ES2846789T3 - Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido que comprende hialuronano (HA) de alto peso molecular, proteína inter-α-inhibidora (IαI) de cadena pesada 1 (HC1), proteína inter-α-inhibidora (IαI) de cadena pesada 2 (HC2), proteína pentraxina 3 (PTX3) y gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral α (TSG-6), en el que el complejo se puede obtener mediante reconstitución usando una relación molar de al menos 3:1 de IαI a TSG- 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos
Antecedentes de la invención
La membrana amniótica (AM) es un saco membranoso avascular que está lleno de líquido amniótico que rodea al feto. La AM, como la placenta, se deriva del epiblasto formado durante el desarrollo del óvulo fertilizado. La AM forma la membrana más interna que rodea al feto en la cavidad amniótica. En los mamíferos placentarios, el cordón umbilical (es decir, el funiculus umbilicalis) conecta al feto en desarrollo con la placenta. El cordón umbilical está formado por membrana amniótica (UCAM) y Gelatina de Wharton. La membrana amniótica forma la capa externa del cordón umbilical. La UCAM funciona para regular la presión del fluido dentro de la UC. La gelatina de Wharton es una sustancia gelatinosa dentro del cordón umbilical, compuesta en gran parte por mucopolisacáridos (ácido hialurónico y sulfato de condroitina). También contiene algunos fibroblastos y macrófagos. El cordón umbilical comprende además dos arterias (las arterias umbilicales) y una vena (la vena umbilical), enterradas dentro de la gelatina de Wharton. El documento WO 2007/038686 A2 en particular divulga composiciones que comprenden hialuronano entrecruzado de alto peso molecular, TSG-6, PTX-3 y TSP-1 para diversos usos médicos tales como el tratamiento de la cicatrización de heridas o la inflamación. Arvo Annual Meeting Abstract Search and Program Planner vol. 2011, mayo de 2011, 4881/A125 se refiere al papel de PTX3 en el potenciamiento de la acción antiangiogénica de los complejos de hialuronano enlazados covalentemente a cadenas pesadas de inhibidor inter­ alfa. J. Biol. Chem. 2009, 284, 20136-20146 describe complejos nHC-HA o rcHC-HA que comprenden TSG-6 y su caracterización bioquímica en vista de su acción antiinflamatoria y anti-cicatrizante.
Sumario de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido según se reivindica, un dispositivo médico que comprende un sustrato recubierto con el mismo y un método in vitro para inducir la expansión de células madre según se reivindica. Las realizaciones adicionales descritas de la solicitud que van más allá del alcance reivindicado se describen únicamente como referencia. En el presente documento se describen métodos para la identificación de complejos HC-HA/PTX3 en tejidos fetales, tales como la membrana amniótica y el cordón umbilical. Además, en el presente documento se describen métodos para el aislamiento de complejos de HC-HA/PTX3 nativos de tejidos fetales, tales como la membrana amniótica y el cordón umbilical. También se describen en el presente documento métodos para la producción de complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos. También se describen en el presente documento métodos para el uso de complejos HC-HA/PTX3 nativos y reconstituidos proporcionados en el presente documento.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir complejos HC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, los métodos comprenden aislar un complejo de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativo a partir de un extracto preparado a partir de un tejido o una célula. En algunas realizaciones, los métodos comprenden generar un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para aislar complejos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativos de tejidos amnióticos, tales como el cordón umbilical o la membrana amniótica. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 se aíslan de una célula aislada. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 se aíslan de una célula cultivada. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 se aíslan de una célula madre. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 se aíslan de una fracción soluble en agua de un extracto preparado a partir de un tejido, tal como el cordón umbilical o la membrana amniótica. En algunas realizaciones, la fracción soluble en agua se extrae con una solución salina isotónica. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 se aíslan de una fracción insoluble en agua de un extracto preparado a partir de un tejido, tal como cordón umbilical o membrana amniótica. En algunas realizaciones, la fracción insoluble se extrae con GnHCl.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido in vitro, (a) poner en contacto (i) hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) inmovilizado en un soporte sólido, y (ii) proteína pentraxina 3 (PTX3), para formar un complejo inmovilizado de PTX3 y HMW HA (PTX3/HA inmovilizado); y (b) poner en contacto la PTX3/HA inmovilizada con una proteína inter-ainhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y el gen 6 estimulado con el factor de necrosis tumoral a (TSG-6) para formar un complejo rcHC-HA/PTX3 inmobilizado. En algunas realizaciones, las etapas (a) y (b) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones del método, el método comprende poner en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con una proteína pentraxina 3 (PTX3), proteína inter-ainhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y el gen 6 estimulado con el factor de necrosis tumoral a (TSG-6) simultáneamente. En algunas realizaciones del método, TSG-6 cataliza el enlace covalente de HC1 de IaIa HA. En algunas realizaciones, el método comprende además eliminar la proteína PTX3 no unida después de la etapa (a) y antes de realizar la etapa (b). En algunas realizaciones, el método comprende además eliminar el TSG-6 no unido después de la etapa (b). En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína PTX3 nativa aislada de una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de la SEQ ID NOS: 32-45 o una variante de especie o variante alélica de la misma. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína multimérica. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es un homomultímero (es decir, una proteína multimérica que coniste en dos o más componentes idénticos). En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero u octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un octámero. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 comprende un dominio de multimerización modificado o un dominio de multimerización heterogéneo. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 utilizada en los métodos es una proteína TSG-6 nativa aislada de una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 utilizada en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de la SEQ ID NOS: 1-31 o una variante de especie o variante alélica de la misma. En algunas realizaciones, la HC1 usado en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, la proteína inter-a-inhibidora (IaI) utilizada en los métodos como fuente de HC1 también comprende HC2 y bikunina enlazados por una cadena de sulfato de condroitina. En algunas realizaciones, la HC1 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 46-47 o una variante de especie o variante alélica de la misma. En algunas realizaciones, HC2 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la HC2 usado en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 48-49 o una variante de especie o variante alélica de la misma. En algunas realizaciones, la bikunina comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, la bikunina utilizada en los métodos comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de la SEQ ID NOS: 52­ 53 o una variante de especie o variante alélica de la misma. En algunas realizaciones, la proteína IaI utilizada en los métodos se aísla de sangre, suero, plasma, membrana amniótica, membrana coriónica, líquido amniótico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína IaI utilizada en los métodos se aísla del suero. En algunas realizaciones, la proteína IaI utilizada en los métodos se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, la proteína IaI utilizada en los métodos es producida por una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, las proteínas IaI y TSG-6 se ponen en contacto en una relación molar de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, o 20:1. En algunas realizaciones, la proteína IaI y TSG-6 se ponen en contacto en una relación molar de 3:1. En algunas realizaciones del método, el peso molecular promedio en peso de1HMW HA está entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa, entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa, entre aproximadamente 1100 kDa y aproximadamente 5,000 kDa, o entre aproximadamente 1400 kDa y aproximadamente 3,500 kDa. En algunas realizaciones del método, el peso molecular promedio en peso del HMW Ha es de 3,000 kDa. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante enlace directo a un soporte sólido. En algunas realizaciones del método, HMW HA se inmoviliza mediante enlace indirecto a un soporte sólido. En algunas realizaciones del método, HMW HA se inmoviliza mediante unión covalente al soporte sólido. En algunas realizaciones del método, HMW HA se inmoviliza mediante unión no covalente al soporte sólido. En algunas realizaciones del método, HMW HA se inmoviliza mediante enlace a un soporte sólido mediante un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador escindible química o enzimáticamente. En algunas realizaciones, el método comprende además la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del soporte sólido después de la etapa (b). En algunas realizaciones, la disociación comprende la escisión de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, el método comprende además la purificación del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado. En algunas realizaciones, la purificación comprende purificación por afinidad, centrifugación, filtración, cromatografía o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones del método, los polipéptidos PTX3, IaI HCl o TSG-6 comprenden una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona de entre una etiqueta de hemaglutinina, una etiqueta de poli-histidina, una etiqueta myc, una etiqueta FLAG, una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST). En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza uniendo HMW HA a un polipéptido intermediario. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario se une covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, la unión de HMW hA al polipéptido intermediario no es covalente. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es una proteína de unión a HA (HABP). En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es un HABP seleccionado de entre HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1, estabilina-2 o una porción de los mismos suficiente para unir HA. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es versicano. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1 o estabilina-2. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de versicano. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un polipéptido establecido en cualquiera de las SEQ ID NOS: 54-99. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un enlazador polipeptídico. En algunas realizaciones, el enlazador está unido al soporte sólido. En algunas realizaciones, el método comprende además la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del polipéptido intermediario después de la etapa (b). En algunas realizaciones, la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del polipéptido intermediario comprende poner en contacto el complejo con un agente de disociación. En algunas realizaciones, el agente de disociación es clorhidrato de guanidina o urea. En algunas realizaciones, el agente de disociación es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M de clorhidrato de guanidina. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario o enlazador comprende una secuencia de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 comprende escindir el polipéptido intermediario o enlazador en la secuencia de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, la escisión comprende poner en contacto la secuencia de escisión proteolítica con una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de entre furina, proteasa 3C, caspasa, metaloproteinasa de matriz y proteasa TEV.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido in vitro, que comprenden poner en contacto un complejo de PTX3/HA inmovilizado en un soporte sólido con una proteína inter-a- inhibidor (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y TSG-6. En algunas realizaciones, el complejo PTX3/HA se produce poniendo en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con una proteína pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones efectivas para formar un complejo de PTX3 y HMW HA (PTX3/HA), en el que el HMW HA está inmovilizado en un soporte sólido. En algunas realizaciones, el método comprende además eliminar la proteína PTX3 no unida antes de poner en contacto el complejo PTX3/HA con IaI y TSG-6. En algunas realizaciones, el método comprende además eliminar el TSG-6 no unido. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína multimérica. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es un homomultímero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un octámero. En algunas realizaciones, PTX3 comprende un dominio de multimerización modificado o un dominio de multimerización heterogéneo. En algunas realizaciones, TSG-6 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, TSG-6 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, HC1 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, la proteína IaI también comprende HC2. En algunas realizaciones, HC2 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la proteína IaI también comprende bikunina. En algunas realizaciones, la bikunina comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, IaI también comprende una cadena de sulfato de condroitina. En algunas realizaciones, la proteína IaI es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína IaI se aísla de sangre, plasma, suero, membrana amniótica, membrana coriónica, líquido amniótico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína IaI se aísla del suero. En algunas realizaciones, la proteína IaI se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, la proteína IaI y TSG-6 se ponen en contacto en una relación molar de 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1 o 20:1. Las proteínas IaI y TSG-6 se ponen en contacto en una relación molar de 3:1. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del HMW HA está entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa, entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa, entre aproximadamente 1100 kDa y aproximadamente 5,000 kDa, o entre aproximadamente 1400 kDa y aproximadamente 3500 kDa. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del HMW HA es de 3,000 kDa. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante enlace directo a un soporte sólido. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante enlace indirecto a un soporte sólido. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante unión covalente al soporte sólido. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante unión no covalente al soporte sólido. En algunas realizaciones, el método comprende además la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del soporte sólido. En algunas realizaciones, el método comprende además la purificación del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado. En algunas realizaciones, la purificación comprende purificación por afinidad, centrifugación, filtración, cromatografía o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, los polipéptidos PTX3, HC1 de IaIo TSG-6 comprenden una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona de entre una etiqueta de hemaglutinina, una etiqueta de poli-histidina, una etiqueta myc, una etiqueta FLAG, una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST). En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza uniendo HMW HA a un polipéptido intermediario. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario se une covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, la unión de HMW hA al polipéptido intermediario no es covalente. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es una proteína de unión a HA (HABP). En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es un HABP seleccionado de entre HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1, estabilina-2 o una porción de los mismos suficiente para unir HA. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es versicano. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1 o estabilina-2. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de versican. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un polipéptido establecido en cualquiera de las SEQ ID NOS: 54-99. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un enlazador polipeptídico. En algunas realizaciones, el enlazador está unido al soporte sólido. En algunas realizaciones, el método comprende además la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del polipéptido intermediario. En algunas realizaciones, la disociación del complejo rcHC-HA/PTX3 del polipéptido intermediario comprende poner en contacto el complejo con un agente de disociación. En algunas realizaciones, el agente de disociación es clorhidrato de guanidina o urea. En algunas realizaciones, el agente de disociación es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M de clorhidrato de guanidina. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario o enlazador comprende una secuencia de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, la disociación comprende escindir el polipéptido intermediario o enlazador en la secuencia de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, la escisión comprende poner en contacto la secuencia de escisión proteolítica con una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona de entre furina, proteasa 3C, caspasa, metaloproteinasa de matriz y proteasa TEV.
Se describen en el presente documento, en ciertas realizaciones, complejos de HC-HA (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos producidos mediante cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento para generar complejos rcHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI, en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 promueven la polarización M2 de un macrófago. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos nativos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI, en los que los complejos nHC-HA/PTX3 promueven la polarización M2 de un macrófago. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inducir la polarización M2 de macrófagos que comprenden poner en contacto un macrófago con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 reducen la expresión de IL-12p40 en macrófagos estimulados con LPS, en donde el nivel de IL-12p40 expresado por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con el nivel de macrófagos espresados por IL-12p40 o estimulados con LPS en ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-12p40. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-12p40.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos nativos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en donde los complejos nHC-HA/PTX3 reducen la expresión de IL-12p40 en macrófagos estimulados con LPS, donde el nivel de IL-12p40 expresado por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con el nivel de IL-12p40 expresado por macrófagos estimulados con LPS en ausencia de los complejos nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-12p40. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-12p40.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para reducir el nivel de IL-12p40 expresado por macrófagos estimulados con LPS que comprenden poner en contacto unos macrófagos estimulados con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-12p40. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-12p40.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 reducen la expresión de proteína IL-12p70 en macrófagos estimulados con LPS, en donde la cantidad de proteína IL-12p70 expresada por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con la cantidad de proteína IL-12p70 expresada por macrófagos estimulados con LPS en ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos nativos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos nHC-HA/PTX3 reducen la expresión de proteína IL-12p70 en macrófagos estimulados con LPS, en la que la cantidad de proteína IL-12p70 expresada por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS entran en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con la cantidad de proteína IL-12p70. expresado por macrófagos estimulados con LPS en ausencia de los complejos nHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para reducir el nivel de proteína IL-12p70 expresada por macrófagos estimulados con LPS que comprenden poner en contacto macrófagos estimulados con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 reducen la expresión de IL-23 en macrófagos estimulados con LPS, en donde el nivel de IL-23 expresado por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con el nivel de IL-23 expresado por macrófagos estimulados con LPS en ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-23. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-23.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos de HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) nativos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos reducen la expresión de IL-23 en macrófagos estimulados con LPS, en los que el nivel de IL-23 expresado por macrófagos estimulados con LPS es menor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con el nivel de IL-23 expresado por macrófagos estimulados con LPS en el ausencia del complejo nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-23. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-23.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para reducir el nivel de IL-23 expresado por macrófagos estimulados con LPS que comprenden poner en contacto macrófagos estimulados con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de ARNm de IL-23. En algunas realizaciones, se reduce el nivel de proteína IL-23.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 e IaI HCl, en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 aumentan la expresión de IL-10 en macrófagos estimulados con LPS, en donde el nivel de IL-10 expresado por macrófagos estimulados con LPS es mayor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con el nivel de IL-10 expresado por macrófagos estimulados con LPS en ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de ARNm de IL-10. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de proteína IL-10.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PtX3 e IaI HCl, en los que los complejos aumentan la expresión de IL-10 en macrófagos estimulados con LPS/IFNy, en los que la cantidad de IL-10 expresada por macrófagos estimulados con LPS/IFNy es mayor cuando los macrófagos estimulados con LPS se ponen en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con la cantidad de IL-10 expresada por macrófagos estimulados con LPS/IFNy en ausencia de los complejos nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de ARNm de IL-10. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de proteína IL-10.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para aumentar el nivel de IL-10 expresado por macrófagos estimulados con LPS que comprenden poner en contacto macrófagos estimulados con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de ARNm de IL-10. En algunas realizaciones, aumenta el nivel de proteína IL-10.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI, en los que los complejos rcHC -HA/PTX3 promueven la apoptosis de neutrófilos estimulados con LPS, pero no promueven la apoptosis en los neutrófilos en reposo. En algunas realizaciones, un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido, que comprende hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI, promueve la apoptosis de neutrófilos estimulados con LPS en los que el número de neutrófilos estimulados con LPS que son apoptóticos en una muestra de neutrófilos estimulados con LPS es mayor cuando la muestra se pone en contacto con el complejo rcHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos estimulados con LPS que son apoptóticos en la muestra en ausencia del complejo rcHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen el complejo nativo HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprende hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , en el que los complejos nHC-HA/PTX3 promueven la apoptosis de neutrófilos estimulados con LPS pero no promueven la apoptosis en los neutrófilos en reposo. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3, que comprende hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , promueve la apoptosis de neutrófilos estimulados con LPS en la que el número de neutrófilos estimulados con LPS que son apoptóticos en una muestra de los neutrófilos estimulados con LPS son más altos cuando la muestra se pone en contacto con el complejo nHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos estimulados con lPs que son apoptóticos en la muestra en ausencia del complejo nHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inducir la apoptosis de neutrófilos estimulados con LPS que comprenden poner en contacto un neutrófilo estimulado con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 promueven la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos, en los que el número de neutrófilos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos estimulados con lPs en una muestra de neutrófilos apoptóticos y macrófagos estimulados con LPS es mayor cuando la muestra se pone en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos que son fagocitados por macrófagos estimulados con LPS en la muestra en ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HCl de IaI, en los que los complejos promueven la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos, en los que el número de neutrófilos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos en reposo en una muestra de neutrófilos apoptóticos y macrófagos en reposo es mayor cuando la muestra se pone en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos que son fagocitados por macrófagos en reposo en la muestra en el ausencia de los complejos rcHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos nativos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos nHC-HA/PTX3 promueven la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos, en donde el número de neutrófilos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos estimulados con lPs en una muestra de neutrófilos apoptóticos y macrófagos estimulados con LPS es mayor cuando la muestra entra en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos que son fagocitado por macrófagos estimulados con LPS en la muestra en ausencia de los complejos nHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos nativos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos nHC-HA/PTX3 promueven la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos, en los que el número de neutrófilos apoptóticos que son fagocitados por macrófagos en reposo en una muestra de neutrófilos apoptóticos y macrófagos estimulados con LPS es mayor cuando la muestra se pone en contacto con los complejos nHC-HA/PTX3 en comparación con el número de neutrófilos que son fagocitados por macrófagos en reposo en la muestra en ausencia de los complejos nHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos que inducen la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos que comprenden poner en contacto una muestra que contiene neutrófilos apoptóticos y macrófagos en reposo o estimulados con LPS con un complejo rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 aislado.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos que comprenden hialuronano de alto peso molecular (HMW hA), PTX3 y HC1 de IaI , en los que los complejos rcHC-HA/PTX3 promueven la unión de macrófagos estimulados con LPS al menos al mismo nivel que un complejo nativo HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) aislado de cordón umbilical humano, membrana amniótica humana o una combinación de complejos nHC-HA/PTX3 de ambos cordones umbilicales humanos y membrana amniótica humana, en la que la unión comprende los macrófagos estimulados con LPS en contacto con los complejos rcHC-HA/PTX3 o nHC-HA/PTX3 inmovilizados en un soporte sólido. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTx3 se aísla del cordón umbilical humano. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica humana. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 se aísla de una combinación de complejos nHC-HA/PTX3 tanto del cordón umbilical humano como de la membrana amniótica humana.
En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del HMW HA del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 está entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa, entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa, entre aproximadamente 1100 kDa y aproximadamente 5,000 kDa, o entre aproximadamente 1400 kDa y aproximadamente 3,500 kDa. En algunas realizaciones, contiene, el peso molecular promedio en peso del HMW HA del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es de aproximadamente 3,000 kDa. En algunas realizaciones, la HC1 del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 está unido covalentemente a HA. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 del complejo rcHC-HA/PTX3 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, PTX3 del complejo rcHC-HA/PTX3 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína multimérica. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es un homomultímero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero u octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un trímero, tetrámero u octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un octámero. En algunas realizaciones, el IaI HCl del complejo rcHC-HA/PTX3 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, la HC1 de IaIdel complejo rcHC-HA/PTX3 es una proteína recombinante.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 comprende TSG-6. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, los polipéptidos PTX3, HC1 de IaIo TSG-6 del complejo rcHC-HA/PTX3 comprenden una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad se selecciona de entre una etiqueta de hemaglutinina, una etiqueta de poli-histidina, una etiqueta myc, una etiqueta FLAG, una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST).
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de solución, suspensión, polvo, pomada, tableta, cápsula o aerosol. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de un sólido, un gel entrecruzado o un liposoma. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de hidrogel de hialuronano entrecruzado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un polímero natural. En algunas realizaciones, el polímero natural comprende fibronectina, colágeno, laminina, queratina, fibrina, fibrinógeno, ácido hialurónico, heparán sulfato, sulfato de condroitina o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente antiinflamatorio, un agente anti-cicatrices, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un agente citotóxico, un agente antimicrobiano o una combinación de los mismos.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para la producción de un medicamento.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe una combinación que comprende: (a) un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento; y (b) un agente antiinflamatorio, un agente anti-cicatrices, un agente antineoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un agente citotóxico, un agente antimicrobiano o una combinación de los mismos.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento, que comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/pTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir o revertir la formación de cicatrices o fibrosis en un tejido, que comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el tejido con una cantidad eficaz del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la cicatriz es una cicatriz de dermatitis, una cicatriz queloide, una cicatriz por contractura, una cicatriz hipertrófica o una cicatriz resultante del acné. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para reducir o prevenir la cicatrización. En algunas realizaciones, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados en este documento reduce o previene la formación de cicatrices o fibrosis disminuyendo o inhibiendo la señalización de TGF-p en el tejido.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir o reducir la inflamación en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionado en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto tejidos inflamados con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la inflamación es una inflamación aguda o una inflamación crónica. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio mediado por macrófagos, un trastorno inmunitario mediado por Th-17 o un trastorno inflamatorio mediado por células T. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno autoinmunitario, una alergia, un defecto leucocitario, una infección, una enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de tejido o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es artritis reumatoide. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del ojo. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es conjuntivitis, queratitis, blefaritis, blefaroconjuntivitis, escleritis, epiescleritis, uveítis, retinitis o coroiditis. En algunas realizaciones, la inflamación aguda está causada por infarto de miocardio, apoplejía, choque por endotoxina o sepsis. En algunas realizaciones, el sujeto tiene aterosclerosis. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene inflamación de un tumor sólido. En algunas realizaciones, al sujeto se le administra el complejo nHC-HA/pTX3 o rcHC-HA/PTX3 en combinación con un agente antiinflamatorio adicional. En algunas realizaciones, el agente antiinflamatorio adicional se selecciona de entre un anticuerpo anti-TGF-p, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-TGF-p, un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-TNF, un anticuerpo anti-IL1p, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL1p, un anticuerpo anti-IL-2, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-2, un anticuerpo anti-IL-6, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-6, un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-12, un anticuerpo anti-IL-17, un anticuerpo que bloquea el receptor anti-IL-17, un anticuerpo anti-IL-23 o un anticuerpo que bloquea el receptor anti-IL-23. En algunas realizaciones, el interferón de tipo 1 es IFN-a o IFN-p. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para reducir o prevenir la inflamación.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para tratar una herida o úlcera cutánea en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido por los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto la herida o úlcera cutánea con una cantidad eficaz del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para tratar una herida o úlcera cutánea. En algunas realizaciones, la herida o úlcera cutánea es una úlcera que no cicatriza.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para promover o inducir la formación ósea en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz del complejo rcHC-HA/PTX3 o del complejo nHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento. o producido por los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el sujeto tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para promover o inducir la formación de hueso en un sujeto.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir o reducir la angiogénesis anormal en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por el métodos proporcionados aquí. En algunas realizaciones, el sujeto tiene degeneración macular húmeda relacionada con la edad (wARMD) o retinopatía proliferativa diabética. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor sólido. En algunas realizaciones, al sujeto se le administra el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en combinación con una terapia contra el cáncer. En algunas realizaciones, la terapia contra el cáncer comprende la administración de un agente antineoplásico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente quimioterapéutico o radioterapia. En algunas realizaciones, la terapia contra el cáncer se administra de forma secuencial, concurrente o intermitente con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para reducir o prevenir la angiogénesis.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir el rechazo de un trasplante en un receptor de trasplante, que comprenden administrar al receptor del trasplante una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido mediante los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el trasplante con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administra antes de un procedimiento de trasplante, después de un procedimiento de trasplante o durante un procedimiento de trasplante. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administra en combinación con un agente inmunosupresor. Se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones, un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para prevenir el rechazo de un trasplante en un receptor de trasplante. En algunas realizaciones, el trasplante es un trasplante de córnea.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inducir la expansión de células madre en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionado en este documento. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto la célula madre con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. Se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones, un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para inducir la expansión de células madre. En algunas realizaciones, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados en este documento induce la expansión de células madre por supresión de la señalización de TGF-p y/o sobrerregulación de las rutas de señalización de BMP. En algunas realizaciones, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados en este documento induce la expansión de células madre reprogramando células diferenciadas en células madre (o células progenitoras inducidas, iPSC).
Se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones, un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para terapia celular.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de terapia celular en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados aquí en combinación con una célula terapéutica. En algunas realizaciones, la célula terapéutica y el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administran localmente a un tejido dañado. En algunas realizaciones, la célula terapéutica y el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administran sistémicamente. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula madre. En algunas realizaciones, la terapéutica es una célula madre. En algunas realizaciones, la terapia celular comprende la administración de una célula madre. En algunas realizaciones, la célula madre es una célula madre mesenquimatosa. En algunas realizaciones, las células madre son células madre progenitoras inducidas. En algunas realizaciones, la terapia celular comprende la administración de células diferenciadas. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula productora de insulina. En algunas realizaciones, la célula productora de insulina es una célula de islote. En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 1.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de terapia celular en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido por el métodos proporcionados en el presente documento en combinación con una célula contenida en un dispositivo de administración de células. En algunas realizaciones, la célula está contenida en una microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a la microcápsula. En algunas realizaciones, la microcápsula se administra localmente a un tejido dañado. En algunas realizaciones, la célula terapéutica y el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administran sistémicamente. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula madre. En algunas realizaciones, la terapéutica es una célula madre. En algunas realizaciones, la terapia celular comprende la administración de una célula madre. En algunas realizaciones, la célula madre es una célula madre mesenquimatosa. En algunas realizaciones, las células madre son células madre progenitoras inducidas. En algunas realizaciones, la terapia celular comprende la administración de células diferenciadas. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula productora de insulina. En algunas realizaciones, la célula productora de insulina es una célula de islote. En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 1.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir o reducir el dolor en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionado en el presente documento, en el que el dolor es causado por quemaduras químicas, queratitis bacteriana grave, síndrome de Stevens-Johnson, necrólisis epidérmica tóxica, irradiación de tumores oculares. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para reducir el dolor en un sujeto, en el que el dolor es causado por quemaduras químicas, queratitis bacteriana grave, síndrome de Stevens-Johnson, necrólisis epidérmica tóxica, irradiación de tumores oculares.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inducir o promover la regeneración tisular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido por el métodos proporcionados aquí. En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto el tejido dañado del sujeto con una cantidad eficaz del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el tejido es hueso o encía, tejido corneal o tejido conjuntival. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administra en combinación con una célula terapéutica, una pluralidad de células terapéuticas o un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, el trasplante de tejido es un aloinjerto o un autoinjerto. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administra en combinación con una terapia basada en tejidos. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para inducir o promover la regeneración de tejido en un sujeto.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para tratar la fibrosis en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido mediante los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el tratamiento inhibe o previene la formación de cicatrices. Se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones, un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para tratar la fibrosis en un sujeto.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para tratar la obesidad o la resistencia a la insulina en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido por el métodos proporcionados aquí. En algunas realizaciones, el tratamiento inhibe o disminuye la cantidad de macrófagos del tejido adiposo M1 en el sujeto. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inhibir o disminuir la cantidad de macrófagos del tejido adiposo M1 en un sujeto que lo necesita, administrando al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido por los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado obesidad o resistencia a la insulina. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para tratar la obesidad o la resistencia a la insulina en un sujeto.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para tratar la conjuntivocalasia en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto la conjuntiva del sujeto con una cantidad eficaz del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento para tratar la conjuntivocalasia en un sujeto.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen cultivos celulares que comprenden un sustrato adecuado para cultivar una célula y un complejo rcHA/PTX3 o el complejo nHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el complejo rcHA/PTX3 o el complejo nHC-HA/PTX3 inmovilizado en el sustrato.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento, en los que al sujeto se le administra una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento en combinación con un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona de un interferón, un agente de necrosis antitumoral, un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1), un antagonista del receptor de interleucina-2 (IL-2), un antagonista del receptor de interleucina-6 (IL-6), un antagonista del receptor de interleucina-12 (IL-12), un antagonista del receptor de interleucina-17 (IL-17), un antagonista del receptor de interleucina-23 (IL-23), un agente citotóxico, un agente antimicrobiano, una interleucina, un agente inmunomodulador, un antibiótico, un bloqueador coestimulador de células T, un agente antirreumático modificador del trastorno, un agente inmunosupresor, un anticuerpo anti-linfocito, un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico, un antimetabolito, un inhibidor de Akt, un inhibidor de IGF-1, un antagonista de la angiotensina II, un inhibidor de la ciclooxigenasa, un inhibidor de la heparanasa, un inhibidor de linfocinas, un inhibidor de citoquinas, un inhibidor de IKK, un inhibidor de P38MAPK, un inhibidor de la vía antiapoptótica, un agonista de la vía apoptótica, un agonista de PPAR, inhibidor de Ras, un inhibidor de la telomerasa, una inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la metaloproteinasa, un inhibidor de la aminopeptidasa, activador SHIP y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano es un agente antivírico, antibacteriano o antifúngico.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento, en los que al sujeto se le administra una cantidad eficaz de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento y el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento, en los que el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a una superficie sólida. En algunas realizaciones, la superficie sólida es una superficie o una parte de la misma de una nanopartícula, una perla, una microcápsula o un dispositivo médico implantable.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen dispositivos médicos que comprenden un sustrato recubierto con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el sustrato comprende al menos uno de una cánula, una articulación, un tornillo, una varilla, un pasador, una placa, una grapa, una derivación, una abrazadera, un clip, una sutura, un ancla de sutura, un electrodo, un catéter, un cable, un injerto, un apósito, un marcapasos, una carcasa de marcapasos, un cardioversor, una carcasa de cardioversor, un desfibrilador, una carcasa de desfibrilador, una prótesis, un tubo de drenaje del oído, un implante oftálmico, un dispositivo ortopédico, un disco vertebral, un sustituto óseo, un dispositivo anastomótico, una envoltura perivascular, un dispositivo de fijación de bolsa de colostomía, una barrera hemostática, un implante vascular, un soporte vascular, un adhesivo tisular, un sellador tisular, un andamio tisular y un dispositivo intraluminal.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un dispositivo que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento inmovilizado sobre una superficie. En algunas realizaciones, la superficie es una superficie de poliestireno, polietileno, sílica, metálica o polimérica. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a una microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a una nanopartícula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a una perla, un chip, un portaobjetos de vidrio o un filtro. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a una lente de contacto. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une a un implante o prótesis quirúrgica. En algunas realizaciones, el implante o prótesis es una articulación artificial, un implante óseo, una sutura o una cánula. En algunas realizaciones, la articulación artificial es una articulación de cadera artificial, una rodilla artificial, una articulación glenohumeral artificial o una rodilla artificial. En algunas realizaciones, la cánula es una cánula coronaria, una cánula ureteral, una cánula uretral, una cánula prostática, una cánula esofágica o una cánula ósea.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen dispositivos médicos que comprenden: una estructura adaptada para su implantación en un paciente, en la que se une una superficie o una parte de una superficie de la estructura que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido por los métodos proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, la unión comprende la unión covalente o no covalente del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 a la superficie o parte de una superficie de la estructura En algunas realizaciones, la unión comprende recubrir la superficie o una parte de una superficie de la estructura con una composición que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la estructura es una cánula vascular, una articulación artificial, una sutura o una microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe la formación de una biopelícula bacteriana. En algunas realizaciones, la microcápsula contiene una célula terapéutica. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula madre.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para modular la actividad de los macrófagos que comprenden poner en contacto un macrófago con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento o producido mediante los métodos proporcionados en este documento en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la expresión. de IL-12 o IL-23, pero también promueven la expresión de IL-10 en macrófagos polarizadores del fenotipo M1 al M2. En algunas realizaciones, el macrófago se ha estimulado con un mediador proinflamatorio. En algunas realizaciones, el mediador proinflamatorio es lipopolisacárido (LPS), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), interferón-gamma (IFN y) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con el macrófago in vivo en un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, el método se realiza in vitro. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento que comprenden la administración de macrófagos que han sido modulados por el método para modular la actividad de los macrófagos proporcionado en el presente documento.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un kit que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento o producido mediante los métodos proporcionados en el presente documento, un dispositivo para la administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para la administración.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe una combinación o mezcla que comprende: (a) un complejo de PTX3 preunido a HMW HA (PTX3/HA); (b) una proteína inter-a-inhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HCl); y (c) TSG-6.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe una combinación o una mezcla que comprende: (a) un complejo de TSG-6 preunido a HC-HA; y (b) PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido in vitro, que comprenden: (a) poner en contacto (i) hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) inmovilizado en un soporte sólido, (ii) una proteína inter-a-inhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HCl) y (iii) TSG-6 para formar un complejo rcHC-HA preunido a TSG-6; y (b) poner en contacto el complejo rcHC-HA preunido a TSG-6 con una proteína pentraxina 3 (PTX3) para formar un complejo rcHC-HA/PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido in vitro, que comprenden poner en contacto (i) hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) inmovilizado en un soporte sólido, (ii) proteína pentraxina 3 (PTX3), (iii) proteína inter-a-inhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y (iv) gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral a (TSG-6) para formar un complejo rcHC-HA/PTX3 inmovilizado.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un complejo que comprende HA inmovilizado unido a PTX3.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para producir un complejo que comprende HA inmovilizado unido a PTX3 in vitro, que comprende poner en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con una proteína PTX3 bajo condiciones eficaces para formar un complejo de PTX3 y HMW HA (PTX3/HA), en el que el h Mw HA está inmovilizado en un soporte sólido. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 es una proteína PTX3 nativa aislada de una célula. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula es una célula de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula es una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína multimérica. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es un homomultímero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un trímero, tetrámero u octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un octámero. En algunas realizaciones, la PTX3 comprende un dominio de multimerización modificado o un dominio de multimerización heterogéneo. En algunas realizaciones, el HMW HA inmovilizador comprende una unión no covalente al soporte sólido. En algunas realizaciones, el HMW HA inmovilizador comprende unir HMW HA a un polipéptido intermediario. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario se une covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, la unión de HMW hA al polipéptido intermediario no es covalente. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es una proteína de unión a HA (HABP). En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es una HABP seleccionada de entre HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1, estabilina-2 o una porción de los mismos suficiente para unir HA. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario es versicano. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, CD44, estabilina-1 o estabilina-2. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un módulo de enlace de versicano. En algunas realizaciones, el polipéptido intermediario comprende un polipéptido establecido en cualquiera de las SEQ ID NOS: 54-99. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se encuentra un complejo PTX3/HA producido mediante el método anterior. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se encuentra una composición farmacéutica que comprende el complejo PTX3/HA producido mediante el método anterior. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describe un uso del complejo PTX3/HA para la producción de un medicamento. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos de tratamiento que comprenden la administración del complejo PTX3/HA para la prevención o inhibición de cicatrices, inflamación, angiogénesis, cáncer, diabetes, obesidad o fibrosis.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para inducir o mantener la pluripotencia en una célula, que comprenden cultivar la célula con un complejo nHC-HA/PTX3 o un complejo rcHC-HA/PTX3, induciendo o manteniendo así la pluripotencia en una célula. En algunas realizaciones, la célula expresa de forma heterogénea una proteína seleccionada de entre Sox2, myc, Oct4 y KLF4. En algunas realizaciones, la célula expresa de forma heterogénea una, dos o tres proteínas seleccionadas de entre Sox2, myc, Oct4 y KLF4. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o el complejo rcHC-HA/PTX3 está inmovilizado. En algunas realizaciones, la célula es una célula adulta diferenciada. En algunas realizaciones, la célula es un fibroblasto. En algunas realizaciones, la célula es un fibroblasto corneal humano. En algunas realizaciones, la célula es una célula madre embrionaria, una célula madre adulta, una célula madre fetal o una célula madre pluripotente inducida. En algunas realizaciones, la célula es una célula progenitora epitelial del limbo, una célula de nicho del estroma limbal, una célula madre del cordón umbilical, una célula madre de la membrana amniótica o una célula madre adiposa. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 es un complejo nHC-HA/PTX3 de membrana amniótica. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 es un complejo nHC-HA/PTX3 de cordón umbilical. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de membrana amniótica. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de membrana amniótica preparado en un regulador de PBS para producir un extracto de nHC-HA/PTX3 (es decir, soluble en nHC-HA/PTX3). En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de membrana amniótica preparado en un regulador de GnHCl para producir un extracto de nHC-HA/PTX3 (es decir, soluble en nHC-HA/PTX3). En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de cordón umbilical. En algunas realizaciones, el extracto de cordón umbilical comprende membrana amniótica de cordón umbilical, estroma de cordón umbilical, gelatina de Wharton o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de cordón umbilical preparado en un regulador de PBS para producir un extracto de nHC-HA/PTX3 (es decir, soluble en nHC-HA/PTX3). En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar el complejo nHC-HA/PTX3 realizando ultracentrifugación en un extracto de cordón umbilical preparado en un regulador de GnHCl para producir un extracto de nHC-HA/PTX3 (es decir, soluble en nHC-HA/PTX3). En algunas realizaciones, los métodos comprenden además realizar dos, tres o cuatro rondas de ultracentifugación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además realizar cuatro rondas de ultracentifugación. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende PTX3. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende PTX3 y un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre decorina, biglicano, fibromodulina, lumican, PRELP (proteína rica en leucina de extremo rico en arginina prolina), queratocán, osteoadherina, epipycan y osteoglicina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina está unido covalentemente a un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, el glicosaminoglicano es queratán sulfato.
Debe entenderse que la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y se refieren a la invención solo en la medida en que divulguen cualquier materia objeto reivindicada.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 ejemplifica la purificación de complejos de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativos a partir del extracto de membrana amniótica (AME) y el análisis de la composición de proteínas y el tamaño de HA. (A-B) Concentraciones de proteína total y HA en fracciones obtenidas por ultracentifugación con CsCl/guanidina HC1 4 M. (C) HA teñido con tinte Stains-all en gel de agarosa al 0.5%. (D-J) Análisis de proteínas presentes en nHC-HA/PTX3 mediante transferencia Western utilizando anticuerpos contra HC1 (D y F), PTX3 (E y G), HC2 (H), HC3 (I), bikunina (J), TSG- 6 (K) o TSP-1 (L). NaOH o N= Tratamiento con NaOH 0.05 N a 25°C durante 1 h. HAasa o H = Tratamiento con 20 unidades/ml HAasa a 60°C durante 2 h (F-K). Gráfico de barras de la cantidad relativa de proteína (M) determinada por ensayos de puntos usando anticuerpos contra diversos antígenos, incluidos IGFBP 1­ 3, PF4 o TIMP-1.
La FIGURA 2 ejemplifica que los receptores CD44 y TLR4 median la unión de macrófagos estimulados con LPS a nHC-HA/PTX3 inmovilizado. (A) Unión celular. Se sembraron células RAW264.7 (100 pl de 2.5x105 células/ml) en HA inmovilizado (2 pg/pocillo) o nHC-HA/PTX3 (2 pg/pocillo) (n= 3) y se estimularon con LPS (1 pg/ml). Después de la incubación durante 90 min, se eliminaron las células no unidas y las células unidas se contaron mediante el ensayo CyQuant. La barra de escala representa 100 pm. Un asterisco (*) indica valores de p <0.05 (HA o nHC-HA/PTX3 versus control de PBS o nHC-HA/PTX3 versus HA). (B) Viabilidad celular. Se incubaron células RAW264.7 estimuladas con LPS en control de PBS inmovilizado, HA o nHC-HA/PTX3 durante 24 h (n= 3). La viabilidad celular se midió mediante ensayo MTT. No se observaron diferencias significativas (todos los valores de p > 0.05) en la viabilidad celular entre las células de estos sustratos inmovilizados. (C) Los receptores CD44 y TLR4 son responsables de la unión de los macrófagos estimulados con LPS al nHC-HA/PTX3 inmovilizado. Se preincubaron células RAW264.7 (2.5x105/ml) con el anticuerpo bloqueador contra CD44, TLR2, TLR4, integrina av, p1, p2 o p3 o péptidos RGD, junto con los anticuerpos de control de isotipo o un péptido de control de RGD, en hielo durante 30 min (n= 3). Después de añadir LPS (1 pg/ml), las células se incubaron durante 90 min y el ensayo de unión celular se realizó de la misma forma como se describe en A. Un asterisco (*) indica un valor de p <0.05.
La FIGURA 3 ejemplifica la polarización de macrófagos estimulados con LPS hacia el fenotipo M2 por nHC-HA/PTX3 inmovilizado. (A) Expresión relativa de ARNm de marcadores M1 (TNF-a, IL-12p40) o M2 (IL-10, Arg-1, LIGHT y SPHK1) en macrófagos unidos al control de PBS o HA inmovilizado o nHC-HA/PTX3 como es determinado por PCR cuantitativa. (B) Cantidades relativas de proteína TNF-a determinadas por ELISA. (C) transferencia Western (izquierda) y citolocalización (derecha) mediante tinción de inmunofluorescencia de IRF5, que es un marcador M1, en macrófagos unidos al control de PBS o nHC-HA/PTX3 inmovilizado. (D) Apoptosis de neutrófilos en reposo, estimulados con fMLP o LPS después de la incubación con nHC-HA/PTX3 inmovilizado. Un asterisco (*) indica p <0.05. (E) Fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por macrófagos en reposo o estimulados con LPS. Un asterisco (*) indica p <0.05.
La FIGURA 4 ejemplifica el papel de CD44 en el mantenimiento de la polarización del macrófago M2 en nHC-HA/PTX3 inmovilizado. (A) Expresión relativa de ARNm de marcadores de macrófagos M1 (IL-12p40) y M2 (IL-10, LIGHT y SPHK1) después de la unión de macrófagos, preincubados con PBS o anticuerpos bloqueadores contra CD44, TlR4 o CD44/TLR4, a nHC-HA/PTX3 según lo determinado por qPCR. Un asterisco (*) indica p <0.05 en comparación con ningún tratamiento con anticuerpos (ninguno) en el mismo grupo. (B) Cantidades de proteína IL-12 e IL-10 determinadas por ELISA. Un asterisco (*) indica p <0.05 en comparación con ningún tratamiento con anticuerpos (ninguno) en el mismo grupo.
FIGURA 5 nHC-HA/PTX3 (4°) promueve la agregación celular, pero tanto nHC-HA/PTX3 (2°) como nHC-HA/PTX3 (4°) inhiben la producción de proteínas IL-12p40 e IL-23 en macrófagos estimulados con IFN-y/LPS. Se cultivaron células RAW264.7 (2.5x105/ml) sobre sustratos inmovilizados (PBS como control) y se estimularon con IFN-y/LPS durante 4 h (A) o 24 h (B y C). (A) Morfología celular a las 4 h después de la siembra. Alternativamente, las células se estimulan con LPS durante 24 h y las proteínas de IL-10 e IL-12p70 en los sobrenadantes del cultivo celular se midieron mediante ELISA respectivos (B y C). Los valores p se indican en B y C.
La FIGURA 6 ejemplifica el acoplamiento dependiente de la dosis y covalente de HMW HA y nHC-HA/PTX3 a superficies de placas CovaLink™ de 96 pocillos. (A) HA ELISA de HMW HA y nHC-HA/PTX3 unidos después de la eliminación de HMW HA y nHC-HA/PTX3 no unidos. (B) HA ELISA de HA unido y no unido de HMW Ha y nHC-HA/PTX3.
La FIGURA 7 ejemplifica la unión dependiente de la dosis de TSG-6 a HA inmovilizado (iHA) y la resistencia a diversos agentes disociantes y reductores. (A) TSG-6 unido a iHA medido por ELISA de TSG-6. (B) TSG-6 unido a iHA medido por ELISA de Ts G-6 después del tratamiento con guanidina HC1 6 M, guanidina HCl 8 M, SDS al 2%, DTT 100 mM o NaOH 25 mM.
La FIGURA 8 ejemplifica la unión dependiente de la dosis de PTX3 a HA inmovilizado (iHA) y la resistencia a diversos agentes disociantes y reductores. (A) PTX3 unido a iHA medido por ELISA de PTX3. (B) PTX3 unido a iHA medido por PTX3 ELISA después del tratamiento con guanidina HCl 6 M, guanidina HCl 8 M, s Ds al 2%, DTT 100 mM o NaOH 25 mM.
La FIGURA 9 ejemplifica la falta de competencia o sinergia entre TSG-6 y PTX3 para la unión de iHA. La absorbancia relativa medida por ELISA se muestra para TSG-6 o PTX3 unidos para la incubación de cada factor solo con iHA o incubación combinada con iHA. No se encuentra significación estadística entre solo y combinado para la unión de TSG-6 o PTX3 a iHA (p> 0.05).
La FIGURA 10 ejemplifica la inhibición parcial de la unión de PTX3 a iHA unida previamente con TSG-6 y la falta de inhibición de la unión de TSG-6 a iHA unida previamente a PTX3. La figura muestra los resultados del ELISA de TSG-6 y PTX3 de la unión subsecuente de t Sg -6 o PTX3 para TSG-6/iHA preunido (A) o PTX3/iHA (B) preunido. Los valores de P se indican en (A) y no se encontró significación estadística entre los grupos en (B).
La FIGURA 11 ejemplifica la unión de macrófagos RAW264.7 estimulados con LPS a PBS (control), HA (iHA), nHC-HA/PTX3, TSG-6/ íhA o PTX3/iHA. Las células se fotografiaron 24 después de la incubación.
La FIGURA 12 ejemplifica la expresión génica relativa en macrófagos RAW264.7 después de la incubación en PBS (control), HA (íhA), nHC-HA/PTX3, TSG-6/iHA o PTX3/iHA. Se aislaron los ARN totales y se midió la expresión de ARNm de IL-12p40 (A) e IL-10 (D) mediante PCR cuantitativa. Alternativamente, las células se estimularon con LPS (B y E) o IFN-y/LPS (C) durante 24 h, y la expresión de proteínas de IL-12p70 (B), IL-23 (C) e IL-10 (E) en los medios de cultivo celular se midieron usando los respectivos ELISA. Un asterisco (*) indica p <0.05 en comparación con el control.
La FIGURA 13 ejemplifica la eficacia de TSG-6 libre en solución versus TSG-6 unido para transferir HC1 y HC2 de IaI a iHA. (A, B) HCl unido relativo (A) o IaI (B) después de la adición simultánea o secuencial de TSG-6 e IaI a iHA según se determina mediante ELISA respectivo. Un asterisco (*) indica p <0.05 en la misma concentración de TSG-6 cuando se agrega simultánea y secuencialmente. (C) Transferencia Western de muestras de A digeridas con hialuronidasa (HAasa) y analizadas con anticuerpo anti-TSG-6. (D) HCl y PTX3 relativos unidos a iHA después de la incubación simultánea de PTX3 e IaI con iHA según lo determinado por ELISA.
La FIGURA 14 ejemplifica los complejos formados en solución después de la incubación simultánea de IaI y TSG-6 con o sin PTX3. (A-D) Transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (A), HC2 (B), TSG-6 (C) o bikunina (D). HAasa = tratamiento con hialuronidasa. (E) Ilustración de la interacción de TSG-6 con IaI. (F) Ilustración de la inhibición de la formación de HC2^TSG-6 por PTX3. (G) transferencia Western con anticuerpo contra IaI.
La FIGURA 15 ejemplifica los complejos formados en iHA después de la incubación simultánea de IaI y TSG-6 con o sin PTX3. Después de lavados con GnHCl 8 M y PBS, se midieron la HC1, TSG-6 y PTX3 unidos mediante ELISA respectivos (A, D, F). Un asterisco (*) indica p <0.05 en comparación con PTX3 a 1 pg/ml. Los complejos se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M y PBS y los componentes unidos se digirieron con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 h. Las muestras digeridas se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (B), HC2 (C), TSG-6 (E) y PTX3 (G).
La FIGURA 16 ejemplifica los complejos formados en iHA después de la adición secuencial de IaI con TSG-6 seguida de PTX3. El HCl, TSG-6 y PTX3 unidos se midieron mediante ELISA respectivos (A, D, F). Los complejos se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M y PBS y los componentes unidos se digirieron con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 h. Las muestras digeridas se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (B), HC2 (C), TSG-6 (E), PTX3 (G).
La FIGURA 17 ejemplifica los complejos formados en iHA después de la adición secuencial de PTX3 seguida de IaI con TSG-6. La HC1, TSG-6 y PTX3 unidas se midieron mediante ELISA respectivos (A, C, E). Los complejos se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M y PBS y los componentes unidos se digirieron con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 h. Las muestras digeridas se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra PTX3 (B), TSG-6 (D), HC1 (F) y HC2 (G).
La FIGURA 18 ejemplifica la unión de macrófagos RAW264.7 estimulados con LPS a PBS (control), HA (iHA), nHC-HA/PTX3, (IaI/TSG-6/PTX3)/iHA (IaI, TSG-6 o PTX3 está simultáneamente unido a iHA), (IaI/TSG-6)/PTX3/iHA (adición secuencial de PTX3 a iHA preincubado con IaI y TSG-6), o (PTX3)/IaI/TSG-6/iHA (adición secuencial de IaI y TSG-6 a iHA preincubados con pTX3). Las células se fotografiaron 24 después de la incubación.
La FIGURA 19 ejemplifica la expresión génica en macrófagos RAW264.7 cultivados en sustratos inmovilizados y estimulados con LPS. Se aislaron los ARN totales y se midió la expresión de ARNm de IL-10 e IL-12p40 mediante PCR cuantitativa (A y C). Las proteínas IL-10 e IL-12p70 en los sobrenadantes del cultivo celular se midieron mediante los respectivos ELISA (B y D). (E) Proteínas IL-23 en los sobrenadantes de cultivos celulares de células RAW264.7 en reposo (ninguna) o con estimulación de IFN-y (200 unidades/ml), LPS (1 pg/ml), IFN-y/LPS, LPS con inmunocomplejo (LPS/IC) o IL-4 (10 ng/ml) durante 24 h según lo medido por ELiSa de iL-23. (F) IL-23 en los sobrenadantes de cultivo celular de células RAW264.7 cultivadas sobre sustratos inmovilizados y estimuladas con IFN-y/LPS durante 24 h según se mide mediante ELISA de IL-23. Un asterisco (*) indica p <0.05.
