なわれない範囲において、このような変異を含むものも包含される。ラタトフエリン F -F 又はラタトフエリン F — A が含んでいてもよいアミ

36 60 36 61

ノ酸残基の置換欠失、挿入、付加又は逆位の数は、好ましくは 1一 12個、より好ましくは 1一 8個、特に好ましくは 1一 5個である。また、アミノ酸残基の置換は、類似の性質を有するアミノ酸同士の置換、いわゆる保存的置換が好ましい。このようなラタトフエリン F -F 又はラタトフエリン F — A の改変体が、ラタトフエリン F -F 又はラタトフエリ

36 60 36 61 36 60 ン F — A よりも長い場合には、付加されるアミノ酸はラタトフヱリンの 36位から N末側

36 61

、又は 60位若しくは 61位から C末側の配列に対応したアミノ酸であることが好ましレヽ。しかし、前記改変体が所望の作用を有する限り、付加されるアミノ酸は任意のァミノ酸であってもよい。

[0047] 本発明に用いることができるラタトフエリン加水分解混合物、又はラタトフエリン部分ペプチドは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有し、該作用は Propidium iodide (PI : Dojindo社製：カタログ番号 P378)を用いた方法〔サイトメトリー（Cytometry)第 8卷、第 4号、 1987年、第 421— 426頁〕、又は

Calcein-AM (Dojindo社製：カタログ番号 341-07901)を用いた方法〔アポトーシス ( Apoptosis)、第 3卷、第 3号、 1998年、第 195— 202頁〕に準じて測定することができる。後述する実施例において、該測定方法について詳細に記載する。

[0048] 本発明の薬剤は、ラタトフヱリン加水分解混合物、若しくはラタトフヱリン部分べプチド、又はこれらを製剤学的に許容される製剤担体と組合わせて、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の癌の抗体療法用の薬剤においては、さらに、前記成分とともに抗体医薬を組み合わせる。本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。

[0049] 本発明の薬剤中に含まれるラタトフヱリン加水分解混合物、若しくはラタトフエリン部分ペプチドの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、ラタトフエリン加水分解混合物は製剤中に 10 /i g/ml— 50mg/ml、好ましくは 50 /i g/ml— 10 mg/ml、とするのがよぐラタトフエリン部分ペプチドは製剤中に 0· 5 /i g/ml— 20 0 μ g/ml、好ましくは 1 μ g/ml— 100 μ g/mlとするのがよレヽ。

[0050] 本発明の薬剤の投与時期は特に限定されず、抗体医薬の投与前、投与後、又は抗体医薬と同時のいずれであっても可能であり、対象となる癌種の治療方法に従つて、適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。

[0051] 本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのラタトフエリン加水分解混合物、若しくはラタトフヱリン部分ペプチドの量は、 0. 001 60mgZkg/日、好ましくは 0. 01 20mg/kg/日の範囲となる量を目安とするのが良ぐ 1日 1回又は複数回に分けて投与することができる。

[0052] 本発明の薬剤は、癌、例えば乳癌、 B細胞リンパ腫、又は大腸癌等のいずれかにおいて、抗体医薬を用いた治療における治療剤、治療効果増強剤、治療補助剤として有用である。また、本発明の薬剤のうち、ラタトフヱリン加水分解混合物又はラタトフエリン部分ペプチドとともに抗体医薬を含有する薬剤は、癌の抗体療法用の薬剤として使用すること力 Sできる。尚、本発明の癌の抗体療法用の薬剤を用いる場合であつても、さらに抗体医薬、又本発明の抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤を投与することもできる。本発明の薬剤は、特に、前記癌の中でも、抗体医薬に耐性を有する癌に極めて著効を示す。尚、本発明に使用することが可能な抗体医薬としては、抗 CD20抗体（リツキシマブ： rituximab)、抗 HER2モノクローナル抗体（トラスッズマブ: trastuzumab)、抗 17— 1 A (ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子）抗体（ edrecolomab)等を例示することができ、その他、癌治療における抗体療法で使用できる抗体医薬も使用することができる。また、現在知られている抗体医薬に限られず、今後開発される抗体医薬も使用することができる。

