JP3693377B2 - 生体内で感染防御作用を有するペプチド混合物と、このペプチド混合物を含有する組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、ラクトフェリン加水分解物より分画され、生体内において感染防御作用を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物（以下糖鎖ペプチド混合物と記載する）と、この糖鎖ペプチド混合物を有効成分として含有する食品、医薬品または飼料等の組成物に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、それ自体生体外では全く抗菌活性を示さず、ヒトおよび動物に経口的に投与することにより、生体内において細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染を防御し、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管からの微生物の臓器侵入等の疾病を予防する効果を有するラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物と、この糖鎖ペプチド混合物を有効成分として含有する組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近代における衛生、栄養の向上、または抗生物質等を用いた化学療法の発展により、細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症は著しく減少した。しかしながら、耐性微生物の出現により、新たな抗生物質の開発が常に余儀なくされており、抗生物質投与によるショック死、菌交代症等の副作用の深刻な問題を惹起している。従って、安全で副作用のない新たな抗菌剤または感染防御剤の開発が期待されている。
【０００３】
ラクトフェリンは涙、唾液、末梢血、乳汁中に含まれている鉄結合性糖蛋白質であり、従来より大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に対して生体外で抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics ）、第９４巻、第１〜９ページ、１９７９年］。
【０００４】
ラクトフェリンに結合している糖鎖の機能については、ヒトラクトフェリンの加水分解物からクロマトグラフィーにより精製して得られた糖ペプチドに赤痢菌（Shigella flexneri ）の腸管粘膜細胞への付着を生体外で阻害する活性が認められている［インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）、第３５巻、第１１１０〜１１１８ページ、１９８２年］。また、ラクトフェリンの糖鎖構造は生物種の間で差異のあることが明らかにされている［バイオキミー（Biochimie ）、第７０巻、第１４５９〜１４６９ページ、１９８８年］が、ウシラクトフェリン由来糖鎖ペプチドの生体内における生理活性に関する報告は現在に至るまで全くなされていない。
【０００５】
一方、ウシラクトフェリンの生理作用については、病原性大腸菌の腸管粘膜への付着に対する阻止作用［第２５回日本無菌生物ノートバイオロジー学会総会、抄録第２２ページ、、１９９２年］、リゾチーム共存下での大腸菌の菌体凝集活性［ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Agricultural and Biological Chemistry）、第５３巻、第１７０５〜１７０６ページ、１９８９年］等が報告されている。さらに、ラクトフェリン、その加水分解物およびラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドについては、、アポラクトフェリンおよびリゾチームを有効成分とする抗菌性組成物（特開昭６２ー２４９９３１号公報）、ラクトフェリン加水分解物を有効成分とする抗菌剤（特開昭５ー３２００６８号公報）、抗菌性ペプチドおよび抗菌剤（特開平５ー９２９９４号公報）、病原性菌付着防止剤およびそれを含有する飲食品（特開平３ー２２０１３０号公報）等、多くの食品、医薬品への応用例が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記のラクトフェリンおよびラクトフェリン関連物質は、いずれも生体外で抗菌活性が既に確認されたものであり、それ自体生体外では抗菌活性を示さない糖鎖ペプチド混合物、特にラクトフェリン加水分解物から分画された糖鎖ペプチド混合物の生理活性は全く知られておらず、その用途に関する報告も皆無である。
【０００７】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、経口的に摂取しても安全であり、生体内における細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症を効果的に防御するペプチド混合物と、このペプチド混合物を有効成分として含有する組成物を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物又はトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物を提供する。
【０００９】
さらにこの発明は、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物又はトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物を有効成分として含有し、かつ当該ペプチド混合物以外の前記ゲル濾過クロマトグラフィー分画物を添加成分としない組成物をも提供する。
【００１０】
そして、この組成物においては、ペプチド混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％（重量。以下断りのない限り同じ）含有されていることを望ましい態様としてもいる。
以下、この発明について詳しく説明する。
この発明の糖鎖ペプチド混合物の出発物質となるラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、牛乳、脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属で結合させた金属飽和若しくは部分飽和ラクトフェリン、またはこれらの混合物であり、公知の方法により調製することができる。出発物質となるラクトフェリンは、ウシ由来のものが最も望ましいが、ヒト、ヤギ、ヒツジ、水牛等から得られるものであってもよい。
【００１１】
この発明の糖鎖ペプチド混合物を得るために用いられるラクトフェリン加水分解物は、例えば、特開平５ー２３８９４８号公報に記載の方法により製造することができる。ラクトフェリンの加水分解にはどのようなプロテアーゼを用いてもよいが、糖鎖ペプチド混合物の高い感染防御活性が得られるペプシンまたはトリプシンが望ましい。
【００１２】
また、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンの加水分解物から（例えば疎水性クロマトグラフィーによって）生体外で抗菌性を有するペプチドを分画した残渣として得られるペプチドの混合物から分画することもできる。