La FIGURA 20 ejemplifica la inmunotinción de HA, PTX3, TSG-6, HC y bikunina en el cordón umbilical humano (A) o la membrana amniótica (B). Se sondaron secciones congeladas de cordón umbilical humano con HABP biotinilado con o sin digestión con HAasa y con anticuerpos contra PTX3 y TSG-6, y anticuerpos específicos de cadena contra componentes IaI y Pal como se indica. Los núcleos se tiñeron por contraste con Hoechst 33342 (azul). Epi, epitelio. La barra representa 100 pm.
La FIGURA 21 ejemplifica una comparación de los niveles de PTX3 en el extracto secuencial de PBS y GnHCl de AM, CH y UC. A, cada carril contiene 2 pg de HA en los carriles 2 y 3 y 20 pg de proteínas totales en los carriles 4­ 11. B, cada carril contiene 40 pg de proteínas totales en los carriles 3-10.
La FIGURA 22 ejemplifica una comparación de HC1, bikunina e lal en extractos secuenciales de PBS y GnHCl de AM, CH y UC. Cada carril contiene 20 pg de proteína total en A y C y 40 pg de proteína total en B y D-F excepto el control positivo.
La FIGURA 23 ejemplifica una comparación de TSG-6 en extracto de AM y UC GnHCl. Cada carril contiene 40 pg de proteínas totales excepto el control TSG-6 positivo.
La FIGURA 24 ejemplifica el análisis de transferencia Western de PTX3 (A), HC1 (B), HC2 (C) y TSG-6 (D) en el complejo 1-4° de AM HC^HA. Cada carril contiene 4 pg de HA excepto el control positivo.
La FIGURA 25 ejemplifica el análisis de transferencia Western de TSP-1 en AME, AM GnHCl y el complejo 1-4° HC-HA. Carriles 3, 4, 10 y 11, cada carril contiene 30 pg de proteínas totales. Carriles 5-8 y 12-15, cada carril contiene 4 pg de HA.
La FIGURA 26 ejemplifica el análisis de transferencia Western de PTX3 (A), HC1 (B), HC2 (C), HC3 (D) y TSG-6 (E) en el 4° complejo UC HC-HA. Cada carril contiene 4 pg de HA excepto el control positivo.
La FIGURA 27 ejemplifica una comparación de HC1 (A) y PTX3 (B) en el 4° complejo HC^HA de PBS y extracto de GnHCl. Cada carril contiene 4 pg de HA excepto el control positivo.
La FIGURA 28 ejemplifica una comparación del 4° complejo HC-HA de PBS y GnHCl en gel de agarosa. Cada carril contiene 15 pg de hA excepto el control de HA positivo.
La FIGURA 29 ejemplifica la tinción con azul de Coomassie para gel SDS-PAGE de GnHC1HC-HA y PBS HC-HA. A. AM PBS y GnHCl HC-HA. B. UC PBS y GnHCl HC-HA. Cada carril contiene 30 pg de HA.
La FIGURA 30 ejemplifica que el queratán sulfato y la osteoadherina estaban presentes en AM GnHC1HC-HA pero no en PBS HC-HA. A. Tinción con azul de Coomassie. Cada carril contiene 30 pg de HA. B y C. transferencia Western para queratán sulfato (B) y osteoadherina (C). Cada carril contiene 4 pg de HA. D, Inmunotinción para sulfato de queratina en AM.
La FIGURA 31 ejemplifica la desglicosilación y el análisis de AM GnHCl HC-HA por SDS-PAGE con tinción con CB (azul de Coomassie) o transferencias Western. A. Tinción con azul de Coomassie. Cada carril contiene 30 pg de HA excepto el carril 6 que contiene 5 |jg de HA. B-H. Transferencia Western para Osteoadherin (B), Decorina (C, D), Biglycan (E, F), Queratán sulfato (G) y PTX3 (H). H: hialuronidasa; C: condroitinasa (Cabc); K: queratinasa (queratán sulfato endo-p-galactosidasa); T: TFMSA (ácido trifluorometanosulfónico). Cada carril contiene 4 jg de HA.
La FIGURA 32 ejemplifica que decorina y biglicano estaban abundantemente presentes en UC GnHC1HC-HA pero no en PBS HC-HA. El queratán sulfato, la osteoadherina y la bikunina también estaban presentes en UC GnHC1HC-HA pero no en PBS HC-HA excepto en el queratán sulfato. A. Tinción con azul de Coomassie. Cada carril contiene 30 jg de HA excepto el carril 6 que contiene 5 jg de HA. B-H. Transferencia Western para Decorin (B), Biglycan (C), Bikunin (D), PTX3 (E), Queratán sulfato (F) y Osteoadherin (G). H: hialuronidasa; C: condroitinasa (Cabc); K: queratinasa (queratán sulfato endo-p-galactosidasa). Cada carril contiene 4 jg de HA.
La FIGURA 33 ejemplifica la inmunolocalización de PTX3 en AM humana. Se sondaron secciones congeladas de membrana fetal humana con anti-PTX3, HABP biotinilado con o sin digestión con HAasa y con anticuerpos específicos de cadena contra componentes IaI. Los núcleos se tiñeron por contraste con Hoechst 33342 (azul). Am , membrana amniótica; Epi, epitelio; CH, corion. Bar, representa 100 jm.
La FIGURA 34 ejemplifica la presencia de PTX3 en el extracto soluble de AM y el complejo HC-HA purificado. PTX3 purificado, extracto de AM (AME) y complejo AM HC-HA se trataron con o sin NaOH 50 mM a 25°C durante 1 h o hialuronidasa (HAase) a 37°C durante 1 h antes de la transferencia Western usando anti-PTX3 (A) y anticuerpos anti-HCl (B) y análisis en electroforesis en gel de agarosa al 0.5% antes de teñir con colorante Stains-all (C). Las especies de PTX3 y su forma multimérica se encontraron en el extracto soluble AM y el complejo HC-HA purificado. M, marcadores de escalera de proteínas.
La FIGURA 35 ejemplifica la expresión de ARNm y proteína de PTX3 por AMEC y AMSCs. El ARN y la proteína se extrajeron de fibroblastos de piel humana (Fib. De Piel) y tanto de AMEC como de AMSCs. Se comparó la expresión de ARNm de PTX3 (A) y proteína en sobrenadantes y lisados celulares (B). Se realizó la transfección de ARNip de PTX3 para verificar la expresión de PTX3 en AMEC y AMSCs (C).
La FIGURA 36 ejemplifica cambios morfológicos de fibroblastos de piel humana (HSF, A), AMSC (B) y AMEC (C) después de la superposición de agarosa. Se cultivaron HSF, AMSC y AMEC bajo condiciones tanto libre de suero como con suero con o sin una superposición de agarosa al 3% durante cinco días y se fotografió la morfología celular. Barra de escala, 50 jm.
La FIGURA 37 ejemplifica que la superposición de agarosa disminuyó la liberación de HA en los medios de cultivo por cultivos de HSF, AMSC y AMEC. La concentración de HA se midió mediante ensayo ELISA en medios de cultivo de HSF, AMSC y AMEC con o sin superposición de agarosa en condiciones tanto que contienen suero como libres de suero.
La FIGURA 38 ejemplifica la inmunolocalización de PTX3, HA y HC1 en cultivos celulares con una superposición de agarosa. HSF, AMSC y AMEC se cultivaron con una superposición de agarosa con o sin tratamiento con TNF y se sometieron a sondas para detectar hialuronano (rojo), PTX3 (verde, A-F; rojo, J-L) y HC1 (verde) (los núcleos son azules). Se encontró colocalización de HCl con HA en todos los cultivos, pero la colocalización de PTX3 con HA o HC1 solo se encontró en AMSC y AMEC. Barra de escala, 50 jm.
La FIGURA 39 ejemplifica el complejo HC-HA/PTX3 en AMSC pero no HSF bajo superposición de agarosa. Los extractos de GnHCl de las capas celulares de cultivos de HSF y AMSC con superposición de agarosa se sometieron a transferencia Western para PTX3 con o con tratamiento con NaOH. M, marcadores de escalera de proteínas. La FIGURA 40 ejemplifica la reconstitución del complejo HC-HA/PTX3 en HA inmovilizada in vitro. iHA (~ 14 jg/ml), IaI (5 jg/ml) y t SG-6 (12 jg/ml) se incubaron simultáneamente sin o con PTX3 (1, 5 o 20 jg/ml) durante 2 ha 37°C. Para secuencialmente, iHA (~ 14 jg/ml), IaI (12 jg/ml) y TSG-6 (12 jg/ml) se incubaron en el regulador de reacción durante 2 ha 37°C, luego PTX3 (1, 5, o 20 jg/ml) y se incubaron durante otras 2 ha 37°C. Después de lavados con GnHCl 8 M y PBS, se digirieron iHA con componentes unidos con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 ha 60°C. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra IaI (A), TSG-6 (B) y PTX3 (C). La FIGURA 41 ejemplifica la morfología celular de fibroblastos corneales humanos hasta D3 cultivados en DMEM/FBS al 10% durante 2 días (A) o DMEM/FBS al 10% durante 2 días ± TGF-p1 durante 3 días (B).
La FIGURA 42 ejemplifica que la HC-HA soluble (PBS) inhibe TGFp1 pero activa la señalización de TGFp3 mientras que la HC-HA insoluble (GnHCl) activa tanto la señalización de TGFp1 como de TGFp3 bajo condiciones libres de suero y se potencia adicionalmente con la estimulación de TGFp1.
La FIGURA 43 ejemplifica que tanto la HC-HA soluble (PBS) como la HC-HA insoluble (GnHCl) inhiben la expresión de TGFpR2 y TGFpR3 bajo exposición de TGFp1. A, expresión de ARNm de TGFpR. B, expresión de la proteína TGFpR.
La FIGURA 44 ejemplifica la inhibición de la translocación nuclear de la señalización de pSMAD2/3 mediante inhibición de HC-HA de la señalización de TGFp1.
La FIGURA 45 ejemplifica la inhibición por HC-HA de la formación de actina del músculo liso alfa.
La FIGURA 46 ejemplifica que la transcripción de BMP6 fue activada por HA y HC-HA soluble/insoluble. La adición de TGFp1 activa la expresión de la transcripción de BMP6 en plástico, pero activa dramáticamente la expresión de ARNm de BMP4/6 en Hc F en HA y HC-HA soluble e insoluble.
La FIGURA 47 ejemplifica que HC-HA pero no HA activa la expresión del transcrito de BMPR1A en HCF expuesto con TGFp1, mientras que TGFpl adicional activa no específicamente la expresión de ARNm de BMPR1B y BMPR2 en HCF.
La FIGURA 48 ejemplifica que tanto la HC-HA soluble (PBS) como la HC-HA insoluble (GnHCl) activa la señalización de BMP4/6 a través de pSMAD1/5/8.
La FIGURA 49 ejemplifica que la activación de SMAD/1/5/8 dio como resultado una sobrerregulación de su gen corriente abajo, inhibidor de la unión al ADN 1, 3 y 4 (ID1, ID3 e ID4), objetivos corriente abajo de la señalización de BMP.
La FIGURA 50 ejemplifica que HC-HA (PBS) y HC-HA (GnHCl) promueven la expresión de ARNm de queratocán en 14 y 16 veces respectivamente, lo que se subregula significativamente por TGFpl adicional.
La FIGURA 51 ejemplifica que HC-HA (PBS) y HC-HA (GnHCl) promueven la expresión de la proteína del queratocán.
La FIGURA 52 ejemplifica que HCF expresa más marcadores ESC en 4X HC-HA (PBS y HC-HA insoluble (GnHCl) que en plástico y cuando las células se expusieron con la adición de TGFp1.
La FIGURA 53 ejemplifica la viabilidad celular de las células MC3T3-E1 medida por MTT.
La FIGURA 54 ejemplifica la mineralización de células MC3T3-E1 medida por tinción con rojo de Alizarina.
La FIGURA 55 ejemplifica la morfología de las células MC3T3-E1 tratadas con HC-HA (A) o AMP (B) el Día 13 de inducción.
La FIGURA 56 ejemplifica la tinción con rojo de Alizarina de células MC3T3-E1 tratadas con HC-HA (A) o AMP (B) el Día 13 de inducción.
La FIGURA 57 ejemplifica el análisis cuantitativo de la tinción con ARS de células MC3T3-E1 tratadas con HC-HA (A) o AMP (B) el Día 13 de inducción.
La FIGURA 58 ejemplifica la actividad de ALP (UI/L) de células tratadas con HC-HA (A) y AMP (B) el Día 13 de inducción.
La FIGURA 59 ejemplifica la microscopía de contraste de fase de los cambios morfológicos en las células MC3T3-E1 después de la inducción desde el Día 3. (A) Se cultivaron células no inducidas en aMEM con FBS al 10% durante 7 días. (B) Se cultivaron células MC3T3-E1 hasta la confluencia en placas de 96 pocillos de fondo plano un día después de la siembra (Día 0). A continuación, se indujeron las células con ácido ascórbico y p-glicerofosfato.
La FIGURA 60 ejemplifica la microscopía de contraste de fase de los cambios morfológicos en células MC3T3-E1 inducidas tratadas con HC-HA (A) o AMP (B) desde el Día 1 al Día 7.
La FIGURA 61 ejemplifica la microscopía de contraste de fase de la formación de anillos de husillo en células MC3T3-E1 inducidas desde el Día 3 de inducción.
La FIGURA 62 ejemplifica la microscopía de contraste de fase de la formación de anillos de husillo en células MC3T3-E1 inducidas tratadas con HC-HA (A) y AMP (B) (Día 0 a Día 6).
La FIGURA 63 ejemplifica la tinción con ARS de células MC3T3-E1 inducidas tratadas con HC-HA y AMP y extracción con GnHCl.
La FIGURA 64 ejemplifica la extracción y cuantificación con ARS de células MC3T3-E1 con ácido acético e hidróxido de amonio al 10%. Los extractos de ARS mediante tratamiento con ácido acético se neutralizaron con hidróxido de amonio al 10% y luego se añadieron a placas de ensayo de fondo transparente de 96 pocillos (A) para lectura en un espectrofotómetro (B). * denota significación estadística.
La FIGURA 65 ejemplifica la extracción y cuantificación con ARS de células MC3T3-E1 con GnHCl. Se añadieron extractos de ARS mediante tratamiento con GnHCl a placas de ensayo de fondo transparente de 96 pocillos (A) para lectura en un espectrofotómetro (B). * denota significación estadística.
La FIGURA 66 ejemplifica la tinción con ARS (A) y la cuantificación (B) de células MC3T3-E1 tratadas con HC-HA en D19 (D18 de inducción). La tinción con ARS se realizó en D19 de cultivo (inducción D18).
La FIGURA 67 ejemplifica la tinción con ARS (A) y la cuantificación (B) de células MC3T3-E1 tratadas con AMP. La tinción con ARS se realizó en D19 de cultivo (inducción D18).
La FIGURA 68 ejemplifica un anillo en forma de husillo observado en células MC3T3-E1 inducidas el Día 14 de inducción.
La FIGURA 69 ejemplifica la microscopía de contraste de fase de la morfología celular de células MC3T3-E1 inducidas tratadas con AMP después de 14 días de cultivo de inducción (A) sin un Transwell o (B) con un Transwell. La FIGURA 70 ejemplifica la tinción con ARS de células MC3T3-E1 inducidas en D14 de inducción.
La FIGURA 71 ejemplifica la cuantificación de la tinción con ARS de células MC3T3-E1 inducidas en D14 de inducción.
La FIGURA 72 ejemplifica la tinción con ARS y la cuantificación de células MC3T3-E1 tratadas con AMP (A) Imagen de contraste de fase e imagen de tinción con ARS de células MC3T3-E1 tomadas en cultivo del Día 21 (Día 20 de inducción). (B) La tinción con ARS se cuantificó el Día 21 de cultivo (Día 20 de inducción). El símbolo * denota una significación estadística de p <0.05.
La FIGURA 73 ilustra un mapa de diferenciación de progenitores diferentes a osteoblastos, con factores comunes agregados al medio de cultivo que se muestran.
La FIGURA 74 ejemplifica la tinción y cuantificación de ARS en células MC3T3-E1. (A) Micrografías de contraste de fase con o sin tinción con ARS de HUVEC, hBMMSC y células madre estromales hAM desde el Día 4 al Día 21. (B) Cuantificación de la tinción con ARS. El símbolo * indica una significación estadística de p <0.05 en comparación con el control negativo.
La FIGURA 75 ilustra una línea de tiempo de osteogénesis en células MC3T3-E1.
La FIGURA 76 ejemplifica la tinción y cuantificación de ARS en células MC3T3-E1. (A) Morfología celular y tinción con ARS de células MC3T3-E1 tratadas con AMP (Día 1, 2, 7, 10). (B) Cuantificación de ARS de células MC3T3-E1 tratadas con AMP (Día 1, 2, 7, 10) El símbolo * indica una significación estadística de p <0.05.
La FIGURA 77 ejemplifica una línea de tiempo de la viabilidad y proliferación celular a través del ensayo MTT. (A) Ensayo MTT de la viabilidad celular y actividad metabólica MC3T3-E1 en los Días 1, 2 y 4. El símbolo * indica la significación estadística de p <0.05 desde el Día 1. (B) Ensayo BrdU de la proliferación de células MC3T3-E1 el Día 1, 2 y 16. El símbolo * indica una significación estadística de p <0.05 desde el Día 1.
La FIGURA 78 ejemplifica la expresión de ARNm por QPCR para diversos genes probados después de la inducción de diferenciación con o sin tratamiento con AMP. (A) hMSC y (B) expresión de células MC3T3-E1.
La FIGURA 79 ejemplifica la microscopía de fase y la cuantificación del ensayo ARS. Las células MC3T3-E1 depositaron mineralización durante la duración del experimento, 8 días. Luego se utilizó ARS para el análisis cualitativo. (A) Placa CovaLink-NH de 96 pocillos en la que se inmovilizaron PBS, HA y HC-HA. (B) Placa convencional de 96 pocillos con el control negativo y AGM (agentes inductivos) y AMP como controles positivos. (C) Cuantificación del ensayo ARS. El símbolo * indica una significación estadística de p <0.05 desde el Día 1.
La FIGURA 80 ejemplifica la expresión de ARNm por QPCR para diversos genes probados después de la inducción de diferenciación con o sin tratamiento con HC-HA/PTX3. (A) Factores de transcripción maestros Runx2 y Sox9 para osteogénesis y condrogénesis, Día 21, 7 y 14. (B) Expresión de proteínas morfogénicas óseas (BMP) el Día 14. (C) Marcador condrogénico Colágeno 2 (COL2) y marcador osteogénico fosfatasa alcalina (ALPL), expresada los Días 7 y 14. (D) Marcadores hipertróficos Colágeno 10 (COL10) y MMP13 expresados el Día 14. (E) Marcadores osteogénicos Colágeno 1 (COL1), Osterix (OSX) y Sialoproteína ósea (BSP) el Día 14.
La FIGURA 81 ejemplifica la microscopía de fase (A) y la cuantificación (B) del ensayo ARS después de la inducción de la diferenciación con o sin tratamiento con HC-HA/PTX3 (soluble o insoluble) el Día 14.
La FIGURA 82 ejemplifica la activación y diferenciación de las células T CD4+. Bajo diferentes estímulos, las células auxiliares T CD4+ ingenuas (Th) se diferencian en Thl, Th2, Thl7 o Treg y secretan diferentes citoquinas. Las citoquinas de tipo Thl1 (por ejemplo, IFN-y e IL-2) tienden a producir respuestas proinflamatorias.
La FIGURA 83 ejemplifica el procedimiento para medir la proliferación celular y la producción de citoquinas. Se aislaron esplenocitos de ratones OT-II que expresan un TCR transgénico específico para ovoalbúmina (OVA) y se estimularon con OVA hasta 4 días. La proliferación celular se midió mediante marcaje con BrdU y la expresión de citoquinas (IFN-y e IL-2) se midió mediante el ELISA respectivo.
La FIGURA 84 ejemplifica la inhibición de nHC-HA/PTX3 de la proliferación de células T CD4+. Los esplenocitos aislados de ratones transgénicos receptores de células T de Ova se estimularon con OVA (0-10 pM) durante 4 días. El extracto de AM (AME, 25 pg/ml) y nHC-HA/PTX3 (25 pg/ml) inhibieron el crecimiento de clones de células T activadas inducido por concentraciones crecientes de OVA (arriba). Se midió la proliferación de esplenocitos tratados con HA, AME o nHC-HA/PTX3 y marcados con CFSE durante 4 días mediante citometría de flujo. Tanto AME como nHC-HA/PTX3 inhibieron de manera dependiente de la dosis la proliferación celular (centro). 25 pg/ml de nHC-HA/PTX3 inhibieron la proliferación de células T CD4+ marcadas con BrdU (abajo) (*, p <0.05 en comparación con el control).
La FIGURA 85 ejemplifica la supresión de nHC-HA/PTX3 de las citoquinas IFN-y e IL-2 de tipo Thl. Los esplenocitos tratados con PBS, 25 pg/ml de HA, 25 pg/ml de AME o 25 pg/ml de nHC-HA/PTX3 se estimularon con 10 pM de OVA durante 4 días. Se midieron IFN-y e IL-2 en los sobrenadantes de cultivo mediante el ELISA respectivo. Tanto AME como nHC-HA/PTX3 suprimieron la producción de IFN-y e IL-2 (* p <0.05 en comparación con el control). La FIGURA 86 ejemplifica la reducción de nHC-HA/PTX3 del influjo de macrófagos (marcados con proteína fluorescente verde potenciada, o EGFP). Se inyectó LPS (2 pl de 2 pg/ml) en el estroma corneal del ratón Mafia. Inmediatamente, se inyectaron 5 pl de PBS o nHC-HA/PTX3 (1 mg/ml) en cada cuadrante de una córnea del mismo ratón a través del tejido subjuntival. El influjo de macrófagos EGFP+ se monitoriza usando microscopía intravital in vivo los Días 1, 2, 3 y 6 después del tratamiento con LPS (arriba). Alternativamente, las córneas de ratón se trataron con PBS o nHC-HA/PTX3 simultáneamente con LPS (pretratamiento (-) o tres días antes del tratamiento con LPS (pretratamiento (+)). El Día 4 después del tratamiento con LPS, las células de las córneas se aislaron mediante digestión con colagenasa y clasificados en EGFP- o EGFP+ (macrófagos) por FACS (* y **, p <0.05 yp <0.01 en comparación con el control, respectivamente).
La FIGURA 87 ejemplifica la polarización de nHC-HA/PTX3 de macrófagos hacia un fenotipo M2. La expresión de ARNm de marcadores M2 (Arg-1 e IL-10) y marcadores M1 (IL-12p40 e IL-12p35) en macrófagos (EGFP+) infiltrados en córneas murinas provocadas por LPS se cuantificó mediante qPCR (* y **, p < 0.05 yp <0.01 en comparación con el control, respectivamente).
La FIGURA 88 ejemplifica la mejora de nHC-HA/PTX3 de la supervivencia del aloinjerto corneal. La supervivencia del aloinjerto corneal murino mejoró significativamente mediante la inyección de nHC-HA/PTX3 en un cuadrante del sitio subconjuntival (10 pg/vez, dos veces/semana, arriba a la izquierda), pero incluso dramáticamente mejor con la inyección de nHC-HA/PTX3 en sitios subconjuntivales de cuatro cuadrantes (20 pg/vez, dos veces/semana, arriba a la derecha). Abajo, fotografías de PBS (Día 21 posoperatorio, izquierda) o tratamiento con nHC-HA/PTX3 (Día 40 posoperatorio, derecha) en aloinjertos de córnea.
La FIGURA 89 ejemplifica la activación clásica de M1 de macrófagos (por ejemplo, Inducida por ligandos de IFN-y y/o TLR tales como LPS) para expresar altos niveles de citoquinas proinflamatorias (tales como TNF-a, IL-12 e IL23), que activan ThI y Linfocitos Thl7 que conducen a muchas enfermedades inflamatorias crónicas.
La FIGURA 90 ejemplifica la infiltración de macrófagos provocada por LPS en córneas murinas con tratamiento de PBS (control), HC-HA/PTX3 o AMP. Ratones MaFIA (los macrófagos son EGFP+) con inyección intraestromal de LPS (5 pg) en ambos ojos. La OS se trató con PBS, la OD se trató bien sea con HC-HA (2 sitios de inyección) (A), HC-HA (4 sitios de inyección) (B), AMP (2 sitios de inyección) (C), AMP (4 sitios de inyección)) (D), cada inyección fue de 5 pl. El tratamiento fue una vez justo después de la inyección de LPS. Se tomaron imágenes el Día 1, Día 2, Día 3 y Día 6. Se contaron las células con base en la intensidad de la fluorescencia verde.
La FIGURA 91 ejemplifica la infiltración de macrófagos provocada por LPS en córneas murinas y sus subtipos (M1 y M2) con tratamiento o pretratamiento de PBS (control), nHC-HA/PTX3 o AMP. El pretratamiento y el tratamiento de los ratones Mafia son los mismos que se describen en la Figura 86. El Día 4, los botones de la córnea se cortan y se digieren con colagenasa a 37°C durante 2 h. Las células EGFP-positivas/negativas se clasifican mediante FACS. La relación de macrófagos positivos para EGFP a células negativas para EGFP se calcula y se usa como una unidad arbitraria para determinar el grado de infiltración de macrófagos (A). El ARN total se extrajo de macrófagos positivos a EGFP clasificados y se convirtió en ADNc. La expresión de Arg-1, IL-10, IL-12p40 e IL-12p35 se mide mediante PCR cuantitativa (B).
FIGURA 92 Diagrama del sitio de inyección. Los sitios de inyección serán subconjuntiva cerca de fórnix nHC-HA/PTX3 o AMP puede reducir la ALKC inducida por DS en un modelo de ojo seco experimental de murino.
La FIGURA 93 ejemplifica la activación de HC-HA de la señalización de IGF1-HIF1a-VEGF para promover la angiogénesis. HC-HA induce un aumento de 2 a 6 veces del ARNm de IGF1 y un aumento de 2 veces del ARNm de VEGF cuando las células están en condición de reposo. HC-HA induce un aumento de 5 a 12 veces del ARNm de IGF1 y un aumento de 5 a 9 veces del ARNm de VEGF cuando las células son expuestas por TGFp (10 ng/ml). n= 4, * p <0.05, ** p <0.01. IGF1, factor 1 de crecimiento similar a la insulina; HIF1a, factor 1 -alfa inducible por hipoxia; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular.
Descripción detallada de la invención
La invención está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. El asunto objeto que va más allá del alcance reivindicado se describe solo como referencia y no es parte de la invención.
Cierta terminología
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece el asunto objeto reivindicado.
Como se usa en este documento, los rangos y cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o rango particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 |jg" significa "aproximadamente 5 jg" y también "5 jg". Generalmente, el término "aproximadamente" incluye una cantidad que se esperaría que estuviera dentro del error experimental.
Como se usa en el presente documento, un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido es un complejo
HC-HA/PTX3 que se forma por ensamblaje de las moléculas componentes del complejo in vitro. El proceso de ensamblaje de rcHC-HA/PTX3 incluye la reconstitución con proteínas o moléculas nativas purificadas de origen biológico, proteínas recombinantes generadas por métodos recombinantes o síntesis de moléculas por síntesis in vitro. En algunos casos, las proteínas nativas purificadas utilizadas para el ensamblaje de rcHC-HA/PTX3 son proteínas en un complejo con otras proteínas (es decir, un multímero, una proteína de cadenas múltiples u otro complejo). En algunos casos, PTX3 se purifica como un multímero (por ejemplo, un homomultímero) de una célula y se emplea para el ensamblaje del complejo rcHC-HA/PTX3.
Como se usa en este documento, un complejo de HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativo purificado se refiere a un complejo de HC-HA/PTX3 que se purifica a partir de una fuente biológica tal como una célula, un tejido o un fluido biológico. Tales complejos generalmente se ensamblan in vivo en un sujeto o ex vivo en células, tejidos o fluidos biológicos de un sujeto, incluido un humano u otro animal.
Como se usa en el presente documento, un complejo PTX3/HA se refiere a un complejo intermedio que se forma al poner en contacto PTX3 con HA inmovilizado. En los métodos proporcionados aquí, el complejo PTX3/HA se genera antes de la adición de HC1 a HA.
Como se usa aquí, "hialuronano", "ácido hialurónico" o "hialuronato" (HA) se usan indistintamente para referirse a un glicosaminoglicano lineal sustancialmente no sulfatado (GAG) con unidades de disacárido repetidas de ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina (D-glucuronosil-N-acetilglucosamina).
Como se usa en este documento, el término "alto peso molecular" o "HMW", como en hialuronano de alto peso molecular (HMW HA), se refiere a HA que tiene un peso molecular promedio en peso que es superior a aproximadamente 500 kilodaltons (kDa)., tales como, por ejemplo, entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa, entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa, entre aproximadamente 1100 kDa y aproximadamente 5,000 kDa, o entre aproximadamente 1400 kDa y aproximadamente 3,500 kDa. En algunas realizaciones, el HMW HA tiene un peso molecular promedio en peso de
3000 kDa o mayor. En algunas realizaciones, el HMW HA tiene un peso molecular promedio en peso de 3000 kDa.
En algunas realizaciones, el HMW HA es Healon® con un peso molecular promedio en peso de aproximadamente
3000 kDa. En algunas realizaciones, HMW HA tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa. En algunas realizaciones, HMW HA tiene un peso molecular de entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa. En algunas realizaciones, HMW HA tiene un peso molecular de aproximadamente 3,000 kDa.
Como se usa en este documento, el término "bajo peso molecular" o "LMW", como en hialuronano de bajo p molecular (LMW HA), se refiere a HA que tiene un peso molecular promedio en peso que es menor de 500 kDa, tal como para ejemplo, menos de aproximadamente 400 kDa, menos de aproximadamente 300 kDa, menos de aproximadamente 200 kDa, aproximadamente 200-300 kDa o aproximadamente 1-300 kDa.
Como se usa en el presente documento, pentraxina 3, o PTX3, proteína o polipéptido se refiere a cualquier proteína PTX3, que incluye, pero no se limita a, una proteína producida de forma recombinante, una proteína producida sintéticamente, una proteína PTX3 nativa y una proteína PTX3 extraída de células o tejidos. pTX3 incluye formas multiméricas (por ejemplo, homomultímero) de PTX3, que incluyen, pero no se limitan a, diméricas, triméricas, tetraméricas, pentaméricas, hexámeras, tetraméricas, octaméricas y otras formas multiméricas producidas de forma natural o artificial.
Tal como se utiliza en el presente documento, el gen-6 estimulado con factor de necrosis tumoral (TSG-6) se refiere a cualquier proteína o polipéptido TSG-6, que incluye peo no e limita a, una proteína producida de forma recombinante, una proteína producida sintéticamente, una proteína TSG-6 nativa y una proteína TSG-6 extraída de células o tejidos.
Como se usa en este documento, inter-a-inhibidora (IaI) se refiere a la proteína IaI compuesta de cadena ligera (es decir, bikunina) y una o ambas cadenas pesadas de tipo HC1 o HC2 conectadas covalentemente por una cadena de sulfato de condroitina. En algunas realizaciones, la fuente de IaI es de suero o de células que producen IaI, por ejemplo, células hepáticas o células epiteliales o estromales amnióticas o células epiteliales o estromales umbilicales bajo una estimulación de modo constitutivo por citoquinas proinflamatorias tales como IL-1 o TNF-a.
Como se usa en este documento, una "proteína de unión a hialuronano", "proteína de unión a HA" o "HABP" se refiere a cualquier proteína que se une específicamente a HA.
Como se usa en este documento, "módulo de enlace" significa dominios de unión a hialuronano.
Como se usa en este documento, "actividad biológica" se refiere a las actividades in vivo de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 o respuestas fisiológicas que resultan de la administración in vivo de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 o una composición o mezcla que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. La actividad biológica, por tanto, abarca los efectos terapéuticos y la actividad farmacéutica de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 y las composiciones y mezclas de los mismos.
Como se usa aquí, los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente. Ninguno de los términos debe interpretarse en el sentido de que requiera la supervisión de un profesional médico (por ejemplo, un médico, una enfermera, un asistente médico, un enfermero, un trabajador de cuidados paliativos). Como se usa en este documento, el sujeto es cualquier animal, incluidos los mamíferos (por ejemplo, un animal humano o no humano) y los no mamíferos. En una realización de los métodos y composiciones proporcionados en este documento, el mamífero es un humano.
Como se usa en este documento, los términos "trato", "tratar" o "tratamiento" y otros equivalentes gramaticales, incluyen aliviar, atenuar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección, mejorar, prevenir o reducir la apariencia, gravedad o frecuencia. de uno o más síntomas adicionales de una enfermedad o afección, mejorar o prevenir las causas metabólicas subyacentes de uno o más síntomas de una enfermedad o afección, inhibir la enfermedad o afección, tal como, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección causada por la enfermedad o afección, o inhibir los síntomas de la enfermedad o afección bien sea de forma profiláctica y/o terapéutica. En un ejemplo no limitante, para beneficio profiláctico, un complejo o composición rcHC-HA/PTX3 divulgada en el presente documento se administra a un individuo con riesgo de desarrollar un trastorno particular, predispuesto a desarrollar un trastorno particular, o a un individuo que informa uno o más de los síntomas fisiológicos de un trastorno.
Como se usa en este documento, "placenta" se refiere al órgano que conecta un feto en desarrollo a la pared uterina materna para permitir la absorción de nutrientes, la eliminación de desechos y el intercambio de gases a través del suministro de sangre materna. La placenta se compone de tres capas. La capa placentaria más interna que rodea al feto se llama amnios. El alantoides es la capa media de la placenta (derivada del intestino posterior embrionario); los vasos sanguíneos que se originan en el ombligo atraviesan esta membrana. La capa más externa de la placenta, el corion, entra en contacto con el endometrio. El corion y el alantoides se fusionan para formar la membrana corioalantoidea.
Como se usa en este documento, "corion" se refiere a la membrana formada por el mesodermo extraembrionario y las dos capas de trofoblasto. El corion coniste en dos capas: una exterior formada por el trofoblasto y una interior formada por el mesodermo somático; el amnios está en contacto con este último. El trofoblasto está formado por una capa interna de células cúbicas o prismáticas, el citotrofoblasto o capa de Langhans, y una capa externa de protoplasma rico en núcleos desprovisto de límites celulares, el sincitiotrofoblasto. El amnios avascular se adhiere a la capa interna del corion.
Como se usa en este documento, "amnios-corion" se refiere a un producto que comprende amnios y corion. En algunas realizaciones, el amnios y el corion no se separan (es decir, el amnios se adhiere naturalmente a la capa interna del corion). En algunas realizaciones, el amnios se separa inicialmente del corion y luego se combina con el corion durante el procesamiento.
Como se usa en este documento, "cordón umbilical" se refiere al órgano que conecta al feto en desarrollo a la placenta. El cordón umbilical está compuesto de gelatina de Wharton, una sustancia gelatinosa compuesta principalmente de mucopolisacáridos. Contiene una vena, que transporta sangre oxigenada y rica en nutrientes al feto, y dos arterias que transportan sangre desoxigenada y empobrecida en nutrientes.
Como se usa en este documento, "membrana amniótica placentaria" (PAM) se refiere a la membrana amniótica derivada de la placenta. En algunas realizaciones, la PAM está sustancialmente aislada.
Como se usa en el presente documento, "membrana amniótica del cordón umbilical" (UCAM) significa membrana amniótica derivada del cordón umbilical. UCAM es una membrana translúcida. La UCAM tiene múltiples capas: una capa epitelial, una membrana basal; una capa compacta; una capa de fibroblastos; y una capa esponjosa. Carece de vasos sanguíneos o de un riego sanguíneo directo. En algunas realizaciones, la UCAM comprende la gelatina de Wharton. En algunas realizaciones, la UCAM comprende vasos sanguíneos y/o arterias. En algunas realizaciones, la UCAM comprende gelatina de Wharton y vasos sanguíneos y/o arterias.
Como se usa en este documento, los términos "purificado" y "aislado" significan un material (por ejemplo, complejo nHC-HA/PTX3) sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. En algunas realizaciones, "purificado" o "aislado" significa que un material (por ejemplo, complejo nHC HA/PTX3) está aproximadamente 50% o más libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo, por ejemplo, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo.
Descripción general: complejos nHC-HA/PTX3 y rcHC-HA/PTX3
El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano lineal sustancialmente no sulfatado (GAG), compuesto de unidades de subunidades de disacárido repetidas de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina a través de enlaces GlcUA-p1,3-GlcNAc-p1,4. El HA es sintetizado por las HA sintasas (por ejemplo, HAS1, HAS2 y HAS3) y se deposita en la matriz extracelular, donde contribuye a la integridad estructural de los tejidos y también regula muchos procesos celulares mediante la interacción con proteínas, incluidos los receptores de la superficie celular. El peso molecular de HA varía típicamente en tamaño de aproximadamente 200 a aproximadamente 10,000 kDa. Los niveles normales de HA se mantienen en los tejidos mediante el equilibrio de la biosíntesis por enzimas HAS y el catabolismo por hialuronidasas, tales como Hyall.
El HA de alto peso molecular (HMW HA), típicamente superior a 500 kDa, promueve la inactividad celular y la integridad estructural de tales tejidos como el cartílago y el cuerpo vítreo (humor) en el ojo, y se asocia con la cicatrización de heridas fetales sin cicatrices. En ciertos casos, HMW HA inhibe la expresión génica de mediadores proinflamatorios y angiogénesis.
En ciertas condiciones patógenas, HMW HA se degrada en fragmentos y oligosacáridos más pequeños (por ejemplo, mediante hialuronidasa o oxidación de radicales libres). Los fragmentos de LMW hA estimulan la proliferación de células endoteliales vasculares, la migración, la síntesis de colágeno, la formación de brotes y la angiogénesis en la piel de rata, el infarto de miocardio y el modelo de injerto de piel crio-lesionada al promover la expresión génica de mediadores proinflamatorios y proangiogénicos.
Las funciones biológicas de HA están mediadas por la interacción de HA con proteínas de unión a HA (HABP), también llamadas hialadherinas. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral a (TSG-6), agrecano, versicano, neurocano, brevicano, LYVE-1, CD44 y la inter-a-inhibidora (IaI). En algunos casos, los HABP comprenden un dominio de módulo de enlace que se une a HA. TSG-6, aggrecano, versicano, neurocan, brevicano, LYVE-1 y CD44 son ejemplos de HABP que contienen un módulo de enlace.
IaI comprende dos cadenas pesadas (HC1 y HC2), ambas unidas a través de enlaces éster a una cadena de sulfato de condroitina que está unida a una cadena ligera (es decir, Bikunin). En algunos casos, HA forma un complejo covalente (de aquí en adelante, "HC-HA") con uno o ambos de los HC de IaI mediante enlace covalente a las cadenas pesadas de IaI. En ciertos casos, el IaI se encuentra en el suero y/o se obtiene de células que producen IaI, por ejemplo, células hepáticas o células epiteliales o estromales amnióticas o células epiteliales o estromales umbilicales bajo una estimulación de modo constitutivo por citoquinas proinflamatorias, tales como IL-1 TNF-a En ciertos casos, TSG-6 facilita la transferencia de, cataliza la transferencia de, y/o transfiere la HC1 y HC2 de IaI a HA. TSG-6 forma complejos estables con HA inmovilizado (TSG-6^HA) dando como resultado la transferencia de HC1 y HC2 a HA para formar un complejo HC-HA y la liberación de TSG-6 del complejo. La expresión de TSG-6 a menudo es inducida por mediadores inflamatorios tales como TNF-a e interleucina-1 y durante procesos de tipo inflamatorio tales como la ovulación y la maduración cervical.
La membrana amniótica (AM) modula la cicatrización de heridas en adultos y facilita la regeneración de tejidos. En ciertos casos, la AM promueve la epitelización mientras suprime la inflamación del estroma, la angiogénesis y la cicatrización. La AM se ha utilizado con éxito como injerto quirúrgico o parche biológico temporal para el tratamiento de afecciones oftálmicas que requieren reconstrucción de la superficie corneal y conjuntival, que incluyen, pero no se limitan a, defecto epitelial persistente, úlcera corneal profunda, queratitis infecciosa, queratopatía bullosa sintomática, Síndrome agudo de Stevens Johnson/Necrólisis Epidérmica Tóxica (SJS/TEN), deficiencia de células madre del limbo, pterigión, pinguécula, conjuntivocalasia, simbléfaron, reconstrucción de formix y tumores conjuntivales.
La matriz estromal avascular de AM contiene grandes cantidades de HA y expresa constitutivamente IaI (Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287 (15): 12433-44). HMW HA en AM forma complejos nHC-HA (He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284 (30): 20136-20146). Como se muestra en el presente documento en los Ejemplos proporcionados, este complejo nHC-HA también contiene pentraxina 3, PTX3 (Figura 1) y, por lo tanto, se denomina en el presente documento "complejo nHC-HA/PTX3". Los complejos HC-HA/PTX3 nativos extraídos de la AM muestran supresión de la actividad del promotor de TGF-p, promoción de la muerte de células de macrófagos y supresión del desarrollo de vasos sanguíneos. Por lo tanto, los complejos nHC-HA/PTX3 de la AM desempeñan un papel activo en las acciones antiinflamatorias, antisicatrizantes y antiangiogénicas de la AM.
Como se describe en el presente documento, los complejos nHC-HA/PTX3 también se encuentran en el cordón umbilical (UC). Los complejos HC-HA/PTX3 DE UC difieren en su composición bioquímica con respecto al contenido de HA y la presencia y/o abundancia relativa de diversos componentes del complejo, incluidos los proteoglicanos, tal como los pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el SLRP es decorina, biglicano y/u osteoadherina. Como se describe en el presente documento, los complejos también difieren en contenido con respecto a la presencia de glicosaminoglicanos sulfatados particulares, tales como el queratán sulfato. Además, como se describe en el presente documento, los complejos aislados de AM o UC que usan diferentes métodos de extracción (por ejemplo, extracción con PBS versus GnHCl) dieron como resultado complejos con diferentes composiciones bioquímicas y propiedades biológicas. En ciertos casos, se encuentra que los complejos aislados de una fracción insoluble por extracción con GnHCl del tejido del cordón umbilical exhiben propiedades mejoradas.
PTX3 es una proteína multimérica que se ha demostrado que interactúa directamente con las TSG-6 y HC de IaI. La PTX3 se sobrerregula en respuesta a los reguladores inflamatorios y se ha demostrado que juega un papel importante en la organización de HA en la matriz extracelular del óvulo acumulado durante la maduración de los ovocitos. Como se demuestra en el presente documento, PTX3 también se encuentra dentro de los complejos nHC-HA (es decir, nHC-HA/PTX3) de la membrana amniótica y el cordón umbilical y juega un papel crítico en la polarización de macrófagos M2.
Los macrófagos M1, o macrófagos proinflamatorios clásicamente activados, son inducidos por interferón (IFN) solo o en combinación con lipopolisacárido (LPS) o factor de necrosis tumoral (TNF) a. Los macrófagos M1 se caracterizan típicamente por una alta expresión de interleucina-12 (IL-12) e IL-23 y niveles bajos de IL-10. Por el contrario, los macrófagos M2 o macrófagos "activados alternativamente" muestran propiedades regenerativas de tejido y cicatrización de heridas y se caracterizan por IL-12/IL-23 baja e IL-10 alta o aproximadamente la misma proporción de IL-12 a IL-10. En ciertos casos, los macrófagos M2 también tienen una alta expresión de TGF-p.
Los ejemplos proporcionados en el presente documento demuestran que PTX3 se une directamente a HA inmovilizado como lo demuestra la resistencia a los agentes disociantes. En el presente documento se demuestra que los complejos reconstituidos in vitro de HA unido a PTX3 exhiben propiedades diferentes en comparación con los complejos reconstituidos in vitro de HA unido a TSG-6. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un complejo PTX3/HA promueve la unión de macrófagos estimulados con LPS sin agregación e induce la expresión de IL-10 en un macrófago estimulado con LPS. En algunas realizaciones, un complejo PTX3/HA divulgado en este documento aumenta la expresión de IL-10 en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en un macrófago estimulado con LPS en comparación con la expresión de IL-10 la ausencia de un complejo PTX3/HA. Por el contrario, en algunas realizaciones, el complejo TSG-6/HA reduce la unión celular y promueve la agregación de macrófagos estimulados con LPS y no induce la expresión de IL-10 en un macrófago estimulado con LPS. Además, en algunas realizaciones, el tSG-6 preunido a HA inhibe la unión subsecuente de PTX3 al complejo. En algunas realizaciones, tanto el complejo TSG-6/HA como el complejo PTX3/HA disminuyeron la expresión de IL-12 en un macrófago estimulado con LPS. En algunas realizaciones, un complejo PTX3/HA o complejo TSG-6/HA divulgado en este documento reduce o inhibe la expresión de IL-12 en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en un macrófago estimulado con LPS en comparación con la expresión IL-12, la ausencia de un complejo PTX3/HA o complejo TSG-6/HA. En algunas realizaciones, tanto el complejo TSG-6/HA como el complejo PTX3/HA aumentaron la expresión de IL-23 en un macrófago estimulado con LPS/IFNy. En algunas realizaciones, un complejo PTX3/HA o complejo TSG-6/HA divulgado en el presente documento reduce o inhibe la expresión de IL-23 en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en un macrófago estimulado con LPS/IFNy en comparación con la expresión de IL-23, la ausencia de un complejo PTX3/HA o complejo TSG-6/HA.
Además, se demuestra en el presente documento que los complejos rcHC-HA/PTX3 reconstituidos in vitro poseen diferentes actividades biológicas dependiendo de si el complejo rcHC-HA/PTX3 se forma con HA preunido a TSG-6 en presencia de IaI seguido de adición de PTX3 o HA preunido a PTX3 seguido de la adición de TSG-6 con IaI. En el presente documento se proporcionan métodos de ejemplo para la reconstitución de rcHC-HA/PTX3 en complejo formado con HA preunido a tSG-6 o HA preunido a PTX3. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a TSG-6 dan como resultado la agregación de macrófagos estimulados con LPS. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a PTX3 promueven la unión de macrófagos estimulados con LPS sin agregación.
En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a PTX3 disminuyen o inhiben la expresión de marcadores de macrófagos M1 tales como IL-12 e IL-23. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado previamente unido a PTX3 disminuyen la expresión de IL-12 en un macrófago estimulado con LPS en comparación con la expresión de IL-12 en ausencia del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, un complejo rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento reduce o inhibe la expresión de IL-12 en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en un macrófago estimulado con LPS en comparación con la expresión de IL-12 la ausencia del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a PTX3 disminuyen o inhiben la expresión de IL-23 en un macrófago estimulado con LPS/IFNy en comparación con la expresión de IL-12 la ausencia del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a PTX3 disminuyen o inhiben la expresión de IL-23 en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en un macrófago estimulado con LPS/IFNy en comparación con la expresión de IL-23, la ausencia del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a PTX3 replican la actividad de los complejos nHC-HA/PTX3 aislados de la membrana amniótica.
En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a TSG-6 disminuyen o inhiben la expresión de marcadores de macrófagos M1 tales como IL-12, pero aumentan la expresión de IL-23. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a TSG-6 disminuyen o inhiben la expresión de IL-12. En algunas realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 formados con HA inmovilizado preunido a TSG-6 aumentan la expresión de IL-23.
En el presente documento se proporcionan métodos para producir complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos usando HA inmovilizado preunido a PTX3 y usos del mismo. También se proporcionan en el presente documento complejos de HA inmovilizado preunidos a PTX3 y usos de los mismos. También se proporcionan en el presente documento métodos para producir complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos usando HA inmovilizado preunido a TSG-6 y usos del mismo. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en el presente documento se administran para tratar una amplia variedad de enfermedades o afecciones, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento, tal como la inhibición, reducción, prevención o disminución del riesgo de inflamación, reacción inmune que conduce a rechazo autoinmune o inmune, adhesión, cicatrización, angiogénesis, afecciones que requieren regeneración celular o tisular, lesión por reperfusión tisular debido a isquemia, incluyendo infarto de miocardio y apoplejía, y los síntomas causados de esta manera. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en este documento se administran para tratar la inflamación. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en este documento se administran para tratar las cicatrices. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en este documento se administran para tratar la angiogénesis. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en este documento se administran para tratar la reacción inmunitaria que conduce al rechazo autoinmune o inmunitario. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en este documento se administran para tratar afecciones que requieren la inhibición de la adhesión celular. En algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos proporcionados en el presente documento se administran para tratar afecciones que requieren regeneración celular o tisular.
Además, los ejemplos proporcionados en el presente documento demuestran la capacidad de los complejos HC-HA/PTX3 para mantener las células madre en un estado indiferenciado, así como para inducir fibroblastos diferenciados adultos a progenitores más jóvenes en un modelo de fibroblastos corneales humanos. Los fibroblastos de córnea humanos se diferencian de los queratocitos y tras la adición de TGF-p1 exógeno, se diferencian adicionalmente en miofibroblastos formadores de cicatrices. Los datos proporcionados en el presente documento demuestran que el cultivo de células en presencia de HC-HA impedía que las células se diferenciaran en miofibroblastos bajo estimulación con TGF-p1. En ausencia de TGF-p1, los complejos HC-HA/PTX3 revierten los fibroblastos corneales humanos en queratocitos que expresan queratocan y CD34. En presencia de TGF-p1, los fibroblastos corneales humanos se reprograman adicionalmente en progenitores más jóvenes que carecen de expresión de queratocán pero que expresan un número de marcadores de células de la cresta neural tales como Osr2, FGF10 y Sox9 y marcadores de células madre embrionarias, tales como c-myc, KLF4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, Sox-2 y SSEA-4.
Se sabe que los factores de transcripción Sox2, Oct4, c-Myc y KLF4 desempeñan un papel importante en la inducción de células madre progenitoras (iPSC) a partir de células adultas diferenciadas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los complejos HC-HA/PTX3 proporcionados en la presente se emplean para reprogramar células adultas diferenciadas en iPSC. En algunas realizaciones, la inducción de iPSC usando un complejo HC-HA/PTX3 en combinación con uno o más de Sox2, Oct4, c-Myc y KLF4 se realiza con una eficiencia mucho mayor que los métodos convencionales que usan estos cuatro factores de transcripción sin HC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la adición del complejo HC-HA/PTX3 facilita la inducción de células madre desactivando la señalización de TGF-p para evitar la diferenciación y activando la señalización de BMP para facilitar la reprogramación en células progenitoras jóvenes tales como las iPSC. En algunas realizaciones, la adición de complejo HC-HA/PTX3 facilita la inducción de células madre reprogramando las células en progenitores más jóvenes y la inducción de marcadores de células madre. En algunas realizaciones, la adición de complejo HC-HA/PTX3 ayuda a mantener las características de las células madre durante la expansión ex vivo, eliminando así la necesidad de utilizar capas alimentadoras hechas de fibroblastos embrionarios murinos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el complejo HC-HA/PTX3 se usa como un portador o andamio para ayudar a administrar células madre que se han expandido ex vivo en los pacientes humanos para promover la eficacia de dichas terapias con células madre.