[0053] 本発明の薬剤は、抗体療法において抗体医薬とともに使用することが好ましく（但し、投与の時期が同時であるか否かは問わない）、公知の前記癌疾患の予防'治療剤（増強剤'補助剤も含まれる）と併用して使用することも可能である。併用することによつて、前記癌疾患の予防 ·治療効果を高めることができ、また、併用する前記予防'治療剤の投与量を減らすことも可能である。さらに、併用する前記癌疾患の予防'治療剤を、本発明の薬剤の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の薬剤の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化し、使用時に組み合わせても良い。

[0054] 本発明の薬剤、又は同薬剤の有効成分であるラタトフエリン加水分解混合物、又はラ外フェリン部分ペプチドは、飲食品 (飲料又は食品）に含有させることもできる。飲食品としては、前記有効成分の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、前記有効成分を含有させること以外は、通常飲食品に用レ、られる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。

[0055] 本発明の飲食品における用途としては、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強するような種々の用途をとることが可能である。例えば、癌等、特に抗体医薬に耐性を有する癌の危険要因の低減 *除去に役立つ飲食品等の用途を例示すること力 Sできる。

[0056] また、本発明の飲食品は、抗体医薬に耐性を有する癌により引き起こされる疾患の予防等に有用である。さらに、本発明の飲食品は、抗体医薬に耐性を有する癌に起因する種々の疾病'合併症等の予防、並びにこれら疾病'合併症等のリスクを低減することが可能である。

[0057] 本発明の飲食品は、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強するために用レ、られるものである旨の表示を付した飲食品、例えば「癌の抗体療法に用レ、る抗体医薬の細胞障害活性増強用と記載された、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤を含有する飲食品」、若しくは「癌の抗体療法に用レ、る抗体医薬の細胞障害活性増強用と記載された、ラタトフエリン加水分解混合物、又はラタトフエリン部分ペプチドを含有する飲食品」、又は「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強する効果を有する化合物を含有する飲食品」、若しくは「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用と表示された、ラタトフエリンの加水分解物を含有する飲食品」、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用と表示された、ラタトフエリン部分ペプチドを含有する飲食品」、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用と記載された、ラクトフエリンの加水分解物を含有する飲食品」、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用と記載された、ラタトフエリン部分ペプチドを含有する飲食品」等として販売することが好ましい。尚、本発明の化合物又は組成物等は、癌の抗体療法に用レ、る抗体医薬の細胞障害活性増強作用を有することから、本発明の飲食品は、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用」と表示することができる。

[0058] 以上のような表示を行うために使用する文言は、「癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強用」という文言のみに限られるわけではなぐそれ以外の文言であっても、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性に対する補助効果又は増強効果を表す文言であれば、本発明の範囲に包含されることはいうまでもなレ、。そのような文言としては、例えば、需要者に対して、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性増強又は癌の抗体療法に用いる抗体医薬の補助'増強効果を認識させるような種々の用途に基づく表示も可能である。例えば、「抗体医薬に耐性を有する癌等の危険要因（リスク）の低減 ·除去に役立つ」等の表示を例示することができる。尚、上記の表示において、「癌の抗体療法に用いる」との文言は省略してもよい。

[0059] 前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起'類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物'媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましレ、。具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的 (インターネット等)方法により提供する行為、等が例示できる。

[0060] 一方、表示としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましぐ特に包装、容器、カタログ、ノンフレット、 POP等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。

[0061] また、例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によつて認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成 15年 4月 30日日本国厚生労働省令第 86号）に定められた特定保健用食品としての表示 (特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。

実施例

[0062] 次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 [0063] [製造例 1]ラ外フェリン加水分解混合物の製造

脱脂乳から分離したゥシ'ラ外フエリン (森永乳業社製。純度約 90%) 2. Okgを 5質量％の濃度で蒸溜水に溶解し、 1規定塩酸を添加して pHを 3. 0に調整した。結晶べプシン（ディフコネ土製）を基質の 3質量％の割合で添加し、 37°Cで 4時間加水分解した。この後 80°Cに 15分間加熱してペプシンを失活させ、 1規定水酸化ナトリウムを添カロして pHを 7. 0に調整し、不溶物を瀘過して除去し、噴霧乾燥し、粉末状のラタトフエリン加水分解物約 1. 9kgを調製した。尚、製造したラタトフエリン加水分解混合物の分解率は 10。/。であった。