この発明の糖鎖ペプチド混合物は、これらのラクトフェリンの加水分解物またはペプチドの混合物から、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、限外濾過等の常法により分画することができる。分画した糖鎖ペプチド混合物は、常法（例えば、減圧加熱濃縮、真空濃縮、膜濃縮等）により濃縮した濃縮液に、またはこの濃縮液を常法（例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等）により乾燥した粉末に、加工することもできる。
【００１３】
分画して得られた糖鎖ペプチド混合物は、未分画のラクトフェリンおよびラクトフェリン加水分解物から分離された公知の抗菌性ペプチドと比較して、より多くの糖を含有していること、および後記する試験例から明らかなように、そのものは生体外において全く抗菌活性を示さないこと、の顕著な相違を有している。
なお、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンの加水分解後に、酵素を加熱失活させるため、既に殺菌されているが、必要があればさらに加熱殺菌することもできる。
【００１４】
以上のようにして得られたラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物は、
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、
ｄ）糖含有量が２０％以上であること、
の理化学的および生物学的性質を有している。
【００１５】
その他に、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンをプロテアーゼで加水分解し、分画操作によって得られた糖鎖ペプチド混合物であるから、水溶性、耐熱性、低抗原性、消化吸収性等に優れ、かつ副作用もないという優れた特徴を有している。
次に、この発明の組成物について説明する。この発明の組成物は、通常の加工食品、加工乳、乳性飲料、育児用ミルク、治療用ミルク、通常の飼料、飼料用ミルク、通常の医薬品、経腸または経管栄養剤等、経口的または経管的に摂取可能な食品、飼料、医薬品等であり、その形態は溶液状、流動状、半固形状、固形状、粉末等どのような形態であってもよい。経腸または経管栄養剤としては、普通流動食、ブレンダー食、濃厚流動食等の完全流動食、低蛋白流動食、低コレステロール流動食、低ナトリウム流動食、治療乳、成分栄養流動食等の特殊流動食であってもよい。
【００１６】
この発明の組成物には、糖鎖ペプチド混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％、望ましくは０．１〜１％含有されている。使用時の状態とは、各種組成物を摂取のために調整した状態を意味し、例えば、粉末組成物の場合、所定濃度で水に溶解した状態である。
この発明の組成物に添加する糖鎖ペプチド混合物は、加熱による変性がほとんどないので、食品、医薬品、飼料等への添加は、製造工程のいずれの段階であっても可能である。この発明の組成物は、糖鎖ペプチド混合物を含有し、病原性微生物による感染を防御する効果がある。
【００１７】
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の調製法を調べるために行った。
すなわち、チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）を以下の方法により加水分解した。
１）ペプシンで加水分解する場合
ラクトフェリンを精製水に５〜１０％の濃度に溶解し、ｐＨを３．０に調整し、ラクトフェリンの約３％の市販の豚ペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）を添加して均一に混合し、３７℃で約４時間保持し、のち加熱して酵素を失活させた。次いでｐＨを中性に調整し、不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。
２）トリプシン、プロナーゼ等の中性プロテアーゼによって分解する場合
ラクトフェリン溶液のｐＨを中性とした後にラクトフェリンの１〜５％の酵素を添加して前記と同様に加水分解した。
３）分画
前記１）および２）のラクトフェリン分解物を常法により凍結乾燥し、乾燥粉末を１０〜３０％の濃度でを精製水に溶解し、ゲル濾過材を充填したカラムで分画した。分画した各フラクションの糖含量を測定し、糖を含有するフラクションを混合し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物を得た。なお、分画方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィーの他、限外濾過膜を用いた方法、レクチン固定化担体を用いた親和性クロマトグラフィー等、糖鎖ペプチド混合物を分画できれば、どのような方法であってもよい。
４）得られた糖鎖ペプチド混合物
前記のとおり得られたラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物は次のａ）〜ｄ）の理化学的および生物学的性質を有することが、後記する試験方法により確認された。
ａ）病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外で抗菌作用を有さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、
ｄ）糖含有量が２０％以上であること。
試験例２
この試験では、病原性微生物感染モデルマウスを作出し、生体内におけるこの発明の糖鎖ペプチド混合物の感染防御能を評価した。
【００１８】
公知の腸管病原性大腸菌（Escherichia coli O111 ：東京大学医科学研究所から分譲された菌株。以下単に大腸菌と記載する）をマウスに胃内投与し、高頻度に感染を惹起するモデルマウスを作出した。すなわち、４週令の無菌マウス（ビニールアイソレーター中で交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２０匹を１０匹づつ２群に分け、別々のビニールアイソレーター中で糞食防止ネットを敷設したケージに入れ、放射線滅菌した固形飼料Ｆ−２（船橋農場製）および滅菌水を自由摂取させて１週間飼育した。
【００１９】
ブレイン・ハート・インヒュージョン液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で前記大腸菌を２４時間静置培養し、培養液を遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）で菌体を３回洗浄し、同リン酸緩衝生理食塩水で５×１０10／ｍｌの生菌濃度で懸濁した。次いで、１群のマウスに菌液０．２ｍｌを、他の１群にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）０．２ｍｌをゾンデで胃内に単回投与した。菌投与後、両群のマウスを前記飼料でさらに２４時間飼育した。飼育終了後のマウスの死亡数を調べ、各群の感染死亡率を比較した。
【００２０】
その結果、大腸菌投与群の死亡頭数は、７／１０（１０匹中７匹が死亡したことを示す。以下特に断りのない限り同じ）であったのに対し、非投与群の死亡頭数は０／１０であった。
試験例３
この試験は、前記病原性微生物感染モデルマウスに対する糖鎖ペプチド混合物の生体内における感染防御能を調べるために行った。
【００２１】