Métodos de producción de complejos nHC-HA/PTX3 aislados
En el presente documento se divulgan métodos para generar complejos HC-HA/PTX3 nativos aislados (nHC-HA/PTX3).
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 aislado se aísla de un tejido amniótico. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 aislado se aísla de una membrana amniótica o de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 aislado se aísla de la membrana amniótica placentaria (PAM), fresca, congelada o previamente congelada, la membrana amniótica del cordón umbilical (UCAM), fresca, congelada o previamente congelada, placenta fresca, congelada o previamente congelada, cordón umbilical fresco, congelado o previamente congelado, corion fresco, congelado o previamente congelado, amnios-corion fresco, congelado o previamente congelado, o cualquier combinación de los mismos. Tales tejidos se pueden obtener de cualquier mamífero, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, un humano, un primate no humano, una vaca o un cerdo.
En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 se purifica mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica por centrifugación (por ejemplo, ultracentrifugación, centrifugación en gradiente), cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y hidroxiapatita), filtración en gel o solubilidad diferencial, precipitación con etanol o mediante cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, todos incorporados aquí como referencia).
En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 se aísla de un extracto. En algunas realizaciones, el extracto se prepara a partir de un extracto de membrana amniótica. En algunas realizaciones, el extracto se prepara a partir de un extracto de cordón umbilical. En algunas realizaciones, el extracto de cordón umbilical comprende estroma de cordón umbilical y/o gelatina de Wharton. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 está contenido en un extracto que se prepara mediante ultracentrifugación. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 está contenido en un extracto que se prepara mediante ultracentrifugación usando un gradiente de CsCl/guanidina HCl 4-6M. En algunas realizaciones, el extracto se prepara mediante al menos 2 rondas de ultracentrifugación. En algunas realizaciones, el extracto se prepara mediante más de 2 rondas de ultracentrifugación (es decir, nHC-HA/PTX32°). En algunas realizaciones, el extracto se prepara mediante al menos 4 rondas de ultracentrifugación (es decir, nHC-HA/PTX3 4°). En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 comprende HC1, HA, PTX3 y/o un pequeño proteoglicano rico en leucina.
En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en un extracto preparado mediante extracción en una solución isotónica. En algunas realizaciones, la solución isotónica es PBS. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido se homogeneiza en PBS para producir una muestra homogeneizada. La muestra homogeneizada se separa luego en una porción soluble y una porción insoluble por centrifugación. En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en la porción soluble del tejido extraído con PBS. En tales realizaciones, el nHC-HA/PTX3 purificado por ultracentrifugación del tejido extraído con PBS se denomina complejo soluble de nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo soluble de nHC-HA comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina. En algunas realizaciones, el complejo soluble de nHC-HA/PTX3 comprende HC1, HA, PTX3 y/o un pequeño proteoglicano rico en leucina.
En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en un extracto preparado mediante extracción directa de guanidina HCl (por ejemplo, GnHCl 4-6 M) de la membrana amniótica y/o tejido del cordón umbilical. En algunas realizaciones, los tejidos del extracto de GnHCl se centrifugan luego para producir porciones solubles en GnHCl e insolubles en GnHCl. En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en la porción soluble en GnHCl. En tales realizaciones, el nHC-HA/PTX3 purificado por ultracentrifugación del tejido extraído con guanidina HCl se denomina complejo insoluble de nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo insoluble de nHC-HA comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina. En algunas realizaciones, el complejo insoluble de nHC-HA/PTX3 comprende HC1, HA, PTX3 y/o un pequeño proteoglicano rico en leucina.
En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en un extracto preparado mediante extracción adicional con guanidina HC1 de la porción insoluble del tejido extraído con PBS. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido se homogeneiza en PBS para producir una muestra homogeneizada. La muestra homogeneizada se separa luego en una porción soluble y una porción insoluble por centrifugación. La porción insoluble se extrae luego en guanidina HC1 (por ejemplo, GnHCl 4-6 M) y se centrifuga para producir porciones solubles e insolubles de guanidina HCl. En algunas realizaciones, la ultracentrifugación se realiza en la porción soluble de guanidina HCl. En tales realizaciones, el nHC-HA/PTX3 purificado por ultracentrifugación del tejido extraído con guanidina HCl se denomina complejo insoluble de nHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo insoluble de nHC-HA comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina. En algunas realizaciones, el complejo insoluble de nHC-HA/PTX3 comprende HC1, HA, PTX3 y/o un pequeño proteoglicano rico en leucina.
En algunas realizaciones, el método de purificación del extracto aislado de nHC-HA/PTX3 comprende: (a) disolver el extracto aislado (por ejemplo, preparado mediante el método soluble o insoluble descrito en este documento) en CsCl/guanidina HCl 4-6m a la densidad inicial de 1.35 g/ml, para generar una mezcla de CsCl, (b) centrifugar la mezcla de CsCl a 125,000 x g durante 48 ha 15°C, para generar un primer extracto purificado, (c) extraer el primer extracto purificado y dializarlo contra agua destilada para eliminar CsCl y guanidina HCl, para generar un dializado.
En algunas realizaciones, el método de purificación del extracto aislado comprende además (d) mezclar el dializado con 3 volúmenes de etanol al 95% (v/v) que contiene acetato de potasio al 1.3% (p/v) a 0°C durante 1 h, para generar una primera mezcla de dializado/etanol, (e) centrifugar la primera mezcla de dializado/etanol a 15,000 x g, para generar un segundo extracto purificado, y (f) extraer el segundo extracto purificado. En algunas realizaciones, el método de purificar el extracto aislado comprende, además: (g) lavar el segundo extracto purificado con etanol (por ejemplo, etanol al 70%), para generar una segunda mezcla de extracto purificado/etanol; (h) centrifugar la segunda mezcla de extracto purificado/etanol, para generar un tercer extracto purificado; e (i) extraer el tercer extracto purificado. En algunas realizaciones, el método de purificación del extracto aislado comprende, además: (j) lavar el tercer extracto purificado con etanol (por ejemplo, etanol al 70%), para generar una tercera mezcla de extracto purificado/etanol; (k) centrifugar la tercera mezcla de extracto purificado/etanol, para generar un cuarto extracto purificado; y (1) extraer el cuarto extracto purificado. En algunas realizaciones, el extracto purificado comprende un complejo nHC-HA/PTX3.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-HC1, los anticuerpos anti-HC2 o ambos se generan y fijan a un soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo HC-HA no purificado (es decir, la fase móvil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC-HA se une a los anticuerpos (por ejemplo, mediante la interacción de (a) un anticuerpo anti-HC1 y HC1, (b) un anticuerpo anti-HC2 y HC2, (c) un anticuerpo anti-PTX y PTX3, (d) un anticuerpo anti-SLRP y el SLRP, o (e) cualquier combinación de los mismos). En algunas realizaciones, el soporte se lava (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molécula no unida o unida suelta. En algunas realizaciones, el soporte se lava luego con una solución que permite la elución del complejo nHC-HA/PTX3 del soporte (por ejemplo, SDS al 1%, guanidina-HCl 6 M o urea 8 M).
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica mediante cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, la HABP se genera y se fija a un soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 no purificado (es decir, la fase móvil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo nHC-HA/PTX3 se une a la HABP. En algunas realizaciones, el soporte se lava (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molécula no unida o unida suelta. En algunas realizaciones, el soporte se lava luego con una solución que permite la elución del complejo HC-HA del soporte.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica mediante una combinación de cromatografía de afinidad HABP y cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos anti-HC1, anticuerpos anti-HC2, anticuerpos anti-PTX3, anticuerpos contra un SLRP o una combinación de SLRP, o cualquier combinación de anticuerpos de los mismos.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica a partir de la fracción insoluble como se describe en este documento usando uno o más anticuerpos. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica a partir de la fracción insoluble como se describe en el presente documento usando anticuerpos anti-SLRP.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica a partir de la fracción soluble como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 se purifica a partir de la fracción soluble como se describe en el presente documento usando anticuerpos anti-PTX3.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 comprende un SLRP de clase I, clase II o clase III. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de SLRP de clase I, tal como decorina y biglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase II, tales como fibromodulina, lumican, PRELP (proteína rica en leucina de extremo rico en arginina prolina), queratocán y osteoadherina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase III, tales como epipycan y osteoglicina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre bikunina, decorina, biglicano y osteoadherina. En algunas realizaciones, la pequeña proteína rica en leucina comprende un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina comprende queratán sulfato.
Métodos de producción de complejos rcHC-HA/PTX3
En el presente documento se describen métodos para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos (rcHC-HA/PTX3) con o sin SLRP. También se divulga en el presente documento complejos rcHC-HA/PTX3 y combinaciones intermedias de componentes generados por tales métodos.
En algunas realizaciones, un método para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos comprende (a) poner en contacto hialuronano inmovilizado de alto peso molecular (HMW HA) con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo PTX3/HA, y (b) poner en contacto el complejo PTX3/HA con IaI y Gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral (TSG-6). En el presente documento se proporcionan complejos rcHC-HA/PTX3 producidos mediante tal método. En algunas realizaciones, TSG-6 cataliza la transferencia de la cadena pesada 1 (HC1) de la inter-a-inhibidora (IaI) a HA. En algunas realizaciones, HC1 de IaI forma un enlace covalente con HA. En algunas realizaciones, las etapas (a) y (b) del método se realizan secuencialmente en orden.
En algunas realizaciones, un método para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos comprende poner en contacto un complejo PTX3/HA con IaI y TSG-6. En algunas realizaciones, TSG-6 cataliza la transferencia de la cadena pesada 1 (HC1) de la inter-a-inhibidora (IaI) a HA. En el presente documento se proporcionan complejos rcHC-HA/PTX3 producidos mediante tal método. En algunas realizaciones, HC1 de IaI forma un enlace covalente con HA.
En algunas realizaciones, un método para generar un complejo de HA unido a PTX3 comprende poner en contacto hialuronano de alto peso molecular inmovilizado (HMW hA) con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo PTX3/HA. En el presente documento se proporcionan complejos PTX3/HA producidos mediante tal método.
En algunas realizaciones, un método para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos comprende (a) poner en contacto hialuronano de alto peso molecular inmovilizado (HMW HA) con IaI y TSG-6 a HA para formar un complejo HC-HA preunido a TSG-6 y (b) poner en contacto el complejo HC-HA con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo rcHC-HA/PTX3. En el presente documento se proporcionan complejos rcHC-HA/PTX3 producidos mediante tal método. En algunas realizaciones, HC1 de IaI forma un enlace covalente con HA. En algunas realizaciones, las etapas (a) y (b) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un complejo HC-HA preunido a TSG-6 con PTX3.
En algunas realizaciones, el método comprende primero poner en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo PTX3/HA, luego poner en contacto el complejo PTX3/HA con IaI y TSG-6.
En algunas realizaciones, la proteína IaI y la proteína TSG-6 se ponen en contacto con el complejo en una relación molar de aproximadamente 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, o 20:1 (IaI:TSG-6). En algunas realizaciones, la relación de IaI:TSG-6 varía de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1, tal como aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, tal como aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, tal como aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1. De acuerdo con la invención, la relación de IaI: TSG-6 es 3:1 o superior. En algunas realizaciones, la relación de IaI:TSG-6 es 3:1.
En algunas realizaciones, las etapas (a) y (b) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un complejo PTX3/HA con IaI y TSG-6.
En ciertos casos, TSG-6 interactúa con IaI y forma complejos covalentes con HC1 y HC2 de IaI (es decir, HCVTSG-6 y HC2^TSG-6). En ciertos casos, en presencia de HA, las HC se transfieren a HA para formar rcHC-HA. En algunas realizaciones, se añade un complejo TSG-6^HC1 al complejo PTX3/HA preunido para catalizar la transferencia de HC1 a HA. En algunas realizaciones, el método comprende primero poner en contacto el hialuronano de alto peso molecular inmovilizado (HMW HA) con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo PTX3/HA, luego poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6. En algunas realizaciones, se añade una combinación de complejo HCVTSG-6 y complejo HC2^TSG-6 a un complejo PTX3/HA.
En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto PTX3 con HMW HA inmovilizado ocurre durante al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto PTX3 con HMW HA inmovilizado se produce durante al menos 2 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto PTX3 con HMW HA inmovilizado se produce durante al menos 2 horas. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto PTX3 con HMW HA inmovilizado se produce a 37°C. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto PTX3 con HMW HA inmovilizado se produce en MgCh5 mM en PBS.
En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con IaI y TSG-6 a HA ocurre durante al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6 y/o un complejo HC2^TSG-6 ocurre durante al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6 y/o un complejo HC2^TSG-6 ocurre durante al menos 2 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6 y/o un complejo HC2^TSG-6 se produce durante al menos 2 horas. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6 y/o un complejo HCVTSG-6 se produce a 37°C. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el complejo PTX3/HA con un complejo HCVTSG-6 y/o un complejo HCVTSG-6 se produce en MgCh5 mM en PBS.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con una proteína pentraxina 3 (PTX3), proteína inter-a-inhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y el gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral a (TSG-6) simultáneamente bajo condiciones adecuadas para formar un complejo HC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el contacto del HMW HA con PTX3, IaI y TSG-6 ocurre durante al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el HMW HA, PTX3, IaI y TSG-6 se produce a 37°C. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el HMW HA, PTX3, IaI y TSG-6 se produce en MgCh5 mM en PBS.
En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto hialuronano de alto peso molecular (HMW HA) con una proteína pentraxina 3 (PTX3), proteína inter-a-inhibidora (IaI) que comprende la cadena pesada 1 (HC1) y el gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral a (TSG-6) secuencialmente, en cualquier orden, bajo condiciones adecuadas para formar un complejo HC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el contacto de1HMW HA con PTX3, IaI y TSG-6 ocurre durante al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos al menos 5 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, o al menos 24 horas o más. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el HMW HA, PTX3, IaI y TSG-6 se produce a 37°C. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto el HMW HA, PTX3, IaI y TSG-6 se produce en MgCh 5 mM en PBS.
En algunas realizaciones, los métodos para la producción de un complejo rcHC-HA/PTX3 comprenden además la adición de uno o más pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRp). En algunas realizaciones, un método para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos comprende (a) poner en contacto hialuronano de alto peso molecular inmovilizado (HMW HA) con pentraxina 3 (PTX3) bajo condiciones adecuadas para formar un complejo PTX3/HA, (b) poner en contacto el complejo PTX3/HA con IaI y el gen-6 estimulado con factor de necrosis tumoral (TSG-6) y (c) poner en contacto el complejo PTX3/HA con una o más SLRPS. En el presente documento se proporcionan complejos rcHC-HA/PTX3 producidos mediante tal método. En algunas realizaciones, TSG-6 cataliza la transferencia de la cadena pesada 1 (HC1) de la inter-a-inhibidora (IaI) a HA. En algunas realizaciones, HC1 de IaI forma un enlace covalente con HA. En algunas realizaciones, las etapas (a), (b) y (c) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, las etapas (a), (b) y (c) del método se realizan simultáneamente. En algunas realizaciones, se realiza la etapa (a) del método y luego las etapas (b) y (c) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, se realiza la etapa (a) del método y luego las etapas (b) y (c) del método se realizan simultáneamente.
En algunas realizaciones, un método para generar complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos comprende (a) poner en contacto hialuronano de alto peso molecular inmovilizado (HMW HA) con IaI y TSG-6 a HA para formar un complejo HC-HA preunido a TSG- 6, (b) poner en contacto el complejo HC-HA con pentraxina 3 (PTX3) y (c) poner en contacto el complejo HC-HA con una o más SLRPS bajo condiciones adecuadas para formar un complejo rcHC-HA/PTX3. En el presente documento se proporcionan complejos rcHC-HA/PTX3 producidos mediante tal método. En algunas realizaciones, la HCl de IaI forma un enlace covalente con HA. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto un complejo HC-HA preunido a TSG-6 con PTX3. En algunas realizaciones, las etapas (a), (b) y (c) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, las etapas (a), (b) y (c) del método se realizan simultáneamente. En algunas realizaciones, se realiza la etapa (a) del método y luego las etapas (b) y (c) del método se realizan secuencialmente en orden. En algunas realizaciones, se realiza la etapa (a) del método y luego las etapas (b) y (c) del método se realizan simultáneamente.
En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre un SLRP de clase I, clase II o clase II. En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre las SLRP de clase I, tales como decorina y biglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase II, tales como fibromodulina, lumican, PRELP (proteína rica en leucina de extremo rico en arginina prolina), queratocán y osteoadherina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase III, tales como epipycan y osteoglicina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre bikunina, decorina, biglicano y osteoadherina. En algunas realizaciones, la pequeña proteína rica en leucina comprende un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina comprende queratán sulfato.
PTX3
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula o una pluralidad de células (por ejemplo, un extracto de tejido). Las células de ejemplo adecuadas para la expresión de PTX3 incluyen, pero no se limitan a, células animales que incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, células de primates, células humanas, células de roedores, células de insectos, bacterias y levaduras, y células vegetales, que incluyen, pero sin limitarse a, algas, angiospermas, gimnospermas, pteridofitas y briofitas. En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula humana. En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula del cordón umbilical se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula epitelial amniótica o la célula epitelial del cordón umbilical se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula estromal amniótica. En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos se aísla de una célula estromal del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula estromal amniótica o la célula estromal del cordón umbilical se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 para uso en los métodos es una proteína PTX3 nativa aislada de una célula. En algunas realizaciones, la célula se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 se prepara mediante tecnología recombinante. En algunas realizaciones, PTX3 se expresa a partir de un vector de expresión recombinante. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica PTX3 está operativamente enlazado a un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica PTX3 está operativamente enlazado a un promotor inducible. En algunas realizaciones, PTX3 se expresa en un animal transgénico. En algunas realizaciones, PTX3 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, PTX3 es una proteína recombinante aislada de una célula. En algunas realizaciones, PTX3 es una proteína recombinante producida en un extracto sin células.
En algunas realizaciones, PTX3 se purifica a partir de membrana amniótica, cordón umbilical, membrana amniótica del cordón umbilical, membrana coriónica, líquido amniótico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, PTX3 se purifica a partir de células de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de PTX3. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, PTX3 no se aísla de una célula o una pluralidad de células (por ejemplo, un extracto de tejido).
En algunas realizaciones, PTX3 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33 o una variante de la misma que tiene al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33. Las variantes de ejemplo incluyen, por ejemplo, variantes de especies, variantes alélicas y variantes que contienen mutaciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras. En algunas realizaciones, PTX3 comprende un fragmento de PTX3 suficiente para unirse a HA y facilitar la formación del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, PTX3 comprende Glul8 a Ser277 de PTX3 humana. Las variantes de PTX3 para uso en los métodos proporcionados incluyen variantes con una modificación de aminoácido que es un reemplazo (sustitución), deleción o inserción de aminoácidos. En algunas realizaciones, tal modificación mejora una o más propiedades de los polipéptidos PTX3, tal como mejorar una o más propiedades terapéuticas del complejo rcHC-HA/PTX3 (por ejemplo, antiinflamatorio, antiinmune, anti-angiogénico, anti-cicatrización, anti-adhesión, regeneración u otras actividades terapéuticas como se describe en este documento).
En algunas realizaciones, la proteína PTX3 se obtiene de una fuente comercial. Una fuente comercial de ejemplo de PTX3 es, pero no se limita a, PTX3 (número de catálogo 1826-TS; R&D Systems, Minneapolis, MN).
En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es una proteína multimérica. En algunas realizaciones, la proteína PTX3 utilizada en los métodos es un homomultímero. En algunas realizaciones, el homomultímero es un dímero, trímero, tetrámero, hexámero, pentámero u octámero. En algunas realizaciones, el homomultímero de PTX3 es un trímero, tetrámero u octámero. En realizaciones particulares, el homomultímero de PTX3 es un octámero. En algunas realizaciones, el dominio de multimerización se modifica para mejorar la multimerización de la proteína PTX3. En algunas realizaciones, el dominio de multimerización se reemplaza con un dominio de multimerización heterogéneo (por ejemplo, un dominio de multimerización de Fc o cremallera de leucina) que cuando se fusiona con PTX3 mejora la multimerización de PTX3.
TSG-6
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula o una pluralidad de células (por ejemplo, un extracto de tejido). Las células de ejemplo adecuadas para la expresión de tSG-6 incluyen, pero no se limitan a, células animales que incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, células de primates, células humanas, células de roedores, células de insectos, bacterias y levaduras, y células vegetales, incluyendo, pero sin limitarse a, algas, angiospermas, gimnospermas, pteridofitas y briófitas. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula humana. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula de membrana amniótica que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula del cordón umbilical. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula del cordón umbilical que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula epitelial amniótica o una célula epitelial del cordón umbilical que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula estromal amniótica. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula estromal del cordón umbilical. En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos se aísla de una célula estromal amniótica o una célula estromal del cordón umbilical que se estimula con una o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 para uso en los métodos es una proteína TSG-6 nativa aislada de una célula. En algunas realizaciones, la célula se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es lL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 se prepara mediante tecnología recombinante. En algunas realizaciones, TSG-6 se expresa a partir de un vector de expresión recombinante. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica TSG-6 está operativamente enlazado a un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica TSG-6 está operativamente enlazado a un promotor inducible. En algunas realizaciones, TSG-6 se expresa en un animal transgénico. En algunas realizaciones, TSG-6 es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, TSG-6 es una proteína recombinante aislada de una célula. En algunas realizaciones, TSG-6 es una proteína recombinante producida en un extracto sin células.
En algunas realizaciones, TSG-6 se purifica a partir de membrana amniótica, membrana amniótica, membrana coriónica, líquido amniótico o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, PTX3 se purifica a partir de células de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, la célula epitelial amniótica es una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma amniótico. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica es una célula del estroma del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula de la membrana amniótica se estimula con o más citoquinas proinflamatorias para sobrerregular la expresión de TSG-6. En algunas realizaciones, la citoquina proinflamatoria es IL-1 o TNF-a.
En algunas realizaciones, TSG-6 no se aísla de una célula o una pluralidad de células (por ejemplo, un extracto de tejido).
En algunas realizaciones, TSG-6 comprende un fragmento de TSG-6 que es suficiente para facilitar o catalizar la transferencia de HCl de IaI a HA. En algunas realizaciones, TSG-6 comprende el módulo de enlace de TSG-6. En algunas realizaciones, TSG-6 comprende los aminoácidos Trp18 a Leu277 de TSG-6. En algunas realizaciones, TSG-6 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2. Las variantes de ejemplo incluyen, por ejemplo, variantes de especies, variantes alélicas y variantes que contienen mutaciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras. Las variantes alélicas naturales de TSG-6 humano incluyen, por ejemplo, TSG-6 que contiene el aminoácido Q144R de reemplazo. Las variantes de TSG-6 o sus fragmentos de unión a HA para uso en los métodos proporcionados incluyen variantes con una modificación de aminoácidos que es un reemplazo (sustitución), deleción o inserción de aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha modificación mejora una o más propiedades de los polipéptidos TSG-6, tales como la transferencia mejorada de HCl de IaI a HA o la liberación mejorada del polipéptido t SG-6 del complejo rcHC-HA/PTX3 después de la transferencia de HCl de IaI a HA.
En algunas realizaciones, TSG-6 comprende una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta de hemaglutinina, una etiqueta de poli-histidina, una etiqueta myc, una etiqueta FLAG, una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST). Tales etiquetas de afinidad son bien conocidas en la técnica para uso en purificación. En algunas realizaciones, tal etiqueta de afinidad se incorpora al polipéptido TSG-6 como una proteína de fusión o mediante un enlazador químico. En algunas realizaciones, TSG-6 comprende una etiqueta de afinidad y el TSG-6 no unido se elimina del complejo rcHC-HA/PTX3 mediante purificación por afinidad.
En algunas realizaciones, la proteína TSG-6 se obtiene de una fuente comercial. Una fuente comercial de ejemplo para TSG-6 es, pero no se limita a, TSG-6 (número de catálogo 2104-TS R&D Systems, Minneapolis, MN).
IaI
De acuerdo con la invención, el IaI comprende una cadena de HCl y una de HC2. En algunas realizaciones, el IaI comprende una HCl y bikunina. En algunas realizaciones, el IaI comprende una cadena de HC1 y HC2 y bikunina. En algunas realizaciones, el IaI comprende una cadena de HC1 y HC2 y bikunina unida por una cadena de sulfato de condroitina.
En algunas realizaciones, IaI se aísla de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra biológica de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero, plasma, hígado, membrana amniótica, membrana coriónica o líquido amniótico. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de suero. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de plasma. En algunas realizaciones, el IaI se purifica a partir de sangre, plasma o suero humanos. En algunas realizaciones, IaI se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, IaI no se aísla del suero. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula de membrana amniótica. En algunas realizaciones, el IaI para uso en los métodos se produce en una célula del cordón umbilical. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula de membrana amniótica de un cordón umbilical. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula epitelial amniótica. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula epitelial del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el IaI para uso en los métodos se produce en una célula estromal amniótica. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula estromal del cordón umbilical. En algunas realizaciones, IaI para uso en los métodos se produce en una célula hepática. En algunas realizaciones, IaI se prepara mediante tecnología recombinante.
En algunas realizaciones, la HCl de IaI se aísla de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra biológica de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero, plasma, hígado, membrana amniótica, membrana coriónica o líquido amniótico. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de suero. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de plasma. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se purifica a partir de sangre, plasma o suero humanos. En algunas realizaciones, IaI se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, la HCl de IaI no se purifica del suero. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se prepara mediante tecnología recombinante. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se purifica a partir de células hepáticas. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se purifica a partir de células de la membrana amniótica. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se purifica a partir de células epiteliales amnióticas o células epiteliales del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la HC1 de IaI se purifica a partir de células estromales amnióticas o células estromales del cordón umbilical.
En algunas realizaciones, HC1 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47.
En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se aísla de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra biológica de un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un humano. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero, plasma, hígado, membrana amniótica, membrana coriónica o líquido amniótico. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre, suero o plasma. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de suero. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de plasma. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se purifica a partir de sangre, plasma o suero humanos. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se aísla del suero humano. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI no se aísla del suero sanguíneo. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se prepara mediante tecnología recombinante. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se purifica a partir de células hepáticas. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se purifica a partir de células de la membrana amniótica. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se purifica a partir de células epiteliales amnióticas o células epiteliales del cordón umbilical. En algunas realizaciones, la HC2 de IaI se purifica a partir de células estromales amnióticas o células estromales del cordón umbilical.
En algunas realizaciones, HC2 comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 49.
En algunas realizaciones, IaI comprende bikunina. En algunas realizaciones, la bikunina comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 53. En algunas realizaciones, IaI comprende una cadena de sulfato de condroitina. HA
En algunas realizaciones, el HA se purifica a partir de una célula, tejido o muestra de fluido. En algunas realizaciones, HA se obtiene de un proveedor comercial (por ejemplo, Sigma Aldrich o Advanced Medical Optics, Irvine, CA (por ejemplo, Healon)). En algunas realizaciones, el hA se obtiene de un proveedor comercial en forma de polvo. En algunas realizaciones, HA se expresa en una célula. Las células de ejemplo adecuadas para la expresión de HA incluyen, pero no se limitan a, células animales que incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, células de primates, células humanas, células de roedores, células de insectos, bacterias y levaduras, y células vegetales, que incluyen, pero no se limitan a, algas, angiospermas, gimnospermas, pteridofitas y briofitas. En algunas realizaciones, HA se expresa en una célula humana. En algunas realizaciones, HA se expresa en un animal transgénico. En algunas realizaciones, HA se obtiene de una célula que expresa una hialuronano sintasa (por ejemplo, HAS1, HAS2 y HAS3). En algunas realizaciones, la célula contiene un vector de expresión recombinante que expresa una HA sintasa. En ciertos casos, una HA sintasa alarga el hialuronano añadiendo repetidamente ácido glucurónico y N-acetilglucosamina al polisacárido naciente a medida que se extruye a través de la membrana celular hacia el espacio extracelular.
El HA para uso en los métodos es típicamente HA de alto peso molecular (HMW). En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso de hMw HA es mayor que aproximadamente 500 kilodaltons (kDa), tal como, por ejemplo, entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 10,000 kDa, entre aproximadamente 800 kDa y aproximadamente 8,500 kDa, entre aproximadamente 1100 kDa. y aproximadamente 5,000 kDa, o entre aproximadamente 1400 kDa y aproximadamente 3,500 kDa. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso de HMW HA es de aproximadamente 3000 kDa.
Componentes adicionales
En algunas realizaciones, se añaden uno o más componentes adicionales para generar un complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se añade un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP) para generar un complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la SLRP es un SLRP de clase I, clase II o clase II. En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre las SLRP de clase I, tales como decorina y biglicano. En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre las SLRP de clase II, tales como fibromodulina, lumican, PRELP (proteína rica en leucina de extremo rico en arginina prolina), queratocán y osteoadherina. En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre las SLRP de clase III, tales como epipycan y osteoglicina. En algunas realizaciones, la SLRP se selecciona de entre bikunina, decorina, biglicano y osteoadherina. En algunas realizaciones, la SLRP comprende un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, la SLRP comprende queratán sulfato.
Inmovilización de HA
En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza en un soporte sólido, tal como una placa de cultivo, una cuenta, una columna u otras superficies adecuadas, tal como, por ejemplo, una superficie de un dispositivo médico implantable o una porción del mismo o sobre una superficie que es subsecuentemente conectada o combinada con un dispositivo médico implantable como se describe en este documento. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza directamente en el soporte sólido, por ejemplo, mediante enlace químico. En algunas realizaciones, HMW HA se une indirectamente al soporte sólido a través de un enlazador o una proteína intermediaria. Los expertos en esta técnica conocen numerosos reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales que se usan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en proteínas. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza directamente al soporte sólido mediante entrecruzamiento con el soporte sólido. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza directamente en el soporte sólido sin entrecruzarse con el soporte sólido. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza directamente al soporte sólido como un recubrimiento. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza en una superficie Covalink™-NH. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza directamente al soporte sólido como un recubrimiento. En algunas realizaciones, HMW HA se inmoviliza en una superficie Covalink™-NH durante aproximadamente 16 ha 4°C.
En algunas realizaciones, el método comprende inmovilizar HMW HA en una superficie sólida mediante un enlace directo a un soporte sólido (es decir, sin una proteína intermediaria). En algunas realizaciones, el soporte sólido se lava para eliminar HMW HA no unido antes de poner en contacto el HA inmovilizado con PTX3. En algunas realizaciones, el soporte sólido se lava con lavados de GnHC1 8 M y PBS para eliminar HMW HA no unido antes de poner en contacto el HA inmovilizado con PTX3.
En algunas realizaciones, el método comprende inmovilizar HA en una superficie sólida mediante una proteína intermediaria o un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador peptídico. En algunas realizaciones, la proteína intermediaria es una proteína de unión a HA (HABP). En algunas realizaciones, HABP se une primero a un soporte sólido (por ejemplo, mediante entrecruzamiento, enlace químico o mediante un enlazador químico). En algunas realizaciones, el soporte sólido que comprende HABP luego se pone en contacto con HA (por ejemplo, HMW HA) para inmovilizar HA al soporte sólido mediante la unión de HABP a HA. En algunas realizaciones, el soporte sólido se lava para eliminar HMW HA no unido antes de poner en contacto e1HMW HA inmovilizado con pTX3. En algunas realizaciones, el soporte sólido se lava con lavados de GnHC1 8 M y PBS para eliminar HMW HA no unido antes de poner en contacto el HA inmovilizado con PTX3.
En algunas realizaciones, el método comprende inmovilizar HA en una superficie sólida mediante la unión de un enlazador peptídico al soporte sólido y unir HA al enlazador peptídico. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico comprende un sitio de escisión de proteasa.
En algunas realizaciones, el método comprende inmovilizar HA en una superficie sólida mediante la unión de un enlazador químico escindible, tal como, pero sin limitarse a, un enlazador químico disulfuro.
En algunas realizaciones, la HABP seleccionada para uso en los métodos es una HABP que se disocia de HA tras la formación del complejo rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la HABP se une de forma no covalente a HA. En algunas realizaciones, el método comprende además disociar el complejo rcHC-HA/PTX3 de HABP usando uno o más agentes de disociación. Se conocen en la técnica agentes disociantes para la ruptura de interacciones no covalentes (por ejemplo, clorhidrato de guanidina, urea y diversos detergentes, por ejemplo, SDS). En algunas realizaciones, el agente de disociación es urea. En algunas realizaciones, el agente de disociación es clorhidrato de guanidina. En algunas realizaciones, el agente de disociación es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M de guanidina-HCl. En algunas realizaciones, el agente de disociación es aproximadamente 4 M, aproximadamente 5 M, aproximadamente 6 M, aproximadamente 7 M, aproximadamente 8 M de guanidina-HCl. En algunas realizaciones, el agente de disociación es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M de guanidina-HCl en PBS a pH 7.5.
En algunas realizaciones, tales agentes de disociación se emplean para disociar el complejo rcHC-HA/PTX3 de una HABP intermediaria. Una HABP para uso en los métodos se selecciona típicamente de tal manera que la afinidad de unión por HA sea lo suficientemente fuerte como para permitir el ensamblaje del complejo rcHC-HA/PTX3 pero se disocie del complejo rcHC-HA/PTX3 con un agente de disociación adecuado. En algunas realizaciones, el agente de disociación es clorhidrato de guanidina.
Las HABP de ejmplo para uso con los métodos proporcionados en este documento incluyen, pero no se limitan a, HAPLN1, HAp Ln2, Ha PLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6 , CD44, estabilina-1 , estabilina-2 o porciones de las mismas (por ejemplo, módulos de enlace de la misma) suficientes para unir HA. En algunas realizaciones, la HABP comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 54-99 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 54-99. En algunas realizaciones, la HABP es versicano. En algunas realizaciones, la HABP es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la HABP es una proteína de mamífero recombinante. En algunas realizaciones, la HABP es una proteína humana recombinante. En algunas realizaciones, la HABP es una proteína versicana recombinante o una porción de la misma suficiente para unirse a HA. En algunas realizaciones, la HABP es una proteína agrecano recombinante o una porción de la misma suficiente para unirse a HA. En algunas realizaciones, la HABP es una HABP nativa o una porción de la misma suficiente para unirse a HA. En algunas realizaciones, la HABP nativa se aísla de tejido o células de mamífero. En algunas realizaciones, la HABP se aísla del cartílago nasal bovino (por ejemplo, HABP de Seikagaku que contiene los dominios de unión a HA del agrecano y la proteína de enlace).
En algunas realizaciones, la HABP comprende un módulo de enlace de HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6 , CD44, estabilina-1 o estabilina-2. En algunas realizaciones, la HABP que comprende un módulo de enlace comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de los dominios de enlace de la SEQ ID NOS: 54-99 o un polipéptido que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia establecida en cualquiera de los dominios de enlace de la SEQ ID NOS: 54-99. En algunas realizaciones, la HABP comprende un módulo de enlace de versicano. En algunas realizaciones, la HABP que comprende un módulo de enlace es una proteína recombinante. En algunas realizaciones, la HABP que comprende un módulo de enlace de versicano es una proteína recombinante.
En algunas realizaciones, la o proteína intermediaria, tal como una HABP, contiene una secuencia de escisión proteolítica que es reconocida por e hidrolizada por una proteasa específica de sitio, tal como furina, proteasa 3C, caspasa, metaloproteinasa de matriz o proteasa TEV. En tales realizaciones, los complejos rcHC-HA/PTX3 ensamblados se liberan del soporte sólido poniendo en contacto los complejos inmovilizados con una proteasa que escinde la secuencia de escisión específica.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica. En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica mediante cualquier método adecuado o combinación de métodos. Las realizaciones descritas a continuación no pretenden ser exclusivas, solo a manera de ejemplo.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, exclusión de tamaño y cromatografía de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación (por ejemplo, centrifugación en gradiente) o solubilidad diferencial, precipitación con etanol o mediante cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad. En algunas realizaciones, se generan anticuerpos contra un componente del complejo rcHC-HA/PTX3 (por ejemplo, anti-HCl, anti-PTX, un anticuerpo contra una o más SLRP del complejo rcHC-HA/PTX3, por ejemplo, anti-bikunina, anti-decorina, anti-biglicano o anti-osteoadherina) y fijada a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 no purificado (es decir, la fase móvil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo rcHC-HA/PTX3 se une a los anticuerpos. En algunas realizaciones, el soporte se lava (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molécula no unida o unida suelta. En algunas realizaciones, el soporte se lava luego con una solución que permite la elución del complejo rcHC-HA/PTX3 del soporte (por ejemplo, SDS al 1%, guanidina-HCl 6 M o urea 8 M). En algunas realizaciones, el agente de disociación se elimina del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado. En algunas realizaciones, el agente disociante se elimina del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado mediante un método que incluye, pero no se limita a, cromatografía de intercambio iónico, diálisis, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración o diafiltración.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica mediante cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, se emplea una HABP para unirse al complejo rcHC-HA/PTX3 para la purificación del complejo y se fija a un soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 no purificado (es decir, la fase móvil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo rcHC-HA/PTX3 se une a la HABP. En algunas realizaciones, el soporte se lava (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molécula no unida o unida suelta. En algunas realizaciones, el soporte luego se lava con una solución (por ejemplo, un agente disociante) que permite la elución del complejo rcHC-HA/PTX3 del soporte. En algunas realizaciones, el agente disociante se elimina del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado mediante un método que incluye, pero no se limita a, cromatografía de intercambio iónico, diálisis, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración o diafiltración.
En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 se purifica mediante una combinación de cromatografía de afinidad HABP y cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos contra uno o más componentes del complejo rcHC-HA/PTX3.
En algunas realizaciones, uno o más componentes del complejo rcHC-HA/PTX3 aquí divulgado comprenden una etiqueta de afinidad (por ejemplo, una proteína de fusión de PTX3 o HC1 con una etiqueta de afinidad). Las etiquetas de afinidad de ejemplo que se incorporan en uno o más componentes del complejo rcHC-HA/PTX3 en algunas realizaciones incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta de hemaglutinina, poli-histidina, una etiqueta myc, una etiqueta FLAG o secuencia de glutatión-S-transferasa. En algunas realizaciones, el ligando para la etiqueta de afinidad se fija al soporte sólido. En algunas realizaciones, el complejo rcHC-HA/PTX3 no purificado se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo rcHC-HA/PTX3 se une al ligando. En algunas realizaciones, el soporte se lava (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molécula unida suelta o no unida. En algunas realizaciones, el soporte se lava luego con una solución que permite la elución de un complejo rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento del soporte. En algunas realizaciones, el agente de elución se elimina del complejo rcHC-HA/PTX3 disociado mediante un método que incluye, pero no se limita a, cromatografía de intercambio iónico, diálisis, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración o diafiltración.
En algunas realizaciones, la PTX3, TSG-6 y/o HC1 se conjugan con un marcador. Un "marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con un polipéptido para generar un polipéptido marcado. En algunas realizaciones, el marcador es detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, cataliza la alteración química de una composición de compuesto de sustrato que es detectable. Ejemplos no limitantes de marcadores incluyen unidades estruturales fluorogénicas, tintes, etiquetas fluorescentes, proteína verde fluorescente o luciferasa.
Métodos para evaluar la actividad de los complejos nHC-HA/PTX3 y rcHC-HA/PTX3
Las propiedades de los complejos nHC-HA/PTX3 y rcHC-HA/PTX3 proporcionados en este documento se evalúan mediante cualquier método adecuado, incluidos los métodos in vitro e in vivo. En este documento se proporcionan ejemplos de métodos in vitro e incluyen, per no se limitan a, métodos de cultivo celular que evalúan la capacidad de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 para promover la unión de macrófagos a los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inmovilizados, para inhibir o reducir la agregación de macrófagos, promover la apoptosis de neutrófilos, fagocitosis de macrófagos de neutrófilos apoptóticos y polarización M2 de macrófagos estimulados. En algunas realizaciones, los macrófagos usados en el ensayo se estimulan, tal como por exposición a LPS o IFN-y. En algunas realizaciones, la expresión de genes o proteínas en macrófagos estimulados se evalúa después del contacto con complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En tales métodos de evaluación de la actividad del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3, se emplea un control adecuado para la comparación. En algunas realizaciones, el control es la ausencia de tratamiento con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 (es decir, un control negativo).
En algunas realizaciones, la actividad de un complejo rcHC-HA/PTX3 se compara con la actividad de un complejo HC-HA/PTX3 nativo. En algunas realizaciones, el HC-HA/PTX3 nativo se aísla de la membrana amniótica.
En algunas realizaciones, la expresión génica en macrófagos tratados se evalúa mediante PCR, RT-PCR, transferencia Northern, transferencia Western, transferencia de mancha, inmunohistoquímica, cromatografía u otro método adecuado para detectar proteínas o ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, se evalúa el nivel de expresión de IL-10, IL-12, IL23, LIGHT y SPHK1.
Los métodos in vitro de ejemplo para evaluar la actividad de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionados en este documento incluyen, pero no se limitan, a modelos animales de diversas enfermedades y afecciones. Hay una variedad de modelos animales disponibles y bien conocidos en la técnica para enfermedades y afecciones, que incluyen, pero no se limitan a, modelos animales (por ejemplo, modelos de roedores y primates) para diversas enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunes que incluyen, pero no se limitan a, lesión por isquemia-reperfusión, diabetes tipo 1 y tipo 2 , enfermedades inflamatorias, artritis inducida por colágeno, artritis reumatoide, enfermedad autoinmune inducida por antígenos tal como artritis inducida por colágeno y encefalomielitis alérgica experimental inducida por péptido de mielina, enfermedad inflamatoria intestinal (EII)/colitis ulcerosa, esclerosis, osteoartritis y nefritis inducidas quirúrgicamente, psoriasis, enfermedades inflamatorias de la piel, choque endotóxico inducido por LPS, lesión pulmonar inducida por LPS, rinitis alérgica, lesión hepática, estrés crónico, asma y modelos de xenoinjerto y aloinjerto para diversos cánceres.
En algunas realizaciones, el modelo animal es un modelo de inflamación de roedor tal como enfermedad de injerto contra huésped crónica (cGVHD), queratitis estromal necrotizante inducida por HSV1 o trasplante de córnea de alto riesgo. En algunas realizaciones, la reducción de la inflamación por el tratamiento con nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se evalúa midiendo la proliferación y activación de células T y la producción de citoquinas inmunes tales como IL-1 a, IL-2, IL- 6 , IFN-y y TNF-a. En algunas realizaciones, el modelo animal es un modelo de roedor de cicatrización tal como la queratectomía fotorrefractiva asistida por láser de excímero (PRK). Los métodos de ejemplo para uso de tales modelos animales se proporcionan en los Ejemplos proporcionados en este documento.
En algunas realizaciones, el modelo animal es un modelo genético de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunitarios que contiene una o más modificaciones genéticas que causan la enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, tales modelos se obtienen de una fuente comercial. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en este documento se administra a un modelo animal de una enfermedad o afección particular y se evalua la capacidad del complejo rcHC-HA/PTX3 para inhibir o reducir uno o más síntomas de la enfermedad o afección.
Composiciones farmacéuticas
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descritos en el presente documento. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 producidos mediante los métodos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que incluyen excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en preparaciones que son adecuadas para uso farmacéutico. La formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada. Cualquiera de las técnicas, vehículos y excipientes bien conocidos se puede usar según sea adecuado y como se entiende en la técnica.
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga una composición farmacéutica que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un adyuvante, excipiente, conservante, agente para retrasar la absorción, agente de relleno, aglutinante, adsorbente, regulador y/o agente solubilizante. Las composiciones farmacéuticas de ejemplo que están formuladas para contener un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en este documento incluyen, pero no se limitan a, una solución, suspensión, emulsión, jarabe, gránulo, polvo, pomada, tableta, cápsula, píldora o aerosol.
Formas de dosificación
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra como una suspensión acuosa. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende agua, solución de Ringer y/o solución isotónica de cloruro de sodio. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un agente edulcorante o saborizante, colorantes o tintes y, si se desea, agentes emulsionantes o agentes de suspensión, junto con diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un agente de suspensión. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y/o goma arábiga. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un agente dispersante o humectante. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un fosfátido de origen natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetileno- oxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un conservante. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende un agente edulcorante. En algunas realizaciones, una suspensión acuosa comprende sacarosa, sacarina o aspartamo.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra como una suspensión oleosa. En algunas realizaciones, se formula una suspensión oleosa suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en aceite mineral (por ejemplo, parafina líquida). En algunas realizaciones, una suspensión oleosa comprende un agente espesante (por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico). En algunas realizaciones, una suspensión oleosa comprende agentes edulcorantes (por ejemplo, los expuestos anteriormente). En algunas realizaciones, una suspensión oleosa comprende un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado o alfa-tocoferol).
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula para inyección parenteral (por ejemplo, mediante inyección o infusión, incluyendo intraarterial, intracardíaca, intradérmica, intraduodenal, intramedular, intramuscular, intraósea, intraperitoneal, intratecal, intravascular, intravenosa, intravítrea, epidural y/o subcutánea). En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra como una solución, suspensión o emulsión estéril.
En algunas realizaciones, una formulación para administración parenteral incluye soluciones inyectables estériles acuosas y/o no acuosas (aceitosas) de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento, que en algunas realizaciones contienen antioxidantes, reguladores, bacteriostáticos y/o solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y/o suspensiones estériles acuosas y/o no acuosas que, en algunas realizaciones, incluyen un agente de suspensión y/o un agente espesante. En algunas realizaciones, una formulación para administración parenteral incluye estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra como una microemulsión de aceite en agua donde el ingrediente activo se disuelve en la fase oleosa. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se disuelve en un aceite graso (por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos (por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas). En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se disuelve en una mezcla de aceite de soja y/o lecitina. En algunas realizaciones, la solución de aceite se introduce en una mezcla de agua y glicerol y se procesa para formar una microemulsión.
En algunas realizaciones, una composición formulada para administración parenteral se administra como una sola inyección de bolo. En algunas realizaciones, una composición formulada para administración parenteral se administra mediante un dispositivo de administración intravenosa continua (por ejemplo, bomba intravenosa Deltec CADD-PLUS™ modelo 5400).
En algunas realizaciones, una formulación para inyección se presenta en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. En algunas realizaciones, una formulación para inyección se almacena en forma de polvo o en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina o agua estéril libre de pirógenos, inmediatamente antes de su uso.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula para administración tópica. Las formulaciones tópicas incluyen, pero no se limitan a, ungüentos, cremas, lociones, soluciones, pastas, geles, películas, barras, liposomas, nanopartículas. En algunas realizaciones, se administra una formulación tópica mediante el uso de un parche, vendaje o apósito para heridas.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula como una composición en forma de un sólido, un gel entrecruzado o un liposoma. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula como un hidrogel entrecruzado insoluble.
En algunas realizaciones, una formulación tópica comprende un agente gelificante (o espesante). Los agentes gelificantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, celulosas, derivados de celulosa, éteres de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa), goma guar, goma de xantano, goma de algarrobo, alginatos (por ejemplo, ácido algínico), silicatos, almidón, tragacanto, polímeros de carboxivinilo, carragenina, parafina, vaselina, acacia (goma arábiga), agar, silicato de aluminio y magnesio, alginato de sodio, estearato de sodio, alga negra común, bentonita, carbómero, carragenina, carbopol, xantano, celulosa, celulosa microcristalina (MCC), ceratonia, chondrus, dextrosa, furcelaran, gelatina, goma ghatti, goma guar, hectorita, lactosa, sacarosa, maltodextrina, manitol, sorbitol, miel, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de sterculia, polietilenglicol (por ejemplo, PEG 200-4500), goma de tragacanto, etilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, etilmetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxietilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, poli(metacrilato de hidroxietilo), oxipoligelatina, pectina, poligelina, povidona, carbonato de propileno, copolímero de metilviniléter/anhídrido maleico (PVM/AM), poli(metacrilato de metoxietilietilo), poli(metacrilato de metoxietoxietilo), hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa de sodio (CMC), dióxido de silicio, polivinilpirrolidona (PVP: povidona), o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una formulación tópica divulgada en este documento comprende un emoliente. Los emolientes incluyen, pero no se limitan a, ésteres de aceite de ricino, ésteres de manteca de cacao, ésteres de aceite de cártamo, ésteres de aceite de semilla de algodón, ésteres de aceite de maíz, ésteres de aceite de oliva, ésteres de aceite de hígado de bacalao, ésteres de aceite de almendras, ésteres de aceite de aguacate, ésteres de aceite de palma, ésteres de aceite de sésamo, ésteres de escualeno, ésteres de aceite de kikui, ésteres de aceite de soja, monoglicéridos acetilados, monoestearato de glicerilo etoxilado, laurato de hexilo, laurato de isohexilo, palmitato de isohexilo, palmitato de isopropilo, palmitato de metilo, deciloleato, isodecil oleato, estearato de hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, isoestearato de metilo, adipato de diisopropilo, adipato de diisohexilo, adipato de dihexildecilo, sebacato de diisopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo y lactato de cetilo, miristato de oleilo, estearato de oleilo y oleato de oleilo, ácido pelargónico, ácido láurico, ácido miristico ácido palmítico, ácido esteárico, ácido isoesteárico, ácido hidroxiesteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido ricinoleico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido erúcico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico, alcohol hexadecílico, alcohol estearílico, alcohol isoestearílico, alcohol hidroxiestearílico, alcohol oleílico, alcohol ricinoleílico, alcohol behenílico, alcohol erucílico, alcohol 2 -octil dodecanílico, lanolina y derivados de la lanolina, cera de abejas, espermaceti, miristato miristílico, cera estearílica, cera de carnauba, cera de candelilla, lecitina y colesterol.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con uno o más polímeros naturales. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se formula con un polímero natural que es fibronectina, colágeno, laminina, queratina, fibrina, fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparán, sulfato de condroitina. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un gel de polímero formulado a partir de un polímero natural. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un gel de polímero formulado a partir de un polímero natural, tal como, pero no limitado a, fibronectina, colágeno, laminina, queratina, fibrina, fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparán, sulfato de condroitina y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un polímero entrecruzado. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un polímero no entrecruzado. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un polímero no entrecruzado y un polímero entrecruzado. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con gel de hialuronano entrecruzado. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con un hidrogel de HA entrecruzado insoluble. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se formula con gel de hialuronano no entrecruzado. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con una matriz de colágeno. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con una matriz de fibrina. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula con una matriz de fibrina/colágeno.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula para su administración a un ojo o un tejido relacionado con el mismo. Las formulaciones adecuadas para la administración a un ojo incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones (por ejemplo, una suspensión acuosa), ungüentos, geles, cremas, liposomas, niosomas, farmacosomas, nanopartículas o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para la administración tópica a un ojo se administra mediante aspersión, lavado o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra a un ojo mediante una preparación de depósito inyectable.