[0064] [製造例 2]ラタトフエリン加水分解ペプチドの製造

製造例 1と同一の方法により製造した出発物質 (ラタトフエリン加水分解混合物） 60 Ogを 5質量％の濃度で蒸溜水に溶解した。約 3000mlの疎水性担体（プチル 'トヨパール。商標。東ソ一社製） 650Mを水で充分洗浄して平衡化した。攪拌機付きタンク内で出発物質溶液を疎水性担体と混合した後、液を分離し、疎水性担体をカラム（長さ 10cm、直径 20cm)に充填し、前記の分離した液をカラムに通液した。この後、洗浄液の 280nmにおける吸光度が 0. 06以下になるまで 400ml/分の流速で水を用いてカラムを充分洗浄した。

[0065] 次いで 10ミリモル塩酸をカラムに通液し、ラタトフエリンカ卩水分解ペプチドを溶出し、等量のマツキルべイン緩衝液（0. 1M酢酸 177容 + 0. 2M第一リン酸ナトリウム 823 容の混合物。 pH7. 0)と混合し、疎水性担体に吸着させた。疎水性担体をカラムに充填し、 6000mlの同じ緩衝液で洗浄し、 9000mlのマツキルべイン緩衝液（0. 1M 酢酸 485容 + 0. 2M第一リン酸ナトリウム 515容の混合物。 pH5. 0)でラタトフエリン加水分解ペプチドを溶出した。カラムに 10mM塩酸および水を通して疎水性担体を再生し、 1規定水酸化ナトリウム溶液で溶出液の pHを 7. 0に調整した。このカラムに前記ラタトフエリン加水分解ペプチドを含む溶出液を通液し、 30リットルの水で洗浄して緩衝液の塩を除去し、のち 10mM塩酸をカラムに通液してラタトフヱリン加水分解ペプチドを溶出し、凍結乾燥し、粉末状のラタトフヱリン加水分解ペプチド約 10. 5g を得た。得られたラタトフヱリン加水分解ペプチドを HPLC法により純度測定した結果、純度は 99%であった。また、前記ラタトフヱリンカ卩水分解ペプチドのアミノ酸配列を測定した結果、製造したラタトフエリン加水分解ペプチドは、ラタトフヱリン F -F 及び

36 60 ラクトフエリン F — A の両ペプチドを含んでいることが確認された。これらのペプチド

36 61

の存在比は、ラクトフエリン F -F ：ラクトフエリン F — A = 1 : 6であった。

36 60 36 61

[0066] 次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。

[0067] [試験例 1]

本試験は、補体と抗体医薬による細胞障害作用に及ぼすラ外フェリン加水分解混合物の添加効果を検討するために行った。

[0068] (1)試験試料

7. 5%ゥシ胎児血清（ギブコ社製：カタログ番号 10099-141)と 1 %

Penicillin-Streptomycin (ギブコネ土製：カタログ番号 15070-063)を含有する RPMI1640 培地（Sigma社製:カタログ番号 R8758) [以下、この溶液を「希釈溶液」と記載する。 ] に、製造例 1で調製したラタトフヱリン加水分解混合物を 1000 μ gZmlになるように調製して試験試料 1を調製した。また、希釈溶液を用いて、ラタトフエリンを 1000 / g /mlになるように希釈して対照試料 1を調製した。

[0069] 補体と抗体医薬による細胞障害作用を測定するための標的細胞、ヒトバーキットリンパ腫 Raji (ATCC CCL-86 :アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA)より入手）を使用し、細胞数力 ¾ X 10⁶個/ mlになるように希釈溶液を用いて懸濁して Raji細胞懸濁液を調製した。抗体医薬溶液は、 CD20抗原を認識するリツキシマブ (全薬工業：日本ロシュ販売）を使用し、希釈溶液を用いて 200 Ai g/mlになるように調製した。補体溶液は Human serum AB (コスモバイオ社製：カタログ番号 832000027)を使用した。これらの抗体医薬溶液及び補体溶液は、後記する試験例 2— 5につレ、ても使用した。

