KR101120161B1 - 키토산을 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로, 특히 본 발명에 따른 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 그람 양성균, 그람 음성균, 효모 및 곰팡이에 대한 매우 우수한 항균활성을 갖는 항균 조성물에 관한 것이다.

키토산, 항균 조성물

Description

키토산을 포함하는 항균 조성물{A ANTIBACTERIAL COMPOSITION COMPRISING CHITOSAN}

본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다. 가장 대표적인 항생제로는 영국인 의사 알렉산더 플레밍이 1928년에 제조한 페니실린이다. 페니실린은 인류가 세균에 본격적으로 대응하기 위해 제조한 최초의 항생제였다. 페니실린 이후에 개발된 대표적인 항생제로는 페니실린 보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있다. 메티실린은 페니실린의 화학구조를 일부 변경하여 제조한 것이다.

상기 메티실린은 베타-락탐계 항생제(beta-lactam class of antibiotics)로 분류되며, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린-결합 단백질(penicillin-binding proteins, PBPs)와 결합을 형성한 후 이 단백질의 활성을 제거함으로써 약효를 발휘하는 것이다.

항생제내성세균이란 특정 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전세계적으로 주요 병원내 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus , MRSA)이 있다. 상기, MRSA는 페니실린이나 메티실린의 항생제에도 내성을 나타낼 수 있는 독특한 유전자를 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 MRSA는 주로 건강한 사람에게는 감염이 되지 아니하고 주로, 면역력이 약한 환자나 수술을 마친 환자에게 감염이 되나, 감염이 되는 경우에는 패혈증이나 폐렴을 일으켜 사망케 하는 것으로 보고되어 있다.

이와 같은 기존 화학물질 유래 항생제에 대한 내성을 가진 병원성 미생물로 인한 감염이 증가함에 따라, 최근에는 기존 화학물질 유래 항균제의 경우 부작용과 내성이 문제되어, 천연물 유래 항균 물질에 대한 개발의 요구가 증대되면서, 천연물을 이용한 여러 약품 또는 항생제를 개발하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.

본 발명은 그람 양성균, 그람 음성균, 효모 및 곰팡이에 대해 항균활성을 갖는 천연물질 유래 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 포함하는 위해 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자는 내성이나 안전성 문제가 제기되는 기존 화학물질 유래 항균물질을 대체할 수 있는 물질을 연구하던 중, 특정 분자량 및 특정 범위의 탈아세틸화도의 키토산을 특정 pH의 범위에서 처리하는 경우, 현저하게 항균활성이 향상된다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 키토산은 새우 및 게 등의 갑각류로부터 산출되는 매우 유용한 생체물질로 그 화학명은 (1→4)2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코사민으로 불려진다. 상기 키토산은 그 자체로서 혈중 콜레스트렐 감소 및 지방 흡수 저해 효 과, 항암 효과, 면역력 강화 효과, 항당뇨 효과 및 상처치료 효과 등의 다양한 생리 활성을 갖고 있으며, 특히 구강, 비강 및 장강 등의 점액질 층에 결합하여 약물의 흡수를 촉진시키는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명에 있어서 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람 양성균, 그람 음성균, 곰팡이 및 효모의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

상기 키토산은 분자량이 12,000 Da 내지 25,000 Da, 바람직하게는 14,000 Da 내지 20,000 Da, 더욱 바람직하게는 15,000 Da 내지 17,000 Da일 수 있다. 분자량에 따른 항균활성을 검토한 결과, 본 발명의 분자량의 범위를 벗어난 키토산의 경우 본 발명의 분자량 범위의 키토산에 비하여 다양한 미생물에 대한 항균활성이 우수하여, 키토산의 분자량은 본 발명의 범위가 바람직하다.

또한, 본 발명의 키토산 탈아세틸화도가 80 내지 90%, 바람직하게는 82.5 내지 87.5%, 더욱 바람직하게는 84 내지 86%일 수 있다. 키토산의 항균활성은 본 발명의 탈아세틸화 범위에서 상기 범위보다 높은 탈아세틸화도 또는 상기 범위보다 낮은 탈아세틸화도의 키토산에 비하여 항균활성이 현저하게 우수한 것으로 확인되었으므로, 키토산의 탈아세틸화도는 본 발명의 범위가 바람직하다.