Como se usa en este documento, una "preparación de depósito" es una formulación de liberación controlada que se implanta en un ojo o en un tejido relacionado con el mismo (por ejemplo, la esclerótica) (por ejemplo, subcutáneamente, intramuscularmente, intravítreamente o dentro de la subconjuntiva). En algunas realizaciones, una preparación de depósito se formula formando matrices microencapsuladas (también conocidas como matrices microencapsuladas) de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento en polímeros biodegradables. En algunas realizaciones, una preparación de depósito se formula atrapando un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento en liposomas o microemulsiones.
Una formulación para administración ocular tiene una tonicidad oftálmicamente aceptable. En ciertos casos, el líquido lagrimal tiene un valor de isotonicidad equivalente al de una solución de cloruro de sodio al 0.9%. En algunas realizaciones, un valor de isotonicidad de aproximadamente 0.6 % a aproximadamente 1.8 % de equivalencia de cloruro de sodio es adecuado para la administración tópica en el ojo. En algunas realizaciones, una formulación para la administración a un ojo divulgada en el presente documento tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 mOsm/L. En algunas realizaciones, una formulación para la administración a un ojo divulgada en el presente documento es hipotónica y, por tanto, requiere la adición de cualquiera adecuado para alcanzar el rango de tonicidad apropiado. Las sustancias oftálmicamente aceptables que modulan la tonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, tiosulfato de sodio, bisulfito de sodio y sulfato de amonio.
Una formulación para administración ocular tiene una claridad oftálmicamente aceptable. Ejemplos de agentes clarificantes oftálmicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 20 , polisorbato 80 o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una formulación para la administración ocular comprende un potenciador de la viscosidad oftálmicamente aceptable. En algunas realizaciones, un potenciador de la viscosidad aumenta el tiempo que una formulación divulgada en este documento permanece en el ojo. En algunas realizaciones, aumentar el tiempo que una formulación divulgada en este documento permanece en el ojo permite una mayor absorción y efecto del fármaco. Ejemplos no limitantes de polímeros mucoadhesivos incluyen carboximetilcelulosa, carbómero (polímero de ácido acrílico), poli(metilmetacrilato), poliacrilamida, policarbofilo, copolímero de ácido acrílico/acrilato de butilo, alginato de sodio y dextrano.
En algunas realizaciones, una formulación para la administración a un ojo se administra o suministra a los segmentos posteriores de un ojo (por ejemplo, a la retina, coroides, vítreo y nervio óptico). En algunas realizaciones, una formulación tópica para la administración a un ojo divulgada en este documento para su suministro a la parte posterior del ojo comprende un agente solubilizante, por ejemplo, un sulfato de glucano y/o una ciclodextrina. Los sulfatos de glucano que se usan en algunas realizaciones incluyen, pero no se limitan a, sulfato de dextrano, sulfato de ciclodextrina y sulfato de p-1,3-glucano, tanto naturales como derivados de los mismos, o cualquier compuesto que se una temporalmente a y sea retenido en tejidos que contienen factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), que mejora la estabilidad y/o solubilidad de un fármaco, y/o que mejora la penetración y la absorción oftálmica de una formulación tópica para la administración a un ojo divulgada en este documento. Los derivados de ciclodextrina que se usan en algunas realizaciones como agente solubilizante incluyen, pero no se limitan a, a-ciclodextrina, pciclodextrina, Y-ciclodextrina, hidroxietil p-ciclodextrina, hidroxipropil Y-ciclodextrina, hidroxipropil p-ciclodextrina, aciclodextrina sulfatada, p-ciclodextrina sulfatada, sulfobutil éter p-ciclodextrina.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se formula para administración rectal o vaginal. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra como supositorio. En algunas realizaciones, se prepara una composición adecuada para administración rectal mezclando un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto, se funden en el recto para liberar el fármaco. En algunas realizaciones, una composición adecuada para administración rectal se prepara mezclando un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento con manteca de cacao, gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de polietilenglicoles de diversos pesos moleculares o ésteres de ácidos grados de polietilenglicol.
En ciertas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se incorpora opcionalmente dentro de partículas de liberación controlada, complejos lipídicos, liposomas, nanopartículas, microesferas, micropartículas, nanocápsulas u otros agentes que potencian o facilitan la administración localizada a la piel. Un ejemplo de un proceso de microencapsulación convencional para preparaciones farmacéuticas se describe en la patente U.S. 3,737,337, incorporada aquí como referencia para tal divulgación.
Dosificación
La cantidad de composiciones farmacéuticas administradas depende en parte del individuo que se va a tratar. En los casos en que las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto humano, la dosificación diaria la determinará normalmente el médico que prescribe con la dosificación que variará generalmente de acuerdo con la edad, el sexo, la dieta, el peso, la salud general y la respuesta del individuo, la gravedad de los síntomas del individuo, la enfermedad o afección precisa que se está tratando, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando, el momento de administración, la vía de administración, la disposición de la composición, la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la discreción del médico que prescribe.
En algunas realizaciones, la dosificación de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 está entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento está en el rango de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 7 g/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 7 g/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento es de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 5 g/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento es de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 2.5 g/día. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 g/día.
En algunas realizaciones, se administra un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento, antes, durante o después de la aparición de una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, se administra una terapia de combinación antes, durante o después de la aparición de una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra con una terapia de combinación antes, durante o después de la aparición de una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, el momento de administración de la composición que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento varía. Por lo tanto, en algunos ejemplos, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como profiláctico y se administra de forma continua a sujetos con propensión a desarrollar afecciones o enfermedades con el fin de prevenir la aparición de la enfermedad o condición. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto durante o tan pronto como sea posible después del inicio de los síntomas. En algunas realizaciones, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se inicia dentro de las primeras 48 horas desde el inicio de los síntomas, preferiblemente dentro de las primeras 48 horas desde el inicio de los síntomas, más preferiblemente dentro de las primeras 6 horas del inicio de los síntomas, y lo más preferiblemente dentro de las 3 horas del inicio de los síntomas. En algunas realizaciones, la administración inicial es a través de cualquier vía práctica, tal como, por ejemplo, una inyección intravenosa, una inyección en bolo, una infusión durante 5 minutos a aproximadamente 5 horas, una píldora, una cápsula, un parche transdérmico, administración bucal o una combinación. del mismo. Un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra preferiblemente tan pronto como sea posible después de que se detecte o sospeche la aparición de una enfermedad o afección, y durante un período de tiempo necesario para el tratamiento de la enfermedad. tal como, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 3 meses. En algunas realizaciones, la duración del tratamiento varía para cada sujeto y la duración se determina utilizando los criterios conocidos. En algunas realizaciones, se administra un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento o una formulación que contiene un complejo durante al menos 2 semanas, preferiblemente de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 5 años, y más preferiblemente de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 años.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra en una sola dosis, una vez al día. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra en múltiples dosis, más de una vez al día. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra tres veces al día. En algunas realizaciones, se administra un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 cuatro veces al día. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra más de cuatro veces al día.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, en algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un individuo que ya padece una enfermedad o afección, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad o condición. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad y el curso de la enfermedad o afección, la terapia previa, el estado de salud del individuo, el peso y la respuesta a los medicamentos, y el criterio del médico tratante.
En aplicaciones profilácticas, en algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un individuo que está en riesgo de padecer un trastorno particular. Tal cantidad se define como una "cantidad o dosis profilácticamente eficaz". En tal uso, las cantidades precisas también dependen del estado de salud, peso y otros parámetros físicos del individuo.
En el caso en el que la condición del individuo no mejore, a discreción del médico, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administrará de forma crónica, es decir, durante un período de tiempo prolongado, incluso durante la duración de la vida de la persona con el fin de mejorar o de otra manera controlar o limitar los síntomas de la enfermedad o condición de la persona.
En algunas realizaciones, en los casos en los que el estado del individuo mejora, a discreción del médico, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra de forma continua o la dosis de fármaco que se administra se reduce o se suspende temporalmente un cierto período de tiempo (es decir, un "descando de fármacos"). En algunas realizaciones, la duración del descanso de fármacos varía entre 2 días y 1 año, incluyendo solo a modo de ejemplo, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días, 15 días, 20 días, 28 días, 35 días, 50 días, 70 días, 100 días, 120 días, 150 días, 180 días, 200 días, 250 días, 280 días, 300 días, 320 días, 350 días o 365 días. En algunas realizaciones, la reducción de la dosis durante un descanso de fármacos es del 10% al 100%, incluyendo, solo a modo de ejemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.
Una vez que se ha producido la mejora de las condiciones del individuo, se administra una dosis de mantenimiento si es necesario. En algunas realizaciones, posteriormente, la dosificación o la frecuencia de administración, o ambas, se reduce, como una función de los síntomas, hasta un nivel en el que se conserva la enfermedad, trastorno o afección mejorada. En algunas realizaciones, los individuos requieren un tratamiento intermitente a largo plazo ante cualquier recurrencia de los síntomas.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica descrita en este documento está en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas. En forma de dosificación unitaria, la formulación se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento. En algunas realizaciones, la dosificación unitaria está en forma de paquete que contiene cantidades discretas de la formulación. Son ejemplos no limitantes las tabletas o cápsulas empaquetadas y los polvos en viales o ampollas. En algunas realizaciones, las composiciones de suspensión acuosa se empacan en recipientes de dosis única que no se pueden volver a cerrar. En algunas realizaciones, se utilizan recipientes que se pueden volver a cerrar de dosis múltiples, en cuyo caso es típico incluir un conservante en la composición. En algunas realizaciones, las formulaciones para inyección parenteral se presentan en forma de dosificación unitaria, que incluyen, pero no se limitan a, ampollas, o en recipientes multidosis, con un conservante añadido.
Las dosificaciones diarias apropiadas para un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento son, por ejemplo, de aproximadamente 0.01 a 2.5 mg/kg por peso corporal. Una dosificación diaria indicada en el mamífero más grande, que incluye, pero no se limita a, humanos, está en el rango de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 100 mg, administrada convenientemente en dosis divididas, que incluyen, pero no se limitan a, hasta cuatro veces al día o en forma de liberación extendida. Las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen de aproximadamente 1 a 50 mg de ingrediente activo. Los rangos anteriores son meramente sugestivos, ya que el número de variables con respecto a un régimen de tratamiento individual es grande y no son infrecuentes desviaciones considerables de estos valores recomendados. En algunas realizaciones, las dosis se alteran dependiendo de una serie de variables, no limitadas a la actividad de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 utilizado, la enfermedad o afección que se va a tratar, el modo de administración, los requisitos del sujeto individual, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando y el juicio del médico.
En algunas realizaciones, la toxicidad y la eficacia terapéutica de tales regímenes terapéuticos se determinan mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, que incluyen, pero no se limitan a, la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). En algunas realizaciones, la relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se expresa como la relación entre LD50 y ED50. Se prefieren los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que exhiben altos índices terapéuticos. En algunas realizaciones, los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se utilizan para formular un rango de dosis para uso en humanos. La dosificación de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con mínima toxicidad. En algunas realizaciones, la dosificación varía dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se empacan como artículos de fabricación que contienen material de empacado, una composición farmacéutica que es eficaz para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad o afección, y una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se utilizará para tratar la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se empacan en formas de dosificación unitaria que contienen una cantidad de la composición farmacéutica para una dosis única o dosis múltiples. En algunas realizaciones, las composiciones empacadas contienen un polvo liofilizado de las composiciones farmacéuticas, que se reconstituye (por ejemplo, con agua o solución salina) antes de la administración.
Composiciones de biomateriales y dispositivos médicos
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se ensambla directamente sobre una superficie o se formula como un recubrimiento para un dispositivo médico implantable. Los métodos para la unión covalente de hialuronano a superficies tales como, pero no limitados a, superficies metálicas, poliméricas, cerámicas, de sílica y de material compuesto son bien conocidos en la técnica y, en algunas realizaciones, se emplean junto con los métodos proporcionados en este documento para el ensamblaje. de complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 sobre tales superficies (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. No.
5,356,433; 5,336,518, 4,613,665, 4,810,784, 5,037,677, 8,093,365). En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se ensambla directamente sobre una superficie de un dispositivo médico implantable o una parte del mismo. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que ha sido generado de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento se purifica y luego se une directamente sobre una superficie de un dispositivo médico implantable o una parte del mismo. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que ha sido generado de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento se purifica y luego se formula como un recubrimiento para su fijación al dispositivo médico o una parte del mismo. En algunas realizaciones, el recubrimiento se aplica directamente a las superficies o se aplica a una superficie pretratada o recubierta donde el pretratamiento o recubrimiento está diseñado para ayudar a la adhesión del recubrimiento al sustrato. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que ha sido generado de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento se purifica y luego se une a un dispositivo médico o una parte del mismo que ha sido recubierto con una sustancia que promueve la unión del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dispositivo médico o una parte del mismo se recubre con un polímero adhesivo que proporciona grupos funcionales en su superficie para la unión covalente de hialuronano del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, se emplea un agente de acoplamiento, tal como, pero sin limitarse a, carbodiimida para unir el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 al recubrimiento de polímero. En algunas realizaciones, la fotoinmovilización se emplea para unir covalentemente un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que ha sido generado de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento al dispositivo médico o una parte del mismo. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que ha sido generado de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento se une a un dispositivo médico o una parte del mismo utilizando una molécula espaciadora que comprende un grupo reactivo fotoquímica o termoquímicamente.
En algunas realizaciones, las formulaciones de recubrimiento que comprenden un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplican al sustrato mediante, por ejemplo, recubrimiento por inmersión. Otros métodos de aplicación incluyen, pero no se limitan a, aspersión, lavado, deposición de vapor, brocha, rodillo, cortina, recubrimiento por rotación y otros métodos conocidos en la técnica.
Los dispositivos médicos implantables de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una articulación artificial, dispositivo ortopédico, implante óseo, lentes de contacto, sutura, grapa quirúrgica, clip quirúrgico, catéter, balón de angioplastia, sensor, instrumento quirúrgico, electrodo, aguja, jeringa, drenaje de heridas, derivación, inserción uretral, implante de metal o plástico, válvula cardíaca, órgano artificial, banda de regazo, anillo de anuloplastia, alambre guía, alambre de Kirschner o clavo Denham, cánulo, injerto de cánula, injerto vascular, marcapasos, pellas, obleas, tubos médicos, manga de infusión, desfibrilador implantable, neuroestimulador, sensor de glucosa, derivación del líquido cefalorraquídeo, bomba de fármaco implantable, caja espinal, disco artificial, implante ocular, implante coclear, implante mamario, dispositivo de sustitución del núcleo pulposo, tubo auditivo, lente intraocular, sistema de administración de fármacos, micropartículas, nanopartículas y microcápsulas.
En realizaciones particulares, el dispositivo médico implantable es un implante o prótesis que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En realizaciones particulares, la prótesis es una articulación artificial. En algunas realizaciones, la prótesis es una articulación de cadera artificial, una rodilla artificial, una articulación glenohumeral artificial, un tobillo artificial.
En realizaciones particulares, el implante es una cánula. En realizaciones particulares, el implante es una cánula coronaria, una cánula ureteral, una cánula uretral, una cánula prostática, una cánula ósea o una cánula esofágica. En realizaciones particulares, el implante es un implante óseo, tal como, pero sin limitarse a, un implante osteointegrado o una prótesis craneofacial (por ejemplo, una oreja artificial, prótesis orbitaria, prótesis nasal).
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se ensambla directamente en una micropartícula o nanopartícula para administrar el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 a un sujeto (véase, por ejemplo, WO 03/015755 y US2004/0241248).
En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionados en este documento se unen, ensamblan o proporcionan como un recubrimiento en las superficies o porciones de los mismos de cualquier dispositivo médico implantable como se describe en este documento o se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 eluye del recubrimiento y entra en el tejido circundante después de la implantación.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se ensambla directamente en un andamio, una micropartícula, una microcápsula o un microportador empleado para el suministro de un biomaterial, tal como una célula madre o una célula productora de insulina. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se une a la microcápsula o se ensambla directamente en una microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se combina con un material usado para formar la microcápsula y se genera una microcápsula que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se usa para recubrir la superficie interna de la microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se usa para recubrir la superficie exterior de la microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se usa para recubrir la superficie interior y exterior de la microcápsula.
Materiales de ejemplo para encapsular células incluyen, pero no se limitan a, hidrogeles termoendurecibles, tales como agarosa, alginato y polímeros artificiales tales como poli(NiPAAm-co-AAC), poli(etilenglicol) (PEG) y derivados de PEG tales como diacrilato de PEG y oligo(poli etilenglicol)) fumarato. Los métodos para el cultivo y microencapsulación de células madre se conocen en la técnica en algunas realizaciones, se emplean para generar microcápsulas que contienen un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en este documento. En algunas realizaciones, la microcápsula contiene una célula, una pluralidad de células u otro material biológico. En algunas realizaciones, la célula o células son células madre, tales como, pero sin limitarse a, células madre mesenquimales. En algunas realizaciones, la célula o células son células diferenciadas, tales como, pero sin limitarse a, células productoras de insulina. En algunas realizaciones, la célula o células son células autólogas (es decir, células que son del o derivadas del receptor de las células). En algunas realizaciones, la célula o células son células alogénicas (es decir, células que no proceden del receptor de las células ni derivan de este). En algunas realizaciones, la microcápsula contiene una célula, una pluralidad de células u otro material biológico y las superficies internas de la microcápsula están recubiertas con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la microcápsula contiene una célula, una pluralidad de células u otro material biológico y las superficies externas de la microcápsula están recubiertas con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la microcápsula contiene una célula, una pluralidad de células u otro material biológico y las superficies exterior e interior de la microcápsula se recubren con el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado aquí. En algunas realizaciones, la microcápsula se administra para tratar una enfermedad o afección. Las enfermedades y afecciones de ejemplo y los métodos de tratamiento para los que se puede administrar una microcápsula se describen en otra parte de este documento e incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias y relacionadas con el sistema inmunológico.
Métodos de tratamiento
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan métodos para tratar a un individuo que lo necesite, que comprenden administrar al individuo complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgados en el presente documento. En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan métodos para tratar a un individuo que lo necesite, que comprenden administrar al individuo complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 producidos mediante los métodos descritos en el presente documento. Los siguientes son ejemplos no limitantes de métodos de tratamiento que comprenden la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para inhibir al menos uno de los siguientes: cicatrización, inflamación, reacción inmune que conduce a rechazo autoinmune o inmune, adhesión, angiogénesis y afecciones que requieren células o regeneración de tejidos. En algunas realizaciones, se usa un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para promover la cicatrización de heridas. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para promover la expansión de células madre. En algunas realizaciones, se usa un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para promover la regeneración de tejidos.
En algunas realizaciones, los métodos para tratar a un individuo que lo necesite, comprenden administrar al individuo complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descritos en el presente documento mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, los métodos para tratar a un individuo que lo necesita, comprenden administrar al individuo complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descritos en el presente documento mediante cualquier vía de administración adecuada. Los métodos de administración adecuados dependerán de la enfermedad o afección que se va a tratar. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administran localmente en el sitio de tratamiento. En algunas realizaciones, los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administran sistémicamente. Los métodos de ejemplo para la administración de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionados en este documento incluyen, pero no se limitan a, parenteral, enteral, subcutánea, percutánea, transdérmica, intradérmica, intravenosa, tópica, inhalación o implantación.
Cicatrización
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir, reducir o revertir la cicatrización en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento.
Como se usa en este documento, "cicatrización" se refiere a la formación de una cicatriz. En un aspecto, la cicatriz es una cicatriz hipertrófica o una cicatriz queloide o una cicatriz resultante del acné. Como se usa en este documento, una "cicatriz" es un área de tejido fibroso que resulta de la sobreproducción de colágeno. En ciertos casos, la cicatrización de heridas comprende la migración de fibroblastos al sitio de la lesión. En ciertos casos, los fibroblastos depositan colágeno. En ciertos casos, los fibroblastos depositan un exceso de colágeno en el sitio de la herida, lo que produce una cicatriz.
En ciertos casos, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento previene o inhibe la señalización de TGF-p. En ciertos casos, TGF-p regula la matriz extracelular estimulando la fibroplasia y el depósito de colágeno e inhibiendo la degradación de la matriz extracelular (sobrerregulando la síntesis de inhibidores de proteasa). En ciertos casos, prevenir o inhibir la expresión de TGF-p da como resultado la prevención o una reducción de la intensidad de una cicatriz. En algunas realizaciones, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento previene o reduce la formación de cicatrices.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento inhibe o evita la capacidad de los fibroblastos para diferenciarse en miofibroblastos. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento revierte los miofibroblastos diferenciados en fibroblastos.
En algunas realizaciones, se usa un método divulgado en este documento para prevenir, reducir o revertir la formación de una cicatriz. En algunas realizaciones, un método divulgado en este documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento a un individuo con un trastorno que da como resultado cicatrices (por ejemplo, cicatriz de dermatitis, cicatriz queloide, cicatriz de contractura, cicatriz hipertrófica, o una cicatriz resultante del acné). En algunas realizaciones, un método divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento a un individuo que lo necesite antes o después del trauma. En algunas realizaciones, un método divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento a un individuo que lo necesite antes o después de la cirugía.
En algunas realizaciones, se usa un método divulgado en este documento para prevenir o reducir la formación de una cicatriz en un ojo o en el tejido circundante. En algunas realizaciones, un método divulgado en este documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento a un individuo con un trastorno que da como resultado cicatrización del ojo o tejido circundante (por ejemplo, retinopatía del prematuro). En algunas realizaciones, un método divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento a un individuo que lo necesite antes o después de un traumatismo en un ojo o el tejido circundante. En algunas realizaciones, un método divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento a un individuo que lo necesite antes o después de la cirugía de un ojo o del tejido circundante.
Inflamación
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se describen métodos para prevenir o reducir la inflamación en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. Como se usa en este documento, "inflamación" significa respuestas fisiológicas que resultan de la migración de plasma y/o leucocitos (por ejemplo, linfocitos, macrófagos, granulocitos y neutrófilos) al sitio de una infección o trauma (por ejemplo, trauma por fuerza contundente, trauma penetrante, o cirugía).
En ciertos casos, los leucocitos secretan citoquinas después del contacto con un antígeno. Como se usa en el presente documento, las "citoquinas" son proteínas de señalización o glicoproteínas. En ciertos casos, una citoquina se une a un receptor de la superficie celular. En ciertos casos, las citoquinas inducen la quimiotaxis de los leucocitos hacia el sitio de una infección. En ciertos casos, los receptores de la superficie celular en un leucocito detectan gradientes químicos de una citoquina. En ciertos casos, un leucocito sigue el gradiente hasta el sitio de la infección. En ciertos casos, la unión de una citoquina a un receptor de la superficie celular da como resultado la sobrerregulación o subregulación de ciertos genes y sus factores de transcripción. En ciertos casos, los cambios en la expresión génica dan como resultado la producción de citoquinas, un aumento en la producción de citoquinas o un aumento en la presentación de receptores de superficie celular.
A modo de ejemplo no limitativo, las citoquinas incluyen interleucinas IL-1, IL-6 , IL-8 , MCP-1 (también conocidas como CCL2) y TNF-a. La interleucina 1 está presente en el cuerpo en dos isoformas: IL-1 a e IL-1 p. En ciertos casos, la presencia de IL-1 aumenta la expresión de factores de adhesión en las células endoteliales. Esto, a su vez, permite la transmigración de leucocitos al sitio de infección. En ciertos casos, IL-8 induce la quimiotaxis de los leucocitos. En ciertos casos, el TNF-a induce la quimiotaxis de los leucocitos. En ciertos casos, MCP-1 recluta leucocitos en sitios de lesión e infección tisular.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento suprime la producción y/o la actividad de citoquinas. En ciertos casos, una disminución en la concentración de citoquinas reduce o previene la inflamación al disminuir el número de leucocitos y/o la tasa a la que los leucocitos migran al sitio de una lesión.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento induce la apoptosis de un leucocito (por ejemplo, un macrófago, neutrófilo o linfocito). En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento reduce el número de leucocitos activados o la tasa a la que se activan los leucocitos. En ciertos casos, una disminución en la concentración de leucocitos reduce o previene la inflamación al disminuir el número (por ejemplo, facilita la muerte de tales células mediante apoptosis) de células que migran al sitio de una lesión.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento inhibe la polarización de un macrófago a un fenotipo inflamatorio (es decir, un fenotipo M1). En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento reduce o inhibe la expresión de IL-12 o IL-23 en macrófagos estimulados. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento promueve la polarización de macrófagos estimulados a un fenotipo M2 regulador o de curación de heridas. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento inhibe o reduce la inflamación en un sujeto. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento inhibe o reduce el daño tisular causado por una respuesta inflamatoria en un sujeto. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce el daño tisular causado por una afección o enfermedad que induce inflamación en un sujeto.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene inflamación. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene inflamación aguda. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene inflamación crónica. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene un trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio mediado por macrófagos. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio mediado por células T. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inmunológico mediado por Th-17.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene una respuesta inflamatoria aguda. En algunas realizaciones, la respuesta inflamatoria aguda es causada, por ejemplo, por una alergia, sepsis, choque endotóxico o isquemia, tal como, pero sin limitación, infarto de miocardio y apoplejía. En algunas realizaciones, la respuesta inflamatoria aguda es el resultado de una infección bacteriana, una infección por protozoos, una infección por protozoos, una infección viral, una infección por hongos o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce la inflamación aguda. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce el daño tisular causado por la inflamación aguda. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce la lesión por reperfusión tisular debida a isquemia, que incluye infarto de miocardio y apoplejía,
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene inflamación crónica que está asociada con la activación de linfocitos a través de inmunidad adaptativa. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra a un sujeto que tiene una respuesta Th1. En algunas realizaciones, la respuesta Th1 conduce al rechazo inmunitario del trasplante biológico. En algunas realizaciones, el trasplante es un trasplante de aloinjerto. En algunas realizaciones, el trasplante es un trasplante autólogo. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es una enfermedad de injerto contra huésped o rechazo de trasplante de tejido. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce la inflamación crónica en un sujeto. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra a un sujeto que tiene inflamación crónica que está asociada con una respuesta inmune Th17 asociada con un trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno autoinmunitario o un defecto leucocitario.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra a un sujeto que tiene un trastorno inflamatorio que es encefalomielitis diseminada aguda; enfermedad de Addison; espondiloartritis anquilosante; síndrome de anticuerpos antifosfolípidos; anemia hemolítica autoinmune; hepatitis autoinmune; enfermedad autoinmune del oído interno; bulus penfigoide; enfermedad de Chagas; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; enfermedad celíaca; dermatomiositis; diabetes mellitus tipo 1; diabetes mellitus tipo 2 ; endometriosis; Síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; Síndorme de Guillain-Barré; enfermedad de Hashimoto; Púrpura trombocitopénica idiopática; cistitis intersticial; lupus eritematoso sistémico (SLE); síndrome metabólico, esclerosis múltiple; Miastenia gravis; miocarditis, narcolepsia; obesidad; Pemphigus vulgaris; anemia perniciosa; polimiositis; cirrosis biliar primaria; artritis reumatoide; esquizofrenia; esclerodermia; Síndrome de Sjogren; vasculitis; vitiligo; granulomatosis de Wegener; rinitis alérgica; cancer de prostata; carcinoma de pulmón de células no pequeñas; cáncer de ovarios; cáncer de mama; melanoma; cáncer gástrico; cáncer colorrectal; cáncer de cerebro; trastorno óseo metastásico; cáncer de páncreas; un linfoma; pólipos nasales; cáncer gastrointestinal; colitis ulcerosa; trastorno de Crohn; colitis colagenosa; colitis linfocítica; colitis isquémica; colitis de derivación; síndrome de Behget; colitis infecciosa; colitis indeterminada; trastorno inflamatorio del hígado, isquemia, infarto de miocardio, apoplejía, choque por endotoxinas, choque séptico; espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis gotosa, polimialgia reumática, trastorno de Alzheimer, trastorno de Parkinson, epilepsia, demencia por SIDA, asma, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, bronquitis, fibrosis quística, lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos, proctitis distal, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, uveítis, conjuntivitis, psoriasis, eczema, dermatitis, trastornos de la proliferación del músculo liso, meningitis, herpes, encefalitis, nefritis, tuberculosis, retinitis, dermatitis atópica, pancreatitis, gingivitis periodontal, necrosis coagulativa, necrosis licuefactiva, necrosis fibrinoide, hiperplasia neointimal o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio de un ojo o del tejido circundante. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es conjuntivitis. En ciertos casos, la conjuntivitis es el resultado de la exposición a un alérgeno. En ciertos casos, la conjuntivitis es el resultado de una infección bacteriana. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es queratitis. Como se usa en este documento, "queratitis" es un trastorno caracterizado por inflamación de la córnea. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es queratoconjuntivitis (es decir, una combinación de conjuntivitis y queratitis (es decir, inflamación de la córnea)). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es blefaritis. Como se usa en este documento, "blefaritis" es un trastorno oftálmico caracterizado por inflamación de los márgenes de los párpados. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es blefaroconjuntivitis (es decir, una combinación de conjuntivitis y blefaritis (es decir, inflamación de un párpado)). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es escleritis. Como se usa en este documento, "escleritis" es un trastorno caracterizado por inflamación de la esclerótica. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es epiescleritis. Como se usa en el presente documento, "epiescleritis" es un trastorno inflamatorio de la epiesclera caracterizado por hiperemia y quemosis. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es uveítis. Como se usa en este documento, "uveítis" es un trastorno inflamatorio de la úvea. En algunas realizaciones, el trastorno es retinitis. Como se usa en este documento, "retinitis" es un trastorno inflamatorio de la retina. En algunas realizaciones, el trastorno es coroiditis. Como se usa en este documento, "coroiditis" es un trastorno inflamatorio de la úvea, el cuerpo ciliar y la coroides.
Angiogénesis anormal
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan métodos para prevenir o reducir la angiogénesis en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. Como se usa en este documento, "angiogénesis" significa la formación de nuevos vasos sanguíneos. En ciertos casos, la angiogénesis facilita el crecimiento y la metástasis de un tumor. Además, en ciertos casos, la angiogénesis anormal es la base de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (wARMD) y la retinopatía proliferativa diabética. En ciertos casos, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento previene o reduce la angiogénesis.
En ciertos casos, la unión de un ligando al receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) inicia una cascada de señalización de tirosina quinasa que estimula la producción de factores que estimulan de diversas formas la permeabilidad de los vasos (eNOS, que produce NO), la proliferación/supervivencia (bFGF), migración (ICAM/VCAM/MMP) y finalmente diferenciación en vasos sanguíneos maduros. En ciertos casos, después de la unión de VEGFR-2 a su ligando, las células endoteliales forman estructuras tubulares que se asemejan a capilares.
Como se usa en este documento, "degeneración macular húmeda relacionada con la edad", "wARMD" o "ARMD húmeda" significa un trastorno de un ojo caracterizado por la proliferación de vasos sanguíneos de la coroides. En ciertos casos, la ARMD húmeda causa pérdida de visión debido a la pérdida de sangre y proteínas debajo de la mácula. En ciertos casos, el sangrado, las fugas y las cicatrices de estos vasos sanguíneos causan un daño irreversible a los fotorreceptores y una rápida pérdida de la visión si no se tratan.
Como se usa en este documento, "retinopatía proliferativa diabética" significa un trastorno de un ojo caracterizado por incompetencia de las paredes vasculares. En ciertos casos, la falta de oxígeno en la retina provoca angiogénesis a lo largo de la retina y en el humor vítreo. En ciertos casos, los nuevos vasos sanguíneos sangran, nublan la visión y destruyen la retina.
En ciertos casos, la proliferación de capilares suministra un tumor con nutrientes, lo que permite que se expanda. En ciertos casos, la proliferación de capilares permite la eliminación rápida de desechos celulares que permiten el crecimiento de tumores. En ciertos casos, la angiogénesis facilita la metástasis. En ciertos casos, la proliferación de capilares aumenta las posibilidades de que una célula cancerosa pueda ingresar a un vaso sanguíneo y así establecer un nuevo tumor en un nuevo sitio.
Los tipos de cáncer de ejemplo que se tratan en algunas realizaciones usando un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, astrocitoma, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer del ducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, glioma de tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma, linforma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, Tumor extragonadal de células germinales, cáncer del ojo, melanoma intraocular, cáncer del ojo, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneal), tumor de células germinales (extragonadal), tumor de células germinales (ovárico), Tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, glioma hipotalámico y de las vías visuales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, Cáncer de riñon (células renales), cáncer de laringe, leucemia (linfoblástica aguda), leucemia (mieloide aguda), leucemia (linfocítica crónica), leucemia (mielógena crónica), cáncer de labios y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (células no pequeñas), cáncer de pulmón (células pequeñas), linfoma (células T cutáneas), linfoma (no Hodgkin), histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal y de seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinativas de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides cáncer del pene, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma (de Kaposi), sarcoma (uterino), síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel (células de Merkel), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago (gástrico), linfoma de células T, cáncer de testículo, timoma, cáncer de tiroides, tumor trofoblástico, gestacional, cáncer uretral, cáncer de útero, endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de las vías visuales, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Reparación de heridas y regeneración de tejidos
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como recubrimiento de heridas o se usa para facilitar la reparación de heridas. En algunas realizaciones, el tejido fue dañado, comprometido o perdido debido a una lesión (por ejemplo, una quemadura; una incisión quirúrgica; un área de necrosis resultante de una infección, trauma o una toxina; una laceración). En algunas realizaciones, el tejido fue dañado, se comprometió o se perdió debido a una quemadura. En algunas realizaciones, el tejido fue dañado, comprometido o perdido debido a una herida (por ejemplo, una incisión, laceración, abrasión). En algunas realizaciones, el tejido fue dañado, comprometido o perdido debido a la necrosis. En algunas realizaciones, el tejido fue dañado, comprometido o perdido debido a ulceración.
Quemaduras
En algunas realizaciones, se aplica a una quemadura una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a una quemadura de primer grado. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica a una quemadura de segundo grado. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica a una quemadura de tercer grado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la quemadura.
Heridas
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a una herida en la piel (por ejemplo, una incisión, laceración, abrasión, úlcera, punción, penetración). En algunas realizaciones, la herida es una herida isquémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la herida. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento trata la herida.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a una incisión en un órgano (por ejemplo, piel, cerebro, estómago, riñones, hígado, intestinos, pulmones, vejiga, tráquea, esófago, vagina, uréter y paredes de los vasos sanguíneos). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica a una incisión quirúrgica. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica al sitio de una resección de colon. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica al sitio de una gastrectomía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica al sitio de una cirugía de mama (por ejemplo, cirugía de reducción de mama, cirugía de aumento de mama y mastectomía). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la herida.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como recubrimiento sobre una incisión en la piel (por ejemplo, una incisión en la epidermis, dermis y/o hipodermis). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para reparar o complementar la piel después de una cirugía de hemorroides. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la herida. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento trata la herida.
Necrosis
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como injerto protector sobre un área de tejido necrótico (por ejemplo, de una infección). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa como injerto protector sobre un área de piel necrótica. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coloca en un área de tejido necrótico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre el tejido necrótico. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento trata el tejido necrótico.
Úlcera
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa como recubrimiento protector sobre una úlcera. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento trata la úlcera. En algunas realizaciones, la úlcera es una úlcera diabética, tal como una úlcera de pie o pierna diabética. En algunas realizaciones, la úlcera es una herida isquémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la úlcera. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento trata la úlcera. En algunas realizaciones, la úlcera es una úlcera que no se cura. Por ejemplo, en algunas realizaciones esa úlcera que no se cura es una herida o úlcera en la piel que ha estado presente durante aproximadamente 3-4 semanas de duración sin curar.
En algunas realizaciones, la úlcera es una úlcera del pie (por ejemplo, una úlcera del pie diabético o una úlcera por insuficiencia arterial). En algunas realizaciones, tratar una úlcera del pie comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); y (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida. En algunas realizaciones, tratar una úlcera del pie comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida; y (c) cubrir la composición farmacéutica con una barrera protectora (por ejemplo, un apósito Silvercell, Metipel, gasa o un vendaje). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la úlcera. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento trata la úlcera.
En algunas realizaciones, la úlcera es una úlcera por estasis venosa (VS). En algunas realizaciones, tratar una úlcera de VS comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); y (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida. En algunas realizaciones, tratar una úlcera de VS comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida; y (c) cubrir la composición farmacéutica con una barrera protectora (por ejemplo, un velo para heridas, apósito antimicrobiano, gasa o vendaje). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la herida. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento trata la úlcera.
En algunas realizaciones, la úlcera es una úlcera corneal (es decir, queratitis ulcerosa). En algunas realizaciones, tratar una úlcera corneal comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); y (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida. En algunas realizaciones, tratar una úlcera corneal comprende (a) preparar la herida (por ejemplo, desbridar la herida); (b) colocar una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento sobre la herida; y (c) cubrir la composición farmacéutica con una barrera protectora (por ejemplo, una lente de contacto o un vendaje). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato antes de colocarla sobre la herida. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento trata la úlcera.
Terapias celulares terapéuticas
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra en combinación con una terapia celular. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con una célula terapéutica. Las células terapéuticas incluyen cualquier célula que presente una propiedad terapéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula recombinante que expresa heterólogamente uno o más productos génicos terapéuticos. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula trasplantada. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula madre. En algunas realizaciones, la célula terapéutica es una célula que expresa uno o más marcadores de células madre (por ejemplo, Oct-3/4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc y Klf4). En algunas realizaciones, la terapia celular es un trasplante de células madre. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se administra para promover la expansión de las células madre del trasplante y la regeneración tisular. En algunos ejemplos, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se emplea para reducir o inhibir la inflamación, la cicatrización y la angiogénesis anormal causada por un trasplante de células madre. En algunas realizaciones, se emplea el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 para mantener las características de las células madre durante la expansión ex vivo mediante la sustitución de las capas alimentadoras. En algunas realizaciones, se emplea el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 para reprogramar una célula diferenciada en una célula madre. En algunas realizaciones, se emplea un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para expandir y cultivar células madre in vitro para su posterior trasplante en un sujeto.
En algunas realizaciones, la terapia con células madre es una terapia con células madre embrionarias. En algunas realizaciones, la terapia con células madre es una terapia con células madre adultas. En algunas realizaciones, la terapia con células madre es una terapia con células madre mesenquimales. En algunas realizaciones, la terapia con células madre se administra para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, tal como, pero no .limitado a, enfermedad cardiovascular, cáncer, diabetes, lesión de la médula espinal, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular de Duchenne, daño o distrofia muscular, apoplejía, quemaduras, enfermedad pulmonar, enfermedad de la retina, enfermedad renal, osteoartritis y artritis reumatoide.
En algunas realizaciones, las células madre se utilizan para tratar la diabetes mellitus. La diabetes tipo 1 es el resultado de la destrucción mediada por autoinmunidad de las células p secretoras de insulina en los islotes de Langerhans del páncreas. La diabetes tipo 2 es el resultado de la resistencia sistémica a la insulina y la reducción de la secreción de insulina por las células p pancreáticas. Se ha demostrado in vitro que las células madre se diferencian en células productoras de insulina (véase, por ejemplo, Schuldiner et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:11307-11312; Guo et al., (2009) Endocr Apocalipsis 30:2l4-227). Por lo tanto, en algunas realizaciones, las células madre, incluidas las ESC y las ASC, y sus derivados, como las células madre parcialmente diferenciadas, se utilizan en la terapia con células madre para la regeneración de las células p pancreáticas.
En algunas realizaciones, las células madre o células diferenciadas empleadas para terapia se encapsulan en un dispositivo de microcápsulas. En algunas realizaciones, la microcápsula comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se une covalentemente a la microcápsula. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se ensambla en la superficie de la microcápsula, tal como la superficie interior o exterior, o ambas. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/pTX3 se formula para recubrir la microcápsula. En algunas realizaciones, la microcápsula comprende poros para permitir el paso de nutrientes a las células al interior de la microcápsula y/o permite que las proteínas y moléculas secretadas (por ejemplo, insulina) por las células encapsuladas fluyan fuera de la microcápsula. En algunas realizaciones, las células se inmovilizan primero en un microvehículo, tal como una perla recubierta con Matrigel® y luego se encapsulan dentro de la microcápsula. Los métodos para la encapsulación de células, tales como células madre, son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Serra et al. (2011) PLoS ONE 6 (8 ): e23212. En algunas realizaciones, se emplea cualquier método para la encapsulación de células junto con los métodos proporcionados en este documento.
En algunas realizaciones, las células madre terapéuticas alogénicas (por ejemplo, células de los islotes productoras de insulina) se encapsulan en un dispositivo de microcápsulas para la producción de insulina. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 promueve la expansión de las células madre. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce una respuesta inflamatoria contra la microcápsula que contiene las células madre empleadas para la terapia de la diabetes mellitus. En algunas realizaciones, la microcápsula comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inhibe o reduce una respuesta inflamatoria contra la microcápsula que contiene las células madre.
Usos de tejidos blandos
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para reparar, reconstruir, reemplazar o complementar el tejido blando dañado, comprometido o faltante de un receptor (por ejemplo, tendones). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica directamente al tejido. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra junto con terapias basadas en células o tejidos. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se mezcla con una célula, una pluralidad de células o un tejido y se administra como parte de una terapia basada en tejidos. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para recubrir una célula, una pluralidad de células o un tejido y se administra como parte de una terapia basada en tejidos.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como recubrimiento sobre una incisión en tejido blando (por ejemplo, los párpados forman el plano del tejido entre diferentes capas de tejido blando). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se aplica a un sustrato y luego se usa como cobertura sobre una incisión en tejido blando (por ejemplo, los párpados forman el plano del tejido entre diferentes capas de tejido blando tejido).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como soporte estructural (tectónico) para tejido blando. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento evita la adhesión en reparaciones de articulaciones o tendones.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa en la reparación de un tendón o articulación (tal como reparaciones del manguito rotador, reparaciones del tendón de la mano). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para reforzar un tendón o articulación. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para prevenir la adhesión de un tendón en curación al tejido, tendones o articulaciones circundantes. En algunas realizaciones, se usa una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para prevenir la formación de tejido cicatricial en un tendón.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y al complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para aumentar tendones y ligamentos más pequeños del pie y el tobillo, incluidos el tendón tibial posterior, los tendones peroneos, los tendones flexores y extensores y los ligamentos del complejo lateral del tobillo. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reforzar reparación primaria de los tendones cuádriceps y rotuliano que rodean la rodilla. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un parche perióstico para injerto óseo en sustitución articular. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para aumentar tejido capsular deficiente de la cadera y la rodilla después de una cirugía de revisión total de la articulación.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa en la reparación de un manguito rotador desgarrado. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un parche sobre un tendón o músculo del manguito rotador (por ejemplo, el tendón del supraespinoso). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reconstruir un músculo o tendón del manguito rotador (por ejemplo, el tendón del supraespinoso). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para aumentar un músculo o tendón del manguito rotador (por ejemplo, el tendón del supraespinoso). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reforzar un músculo o tendón del manguito rotador (por ejemplo, el tendón del supraespinoso). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para prevenir adhesión de tejido blando a un músculo o tendón del manguito rotador (por ejemplo, el tendón del supraespinoso).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa en la reparación gingival. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa en la reparación de la recesión gingival. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica a un sustrato y se usa como parche sobre la encía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica al sustrato y se usa como parche sobre la superficie de la raíz del diente expuesta. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para reconstruir la encía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para aumentar la encía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para reforzar la encía. En algunas realizaciones, se usa una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para prevenir la adhesión de tejido blando a la encía.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un injerto protector sobre una incisión o desgarro en la fascia. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónica) de la fascia. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo o complemento para la fascia. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia (por ejemplo, para reparar la fascia). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia inguinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia femoral. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia umbilical. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia incisional. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia diafragmática. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia de Cooper, una hernia epigástrica, una hernia hiatal, una hernia de Littre, una hernia lumbar, una hernia de Maydl, una hernia obturatriz, una hernia de pantaloon, una hernia paraesofágica, una hernia paraumbilical, una hernia perineal, una hernia propitoneal, una hernia de Richter, una hernia deslizante, una hernia ciática, hernia de Spiegel, una hernia deportiva, hernia de Velpeau o una hernia de Amyand.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para reparar una hernia de disco espinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un injerto protector sobre una incisión o desgarro en un disco espinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un injerto protector sobre una incisión o desgarro en un anillo fibroso. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) de un disco espinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estrutural (tectónico) de un anillo fibroso. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo o suplemento de un disco espinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) de un disco espinal. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo o suplemento para un anillo fibroso.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa sobre una incisión en el cerebro o en una (o todas) de las meninges (es decir, la duramadre, la piamadre y/o la aracnoides). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para una (o todas) de las meninges (es decir, la duramadre, la piamadre y/o la aracnoides). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo de una (o todas) de las meninges (es decir, la duramadre, la piamadre y/o la aracnoides).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa sobre una incisión en un pulmón o en la pleura. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para la pleura. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo de la pleura.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa sobre una incisión en una membrana timpánica. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para una membrana timpánica. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo de una membrana timpánica.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un injerto protector sobre una incisión en el corazón o el pericardio. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para el pericardio. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo del pericardio.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un injerto protector sobre una incisión en el peritoneo. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para el peritoneo. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo del peritoneo.
Usos oftálmicos
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para reparar, reconstruir, reemplazar o complementar el tejido ocular dañado, comprometido o faltante de un receptor.
Tratamiento del glaucoma
Como se usa en el presente documento, "Glaucoma" significa un trastorno caracterizado por la pérdida de células ganglionares de la retina en el nervio óptico. En ciertos casos, el glaucoma es el resultado parcial o total de un aumento de la presión intraocular en la cámara anterior (AC). La presión intraocular varía dependiendo de la producción de humor acuoso líquido por los procesos ciliares del ojo y el drenaje del humor acuoso a través de la red trabecular.
Los dispositivos de drenaje de glaucoma (GDD) son dispositivos médicos que se implantan en un ojo para aliviar la presión intraocular al proporcionar una vía alternativa para que drene el humor acuoso. Si se deja descubierto, un tubo de GDD se erosionará y dejará el ojo susceptible a infecciones intraoculares. Por lo tanto, es necesario cubrir el tubo GDD. Actualmente, los parches que se utilizan para cubrir los tubos GDD están hechos de pericardio, esclerótica y córnea. Estos parches tienen un grosor de entre 400 y 550 micrones. La delgadez de estos parches hace que se derritan en un 25% en 2 años, dejando potencialmente el tubo de derivación expuesto nuevamente. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para cubrir tubos GDD. En algunas realizaciones, el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 tiene un espesor de 300-600 micrómetros. En algunas realizaciones, el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 no se funde en un 25% en 2 años.
Tratamiento de úlceras oculares
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa para cubrir defectos epiteliales persistentes y/o úlceras en los ojos.
En algunas realizaciones, la base de la úlcera se desbrida con esponjas quirúrgicas y se retira el epitelio adherido pobrevemte adyacente al borde de la úlcera (por ejemplo, en la sección del ojo donde el epitelio se vuelve bastante adherente). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se transfiere al ojo receptor. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se fija luego a el ojo mediante suturas (por ejemplo, suturas de nailon 10-0 interrumpidas o suturas de nailon 10-0 continuas) con los nudos de sutura enterrados. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se fija al ojo mediante el uso de pegamento de fibrina. En algunas realizaciones, se aplica una capa protectora sobre el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 o sobre todo el ojo (por ejemplo, una lente de contacto). En algunas realizaciones, el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 comprende además un antibiótico (por ejemplo, neomicina, sulfato de polimixina b y dexametasona).
Reconstrucción de la superficie del borde conjuntival, escleral, palpebral y orbitario
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa en la reconstrucción de la superficie del borde conjuntival, escleral, palpebral y orbitario. En algunas realizaciones, el daño a la superficie conjuntival resulta de la lisis del simbléfaron; extirpación quirúrgica de tumor, lesión y/o tejido cicatricial; queratectomía fotorrefractiva con láser excimer y queratectomía terapéutica; o combinaciones de los mismos.
Usos coronarios
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para reparar, reconstruir, reemplazar o complementar el tejido coronario dañado, comprometido o faltante de un receptor.
Prevención del daño por reperfusión por isquemia
En el presente documento se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento para la inhibición o reducción del daño tisular resultante de la inflamación aguda causada por isquemia, tal como, por ejemplo, infarto de miocardio o apoplejía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra a un sujeto que tiene una afección isquémica, tal como, pero sin limitarse a, infarto de miocardio o apoplejía.
Desviación de arteria coronaria
En el presente documento se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento en cirugía de desviación de arteria coronaria. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se injerta en una arteria coronaria para desviar una sección de la arteria que se caracteriza por aterosclerosis.
Válvulas cardíacas
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se aplica sobre una válvula del corazón. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para una válvula cardíaca. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo de una válvula cardíaca.
Venas y Arterias
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se aplica a un vena o arteria. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) para una vena o arteria.
Usos nerviosos
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para reparar, reconstruir, reemplazar o complementar el tejido nervioso dañado, comprometido o faltante de un receptor.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un cubrimiento sobre un nervio (por ejemplo, un nervio periférico). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un cubrimiento sobre un injerto de nervio, transferencia de nervio o un nervio reparado. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un cubrimiento sobre una incisión en un nervio (por ejemplo, un nervio periférico). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) de un nervio (por ejemplo, un nervio periférico). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento evita la adhesión en la reparación nerviosa.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un revestimiento no constrictivo para nervios lesionados. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento previene o minimiza la formación de cicatrices, encapsulación, compresión crónica, inmovilización de un nervio y atrapamiento de nervio. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento previene o minimiza la formación de neuromas. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento previene o minimiza la migración de factores de crecimiento endógenos (es decir, factor de crecimiento nervioso) presentes durante la reparación nerviosa.
Usos espinales
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulga el uso de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento durante la cirugía espinal.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa durante una laminectomía. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir la fibrosis epidural y/o las adherencias de cicatrices después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se implanta entre la duramadre y el tejido suprayacente después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, la implantación de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento entre la duramadre y el tejido suprayacente después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía) reduce o previene la migración de fibroblastos a la duramadre y deposición del colágeno sobre la duramadre.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de cicatrices proliferativas después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de una cicatriz epidural/peridural/perineural posoperatoria (por ejemplo, poslaminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de cicatrices proliferativas después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de una membrana poslaminectomía.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en este documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de compresión extradural o anclaje dural después de cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de raíces nerviosas atadas después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 descrito en el presente documento se usa para reducir o prevenir el desarrollo de aracnoiditis después de una cirugía espinal (por ejemplo, laminectomía).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento comprende además tejido óseo troceado. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento que comprende tejido óseo troceado se usa durante un procedimiento de fusión espinal. En algunas realizaciones, se implanta una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento que comprende tejido óseo troceado entre vértebras adyacentes. En algunas realizaciones, la implantación de una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento que comprende tejido óseo troceado entre dos vértebras adyacentes promueve la fusión de las vértebras.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa como injerto protector sobre una incisión en la duramadre. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como soporte estructural (tectónico) de la duramadre. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un sustrato y el complejo sustrato/nHC-HA/PTX3 o sustrato/rcHC-HA/PTX3 se usa como un reemplazo de la duramadre.