細胞の生死の判定には、 Propidium iodide (PI： Dojindo社製：カタログ番号 P378)を用いた方法〔サイトメトリー（Cytometry)第 8卷、第 4号、 1987年、第 421— 426頁〕、又は Calcein-AM (Dojindo社製：カタログ番号 341-07901)を用いた方法〔アポトーシス (Apoptosis)、第 3卷、第 3号、 1998年、第 195 202頁〕に準じて行った。

[0070] (2)試験方法

24穴培養用プレート（NUNC社製：カタログ番号 143982)の各穴に、 Raji細胞懸濁液を各々 100 /i lずつ（2 X 10⁵個ずつ）添加した。 24穴を 4つの群に分け、そのうちの 1 群（6穴）に抗体医薬溶液 50 _β 1と希釈溶液 250 _β 1を添加して「抗体医薬添加」とした。また、他の 1群（6穴）に補体溶液 100 μ 1と希釈溶液 200 μ 1を添加して「補体添加」とした。さらに、他の 1群（6穴）に抗体医薬溶液 50 μ 1と補体溶液 100 μ 1と希釈溶液 150 μ ΐを添加して「抗体医薬 +補体添加」とした。残りの 1群（6穴）に希釈溶液 300 μ 1を添加して「無添加」とした。

[0071] 以上の 4群それぞれにつレ、て、前記試験試料 1 (4群 X 2穴）、対照試料 1 (4群 X 2 穴）、又は希釈溶液 (4群 X 2穴）を各々 100 μ ΐずつ添加して、それぞれ「試験試料群 1」、「対照試料群 1」、「陰性試料群 1」とした。

[0072] 上記のようにして準備した 24穴プレートをインキュベーター（Napco社製：カタログ番号 5300)を用いて 37°C、 5%二酸化炭素の条件下で 1時間培養した後、各試料群の細胞を回収し、各々の死細胞の割合を、前記の PIを用いた方法で検討した。細胞障害活性は全ての標的細胞が殺された場合を 100%として算出した。

[0073] (3)試験結果

本試験の結果は表 1に示すとおりである。表 1から明らかなとおり、「抗体医薬 +補体添加」において、各試料群で細胞障害活性（「試験試料群 1」 : 45. 7%、「対照試料群 1」：24. 3%、「陰性試料群 1」：30. 7%)が確認されたが、なかでも、特にラクトフェリン加水分解混合物 (試験試料群 1)は、著しく細胞障害活性が増強（陰性試料群 1に比して約 50%増加）されることが明らかとなった。これに対し、対照試料群 1では陰性試料群に比べて細胞障害活性は増加しなかったことから、細胞障害活性の増強はラタトフヱリン加水分解混合物に特異的な活性であることが判明した。

[0074] [表 1] 表 1 細胞障害活性（％) 試験試料群 1 対照試料群 1 陰性試料群 1 抗体医薬 +補体添加 4 5 . 7 2 4 . 3 3 0 . 7 抗体医薬添加 0 . 9 1 . 0 1 . 0 補体添加 1 . 5 1 . 2 1 . 1 無添加 1 . 2 1 . 0 1 . 3

[0075] [試験例 2]

本試験は、培養時にラタトフエリン加水分解混合物を添加して培養した標的腫瘍細胞において、補体と抗体医薬による細胞障害活性に対する感受性の変化を検討するために行った。

[0076] (1)試験試料

製造例 1で調製したラタトフエリン加水分解混合物を試験例 1で使用した希釈溶液を用いて、 1000 / g/mlとなるように希釈して試験試料 2を調製した。

[0077] (2)試験方法

ヒトバーキットリンパ腫 Rajiを細胞数が 2 X 10⁵個/培養フラスコ（BD社製:カタログ番号 35-3014)になるように希釈溶液 6. 3mlに懸濁した。このとき上記の試験試料 2を 0 . 7ml添加する群 (試験試料群 2)と希釈溶液を 0. 7ml添加する群（陰性試料群 2)をそれぞれ準備し、インキュベーターを用いて 37°C、 5%二酸化炭素の条件下で 3日間培養した。