試験例２と同一の方法により作成した無菌雌マウス、５０匹を１０匹づつ５群に分け、別々のビニールアイソレーター中で糞食防止ネットを敷設したケージに入れた。実施例１の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物を０、０．０１、０．１、１または５％の各濃度で無菌水に添加し、フィルターユニット（ナルゲン社製）で再度除菌した。この溶液および放射線滅菌した固形飼料Ｆ−２（船橋農場製）を無菌マウスに１週間自由摂取させた。
【００２２】
試験例２と同一の方法ですべての群に前記大腸菌を投与し、各群を前記と同一の飼料でさらに２４時間飼育し、のち感染死亡頭数を比較した。
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１の結果からこの発明の糖鎖ペプチド混合物は０．０１％、望ましくは０．１％以上の添加濃度で病原性大腸菌による感染を顕著に抑制することが認められた。
【００２３】
一方、対照として卵白アルブミン（シグマ社製）から、試験例１と同一のペプシン加水分解により調製した糖鎖を有するペプチド混合物を無菌水に５％の濃度で添加し、同様に試験したが、感染死亡頭数は７／１０であり、感染防御効果は認められなかった。
なお、他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物を用いて同様の試験を行ったが、ほぼ同様の感染防御効果が認められた。
【００２４】
【表１】
【００２５】
試験例４
この試験は、生体外におけるこの発明の糖鎖ペプチド混合物の抗菌活性を調べるために行った。
１％バクトペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）水からなる液体培地２ｍｌに、０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で段階的にこの発明の糖鎖ペプチド混合物（実施例１と同一の方法により製造）を添加し、大腸菌を１０6 ／ｍｌの生菌数濃度で接種し、３７℃で１６時間静置培養した。培養後の供試菌の発育状態を６６０ｎｍの吸光度で測定した結果、糖鎖ペプチド混合物をいずれの濃度に添加した場合にも供試菌の増殖抑制は認められず、この糖鎖ペプチド混合物には生体外における抗菌活性は全く存在しないことが認められた。
【００２６】
一方、対照として用いた未分解のラクトフェリンは２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全に阻止し、またラクトフェリンのペプシン分解物は２００μｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全に阻止した。
なお、他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物についても同様の試験を行ったが、いずれも生体外における抗菌活性は全く認められなかった。
試験例５
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量および分子量を調べるために行った。
１）糖含有量
実施例１と同一の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量を次の方法により測定した。
【００２７】
糖鎖ペプチド混合物溶液０．２ｍｌを試験管にとり、５％フェノール水溶液０．２ｍｌを添加混合した後、濃硫酸（精密分析用。和光純薬工業社製）１ｍｌをすばやく添加してよく混合し、この溶液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。糖含有量は、同時に標準ガラクトース（和光純薬工業社製）溶液を用いて測定した検量線から求めた。
【００２８】
その結果、この発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量は、２５％であった。なお、他の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物においても糖含有量は、いずれも２０％以上であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含量１１％と比較して顕著に多いことが判明した。
２）分子量
実施例１および実施例２と同一の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物の分子量を次の方法により測定した。
【００２９】
１５〜２５％の濃度勾配を有するＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（第一化学薬品社製）に糖鎖ペプチド混合物１０μｇを供給し、常法により電気泳動を行った。また、分子量測定マーカー（第一化学薬品社製）を同時に供給し、これらのマーカーの泳動距離との比較から、供試した糖鎖ペプチド混合物の分子量を求めた。
【００３０】
その結果は、図１に示すとおりであった。図１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真であり、レーン１からレーン４は、それぞれマーカー、未分解のウシラクトフェリン、実施例１の糖鎖ペプチド混合物および実施例２の糖鎖ペプチド混合物である。
図１から明らかなとおり、実施例１および実施例２のこの発明の糖鎖ペプチド混合物の分子量は、それぞれ１４，０００以下および４２，０００以下であった。なお、他の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物の分子量は、いずれも４２，０００以下であり、未分解のラクトフェリンの分子量８０，０００と比較して極めて小さいことが判明した。
試験例６
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の急性毒性を調べるために行った。
１）使用動物
６週令のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ各３群、計６群（１群５匹）に分けた。
２）試験方法
実施例１と同様の方法で製造した糖鎖ペプチド混合物を注射用水（大塚製薬社製）に１０％の濃度で溶解し、体重１ｋｇ当たり１０００または２０００ｍｇの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、２週間観察して急性毒性を試験した。なお、対照として雄および雌の各１群に注射用水を体重１００ｇ当たり２ｇの割合で同様に経口投与した。
３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、この糖鎖ペプチド混合物を１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、この糖鎖ペプチド混合物のＬＤ50は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低いことが認められた。なお、他の製造方法により得られたこの発明の糖鎖ペプチド混合物についても試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３１】
【表２】
【００３２】
試験例７
この試験は、実際に試作したこの発明の組成物と対照の組成物について、感染予防効果を比較するために行った。
１）試料の調製
実施例３と同一の方法によりこの発明の組成物を調製した（試料１）。