Usos diversos de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se aplica a un parche o apósito para heridas.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa como relleno dérmico. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se inyecta en tejidos faciales subdérmicos. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se inyecta bajo las arrugas y líneas de envejecimiento de la cara (por ejemplo, pliegues nasolabiales, pliegues melomentales, "patas de gallo" y arrugas en la frente). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para el aumento de labios. En algunas realizaciones, se inyecta en los labios una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para tratar la artritis (por ejemplo, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis séptica, espondilitis anquilosante, espondilosis). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se inyecta en una articulación artrítica (por ejemplo, una rodilla).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para tratar la artritis en el pie. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para tratar la artritis de la primera articulación metatarsofalángica (MTP) (por ejemplo, hallux rigidus). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se administra a una articulación MTP después de queilectomía dorsal. En algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento reduce uno o más síntomas adversos asociados con hallux rigidus o un procedimiento de queilectomía dorsal (por ejemplo, cicatrización, rigidez articular, hinchazón, inflamación y dolor).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para tratar uno o más síntomas asociados con un espolón óseo (por ejemplo, cicatrización, rigidez articular, hinchazón, inflamación y dolor).
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para inhibir la resorción ósea en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el individuo tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En algunas realizaciones, se inyecta en una articulación una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con un hueso (por ejemplo, mediante el uso de un apósito o vendaje para heridas). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 recubre una cánula ósea, un implante óseo o una prótesis ósea (por ejemplo, un implante osteointegrado). Como se usa en este documento, un "implante osteointegrado" significa un implante tridimensional que contiene poros en los que migran los osteoblastos y el tejido conectivo de soporte. En algunas realizaciones, las cánulas óseas se insertan en el canal intramedular de un hueso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en el seno del tarso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una rodilla o articulación. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una fractura ósea. En algunas realizaciones, la cánula ósea es expandible o contráctil.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para promover o inducir la formación de hueso en un individuo que lo necesita. En algunas realizaciones, el individuo tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En algunas realizaciones, se inyecta en una articulación una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con un hueso (por ejemplo, mediante el uso de un apósito o vendaje para heridas). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 recubre una cánula ósea, un implante óseo o una prótesis ósea (por ejemplo, un implante osteointegrado). Como se usa en este documento, un "implante osteointegrado" significa un implante tridimensional que contiene poros en los que migran los osteoblastos y el tejido conectivo de soporte. En algunas realizaciones, las cánulas óseas se insertan en el canal intramedular de un hueso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en el seno del tarso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una rodilla o articulación. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una fractura ósea. En algunas realizaciones, la cánula ósea es expandible o contráctil.
En algunas realizaciones, se usa una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento para inhibir la diferenciación de osteoclastos. En algunas realizaciones, el individuo tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En algunas realizaciones, se inyecta en una articulación una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con un hueso (por ejemplo, mediante el uso de un apósito o vendaje para heridas). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 recubre una cánula ósea, un implante óseo o una prótesis ósea (por ejemplo, un implante osteointegrado). Como se usa en este documento, un "implante osteointegrado" significa un implante tridimensional que contiene poros en los que migran los osteoblastos y el tejido conectivo de soporte. En algunas realizaciones, las cánulas óseas se insertan en el canal intramedular de un hueso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en el seno del tarso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una rodilla o articulación. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una fractura ósea. En algunas realizaciones, la cánula ósea es expandible o contráctil.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para promover la mineralización por osteoblastos en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el individuo tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En algunas realizaciones, se inyecta en una articulación una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con un hueso (por ejemplo, mediante el uso de un apósito o vendaje para heridas). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 recubre una cánula ósea, un implante óseo o una prótesis ósea (por ejemplo, un implante osteointegrado). Como se usa en este documento, un "implante osteointegrado" significa un implante tridimensional que contiene poros en los que migran los osteoblastos y el tejido conectivo de soporte. En algunas realizaciones, las cánulas óseas se insertan en el canal intramedular de un hueso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en el seno del tarso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una rodilla o articulación. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una fractura ósea. En algunas realizaciones, la cánula ósea es expandible o contráctil.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para equilibrar la resorción ósea y la formación ósea en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el individuo tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar, enfermedad de Paget o un tumor óseo. En algunas realizaciones, se inyecta en una articulación una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se pone en contacto con un hueso (por ejemplo, mediante el uso de un apósito o vendaje para heridas). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 recubre una cánula ósea, un implante óseo o una prótesis ósea (por ejemplo, un implante osteointegrado). Como se usa en este documento, un "implante osteointegrado" significa un implante tridimensional que contiene poros en los que migran los osteoblastos y el tejido conectivo de soporte. En algunas realizaciones, las cánulas óseas se insertan en el canal intramedular de un hueso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en el seno del tarso. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una rodilla o articulación. En algunas realizaciones, la cánula ósea se coloca en una fractura ósea. En algunas realizaciones, la cánula ósea es expandible o contráctil.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para tratar una afección ortodóntica o periodontal. En algunas realizaciones, la afección periodontal se selecciona de gingivitis, recesión gingival o periodontitis. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa como antiinflamatorio o se usa para promover la osteointegración o la curación. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa en combinación con un implante dental para promover la osteointegración, antiinflamación y curación del implante.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 para tratar la ronquera o los trastornos de la voz. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se usa para laringoplastia por inyección para reparar las cuerdas vocales.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se recubre sobre un implante médico (por ejemplo, una cánula). En algunas realizaciones, un complejo de implante/nHC-HA/PTX3 o implante/rcHC-HA/PTX3 médico divulgado en este documento se implanta en un individuo que lo necesita, en donde el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es parcial o completamente liberado en el individuo. En algunas realizaciones, el implante médico es una cánula (por ejemplo, una cánula ósea o una cánula coronaria). En algunas realizaciones, el implante médico es una cánula ósea. En algunas realizaciones, el implante médico es una cánula coronaria.
Combinaciones
En algunas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en este documento se usan junto con un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en el presente documento se utilizan junto con dos o más agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en este documento se usan junto con uno o más agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos descritos en este documento se usan junto con 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento y un segundo agente terapéutico se administran en la misma forma de dosificación. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento y un segundo agente terapéutico se administran en formas de dosificación separadas.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento y un segundo agente terapéutico se administran simultáneamente (por ejemplo, simultáneamente, esencialmente simultáneamente o dentro del mismo protocolo de tratamiento).
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento y un segundo agente terapéutico se administran secuencialmente. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra antes o después del segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, el período de tiempo entre la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento y un segundo agente activo varía de unos pocos minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmacéutico, tales como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media plasmática y perfil cinético del fármaco. En algunas realizaciones, la variación circadiana de la concentración de la molécula diana determina el intervalo de dosis óptimo. En algunas realizaciones, el tiempo entre la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento y un segundo agente activo es aproximadamente una hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente un día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente una semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente un mes o más.
En algunas realizaciones, la coadministración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento da como resultado una dosificación requerida más baja para el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 que la dosificación requerida cuando se administra un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 solo. En algunas realizaciones, la coadministración de un segundo agente terapéutico da como resultado una dosificación requerida más baja para el segundo agente que la dosificación requerida cuando se administra el segundo agente solo. Los métodos para determinar experimentalmente dosificaciones terapéuticamente eficaces de fármacos y otros agentes para uso en regímenes de tratamiento de combinación son conocidos y descritos en la técnica. Por ejemplo, el uso de dosificación metronómica, es decir, proporcionar dosis más bajas y más frecuentes para minimizar los efectos secundarios tóxicos, se ha descrito extensamente en la técnica. El tratamiento combinado incluye además tratamientos periódicos que comienzan y terminan en diversos momentos para ayudar con el manejo clínico del individuo.
En algunas realizaciones, se modifica el tratamiento de combinación del complejo nHC-HA/PTX3 rcHC-HA/PTX3 y uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, el tratamiento de combinación se modifica, por lo que la cantidad del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 aumenta en relación con la cantidad de un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, el tratamiento de combinación se modifica, por lo que la cantidad del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 disminuye con respecto a la cantidad de un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, el tratamiento de combinación se modifica, por lo que la cantidad de un segundo agente terapéutico aumenta con respecto a la cantidad del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el tratamiento de combinación se modifica, por lo que la cantidad de un segundo agente terapéutico disminuye con respecto a la cantidad del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico se selecciona de agentes citotóxicos, agentes antimicrobianos, agentes anti-angiogénesis, agentes quimioterapéuticos, agentes anti-neoplásicos o radioterapia. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico se selecciona de agentes alquilantes, antimetabolitos, epidofilotoxinas; enzimas antineoplásicas, inhibidores de topoisomerasa, procarbazinas, mitoxantronas, complejos de coordinación de platino, modificadores de la respuesta biológica e inhibidores del crecimiento, agentes terapéuticos hormonales/antihormonales, factores de crecimiento hematopoyético, inhibidores de la aromatasa, antiestrógenos, antiandrógenos, corticosteroides, agonistas de gonadorelina, agentes activos de microtúbulos, nitrosoureas, agentes de direccionamiento a lípidos o proteína quinasas, fármacos inmunomoduladores (IMiD), agentes de direccionamiento a proteínas o lípidos fosfatasa, agentes antiangiogénicos, inhibidores de Akt, inhibidores de IGF-I, moduladores de FGF3, inhibidores de mTOR, miméticos de Smac, inhibidores de HDAC, agentes que inducen la diferenciación celular, antagonistas del receptor de bradicinina 1, antagonistas de angiotensina II, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de heparanasa, inhibidores de linfocinas, inhibidores de citoquinas, inhibidores de IKK, inhibidores de P38MAPK, inhibidores de HSP90, inhibidores de multiquinasas, bisfosfonato, derivados de rapamicina, inhibidores de la vía antiapoptótica, agonistas de la vía apoptótica, agonistas de PPAR, agonistas de RAR, inhibidores de isoformas Ras, inhibidores de telomerasa, inhibidores de proteasa, inhibidores de metaloproteinasas, inhibidores de aminopeptidasa, activadores SHIP: AQX-MN100, Humax-CD20 (ofatumumab), antagonistas de CD20, fusiones IL2-toxina diftérica o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano es un agente antivírico, antibacteriano o antifúngico. Los agentes antibacterianos de ejemplo no limitantes incluyen los clasificados como aminoglucósidos, betalactámicos, quinolonas o fluoroquinolonas, macrólidos, sulfonamidas, sulfametaxozoles, tetraciclinas, estreptograminas, oxazolidinonas (tales como linezolid), clindamicinas, linxcomicidas, glicimicinas, rifinsamicidas. antibióticos lipopéptidos, así como sales de sodio farmacológicamente aceptables, sales de calcio farmacológicamente aceptables, sales de potasio farmacológicamente aceptables, formulaciones lipídicas, derivados y/o análogos de los anteriores. Las clases de ejemplo no limitantes de agentes antifúngicos incluyen imidazoles o triazoles tales como clotrimazol, miconazol, ketoconazol, econazol, butoconazol, omoconazol, oxiconazol, terconazol, itraconazol, fluconazol, voriconazol (UK109,496), posaconazol; ravuconazol o flutrimazol, los antifúngicos poliénicos tales como anfotericina B, anfotericina B liposomal, formulaciones lipídicas de natamicina, nistatina y formulaciones de lípidos de nistatina; los antifúngicos lipopéptidos cíclicos activos en la pared celular, incluyendo las equinocandinas tales como caspofungina, micafungina, anidulfungina, cilofungina; LY121019; LY303366; el grupo de alilamina de antifúngicos tales como terbinafina. Aún otros ejemplos no limitantes de agentes antifúngicos incluyen naftifina, tolnaftato, mediocidina, candicidina, tricomicina, hamicina, aurefungina, ascosina, ayfattina, azacolutina, tricomicina, levorina, heptamicina, candimicina, griseofulvina, BF-796, MTCH 24, BTG-137586, pradimicinas (MNS 18184), benanomicina; ambisome nikkomycin Z; flucitosina o perimicina. Ejemplos no limitantes de agentes antivirales incluyen cidofovir, amantadina, rimantadina, aciclovir, ganciclovir, penciclovir, famciclovir, foscamet, ribavirina o valciclovir. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano es un péptido o proteínas inmunes innatos. Algunas clases de ejemplo de péptidos o proteínas innatos son transferrinas, lactoferrinas, defensinas, fosfolipasas, lisozima, catelicidinas, serprocidinas, proteínas que aumentan la permeabilidad bactericida, péptidos alfa helicoidales anfipáticos y otras proteínas antimicrobianas sintéticas. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano es un agente antiséptico.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico se selecciona de ARRY-797, dacarbazina (DTIC), actinomicinas C2, C3, D y Fi, ciclofosfamida, melfalán, estramustina, maitansinol, rifamicina, estreptovaricina, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, detorrubicina, carminomicina, esorrubicina, mitoxantrona, bleomicinas A, A2 y B, camptotecina, irinotecán, topotecán, 9-aminocamptotecina, 10,11-metilendioxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, bortezomib, temozolomida, TAS103, NPI0052, combretastatina, combretastatina A-2, combretastatina A-4, caliqueamicinas, neocarcinostatinas, epotilonas A B, C y variantes semisintéticas, Herceptin, Rituxan, anticuerpos CD40, asparaginasa, interleucinas, interferones, leuprolida y pegaspargasa, 5-fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, ptorafur, 5'-desoxifluorouridina, UFT, MITC, S-1 capecitabina, dietilestilbestrol, tamoxifeno, toremefina, tolmudex, timitaq, flutamida, fluoximesterona, bicalutamida, finasterida, estradiol, trioxifeno, dexametasona, acetato de leuproelina, estramustina, droloxifeno, medroxiprogesterona, acetato de megesterol, aminoglutetimida, testolactona, testosterona, dietilestilbestrol, hidroxiprogesterona, mitomicinas A, B y C, porfiromicina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, tetraplatino, platino-DACH, ormaplatino, talidomida, lenalidomida, CI-973, telomestatina, CHIR258, Rad 001, SAHA, Tubacina, 17-AAG, sorafenib, JM-216, podofilotoxina, epipodofilotoxina, etopósido, tenipósido, Tarceva, Iressa, Imatinib, Miltefosina, Perifosina, aminopterina, metotrexato, metopterina, dicloro-metotrexato, 6 -mercaptopurina, tioguanina, azattuoprina, alopurinol, cladribina, fludarabina, pentostatina, 2-cloroadenosina, desoxicitidina, citosina arabinósido, citarabina, azacitidina, 5-azacitosina, gencitabina, 5-azacitosina-arabinósido, vincristina, vinblastina, vinorelbina, leurosina, leurosidina y vindesina, paclitaxel, taxotere y/o docetaxel.
En algunas realizaciones, el segundo agente activo es niacina, un fibrato, una estatina, un polipéptido mimético de Apo-A-1 (por ejemplo, DF-4, Novartis), un sobrerregulador transcripcional de apoA-1, un inhibidor de ACAT, un modulador de CETP, antagonistas del receptor de glucoproteína (GP) IIb/IIIa, antagonistas del receptor P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente de factor de necrosis antitumoral (TNF), un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1), un antagonista del receptor de interleucina-2 (IL-2), un antagonista del receptor de la interleucina-6 (IL-6 ), un antagonista del receptor de la interleucina-12 (IL-12), un antagonista del receptor de la interleucina-17 (IL-17), un antagonista del receptor interleucina-23 (IL-23), un agente citotóxico, un agente antimicrobiano, un agente inmunomodulador, un antibiótico, un bloqueador coestimulador de células T, un agente antirreumático modificador del trastorno, un agente de depleción de células B, un agente inmunosupresor, un anticuerpo antilinfocitos, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, un terpenoides, un inhibidor de la topoisomerasa, un antibiótico antitumoral, un anticuerpo monoclonal, una terapia hormonal (por ejemplo, inhibidores de aromatasa) o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente activo es un anticuerpo anti-TGF-p, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-TGF-p, un anticuerpo anti-TNF, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-TNF, un anticuerpo anti-IL1p, un anticuerpo bloqueador del receptor de IL1p, un anticuerpo anti-IL-2, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-2, un anticuerpo anti-IL-6 , un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-6 , un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo bloqueador del receptor de IL-12, un anticuerpo anti-IL-17, un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-17, un anticuerpo anti-IL-23 o un anticuerpo bloqueador del receptor anti-IL-23.
En algunas realizaciones, el segundo agente activo es niacina, bezafibrato; ciprofibrato; clofibrato; gemfibrozil; fenofibrato; DF4 (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2); DF5; RVX-208 (Resverlogix); avasimibe; sulfato de pactimiba (c S-505); CI-1011 (2 ,6 -diisopropilfenil [(2 , 4,6-triisopropilfenil)acetil]sulfamato); CI-976 (2 ,2 -dimetil-N-(2,4,6-trimetoxifenil)dodecanamida); VULM1457 (1-(2,6-diisopropil-fenil)-3-[4-(4'-nitrofeniltio)fenil] urea); CI-976 (2,2-dimetil-N-(2,4,6-trimetoxifenil)dodecanamida); E-5324 (n-butil-N'-(2-(3-(5-etil-4-fenil-lH-imidazol-1-il)propoxi)-6-metilfenil)urea); HL-004 (N-(2,6-diisopropilfenil) tetradeciltioacetamida); KY-455 (N-(4,6-dimetil-1 -pentilindolin-7-il)-2.2- dimetilpropanamida); FY-087 (N-[2-[N'-pentil-(6,6-dimetil-2,4-heptadiinil)amino]etil]-(2-metil-1-naftiltio)acetamida); MCC-147 (Mitsubishi Pharma); F 12511 ((S)-2',3',5'-trimetil-4'-hidroxi-alfa-dodeciltioacetanilida); SMP-500 (Sumitomo Pharmaceuticals); CL 277082 (2,4-difluoro-fenil-N[[4-(2,2-dimetilpropil)fenil]metil]-N-(heptil)urea); F-1394 3-[N-(2,2,5,5-tetrametil-1,3-dioxano-4-carbonil)amino]propionato) de ((1s,2s)-2-[3-(2,2-dimetilpropil)-3-nonilureido]aminociclohexano-1-ilo; CP- 113818 (amida del ácido N-(2,4-bis(metiltio)-6-metilpiridin-3-il)-2-(hexiltio)decanoico); YM-750; torcetrapib; anacetrapid; JTT-705 (Japan Tobacco/Roche); abciximab; eptifibatide; tirofiban; roxifiban; variabilin; XV 459 (N(3)-(2-(3-(4-formamidinofenil)isoxazolin-5-il)acetil)-N(2)-(1-butiloxicarbonil)-2.3- diaminopropionato); SR 121566A (ácido 3-[N-{4-[4-(aminoiminometil)fenil]-1,3-tiazol-2-il}-N-(1-carboximetilpiperid-4-il)aminol propiónico, trihidrocloruro); FK419 (trihidrato del ácido (S)-2-acetilamino-3-[(R)-[1-[3-(piperidin-4-il) propionil] piperidin-3-ilcarbonil] amino] propiónico); clopidogrel; prasugrel; cangrelor; AZD6140 (AstraZeneca); MRS 2395 (3-(2-chloro-6-metilaminopurin-9-il)-2-(2,2-dimetil-propionyloximetil)-propil éster del ácido 2,2-Dimetil-propiónicoc); BX 667 (Berlex Biosciences); BX 048 (Berlex Biosciences); darapladib (SB 480848); SB-435495 (GlaxoSmithKline); SB-222657 (GlaxoSmithKline); SB-253514 (GlaxoSmithKline); alefacept, efalizumab, metotrexato, acitretin, isotretinoin, hidroxiurea, micofenolato de mofetilo, sulfasalazina, 6 -Tioguanina, Dovonex, Taclonex, betametasona, tazarotena, hidroxicloroquina, sulfasalazina, etanercept, adalimumab, infliximab, abatacept, rituximab, trastuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD45 AHN-12 (NCI), Yodo-131 Anticuerpo Anti-Bl (Corixa Corp.), anticuerpo monoclonal anti-CD66 BW 250/183 (NCI, Southampton Genera1Hospital), anti-CD45 (NCI, Baylor College of Medicine), anti-anb3 integrina de anticuerpo (NCI), BiW-8962 (BioWa Inc.), anticuerpo BC8 (NCI), anticuerpo muJ591 (NCI), anticuerpo monoclonal de Indio In 111 MN-14 (NCI), anticuerpo monoclonal de itrio Y 90 MN-14 (NCI), anticuerpo monoclonal de F105 (NIAID), anticuerpo monoclonal de RAV12 (Raven Biotechnologies), CAT-192 (Anticuerpo monoclonal anti-TGF-betal humano, Genzyme), anticuerpo 3F8 (NCI), 177Lu-J591 (Weill Medical College of Cornell University), TB-403 (BioInvent International AB), anakinra, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, leflunomide, d-penicilamina, amitriptilina, o nortriptilina, clorambucil, mostaza nitrogenada, prasterona, LJP 394 (abetimus sódico), LJP 1082 (La Jolla Pharmaceutical), eculizumab, belibumab, rhuCD40L (NIAID), epratuzumab, sirolimus, tacrolimus, pimecrolimus, talidomida, globulina antitimocítica equina (Atgam, Pharmacia Upjohn), globulina antitimocítica-conejo (Thymoglobulin, Genzyme), Muromonab-CD3 (FDA Office of Orphan Products Development), basiliximab, daclizumab, riluzol, cladribina, natalizumab, interferon beta-lb, interferon betala, tizanidina, baclofen, mesalazinea asacol, pentasa, mesalamina, balsalazida, olsalazina, 6 -mercaptopurina, AIN457 (anticuerpo monoclonal Anti IL-17, Novartis), teofilina, D2E7 (un mAb anti-TNF humano de Knoll Pharmaceuticals), Mepolizumab (anticuerpo Anti-IL-5, SB 240563), Canakinumab (Anticuerpo Anti-IL-1 Beta, NIAMS), Anticuerpo receptor anti-IL-2 (Daclizumab, NHLBI), CNTO 328 (Anticuerpo monoclonal anti IL-6 , Centocor), ACZ885 (anticuerpo monoclonal anti-interleucina-lbeta completamente humano, Novartis), CNTO 1275 (Anticuerpo monoclonal anti-IL-12 completamente humano, Centocor), (3S)-N-hidroxi-4-({4-[(4-hidroxi-2-butinil)oxi]fenil}sulfonil)-2,2-dimet-il-3-tiomorfolina carboxamida (apratastat), golimumab (CNTO 148), Onercept, BG9924 (Biogen Idec), Certolizumab Pegol (CDP870, UCB Pharma), AZD9056 (AstraZeneca), AZD5069 (AstraZeneca), AZD9668 (AstraZeneca), AZD7928 (AstraZeneca), AZD2914 (AstraZeneca), AZD6067 (AstraZeneca), AZD3342 (AstraZeneca), AZD8309 (AstraZeneca),), ácido [(1R)-3-metil-1-({(2S)-3-fenil-2-[(pirazin-2-ilcarbonil)amino]propanoil}amino)butil]borónico (Bortezomib), AMG-714, (Anticuerpo monoclonal humano anti-IL 15, Amgen), ABT-874 (Anticuerpo monoclonal anti IL-12, Abbott Labs), MRA(Tocilizumab, un Anticuerpo monoclonal receptor anti-IL-6 , Chugai Pharmaceutical), CAT-354 (un anticuerpo monoclonal humano anti-interleucina-13, Cambridge Antibody Technology, MedImmune), aspirina, ácido salicílico, ácido gentísico, salicilato de colina y magnesio, salicilato de colina, salicilato de colina y magnesio, salicilato de colina, salicilato de magnesio, salicilato de sodio, diflunisal, carprofeno, fenoprofeno, fenoprofeno cálcico, flurobiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, nabutona, ketolorac, ketorolaco trometamina, naproxeno, oxaprozina, diclofenaco, etodolaco, indometacina, sulindac, tolmetina, meclofenamato, meclofenamato sódico, ácido mefenámico, piroxicam, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, CS-502 (Sankyo), JTE-522 (Japan Tobacco Inc.), L-745,337 (Almirall), NS398 (Sigma), betametasona (Celestone), prednisona (Deltasone), alclometasona, aldosterona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, ciclesonida, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, cortisona, cortivazol, deflazacort, desoxicorticosterona, desonida, desoximetasona, desoxicortona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, fluclorolona, fludrocortisona, fludroxicortida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortina, fluocortolona, fluorometolona, fluperolona, fluprednideno, fluticasona, formocortal, formoterol, halcinonida, halometasona, hidrocortisona, hidrocortisona aceponato, buteprato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, loteprednol, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, aceponato de metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisona, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, ulobetasolona; cisplatino; carboplatino; oxaliplatino; mecloretamina; ciclofosfamida; clorambucilo; vincristina; vinblastina; vinorelbina; vindesina; azatioprina; mercaptopurina; fludarabina; pentostatina; cladribina; 5-fluorouracilo (5FU); floxuridina (FUDR); arabinósido de citosina; metotrexato; trimetoprima; pirimetamina; pemetrexed; paclitaxel; docetaxel; etopósido; tenipósido; irinotecan; topotecan; amsacrina; etopósido; fosfato de etopósido; tenipósido; dactinomicina; doxorrubicina; daunorrubicina; valrubicina; idarubicina; epirrubicina; bleomicina; plicamicina; mitomicina; trastuzumab; cetuximab; rituximab; bevacizumab; finasterida; goserelina; aminoglutetimida; anastrozol; letrozol; vorozol; exemestano; 4-androsteno-3,6,17-triona ("6 -OXO"; 1,4,6-androstatrien-3,17-diona (ATD); formestano; testolactona; fadrozol o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un antibiótico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agente antibacteriano. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, geldanmicina, herbimicina, loracarbef, ertapenem, doripenem, imipenem, cilastatina, meropenem, cefadroxil, cefazolin, cefalotin, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, defprozil, cefuroxima, cefixime, cefdinir, cefditoren, cefoperazon, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepime, ceftobiprole, teicoplanin, vancomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, aztreonam, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, piperacilina, ticarcilan, bacitracina, colistin, polimixina B, ciprofloxacin, enoxacin, gatifloxacin, levofloxacin, lomefloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, ofloxacin, trovfloxacin, mafenide, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilamida, sulfsalazina, sulfsioxazol, trimetoprim, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxtetraciclina, tetraciclina, arsfenamina, cloramfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácido fusídico, furazolidona, isoniazid, linezolid, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, rifampin, tinidazol, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agente antivírico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es aciclovir, famciclovir, valaciclovir, abacavir, aciclovir, adfovir, amantadina, amprenavir, arbidol., atazanavir, artipla, brivudina, cidofovir, combivir, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtide, entecavir, fomvirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, gardasil, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidores de la integrasa, interferones, incluido el interferón tipo I (por ejemplo, IFN a e IFN p), interferón tipo II, interferón tipo III, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK-0518, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósidos, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidores de la proteasa, inhibidores de la transcriptasa reversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agente antifúngico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es amrolfina, utenafina, naftifina, terbinafina, flucitosina, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, clotrimazol, econazol, miconazol, oxiconazol, sulconazol, terconazol, tioconazol, nikkomycin Z, caspofungina, micafungina, anidulafungina, anfotericina B, nistastina liposomal, pimaricina, griseofulvina, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato, undecilenato, clioquinol, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agente antiparasitario. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es amitraz, amoscanato, avermectina, carbadox, dietilcarbamizina, dimetridazol, diminazeno, ivermectina, macrofilaricida, malatión, mitaban, oxamniquina, permetrina, praziquantel, pamoato de pirantel, selamectina, estibogluconato de sodio, tiabendazol, combinaciones de los mismos.
Combinaciones con células y tejidos.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con una célula, una pluralidad de células o un tejido.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con una célula terapéutica. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un trasplante de células madre. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un trasplante de órgano.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra simultáneamente (por ejemplo, simultáneamente, esencialmente de manera simultánea o dentro del mismo protocolo de tratamiento) con un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se administra antes o después de un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, el período de tiempo entre la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento y el trasplante de tejido varía de unos pocos minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmacéutico, tales como la potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media plasmática y perfil cinético del agente farmacéutico. En algunas realizaciones, la variación circadiana de la concentración de la molécula diana determina el intervalo de dosis óptimo. En algunas realizaciones, el tiempo entre la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento y un segundo agente activo es aproximadamente menos de una hora, menos de un día, menos de una semana o menos de un mes.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un trasplante de tejido y un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un trasplante de tejido y un inhibidor de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina o tacrolimus); un inhibidor de mTOR (sirolimus; everolimus); un agente antiproliferativo (azatioprina o ácido micofenólico); un corticosteroide (por ejemplo, prednisolona o hidrocortisona); un anticuerpo receptor anti-IL-2Ra monoclonal (por ejemplo, basiliximab o daclizumab); anticuerpos policlonales anti-células T (por ejemplo, globulina anti-timocitos (a Tg ) o globulina anti-linfocitos (ALG)); o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un tejido se recubre con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, una pluralidad de células madre se recubren con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento. En algunas realizaciones, un órgano se recubre con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, recubrir un tejido con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento evita que el sistema inmunitario del huésped actúe sobre un tejido.
En algunas realizaciones, un órgano, tejido o pluralidad de células madre se pone en contacto con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, un órgano, tejido o pluralidad de células madre se pone en contacto con una composición que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición tiene un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.5. En algunas realizaciones, la composición tiene un pH de 7.4. En algunas realizaciones, la composición comprende además potasio, magnesio y rafinosa. En algunas realizaciones, la composición comprende además al menos uno de adenosina, glutatión, alopurinol y almidón de hidroxietilo. En algunas realizaciones, la composición es una solución UW complementada con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento.
En algunas realizaciones, el órgano, tejido o pluralidad de células madre se ponen en contacto con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas o aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones, el contacto se produce a una temperatura que protege los tejidos y el acondicionamiento vascular (por ejemplo, menos que la temperatura ambiente). En algunas realizaciones, el contacto se produce a 4°C.
Combinaciones de dispositivos médicos
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento se coadministra con un dispositivo médico. En algunas realizaciones, el dispositivo médico o una porción del mismo se pone en contacto con un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en este documento se usa para recubrir un dispositivo médico o una porción del mismo como se describe en otra parte del presente documento. En alguna realización, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento en combinación con un dispositivo médico reduce, inhibe o previene reacciones inflamatorias contra el dispositivo médico implantado. En alguna realización, la administración de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 divulgado en el presente documento en combinación con un dispositivo médico reduce, inhibe o previene la formación de biopelículas infecciosas que son producidas por el crecimiento de microorganismos en el dispositivo médico implantado (es decir, infección crónica por biopelícula). Ejemplos de tales biopelículas son las producidas por bacterias, tales como, pero sin limitarse a, Staphylococcus aureus.
Artículos de fabricación y kits
Los artículos de fabricación proporcionados en este documento contienen materiales de empaque. Los materiales de empaque para uso en el empaque de productos farmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de materiales de empaque farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, empaques tipo blíster, botellas, tubos, inhaladores, inhaladores (por ejemplo, Inhaladores de dosis medidas presurizadas (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI), nebulizadores (por ejemplo, nebulizadores de chorro o ultrasónicos) y otros sistemas líquidos de respiración única), bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, botellas y cualquier material de empaque adecuado para una formulación seleccionada y el modo de administración y tratamiento previstos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se incorpora, aplica a o recubre en dispositivos médicos, tales como implantes, catéteres, articulaciones artificiales, cánulas, válvulas, nanopartículas o microcápsulas.
En algunas realizaciones, las composiciones o combinaciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se proporcionan como kits. Los kits incluyen opcionalmente uno o más componentes tales como instrucciones de uso, dispositivos y reactivos adicionales (por ejemplo, agua esterilizada o soluciones salinas para diluir las composiciones y/o reconstituir la proteína liofilizada) y componentes, tales como tubos, recipientes y jeringas para práctica de los métodos. Los kits de ejemplo incluyen las composiciones farmacéuticas o combinaciones proporcionadas en este documento, y opcionalmente incluyen instrucciones de uso, un dispositivo para administrar las composiciones farmacéuticas o combinaciones a un sujeto, un dispositivo para detectar los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en un sujeto, un dispositivo para detectar los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en muestras obtenidas de un sujeto, y un dispositivo para administrar un agente terapéutico adicional a un sujeto.
El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones. Las instrucciones típicamente incluyen una expresión tangible que describe los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 y, opcionalmente, otros componentes incluidos en el kit, y métodos de administración, incluidos métodos para determinar el estado adecuado del sujeto, la cantidad de dosificación adecuada, regímenes de dosificación y el método de administración adecuado para administrar los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, las instrucciones incluyen una guía para monitorizar al sujeto durante la duración del tiempo de tratamiento.
En algunas realizaciones, los kits incluyen una composición farmacéutica descrita en este documento y un ítem para diagnóstico. Por ejemplo, tales kits incluyen un ítem para medir la concentración, cantidad o actividad de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 seleccionados en un sujeto.
En algunas realizaciones, los kits proporcionados en este documento incluyen un dispositivo para administrar los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 a un sujeto. En algunas realizaciones, cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos a un sujeto se incluye en los kits proporcionados en este documento. Los dispositivos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un inhalador (por ejemplo, Inhalador de dosis medida presurizado (MDI), inhalador de polvo seco (DPI), nebulizador (por ejemplo, nebulizadores de chorro o ultrasónicos) y otro sistema líquido de respiración única), una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter y un dispensador de líquido tal como un gotero. Típicamente, el dispositivo para administrar los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 del kit será compatible con el método de administración deseado de los complejos nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3.
Expansión de cultivos de células madre
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan métodos para expandir una célula madre aislada sobre un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento. Como se describe en el presente documento, los complejos HC-HA/PTX3 promueven la agregación de células madre, previenen la diferenciación de las células y conservan la expresión de marcadores de células madre. En algunas realizaciones, la expansión en un complejo nHC-HA/PTX3 o complejo rcHC-HA/PTX3 conserva la expresión de uno o más marcadores de células madre embrionarias (ESC) (por ejemplo, Oct4, Nanog, Sox2 (SRY (región Y determinante del sexo)-caja 2), Rex1 (Zfp42), SSEA4 (antígeno embrionario específico de estadio 4), MYC/c-Myc y KLF4, marcadores de pericitos (por ejemplo, NG2 (antígeno neuronal glial 2/proteoglicano sulfato de condroitina 4 (CSPG4)), PDGFR-p (receptor B del factor de crecimiento derivado de plaquetas) y a-SMA (a-actina del músculo liso)) y marcadores angiogénicos (por ejemplo, CD133/2, FLK-1 (VEGF-R2, Ly-73), vWF (factor von Willebrand), Cd34, CD31 (PECAM-1) y CD146). En algunas realizaciones, la expresión del marcador de células madre se determina mediante métodos convencionales, tales como por ejemplo, análisis de expresión de proteínas (por ejemplo, transferencia Western, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia) o análisis de ARNm (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o Northern).
En algunas realizaciones, nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 suprime la señalización de TGF-p en una célula cultivada. En algunas realizaciones, nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 suprime la señalización de TGF-p en una célula madre cultivada. En algunas realizaciones, la supresión de la señalización de TGF-p se refiere a una disminución en la actividad o expresión de una o más proteínas o marcadores en la vía de señalización de las células TGF-p, tal como la señalización de pSMAD 2/3, formación de músculo liso a, en una célula en presencia del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en comparación con la ausencia del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3.
En algunas realizaciones, nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inducen la señalización de BMP en una célula cultivada. En algunas realizaciones, nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inducen la señalización de BMP en una célula madre cultivada. En algunas realizaciones, la supresión de la señalización de TGF-p se refiere a un aumento en la actividad o expresión de una o más proteínas en la vía de señalización de BMP, tal como BMP-2, BMP-4, BMP-6 y pSMAD1/5/8, en una célula en presencia del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 en comparación con la ausencia del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3.
En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre embrionaria. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre adulta. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre fetal. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre pluripotente/progenitora inducida (iPSC).
En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre mesenquimatosa. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre adiposa (ASC). En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre de membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula limbal, tal como una célula de nicho limbal o una célula progenitora epitelial limbal. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre endotelial. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre hematopoyética. En algunas realizaciones, la célula madre aislada es una célula madre de médula ósea. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre neural. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula progenitora endotelial. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre de músculo esquelético. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre mamaria. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre intestinal.
En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre pluripotente/progenitora inducida (iPSC). En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre pluripotente inducida derivada de una célula adulta diferenciada o parcialmente diferenciada. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre pluripotente inducida derivada de un fibroblasto. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 es una célula madre pluripotente inducida derivada de un fibroblasto corneal humano.
En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de un tejido fetal, tal como tejido placentario o tejido de cordón umbilical. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de la membrana amniótica. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de tejido adiposo. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de tejido limbal. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de la médula ósea. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de tejido endotelial. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de tejido limbal. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de tejido neural. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva del tejido limbal. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva del músculo esquelético. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de la piel. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva del sistema digestivo. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva del páncreas. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva del hígado. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de la mucosa olfativa. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de una población de células germinales. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de sangre. En algunas realizaciones, la célula madre aislada cultivada en nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 se deriva de sangre de cordón umbilical.
En algunas realizaciones, el complejo HC-HA/PTX3 es un nHC-HA/PTX3 aislado de la membrana amniótica o del cordón umbilical. En algunas realizaciones, el complejo HC-HA/PTX3 es un complejo HC-HA reconstituido. En algunas realizaciones, HA está unido covalentemente a HC. En algunas realizaciones, la HC de IaI es la cadena pesada 1 (HC1). En algunas realizaciones, el complejo HC-HA comprende pentraxina 3 (PTX3).
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende un SLRP de clase I, clase II o clase II. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende PTX3 y un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase I, tal como decorina y biglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase II, tales como fibromodulina, lumican, PRELP (proteína rica en leucina de extremo rico en arginina prolina), queratocán y osteoadherina. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina se selecciona de entre SLRP de clase III, tales como epipycan y osteoglicina.
En algunas realizaciones, la célula madre aislada se expande sobre un sustrato que comprende nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inmovilizados. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 inmovilizados comprende uno o más pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el SLRP se selecciona de entre bikunina, decorina, biglicano y osteoadherina. En algunas realizaciones, la pequeña proteína rica en leucina comprende un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina comprende queratán sulfato.
En algunas realizaciones, la célula madre aislada se expande en un medio de cultivo que comprende el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 comprende uno o más pequeños proteoglicanos ricos en leucina (SLRP). En algunas realizaciones, el SLRP se selecciona de entre bikunina, decorina, biglicano y osteoadherina. En algunas realizaciones, la pequeña proteína rica en leucina comprende un glicosaminoglicano. En algunas realizaciones, el pequeño proteoglicano rico en leucina comprende queratán sulfato. En algunas realizaciones, el medio es medio de células madre embrionarias, medio de células madre embrionarias modificado, medio epitelial hormonal suplementado y/o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el medio se complementa con uno o más factores de crecimiento. En algunas realizaciones, el medio se complementa con EGF, bFGF y/o LIF. En algunas realizaciones, el medio se complementa con un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (inhibidor de ROCK).
Inducir y mantener la pluripotencia
En el presente documento, en ciertas realizaciones, se divulgan métodos para inducir pluripotencia en una célula o mantener la pluripotencia de una célula madre sobre un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. Como se describe en el presente documento, los complejos HC-HA/PTX3 ayudan en el mantenimiento de la expresión del marcador de células madre y previenen la diferenciación de las células durante los pases sucesivos de una población de células madre. Además, como se describe en el presente documento, los complejos HC-HA/PTX3 promueven la inducción de las propiedades de las células madre en una población de células diferenciadas o parcialmente diferenciadas.
En ciertas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 promueve o induce la pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada. En ciertas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 promueve o induce la pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada en comparación con una célula diferenciada o parcialmente diferenciada cultivada en ausencia de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En un método de ejemplo, una célula diferenciada o una célula parcialmente diferenciada se cultiva en un sustrato que comprende el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3, mediante el cual se induce la pluripotencia en la célula.
En ciertas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 promueve o induce además la pluripotencia de una célula madre. En ciertas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 además promueve o induce la pluripotencia de una célula madre en comparación con una célula madre cultivada en ausencia de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En un método de ejemplo, se cultiva una célula madre en un sustrato que comprende complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3, por lo que se mantiene la pluripotencia en la célula madre. En un método de ejemplo, se cultiva una célula madre sobre un sustrato que comprende complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3, por lo que se induce además la pluripotencia en la célula madre.
Utilizando la reprogramación genética con factores de transcripción de proteínas, se han derivado células madre pluripotentes equivalentes a células madre embrionarias a partir de tejido cutáneo humano adulto. Las células iPSC se derivan típicamente por transfección de ciertos genes asociados a células madre en células no pluripotentes, tales como fibroblastos adultos. La transfección se logra típicamente a través de vectores virales, tales como retrovirus, donde el gen de pluripotencia está operativamente ligado a un promotor para la expresión génica. Cuatro genes clave de pluripotencia esenciales para la producción de células madre pluripotentes son Oct-3/4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc y Klf4. Otros genes pueden mejorar la eficiencia de la inducción. En algunos estudios, se han empleado Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 para inducir la pluripotencia. En ciertos casos, después de 3-4 semanas, pequeñas cantidades de células transfectadas comienzan a volverse morfológica y bioquímicamente similares a las células madre pluripotentes, y típicamente se aíslan mediante selección morfológica, tiempo de duplicación o mediante un gen indicador y selección de antibióticos.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para inducir pluripotencia en una célula diferenciada o parcialmente diferenciada usando la expresión heteróloga de menos de cuatro de los factores de transcripción esenciales Oct-3/4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc y Klf4. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia cuando el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 mejora la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que expresa al menos uno de Oct-3/4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc y/o Klf4 por transferencia de genes heterólogos. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia donde el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 mejora la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que expresa uno, dos o tres factores seleccionados de entre Oct-3/4 (Pou5f1), Sox2, c-Myc y/o Klf4 por transferencia de genes heterólogos. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia cuando el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 mejora la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que expresa Oct-3/4 (Pou5f1) por transferencia genética heteróloga. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia cuando el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 mejora la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que Sox2 mediante transferencia de genes heterólogos. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia cuando el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 potencia la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que expresa c-Myc mediante transferencia de genes heterólogos. En algunas realizaciones, se proporciona un método para inducir pluripotencia cuando el uso de un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 mejora la inducción de pluripotencia de una célula diferenciada o parcialmente diferenciada que expresa Klf4 mediante transferencia de genes heterólogos.
En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar uno o más de Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar al menos uno de Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar uno, dos o tres de Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar Oct-3/4 (Pou5f1); y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar SOX2; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar c-Myc; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce para expresar Klf4; y la célula transducida se cultiva en un sustrato que comprende un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, la célula se transduce para expresar uno o más genes adicionales, tales como, por ejemplo, Nanog, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tel1 y p-catenina.
En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce con un vector viral que contiene uno o más genes que codifican uno o más de Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4. En algunas realizaciones, una célula diferenciada o parcialmente diferenciada se transduce con dos o más vectores virales que contienen uno o más genes que codifican uno o más de Oct-3/4 (Pou5f1), SOX2, c-Myc y Klf4.
Diversos métodos para la inducción, cultivo y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas y la evaluación de la pluripotencia de las células madre inducidas, incluida la evaluación de marcadores de células madre y la inducción de diferentes linajes celulares, son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos descritos en la patente U.S. 7,682,828, 8,048,999, 8,211,697, 7,951,592, y las publicaciones de patente U.S. 2009/0191159 y 2010/000375.
En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 reduce el tiempo de inducción de pluripotencia en la célula transducida en comparación con una célula transducida cultivada en ausencia del complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 aumenta el porcentaje de células transducidas que son inducidas a pluripotencia en una población de células transducidas en comparación con células transducidas cultivadas en ausencia de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC--HA/PTX3 en comparación con una célula transducida cultivada en ausencia de complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 potencia el nivel de pluripotencia en la célula transducida. En algunas realizaciones, el complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 disminuye el número de factores de transcripción heterólogos requeridos para la inducción de pluripotencia en la célula transducida.
En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento inhibe la señalización de TGFp1 en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado aquí inhibe la translocación nuclear de SMAD2 o SMAD3 en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en este documento inhibe la formación de actina de músculo liso alfa en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento activa la señalización de BMP4 en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento activa la señalización de BMP6 en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento induce la expresión de un marcador de células embrionarias en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC. En algunas realizaciones, un complejo nHC-HA/PTX3 o rcHC-HA/PTX3 proporcionado en el presente documento induce la expresión de c-myc, KLF-4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, Sox-2 y SSEA-4 en una célula diferenciada, una célula madre o una iPSC.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de las reivindicaciones está destinado únicamente a fines ilustrativos y comparativos y no forma parte de la invención. Ejemplo 1. Purificación de complejos HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativos a partir de extractos de membrana amniótica humana (AME)
Preparación de extracto de membrana amniótica (AME) y polvo de AM (AMP)
La AM humana congelada obtenida de Bio-tissue (Miami, FL) se lavó 2-3 veces con PBS para eliminar el medio de almacenamiento. Para preparar AME, se transfirió AM a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril y se centrifugó a 4°C durante 5 min a 5000 * g para eliminar el exceso de líquido. Se pesó AM (~ 10 mg/cm2), se transfirió a una placa de Petri estéril de 100 mm o 150 mm y se congeló en la fase de aire de un recipiente de nitrógeno líquido durante 20 min antes de cortarla en trozos pequeños con un bisturí desechable y homogeneizar con Tissue-Tearor (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK) en PBS. El homogeneizado se mezcló a 4°C durante 30 min y se centrifugó a 48,000 x g durante 30 min. El sobrenadante se recolectó, se designó como AME y se usó para la purificación de nHC-HA/PTX3 o se almacenó a -80°C.
Para preparar polvo de AM liofilizado (AMP), se transfirió AM congelada en un congelador a -80°C y se liofilizó en un liofilizador de mesa superior (Freezone 4.5, Labconco, Kansas City, MO) durante 16 horas. A continuación, la AM liofilizada se micronizó en su forma de matriz (AMP) mediante un Mixer Mill (Retsch, Newtown, PA). El AMP se almacenó por debajo de -20°C para análisis adicionales.
Purificación del complejo HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativo
Se disolvió AME en una mezcla de CsCl/guanidina HCl 4M a una densidad inicial de 1.35 g/ml y se centrifugó a 125,000 x g durante 48 h a 15°C. Se recolectó un total de 15 fracciones (0.8 ml/fracción) desde la parte superior hasta la parte inferior de cada tubo. La concentración de proteína total para cada fracción se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas BCA. La concentración de hialuronano (HA) para cada fracción se determinó mediante un kit de ensayo cuantitativo HA basado en ELISA de Corgenix (Westminster, CO) (Figura 1A). Las fracciones # 8-15, que contenían HA pero no proteínas detectables, se combinaron y se usaron para una segunda ultracentrifugación. Se guardó una muestra de las fracciones agrupadas (designadas AM 1°) para su análisis. Las fracciones agrupadas se ajustaron con CsCl/guanidina HCl 4 M a una densidad inicial de 1.40 g/ml, se centrifugaron y fraccionaron de la misma manera que se describe anteriormente (Figura 1B). Las fracciones #3-15, que contenían HA pero no proteínas detectables, se combinaron (designadas AM 2°) y se dializaron contra agua destilada para eliminar CsCl y guanidina HCl. El dializado se liofilizó de la misma manera que para el AMP descrito anteriormente. Alternativamente, el dializado se mezcló con 3 volúmenes de etanol al 95% (v/v) que contenía acetato de potasio al 1.3% (p/v) a 0°C durante 1 h. Después de centrifugar a 15,000 x g, el sedimento se lavó con etanol al 70% (v/v) y se centrifugó de nuevo. El sedimento se secó brevemente al aire y se almacenó a -80°C. El polvo y el sedimento se designaron como complejo nHC-HA/PTX3.
En algunos casos, la muestra agrupada pasó por tres o cuatro veces de ultracentrifugación. En estas ultracentrifugaciones, sólo se agruparon las fracciones # 7-12 y la densidad inicial de CsCl/guanidina HCl 4M es de 1.42 g/ml. Después de la tercera o cuarta ultracentrifugación, las fracciones agrupadas #7-12 se denominan nHC-HA/PTX3 (3a) o nHC-HA/PTX3 (4a).
Las fracciones agrupadas de AME después de la 1a, 2a, 3a o 4 a ultracentrifugaciones se trataron con o sin NaOH 0.05 N a 25°C durante 1 h. Las fracciones agrupadas de la 1a, 2a, 3a o 4 a ultracentrifugación también se digirieron con 20 unidades/ml de hialuronidasa (HAasa) (Seikagaku Biobusiness Corporation, Tokio, Japón) a 60°C durante 2 h.
Las muestras de las fracciones combinadas y las muestras tratadas con NaOH y HAasa se procesaron luego en geles de agarosa al 0.5% y se analizaron mediante tinción con colorante Stains-all (Figura 1C) o mediante transferencia Western usando anticuerpos contra la cadena pesada de IaI 1 (HC1) (Figuras ID e IF), pentraxina 3 (PTX3) (Figuras IE y 1G), cadena pesada 2 de IaI (HC2) (Figura 1H), cadena pesada 3 de IaI (h C3) (Figura II), bikunina (Figura 1J), Gen 6 estimulado con TNF (Ts G-6) (figura 1K), trombospondina-1 (TSP-1) (figura 1L) o IGFBP 1-3 y PF4 (figura 1M), de los cuales los dos últimos fueron analizados mediante ensayos de puntos de proteínas utilizando matrices de angiogénesis humana (cada matriz contiene 56 proteínas angiogénicas diferentes, R&D Systems, Minneapolis, MN). En resumen, se incubaron por separado 1.5 ml de extracto de AM humana (25 pg/ml HA) y nHC-HA/pTX3 purificado (2do) (25 pg/ml HA) con los anticuerpos de detección prerrecubiertos en la membrana durante la noche a 4°C, seguido de incubación con el anticuerpo secundario. Las señales se detectaron con luz quimioluminiscente expuesta a una película de rayos X. Los datos de la matriz en la película de rayos X revelada se cuantificaron escaneando la película en un escáner de modo de transmisión, y la película de imagen de la matriz se analizó con el software ImageJ1.46 (National Institutes of Health, Bethesda, m D).
La caracterización bioquímica mostró que nHC-HA/PTX3 está compuesto de HA de alto peso molecular (HMW HA) (Figura 1C) unida covalentemente a la cadena pesada 1 (HC1) de IaI y PTX3. Tanto HC1 como PTX3 en nHC-HA/PTX3 se liberan solo después del tratamiento de hialuronidasa (HAasa) o NaOH (Figuras 1D-G), lo que demuestra que HCl está enlazada a HA mediante enlaces éster como se informa.