[0078] 両試料群の細胞は、希釈溶液を新たに 10ml各々加えて、遠心分離機 (KUBOTA 社製：カタログ番号 5910)により上清を除く作業（1 lOOrpm X 6分）を 3度繰り返した後、試験例 1の「抗体医薬 +補体添加」及び「無添加」と同様の系により細胞障害活性に対する感受性を調べた。

[0079] (3)試験結果

本試験の結果は表 2に示すとおりである。表 2から明らかなとおり、ラタトフエリン加水分解混合物を添加して 3日間培養した標的腫瘍細胞の群 (試験試料群 2)は陰性試料群 2に比して、明らかに「補体 +抗体医薬」による細胞障害活性に対する感受性が亢進しており、試験例 1で明らかとなった増強作用については、標的腫瘍細胞に作用していることが判明した。

[表 2]

細胞障害活性（％) 試験試料群 2 陰性試料群 2 抗体医薬 +補体添加 5 3 . 9 3 4 . 8

無添加 1 . 9 1 . 5

[0081] [試験例 3]

本試験は、補体と抗体医薬による細胞障害作用に及ぼすラ外フェリン加水分解べプチドの添加効果を検討するために行った。

[0082] (1)試験試料

製造例 1で調製したラタトフエリン加水分解混合物を試験例 1で使用した希釈溶液を用いて、 1000 z gZmlとなるように希釈して試験試料 3を調製した。また、製造例 2 で調製したラタトフエリン加水分解ペプチドを同様の希釈溶液を用いて、 1000 μ gZ mlとなるように希釈して試験試料 4を調製した。

[0083] (2)試験方法

ヒトバーキットリンパ腫 Rajiを細胞数が 2 X 10⁵個/ mlとなるように前記希釈溶液を用いて懸濁して細胞懸濁液を調製し、該細胞溶液を 96穴培養用プレート（NUNC社製：カタログ番号 167008)の 18穴に各々 50 μ 1 (1 X 10⁴個ずつ）添加した。 18穴を 2群に分け、一方の 1群（9穴）に抗体医薬溶液 10 _β 1と補体溶液 20 μ 1と希釈溶液 10 μ 1 を添加して「抗体医薬 +補体添加」とした。残りの 1群（9穴）に希釈溶液 40 μ 1を添カロして「無添加」とした。以上の 2群のそれぞれについて、前記試験試料 3 (2群 X 3穴）、試験試料 4 (2群 X 3穴）、又は希釈溶液（2群 X 3穴）を各々 10 / 1ずつ添加して、それぞれ「試験試料群 3」、「試験試料群 4」、「陰性試料群 2」とした。 [0084] 上記のようにして準備した 96穴プレートを、インキュベーターを用いて 37°C、 5%二酸化炭素の条件下で 1時間培養した後、各試料群の細胞を回収し、各々の死細胞の割合を、前記の PIを用いた方法で検討した。細胞障害活性は全ての標的細胞が殺された場合を 100%として算出した。

[0085] (3)試験結果

本試験の結果は表 3に示すとおりである。表 3から明らかなとおり、ラタトフエリン加水分解ペプチド (試験試料群 4)についても、補体と抗体による細胞障害活性を著しく増強（陰性試料群 2に比して約 67%増カロ）することが明らかとなった。

[0086] [表 3] 表³

細胞障害活性（％) 試験試料群 3 試験試料群 4 陰性試料群 2 抗体医薬 +補体添加 7 7 . 4 8 6 . 5 5 1 . 9 無添加一 0 . 1 3 . 1 - 0 . 5

[0087] [試験例 4]

本試験は、補体と抗体による細胞障害活性に対する感受性が異なる標的腫瘍細胞を用いた、ラタトフエリン加水分解混合物の細胞障害活性の増強作用（感受性リカバリー）について検討した。