본 발명의 항균 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 키토산을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 항균 조성물은 병원성 미생물, 구체적으로는 그람 양성균 또는 그람 음성균에 대한 항균 활성을 갖는 항균 조성물일 수 있고, 보다 상세하게는 스테필로코커스속 균주(Staphylococcus sp), 대장균(E. coli), 슈도모나스속 균주(Pseudomonas sp), 안티모바실러스속 균주(Antimobacillus . sp), 스트렙토코커스속 균주(Streptococcus sp), 칸디다 균(Candida albicans) 및 아스퍼질러스속 균주(Aspergillus sp)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 안티모바실러스 안티마세템코미탄스(Antimobacillus . antinomycetemcomitans), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 칸디다 균(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상, 더욱 바람직하게는 칸디다 균, 스트렙토코커스 뮤탄스, 아스퍼질러스 나이거 및 황색포도상구균으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상에 대해 항균활성을 갖는 항균 조성물일 수 있다.

상기 황색포도상구균은 농양이나 창상감염 등의 피부 감염뿐만 아니라 폐렴, 패혈증 등의 중증 감염의 원인 균으로 보고되어 있으며, 상기 황색포도상구균에 의한 감염에 의해 폐렴, 폐화농증, 농흉 등의 호흡기감염증, 패혈증, 균혈증, 감염성 심내막염, 장관감염증, 난치성 욕창 또는 창상 감염 등이 발병되는 것으로 보고되어 있다.

본 발명의 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있다.

상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 절지동물에 속하는 게, 새우, 대하 등의 갑각류, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류, 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 인간, 돼지, 소 염소 등의 포유류일 수 있다.

본 발명의 항균 조성물은 키토산 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

본 발명의 상기 항균 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 식품, 식품 첨가제, 음료, 화장료 조성물, 화장품 첨가물 또는 세정제의 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 상기 항균대상이 되는 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 질병은 일 예로 상기 병원성 미생물의 감염에 의해 발병할 수 있는 각종 감염성 질병을 의미하며, 바람직하게는 황색포도상구균의 감염에 의한 폐렴, 폐화농증, 농흉 등의 호흡기감염증, 패혈증, 균혈증, 감염성 심내막염, 장염, 장관감염증, 난치성 욕창 또는 창상감염, 대장균 감염에 의한 방광염, 신우염, 복막염, 패혈증 또는 설사, 녹농균 감염에 의한 농흉 또는 중이염, 스트렙토코커스 뮤탄스 감염에 의한 충치 또는 구강질환, 칸디다 균 감염에 칸디다 증 또는 칸디다질염, 아스퍼질러스의 감염에 의한 각막진균증, 진균성 유방염, 아스퍼질러스증 등일 수 있다.

본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 키토산 이외에 제형 및 사용방법에 따라 약리학적으로 사용가능한 담체나 부형제를 부가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물 단독으로 또는 미생물의 감염에 의한 질병의 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다.

이 경우 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물내 키토산의 함량은 0.001 내지 99 중량%일 수 있다. 조성물 내 키토산의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우 효과적인 효능을 위해선 다량의 투여가 필요할 수 있으며, 99 중량% 초과하는 경우 사용량에 비해 효능이 일정할 수 있어 비경제적일 수 있다. 또한, 사용방법 및 사용목적에 따라 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 키토산의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있으나, 이의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으므로 하기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다. 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르, 리퀴드 파라틴 및 생리식염수가 있다.

구체적으로는 제형에 따라 경구투여의 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있고, 비경구투여의 경우, 멸균된 수용액, 비수성용제 또는 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등을 사용할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁제는 일예로 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등 일 수 있으며, 상기 좌제는 일예로 위텝솔, 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지 또는 글리세로제라틴 등일 수 있다.

또한, 추가로 본원발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 담체와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여대상은 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 극피동물, 절지동물, 연체동물 및 어류를 포함하는 해양생물 및 상기 해양생물을 섭취할 수 있는 포유류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 해양생물은 성게류 또는 해삼류와 같은 극피동물, 절지동물에 속하는 게, 새우, 대하 등의 갑각류, 두족류, 복족류 또는 이매패류 등의 연체동물, 참돔, 도미, 대구, 가자미, 넙치 등의 어류를 포함하는 양식 가능한 어패류일 수 있고 상기 포유류는 인간을 포함한 상기 양식 가능한 어패류를 섭취할 수 있는 돼지, 소, 염소 등의 사육이 가능한 가축과 꿩, 닭 등의 가금류일 수 있다.

본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여량 또는 사용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하며, 예컨대 1일 유효 투여량은 통상적으로 성인(70kg)의 경우, 10 내지 5000mg/kg이며 바람직하게는 100 내지 3000mg/kg이고, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루 1 내 지 3회 투여될 수 있다.