Por el contrario, nHC-HA/PTX3 no contiene HC2 (Figura 1H), HC3 (Figura 1I, una banda de ~ 12 kDa detectada solo después del tratamiento con NaOH es probablemente inespecífica), bikunina (Figura 1J), TSG -6 (fIGURA 1K) y TSP-1 (fIGURA 1L). La proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-1-3 (IGFBP1-3) y el factor plaquetario 4 (PF4) se detectan mediante el ensayo de puntos de proteína (similar a ELISA) en nHC-HA/PTX3 (2°) (Figura 1J); no está claro si todavía están en nHC-HA/PTX3 (4°).
Ejemplo 2. Preparación de HA inmovilizado (iHA) mediante enlace covalente
Una serie de cantidades de hialuronano (HA) (0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10 y 25 pg/pocillo) de HMW HA (Healon, Advanced Medical Optics, Santa Ana, CA) o nHC-HA/PTX3 (2do) se añadió a la solución de acoplamiento que contenía Sulfo-NHS (0,184 mg/ml) y EDAC (0,123 mg/ml) (Ambos eran de Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se incubaron en placas Covalink™ -NH de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific Inc.), durante 16 ha 4°C. Después de tres lavados de guanidina-HCl 8 M (GnHCl) seguidos de lavados con PBS, e1HA acoplado de HMW HA o nHC-HA/PTX3 se midió cuantitativamente mediante HA ELISA de Corgenix (Westminster, CO) de acuerdo con el protocolo del fabricante (fIGURA 6A). HMW HA y nHC-HA/PTX3 purificados a partir de AM se acoplan covalentemente y de forma dependiente de la dosis a las superficies de 96 pocillos Covalink-NH. El iHA resultante o el nHC-HA/PTx3 inmovilizado es resistente a los lavados con guanidina HCl 8 M. E1HA de HMW HA o nHC-HA/PTX3 se acopló al máximo a 2 pg/pocillo de entrada equivalente de HA (Figura 6A).
Para determinar la eficiencia de acoplamiento, se acopló HA de HMW HA o nHC-HA/PTX3 a Covalink™ -NH por pocillo de las placas de 96 pocillos, y se midió HA no unido y unido de HMW HA o nHC-HA/PTX3 mediante HA ELISA (Figura 6B). Se añadieron 2 pg de HA de HMW HA o nHC-HA/PTX3 a la solución de acoplamiento que contenía Sulfo-NHS (0,184 mg/ml) y EDAC (0,123 mg/ml) [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ] en H2O y se incubaron en placas de 96 pocillos Covalink™-NH (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), durante 16 h a 4°C. Tanto el HA acoplado a los pocillos como el no unido en la solución lavada (agrupada) se midieron con HA ELISA de Corgenix (Westminster, CO) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad total de HA en cada pocillo acoplado o no unido se divide por la cantidad de HA de entrada (2 pg/pocillo) para calcular la eficiencia de acoplamiento o el porcentaje no unido. Se determinó que la eficiencia de acoplamiento promedio era 70.5 ± 13.4% para HMW HA y 69.0 ± 5.7% para nHC-HA/PTX3 (Figura 6B). Entonces, 2 pg/pocillo de entrada de HA da como resultado aproximadamente 1.4 pg de iHA.
Ejemplo 3. Actividad de complejos HC-HA/PTX3 (nHC-HA/PTX3) nativos purificados
Unión de macrófagos estimulados con LPS a nHC-HA/PTX3 inmovilizados
Se sembraron células RAW264.7 (100 |jl de 2.5 x 105 células/ml) [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA] en DMEM/FBS al 10% (Life Technologies, Grand Island, NY) en placas de 96 pocillos que contenían HA inmovilizado (Advanced Medical Optics, Santa Ana, CA, 2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o control de PBS y estimulado con lipopolisacárido (LPS) (1 jg/ml) (n=3) [LPS-EB Ultrapure, InvivoGen, San Diego, CA]. La inmovilización de HA y nHC-HA/PTX3 en la superficie de 96 pocillos de Covalink-NH se realizó de forma similar a la descrita anteriormente. En resumen, las placas Covalink-NH de 96 pocillos se esterilizaron en alcohol al 70% durante 2 h, se lavaron 3 veces con agua destilada y se agregaron 100 j l de 0,184 mg/ml de Sulfo-NHS (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y 0,123 mg/ml de EDAC (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) en agua destilada que contiene 20 jg/ml de HA o nHC-HA/PTX3 por placa de 96 pocillos (los pocillos de control PBS contienen todos los reactivos excepto HA y nHC-HA/PTX3). La placa se incubó a 4°C durante la noche o a 25°C durante 2 h antes de retirar la solución de acoplamiento, se lavó 3 veces con PBS que contenía NaCl 2 M y MgSO450 mM, y seguido de 3 lavados con PBS. Después de la incubación durante 90 min, se retiraron las células no unidas y las células unidas se fotografiaron y contaron mediante el ensayo CyQuant (Figura 2A). Se observó un aumento de más de 3 veces en la unión de macrófagos estimulados con LPS para los pocillos que contenían nHC-HA/PTX3 inmovilizado en comparación con los pocillos de control. Los pocillos que contenían HA inmovilizado inhibieron la unión de macrófagos estimulados con LPS.
A continuación, se examinó la viabilidad celular de los macrófagos estimulados con LPS unidos. Se incubaron células RAW264.7 estimuladas con LPS (100 j l de 2.5 x 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% en control de PBS inmovilizado, HA o nHC-HA/PTX3 durante 24 h como se describió anteriormente (n= 3). Después de la incubación, se midió la viabilidad celular de los macrófagos unidos mediante ensayo MTT. No se observaron diferencias significativas (todos los valores de p> 0.05) en la viabilidad celular entre las células de estos sustratos inmovilizados (Figura 2B).
Después se examinó la capacidad de bloquear anticuerpos y péptidos para inhibir la unión de macrófagos estimulados con LPS a nHC-HA/PTX3 inmovilizado. Se preincubaron células RAW264.7 (a una concentración de 2.5 x 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% con los anticuerpos bloqueadores contra CD44 (10 jg/ml), TLR2 (10 jg/ml), TLR4 (10 jg/ml)), integrina av (20 jg/ml), p1 (20 jg/ml), p2 (20 jg/ml) o p3 (20 jg/ml) o péptidos RGD (s Dg RG, RGDS, GRGDS, todos a 1 mg/ml), junto con los anticuerpos de control de isotipo [IgG de rata (10 jg/ml), IgG de ratón (10 jg/ml) o IgG de hámster armenio (20 jg/ml)] o un péptido de control RGD (1 mg/ml), en hielo durante 30 min (n= 3). (Los anticuerpos contra CD44 e IgG de rata eran de BD Pharmingen, San Diego, CA; los anticuerpos contra TLR2, TLR4 e IgG de ratón eran de InvivoGen, San Diego, CA; los anticuerpos contra la integrina av, p1, p2, p3 e IgG de hámster armenio eran de Biolegend, San Diego, CA; Los péptidos RGD eran de Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Después de añadir LPS (1 jg/ml), las células se sembraron en placas que contenían HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o control PBS y se incubaron durante 90 min (n= 3). Después de la incubación, se eliminaron las células no unidas y las células unidas se fotografiaron y contaron mediante el ensayo CyQuant (Figura 2C). Los resultados mostraron que los anticuerpos contra CD44 y TLR4 inhibieron significativamente la unión de macrófagos estimulados con LPS, demostrando que estos receptores están involucrados en la unión de macrófagos estimulados con LPS a nHC-HA/PTX3 inmovilizado.
Polarización de macrófagos estimulados con LPS
Se examinó la polarización de macrófagos estimulados con LPS hacia el fenotipo M1 o M2 mediante nHC-HA/PTX3 inmovilizado determinando la expresión de genes que codifican marcadores M1 y M2 mediante análisis de ARN y proteínas.
Se sembraron células RAW264.7 (100 j l de 2.5 x 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% en placas de 96 pocillos que contenían HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o PBS control y estimulado con LPS (1 jg/ml) durante 4 h (n= 3). Después de la incubación, se eliminaron las células no unidas y se extrajeron los ARN totales de las células unidas. La expresión de ARNm de marcadores M1 (factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) (Mm00443258_m1) y subunidad p40 de interleucina 12 (IL-12p40) (Mm00434165_m1)) y marcadores M2 (interleucina-10 (IL-10) (Mm00439614_m1), Arginasa-1 (Arg-1) (Mm00475988_m1), LIGHT/TNSF14 (Mm00444567_m1, y esfingosina quinasa-1 (SPHK1) (Mm0044884_g1)) se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real con glceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Mm1D9999) como control endógeno. La PCR en tiempo real se realizó en sistema 7300 de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA). El programa de amplificación consistió en 10 min de activación inicial a 95°C seguido de 40 ciclos de desnaturalización de 15 segundos a 95°C, y 1 min de hibridación y extensión a 60°C. Los datos de expresión génica relativa se analizaron mediante el método comparativo de CT (AACT). Todos los ensayos se realizaron por triplicado; los resultados fueron normalizados por GAPDH como control interno. Todos los cebadores eran de Applied Biosystems. Se observó una inducción significativa de la expresión de los marcadores M2 IL-10, Arg-1, LIGHT y SPHK1 en comparación con el control en células unidas a nHC-HA/PTX3 inmovilizado, pero no a HA (Figura 3A). Además, se redujo la expresión de ambos marcadores M1, TNF-a e IL-12p40.
La cantidad de proteína TNF-a secretada se midió en sobrenadantes de cultivo de células tratadas con estimulación con LPS (1 jg/ml) durante 4 h en DMEM/FBS al 10% en placas que contenían HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC HA/PTX3 (2 |jg/pocillo) o control de PBS como se describió anteriormente (n= 3). La cantidad de TNF-a se midió mediante ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN).
Se observó una cantidad reducida de TNF-a en los sobrenadantes del cultivo celular de células incubadas en placas que contenían nHC-HA/PTX3 inmovilizado en comparación con el control de PBS (Figura 3B). No se observó ningún cambio en la cantidad de TNF-a en la placa de HA inmovilizada.
La alta expresión de IRF-5 es característica de los macrófagos M1. IRF-5 activa directamente la transcripción de los genes que codifican IL-12p40, IL-12p35 e IL-23p19 y reprime el gen que codifica IL-10. Se examinó la expresión de la proteína IRF-5 y su citolocalización en nHC-HA/pTX3 inmovilizado. Las células sembradas en el control inmovilizado o nHC-HA/PTX3 se estimularon con LPS (1 jg/ml) durante 4 o 24 h en DMEM/FBS al 10%. La expresión de la proteína IRF-5 en lisados celulares (estimulación con LPS durante 24 h) se detectó mediante transferencia Western (Figura 3C, izquierda) (anticuerpo primario: abcam, Cambridge, AM; anticuerpo secundario, DAKO, Carpinteria, CA). En un experimento paralelo, las células (estimulación con LPS durante 4 h) se fijaron y se inmunotiñeron con anticuerpo anti-IRF-5. La citolocalización de IRF-5 se examinó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal (microscopio confocal LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Alemania) (Figura 3C, derecha). El nHC-HA/PTX3 inmovilizado redujo la expresión y evitó la localización nuclear de IRF-5. Estos resultados son consistentes con la supresión del fenotipo Mi por nHC-HA/PTX3 inmovilizado.
Apoptosis de neutrófilos activados y fagocitosis de macrófagos de neutrófilos apoptóticos
Los neutrófilos se aislaron de la sangre periférica humana normal usando la centrifugación de densidad de dextrano [Lymphocyte Poly (R), Cedarlane USA, Burlington, NC] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron neutrófilos aislados a 2 * 106 células/ml en IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove, Life Technologies, Grand Island, NY) en HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o PBS control y tratados con PBS (en reposo), N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (1 jM ) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) o LPS (1 jg/ml) durante 24 h (n= 3). La apoptosis de neutrófilos se determinó mediante ELISA de detección de muerte celular (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) en lisados celulares de acuerdo con el protocolo del fabricante. El nHC-HA/PTX3 inmovilizado, pero no el Ha , promueve la apoptosis de neutrófilos activados por fMLP o LPS pero no neutrófilos en reposo (Figura 3D).
Luego se examinó la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por macrófagos en reposo o estimulados con LPS. Se cultivaron células RAW264.7 (1 x 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% en el HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o control de PBS sin o con LPS (1 jg/ml) de estimulación durante 6 días (n= 3). Luego se retiró el medio de cultivo celular y se añadieron 100 j l de 2 x 106 células/ml de neutrófilos apoptóticos en IMDM (preparado mediante tratamiento de neutrófilos humanos aislados en reposo con roscovitina (20 jM ) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) durante 8 h) a cada pocillo que contenía macrófagos en reposo o estimulados con LPS. Después de la incubación durante 30 min a 37°C, cada pocillo se lavó tres veces con PBS frío y se recolectaron lisados celulares (incluidos macrófagos y neutrófilos fagocitados) para determinar la actividad de la mieloperoxidasa humana (MPO) mediante el ensayo ELISA para medir los neutrófilos fagocitados mediante macrófagos. Se recolectaron lisados celulares y se sometieron a ensayo ELISA de mieloperoxidasa humana (MPO) (n= 4) (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, la MPO se normalizó con la proteína total medida mediante el ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) en el lisado celular respectivo y se expresó como índice de fagocitosis. El índice de fagocitosis de las células en reposo sin estimulación con LPS (-LPS) se definió como 100% en este experimento. El nHC-HA/PTX3 inmovilizado, pero no e1HA, promovió la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos bien sea por macrófagos en reposo o tratados con LPS (Figura 3E).
Estos resultados demuestran que el nHC-HA/PTX3 inmovilizado (2°) potencia la apoptosis de neutrófilos activados y la fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por macrófagos.
Análisis de receptores implicados en la polarización de macrófagos M2 por nHC-HA/PTX3 inmovilizado
Con el fin de determinar la participación de receptores particulares en la polarización de macrófagos M2, se realizó la expresión cuantitativa de ARNm de marcadores de macrófagos M1 y M2 en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueadores de receptores. Se preincubaron células RAW264.7 (2.5 * 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% con PBS (control) o anticuerpos bloqueadores contra CD44 (10 jg/ml), TLR4 (10 jg/ml) o CD44/TLR4 (cada uno a 10 jg/ml) durante 30 min en hielo (n= 3). A continuación, las células se estimularon con LPS (1 jg/ml) y se incubaron a 37°C durante 4 h en HA inmovilizado (2 jg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 jg/pocillo) o control de PBS. Los ARN totales se extrajeron de las células totales. La expresión relativa de ARNm del marcador M1 (IL-12p40) y los marcadores M2 (IL-10, LIGHT y SPHK1) se determinaron mediante PCR cuantitativa con GAPDH como control endógeno como se describió anteriormente (Figura 4A). La expresión de IL-12p40 se abolió mientras que la de IL-10, LIGHT y SPHK1 fue promovida por nHC-HA/PTX3 inmovilizado, pero no HA. Este patrón de expresión fue inhibido más por el anticuerpo bloqueador de CD44 que por el anticuerpo bloqueador de TLR4. Por el contrario, la expresión de IL-12p40 y el transcrito de IL-10 por HA inmovilizada se vio más afectada por el anticuerpo bloqueador contra TLR4 que contra CD44.
También se determinó la expresión de proteínas de IL-12 e IL-10. Los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron de células cultivadas en HA inmovilizada (2 pg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 pg/pocillo) o control de PBS tratado como se describió anteriormente excepto por 24 h (en lugar de 4 h) (n= 3). La cantidad de proteína IL-12 o IL-10 en los sobrenadantes del cultivo celular se determinó mediante ELISA (Biolegend, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Figura 4B). La expresión de la proteína IL-12 se suprime mientras que la de la proteína IL-10 se promueve notablemente por nHC-HA/PTX3 inmovilizado. Este patrón de expresión es inhibido por el anticuerpo bloqueador contra CD44. Por el contrario, la expresión de la proteína IL-12 se promueve mientras que la de IL-10 es suprimida por HA inmovilizado, y el patrón de expresión se ve más afectado por el anticuerpo bloqueador contra TLR4.
Comparación de los complejos nHC-HA/PTX3 (2do) y nHC-HA/PTX3 (4to)
Se compararon los complejos nHC-HA/PTX3 (2do) y nHC-HA/PTX3 (4to) examinando la capacidad de cada complejo para inducir la agregación celular de macrófagos (indicativo de unión celular deficiente) y/o promover la polarización de macrófagos M2. Se cultivaron células RAW264.7 (2.5 x 105 células/ml) en DMEM/FBS al 10% en HA inmovilizado (2 pg/pocillo), nHC-HA/PTX3 (2 pg/pocillo) o control de PBS y se estimularon con 200 unidades/ml IFN-Y/1 pg/ml de LpS (ambos eran de InvivoGen, San Diego, CA) durante 4 ho 24 h (n= 3). Después de 4 horas, se examinó la agregación celular mediante microscopía óptica y se fotografió (Figura 5A). El nHC-HA/PTX3 inmovilizado (4to), pero no el nHC-HA/PTX3 (2do), promueve la agregación celular de los macrófagos, lo que indica que el nHC-HA/PTX3 (4to) no promueve la unión celular a la placa mientras que el nHC-HA/PTX3 (2do) lo hace. Después de 24 h, se obtuvieron muestras de sobrenadantes de cultivo celular y se midió la proteína IL-12p40 y la concentración de proteína IL-23 mediante ELISA respectivo (Biolegend, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante (fIGuRA 5B y 5C). Tanto nHC-HA/PTX3 (2do) como nHC-HA/PTX3 (4to) inhiben la producción de proteínas IL-12p40 e IL-23 en macrófagos estimulados con IFN-y/LPS.
Ejemplo 4: Unión in vitro de TSG-6 y PTX3 a HA inmovilizado (iHA) en ausencia de IaI
Unión de TSG-6 a iHA
Se preparó HA inmovilizado (entrada de 2 pg/pocillo) como se describió anteriormente. Una serie de concentraciones de TSG-6 humano (sobreexpresión en la línea celular de mieloma de ratón NS0 con Trp18 a Leu277 de TSG-6 humano, con una etiqueta C terminal 10 His, # de acceso P98066; R&D Systems, Minneapolis, MN, No. de cat. 2104- TS) (0, 0.24, 1.2, 6, 12 y 24 pg/ml, 100 pl de volumen por pocillo) se incubaron con iHA durante 2 h a 37°C en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5). El TSG-6 no unido se eliminó mediante lavados de guanidina-HCl 8 M y PBS. El TSG-6 unido se midió mediante ELISA TSG-6 modificado (R&D Systems, Minneapolis, MN). Debido a que TSG-6 ya estaba unido a iHA acoplado en pocillos, se omitieron las etapas de incubar muestras con anticuerpo TSG-6 prerrecubierto. Las etapas posteriores se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Figura 7A). TSG-6 se unió de forma dependiente de la dosis a iHA y alcanzó su capacidad máxima de unión a aproximadamente 6 pg/ml (o 0.6 pg en 0.1 ml de la solución de reacción) cuando iHA era de aproximadamente 1.4 pg (2 pg de HA por pocillo según la eficiencia de acoplamiento de ~70%). La relación molar de TSG-6 a HA era aproximadamente 37:1 con base en que TSG-6 era 35 kDa y HA era ~ 3000 kDa.
Luego se examinó la capacidad del complejo TSG-6/iHA para resistir la disociación. Se preparó iHA (entrada de 2 pg/pocillo) como se describió anteriormente. Se incubó tSG-6 (6 pg/ml en 100 pl) con iHA durante 2 ha 37°C. El TSG-6 no unido se eliminó mediante lavados con PBS (como control) o con diferentes agentes disociantes o reductores: Guanidina HCl/PBS 6 M, Guanidina HCl 8 M/PBS, SDS/PBS al 2%, DTT/PBS 100 mM y 25 mM NaOH/H2O. El TSG-6 unido se midió mediante ELISA de TSG-6 modificado como se describió anteriormente (Figura 7B). El complejo TSG-6/iHA formado era estable y resistente al tratamiento con los diversos agentes disociantes y/o reductores. No se observó significación estadística entre todos los grupos.
Unión de PTX3 a iHA
Se preparó HA inmovilizado (entrada de 2 pg/pocillo) como se describió anteriormente. Una serie de concentraciones de PTX3 (sobreexpresión en la línea celular de mieloma de ratón NS0 con Glu18 a Ser277 de PTX3 humano, con una etiqueta C terminal 6 His, # de acceso P26022; R&D Systems, Minneapolis, MN) (0, 0.04, 0.2, 1, 5 y 25 pg/ml, volumen de 100 pl por pocillo) se incubaron con iHA durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción (MgCh5 mM en PBS, pH 7.5). La PTX3 no unida se eliminó mediante lavados con GnHCl 8 M y PBS. La PTX3 unida se midió mediante ELISA PTX3 modificado (R&D Systems, Minneapolis, MN). Debido a que PTX3 ya estaba unido a iHA acoplado en pocillos, se omitieron las etapas de incubar muestras con anticuerpo PTX3 prerrecubierto. Las etapas posteriores fueron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Figura 8A). PTX3 se unió de forma dependiente de la dosis a iHA y alcanzó la capacidad máxima de unión a aproximadamente 5 pg/ml (o 0.5 pg en 0.1 ml de la solución de reacción) cuando iHA era de aproximadamente 1.4 pg (2 pg de HA por pocillo basado en la eficiencia de acoplamiento del 70%) La relación molar de PTX3 a HA era aproximadamente 24:1 con base en que PTX3 era de 45 kDa y HA de ~ 3000 kDa.
Luego se examinó la capacidad del complejo PTX3/iHA para resistir la disociación. Se preparó iHA (entrada de 2 pg/pocillo) como se describió anteriormente. Se incubó PTX3 (5 pg/ml en 100 pl) con iHA durante 2 ha 37°C. La PTX3 no unida se eliminó mediante lavados con PBS (como control) o con diferentes agentes disociantes o reductores: Guanidina HCl/PBS 6 M, Guanidina HCl 8 M/PBS, SDS/PBS al 2%, DTT/PBS 100 mM y NaOH 25 IT1M/H2O. La PTX3 unida se midió mediante ELISA de PTX3 modificado como se describió anteriormente (Figura 8B). El complejo PTX3/iHA formado era estable y resistente al tratamiento con los diversos agentes disociantes y/o reductores. No se observó significación estadística entre todos los grupos.
Unión simultánea de TSG-6 y PTX3 a iHA
Se preparó iHA (entrada de 2 pg/pocillo) como se describió anteriormente. Se incubaron 6 pg/ml de TSG-6 y 5 pg/ml de PTX3 (concentraciones para la unión máxima descrita anteriormente) con iHA solo o combinado en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5). El TSG-6 o PTX3 unido se midió mediante ELISA modificado respectivo como se describe anteriormente. No hubo competencia o sinergia para la unión a iHA por TSG-6 o PTX3 cuando ambas proteínas se incubaron con iHA simultáneamente en comparación con cuando se agregó TSG-6 o PTX3 solo (p> 0.05). Estos datos indicaron que los sitios de unión en iHA para TSG-6 y PTX3 son diferentes y podrían no solaparse (Figura 9).
Unión secuencial de TSG-6 y PTX3 a iHA
Se examinó la adición secuencial de TSG-6 y PTX3 a iHA para determinar si TSG-6 o PTX3 unida previamente inhibiría la unión de la otra proteína a iHA. Se unieron previamente 6 pg/ml de TSG-6 o 5 pg/ml de PTX3 a iHA, preparados como se describió anteriormente. Después de los lavados con GnHCl 8 M y PBS, las concentraciones seriadas de PTX3 (0, 5 o 5 pg/ml) o TSG-6 (0, 1.2 o 6 pg/ml) se incubaron posteriormente con TSG-6/iHA previamente unido o PTX3/iHA previamente unido en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5)), respectivamente. El TSG-6 y PTX3 unidos posteriormente se midieron mediante ELISA modificado respectivo. La TSG-6 preunido (6 pg/ml) impidió parcialmente que PTX3 posterior se una a iHA (Figura 10A) (p = 0.05 y 0.01 cuando se añadió PTX3 posterior a 1 pg/ml y 5 pg/ml, respectivamente) (Figura 5A). La PTX3 previamente unida (5 pg/ml) no interfirió con la posterior unión de TSG-6 a iHA (p = 0.56 y 0.74 cuando se añadió TSG-6 posterior a 1.2 pg/ml y 6 pg/ml, respectivamente) (Figura10B). Estos datos indican que el iHA cambia estructuralmente después de la unión de TSG-6 de tal manera que interfiere con la unión de PTX3 posterior.
Ejemplo 5: Unión de macrófagos estimulados con LPS a complejos inmovilizados de TSG-6/iHA y PTX3/iHA Los 96 pocillos de Covalink-NH se acoplaron covalentemente con PBS (control), HA (iHA) o HC-HA/PTX3 nativo (nHC-HA/PTX3) como se describió anteriormente. Después se añadió TSG-6 (6 pg/ml) o PTX3 (5 pg/ml) y se unió a iHA. Se sembraron macrófagos RAW264.7 (100 pl de 1 x 105 células/ml) en Dm EM/FBS al 10% en cada pocillo acoplado y se trataron con 1 pg/ml de LPS. Después de la incubación durante 24 h, se fotografió la morfología celular.
Los macrófagos se adhirieron pobremente (es decir, dando como resultado más células agregadas) a iHA en comparación con el control plástico. Tal unión se vio obstaculizada además por TSG-6/iHA, lo que resultó en un gran número y agregaciones más grandes de células. Por el contrario, PTX3/iHA promovió la unión celular, dando como resultado un patrón similar al mostrado en nHC-HA/PTX3 inmovilizado (Figura 11).
Ejemplo 6: Regulación de marcadores M1 y M2 por complejos TSG-6/iHA y PTX3/iHA
Se cultivaron células RAW264.7 como en el Ejemplo 5 y se estimularon con 1 pg/ml de LPS durante 4 h en PBS (control), HA inmovilizado (iHA), TSG-6/iHA, PTX3/iHA o nHC-HA/PTX3. Los ARN totales se aislaron de las células y la expresión de ARNm del marcador M2 IL-10 y el marcador M1 IL-12p40 se midieron mediante PCR cuantitativa (Figuras 12A y 12D) como se describió anteriormente. Alternativamente, las células se estimularon con 1 pg/ml de LPS (Figuras 12B y 12E) o IFN-y/LPS (Figura 12C) durante 24 h, y la expresión de proteínas de IL-10, IL-12p70 e IL-23 se midieron en medios de cultivo celular usando los respectivos ELISA.
La expresión de ARNm de IL-12p40 (una de las dos subunidades de IL-12p70) no se modificó significativamente en iHA (ninguna) en comparación con la del control (Ctrl) (p> 0.05) (Figura 12A). Por el contrario, el ARNm de IL-12p40 se sobrerreguló en TSG-6/iHA (p <0.01), pero se reguló negativamente en PTX3/iHA y nHC-HA/PTX3 (p <0.05) (Figura 12A). La expresión de la proteína IL-12p70, sin embargo, solo fue detectable sin ninguna diferencia significativa (p> 0.05) en el control o en iHA solo, pero es indetectable en TSG-6/iHA, PTX3/iHA y nHC-HA/PTX3 (Figura 12B). IL-12p40 también sirve como una subunidad de IL-23. Se observó que la expresión de la proteína IL-23 se incrementó significativamente en TSG-6/iHA y PTX3/iHA (p <0.01), pero es indetectable en nHC-HA/PTX3 (p <0.05) (Figura 12C). Estos datos indican que tanto TSG-6/iHA como PTX3/iHA son efectivos para suprimir IL-12 pero no IL-23.
La expresión de ARNm de IL-10 por células RAW264.7 no se modificó significativamente en iHA solo en comparación con el control (p> 0.05), pero se incrementó significativamente en TSG-6/iHA, PTX3/iHA y nHC-HA/PTX3 (p <0.05) (Figura 12D). La expresión de la proteína IL-10, sin embargo, solo se sobrerregula significativamente en PTX3/iHA similar al control positivo de nHC-HA/PTX3 inmovilizado (p <0.05) (Figura 12E).
Estos datos sugieren que siguiendo diferentes patrones de unión celular (Ejemplo 5), las células resultantes exhiben diferentes funciones, y que PTX3/ÍHA es más efectivo que TSG-6/iHA en la sobrerregulación de IL-10 <Ejemplo 7: Transferencia in vitro de HC1 y HC2 de IaI a HA inmovilizado
Los 96 pocillos de Covalink-NH se acoplaron covalentemente con PBS (control), HA (iHA) o HC-HA/PTX3 nativo (nHC-HA/PTX3) como se describió anteriormente. Las concentraciones en serie de TSG-6 (0, 0.24, 1.2, 6, 12 pg/ml en 100 pl) se incubaron individualmente con iHA en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5)). Se añadió IaI humano (5 pg/ml) (preparado a partir de plasma humano de acuerdo con Blom et al. (1999) J. Biol. Chem.
274, 298-304) bien sea simultáneamente con TSG-6 o secuencialmente (2 h más tarde). La HC1, HC2 unida (los anticuerpos contra HC1 y HC2 eran de abcam, Cambridge, AM) o IaI (DAKO, Carpinteria, CA) se midieron mediante ELISA modificado respectivo similar a los ELISA TSG-6 y PTX3 descritos anteriormente.
Los datos muestran que la cantidad de HC1 (Figura 13A) o IaI (Figura 13B) unido a iHA es menor a concentraciones más altas de TSG-6 (6 y 12 pg/ml) cuando TSG-6 se preunió a iHA con posterior adición de IaI que cuando se agregaron TSG-6 e IaI simultáneamente. No se detectó HC2 en las muestras (datos no mostrados). Los pocillos se incubaron con hialuronidasa para digerir el HA unido y para liberar proteínas unidas de HA y estas muestras se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpo anti-TSG-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN); la cantidad de TSG-6 unido a iHA fue menor cuando se añadió IaI simultáneamente con TSG-6 que cuando se añadió posteriormente IaI (es decir, después de que TSG-6 se uniera a iHA, figura 13C). Cuando se incubaron 5 pg/ml de PTX3 y 5 pg/ml de IaI con iHA simultáneamente, PTX3 pero no IaI se unió a iHA (Figura 13D).
Estos datos indican que TSG-6 libre en solución es más eficaz que TSG-6 unido a iHA en la transferencia de HC1 de IaI a iHA (Figuras 13A y 13B). Más TSG-6 se une a iHA cuando TSG-6 está preunido a iHA solo que cuando TSG-6 e IaI se incuban con iHA simultáneamente (Figura 13C), lo que indica que IaI evita que TSG-6 se una a iHA si se agrega simultáneamente con TSG-6, y que TSG-6 podría tener una mayor afinidad en la unión a IaI que a iHA. Además, PTX3 libre en solución o unido a iHA no transfiere las HC de IaI a iHA (Figura 13D).
Ejemplo 8: Efecto de PTX3 sobre la formación de complejos HCVTSG-6 y HC2^TSG-6
Se incubaron IaI (40 pg/ml) y TSG-6 (6 pg/ml) en el regulador de reacción (MgCh5 mM en PBS, pH 7.5) durante 2 h a 37°C sin o con PTX3 (20 pg/ml o 120 pg/ml). Las muestras de reacción se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (figura 14A), HC2 (figura 14B), TSG-6 (figura 14C), bikunina (abcam, Cambridge, AM) (figura 14D) y PTX3 (datos no mostrados). En solución sin HMW HA, TSG-6 forma complejos HCVTSG-6 y Hc2^TSG-6, y genera HMW IaI (Figuras 14A y 14B). La formación de HMW IaI se ilustra en la Figura 14E. Estos datos indican que tanto la HC1 como la HC2 son transferidas por TSG-6 en solución a HMW HA.
La adición simultánea de PTX3 inhibe de forma dependiente de la dosis la formación de HC2^TSG-6 pero no de HCVTSG-6 (Figuras 14A y 14B). Por el contrario, HMW IaI que contiene HC2 aumenta mientras que h Mw IaI que contiene HC1 disminuye (Figuras 14A y 14B). TSG-6 forma dímeros cuando se agrega en solución sin HMW HA con o sin PTX3 (Figura 14C). Estos hallazgos indican que 1) tanto la HC1 como la HC2 en IaI forman un complejo con TSG-6 o un IaI de HMW a través de la acción de TSG-6; 2) PTX3 interfiere con el proceso anterior de manera diferente con respecto a la transferencia de HC1 y HC2 por TSG-6. No existe una forma truncada de HC1 o HC2. La inhibición de Hc2^TSG-6 por PTX3 se ilustra en la Figura 14F.
Una forma glicosilada y una forma glicosilada y conjugada con sulfato de condroitina de bikunina de aproximadamente 40 kDa y 45 kDa, respectivamente, fueron liberadas por TSG-6 y PTX3, respectivamente (Figura 14D). Estos datos son consistentes con los datos publicados que muestran que tanto TSG-6 como PTX3 interactúan con IaI, y también sugieren que TSG-6 y PTX3 interactúan de manera diferente con IaI dando como resultado un resultado diferente de la bikunina.
En un experimento separado, se incubaron HMW HA (250 pg/ml), IaI (40 pg/ml) y TSG-6 (6 pg/ml) en solución durante 24 ha 37°C sin o con PTX3 (1, 2.5 y 5 pg/ml) en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5). Las muestras de reacción se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra IaI (Figura 14G). En solución con HMW HA pero sin PTX3, las HC de IaI se transfirieron completamente a HMW HA mediante TSG-6. En presencia de PTX3, la transferencia de HC mediada por TSG-6 se inhibió de manera dependiente de la dosis, lo que rdio como resultado la acumulación de intermedios de LMW (~ 130 kDa y probablemente consistentes en HC1-TSG-6) o pre-IaI sin procesar (~130 kDa, IaI sin procesar (220 kDa) y HMW IaI (retenido en pocillos de carga) (Figura 14G). Estos datos son consistentes con el hallazgo de que PTX3 previene específicamente la formación de HC2-TSG-6, lo que da como resultado la inhibición de la transferencia de HC2 y posible transferencia de HC1.
Ejemplo 9: Formación de complejos de HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos in vitro a partir de HA inmovilizado con adición simultánea de TSG-6, PTX3 e IaI
Se preparó HA inmovilizado (~ 14 pg/ml o 1.4 pg en 100 pl en cada pocillo) como se describe en el Ejemplo 3. Se incubaron IaI (5 pg/ml) y TSG-6 (12 pg/ml) simultáneamente en iHA con o sin PTX3 (1, 5 o 20 pg/ml) durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5). Después de lavados con GnHCl 8 M y PBS, se midieron HCl, TSG-6 y PTX3 unidos mediante ELISA modificado respectivo (Figuras 15A, 15D y 15F, respectivamente). Los pocilios se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M y PBS, y el iHA con componentes unidos se digirió con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 ha 60°C en regulador de acetato 10 mM con NaCl 75 mM, pH 6.0. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (figura 15B), HC2 (figura 15C), TSG-6 (figura 15E) y PTX3 (figura 15G).
La adición simultánea de TSG-6, PTX3 e IaI a iHA dio como resultado complejos rcHC-HA/PTX3 que contenían HMW HC1 pero no HC2, y HC1 y HC2 truncados (Figuras 15A-C). PTX3 redujo de manera dependiente de la dosis la cantidad de HMW HC1 en el complejo. Los datos muestran que PTX3 interfirió de manera dependiente de la dosis con la transferencia de HC1 y HC2 a iHA por TSG-6 (Figuras 15A-C), dando como resultado menos HC1/HC1 truncado y HC2 truncado (Figuras 15B y 15C). El monómero de TSG-6 disminuyó mientras que HMW TSG-6 (ya sea multimérico o complejado con PTX3 y/o HCs) no cambió (Figuras 15D y E).
Los datos también indican que PTX3 no interfiere con TSG-6 unido a iHA en presencia o ausencia de IaI. Los datos publicados sugieren que TSG-6 forma dímeros con iHA cuando se prueba un MW HA más pequeño (Baranova et al. (2011) J Biol Chem. 286 (29): 25675-86). Los datos aquí presentes indican que TSG-6 forma un complejo en el complejo HMW HC-HA/PTX3 en presencia de IaI. Debido a que PTX3 reduce el TSG-6 libre de una manera dependiente de la dosis, indica además que PTX3 promueve la unión de TSG-6 en el complejo HC-HA/PTX3 en presencia de IaI. En esta situación, la mayoría de PTX3 existe como formas multiméricas en el complejo HC-HA/PTX3, similar a lo que se ha observado en nHC-HA/PTX3, con una cantidad decreciente de monómero, dímeros o trímeros (fIGURA 15F y G
Ejemplo 10: Efecto de la adición secuencial de PTX3 a complejos HC-HA/PTX3 reconstituidos (rcHC-HA/PTX3) formados in vitro con TSG-6 e IaI sobre HA inmovilizado
Se preparó HA inmovilizado (~14 pg/ml) como se describe en el Ejemplo 3. Se incubaron IaI (5 pg/ml) y TSG-6 (12 |jg/ml) en iHA en el regulador de reacción (MgCh5 mM en PBS, pH 7.5) durante 2 ha 37°C. Después de eliminar IaI y TSG-6 no unidos, se incubó el regulador de reacción con o sin PTX3 (1, 5 o 20 pg/ml) con los HC y TSG-6 previamente unidos durante 2 h a 37°C. Después de lavados con GnHCl 8 M y PBS, se midieron e1HCl, TSG-6 y PTX3 unidos mediante ELISA, respectivamente (Figuras 16A, 16D y 16F, respectivamente). A continuación, los pocillos se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M. El control de PBS y el iHA con componentes unidos se digirieron luego con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 horas a 60°C. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra HC1 (Figura 16B), HC2 (Figura 16C), TSG-6 (Figura 16E), PTX3 (Figura 16G) Cuando se agrega PTX3 posteriormente después de que el TSG-6 y las HC se hayan preunido a iHA, la PTX3 reduce de manera dependiente de la dosis la transferencia de HC1 al complejo HMW (se reducen tanto la HC1 intacta como la HC1 truncada) pero aumenta la cantidad de HC2 truncada en el complejo. De acuerdo con los datos mostrados en el Ejemplo 7, el TSG-6 unido es menos eficaz que el TSG-6 libre en la transferencia de HC a iHA. De manera similar a los datos mostrados en el Ejemplo 8, PTX3 también redujo de manera dependiente de la dosis el TSG-6 de HMW y el TSG-6 monomérico (Figura 16D y 16E), lo que indica que la adición posterior de PTX3 agota continuamente el TSG-6 preunido. Sin embargo, PTX3 ya no puede incorporarse en el complejo TSG-6/HC-HA (Figura 16F y 16G). Debido a que el TSG-6 preunido en iHA también previene parcialmente que pTX3 se una a iHA (véase Ejemplo 4), este hallazgo indica que la formación de un complejo rcHC-HA/PTX3 por TSG-6 e IaI es estructuralmente diferente de TSG-6/iHA en la medida en que la unión de PTX3 a iHA esté completamente excluida. Ejemplo 11: Formación de complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos in vitro con PTX3 preunida en HA inmovilizado y adición secuencial de TSG-6 e IaI
Se preparó HA inmovilizado (~14 pg/ml) como se describe en el Ejemplo 3. Se incubaron PTX3 (5 pg/ml) y iHA en el regulador de reacción durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción (MgCh 5 mM en PBS, pH 7.5). Después de eliminar la PTX3 no unida, el regulador de reacción que contenía TSG-6 (6 pg/ml) e IaI (5, 25 y 125 pg/ml) se incubaron durante 2 ha 37°C. Después de lavados con GnHCl 8 M y PBS, se midieron HCl, TSG-6 y PtX3 unidos mediante ELISA, respectivamente (Figuras 17A, 17C y 17E, respectivamente). A continuación, los pocillos se lavaron de nuevo con GnHCl 8 M. PBS o iHA con componentes unidos se digirieron con 1 unidad/ml de hialuronidasa durante 2 h a 60°C en regulador de acetato 10 mM con NaCl 75 mM, pH 6.0. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra PTX3 (figura 17B), TSG-6 (figura 17D), HC1 (figura 17F) y HC2 (figura 17G).
En presencia de IaI y TSG-6, la PTX3 unida previamente aumentó de forma dependiente de la dosis la inmunorreactividad de ELISA para PTX3 y la cantidad de PTX3 multimérica, pero disminuyó la de PTX3 monomérica en el complejo HC-HA/PTX3 (Figuras 17A y 17B). Estos datos indican que la PTX3 multimérica promueve la inmunorreactividad de este anticuerpo.
El TSG-6 monomérico de forma dependiente de la dosis excluyó PTX3 preunido al tiempo que disminuye el TSG-6 en el complejo rcHC-HA/PTX3 (Figuras 17C y 17D). La reducción significativa de TSG-6 unido (tanto monómero como formas HMW) se detecta cuando una relación molar de IaI a TSG-6 es 3:1, donde la PTX3 multimérica unida también se maximiza.
No hubo ningún cambio significativo en la HC1 unida con base en a los datos de ELISA de HC1 (Figura 17E). La transferencia de HC2 se incrementó de forma dependiente de la dosis al aumentar las concentraciones de IaI.
Ejemplo 12: Comparación de la actividad de unión de células macrófagas entre complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos formados in vitro con TSG-6 preunido versus PTX3 preunido en hA inmovilizado
Los 96 pocillos de Covalink-NH se acoplaron covalentemente con PBS (control), HA (iHA) o nHC-HA/PTX3 como se describe en el Ejemplo 3. IaI (5 pg/ml), TSG-6 (6 pg/ml) o PTX3 (5 pg/ml) se unieron simultánea o secuencialmente a iHA de la siguiente manera: (1) (Ial/TSG-6/pTx3)/iHA: IaI, TSG-6 y PTX3 se incubaron simultáneamente con iHA durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción; (2) (IaI/TSG-6)/PTX3/iHA: Primero se incubaron IaI y TSG-6 con iHA durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción. Después de eliminar el IaI/TSG-6 no unido, se lavó con GnHCl 8 M y PBS, se añadió PTX3 y se incubó durante 2 ha 37°C en el regulador de reacción; (3) (PTX3)/IaI/TSG-6/iHA: PTx 3 se incubó primero con iHA durante 2 horas a 37°C en el regulador de reacción. Después de eliminar la PTX3 no unida, se lavó con GnHCl 8 M y PBS, se añadió IaI/TSG-6 y se incubó durante 2 h a 37°C en el regulador de reacción. Después de la formación de los complejos, se sembraron 100 pl de células RAW264.7 (1 x 105 células/ml) en cada pocillo acoplado y se trataron con 1 pg/ml de LPS. Después de la incubación durante 24 h, se fotografió la morfología celular.
Los macrófagos se pobremente a iHA como control. En presencia de IaI, TSG-6 simultáneo o previamente unido a iHA ((IaI/TSG-6/PTX3)/iHA o (IaI/TSG-6)/PTX3/iHA) inhibe la unión celular y promueve la agregación celular (Figura18) similar a la condición sin IaI (véase Ejemplo 5). Por el contrario, PTX3 unida previamente a iHA [(PTX3)/IaI/TSG-6/iHA] promueve la unión celular similar a la PTX3 unida previamente sin IaI como se muestra en el Ejemplo 5. Este último se asemeja al control positivo de nHC-HA/PTX3 (Figura 18).
Ejemplo 13: Comparación de la regulación de la expresión de los marcadores M1 y M2 entre complejos HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituidos formados in vitro con TSG-6 preunido versus PTX3 preunido en HA inmovilizado
Expresión de IL-10 e IL-12p40 en macrófagos cultivados en rcHC-HA/PTX3
Complejos
Se cultivaron células RAW264.7 en DMEM/FBS al 10% sobre sustratos inmovilizados y se estimularon con 1 pg/ml de LPS durante 4 h como se describe en el Ejemplo 12. Se aislaron los ARN totales y se midió la expresión de ARNm de IL-10 e IL-12p40 mediante PCR cuantitativa como se describió anteriormente (Figuras 19A y 19C). Alternativamente, las células se estimularon con 1 pg/ml de LPS durante 24 h y las proteínas IL-10 e IL-12p70 en los sobrenadantes del cultivo celular se midieron mediante ELISA respectivos (Figuras 19B y 19D).
En comparación con el control de PBS, la expresión de ARNm de IL-10 no cambió significativamente por iHA (p = 0.56), pero se incrementó significativamente en complejos formados por la adición simultánea de TSG-6, IaI y PTX3 en iHA (IaI/TSG- 6/PTX3 (a) en la Figura 19) (p = 0,0008). De manera similar, la expresión de ARNm de iL-10 se incrementó significativamente en los complejos formados por TSG-6 preunido a iHA con la posterior adición de IaI y PTX3 (IaI/TSG-6/PTX3 (b) en la Figura 19) (p = 0.04) y el control positivo nHC-HA/PTX3 (p = 0,008). La expresión de ARNm de IL-10 fue significativamente mayor en nHC-HA/PTx3 que en IaI/TSG-6/PTx3 (a) (p = 0.04), pero no significativamente mayor que en IaI/TSG-6/PTX3 (b) (p = 0.55). Por el contrario, la expresión de ARNm de IL-10 no se sobrerrreguló significativamente por los complejos formados por PTX3 preunida a iHA (IaI/TSG-6/PTX3 (c) en la Figura 19) (p = 0.74) (Figura 19A). La expresión de la proteína IL-10, medida por ELISA, sólo se incrementó significativamente mediante nHC-HA/PTX3 (p = 0.03) (Figura 19B).
En comparación con el control, la expresión de IL-12p40 (IL-12p40 es una de las dos subunidades de IL-12p70 y la otra subunidad es IL-12p35), el ARNm no se modificó significativamente por iHA (p = 0.1). Por el contrario, la expresión de ARNm de IL-12p40 se sobrerreguló significativamente en los complejos formados por la adición simultánea de TSG-6, IaI y PTX3 en iHA (IaI/TSG-6/PTX3 (a) en la Figura 19) (p = 0.05) y en complejos formados por TSG-6 preunido a iHA (IaI/TSG-6/PTx3 (b) en la Figura 19) (p = 0.04). Por el contrario, la expresión de ARNm de IL-12p40 se abolió por completo en los complejos formados por PTX3 unida previamente (IaI/TSG-6/PTX3 (c) en la Figura 19) y se subreguló significativamente por nHC-HA/PTX3 (p = 0.01). Hubo una diferencia de significación estadística entre las dos últimas condiciones (p = 0.04) (Figura 19C). En comparación con el control, la expresión de la proteína IL-12p70 no se modificó significativamente por iHA (p = 0.32), pero se subreguló significativamente en los complejos formados por PTX3 preunida (IaI/TSG-6/PTX3 (c)) (p = 0.03) (Figura 19D). Por el contrario, la expresión de la proteína IL-12p70 se abolió en los complejos formados por la adición simultánea de TSG-6, IaI y PTX3 en iHA (IaI/TSG-6/PTX3 (a)), en complejos formados por PTX3 previamente unida (IaI/TSG-6/PTX3 (c)) y nHC-HA/PTX3 (p = 0.05, 0.02 y 0.01, respectivamente).
Expresión de IL-23 en macrófagos cultivados en presencia de diversos estímulos
En un experimento separado, la proteína IL-23 en los sobrenadantes de cultivo celular de células RAW264.7 en reposo (ninguna) o con estimulación de IFN-y (200 unidades/ml), LPS (1 pg/ml), IFN-y/LPS, LPS (1 pg/ml) con inmunocomplejo o IC (LPS/IC) [IC contenía 150 pg/ml de OVA opsonizado con IgG (IgG-OVA) y se preparó mezclando un exceso molar diez veces mayor de IgG anti-OVA de conejo (Cappel, Durham, NC) a OVA (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, Nj ) durante 30 min a 25°C], o iL-4 (10 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) en DMEM/10% se midió FBS durante 24 h. La proteína IL-23 en los sobrenadantes del cultivo celular se midió mediante ELISA de IL-23 (Biolegend, San Diego, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Figura 19E). La proteína IL-23 fue indetectable en el sobrenadante del cultivo celular de las células RAW264.7 en reposo y en las de las células bajo estimulación durante 24 h por LPS (1 pg/ml), LPS con inmunocomplejo (LPS/IC) o IL-4 (10 ng/ml), pero se volvió detectable bajo estimulación durante 24 h por IFN-y (200 unidades/ml) e IFN-y/LPS (Figura 19E).
Expresión de IL-23 en macrófagos cultivados en complejos rcHC-HA/PTX3
En un experimento separado, se cultivaron células RAW264.7 en sustratos inmovilizados como se describió anteriormente y se estimularon con IFN-y/LPS durante 24 h. La IL-23 en los sobrenadantes del cultivo celular se midió mediante ELISA de IL-23 como se describió anteriormente (Figura 19F).
En comparación con el control, la proteína IL-23 en el sobrenadante del cultivo celular de células RAW264.7 con estimulación de 200 unidades/ml de IFN-y/1 pg/ml de LPS durante 24 h no se vio significativamente afectada por iHA (p = 0.02), pero se sobrerreguló significativamente en complejos formados por la adición simultánea de TSG-6, IaI y pTX3 en iHA (IaI/TSG-6/PTX3 (a)) (p = 0.002) y en complejos formados por TSG-6 preunido a iHA (IaI/TSG-6/PTx3 (b)) (p = 0,0005). Por el contrario, la proteína iL-23 se elimina completamente en los complejos formados por PTX3 (IaI/TSG-6/PTX3 (c)) unida previamente (p = 0.05) similar a nHC-HA/PTX3 (p = 0.05) (Figura 19F).
Ejemplo 14: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la enfermedad crónica de injerto contra huésped
El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es un tratamiento potencialmente curativo para las malignidades hematológicas. Sin embargo, la enfermedad de injerto contra huésped crónica (cGVHD) sigue siendo una complicación importante. La GVHD provoca varias manifestaciones oculares en el 45-60%, entre las que el ojo seco es la complicación más frecuente, y ocurre en casi el 50% de los receptores de HSCT alogénico. De hecho, el ojo seco es un signo y síntoma distintivo para el diagnóstico de cGVHD. Los pacientes con cGVHD manifiestan bien sea una enfermedad de ojo seco leve en etapa temprana relacionada con cGVHD o la llamada "característica distintiva de cGVHD" de acuerdo con la clasificación de la conferencia de consenso de los NIH. Se han observado dos tipos de ojo seco después del HSCT; uno tenía daño severo en la superficie ocular y en la función lagrimal con disminución del lagrimeo reflejo que ocurre poco después del inicio del ojo seco, mientras que el otro es leve con lagrimeo reflejo normal. El ojo seco típicamente ocurre 6 meses después del trasplante y se ha informado que la gravedad se correlaciona con la presencia de cGVHD y enfermedad de las glándulas de Meibomio. El inicio del ojo seco severo relacionado con la cGVHD es más temprano que el del ojo seco leve. Por ejemplo, el ojo seco severo ocurre 6.8 ± 2.5 meses después del HSCT, mientras que el ojo seco leve se produce 13.2 ± 9.1 meses después del HSCT. Un estudio comparativo de 50 ojos de 25 pacientes post-HSCT y 28 ojos de 14 controles sanos de la misma edad mostró que la obstrucción de MG, la disminución de la sensibilidad corneal, mayor tasa de evaporación de lágrimas, la disminución de GCD conjuntival, el aumento de metaplasia escamosa conjuntival y células inflamatorias se notaron más en los ojos secos relacionados con la cGVHD que los controles normales y después del HSCT sin sujetos con ojo seco. Adicionalmente, las células inflamatorias conjuntivales fueron significativamente más altas en los ojos secos graves en comparación con los ojos secos leves (P <0.03). Además, la mayoría de los pacientes con ojo seco grave tenían cGVHD sistémica, mientras que sólo unos pocos pacientes en el grupo de sequedad leve tenían cGVHD sistémica. Esos hallazgos indicaron los diferentes procesos patológicos en la enfermedad del ojo seco leve y grave relacionada con la cGVHD. Debido a que se observó una alteración completa de la superficie ocular en pacientes post-HSCT, independientemente de si tenían ojo seco relacionado con cGVHD o no, sus resultados sugieren que la extensión del proceso inflamatorio parece tener un papel fundamental en el resultado de del ojo seco relacionado con cGVHD. Las muestras de citología con cepillo conjuntival mostraron un aumento considerable del número de células inflamatorias tanto en los pacientes con ojo seco severo como en el ojo seco leve relacionado con la cGVHD en comparación con los controles normales y después de1HSCT sin sujetos con ojo seco. Además, el número de células inflamatorias en las muestras de ojo seco grave fue significativamente mayor que en las muestras de ojo seco leve. Además, muchos marcadores inflamatorios expresados en muestras de biopsia de la conjuntiva y la glándula lagrimal de pacientes con ojo seco relacionado con cGVHD, lo que confirma que la inflamación está involucrada en la patogénesis del ojo seco relacionado con cGVHD.