[0088] (1)試験試料

製造例 1で調製したラタトフエリン加水分解混合物を試験例 1で使用した希釈溶液を用いて、 1000 / g/mlとなるように希釈して試験試料 5を調製した。

[0089] (2)試験方法

リンパ腫由来細胞 Daudi (ATCC CCL-213 :アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクションより入手）、 Raji (ATCC CCL-86 :アメリカン'タイプ'カルチャー 'コレクションより入手）、 SKW6.4 (ATCC TIB-215 :アメリカン'タイプ'カルチャ^ ~ ·コレクションより入手）、及び抗体医薬に耐性を有するリンパ腫由来細胞 ARH-77 (ATCC CRL-1621：アメリカン.タイプ.カルチャー ·コレクションより入手）を、各々細胞数が 2 X 10⁶個/ mlとなるように前記希釈溶液を用いて懸濁し、それぞれ細胞溶液を調製して、 24穴培養用プレート（NUNC社製：カタログ番号 143982)に各細胞溶液 100 /i 1ずつ（2 X 10⁵個ずつ )を添加した。

[0090] 細胞障害活性の検討は、試験例 1の「抗体医薬 +補体添加」の系と同様に行った。

すなわち、各細胞溶液を添加した穴に抗体医薬溶液 50 μ 1と補体溶液 100 μ 1と希釈溶液 150 μ 1を添加し、前記試験試料 5、又は希釈溶液を各々 100 μ 1ずつ添加して、それぞれ「試験試料群 5」、「陰性試料群 3」とした。

[0091] 上記のようにして準備した 24穴プレートをインキュベーター（Napco社製：カタログ番号 5300)を用いて 37°C、 5%二酸化炭素の条件下で 1時間培養した後、各試料群の細胞を回収し、各々の死細胞の割合を、前記の PIを用いた方法で検討した。細胞障害活性は全ての標的細胞が殺された場合を 100%として算出した。

[0092] (3)試験結果

本試験の結果は表 4に示すとおりである。表 4から明らかなとおり、ラタトフエリン加水分解混合物は、補体と抗体による細胞障害活性に高レ、感受性を示す Daudiにつレ、て、その感受性を減弱させることは確認されなかった。また、 Raji、 SKW6.4に対しては、補体と抗体による細胞障害活性を増強する効果が確認された。

[0093] さらに、補体と抗体による細胞障害活性に抵抗性を示す (抗体医薬に耐性を有する )リンパ腫由来細胞である ARH-77については、ラタトフエリン加水分解混合物により、細胞障害活性に対する抵抗性を解除する効果を有することが確認された。これは、ラタトフェリン加水分解混合物が、抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、細胞障害活性に対する感受性を高め、補体と抗体医薬の細胞障害活性をリカバリーする効果を有すると考察された。

[0094] [表 4] 表 4 細胞障害活性（％)

試験試料群 5 陰性試料群 3

D a u d 1 97. 1 96. 4

R a j i 49. 0 27. 2

SKW6. 4 38. 9 19. 8

ARH- 77 15. 5 0. 0

[0095] [試験例 5]

本試験は、ラタトフヱリン加水分解混合物、ラタトフヱリン部分ペプチド、及び対照として未分解のラタトフエリン等を試料として、補体と抗体医薬の標的細胞ヒトバーキットリンパ腫 Rajiに対する細胞障害活性に及ぼす効果を検討した。

[0096] (1)試験試料

製造例 1で製造したラタトフヱリン加水分解混合物を試料 Aとし、製造例 2で製造したラタトフエリン加水分解ペプチド (ラタトフエリン部分ペプチド）を試料 Bとした。また、対照試料として、市販のゥシ 'ラ外フェリン (森永乳業社製)を対照 A、硫酸プロタミン (Protamine Sulfate)を対照 Bとした。

[0097] (2)試験方法

対数増殖期にある Raji細胞を標的細胞として用いた。細胞懸濁液を遠心して回収した Raji細胞を新しい培養液（RPMI1640，10%FCS)に懸濁し、計数した後、 24穴プレートに 1.0X10⁵/wellで添加した。そこへ Rituximab(10mg/ml)と試料 A、試料 B、対照 A、対照 Bを各々 1.0mg/mlの最終濃度で添加（または、各試料の代りに Medium [培養液]添加）の後、ヒト正常血清 (AB型）を最終濃度が 10%になるように添加して 1時間 COインキュベーターで培養し、培養の最後の 15分間に、 PI (Propidium iodide, lmg/ml)を添加した。培養終了後、総ての Raji細胞を回収し、遠心分離してその上清を除去し、 PBS (リン酸緩衝液） 0.5mlに細胞を再懸濁した。培養中に死んだ Raji細胞の計数は、死細胞が PIによる核染色で陽性になることを利用して、この懸濁液をフロ一サイトメーター（FACScan)で解析した。