【００３３】
これとは別に実施例３と同一の方法により調製した中間製品粉末０．５ｋｇに蔗糖（ホクレン製）６８ｇ、ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）６ｇおよびアミノ酸混合粉末（味の素社製）３ｇを添加し、均一に混合し、粉末状の組成物約０．５６ｋｇを得た（試料２）。
２）試験方法
２種類の試料を、それぞれ別個に１５％の濃度で水に溶解し、摂取時の状態で糖鎖ペプチド混合物を、０．１６％（試料１）または０％（試料２）含有する試料（経腸栄養剤）を調製し、オートクレーブで常法により加熱殺菌した。この２種類の試料を無菌パックに分注し、無菌水および固形飼料の代わりに使用し、試験例３と同様の方法により４週令の無菌マウス（ビニールアイソレーター中で交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌各１０匹に自由摂取させた。飼育１週間目に両群のマウスに試験例２と同一の方法で調製した大腸菌の菌液（生菌濃度５×１０10／ｍｌ）０．２ｍｌをゾンデで胃内に単回投与した。各群を上記と同様の経腸栄養剤でさらに飼育し、２４時間後のマウスの感染死亡頭数を試験した。
３）試験結果
その結果、感染死亡頭数は、試料２を投与した群では８／１０であったのに対し、この発明の糖鎖ペプチド混合物を含む試料１を投与した群では１／１０であり、この発明の組成物により病原性微生物感染が、顕著に抑制されることが認められた。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを精製水９ｌに溶解し、１規定の塩酸を添加してｐＨを３．０に調整し、市販の豚ペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、のち８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。次いで、１規定水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。このラクトフェリン分解物溶液を凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約９６０ｇを得た。
【００３５】
前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物約１５ｇを得た。
【００３６】
得られた糖鎖ペプチド混合物について、前記の各試験例と同様の方法により試験した結果、生体外における抗菌性活性は全く存在せず、糖含有量は２５％であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含量１１％の約２．３倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した糖鎖ペプチド混合物の分子量は１４，０００以下に分布していることが確認された。
実施例２
チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを精製水９リットルに溶解し、ｐＨを中性に調整し、市販の豚トリプシン（１，０００単位／ｍｇ。シグマ社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、のち８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。このラクトフェリン分解物溶液を凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約９６０ｇを得た。
【００３７】
前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物約２０ｇを得た。これら一連の分画操作を３回反復し、合計約６０ｇの糖鎖ペプチド混合物の粉末を得た。
【００３８】
得られた糖鎖ペプチド混合物について、前記と同様の方法により試験した結果、生体外における抗菌性活性は全く存在せず、糖含量は２０％であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含有量１１％の約１．８倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した糖鎖ペプチド混合物の分子量は４２，０００以下に分布していることが確認された。
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１．２ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３．６ｋｇ並びに少量の水溶性ビタミンおよびミネラルを、水２０ｋｇを注入したタンク内で溶解し、水相を調製した。一方、大豆サラダ油（太陽油脂社製）０．３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）０．８５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）０．２５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．０２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．０２ｋｇおよび少量の脂溶性ビタミンを混合物を均一に混合し、油相を調製した。
【００３９】
タンク内の水相に油相を添加し、撹拌して混合し、７０℃に加温し、ホモゲナイザーより１５０ｋｇ／ｃｍ2 の圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、中間製品粉末約３．５ｋｇを得た。
この中間製品粉末２．５ｋｇに蔗糖（ホクレン製）０．３４ｋｇ、実施例２と同一の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物の粉末３０ｇおよびアミノ酸混合粉末（味の素社製）１５ｇを添加して均一に混合し、粉末状の経腸栄養剤約２．８ｋｇを得た。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の糖鎖ペプチド混合物と、これを有効成分として含有する組成物は、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管からの微生物の臓器侵入等の細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症からヒトおよび動物を防御する効果を有する。これらの使用により、抗生物質等の投与量を減少させ、それらによる副作用を緩和することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の糖鎖ペプチド混合物の、図面に代わるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真である。
【産業上の利用分野】