Una causa probable de generar una serie de complicaciones cicatriciales en la cGVHD es a través de EMT del epitelio basal conjuntival y el mioepitelio de la glándula lagrimal como resultado de las citoquinas liberadas por la inflamación crónica debido a la infiltración de linfocitos del donante. Previamente, se reconoció que la inflamación y la fibrosis excesiva son características histológicas prominentes de la enfermedad de injerto contra huésped crónica (cGVHD), pero el mecanismo subyacente a estos cambios sigue siendo desconocido. La cGVHD manifiesta características que se asemejan a la esclerodermia, exhibiendo fibrosis prominente en las lesiones cutáneas, fibrosis pulmonar e inmunodeficiencia crónica. Las características clínicas de la cGVHD ocular incluyen la aparición de ojos secos, arenosos o dolorosos, conjuntivitis cicatricial que incluye formación de tejido fibrovascular subconjuntival y acortamiento escleral, el cual es un rasgo característico de la fibrosis conjuntival. Además de las características escleróticas en las lesiones cutáneas, la atrofia de la mucosa en la boca, las restricción o estenosis en el tercio superior o medio del esófago, la rigidez o contractura de las articulaciones debido a la esclerosis y la bronquitis obliterante en el pulmón, en conjunto, indican los rasgos característicos de la fibrosis sistémica mediada por GVHD. Los principales hallazgos histológicos en la glándula exocrina y la mucosa afectadas son una marcada fibrosis del intersticio y un aumento prominente del número de fibroblastos, acompañado de una infiltración linfocítica leve. Clínicamente, la gravedad del ojo seco se correlaciona con el grado de cambio fibrótico, más que con la cantidad de infiltración linfocítica, lo que indica que la acumulación excesiva de matriz extracelular contribuye principalmente a la disfunción exocrina. Los fibroblastos del intersticio también desempeñan un papel en la inflamación, al unirse a los linfocitos y expresar el antígeno leucocitario humano de clase II y moléculas coestimuladoras. Estos hallazgos juntos indican que los fibroblastos juegan un papel importante en la patogénesis de la cGVHD. Además, se ha encontrado que los fibroblastos acumulados en la glándula lagrimal de los pacientes con cGVHD tienen un estado quimérico. Por lo tanto, los fibroblastos que se originan a partir de precursores circulantes derivados del donante y fibroblastos derivados del receptor pueden participar en la fibrosis excesiva en pacientes con cGVHD al interactuar con las células T. Aún se desconoce si el control de la inflamación mediante la supresión de la infiltración de células T conducirá a una menor complicación cicatricial en la cGVHD.
Anteriormente, los fibroblastos derivados de donantes se detectaban combinando inmunohistoquímica y métodos de hibridación in situ fluorescente del cromosoma Y (FISH) en muestras de tejido humano de cGVHD. Usando un modelo murino de cGVHD establecido por Zhang et al. ((2002) J Immunol. 168:3088-3098), se puede reproducir el hallazgo anterior. En este modelo, el volumen de lágrimas comienza a disminuir a las 3 semanas después del trasplante. La fibrosis temprana alrededor de los conductos de la glándula lagrimal y la fibrosis progresiva se detectan tan pronto como 3 semanas después del trasplante, y progresan gradualmente hasta 8 semanas de manera similar a las muestras humanas. Se han realizado estos experimentos más de 20 veces para crear tanto grupos de control como de GVHD con éxito, lo que da como resultado una reproducibilidad general del 70 al 80% con base en el análisis de muestras de tejido de la glándula lagrimal y volúmenes de lágrimas.
En un experimento de trasplante típico, ratones B10.D2 (H-2d) y BALB/c (H-2d, Sankyo Laboratory, Ltd) de 7 a 8 semanas de edad se utilizan como donantes y receptores, respectivamente, utilizando células de bazo añadidas como fuente de células T maduras. En resumen, se irradian letalmente ratones receptores hembra con 700 cGy de una fuente de Gammacel 137Cs (J. L. Shepherd & Associates, San Fernando, CA). Aproximadamente 6 h después se inyectan por la vena de la cola con células de médula ósea de donante masculino (1 x 106/ratón) y bazo (2 x 106/ratón) suspendidas en RPMI 1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD). Un grupo de control (BMT singénico) consiste en ratones receptores hembra BALB/c que reciben el mismo número de células BALB/c machos de bazo y médula ósea. (Zhang et al. (2002) J Immunol. 168:3088-3098). Para el tratamiento de HC-HA/PTX3, los complejos HC-HA/PTX3 se administran mediante inyección subconjuntival en momentos predeterminados después del trasplante de médula ósea, tales como 7, 14, 21 y 28 días después del trasplante de médula ósea.
Los efectos del tratamiento se evalúan usando ensayos que incluyen, pero no se limitan a, la medición de la fibrosis de la glándula lagrimal usando tinción de Mallory, determinando el número de fibroblastos activados por campo usando HSP47, un chaperón molecular específico de colágeno, como marcador de fibroblastos activados, mide la producción de lágrimas lacrimales bajo estimulación con pilocarpina mediante una prueba de hilo de algodón y determinación del nivel de citoquinas fibrogénicas tales como HSP47, IL-4, IL-6 y TGF-beta usando RT-PCR.
Se espera que el tratamiento con complejos HC-HA/PTX3 dé como resultado la reducción de la fibrosis de la glándula lagrimal en el modelo de ratón. Los complejos HC-HA/PTX3 se administran luego en el entorno clínico mediante inyección subconjuntival a sujetos humanos para el tratamiento del ojo seco causado por cGVHD.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 15: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la inflamación en un modelo de ratón
En este ejemplo, la eficacia antiinflamatoria se prueba en un modelo murino de queratitis del estroma corneal necrotizante por HSV-1. Un total de 240 ratones hembra BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad) obtenidos de Charles River Wiga (Sulzfeld, Alemania) se anestesian mediante inyección intraperitoneal de 2 mg de ketamina HCl y 400 ng de mepivacaína HCl. Para cada ratón, la córnea central de un ojo se raspa en un patrón entrecruzado con 8 rasguños horizontales y 8 verticales usando una aguja de calibre 27 bajo un microscopio quirúrgico. A cada córnea lesionada se aplica una suspensión de 5 pl que contiene 1 x 105 unidades formadoras de placa de virus HSV-1 (cepa KOS), que se propagan de forma rutinaria en células Vero, se almacenan a -80°C y se cuantifican mediante un ensayo de placa estándar. El Día 14 después de la inoculación de HSV-1, las córneas de ratón que han desarrollado queratitis estromal ulcerante grave se incluyen para el estudio (rendimiento de aproximadamente 50%) y se subdividen en tres grupos, cada uno de los cuales coniste en 40 córneas (n= 6 para el examen clínico, n= 5 para histología, n= 5 para inmunotinción, n= 6 para ELISA de citoquinas, n= 5 para TUNEL y n= 10 para citometría de flujo y n= 3 para desgaste/respaldo). Los ojos contrarios no infectados se utilizan como grupo de control negativo. El grupo de control positivo recibe tarsorrafia usando 2 suturas de nailon 10-O para cerrar los párpados. El grupo experimental HC-HA/PTX3 recibe la misma tarsorrafia que el control positivo y la aplicación tópica 4 veces al Día de una composición que contiene el complejo HC-HA/PTX3 purificado. El grupo de HA experimental recibe la misma tarsorrafia pero aplicación tópica de composición de HA solo cuatro veces al Día. Después de 2 días, se elimina la tarsorrafia en los tres grupos. Utilizando un microscopio quirúrgico (Zeiss, Alemania), la gravedad de la inflamación del estroma de cada córnea se evalúa mediante una puntuación de 0 a 4+, con 1+ que tiene menos del 25%, 2+ menos del 50%, 3+ menos de 75 %, y 4+ entre 75 y 100% de opacidad corneal con neovascularización corneal, edema y adelgazamiento. Después de la eutanasia por cámara de CO2 seguida de dislocación cervical, 5 córneas de cada grupo se someten a inmunotinción de corte congelado utilizando anticuerpos primarios contra CD11b (neutrófilos y macrófagos), F4/80 (macrófagos), Gr-1 (PMN) y CD3 (células T) (véase Métodos), y otras 5 córneas de cada grupo se someten a tinción con hematoxilina-eosina y tinción TUNEL. Además, los homogeneizados de córnea preparados a partir de 6 córneas de cada grupo se someten a medición ELISA de los niveles de IL-1a, IL-2, IL-6, IFN-y y TNFa. Las células liberadas por la colagenasa de 10 córneas de cada grupo se preparan para la citometría de flujo para cuantificar las células viables mediante el ensayo MTT y las células apoptóticas mediante el kit de detección de apoptosis con anexina V-PE (BD-Pharmingen, Heidelberg, Alemania).
Se espera que el 50% de las córneas infectadas por HSV-1 de ratón desarrollen queratitis (inflamación) estromal corneal grave, edema y ulceración en las dos semanas posteriores a la inoculación para ser incluidas en el estudio. Dos días después, las córneas no infectadas permanecerán normales, mientras que las córneas infectadas del grupo de control mantendrán una inflamación grave similar cuando se elimine la tarsorrafia. Al igual que en el grupo de control, las córneas del grupo experimental de HA exhibirán una inflamación grave similar. Por el contrario, las córneas del grupo experimental HC-HA/PTX3 mostrarán una reducción de la inflamación, que se correlacionará y se justificará mediante una reducción significativa de la infiltración inflamatoria (PMN/macrófagos) e inmunitaria (células T) con base en la histología y la inmunotinción para CD11b, F4/80, Gr-1 y CD3, mediante una reducción significativa de citoquinas inflamatorias e inmunes tales como IL-1 a, IL-2, IL-6, IFN-y y TNF-a con base en ELISA y por un aumento significativo de células positivas para TUNEL en tejidos corneales y de células muertas (MTT) y apoptóticas liberadas por colagenasa de la córnea (citometría de flujo usando Anexina-V/7-AAD) en comparación con el grupo de control positivo y el grupo experimental de HA. En conjunto, estos datos apoyan la noción de que el complejo HC-HA/PTX3 ejerce una eficacia antiinflamatoria clínica en este modelo murino de HSV-1.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 16: Uso de HC-HA/PTX3 para la inhibición de la cicatrización en un modelo de conejo
En este ejemplo, la eficacia anti-cicatrización es probada en un modelo de conejo de queratectomía fotorrefractiva asistida por láser de excímero (PRK). Se utilizan un total de 30 conejos albinos blancos de Nueva Zelanda con un peso corporal (BW) de 2,5-3.0 kg, de ambos sexos, y se subdividen en tres grupos (n= 10 cada uno): el grupo de control sin PRK, el grupo PRK HA, y el grupo PRK HC-HA/PTX3. Antes de la PRK y para todos los exámenes de CMTF, los conejos se anestesian mediante una inyección intramuscular de 5 mg/kg de peso corporal de xilazina y 30 mg/kg de peso corporal de ketamina y por vía tópica con una solución oftálmica de tetracaína Hcl al 0.5% (Ortopics Laboratories Corp., Fairton, NJ). Para los dos grupos de PRK, el epitelio corneal de un ojo de cada animal se elimina manualmente raspando suavemente con una espátula roma en un área un poco más grande que la zona de ablación, el estroma denudado se irriga con solución salina normal y se elimina el exceso de líquido suavemente con una esponja de celulosa. Se realiza una PRK de corrección miope estándar PRK 9.0 D de 6 mm de diámetro usando un láser excímero LaddarVision (Alcon, Ft. Worth, TX) para lograr una profundidad de ablación estromal teórica prevista de 118 pm. Inmediatamente después de PRK y posteriormente, el grupo PRK HC-HA/PTX3 se aplica con una composición que contiene el complejo HC-HA/PTX3 mientras que el grupo PRK HA se aplica con la composición que contiene HA solo, ambos cuatro veces al Día a partir de entonces para un total de 3 semanas. Además, a todos los ojos tratados con PRK se les instila diclofenaco sódico tópico al 0.1% (una gota inmediatamente después de la PRK) y sulfato de gentamicina al 0.3% (tres veces al día durante 3 días).
La CMTF in vivo se realiza en todos los ojos operados (n= 6 de cada grupo) antes de la PRK y en una, dos, tres y 4 semanas, dos meses y 4 meses después de la PRK utilizando un microscopio confocal de barrido en tándem modificado (exploración en tándem Corporation, Reston, VA) con un objetivo de contacto de superficie de 24X. Después de un examen confocal estándar de la morfología corneal, la configuración de la cámara de video (ganancia, kilovoltios y nivel de negro) se cambia a manual y se mantiene constante durante el estudio para permitir la comparación directa de todas las exploraciones. La CMTF se realiza como una exploración continua del eje z a través de toda la córnea. El grosor corneal, epitelial y estromal se mapea dentro de la zona central de 3 mm mediante la realización de 10 exploraciones CMTF consecutivas en áreas que cubren todas las regiones. Solo los datos obtenidos de la región estromal más delgada correspondiente al centro del perfil de fotoablación se utilizan para los cálculos posteriores. Los perfiles CMTF basados en la profundidad de intensidad de la imagen se generan a partir de grabaciones de video CMTF. La reflectividad de la luz corneal se mide mediante perfiles CMTF y se expresa en unidades arbitrarias (U) definidas como pm*intensidad de píxel como una estimación de la turbidez corneal.
Para identificar y medir la presencia de tejido fibrótico estromal, tres animales tratados con PRK de cada grupo (control y tratados) se tiñen vitalmente con 5-(4,6-didorotriazinil)aminofluoresceína (DTAF) al 0.5% disuelto en bicarbonato de sodio 0.2 M como se informó previamente. Después de 2 min de tinción, los ojos se enjuagan a fondo para eliminar el exceso de tinte antes de la administración de antibióticos tópicos. A los 4 meses después de la PRK, los animales se sacrifican mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico (120 mg/kg de peso corporal). Después de la eutanasia, todas las córneas se fijan in situ mediante perfusión en la cámara anterior de paraformaldehído al 2% en PBS, pH 7.2, durante 3 min, se extirpan, se colocan en un fijador nuevo y se almacenan a 4°C. Luego, el tejido es embebido en OCT, se congela instantáneamente en nitrógeno líquido y se secciona utilizando un criomicrótomo. El tejido es una sección escalonada en serie para identificar la parte central y más profunda de la fotoablación, y se somete a inmunotinción utilizando anticuerpos para queratocán, CD3434, faloidina conjugada con FITC, fibronectina ED-A, S-100A4 y a-actina de músculo liso (a-SMA) para correlacionar los cambios de la turbidez corneal (por reflectividad de la luz CMTF) con cambios fenotípicos de queratocitos a fibroblastos o miofibroblastos. Además, en aquellos ojos que se tiñen con DTAF, el espesor del tejido fibrótico que se deposita se mide determinando la distancia entre las células epiteliales basales y el tejido corneal teñido con DTAF que representa el estroma corneal original no dañado.
Se espera que la microscopía confocal in vivo revele características epiteliales, láminas basales, estromales y endoteliales características, que se correlacionarán bien con picos bien definidos que cambian en intensidad y posición con el tiempo cuando se analizan perfiles de CMTF in vivo para córneas del control no PRK, así como para aquellos que reciben PRK. Según los datos publicados, las córneas tratadas con PRK exhibirán cuatro picos que se originan en el epitelio superficial, la superficie del estroma fotoablacionada, las capas de fibroblastos fusiformes y el endotelio, mientras que las del control sin PRK exhibirán tres picos que se originan en la superficie epitelio, lámina basal y endotelio una semana después de la PRK. Se espera que no haya mucha diferencia entre los dos grupos experimentales una semana después de la PRK. A las 2 semanas después de la PRK, el grupo PRK HA experimental mostrará una intensidad creciente del pico cerca de la superficie del estroma fotoablacionada debido a la migración celular en curso de fibroblastos fusiformes. Sin embargo, se espera que la intensidad de los fibroblastos repobladores (por la altura del pico) se reduzca mucho en el grupo experimental PRK HC-HA/PTX3. Durante el período de 3 semanas a 4 meses después de la PRK, el pico correspondiente a la capa de fibroblastos fusiformes se fusionará con el pico que se origina en la superficie del estroma fotoablacionado debido a la finalización de la repoblación del estroma anterior acelular en el grupo PRK HA experimental, y dará como resultado un aumento espectacular de la reflectividad del pico correspondiente a la superficie del estroma fotoablacionado. En contraste, no habrá un aumento tan dramático de la reflectividad en el grupo experimental PRK HC-HA/PTX3. Tal diferencia de reflectividad de la luz también se puede cuantificar calculando el área de los picos de CMTF que se originan en estructuras intracorneales específicas. Se espera que el grupo PRK HA experimental presente un aumento lineal sustancial en la intensidad de la reflectividad dentro de las primeras 2 a 3 semanas posteriores a la PRK y una disminución lineal lenta de la reflectividad a partir de entonces. Por el contrario, se espera que haya una disminución significativa de la reflectividad en el grupo experimental PRK HC-HA/PTX3 durante ambos períodos. En conjunto, estos datos de CMTF respaldan que el complejo HC-HA/PTX3 ejerce un efecto inhibidor de la activación, migración y reclutamiento celular de los queratocitos durante la repoblación del estroma anterior acelular, lo que explica por qué la dispersión de la luz corneal (neblina) se reduce de manera similar a la de los anticuerpos anti-TGF-p reportados previamente. Como resultado, hay menos celularidad y reflectividad de queratocitos de cicatrización de heridas intraestromales migratorios activados, y menos deposición de nueva matriz extracelular estromal y un establecimiento más rápido de una población de queratocitos inactivos normal en el estroma anterior. Esta conclusión será corroborada por una reducción significativa de queratocitos activados (F-actina en células que expresan queratocán), fibroblastos (tinción citoplasmática de S-100A4, expresión de membrana de fibronectina ED-A) y miofibroblastos (expresión nuclear de S100A4 y expresión citoplasmática de a-SMA) en el grupo experimental PRK HC-HA/PTX3 en comparación con el grupo experimental PRK HA durante el período de 2 a 3 semanas post-PRK. También se espera que haya una reducción significativa de la distancia entre las células epiteliales basales y el tejido corneal teñido con DTAf en el grupo PRK HC-HA/PTX3, indicativo de una cantidad significativamente menor de tejido fibrótico, en comparación con el grupo PRK HA.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 17: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la aterosclerosis
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de la aterosclerosis.
La aterosclerosis incluye la participación de una población de células inflamatorias, en particular macrófagos. Se observa un cambio fenotípico de macrófagos durante la progresión de la enfermedad. En la aterosclerosis, los monocitos circulantes se reclutan en sitios de acumulación de depósitos grasos dentro de la íntima y subíntima vascular a través de CCR2 y mecanismos mediados por la adhesión endotelial. Al llegar, estas células se activan y se diferencian en macrófagos. Luego, los depósitos de grasa comienzan a madurar en placas con el reclutamiento continuo de células inflamatorias, células del músculo liso y la producción de matriz extracelular. La población inicial de macrófagos infiltrantes en la aterosclerosis temprana es heterogénea, pero posee un fenotipo predominantemente similar a M2. Simultáneamente con la progresión y expansión de la lesión, se ha observado un cambio a un fenotipo predominantemente M1. Este cambio fenotípico puede deberse a la fagocitosis del exceso de lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas dentro de la placa por los macrófagos y a la producción de IFN-y por las células Th1 locales, lo que resulta en el desarrollo de macrófagos de células espumosas. Los macrófagos de células espumosas exhiben un fenotipo altamente activado que conduce a la producción de mediadores proinflamatorios y MMP que desestabilizan las placas, lo que potencialmente conduce a tromboembolismo. Las terapias que evitan el cambio de M2 a M1 o reducen selectivamente los macrófagos M1 son de utilidad clínica para la estabilización de placas ateroscleróticas.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que tiene aterosclerosis. El complejo HC-HA/PTX3 se emplea, por ejemplo, para recubrir dispositivos médicos implantables, tales como una cánula, para su implantación en o cerca del sitio de inflamación. Se espera que el tratamiento de la aterosclerosis con un complejo HC-HA/PTX3 disminuya la inflamación y prevenga la tromboembolia.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 18: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la obesidad y la resistencia a la insulina
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de la obesidad y la resistencia a la insulina.
Los macrófagos del tejido adiposo (ATM) comprenden una proporción significativa del componente celular del tejido adiposo tanto en estados magros como obesos. En humanos normales, los ATM constituyen hasta el diez por ciento de los componentes celulares del tejido. En comparación, en sujetos obesos ese número se eleva hasta un 40%. En sujetos normales no obesos, los a Tm tienen un fenotipo M2 polarizado que se caracteriza por un aumento de la expresión de STAT6 y PPAR-y basales. Estas células juegan un papel importante y beneficioso en el metabolismo de los nutrientes. La deficiencia de PPAR-y conduce a una función del macrófago M2 deteriorada y a la susceptibilidad a la inflamación inducida por la dieta y la resistencia a la insulina. Por el contrario, los ATM que se acumulan en el tejido adiposo durante la obesidad tienen un fenotipo proinflamatorio M1 fuertemente polarizado. Estas células producen niveles elevados de TNFa, IL-6 e IL-1p, todos los cuales también se observan en niveles aumentados de tejido adiposo de individuos resistentes a la insulina. Los altos niveles de mediadores proinflamatorios deterioran localmente la función de las células de procesamiento de insulina residentes.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que padece obesidad o resistencia a la insulina. Se administra un complejo HC-HA/PTX3, por ejemplo, como una solución en gel para el tratamiento. Se espera que el tratamiento con un complejo HC-HA/PTX3 promueva un cambio fenotípico de macrófagos del tejido adiposo (ATM) de un fenotipo proinflamatorio M1 a un fenotipo M2 y restablezca el procesamiento normal de la insulina.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 19: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la diabetes tipo 1
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de la diabetes tipo 1.
La diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1DM, IDDM o, antes, diabetes juvenil) es una forma de diabetes mellitus que resulta de la destrucción autoinmune de las células beta del páncreas productoras de insulina. La subsiguiente falta de insulina conduce a un aumento de la glucosa en sangre y orina. Los síntomas clásicos son poliuria (micción frecuente), polidipsia (aumento de la sed), polifagia (aumento del hambre) y pérdida de peso.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que padece diabetes tipo 1 en forma de microcápsulas que contienen células productoras de insulina autólogas o alogénicas recubiertas con el complejo HC-HA/PTX3. Las microcápsulas se administran a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección. Se espera que el tratamiento con las microcápsulas recubiertas de HC-HA/PTX3 permita la producción de insulina que se libera en el sujeto y prevenga o reduzca las respuestas inflamatorias contra la terapia celular o microcápsula, aliviando así la diabetes tipo 1 y los síntomas de la misma.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 20: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la fibrosis
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de fibrosis o trastorno fibrótico.
Las enfermedades fibróticas progresivas, tales como la fibrosis pulmonar idiopática (IPF), la fibrosis hepática y la esclerosis sistémica, están estrechamente reguladas por los macrófagos. Los macrófagos 'profibróticos' exhiben propiedades M1 y producen diversos mediadores, incluidos TGFpl, PDGF y factor de crecimiento similar a la insulina 1, que activan directamente los fibroblastos y miofibroblastos, que controlan la deposición de ECM. Los macrófagos profibróticos también producen MMP, TIMP e IL-1p, IL-1 p estimula las células TH17 para producir IL-17, un importante inductor de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, un trastorno fibrótico con características similares a las de la IPF. La producción de IL-10, RELMa y ARG1 por macrófagos similares a M2 suprime la fibrosis. Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que padece fibrosis o un trastorno fibrótico. Un complejo de HC-HA/PTX3 se administra, por ejemplo, como solución, gel o como recubrimiento en un dispositivo médico implantable. Se espera que el tratamiento con un complejo HC-HA/PTX3 disminuya los macrófagos M1 y la activación de fibroblastos y miofibroblastos y aumente la cantidad de macrófagos M2 presentes en el sitio o sitios afectados en el sujeto, suprimiendo así la fibrosis y los síntomas de la misma, tales como cicatrización.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 21: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la inflamación crónica
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de una afección inflamatoria crónica, tal como la artritis reumatoide.
Muchas enfermedades autoinmunes, incluida la artritis reumatoide, implican respuestas inflamatorias a autoanticuerpos que activan los receptores Fc para desencadenar la activación de mastocitos y macrófagos, y la invasión de neutrófilos. Esto conduce a una intensa respuesta inflamatoria local y, si no se resuelve, a un daño tisular con el tiempo con ciclos de reparación y destrucción. En la artritis reumatoide, el CSF1 es producido de manera constitutiva por fibroblastos sinoviales y recluta monocitos y macrófagos que se infiltran en los tejidos. Además, el CSF1 producido localmente, junto con RANK1, induce la diferenciación de monocitos en osteoclastos, que desencadenan la pérdida ósea.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que padece una afección inflamatoria crónica, tal como artritis reumatoide. Un complejo de HC-HA/PTX3 se administra, por ejemplo, como solución, gel o como recubrimiento en un dispositivo médico implantable. Se espera que el tratamiento con HC-HA/PTX3 suprima los macrófagos proinflamatorios M1, induzca la apoptosis de los neutrófilos e inhiba la diferenciación de los osteoclastos, tratando así la afección inflamatoria y sus síntomas.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 22: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de la respuesta inflamatoria aguda
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de una respuesta inflamatoria aguda causada por una afección tal como infarto de miocardio, apoplejía o sepsis. Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que tiene una respuesta inflamatoria aguda causada por una afección tal como infarto de miocardio, apoplejía o sepsis. Un complejo HC-HA/PTX3 se administra, por ejemplo, como una solución por infusión intravenosa. Se espera que el complejo HC-HA/PTX3 disminuya o prevenga el daño causado por la inflamación aguda por supresión de los macrófagos inflamatorios M1.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 23: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento del cáncer
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento del cáncer.
Se ha observado la participación de un gran número de células inflamatorias en el desarrollo y la progresión del tumor y se describe comúnmente como "inflamación latente". Estas observaciones han llevado a un vínculo bien establecido entre las células inflamatorias, los macrófagos en particular y el cáncer. Inicialmente se pensó que el desarrollo de oncogenes resultaba en el microambiente característico del cáncer, en el que las células transformadas secretan citoquinas y quimioquinas que promueven el desarrollo de tejidos y previenen la apoptosis, así como suprimen las respuestas inmunes citotóxicas (denominada "vía intrínseca"). Ahora se reconoce que existe otra vía que conduce a la tumorigénesis. Esta "vía extrínseca" se caracteriza inicialmente por un entorno proinflamatorio crónico resultante de una infección microbiana persistente, enfermedad autoinmune u otra etiología de origen desconocido. La producción crónica de grandes cantidades de mediadores inflamatorios en estos casos puede conducir a la proliferación y supervivencia de células tumorales o a la inducción de inestabilidades genéticas en células normales, con la expresión resultante de oncogenes y producción de citoquinas inmunosupresoras. Por lo tanto, el desarrollo temprano del tumor se caracteriza, en muchos casos, por un entorno de macrófagos tipo M1, inflamatorio polarizado.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que tiene un cáncer, tal como un cáncer de tumor sólido. Un complejo HC-HA/PTX3 se administra, por ejemplo, como una solución, gel o como un recubrimiento en un dispositivo médico implantable para aplicación tópica, inyectable o implantiva. Debido a que HC-HA/PTX3 puede suprimir la polarización de macrófagos M1, se espera que el tratamiento con HC-HA/PTX3 inhiba o prevenga cánceres o su progresión hacia fenotipos en etapa tardía.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 24: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de heridas o úlceras cutáneas no cicatrizantes
En este ejemplo, un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra para el tratamiento de una herida o úlcera que no cicatriza en la piel.
Una herida o úlcera no cicatrizante en la piel, que ha estado presente durante aproximadamente 3-4 semanas de duración, sin cicatrización, se denomina úlcera no cicatrizante Las enfermedades que comúnmente causan úlceras no cicatrizantes son las enfermedades vasculares, la diabetes, los cánceres de piel y algunas infecciones.
Un complejo HC-HA/PTX3 generado por los métodos descritos en este documento se administra a un sujeto que tiene una herida o úlcera en la piel que no cicatriza. Se administra un complejo HC-HA/PTX3, por ejemplo, como una solución, gel por vía tópica o subcutánea para el tratamiento en el sitio de la herida o úlcera. Se espera que el tratamiento con HC-HA/PTX3 promueva la curación de la herida o úlcera al promover el fenotipo M2 de la curación de heridas y los macrófagos regeneradores de tejidos.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 25: Uso de HC-HA/PTX3 para el tratamiento de trasplantes de córnea de alto riesgo
En este ejemplo, HC-HA/PTX3 se administra para el tratamiento de trasplantes de córnea de alto riesgo. Ratones MaFIA, cuyos macrófagos EGFP+ se inyectan intraestrómicamente con LPS (5 |jg por ojo) para ambos ojos. En cada ojo, OS (oculus sinister; ojo izquierdo) se trata con PBS (2 o 4 sitios de inyección) mientras que OD (oculus dexter, ojo derecho) se trata una vez con HC-HA/PTX3 (2 o 4 sitios de inyección; 5 j l de 1 mg/ml de composición de HA que contiene HC-HA/PTX3 por sitio de inyección) inmediatamente después de la inyección de LPS. Se toman imágenes de córneas completas con microscopía intravital in vivo el día 1, día 2, día 3, día 4, día 5, día 6 y día 7. Las células positivas a EGFP se cuentan en función de la intensidad de la fluorescencia verde para determinar el nivel de infiltración de EGFP. En un modelo de ratón de trasplante de córnea, se espera que la inyección de HC HA/PTX3 en sitios subconjuntivales reduzca la inflamación (es decir, la infiltración de macrófagos) y mejore la tasa de supervivencia de las córneas trasplantadas en comparación con el control de vehículo PBS.
En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento descrito en este documento es un complejo HC-HA/PTX3 nativo aislado (nHC-HA/PTX3). En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla del tejido del cordón umbilical. En algunos ejemplos, el nHC-HA/PTX3 se aísla de la membrana amniótica. En algunos ejemplos, el complejo HC-HA/PTX3 usado en el método de tratamiento aquí descrito es un complejo HC-HA/PTX3 reconstituido (rcHC-HA/PTX3).
Ejemplo 26: Distribución de HA, PTX3, TSG-6, HC1, HC2, HC3 y bikunina en el cordón umbilical (UC)
En este ejemplo, se detectó la distribución in vivo de HA, PTX3, TSG-6, HC1, HC2, HC3 y bikunina en el cordón umbilical (UC) mediante inmunotinción. Las secciones congeladas de tejido de UC se sometieron a inmunotinción para HA, PTX3, TSG-6 y diversos componentes de IaI, incluidas HC y bikunina. El UC constaba de una capa de epitelio y un estroma compuesto por una capa subamnios y una gelatina de Wharton que contenía tres vasos, es decir, una vena y dos arterias (Figura 20a, con un vaso arterial, fase). Se observó una tinción de HA fuerte positiva en el epitelio de UC, la capa subamnios y la gelatina de Wharton, y una tinción de HA débil en la pared del vaso (Figura 20a, HA). Con la digestión con HAasa, la tinción de HA mencionada anteriormente desapareció (Figura 20a, HA (+ HAasa)), conformando la tinción específica para HA.
En la gelatina de Wharton estaba presente una fuerte inmunotinción positiva de PTX3, y una débil tinción de PTX3 en la capa subamnios y el epitelio (Figura 20a, PTX3). La digestión con HAasa no mejoró la tinción de PTX3 en la capa subamnios y el epitelio (no mostrado), lo que sugiere que la tinción de PTX3 débil no se debió al efecto de enmascaramiento por Ha . También se observó tinción positiva de PTX3 en el endotelio de los vasos (no mostrado) pero no en la pared del vaso de las arterias y las venas.
Tanto TSG-6 como la bikunina estaban presentes en todo el UC con TSG-6 principalmente presente en las células y alrededor de las células y más TSG-6 estaba en el epitelio y subamnión en comparación con la gelatina de Wharton. La HC1 tenía una localización similar al HA excepto que el epitelio y la pared del vaso tenían una tinción de HC1 tenue. La tinción de HC2 y HC3 débil o nula estaba presente en el epitelio, pero no en el estroma del UC. Estos resultados mostraron que el UC produjo abundantes HA, PTX3, TSG-6, HC1 y bikunina, y desproporcionadamente menos HC2 y HC3 en comparación con AM. Se determinó que UC expresó constitutivamente las proteínas anteriores y el complejo HC-HA/PTX3.
Adicionalmente, PTX3 estuvo presente en UC con un patrón de distribución diferente al reportado en AM. Había más PTX3 presente en la gelatina de Wharton del UC y menos en el epitelio y el subamnios. En contraste, más PTX3 estaba en el epitelio y la capa compacta del estroma en la AM. El UC tuvo un patrón similar a la AM en los siguientes marcadores: más hA estaba presente en todo el estroma del UC y poco en el epitelio del UC. Esto fue similar en el patrón de distribución de HA en la AM. El TSG-6 se localizó principalmente en las células epiteliales y submiónicas del UC, y la bikunina se encontró en todo el UC.
Ejemplo 27: Comparación de los extractos de PBS y GnE obtenidos secuencialmente de AM y UC
Este ejemplo determinó si la parte insoluble después del extracto de PBS de AM todavía contenía PTX3, TSG-6 e IaI así como complejo HC-HA/PTX3. Las proteínas se extrajeron de la parte insoluble de AM mediante GnHCl 4 M después de la extracción con PBS para ver si había PTX3, TSG-6 e IaI. Además, el UC con PBS también se extrajo secuencialmente con GnHCl 4 M para detectar PTX3, TSG-6, HC y bikunina en estas dos extracciones diferentes. De acuerdo con el método descrito en He et al. (2009) J. Biol Chem. 284:20136-20146), AM, CH y UC se homogeneizaron con un mezclador en PBS frío a 1:1 (g/ml) para AM o 1:1.5 (g/ml) para UC, y se mezclaron a 4°C durante 1 h. La mezcla se centrifugó a 48,000 g a 4°C durante 30 min. Los sobrenadantes del extracto de PBS se denominaron AME, CHE y UCE, respectivamente. Además, la mezcla de gelatina de Wharton de UC también fue extraída por PBS y tal extracto se denominó UJE. El sedimento insoluble de mezcla de gelatina AM, CH, UC y UC después de la extracción con PBS se extrajo adicionalmente con regulador de GnHCl 4 M (acetato de sodio 100 mM, pH 5.8, GnHCl 4 M, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1%) a 4°C durante 24 h. Después de la centrifugación a 48,000 g a 4°C durante 30 min, se recolectaron los sobrenadantes y se denominaron AMGnE, CHGnE, UCGnE y UJGnE, respectivamente. Las concentraciones de HA y proteína en cada extracción se detectaron mediante HA ELISA y ensayo BCA, respectivamente.
GnHCl extrajo además abundante HA y proteínas del sedimento insoluble después de la extracción con PBS Las concentraciones de HA y proteína en extractos secuenciales de PBS y GnHCl se resumen en la Tabla 1, donde también se comparó la relación HA/proteína entre los dos extractos. En general, el GnHCl 4 M extrajo además abundantes proteínas y HA del sedimento insoluble de la mezcla de gelatina de AM, CH, UC y UC después de la extracción con PBS. El regulador de GnHCl extrajo más proteínas pero menos HA del sedimento insoluble que PBS. Sin embargo, UCGnE todavía contenía una cantidad similar de proteínas y HA a AME y CHE. Es decir, UC contenía más HA que AM y CH en los extractos de PBS y GnHCl.
Tabla 1. Cuantificación de proteínas y HA en extractos de GnHCl 4 M (GnE) del sedimento insoluble de mezcla de gelatina de AM, CH, UC y Uc después del extracto de PBS
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El monómero, dímero y HMW PTX3 estaba presente en cantidades más altas en la extracción con PBS de las células de UC en comparación con las células de AM. Pero HMW PTX3 estaba presente en cantidades más altas en la extracción de GnHCl en células de AM.
El análisis de AME con anticuerpo anti-PTX3 reveló una banda de ~ 45 kDa correspondiente al tamaño del monómero de PTX3 nativo y una banda de HMW en el fondo del pocillo de carga (Figura 21A, carril 4). El tratamiento con NaOH no afectó la banda de 45 kDa, pero eliminó completamente la banda HMW, lo que dio como resultado una mancha de HMW de PTX3 (Figura 21A, carril 5), que es una característica notable de PTX3 en el complejo HC-HA con tratamiento con NaOH donde no se detectó monómero PTX3, pero se detectó un dímero de 90 kD con o sin tratamiento con NaOH (Figura 21A, carriles 2 y 3). La mancha de HMW de PTX3 representó los complejos formados entre PTX3 y HC-HA. CHE tenía el mismo patrón de la banda de PTX3, pero hubo menos mancha de PTX3 después del tratamiento con NaOH, lo que concuerda con el resultado de inmunotinción. El extracto de placenta tuvo el mismo resultado con CHE. En particular, PTX3 existió más en una mancha de dímero y HMW además de monómero en UCE, y su intensidad aumentó además después del tratamiento con NaOH. De manera similar a AME, UCE también generó un patrón de manchas de HMW, más que AME. Estos resultados mostraron que UCE contiene más PTX3 que AME, mientras que los extractos de placenta y CHE contienen poca PTX3.
Comparado con AME (Figura 21A), AMGnE mostró una fuerte mancha de PTX3 de HMW, niveles débiles de dímero y monómero de PTX3, y la intensidad de la mancha de PTX3 de HMW se incrementó además después del tratamiento con NaOH (Figura 21B, carriles 3 y 4), que mostró que AMGnE contenía más HMW PTX3 que AME. Había más PTX3 presente en la parte insoluble en agua de AM. La CHGnE solo tenía una banda de h Mw en el pocillo de carga, pero ningúna mancha de HMW PTX3 independientemente del tratamiento con o sin NaOH. UCGnE y UJGnE tenían el mismo patrón de PTX3 con o sin tratamiento con NaOH que AMGnE excepto que la intensidad de la mancha de PTX3 era un poco más débil que la de AMGnE (Figura 21B, carriles 3 y 4). La intensidad de la mancha de PTX3 en UCGnE también fue menor que en UCE, lo que mostró que UCGnE contenía menos HMW PTX3 que UCE; es decir, más PTX3 estaba presente en la parte soluble en agua de UC.
Los resultados anteriores mostraron que tanto AM como UC contenían HMW PTX3. En AM, más HMW PTX3 era insoluble en agua y podía extraerse con GnHCl después de la extracción con PBS, mientras que más HMW PTX3 en UC era soluble en agua y podía extraerse principalmente con PBS.
Tanto IaI como HC1 está principalmente en extracto de AM PBS, pero en UC la mayoría de IaI está en extracto de PBS mientras que HC1 está en extracto de GnHCl, mientras que hay más bikunina presente en UCGnE que en UCE sin diferencia en los otros dos extractos.
La Figura 22 muestra que una banda de HC1 de 80 kDa estaba presente en todos los extractos de PBS excepto UCE y en todos los extractos de GnE excepto AMGnE. Esta banda fue aumentada por NaOH en todos los extractos de PBS pero no en GnE, mostrando que AM co Contiene HC1 libre y unida soluble en agua (es decir, éster unido a HA en HC-HA y a bikunina en IaI) que fue liberado por NaOH de acuerdo con Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem.
287:12433-12444. UC contenía HCl unida soluble en agua que fue liberado por NaOH, y también contenía HCl libre insoluble en agua unida a componentes extracelulares insolubles en agua que fueron disociados por SDS y 2-ME pero no afectados por NaOH. Esto fue consistente con una fuerte tinción positiva con HC1 en UC. La banda HMW HC1 estaba presente en todos los extractos de PBS y GnHCl en los pocillos de carga y se redujo con NaOH, lo que muestra que era el complejo HC-HA. La banda HMW HC1 fue más débil en UCGnE que en UCjGnE, lo que ilustra que la gelatina de Wharton contenía más complejo HC-HA insoluble en agua. Se encontró IaI libre en todos los extractos de PBS pero no en todos los extractos de GnE, lo que sugiere que era soluble en agua. Sin embargo, se encontró PaI libre en todos los extractos de PBS y GnHCl, lo que sugiere que PaI tenía una interacción diferente con IaI. Se encontró más bikunina en UCGnE que en UCE sin diferencias en otros dos extractos, destacando que la mayoría de bikunina estaba unida a otras moléculas insolubles en agua en UC y que esto era indicativo de una función única.
TSG-6 estaba presente en el complejo HMW de AM pero no en el extracto de UC GnHCl
La figura 23 mostró que la banda de 35 kDa TSG-6, que se ha informado en AME (Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem.
287:12433-12444), estaba presente en AMGnE pero no en todos los demás extractos, lo que demuestra que TSG-6 estaba ausente en GnE de UC. Esta banda no se vio afectada por NaOH, lo que confirma que TSG-6 no se unió a especies de HMW que pueden escindirse con NaOH. Sin embargo, la banda HMW TSG-6 se encontró en AMGnE y CHGnE, pero no en UCGnE y UJGnE. Además, esta banda no fue cambiada por NaOH, lo que demuestra que TSG-6 estaba fuertemente unido a especies de HMW. TSG-6 no se detectó en HC-HA purificado por ultracentrifugación 4X de GnE, lo que sugiere que aunque TSG-6 todavía está unido en la matriz insoluble, es separable por GnHCl durante la ultracentrifugación.
En resumen, GnHCl extrajo además abundante HA y proteínas de la parte insoluble de AM y UC después del extracto de PBS. UC contenía más HA que AM y CH tanto en los extractos de PBS como de GnHCl. HMW PTX3 estaban en un nivel más alto en el extracto de AM GnHCl y en un nivel más alto en el extracto de UC PBS. Se retuvo más HMW PTX3 en la parte insoluble después del extracto con PBS. El HC1 se encontraba principalmente en el extracto de AM PBS pero no en el extracto de UC GnHCl. HMW TSG-6 estaba en AMGnE pero no en UCGnE y UJGnE, lo que muestra que TSG-6 todavía estaba unido en la matriz insoluble pero separable por GnHCl durante la ultracentrifugación.
Ejemplo 28: Purificación del complejo HC-HA mediante cuatro ultracentrifugaciones sucesivas de extracto de AM y UC PBS y detección de la presencia de PTX3, HC, bikunina y TSG-6 en los complejos HC-HA
En este ejemplo, el complejo HC-HA se purificó mediante cuatro ultracentrifugaciones sucesivas de AME y UCE, y se detectó la presencia de PTX3, así como de HC, bikunina y TSG-6 en el complejo AM y UC HC-HA mediante transferencia Western.
El 4to complejo AM HC-HA contenía más HMW PTX3 y HC1, y era más puro que el 2do y 3er complejo HC-HA. Con el anticuerpo anti-PTX3, el análisis de transferencia Western de 1-4to AM HC-HA mostró una banda de 90 kDa (dímero), en comparación con el monómero que se encontró en los extractos de PBS. Esto mostró que el estado del dímero se resolvió mediante extracción adicional en GnHCl 4 M mediante ultracentrifugación, revelando una banda de HMW en la parte superior del gel en el 1er, 2°, 3er y 4° complejo HC-HA (Figura 24a). En comparación con el control de PTX3 purificado, la banda de 90 kDa era el dímero de PTX3 y la banda de alto peso molecular era el complejo HC-HA que contenía PTX3. Después del tratamiento con HAasa, la banda de 90 kDa no cambió en todos los complejos HC-HA, pero la banda de mancha de HMW se detectó vagamente en las fracciones 3 y 4. Es decir, del 1° al 4°, la banda HMW desapareció gradualmente y poco a poco apareció una mancha que se intensificó más en el 4° complejo HC-HA. No hubo banda de monómero PTX3 de 45 kDa en todos los complejos HC-HA. Los resultados mostraron que el complejo HC-HA contenía una forma multimérica de PTX3 que es capaz de unirse a HC-HA, y con el aumento del número de ultracentrifugación, el complejo HC-HA que contiene PTX3 se volvió más purificado. La existencia de dímero PTX3 de 90 kDa en el complejo HC-HA con o sin HAasa mostró que: 1) el dímero PTX3 presente en HC-HA fue disociado por SDS y 2-ME, y 2) el HMW PTX3 era resistente a SDS y 2-ME. El dímero de PTX3 que es un producto debido a 2ME se confirma adicionalmente a continuación (Figura 24a).
Con el anticuerpo anti-HCl, se detectó una banda de HCl de 80 kDa sólo en las primeras fracciones 1 y 2 de los cuatro complejos HC-HA (Figura 24b). Después del tratamiento con HAasa, la banda de HC1 se intensificó y también aparecieron varias bandas más pequeñas en los complejos de HC-HA 1° a 3°. Los resultados mostraron que el complejo HC-HA purificado no contenía HC libre y que HC-HA estaba hecho de HCl. De acuerdo con los resultados de la transferencia Western de PTX3 anteriores, al aumentar los tiempos de ultracentrifugación, el complejo HC-HA se volvió más purificado. No se encontraron HC2 (Figura 24c), HC3 ni TSG-6 (Figura 24d) en todos los complejos HC-HA.
TSP-1 solo estaba presente en el extracto de AM GnHCl pero no en el extracto de PBS y el complejo 1-4to de HC-HA
La trombospondina-1 (TSP-1) solo se detectó como trímero en el extracto de AM GnHCl pero no en el extracto de PBS y el complejo 1-4to de HC-HA (Figura 25). Después del tratamiento con HAasa, apareció como una mancha, lo que ilustra que TSP-1 era insoluble en agua y estaba fuertemente unido a HC-HA. Sin embargo, tal unión en la matriz insoluble a HC-HA puede disociarse por GnHCl y CsCl.
Al igual que el 4to complejo AM HC-HA, el 4to complejo UC HC-HA contenía PTX3 y HC1 pero no HC2, HC3, bikunina y TSG-6 y la falta de 2ME no generó dímero de PTX3 pero produjo HC1
Con el anticuerpo anti-PTX3, el análisis de transferencia Western del 4to UC HC-HA con o sin tratamiento con HAasa mostró un patrón de banda PTX3 similar en el complejo del 4to UC HC-HA (figura 26a, carriles 5 y 6) al del 4to complejo AM HC-HA (Figura 26a, carriles 3 y 4). Cuando el regulador de muestra no contenía 2-ME, el dímero de PTX3 de 90 kDa desapareció en el complejo UC HC-HA con o sin HAasa (Figura 26a, carriles 7 y 8), mostrando que la aparición del dímero de PTX3 de 90 kDa en el complejo HC-HA se debió a la reducción de PTX3 unido a HC-Ha por 2-ME en el regulador de muestra. Con el anticuerpo anti-HCl, solo se detectó una banda de HC-HA de alto peso molecular en el 4to complejo UC HC-HA (figura 26b, carril 6) similar a la del 4to complejo AM HC-HA (figura 26b, carril 4). Después de HAasa, la banda de HC-HA desapareció y la banda de HC1 aumentó (carril 7) como el 4to complejo AM HC-HA (carril 5), aunque su intensidad fue un poco más débil que en el 4to AM HC-HA. Esto mostró que la HC1 formó un complejo con S-S con PTX3. La banda más fuerte con un MW ligeramente más alto que el de la HC1 genérica apareció cuando el regulador de muestra no contenía 2-ME, lo que muestra que la HC1 estaba unida a PTX3 a través de S-S. No se detectó HC2, HC3 (Figura 26c), bikunina (Figura 26d) ni Ts G-6 (Figura 26e) en el 4to complejo AM y UC HC-HA.
Ejemplo 29: Purificación del complejo HC-HA a partir del extracto total de AM y UC GnHCl mediante cuatro ultracentrifugaciones sucesivas y comparación con extracciones de PBS
Este ejemplo determinó que se podía obtener más complejo HC-HA de AM y UC, que el complejo HC-HA tenía una constitución más razonable de PTX3 y HC-HA, y que tenía un papel terapéutico más eficaz en la clínica. AM y UC se extrajeron con regulador de GnHCl 6 M (Tris-HCl 200 mM, pH 8.0, GnHCl 6 M, EDTA 10 mM, ácido aminocaproico 10 mM, N-etilmaleimida 10 mM, PMSF 2 mM): La extracción de GnHCl de AM y UC se realizó mediante la adición de regulador de GnHCl 6 M a polvo de AM y UC a 1:4 (g/ml). Las muestras se mezclaron durante la noche a 4°C y se centrifugaron a 48,000 g, a 4°C durante 30 min. Los sobrenadantes fueron extractos de GnHCl. El 4to complejo HC-HA se purificó a partir del extracto de AM y UC GnHCl usando el mismo procedimiento que para la purificación del 4to HC-HA a partir del extracto de PBS. La caracterización del complejo HC-HA se realizó mediante transferencia Western para examinar PTX3, HC, bikunina, TSG-6 y probablemente otras proteínas. Se ejecutó un gel de agarosa de HC-HA para ver el contenido de HA y el peso molecular.
GnHCl extrajo más complejo HC-HA de AM y UC que PBS.
Los extractos de GnHCl de AM y UC se denominaron AMEG y UCEG, y sus contenidos de HA y proteínas se detectaron mediante el ensayo BCA y HA ELISA, respectivamente. El 4to complejo HC-HA se purificó a partir del extracto de GnHCl y se detectaron de manera similar sus contenidos de HA y proteína. La Tabla 2 resume el contenido de proteína y HA en los extractos de PBS y GnHCl y su 4to complejo HC-HA. Los resultados mostraron que los extractos de a M y UC GnHCl contenían más Ha y tienen una relación HA/proteína más alta en comparación con el extracto relativo de PBS. Además, se purificó más complejo HC-HA a partir del extracto de GnHCl.