투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.

본 발명의 미생물의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 우수한 항균 효과에 의한 감염의 예방 또는 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 천연물질인 키토산을 유효성분으로 포함하는 것이므로 장기간 복용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 세정제를 제공한다. 상기 세정제는 바람직하게는 의류용 세제, 식기 세척제, 식품 세정제, 가전제품 세척제일 수 있다. 상기 항균 조성물은 천연성분으로 인체에 유해하지 아니하므로, 더욱 바람직하게는 주방용품 또는 식품세척 등을 포함하는 각종 생활용품의 세척이나 항균성 부여를 목적으로 사용할 수 있다.

상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택된 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 세정제 등 다른 유효성분이나 색소, 계면활성제, 방부제 등의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 세정제는 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있으며, 제품화를 위하여 포장을 위해 통상의 방법을 사용할 수 있다.

또한, 상기 세정제 중 항균 조성물의 사용량은 사용목적과 적용형태, 적용부위, 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있으며, 예를 들면 전체 조성물 기준으로 0.01 내지 50 중량부를 포함할 수 있으나, 상기 항균 조성물의 함량은 이에 한정되는 것은 아니다. 본원 발명의 항균 조성물은 천연성분으로 인체에 유해하지 아니하므로, 그 제품의 특성상 적용목적을 달성할 수 있는 경우라면 다양한 양으로 사용가능하다.

본 발명의 키토산을 포함하는 항균 조성물은 황색포도상구균, 대장균, 녹농균, 안티모바실러스 안티마세템코미탄스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 칸디다 균 또는 아스퍼질러스 나이거에 대해 항균활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 천연물질로부터 유래한 것이므로 부작용의 염려가 없어 천연항균제 및 상기 미생물의 감염에 의한 질병의 치료제로서 매우 가치가 높을 것으로 판단되므로, 다양한 산업분야에 널리 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분자량에 따른 키토산의 분리

분자량에 따른 키토산의 항균활성을 확인하기 위하여, 도 1에 기재된 방법으 로 한외여과필터를 이용하여 분자량 별로 키토산을 분리하였다.

보다 구체적으로는, MWCO 100KDa 한외여과필터(도면 1에서 A), MWCO 50KDa 한외여과필터 잔류액(도면 1에서 B), MWCO 10KDa 한외여과필터 잔류액(도면 1에서 C), MWCO 5KDa 한외여과필터 잔류액(도면 1에서 D)를 이용하여 키토산을 분리하였고, 이때 한외여과필터에 투입된 키토산은 키토산 3% 용액으로 농도를 조정한 키토산 용액이었다.

우선, 상기 키토산 3% 용액을 MWCO 100KDa 한외여과필터에 통과시킨 후, 잔류액을 수거하고(도 1의 2, A), 상기 여과액을 MWCO 50KDa 한외여과필터에 통과시켜 잔류액(도 1의 5, B)과 여과액을 수거하였다. 상기 수거된 여과액을 MWCO 10KDa 한외여과필터에 통과시킨 후, 잔류액을 수거하고(도 1의 8, C), 여과액을 MWCO 5KDa 한외여과필터에 통과시켜 잔류액(도 1의 11, D) 및 여과액(도 1의 12, E)을 수거하였다.

상기 수거된 잔류액 및 여과액에 대해 GPC(Gel Permeation Chromatography)를 수행하여 평균분자량을 측정하였다.

보다 구체적으로 상기 GPC는 Shimazu 10A 및 Waters Ultrahydrogel 칼럼(column)를 이용하였고, 이동상(Eluent)는 0.2% 아세트산(acetic acid) 및 0.4% NaCl을 사용하였으며, 시료는 0.5% 농도로 희석한 후, 0.45 μm 시린지 필터로 여과 후 사용하였고, 시료투입량은 100 μl이었다. 상기 조건으로 수행한 GPC 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.

[표 1]

분리액	A	B	C	D	E
평균분자량(Da)	258,000	35,800	15,785	5,790	890

상기 표 1은 평균 GPC 결과 계산한 평균 분자량이고, 상기 도 2는 각 분리액의 GPC 다이아글램(Diagram)을 나타낸 것이다.

실시예 2: 항균 활성의 측정

2-1. 탈아세틸화에 따른 항균활성의 측정

상기 항균활성이 우수한 키토산의 항균활성이 탈아세틸화도(DAC)에 의해 구분되어지는지 여부를 확인하였다.