[0098] 本試験における細胞傷害活性は次式により算出した。 [0099] 細胞傷害活性（％) = (PI陽性細胞数) / (全細胞数） X 100

[0100] (3)試験結果

本試験の結果は図 1に示すとおりである。図 1から明らかなとおり、試料として対照 A を使用した場合は、 Medi醒 (培養液）と同程度の細胞障害活性 [死細胞数(％) ]であつたが、試料 Aを使用した場合に細胞傷害活性は上昇し、さらに試料 Aであるラタトフエリン加水分解混合物から分離された試料 Bを使用した場合、試料 Aに比して細胞傷害活性の上昇が観察された。しかし、対照 Bの添加ではそのような活性の上昇は観察されなかった。

すなわち、試料 Aの含有成分である試料 Bにも CDC (補体依存性細胞障害活性）の作用を増強する添加効果を有することが確認された。また、試料 Bと類似した、塩基性アミノ酸を多く含む物質である対照 Bには、 CDCの反応を増強することは確認されなかったことから、必ずしも、ペプチドの物性 (塩基性）が CDCの反応を増強する作用に影響しているわけではないことも明らかとなった。これらの結果から、抗体医薬と補体による細胞障害活性を増強する作用は、試料 A (ラタトフエリン加水分解混合物）又は試料 B (ラタトフヱリン部分ペプチド）に極めて特異的な効果であることが判明した。

[0101] [製造例 3]ラタトフエリン加水分解混合物を有効成分とする癌の治療剤の製造

乳糖 (メグレ社製) 600g、トウモロコシデンプン（日清製粉社製) 400g、結晶セル口ース (和光純薬工業社製) 400g及び前記製造例 1で製造したラ外フェリン加水分解混合物 600gを 50メッシュのふるレ、（ャマト科学社製）により篩い分けし、厚さ 0· 5mm のポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機 (セセレ 'ぺディー二社製。プレス式)を用レ、、前記粉末をカプセル（日本エランコネ土製。 1号ゼラチン力プセル、 Op. Yellow No.6 Body,空重量 75mg)に内容量 275mgで充填し、抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有するカプセル剤 7000個を得た。

[0102] [製造例 4]ラタトフエリン加水分解ペプチドを有効成分とする癌の治療剤の製造

1000ml容量の乳鉢（中島製作所社製）に結晶セルロース (和光純薬工業社製) 2 Ogを採取し、水 20mlを添加して混和し、次いで予め 48メッシュのふるレ、（和科盛社製)で篩い分けした乳糖 (メグレ社製） 25gを添加し、前記製造例 2で調製したラ外フヱリンカ卩水分解ペプチド 55gを添カ卩し、混和した。得られた湿塊をステンレス製 20メッシュふるい（和科盛社製）上に取り、乾燥用ステンレス板の上に手で押し出して顆粒を形成し、手早く均等に分布させ、乾燥機に入れ、 25°Cで 2日間乾燥し、微細な顆粒とした。該顆粒を、ポリエチレン製 20メッシュふるい（和科盛社製）で篩い分けし、ふるいを通過した顆粒を広い紙上に広げ、予め 48メッシュで篩い分けしたステアリン酸マグネシウム（関東化学社製） 2gを添加し、手で混ぜて均質にした。これを打錠機 (木村製作所社製、 KT一 2型）により、直径 8mmの R杵を使用して打錠数を 10、錠剤重量 6. 2g、及びモンサント硬度 3. 5-5. 0kgの条件で圧縮圧力を設定して、打錠し、ラタトフヱリン加水分解ペプチド約 50%を含有する抗体医薬の細胞障害活性を高める効果を有する薬剤 16個を得た。