この発明は、ラクトフェリン加水分解物より分画され、生体内において感染防御作用を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物（以下糖鎖ペプチド混合物と記載する）と、この糖鎖ペプチド混合物を有効成分として含有する食品、医薬品または飼料等の組成物に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、それ自体生体外では全く抗菌活性を示さず、ヒトおよび動物に経口的に投与することにより、生体内において細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染を防御し、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管からの微生物の臓器侵入等の疾病を予防する効果を有するラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物と、この糖鎖ペプチド混合物を有効成分として含有する組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近代における衛生、栄養の向上、または抗生物質等を用いた化学療法の発展により、細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症は著しく減少した。しかしながら、耐性微生物の出現により、新たな抗生物質の開発が常に余儀なくされており、抗生物質投与によるショック死、菌交代症等の副作用の深刻な問題を惹起している。従って、安全で副作用のない新たな抗菌剤または感染防御剤の開発が期待されている。
【０００３】
ラクトフェリンは涙、唾液、末梢血、乳汁中に含まれている鉄結合性糖蛋白質であり、従来より大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム菌等の有害微生物に対して生体外で抗菌作用を示すことが知られている［ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics ）、第９４巻、第１〜９ページ、１９７９年］。
【０００４】
ラクトフェリンに結合している糖鎖の機能については、ヒトラクトフェリンの加水分解物からクロマトグラフィーにより精製して得られた糖ペプチドに赤痢菌（Shigella flexneri ）の腸管粘膜細胞への付着を生体外で阻害する活性が認められている［インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）、第３５巻、第１１１０〜１１１８ページ、１９８２年］。また、ラクトフェリンの糖鎖構造は生物種の間で差異のあることが明らかにされている［バイオキミー（Biochimie ）、第７０巻、第１４５９〜１４６９ページ、１９８８年］が、ウシラクトフェリン由来糖鎖ペプチドの生体内における生理活性に関する報告は現在に至るまで全くなされていない。
【０００５】
一方、ウシラクトフェリンの生理作用については、病原性大腸菌の腸管粘膜への付着に対する阻止作用［第２５回日本無菌生物ノートバイオロジー学会総会、抄録第２２ページ、、１９９２年］、リゾチーム共存下での大腸菌の菌体凝集活性［ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Agricultural and Biological Chemistry）、第５３巻、第１７０５〜１７０６ページ、１９８９年］等が報告されている。さらに、ラクトフェリン、その加水分解物およびラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドについては、、アポラクトフェリンおよびリゾチームを有効成分とする抗菌性組成物（特開昭６２ー２４９９３１号公報）、ラクトフェリン加水分解物を有効成分とする抗菌剤（特開昭５ー３２００６８号公報）、抗菌性ペプチドおよび抗菌剤（特開平５ー９２９９４号公報）、病原性菌付着防止剤およびそれを含有する飲食品（特開平３ー２２０１３０号公報）等、多くの食品、医薬品への応用例が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記のラクトフェリンおよびラクトフェリン関連物質は、いずれも生体外で抗菌活性が既に確認されたものであり、それ自体生体外では抗菌活性を示さない糖鎖ペプチド混合物、特にラクトフェリン加水分解物から分画された糖鎖ペプチド混合物の生理活性は全く知られておらず、その用途に関する報告も皆無である。
【０００７】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、経口的に摂取しても安全であり、生体内における細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症を効果的に防御するペプチド混合物と、このペプチド混合物を有効成分として含有する組成物を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記の課題を解決するものとして、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物又はトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物を提供する。
【０００９】
さらにこの発明は、ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物又はトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物を有効成分として含有し、かつ当該ペプチド混合物以外の前記ゲル濾過クロマトグラフィー分画物を添加成分としない組成物をも提供する。
【００１０】
そして、この組成物においては、ペプチド混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％（重量。以下断りのない限り同じ）含有されていることを望ましい態様としてもいる。
以下、この発明について詳しく説明する。
この発明の糖鎖ペプチド混合物の出発物質となるラクトフェリンは、市販のラクトフェリン、牛乳、脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）により分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属で結合させた金属飽和若しくは部分飽和ラクトフェリン、またはこれらの混合物であり、公知の方法により調製することができる。出発物質となるラクトフェリンは、ウシ由来のものが最も望ましいが、ヒト、ヤギ、ヒツジ、水牛等から得られるものであってもよい。
【００１１】
この発明の糖鎖ペプチド混合物を得るために用いられるラクトフェリン加水分解物は、例えば、特開平５ー２３８９４８号公報に記載の方法により製造することができる。ラクトフェリンの加水分解にはどのようなプロテアーゼを用いてもよいが、糖鎖ペプチド混合物の高い感染防御活性が得られるペプシンまたはトリプシンが望ましい。
【００１２】
また、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンの加水分解物から（例えば疎水性クロマトグラフィーによって）生体外で抗菌性を有するペプチドを分画した残渣として得られるペプチドの混合物から分画することもできる。
この発明の糖鎖ペプチド混合物は、これらのラクトフェリンの加水分解物またはペプチドの混合物から、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、限外濾過等の常法により分画することができる。分画した糖鎖ペプチド混合物は、常法（例えば、減圧加熱濃縮、真空濃縮、膜濃縮等）により濃縮した濃縮液に、またはこの濃縮液を常法（例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等）により乾燥した粉末に、加工することもできる。