상기 실시예 1의 분자량 별로 분리하기 전인 키토산 3% 용액을 탈아세틸화 정도에 따라 구분하여 제조하였다. 상기 탈아세틸화는 탈아세틸화가 각각 95%, 85% 및 70%인 키토산을 이용하였다.

항균력 측정에 사용된 균주는 각각 공시 균주를 사용하였고, 구체적으로 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 안티모바실러스 안티마세템코미탄스(Antimobacillus . antinomycetemcomitans), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 칸디다 균(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)이었다.

각 균주의 배양배지는 세균의 경웅 영양 한천 배지(Nutrient Agar)로, TSB(Tryptic soy broth), MHB(Muller-Hinton broth) 및 LB(Luria-Bertani broth) 등을 이용하여 제조하였고, 효모든 PDA 한천배지(potato dextrose agar)를 사용하 였으며, 각 세균의 배양온도는 세균의 경우 37℃ 및 효모의 경우 25℃를 이용하였다.

상기 항균활성의 측정은 최소억제농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)를 이용하였다. 구체적으로, 상기 대상 균주 각각에 대하여 세포수가 5 x 10⁴ CFU/ml이 되도록 농도를 조정한 세균 희석액과 상기 탈아세틸화도를 조정한 키토산 혼합액을 액체배지에 혼합하여 상기 온도 조건 및 배지에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 키토산 혼합액은 별도의 pH를 조절하거나 분자량 별로 분리하지 아니하였다. 상기 배양한 배양액 100 μl를 상기 균주에 따른 배지로 제조된 평판 고체배지에 도말하고, 60시간 동안 배양하였다. 평판고체배지에서 배양 후, 균수를 측정하여 균의 생육이 증가되지 않는 키토산의 농도를 최소성장억제농도(MCI)로 정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 상기 MIC의 농도는 mg/l이다.

[표 2]

	DAC 95%	DAC 85%	DAC 70%
S. aureus	470	370	420
E. coli	550	410	520
P. aeruginosa	600	380	420
Antimobacillus . antinomycetemcomitans	880	420	600
Streptococcus . mutans	950	610	750
C. albicans	160	50	120
A. niger	920	810	870

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 탈아세틸화가 85%인 키토산의 경우에 탈아세틸화가 70% 또는 95%인 경우에 비하여, 균주에 대한 항균활성이 우수한 것으로 확인되었다. 상기 결과는 탈아세틸화에 따라 항균활성이 증가되는 특정 범위가 있는 것이 확인되어, 탈아세틸화 정도를 조절함으로써 키토산의 항균활성을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 결과에 따라, 이후 항균활성과 관련된 키토산의 최적 분자량 및 최적 pH를 확인하기 위한 실험의 경우, 85%의 탈아세틸화를 진행한 키토산을 이용하여 실험하였다.

2-2. 분자량 및 pH 에 따른 항균활성의 측정

항균력 측정에 사용된 균주는 상기 실시예 2-1의 균주를 사용하였고, 균주의 배양 조건도 동일한 조건으로 배양하였다. 상기 항균활성의 측정은 최소억제농도법을 이용하였다.

구체적으로, 상기 대상 균주 각각에 대하여 세포수가 5 x 10⁴ CFU/ml이 되도록 농도를 조정한 세균 희석액과 상기 실시예 1의 분리액을 액체배지에 혼합하여 상기 온도 조건 및 배지에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 실시예 1의 분리액은 pH를 pH 6.5 및 pH 4.5로 조정하여 각각의 pH에 대해 실험을 수행하였다. 상기 배양한 배양액 100 μl를 상기 균주에 따른 배지로 제조된 평판 고체배지에 도말하고, 60시간 동안 배양하였다. 평판고체배지에서 배양 후, 균수를 측정하여 균의 생육이 증가되지 않는 키토산의 농도를 최소성장억제농도(MCI)로 정하였으며, 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.