産業上の利用可能性

本発明における癌治療のための薬剤の有効成分は、牛乳等の比較的安価な原料力得られることから、大量生産することが可能である。また、本発明の薬剤により、補体と抗体医薬による細胞障害活性を増強することで、標的になる腫瘍細胞を効率よく殺傷することが可能である。さらに、抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞障害活性をリカノリーする効果も兼ね備えている。すなわち、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難であると判断された患者に対しても、本発明の薬剤を併用することは、継続して抗体医薬での治療を行いたいという要望に応えるものである。このことは、取りも直さず癌治療における抗体医薬耐性の克服への新規な道標を提供するものである。

Claims

請求の範囲

[1] ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するラ外フェリン加水分解物を有効成分として含有する、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤。

[2] 前記加水分解酵素がペプシンである請求項 1に記載の薬剤。

[3] 前記ラタトフヱリン加水分解物の分解率が 6— 20%である請求項 1又は 2に記載の薬剤。

[4] 前記ラタトフエリン加水分解物の数平均分子量が 500— 5000である請求項 1一 3のいずれか一項に記載の薬剤。

[5] 前記癌が、乳癌、 B細胞リンパ腫、又は大腸癌のいずれかである請求項 1一 4のいずれか一項に記載の薬剤。

[6] 前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であることを特徴とする請求項 1一 5のいずれか一項に記載の薬剤。

[7] 前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用が、標的細胞への抗体医薬に対する感受性を高める作用であることを特徴とする請求項 1一 6のいずれか一項に記載の薬剤。

[8] 癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤であって、以下の（a)— (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物を有効成分とする薬剤。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。

[9] 前記癌が、乳癌、 B細胞リンパ腫、又は大腸癌のいずれかである請求項 8に記載の薬剤。

[10] 前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であることを特徴とする請求項 8又は 9に記載の薬剤。

[11] 前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用が、標的細胞への抗体医薬に対する感受性を高める作用であることを特徴とする請求項 8 10のいずれか一項に記載の薬剤。

[12] 請求項 1一 11のいずれか一項に記載の薬剤を含有する飲食品。

[13] ラタトフヱリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができるラタトフヱリン加水分解物を含有し、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するものであり、癌の抗体療法に用いる抗体医薬の細胞障害活性を増強するために用いられる旨の表示を付した飲食品。

[14] ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができるラクトフエリン加水分解物及び抗体医薬を有効成分として含有する、癌の抗体療法用の薬剤。

[15] 前記加水分解酵素がペプシンである請求項 14に記載の薬剤。

[16] 前記ラタトフヱリン加水分解物の分解率が 6— 20%である請求項 14又は 15に記載の薬剤。

[17] 前記ラタトフエリン加水分解物の数平均分子量が 500— 5000である請求項 14一 1

6のレ、ずれか一項に記載の薬剤。

[18] 前記抗体医薬が、抗 CD20抗体、抗 HER2モノクローナル抗体、又は抗 17—1A (ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子)抗体である請求項 14一 17のいずれか一項に記載の薬剤。

[19] 前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であることを特徴とする請求項 14一 18のいずれか一項に記載の薬剤。

[20] 癌の抗体療法用の薬剤であって、以下の（a)— (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物、及び抗体医薬を有効成分として含有する薬剤。 (a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。

(d)配列番号 1のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 36 61のアミノ酸配列を有するぺプチドであって、 1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、又は逆位を含み、かつ癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するペプチド

[21] 前記抗体医薬が、抗 CD20抗体、抗 HER2モノクローナル抗体、又は抗 17—1A (ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子)抗体である請求項 20に記載の薬剤。

[22] 前記癌が、抗体医薬に耐性を有する癌であることを特徴とする請求項 20又は 21に記載の薬剤。

[23] 癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の製造における、ラタトフエリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するラ外フェリン加水分解物の使用。

[24] 癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の製造における、以下の（a)— (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物の使用。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。

[25] 抗体医薬を用いた癌の抗体療法において、前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法であって、ラタトフヱリンを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有するラタトフエリン加水分解物を患者に投与することを特徴とする方法。

[26] 抗体医薬を用いた癌の抗体療法において、前記抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法であって、以下の（a) (d)に示すペプチドの 1種又は複数種の混合物を患者に投与することを特徴とする方法。

(a)配列番号 2のアミノ酸配列を有するペプチド。

(c)配列番号 3のアミノ酸配列を有するペプチド。