【００１３】
分画して得られた糖鎖ペプチド混合物は、未分画のラクトフェリンおよびラクトフェリン加水分解物から分離された公知の抗菌性ペプチドと比較して、より多くの糖を含有していること、および後記する試験例から明らかなように、そのものは生体外において全く抗菌活性を示さないこと、の顕著な相違を有している。
なお、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンの加水分解後に、酵素を加熱失活させるため、既に殺菌されているが、必要があればさらに加熱殺菌することもできる。
【００１４】
以上のようにして得られたラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物は、
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、
ｄ）糖含有量が２０％以上であること、
の理化学的および生物学的性質を有している。
【００１５】
その他に、この発明の糖鎖ペプチド混合物は、ラクトフェリンをプロテアーゼで加水分解し、分画操作によって得られた糖鎖ペプチド混合物であるから、水溶性、耐熱性、低抗原性、消化吸収性等に優れ、かつ副作用もないという優れた特徴を有している。
次に、この発明の組成物について説明する。この発明の組成物は、通常の加工食品、加工乳、乳性飲料、育児用ミルク、治療用ミルク、通常の飼料、飼料用ミルク、通常の医薬品、経腸または経管栄養剤等、経口的または経管的に摂取可能な食品、飼料、医薬品等であり、その形態は溶液状、流動状、半固形状、固形状、粉末等どのような形態であってもよい。経腸または経管栄養剤としては、普通流動食、ブレンダー食、濃厚流動食等の完全流動食、低蛋白流動食、低コレステロール流動食、低ナトリウム流動食、治療乳、成分栄養流動食等の特殊流動食であってもよい。
【００１６】
この発明の組成物には、糖鎖ペプチド混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％、望ましくは０．１〜１％含有されている。使用時の状態とは、各種組成物を摂取のために調整した状態を意味し、例えば、粉末組成物の場合、所定濃度で水に溶解した状態である。
この発明の組成物に添加する糖鎖ペプチド混合物は、加熱による変性がほとんどないので、食品、医薬品、飼料等への添加は、製造工程のいずれの段階であっても可能である。この発明の組成物は、糖鎖ペプチド混合物を含有し、病原性微生物による感染を防御する効果がある。
【００１７】
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の調製法を調べるために行った。
すなわち、チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）を以下の方法により加水分解した。
１）ペプシンで加水分解する場合
ラクトフェリンを精製水に５〜１０％の濃度に溶解し、ｐＨを３．０に調整し、ラクトフェリンの約３％の市販の豚ペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）を添加して均一に混合し、３７℃で約４時間保持し、のち加熱して酵素を失活させた。次いでｐＨを中性に調整し、不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。
２）トリプシン、プロナーゼ等の中性プロテアーゼによって分解する場合
ラクトフェリン溶液のｐＨを中性とした後にラクトフェリンの１〜５％の酵素を添加して前記と同様に加水分解した。
３）分画
前記１）および２）のラクトフェリン分解物を常法により凍結乾燥し、乾燥粉末を１０〜３０％の濃度でを精製水に溶解し、ゲル濾過材を充填したカラムで分画した。分画した各フラクションの糖含量を測定し、糖を含有するフラクションを混合し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物を得た。なお、分画方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィーの他、限外濾過膜を用いた方法、レクチン固定化担体を用いた親和性クロマトグラフィー等、糖鎖ペプチド混合物を分画できれば、どのような方法であってもよい。
４）得られた糖鎖ペプチド混合物
前記のとおり得られたラクトフェリン由来の糖鎖ペプチド混合物は次のａ）〜ｄ）の理化学的および生物学的性質を有することが、後記する試験方法により確認された。
ａ）病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外で抗菌作用を有さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、
ｄ）糖含有量が２０％以上であること。
試験例２
この試験では、病原性微生物感染モデルマウスを作出し、生体内におけるこの発明の糖鎖ペプチド混合物の感染防御能を評価した。
【００１８】
公知の腸管病原性大腸菌（Escherichia coli O111 ：東京大学医科学研究所から分譲された菌株。以下単に大腸菌と記載する）をマウスに胃内投与し、高頻度に感染を惹起するモデルマウスを作出した。すなわち、４週令の無菌マウス（ビニールアイソレーター中で交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２０匹を１０匹づつ２群に分け、別々のビニールアイソレーター中で糞食防止ネットを敷設したケージに入れ、放射線滅菌した固形飼料Ｆ−２（船橋農場製）および滅菌水を自由摂取させて１週間飼育した。
【００１９】
ブレイン・ハート・インヒュージョン液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で前記大腸菌を２４時間静置培養し、培養液を遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）で菌体を３回洗浄し、同リン酸緩衝生理食塩水で５×１０10／ｍｌの生菌濃度で懸濁した。次いで、１群のマウスに菌液０．２ｍｌを、他の１群にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）０．２ｍｌをゾンデで胃内に単回投与した。菌投与後、両群のマウスを前記飼料でさらに２４時間飼育した。飼育終了後のマウスの死亡数を調べ、各群の感染死亡率を比較した。
【００２０】
その結果、大腸菌投与群の死亡頭数は、７／１０（１０匹中７匹が死亡したことを示す。以下特に断りのない限り同じ）であったのに対し、非投与群の死亡頭数は０／１０であった。
試験例３
この試験は、前記病原性微生物感染モデルマウスに対する糖鎖ペプチド混合物の生体内における感染防御能を調べるために行った。
【００２１】
試験例２と同一の方法により作成した無菌雌マウス、５０匹を１０匹づつ５群に分け、別々のビニールアイソレーター中で糞食防止ネットを敷設したケージに入れた。実施例１の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物を０、０．０１、０．１、１または５％の各濃度で無菌水に添加し、フィルターユニット（ナルゲン社製）で再度除菌した。この溶液および放射線滅菌した固形飼料Ｆ−２（船橋農場製）を無菌マウスに１週間自由摂取させた。
【００２２】