[표 3]

	258 kDa	35.8 kDa	15.7 kDa	5.8 kDa	890Da
S. aureus	950	950	800	-	-
E. coli	1500	1350	1200	-	-
P. aeruginosa	950	850	750	-	-
Antimobacillus . antinomycetemcomitans	1150	1100	900	-	-
Streptococcus . mutans	1800	1570	1150	-	-
C. albicans	850	750	420	-	-
A. niger	3500	2600	1500	-	-

[표 4]

	15.7 kDa
	pH 6.5	pH 4.5
S. aureus	800	200
E. coli	1200	400
P. aeruginosa	750	350
Antimobacillus . antinomycetemcomitans	900	150
Streptococcus . mutans	1150	200
C. albicans	420	20
A. niger	1500	400

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 키토산의 분자량이 5.8 kDa 및 890 Da의 경우 항균활성이 전혀 없는 반면, 15.7 kDa의 경우 전반적으로 다른 분자량에 비하여 현저하게 우수한 항균활성을 나타내었다. 특히, 곰팡이와 효모인 칸디다 균(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)와 충치 등 구강 질환 등의 원인이 되는 스트렙토코커스 뮤탄스 등의 경우에는 258 kDa 및 35.8 kDa에 비하여 약 절반의 함량으로도 항균활성이 나타나, 약 2배에 가까운 항균활성이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 가장 항균활성이 뛰어난 평균분자량이 15.7 kDa인 키토산의 pH를 조정하면서 실험을 수행한 결과 pH 6.5에 비하여 pH 4.5의 경우에 전반적으로 현저하게 우수한 항균활성의 증가가 있는 것으로 확인되었고, 특히 칸디다 균의 경우 약 21배의 항균활성 증가가 확인되었고, 스트렙토코커 스 뮤탄스, 아스퍼질러스 나이거 및 황색 포도상구균의 경우에도 4배 이상의 현저한 항균활성이 있는 것으로 확인되어, 평균분자량이 15.7 kDa인 키토산의 pH를 pH 4.5로 조절하는 경우 항균활성을 현저하게 향상시킬 수 있음이 확인되었다.

상기 결과는 평균분자량이 15.7 kDa인 키토산의 pH를 조절하는 간단한 방법으로 항균활성을 현저하게 향상시킬 수 있는 것임을 확인시켜, 상기 키토산을 이용한 항균활성제와 관련하여 다양한 응용방법을 제공한 것으로 평가된다.

2-3. 분리여부에 따른 항균활성의 측정

상기 항균활성이 상기 특정 분자량의 키토산에 의한 것임을 확인하기 위하여, 상기 특정 분자량의 키토산만을 분리한 경우와 다양한 키토산이 포함되어 있으나 평균 분자량이 15 kDa인 키토산 혼합액을 비교하여 항균활성을 측정하였다. 상기 항균활성의 분리액은 상기 실시예 1에서 제조된 평균 분자량이 15.7kDa인 키토산을 사용하였고, 대조예로는 한외여과를 수행하지 않고 가수분해를 통해 얻은 평균 분자량이 15 kDa인 키토산을 사용하였으며, MIC의 측정은 pH 4.5의 조건에서 실시예 2-1과 같은 방법으로 수행하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5]

	키토산 분리액	가수분해 키토산
S. aureus	200	550
E. coli	400	650
P. aeruginosa	350	750
Antimobacillus . antinomycetemcomitans	150	350
Streptococcus . mutans	200	550
C. albicans	20	85
A. niger	400	950

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 키토산의 분자량이 유사한 경우에도 단순히 가수분해한 키토산에 비하여, 키토산 분리액은 약 2배 내지 4배 이상의 우수한 항균활성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 특정 분자량의 키토산이 다른 분자량의 키토산에 비하여 현저하게 우수한 항균활성을 갖는다는 본 발명자의 효과가 확인되었다.

상기 실험결과에 의할 경우, 본원발명의 특정 범위의 탈아세틸화를 진행한 특정 범위의 분자량의 키토산을 특정 pH로 조절하여 사용하는 경우, 다양한 세균 특히, 칸디다 균, 스트렙토코커스 뮤탄스, 아스퍼질러스 나이거 또는 황색 포도상구균 등에 대하여 현저하게 우수한 항균활성을 가질 수 있으므로, 상기 균들과 관련하여 기존 항생제를 대체할 수 있는 항생제 대체물질로 작용할 수 있음이 확인되었고, 이로부터 본원발명의 키토산을 다양한 분야에 산업적으로 이용할 수 있을 것으로 예상되었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산의 분자량을 분리하는 과정을 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키토산의 분자량에 따라 분리한 결과를 나타낸 분리액의 분자량 분포도를 나타낸 그래프이다.

Claims (6)

1. 분자량이 15,000 Da 내지 17,000 Da이고, 탈아세틸화도가 85%인 키토산을 유효성분으로 포함하는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(E.coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 칸디다 균(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것에 대해 항균활성을 갖는 항균 조성물로 상기 항균 조성물의 pH가 pH 4.5인 항균 조성물.
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