試験例２と同一の方法ですべての群に前記大腸菌を投与し、各群を前記と同一の飼料でさらに２４時間飼育し、のち感染死亡頭数を比較した。
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１の結果からこの発明の糖鎖ペプチド混合物は０．０１％、望ましくは０．１％以上の添加濃度で病原性大腸菌による感染を顕著に抑制することが認められた。
【００２３】
一方、対照として卵白アルブミン（シグマ社製）から、試験例１と同一のペプシン加水分解により調製した糖鎖を有するペプチド混合物を無菌水に５％の濃度で添加し、同様に試験したが、感染死亡頭数は７／１０であり、感染防御効果は認められなかった。
なお、他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物を用いて同様の試験を行ったが、ほぼ同様の感染防御効果が認められた。
【００２４】
【表１】
試験例４
この試験は、生体外におけるこの発明の糖鎖ペプチド混合物の抗菌活性を調べるために行った。
１％バクトペプトン（ディフコ・ラボラトリー社製）水からなる液体培地２ｍｌに、０〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で段階的にこの発明の糖鎖ペプチド混合物（実施例１と同一の方法により製造）を添加し、大腸菌を１０6 ／ｍｌの生菌数濃度で接種し、３７℃で１６時間静置培養した。培養後の供試菌の発育状態を６６０ｎｍの吸光度で測定した結果、糖鎖ペプチド混合物をいずれの濃度に添加した場合にも供試菌の増殖抑制は認められず、この糖鎖ペプチド混合物には生体外における抗菌活性は全く存在しないことが認められた。
【００２６】
一方、対照として用いた未分解のラクトフェリンは２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全に阻止し、またラクトフェリンのペプシン分解物は２００μｇ／ｍｌ以上の濃度で供試菌の増殖を完全に阻止した。
なお、他の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物についても同様の試験を行ったが、いずれも生体外における抗菌活性は全く認められなかった。
試験例５
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量および分子量を調べるために行った。
１）糖含有量
実施例１と同一の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量を次の方法により測定した。
【００２７】
糖鎖ペプチド混合物溶液０．２ｍｌを試験管にとり、５％フェノール水溶液０．２ｍｌを添加混合した後、濃硫酸（精密分析用。和光純薬工業社製）１ｍｌをすばやく添加してよく混合し、この溶液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。糖含有量は、同時に標準ガラクトース（和光純薬工業社製）溶液を用いて測定した検量線から求めた。
【００２８】
その結果、この発明の糖鎖ペプチド混合物の糖含有量は、２５％であった。なお、他の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物においても糖含有量は、いずれも２０％以上であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含量１１％と比較して顕著に多いことが判明した。
２）分子量
実施例１および実施例２と同一の方法により製造したこの発明の糖鎖ペプチド混合物の分子量を次の方法により測定した。
【００２９】
１５〜２５％の濃度勾配を有するＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用ゲル（第一化学薬品社製）に糖鎖ペプチド混合物１０μｇを供給し、常法により電気泳動を行った。また、分子量測定マーカー（第一化学薬品社製）を同時に供給し、これらのマーカーの泳動距離との比較から、供試した糖鎖ペプチド混合物の分子量を求めた。
【００３０】
その結果は、図１に示すとおりであった。図１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真であり、レーン１からレーン４は、それぞれマーカー、未分解のウシラクトフェリン、実施例１の糖鎖ペプチド混合物および実施例２の糖鎖ペプチド混合物である。
図１から明らかなとおり、実施例１および実施例２のこの発明の糖鎖ペプチド混合物の分子量は、それぞれ１４，０００以下および４２，０００以下であった。なお、他の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物の分子量は、いずれも４２，０００以下であり、未分解のラクトフェリンの分子量８０，０００と比較して極めて小さいことが判明した。
試験例６
この試験は、この発明の糖鎖ペプチド混合物の急性毒性を調べるために行った。
１）使用動物
６週令のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ各３群、計６群（１群５匹）に分けた。
２）試験方法
実施例１と同様の方法で製造した糖鎖ペプチド混合物を注射用水（大塚製薬社製）に１０％の濃度で溶解し、体重１ｋｇ当たり１０００または２０００ｍｇの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、２週間観察して急性毒性を試験した。なお、対照として雄および雌の各１群に注射用水を体重１００ｇ当たり２ｇの割合で同様に経口投与した。
３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなように、この糖鎖ペプチド混合物を１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、この糖鎖ペプチド混合物のＬＤ50は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低いことが認められた。なお、他の製造方法により得られたこの発明の糖鎖ペプチド混合物についても試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３１】
【表２】
試験例７
この試験は、実際に試作したこの発明の組成物と対照の組成物について、感染予防効果を比較するために行った。
１）試料の調製
実施例３と同一の方法によりこの発明の組成物を調製した（試料１）。
【００３３】
これとは別に実施例３と同一の方法により調製した中間製品粉末０．５ｋｇに蔗糖（ホクレン製）６８ｇ、ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）６ｇおよびアミノ酸混合粉末（味の素社製）３ｇを添加し、均一に混合し、粉末状の組成物約０．５６ｋｇを得た（試料２）。
２）試験方法
２種類の試料を、それぞれ別個に１５％の濃度で水に溶解し、摂取時の状態で糖鎖ペプチド混合物を、０．１６％（試料１）または０％（試料２）含有する試料（経腸栄養剤）を調製し、オートクレーブで常法により加熱殺菌した。この２種類の試料を無菌パックに分注し、無菌水および固形飼料の代わりに使用し、試験例３と同様の方法により４週令の無菌マウス（ビニールアイソレーター中で交配し、維持したもの）、ＢＡＬＢ／ｃ、雌各１０匹に自由摂取させた。飼育１週間目に両群のマウスに試験例２と同一の方法で調製した大腸菌の菌液（生菌濃度５×１０10／ｍｌ）０．２ｍｌをゾンデで胃内に単回投与した。各群を上記と同様の経腸栄養剤でさらに飼育し、２４時間後のマウスの感染死亡頭数を試験した。
３）試験結果
その結果、感染死亡頭数は、試料２を投与した群では８／１０であったのに対し、この発明の糖鎖ペプチド混合物を含む試料１を投与した群では１／１０であり、この発明の組成物により病原性微生物感染が、顕著に抑制されることが認められた。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１
チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを精製水９ｌに溶解し、１規定の塩酸を添加してｐＨを３．０に調整し、市販の豚ペプシン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、のち８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。次いで、１規定水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。このラクトフェリン分解物溶液を凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約９６０ｇを得た。
【００３５】
前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物約１５ｇを得た。
【００３６】
得られた糖鎖ペプチド混合物について、前記の各試験例と同様の方法により試験した結果、生体外における抗菌性活性は全く存在せず、糖含有量は２５％であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含量１１％の約２．３倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した糖鎖ペプチド混合物の分子量は１４，０００以下に分布していることが確認された。
実施例２
チーズホエーから分離した市販のラクトフェリン（森永乳業社製）１ｋｇを精製水９リットルに溶解し、ｐＨを中性に調整し、市販の豚トリプシン（１，０００単位／ｍｇ。シグマ社製）３０ｇを添加して均一に混合し、３７℃で４時間保持し、のち８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。不溶物を濾過して除去し、ラクトフェリン分解物溶液を得た。このラクトフェリン分解物溶液を凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物の粉末約９６０ｇを得た。
【００３７】
前記粉末４０ｇを精製水４００ｍｌに溶解し、セファデックス（商標。ファルマシア社製）Ｇ−５０を充填し、予め精製水で平衡化したカラム（直径２０ｃｍ×高さ５５ｃｍ）に流速６５ｍｌ／分で通液し、溶出液を１００ｍｌのフラクションとして分取し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度および糖含量（前記試験例５と同一の方法による）を測定した。高分子域に溶出された糖を含有するフラクションをすべて混合し、逆浸透膜（旭化成社製）により濃縮し、凍結乾燥し、糖鎖ペプチド混合物約２０ｇを得た。これら一連の分画操作を３回反復し、合計約６０ｇの糖鎖ペプチド混合物の粉末を得た。
【００３８】
得られた糖鎖ペプチド混合物について、前記と同様の方法により試験した結果、生体外における抗菌性活性は全く存在せず、糖含量は２０％であり、未分画のラクトフェリン加水分解物の糖含有量１１％の約１．８倍であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した糖鎖ペプチド混合物の分子量は４２，０００以下に分布していることが確認された。
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１．２ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３．６ｋｇ並びに少量の水溶性ビタミンおよびミネラルを、水２０ｋｇを注入したタンク内で溶解し、水相を調製した。一方、大豆サラダ油（太陽油脂社製）０．３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）０．８５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）０．２５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．０２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．０２ｋｇおよび少量の脂溶性ビタミンを混合物を均一に混合し、油相を調製した。
【００３９】
タンク内の水相に油相を添加し、撹拌して混合し、７０℃に加温し、ホモゲナイザーより１５０ｋｇ／ｃｍ2 の圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、中間製品粉末約３．５ｋｇを得た。
この中間製品粉末２．５ｋｇに蔗糖（ホクレン製）０．３４ｋｇ、実施例２と同一の方法により製造した糖鎖ペプチド混合物の粉末３０ｇおよびアミノ酸混合粉末（味の素社製）１５ｇを添加して均一に混合し、粉末状の経腸栄養剤約２．８ｋｇを得た。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明の糖鎖ペプチド混合物と、これを有効成分として含有する組成物は、下痢、食中毒、細菌性腸炎、敗血症、消化管からの微生物の臓器侵入等の細菌、ウイルス、かび、酵母等の病原性微生物による感染症からヒトおよび動物を防御する効果を有する。これらの使用により、抗生物質等の投与量を減少させ、それらによる副作用を緩和することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の糖鎖ペプチド混合物の、図面に代わるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動写真である。
Claims (3)
- ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物またはトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物。 - ウシラクトフェリンのペプシン加水分解物またはトリプシン加水分解物から、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画され、次のａ）〜ｄ）
ａ）消化管内で病原性微生物による感染を防御すること、
ｂ）生体外では全く抗菌作用を示さないこと、
ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した分子量が４２，０００以下であること、および
ｄ）糖含有量が２０％（重量）以上であること、
の理化学的および生物学的活性を有し、かつ糖鎖を有するペプチド混合物を有効成分として含有し、かつ当該ペプチド混合物以外の前記ゲル濾過クロマトグラフィー分画物を添加成分としない組成物。 - ペプチド混合物が、使用時の状態において少なくとも０．０１％（重量）含有されている請求項２に記載の組成物。
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