Tabla 2. Cuantificación de proteínas y HA en extractos y 4to HC-HA de AM y UC.
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El 4to complejo AM GnHCl HC-HA contenía más HC1 y HMW PTX3 pero contenía menos que el PBS HC-HA con o sin tratamiento con HAasa o NaOH, y tanto PBS como GnHCl HC-HA no contenían TSP-1.
Con el anticuerpo anti-HCl, GnHCl HC-HA mostró una banda de HMW en el pocillo de carga como PBS HC-HA, pero la digestión con HAasa solo liberó HC1 más débil (Figura 27a, carriles 6 y 7). El tratamiento con NaOH también liberó una banda de HC1 más débil que tenía un MW un poco más alto que el liberado por HAasa (Figura 27a, carril 8), que no se observó en PBS HC-HA después del tratamiento con NaOH. Estos resultados mostraron que GnHCl HC-HA contenía HC1 pero la cantidad era menor que PBS HC-HA. De manera similar, a diferencia de PBS HC-HA, con anticuerpo anti-PTX3, GnHCl HC-HA solo mostró dímero PTX3 pero ninguna mancha de HMW PTX3 notable con o sin digestión con HAasa (Figura 27b, carriles 6 y 7). El NaOH también dio como resultado una apariencia de HMW y dímero PTX3. Estos resultados mostraron que GnHCl HC-HA contenía menos HMW PTX3 que PBS HC-HA. Similar a la transferencia de HC1, se produjo un dímero de PM más alto de PTX3 después de NaOH que de HAasa en GnHCl HC-HA. Estos resultados indicaron colectivamente que NaOH liberó un enlace éster que une HC1 a HA y podría estar asociado con PTX3. Debido a que GnHCl HC-HA tenía más contenido de HA que PBS HC-HA, el complejo GnHCl HC-HA contenía HA que no estaba unido por PTX3 o HC1, lo que resultaba en la disminución del contenido real de complejo HC-HA/PTX3 en los productos purificados y menos HC1 y HMW PTX3 en este. No se detectó TSP-1 en PbS HC-HA con anti-TSP-1. Cabe señalar que TSP-1 tampoco se detectó en GnHC1HC-HA. Debido a que el extracto de GnHCl contenía TSP-1, estos resultados mostraron que TSP-1 se disociaba por ultracentrifugación, por lo que no estaba presente en GnHCl HC-HA.
El gel de agarosa mostró abundante HA en GHCl HA-HA
PBS HC-HA mostró una "mancha de HA continua desde el pocillo de carga superior hasta la parte inferior del gel de agarosa, y HAasa abolió completamente la mancha de HA (Figura 28, carriles 3 y 4). GnHC1HC-HA mostró una banda en la carga pocillo y una mancha de HA, que comenzó desde la ubicación de 4,570 kDa hasta el fondo del gel de agarosa (Figura 28, carril 5). HA en GnHCl HC-HA tuvo una ruptura entre el pocillo de carga y el comienzo de la mancha de HA, aunque su intensidad fue más fuerte que en PBS HC-HA. Además, HAasa no abolió completamente la mancha de HA y la banda de HMW HA en GnHCl HC-HA (Figura 28, carril 6). Las fracciones superiores (fracciones 1-6) del extracto de GnHCl después de la cuarta ultracentrifugación también mostró el mismo patrón de mancha de HA que las "fracciones inferiores" de GnHCl HC-HA (Figura 28, carriles 7 y 8). Estos resultados mostraron que GnHCl HC-HA contenía más HMW HA (con un MW menor que PBS HC-HA) pero carecía de una porción de la mancha de HMW HA que correspondía a la falta de mancha de HMW PTX3 en la transferencia Western de GnHCl HC-HA. Esto indica que la mancha de HMW HA faltante, que estaba presente en PBS HC-HA, se formó al menos en parte por entrecruzamiento de PTX3 y HC-HA, y que el h Mw HA en el pocillo de carga de GnHCl HC-HA se complementó con componentes diferentes de PTX3
GnHCl HC-HA contenía algunas proteínas que no se encuentran en PBS HC-HA mediante tinción con azul de Coomasie
GnHCl HC-HA contained some proteins that are not found in PBS HC-HA by Coomasie blue staining
La figura 29A muestra que las bandas en el pocillo de carga superior, una banda principal de 140 kDa y algunas bandas menores de 70 kDa, doblete de 55 kDa y 20 kDa, estaban presentes en AM GnHC1HC-HA y en las fracciones superiores de GnHCl HC-HA, pero no en todos los otros PBS HC-HA. Esto mostró que AM GnHC1HC-HA contenía algunas proteínas que estaban ausentes en PBS HC-HA. Además, también se visualizaron una banda de 90 kDa y 25 kDa en las fracciones superiores de GnHCl HC-HA. Debido a que la transferencia Western detectó HC1 en PBS HC-HA, la HC1 también debería estar presente en PBS HC-HA mediante tinción con azul de Coomassie. La razón por la que no estaba presente en PBS HC-HA se debió al hecho de que HC-HA cargado no entró en el gel debido a la sobrecarga. Los 140 kDa se mostraron como una banda ancha, lo que sugiere que contenía unidades estructurales de azúcar. Además, HAasa no afectó a estas bandas, lo que demuestra que estas especies se disociaron por SDS y 2-ME.
En comparación con AM GnHCl HC-HA, UC GnHCl HC-HA mostró bandas en el pocillo de carga superior, bandas de 90 kDa, 70 kDa, doblete 55 kDa, 35 kDa y 20 kDa (Figura 29B, carriles 4 y 5). También estaba presente una tenue banda de 140 kDa. Estas bandas no se vieron afectadas por HAasa. Además, las fracciones superiores de GnHCl HC-HA también mostraron una mancha desde el pocillo superior hasta el sitio de 200 kDa que disminuyó después del tratamiento con HAasa. Todas las bandas estaban ausentes en UC PBS HC-HA. Estos resultados mostraron que UC GnHCl HC-HA también contenía algunas proteínas que estaban ausentes en PBS HC-HA, y UC GnHCl HC-HA era diferente de AM GnHCl HC-HA con respecto a las bandas de proteínas que contenían.
Los resultados anteriores mostraron que GnHCl HC-HA era diferente de PBS HC-HA tanto de AM como de UC en los siguientes aspectos: (1) GnHCl HC-HA contenía menos HC1 y HMW PTX3 que PBS HC-HA (de transferencia Western) mientras que como PBS HC-HA, TSG-6, HC2 y HC3 tampoco estaban presentes en GnHC1HC-HA. (2) GnHCl HC-HA contenía más HMW HA pero carecía de una pieza de HMW HA que correspondía a la mancha de HMW PTX3 en la transferencia Western mostrada por PBS HC-HA (de gel de agrosa). (3) GnHC1HC-HA contenía algunas proteínas principalmente con MW 140 kDa que no se encontraron en PBS HC-HA (del gel de tinción con azul de Coomassie).
En resumen, el GnHCl extrajo más HA y proteínas del tejido AM y UC, lo que resultó en una relación HA/proteína más alta en comparación con el extracto de PBS. Se purificó más complejo de HC-HA (de acuerdo con el contenido de HA) del extracto de GnHCl tanto para AM como para UC. GnHCl HC-HA contenía hC1 y HMW PTX3 pero mucho menos que en PBS HC-HA tanto para AM como para UC. GnHCl HC-HA carecía de una especie de mancha de HMW hA en el gel de agrosa que correspondía a la mancha de HMW PTX3 en la transferencia Western mostrada por PBS HC-HA. GnHCl HC-HA contenía algunas proteínas que no se encuentran en PBS HC-HA.
Ejemplo 30: Determinación de la identidad de bandas de proteínas desconocidas en el complejo GnHC1HC-HA purificado de AM y UC
Este ejemplo determinó la identificación de bandas desconocidas en GnHCl HC-HA ejecutando geles SDS-PAGE seguido bien sea por tinción CB o análisis de transferencia Western de GnHC1HC-HA de AM y UC con o sin desglicosilación. La muestra se liofilizó AM y UC 4x HC-HA (contenía 30 |jg de HA) tanto de extractos de PBS como de GnHCl. Se incubaron HC-HA liofilizados con 50 j l de TFMS y 20 j l de anisol en hielo durante 3 horas y se neutralizaron con TFMS con 125 j l de N-etilmorfolina. Las muestras se precipitaron con 5-10 volúmenes de acetona durante la noche a -20°C o durante 1 h a -80°C. Las muestras se centrifugaron y el sedimento seco se disolvió en regulador de carga de muestra SDS para electroforesis. Se realizó la desglicosilación enzimática con queratinasa (Endo-p-galactosidasa) para eliminar la cadena de queratán sulfato y los oligosacáridos unidos a N, o con Condroitinasa (Cabc) para eliminar la cadena de sulfato de condroitina. Se incubó HC-HA (que contenía 30 jg de HA) con 0.1 U/ml de queratinasa en acetato de sodio 50 mM, pH 5.8, a 37°C durante 2 h, o se incubó con 5 U/ml de Cabc en PBS a 37°C durante 2 h. Se ejecutó un gel SDS-PAGE para probar la tinción CB, seguido de análisis de transferencia Western.
El queratán sulfato y la osteoadherina estaban presentes en AM GnHCl HC-HA pero no en PBS HC-HA.
Se realizó un análisis de transferencia Western. Los resultados se muestran en la fig. 30.B y C. La transferencia Western con anticuerpo anti-queratán sulfato mostró una banda ancha de 70 kDa (60-80 kDa) en AM GnHC1HC-HA con o sin digestión con HAasa (Figura 30B, carriles 6-8), pero no en PBS HC-HA, que mostró que este proteoglicano de sulfato de queratina de ~ 70 kD era responsable de la inmunotinción positiva mostrada en la Figura 30D. Esta banda de 70 kD correspondía a la misma banda anotada en GnHCl HC-HA con o sin tratamiento con HAasa que se muestra en el gel teñido con azul de Coomassie (Figura 30A).
Para determinar adicionalmente si este proteoglicano de sulfato de queratina de 70 kD es un SLRP, se usaron anticuerpos anti-lumican, anti-fibromodulina y anti-osteoadherina en la transferencia Western. El anticuerpo antiosteoadherina reconoció una banda de 60 kD, pero no una banda de 70 kD en GnHC1HC-HA con o sin digestión con HAasa (Figura 30C, carriles 6-8), pero no en PBS HC-HA. La osteoadherina con cadena de sulfato de queratina tiene una masa molecular de ~ 80 kD, mientras que su proteína sin sulfato de queratina es de ~ 60 kD. Se detectó una banda de sulfato de queratina en el tamaño de 60 kD, pero solo en un tamaño amplio de 70 kD, que mostró que la banda de 60 kD detectada por anti-osteoadherina era osteoadherina sin queratán sulfato. AM GnHC1HC-HA contenía osteoadherina sin queratán sulfato que se asoció estrechamente con HC-HA y resistió ultracentrifugación 4 veces en presencia de GnHCl 6 M y cloruro de cesio. Pero fue liberado por SDS y 2-ME en el reguladore de muestra. Los resultados también mostraron que el proteoglicano de sulfato de queratina de 70 kD no era osteoadherina. No se detectó lumican ni fibromodulina en GnHCl HC-HA, lo que mostró que el proteoglicano de 80 kD no es lumican ni fibromodulina.
Desglicosilación y análisis de AM GnHCl HC-HA
El HC-HA fue desglicosilado por TFMSA para eliminar todos los glucanos usando queratinasa y condroitinasa para eliminar glucanos específicos para ver si había algún cambio en las bandas de 140 kD y ~80 kD en AM GnHC1HC-HA, y determinar además si el proteoglicano de sulfato de queratina de ~80 kD era queratocán, PRELP u osteoglicano. Como primera etapa que confirma el efecto de la desglicosilación anterior, se realizó la tinción con azul de Coomassie.
En la Fig. 31A, el gel teñido con azul de Coomassie (CB), AM GnHCl HC-HA (Figura 31A, carril 2) mostró las mismas bandas de 140 kDa, 70 kDa, doblete 50 kDa, 20 kDa y una banda débil de 35 kDa también como una banda HMW en la parte superior del gel. K/C/H no afectó mucho a estas bandas excepto por generar una apariencia de bandas principales de 80 kDa, una débil de 100 kDa y de 30 kDa (Figura 31A, carril 3). Este patrón fue similar al derivado de la fracción superior de AM GnHCl HC-HA bajo C/K/H (Figura 31A, carril 6). Estos resultados mostraron que las bandas de 140 kDa, 70 kDa y 55 kDa no estaban sulfatadas con queratán y/o condroitina sulfatadas, y que había otras proteínas sulfatadas con queratán y/o condroitina sulfatadas en GnHC1HC-HA que se liberaron como una especie principal de 80 kDa después de C/K/H. El tratamiento con TFMSA condujo a la desaparición de todas las bandas anteriores excepto la banda de 20 kDa, y generó una nueva banda clara de 50 kDa y una mancha de HMW (Figura 31A, carril 4). TFMSA/H hizo desaparecer la mancha dando como resultado una nueva banda de 25 kDa pero no cambió la banda de 50 kDa (Figura 31A, carril 5). Este resultado mostró que las bandas de 140 kDa, 70 kDa, 55 kDa y 80 kDa eran la misma especie de 50 kDa que con diferentes cantidades de cadenas de glucano.
Para determinar si la banda de 50 kDa se originó a partir de osteoadherina de 60 kDa, se realizó un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-osteoadherina. El resultado mostró una especie de 60 kDa en AM GnHCl HC-HA (Fig. 31B, carril 4), consistente con el hallazgo mostrado en la Figura 31C. C/K/H no cambió su masa molecular (Figura 31B, carriles 5 y 6), pero TFMSA con o sin tratamiento con HAasa (T/H) la cambió completamente en una especie de 55 kDa con menos intensidad (Figura 31, carriles 7 y 8). La fracción superior de AM GnHC1HC-HA con T/H mostró una banda más fuerte pero un MW más pequeño sin el cambio de intensidad en comparación con sin T/H (Figura 31B, carriles 9 y 10). Estos resultados confirmaron además que AM GnHC1HC-HA contenía osteoadherina, que estaba libre de queratán sulfato y sulfato de condroitina. La razón por la cual la intensidad de la banda de osteoadherina disminuyó después del tratamiento con TFMSA se debió a que (1) la proteína fue degradada por TFMSA; (2) fue bloqueadA por otra gran cantidad de proteínas con el mismo MW que también fueron liberadas después del tratamiento con TFMSA. La osteoadherina no fue detectable en PBS HC-HA sin ningún tratamiento, pero aparecieron bandas de doblete de 60 kDa después del tratamiento con TFMSA/HAasa, lo que muestra que PBS HC-HA contenía una cantidad mínima de osteoadherina, que estaba estrechamente unida a HA.
La transferencia Western con un anticuerpo anti-decorina mostró una especie de 140 kDa muy fuerte y ancha (80­ 160 kDa) y una especie de doblete débil de 50 kDa en AM GnHCl HC-HA (Figura 31C, carril 4; 31D, carriles 4 y 5) pero no en PBS HC-HA (Figura 31C, carril 2; 31D, carriles 2 y 3). Las especies anchas de 140 kDa correspondían a decorina con una cadena de sulfato de condroitina o sulfato de dermatán y diferente número de glicanos, mientras que las especies de doblete de 50 kDa probablemente correspondían a la decorina menos glicosilada. Debido a que HAasa no afectó a las especies de decorina, mostró que pueden ser liberadas por SDS y 2-ME. La noción anterior fue confirmada por C/H, que aumentó una especie de 70 kDa (Figura 31C, carril 5), y por C/H/K, que dio el mismo resultado (Figura 31B, carril 6). Por lo tanto, la especie de 70 kDa era la decorina sin condroitina. Esta especie de 70 kDa fue un componente menor porque la principal especie amplia de 140 kDa no sufrió grandes cambios ni por C/H ni por C/H/K. El tratamiento con TFMSA eliminó completamente la especie amplia de 140 kDa mientras tanto dio lugar a una especie principal de 43 kDa que correspondía a la proteína del núcleo de decorina desglicosilada, y una especie menor de 95 kDa, 80 kDa y una especie débil de 30 kDa (Figura 31C, carril 7). El tratamiento con TFMSA/H mostró el mismo patrón de especies que con TFMSA solo, excepto que se potenció la intensidad de todas estas especies, lo que muestra que la decorina estaba estrechamente unida a HA. TFMSA/H también dio como resultado la liberación de una especie débil de 43 kDa de PBS HC-HA, lo que muestra que AM PBS HC-HA también contenía una cantidad diminuta de decorina que estaba fuertemente unida a HA. La fracción superior de AM GnHC1HC-HA con o sin TFMSA/H mostró el mismo patrón que la fracción inferior con la intensidad más fuerte que la última (Figura 31C, carriles 9 y 10), lo que mostró que la fracción superior también contenía abundantes decorina. Los resultados anteriores mostraron que las principales especies de 140 kDa, 70 kDa y doblete de 50 kDa en el gel de tinción CB están formadas por decorina a través de CS y principalmente sin CS y sin KS.
A diferencia de la decorina, la transferencia Western con un anticuerpo anti-biglicano mostró una mancha de HMW con un área fuerte a 400 kDa, y una especie débil de 45 kDa en AM GnHCl HC-HA con o sin HAasa (Fig. 31E carril 4; 2F carriles 4 y 5) pero no en PBS HC-HA (Figura 31D, carril 2; F, carriles 2 y 3). La especie de 45 kDa correspondió a una proteína del núcleo de biglicano, mientras que la mancha de HMW era biglicano glicosilado con dos cadenas de sulfato de condroitina o sulfato de dermatano. HAasa intensificó el área de 400 kDa con menos mancha de HMW por encima de 400 kDa, lo que mostró que algunos biglicanos también estaban unidos a HC-HA. C/H o C/K/H no cambiaron mucho la mancha de HMW y las especies de 45 kDa, pero aumentaron una especie de 70 kDa (Figura 31E, carriles 5 y 6) que probablemente era el biglicano libre de condroitina. Debido a que la cantidad de especies de 70 kDa era muy pequeña y la mancha de HMW principal no se modificó mucho por los tratamientos anteriores, la mayoría de los biglicanos en AM GnHCl HC-HA no se asociaron con CS o KS. El tratamiento con TFMSA eliminó completamente la mancha de HMW y dio lugar a una especie principal de 45 kDa que correspondía a la proteína del núcleo de decorina desglicosilada, y una especie débil de 95 kDa, 80 kDa y 30 kDa (Figura 31E, carril 7), lo que sugirió la existencia de biglicano en AM GnHCl HC-HA. Las especies de 95 kDa y 80 kDa fueron biglicanos parcialmente desglicosilados, mientras que las especies de 30 kDa fueron biglicanos degradados. TFMSA junto con el tratamiento con HAasa mostró el mismo patrón de especies que TFMSA solo, excepto que la intensidad de todas estas especies se potenció, lo que sugirió que el biglicano también estaba estrechamente unido a HA. La fracción superior de AM GnHCl HC-HA con o sin TFMSA/HAasa mostró el mismo patrón de especies que la fracción inferior con la intensidad más fuerte que la última (Figura 31E, carriles 9 y 10), que mostró que la fracción superior también contenía abundantes biglicanos. El análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-queratán sulfato mostró la presencia de la proteína queratán sulfatada de 70 kDa en AM GnHC1HC-HA con o sin tratamiento de queratinasa o condroitinasa sin desplazar el tamaño molecular (Figura 31G), lo que sugirió que la queratinasa no eliminó completamente el queratán sulfato o la cantidad de KS fue mínima en esta especie. La transferencia Western con anticuerpo anti-PTX3 mostró una mayor mancha de HMW PTX3 que se mostró en AM GnHC1HC-HA con K e incluso más con K/H (Figura 31H, carriles 6 y 8) en comparación con la que se realizó con o sin digestión con HAasa sola. (Figura 31G, carriles 4 y 5). La condroitinasa no tuvo tal efecto, lo que indicó que algunas especies que contienen KS estaban unidas a PTX3 en GnHCl HC-HA. También se obtuvieron los mismos resultados a partir del análisis de transferencia Western de UC GnHCl HC-HA con o sin digestión con queratinasa (véase más abajo la Figura 32G). Las transferencias Western confirmaron que no había fibromodulina, Lumican, queratocan, PRELP, osteoglicina, epificana, periostina y TSG-6, así como bikunina en AM GnHC1HC-HA.
En resumen, AM GnHCl HC-HA contenía decorina y biglicano abundantes que estaban unidos a HC-HA, pero PBS HC-HA contenía solo decorina tenue y no biglicano. AM GnHCl HC-HA contenía especies que contenían osteoadherina y queratán sulfato, mientras que PBS HC-HA no. Una cantidad muy pequeña de decorina y biglicano en AM GnHCl HC-HA contenía cadena de sulfato de condroitina.
La desglicosilación y el análisis de UC GnHCl HC-HA mostraron abundante presencia de decorina y biglicano en UC GnHCl HC-HA pero no en PBS HC-HA. El queratán sulfato, la osteoadherina y la bikunina también estaban presentes en UC GnHCl HC-HA.
La tinción con CB (Figura 32A) mostró las mismas bandas de bandas de 160 kDa, 90 kDa, 70 kDa, doblete 50 kDa, 35 kDa y 20 kDa en el pocillo de carga superior en UC GnHCl HC-HA (Figura 32A, carril 4). C/H o C/H/K no afectaron mucho a estas bandas, excepto que dieron como resultado la aparición de una banda principal de 80 kDa y una banda débil de 30 kDa (Figura 32A, carriles 5 y 6). El tratamiento con TFMSA disminuyó todas las bandas anteriores excepto la banda de 20 kDa pero aumentó una banda principal de 50 kDa, una banda menor de 80 kDa y una mancha de HMW (Figura 32A, carril 7). TFMSA/H hizo desaparecer la mancha y la banda de 80 kDa pero dio como resultado una banda débil de 25 kDa que apareció y disminuyó la intensidad de la banda de 50 kDa recién formada (Figura 32A, carril 8). Estos resultados son similares a los obtenidos de AM GnHC1HC-HA (Figura 31A), mostrando que UC GnHCl HC-HA tenía una constitución similar con AM GnHCl HC-HA. La fracción superior de UC GnHCl HC-Ha con o sin TFMSA/H mostró el mismo patrón que la fracción inferior (Figura 32A, carriles 9 y 10), lo que indica que tenían los mismos componentes que la fracción inferior. UC PBS HC-HA sin desglicosilación solo mostró una banda HMW en el pocillo de carga y debajo de ella, así como una banda de 20 kDa. TFMSA/H eliminó la banda HMW pero aumentó principalmente una banda de 50 kDa junto a una banda débil de 80 kDa y una banda de 25 kDa, lo que sugiere que UC PBS HC-HA contenía algo de proteína glicosilada que solo se liberó por desglicosilación completa y degradación de HA.
El análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-decorina mostró una especie amplia de 160 kDa en UC GnHCl HC-HA con o sin HAasa (Figura 32B, carriles 4 y 5) pero no en PBS HC-hA (Figura 32B, carriles 2 y 3), lo que indica que UC GnHCl HC-HA, como AM GnHCl HC-HA, también contenía decorina. Su masa molecular era diferente a la de AM GnHCl HC-HA debido a un nivel diferente de glicosilación. La HAasa disminuyó en gran medida la especie de 160 kDa, mostrando que estaba unida a HC-HA. La queratinasa con o sin HAasa también disminuyó la intensidad de especies de 160 kDa, lo que indica que también contenía algo de KS. En particular, C con o sin digestión con HAasa condujo a la desaparición de las especies de 160 kDa y las especies del pocillo superior, pero dio lugar a una fuerte especie de 50 kDa y 90 kDa, así como una mancha de HMW, que muestra que la decorina en UC GnHCl HC-HA fue principalmente sulfato de condroitina en comparación con la de AM GnHC1HC-HA, donde menos de ellos contenían cadena de sulfato de condroitina. Estos resultados confirmaron además que UC GnHCl HC-HA contenía decorina, y que la decorina en UC difería de AM en (1) glicosilación, (2) se une el tipo de glicosaminoglicano y (3) la cantidad total.
La transferencia de Western con anticuerpo anti-biglicano mostró una especie HMW fuerte en el pocillo superior, una mancha de HMW en un área de 400 kDa y un área de 140 kDa, y una especie de 45 kDa en UC GnHC1HC-HA con o sin HAasa (Figura 31C, carriles 4 y 5) pero no en PBS HC-HA (Figura 31C, carriles 2 y 3). HAasa intensificó el área de 400 kDa sin afectar a las especies de HMW en el pocillo, lo que sugiere que algunas especies estaban estrechamente unidas a HA. La queratinasa con o sin HAasa no cambió mucho por encima de las especies excepto por la disminución de las especies de 45 kDa (Figura 32C, carriles 6 y 8), lo que sugiere que las especies de 45 kDa contenían KS pero la mayoría de las otras no. La condroitinasa sola abolió la especie HMW en el pocillo superior y redujo la intensidad del área de 400 kDa, pero aumentó una especie fuerte y ancha de 50 kDa, una especie de 100 kDa y una especie de 28 kDa con mancha entre ellas (Figura 32C, carril 7). La condroitinasa más HAasa tuvo los mismos resultados con toda la mancha más intensificada y las especies de 28 kDa desaparecieron (Figura 32C, carril 9). Estos resultados sugirieron que, de forma similar a la decorina, el biglicano en UC GnHC1HC-HA aporta principalmente la cadena de sulfato de condroitina. Este hallazgo es diferente al de AM HC-HA donde se sulfató menos condroitina. Además, la mayoría de los biglicanos forman el complejo HMW en HC-HA y algunos se unen a HC-HA.
La transferencia Western con anticuerpo anti-bikunina mostró una banda ancha de 35 kDa en UC GnHC1HC-HA con o sin digestión con HAasa pero no en PBS HC-HA (Figura 32D, carriles 4 y 5). La banda de 35 kDa corresponde al MW de la bikunina nativa. La queratinasa con o sin HAasa agudizó esta banda de 35 kDa pero no cambió su MW (Figura 32D, carriles 6 y 8), mientras que la condroitinasa con o sin digestión con HAasa cambió la bikunina de 35 kDa en una bikunina de núcleo de 25 kDa (Figura 32D, carriles 7 y 9), confirmando además la existencia de bikunina en UC GnHCl HC-HA, y contenía CS como se informó. Debido a que también se formó una mancha de HMW después del tratamiento con condroitinasa, sugirió que la bikunina está fuertemente unida a HC-HA a través de CS. Estos resultados fueron diferentes de AM GnHCl HC-HA que no contenía bikunina.
La transferencia Western con anticuerpo anti-PTX3 mostró un aumento en la mancha de HMW PTX3 en UC GnHCl HC-HA después de H, K, C, y especialmente con K/H (Figura 32E, carriles 6 y 8) en comparación con eso solamente con o sin digestión con HAasa (Figura 32E, carriles 4 y 5). Estos resultados confirmaron la existencia de HMW PTX3 en UC GnHCl HC-HA y su fuerte unión en GnHCl HC-HA. Adicionalmente, una unión tan fuerte se vio favorecida por la presencia de especies que contienen KS, cuya identidad sigue sin estar clara. También explicó que nuestros datos anteriores (sin digestión enzimática) podrían haber subestimado la cantidad de HMW PTX3 en UC GnHC1HC-HA.
La transferencia Western con anticuerpo anti-queratán sulfato mostró una especie de HMW en el pocillo y una banda tenue de 55 kD en UC PBS HC-HA. HAasa no cambió esta banda pero hizo más obvia una banda de 60 kDa (Figura 32F, carriles 2 y 3). Sin embargo, se reconoció una banda de 140 kD por el anticuerpo anti-queratán sulfato en UC GnHCl HC-HA con o sin digestión con HAasa (Figura 32F, carriles 4 y 5). La queratinasa con o sin tratamiento con HAasa no eliminó la banda de 140 kDa, pero aumentó principalmente una banda de 35 kDa y varias otras bandas entre ellas, incluidas las bandas de 60 kDa y 55 kDa observadas en PBS HC-HA (Figura 32F, carriles 6 y 8).
La condroitinasa con o sin tratamiento con HAasa tampoco eliminó la banda de 140 kDa, pero aumentó una banda de 90 kDa así como también las bandas de 60 kDa y 55 kDa observadas en PBS HC-HA (Figura 32F, carriles 7 y 9). El tratamiento con condroitinasa también dio como resultado una apariencia de mancha de HMW que disminuyó después del tratamiento con HAasa, lo que sugiere que UC GnHCl HC-HA contenía abundantes proteínas sulfatadas con condroitina además de proteínas sulfatadas con queratán. Estaba claro que la proteína sulfatada con queratán en UC GnHCl HC-HA (140 kDa) tenía un MW diferente al de AM GnHCl HC-HA (~80 kDa), y tal vez se debió a la diferente cantidad de glicano en la cadena.
Con el anticuerpo anti-osteoadherina, se detectaron una banda principal de 60 kD y una banda débil de 80 kD en UC GnHCl HC-HA (Figura 32G, carriles 4) pero no en PBS HC-HA. Obviamente, estas dos bandas no se vieron afectadas por la queratinasa, la condroitinasa o la HAasa. Los 80 kD deben ser osteoadherina sulfatada con queratina, mientras que 60 kD deben ser osteoadherina sulfatada sin queratina. Los resultados sugirieron que UC GnHCl HC-HA contenía osteoadherina sulfatada con queratina y sin sulfato de queratina.
En resumen, no se detectaron fibromodulina, Lumican, Keratocan, PRELP, osteoglicina, epificana, periostina y TSG-6 en UC GnHCl HC-HA. UC GnHCl HC-HA contenía decorina, biglicano, osteoadherina, queratán sulfato y bikunina. El biglicano y la decorina eran abundantes, mientras que PBS HC-HA no contenía una abundancia de estas especies.
Resumen
Se purificó el complejo HC-HA mediante ultracentrifugación 4x de PBS y extracto de GnHCl de AM y UC. E1HC-HA purificado a partir de GnE era bastante diferente del HC-HA purificado a partir del extracto de PBS en rendimiento y constitución química (véase Tabla 1). En cantidad, el HC-HA purificado a partir de GnE contenía más HA que el purificado a partir de PBS. En constitución química: GnHCl HC-HA contenía más HMW HA (con un MW ligeramente más pequeño que PBS HC-HA) pero carecía de una pieza de HMW HA que correspondía a la mancha de HMW PTX3 en la transferencia Western mostrada por PBS HC-HA (de gel de agarosa). Con o sin digestión con HAasa, GnHCl HC-HA contenía menos HCl y HMW PTX3 que PBS HC-HA, pero después de la digestión con queratinasa más HAasa, se detectó más PTX3 (de transferencia Western), lo que sugiere que e1HMW PTX3 estaba estrechamente unido a las proteínas sulfatadas con queratán en GnHCl HC-HA. Ni p Bs HC-HA ni GnHC1HC-HA contenían TSG-6, HC2 y HC3. La bikunina estaba presente en UC GnHCl HC-HA pero no en UC PBS HC-HA y tanto en AM PBS como en GnHCl HC-HA. AM GnHCl HC-HA contenía decorina abundante, relativamente más que UC GnHCl HC-HA. Tanto AM como UC PBS HC-HA contenían una leve cantidad de decorina. AM y UC GnHC1HC-HA contenían abundante biglicano, especialmente en UC GnHCl HC-HA. No estaba presente biglicano en PBS HC-HA. AM y UC GnHCl HC-HA contenían osteoadherina. AM y UC PBS HC-HA no contenían biglicano, especies que contienen queratán sulfato, fibromodulina, lumican, queratocán, PRELP, osteoglicina, epificano, periostina y osteopondina, TSP-1. No hubo fibromodulina, Lumican, queratocán, PRELP, osteoglicina, epificana, periostina y osteopondina, TSP-1, asporina en AM y UC GnHCl HC-HA. GnHCl HC-HA contenía bandas proteicas visibles principalmente con MW de 200 kDa, 80 kDa y 60 kDa que no se encontraron en PBS HC-HA (del gel de tinción con azul de Coomassie).
Tabla 3. Resumen de comparación del complejo HC-HA 4x purificado a partir de extracto de PBS y GnHCl.
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Tabla 4. Resumen de comparación del extracto de PBS y GnE obtenido secuencialmente de AM y UC.
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Ejemplo 31: La expresión constitutiva de PTX3 mediante células estromales de membrana amniótica humana conduce a la formación del complejo HC-HA/PTX3
En este ejemplo, se examinó la expresión de PTX3 en HC-HA purificada de AM y su efecto sobre la formación del complejo HC-HA/PTX3 en AM.
Procedimientos experimentales
1. Materiales
Clorhidrato de guanidina, cloruro de cesio, EDTA, alcohol anhidro, acetato de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, hidróxido de sodio, base Tris, Triton X-100, 3-(N,N-dimetil palmitil amonio) propanosulfonato (Zwittergent3'16), mezcla inhibidora de la proteasa (que incluye clorhidrato de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonil fluoruro, aprotinina, clorhidrato de bestatina, E-64, leupeptina y pepstatina A) y fluoruro de fenilmetanosulfonilo se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La hialuronidasa de Streptomyces (HAasa) y la proteína de unión a HA biotinilada (HABP) eran de Seikagaku Biobusiness Corporation (Tokio, Japón). El medio Eagle modificado de Dulbecco, la mezcla de nutrientes F12 de Ham, el suero bovino fetal, la solución salina equilibrada de Hank, la gentamicina, la anfotericina B y el regulador RIPA se adquirieron de Invitrogen (Grand Island, NY). Los casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (3.5K MWCO) eran de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). El kit de ensayo de proteínas BCA era de Pierce (Rockford, IL). El kit de prueba cuantitativa HA era de Corgenix (Westminster, CO). Los geles preparados para acrilamida en gradiente al 4-15% y las membranas de nitrocelulosa eran de Bio-Rad (Hercules, CA). IaI se preparó en nuestro laboratorio a partir de plasma humano, de acuerdo con el método publicado (1.38). El mAb de PTX3 (MNB4) y el pAb eran de Enzo Life Sciences, Inc. (Plymouth, PA). El TNF humano recombinante, la Pentraxina 3/TSG-14 humana recombinante y el MAb TSG-6 humano/de ratón (MAB2104) eran de R&D Systems (Minneapolis, MN). El anticuerpo policlonal ITIH1 anti-humano de ratón contra ITIH1 de longitud completa y el anticuerpo policlonal ITIH2 antihumano de conejo contra los aminoácidos 124-321 eran de Abcam Inc. (Cambridge, AM). El reactivo de transfección HiPerFect y el kit de aislamiento de ARN RNeasy Mini eran de QIAGEN (Valencia, CA). Los oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeños (ARNip) para direccionar la PTX3 humana endógena (ACACUUGAGACUAAUGAAAGAGAGA) y los oligonucleótidos de control de ARNsi no direccionado (ARN mezclado) ARNsi eran de OriGene Technologies, Inc (Rockville, MD). El reactivo de quimioluminiscencia Western Lighting™ era de PerkinElmer, Inc. (Waltham, AM). La ultracentrífuga (modelo LM8, rotor SW41) era de Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA).
2. Cultivos celulares y superposición de agarosa
El tejido humano se manipuló de acuerdo con la Declaración de Helsinki. La placenta humana fresca se obtuvo de madres sanas después de un parto por cesárea electiva en el Baptist Hospital (Miami, FL) mediante una aprobación (número de protocolo 03-028) de la Baptist Health South Florida Institutional Review Board. Se aislaron células estromales y epiteliales de AM humana primaria (designadas como AMEC y AMSC, respectivamente) de placenta fresca como se describió previamente (Chen et al. (2007) Stem Cells. 25:1995-2005; Li et al. (2008) J. Cell. Physiol.215:657-664) y se cultivaron en medio epitelial hormonal suplementario (SHEM, que consistía en DMEM/F12 (1:1, v/v), 5% (v/v) FBS, 0.5% (v/v) dimetilsulfóxido, 2 ng/ml de EGF, 5 pg/ml de insulina, 5 pg/ml de transferrina, 5 ng/ml de selenito de sodio, 0.5 pg/ml de hidrocortisona, 0.1 nM de toxina del cólera, 50 pg/ml de gentamicina, 1.25 pg/ml de anfotericina B) (Chen et al. (2007) Stem Cells 25:1995-2005; Chen et al. (2011) Tissue Eng Part C Methods 17:537-548) bajo una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37°C. El medio de cultivo se cambió cada 2 días. Las células con una confluencia del 80% se cambiaron a DMEM/F12 que contenía FBS al 0.5% durante 48 h para dejar que las células se volvieran quiescentes y luego se trataron con 20 ng/ml de TNF o 20 ng/ml de IL-1 p durante 4 o 24 horas antes de someterlas a RT-PCR y análisis de transferencia Western. Para el cultivo de superposición de agarosa, AMEC, AMSC y HSF se siembran en placas de 12 pocilios (1x105 células/pocillo) y de 6 pocilios (2x105 células/pocillo) a una densidad de 2x104/cm2 en SHEM. El medio se cambia el Día 1 a SHEm libre de suero que contiene un reemplazo de suero KnockOut al 5% y ácido 2-fosfo-L-ascórbico 1 mM y se incuban durante otros 2 días. Después de la eliminación del medio, se aplicó una capa de agarosa al 3% (tipo de bajo punto de fusión, Tipo VII, Sigma, A9045) en DMEM/F12 con ácido 2-fosfo-L-ascórbico 1 mM a 1 ml o 0.5 ml para lograr una capa de gel de 1 mm de espesor a temperatura ambiente durante 5-10 minutos antes de agregar 3 ml o 1.5 ml de medio SHEM libre de suero con o sin 5 ng/ml de TNF por placa de 6 o 12 pocillos, respectivamente. Las células se recolectaron sin cambios de medio intervinientes en los días 5.
3. Transfección de ARNip
Se cultivaron AMEC y AMSC en SHEM en placas de seis pocillos hasta una confluencia del 80%. Las células se cambiaron a DMEM/F12 con FBS al 0.5% durante 48 horas y se transfectaron con el reactivo de transfección de ARNip PepMute™ con ARNip de PTX3100 nM o ARN mezclado (sc). Después de 48 h, las células se recolectaron y se sometieron a RT-PCR y análisis de transferencia Western.
4. Purificación del complejo HC-HA de AM y cultivos libres de suero mediante ultracentrifugación
El complejo HC-HA se purificó a partir de AM y cultivos celulares como se describió anteriormente (He et al. (2009) J. Biol Chem. 284:20136-20146; Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247- 5257; He et al. (2008) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49:4468-447532). En resumen, la AM humana criopreservada, obtenida de Bio-tissue, Inc. (Miami, FL), se cortó en trozos pequeños, se congeló en nitrógeno líquido y se molió hasta obtener un polvo fino mediante un BioPulverizer. El polvo se mezcló con regulador de solución salina regulada con fosfato (PBS) frío a 1:1 (g/ml). La mezcla se mantuvo a 4°C durante 1 h con agitación suave y luego se centrifugó a 48,000 g durante 30 min a 4°C. El sobrenadante (designado como extracto de AM) se mezcló luego con una solución de guanidina HCl/PBS 8 M (en una relación 1:1 de v/v) que contenía EDTA 10 mM, ácido aminocaproico 10 mM, N-etilmaleimida 10 mM y 2 mM PMSF y se ajustó a una densidad de 1.35 g/ml (extracto de AM) o 1.40 g/ml (extracto celular) con cloruro de cesio, respectivamente, y se sometieron a centrifugación isopícnica a 35,000 rpm, 15°C, durante 48 h. Los gradientes de densidad resultantes se fraccionaron en 12 tubos (1 ml/tubo), en los que se midieron los contenidos de HA y proteínas utilizando el kit de prueba HA Quantitative y el kit BCA Protein Assay, respectivamente. Las fracciones de la primera ultracentrifugación, que contenían la mayor parte de HA, se combinaron, se llevaron a una densidad de 1.40 g/ml mediante la adición de CsCl, se ultracentrifugaron y se fraccionaron de la misma manera que se describió anteriormente. Las fracciones de la segunda ultracentrifugación, que contenían HA pero no proteínas detectables, se agruparon y continuaron hasta la tercera y cuarta ultracentrifugación en una densidad de 1.42 g/ml mediante la adición de CsCl. Las fracciones de la segunda y cuarta ultracentrifugación se dializaron en agua destilada y luego se precipitaron dos veces con 3 volúmenes de etanol al 95% (v/v) que contenía acetato de potasio al 1.3% (p/v) a 0°C durante 1 h. Después de la centrifugación a 15,000 g, el sedimento se secó brevemente al aire, se almacenó a -80°C y se designó como AM 2do HC-HA y 4to HC-HA, respectivamente.
5. Inmunotinción
La membrana fetal humana que contiene AM y sección de corion, así como cultivos celulares con o sin sobreposición de agarosa, se fijaron con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.2% (v/v) en PBS durante 20 min. Después de bloquear con albúmina de suero bovino al 0.2% (p/v) en PBS durante 1 h, las secciones se incubaron con HABP biotinilado (para HA, 5 pg/ml), anticuerpos anti-PTX3, anti-HCl o anti-HC2 (todos diluidos 1:200 en solución bloqueadora) durante la noche en una cámara de humedad a 4°C. Después de lavar con PBS, se incubaron con estreptavidina Alexa Fluor 488 (para HA, diluida 1:100) o los respectivos anticuerpos secundarios (es decir, Alexa Fluor 488 anti-IgG de ratón o Alexa Fluor 555 anti-IgG de rata conjugada). durante 1 h a temperatura ambiente. Se utilizaron como control anticuerpos IgG inespecíficos emparejados por isotipo. Alternativamente, las secciones se trataron con 50 U/ml de Streptomyces HAasa a 37°C durante 4 h antes de la fijación. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 y las imágenes se obtuvieron usando un microscopio de barrido láser confocal Zeiss LSM700 (Zeiss, Alemania).
6. PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de cultivos celulares utilizando el kit de aislamiento RNeasy Mini RNA. El ADNc se transcribió en forma reversa a partir de 1 pg de ARN total utilizando un kit de síntesis de ADNc de primera cadena de AMW clonado con cebador oligo (dT). Los ADNc de primera cadena se amplificaron mediante qPCR usando AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix y los cebadores PTX3 específicos (46-48). Se usó la expresión del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para normalizar las cantidades de los productos amplificados.
7. Transferencia Western
Se recolectaron los sobrenadantes del cultivo y se obtuvieron los lisados celulares lavando las células seis veces con PBS frío seguido de incubación en regulador RIPA a 4°C durante 1 h con agitación suave y centrifugación a 14,000 g durante 30 min a 4°C. Las concentraciones de proteínas en los sobrenadantes de cultivos y los lisados celulares se cuantificaron con un kit de ensayo de proteínas BCA. Las muestras se incubaron en NaOH 50 mM durante 1 h a 25°C o se disolvieron en regulador de acetato de sodio 0.1 M (pH 6.0) y se incubaron a 60°C durante 1 h con o sin 20 unidades/ml de Streptomyces HAasa A continuación, se resolvieron mediante SDS-PAGE en geles listos para acrilamida en gradiente al 4-15% (p/v) bajo condiciones de desnaturalización y reducción y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, la membrana se bloqueó con leche libre de grasa al 5% (p/v) en Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, regulador que contenía NaCl 150 mM y Tween-20 al 0.05% (v/v) seguido de incubación secuencial con diferentes anticuerpos primarios seguidos de sus respectivos anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron mediante el reactivo de quimioluminiscencia Western Lighting™.
Resultados
Tinción PTX3 positiva en el epitelio de AM y el estroma compacto
La tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-PTX3 humano se realizó en secciones transversales de membrana fetal humana fresca, que consistía en una capa de epitelio y un estroma avascular, que se puede subdividir en una capa compacta y una capa esponjosa, y el corion rico en células subyacentes (Figura 33, fase). Se encontró tinción PTX3 positiva en la superficie apical del epitelio y el estroma compacto. Por el contrario, la tinción de PTX3 se atenuó notablemente en el estroma esponjoso y el corion (Figura 33, pTX3). La digestión con HAasa no potenció la tinción de PTX3 en este último, lo que sugiere que la tinción de PTX3 débil en estas dos áreas no se debió al efecto de enmascaramiento. Se encontró una fuerte tinción positiva de HA en el estroma AM y una tinción relativamente débil en el epitelio AM utilizando un HABP biotinilado (Figura 33, HA), mientras que se observó una tinción débil de HA en la capa superior del corion subyacente al estroma AM pero fuerte tinción en la capa inferior del corion. Esta tinción desapareció cuando la sección de tejido fue predigerida por HAasa (Figura 33, HA (+HAasa)), lo que sugiere que la tinción de HA era específica. La inmunotinción de las HC individuales también reveló una tinción positiva en el epitelio AM, las células y la matriz estromales y el corion (Figura 33, HC1 y HC2). Estos resultados sugirieron la presencia de PTX3 en AM predominantemente en el estroma compacto y el epitelio. Presencia de PTX3 en el extracto soluble de AM y el complejo HC-HA purificado
Para investigar adicionalmente la presencia de PTX3 en AM, primero se realizó análisis de transferencia Western del extracto de AM obtenido por un regulador de sal isotónica antes y después del tratamiento con NaOH 50 mM para escindir los enlaces éster. La PTX3 recombinante apareció como especies de 45 kDa, 90 kDa, 180 kDa y HMW (Figura 34, carril 2). El extracto soluble de AM reveló 45 kDa y una especie de HMW en el fondo del pocillo de carga (en su mayoría sin entrar en el gel) (Figura 34, carril 3). El tratamiento con NaOH no afectó a las especies de 45 kDa, pero eliminó por completo las especies de HMW, dando como resultado una mancha de HMW de PTX3 (Figura 34, carril 4). Estos resultados sugirieron que PTX3 estaba presente como un monómero y un complejo HMW en el AME. Debido a que este último podría disociarse en una mancha de HMW por NaOH que puede escindir el enlace covalente de éster entre HC-HA, las especies que contienen HMW PTX3 en el pocillo de carga podrían estar asociadas con HC-HA.
Para confirmar además si PTX3 estaba asociado con el complejo AM HC-HA, se purificó el complejo HC-HA mediante dos y cuatro ultracentrifugaciones sucesivas del extracto soluble de AM como se informó anteriormente (He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:20136-20146.; Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444) y se realizaron análisis de transferencia Western con o sin digestión con HAasa. En contraste con el monómero encontrado en AME soluble, se mostró una especie de 90 kDa correspondiente al tamaño del dímero de PTX3 nativo en el complejo AM 2 y 4 HC-HA además de una banda de HMW en la parte inferior del pocillo de carga (Figura 34, carriles 5 y 7). Además, también se observó una mancha de HMW débil en el segundo complejo HC-HA y fuerte en el cuarto complejo HC-HA. Después del tratamiento con HAasa, el dímero de 90 kDa permaneció en ambos complejos HC-HA, pero la mancha de HMW se intensificó en el 4° HC-HA y aumentó en el 2° HC-HA con la desaparición de la banda de HMW en la parte superior del gel (Figura 34, carriles 6 y 8) similar a los resultados observados en AME. Se descubrió que la existencia de dímero PTX3 de 90 kDa en el complejo HC-HA con o sin HAasa era causada por la disociación de HC-HA causada por 2-ME ya que la eliminación de 2-ME dio como resultado la ausencia de esta especie de 90 kDa (no se muestra). Estos resultados sugirieron que el complejo HC-HA contenía PTX3 que se unió a HC-HA para formar el complejo HC-HA/PTX3 a pesar de cuatro veces de ultracentrifugación.
El análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-HCl mostró la presencia de complejo HC-HA como una especie HMW en el fondo del pocillo de carga que desapareció tras la digestión con HAasa (Figura 34, carriles 10­ 13), y la presencia de HC1 en el complejo HC-HA que se liberó del complejo HC-HA después de la digestión con HAasa (Figura 34, carriles 11 y 13). No se detectó HC2 ni TSG-6 (no se muestra). Estos resultados confirmaron colectivamente que HC-HA purificado a partir de AM solo contenía HC1. También se notó una diferencia principal entre el 2° y el 4° complejo HC-HA, es decir, se detectó una banda libre de HC1 de 80 kDa solo en el 2do complejo HC-HA (Figura 34, carril 11), pero no el 4to complejo HC-HA, lo que sugiere que este último no contenía HC1 libre. La presencia de HA en el 4° HC-HA se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa para que se mostrara como una mancha de HA continua desde el pocillo de carga superior hasta la parte inferior del gel, y que tal mancha se resolvió mediante digestión con HAasa.
Expresión de ARNm y proteína de PTX3 por AMEC y AMSC
Luego se determinó que PTX3 se sintetizó mediante cultivos de células estromales y epiteliales de AM. Se cultivaron estas células como se informó (Chen et al. (2007) Stem Cells 25 (8): 1995-2005; Li et al. (2008) J Cell Physiol. 215 (3): 657-64; Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem.287:12433-12444) y extrajo ARN total para RT-pCr y proteínas para análisis de transferencia Western, y las comparó con fibroblastos de piel humana (HCF), que se informó que expresan solo ARNm y proteína de PTX3 bajo la estimulación de citoquinas proinflamatorias tal como TNF e IL-1. Como era de esperar, los resultados de la qRT-PCR mostraron que la expresión del transcrito de PTX3 era baja en el HSF en reposo, pero sobrerregulada por TNF e IL-1p (Figura 35A). Aunque la expresión de la transcripción de PTX3 en AMEc y AMSC en reposo también fue baja, fue dramáticamente elevada por TNF o IL-1p (Figura 35A). El análisis de transferencia Western confirmó que la proteína PTX3 era baja en lisados (45 kDa) e indetectable en medio en HSF en reposo (Figura 35B, carril 2) pero se detectó en lisados pero no en medio después de la adición de TNF o IL-1 p durante 24 h. Por el contrario, la proteína PTX3 era detectable en AMEC en reposo y aumentaba notablemente por TNF o IL-1b tanto en lisados 45 kDa) como en medios (45 kDa y 90 kDa) (Figura 35B, carriles 5, 6 y 7), con TNF siendo más eficaz que IL-1b. El mismo hallazgo se observó en AMSC (Figura 34B, carriles 8, 9 y 10). Para verificar que las bandas de 75 kDa y 135 kDa en los lisados y la banda de 50 kDa en los medios de todas las células eran inespecíficas porque estas bandas no cambiaban bajo TNF o IL-1b, se realizó transfección de ARNip de PTX3 y de hecho se subreguló la especie de 45 kDa en lisis y especies de 45 kDa y 90 kDa pero no estas bandas inespecíficas. (Figura 35C). Estos resultados sugirieron colectivamente que PTX3 de hecho fue sintetizada y secretada por células de AM en reposo y fue sobrerregulada adicionalmente por estímulos proinflamatorios.
Producción de complejo HC-HA/PTX3 por células estromales de AM
Estudios previos han demostrado que el complejo HC-HA (es decir, SHAP-HA) puede aislarse de la capa celular de fibroblastos dérmicos de ratón cultivados en un medio suplementado con FBS, y que e1HC-HA aislado contiene tanto HC1 como HC2 de IaI derivado de FBS (Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247-5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725-26730). Sin embargo, se informa que las células AM producen HC-HA mediante el uso de su IaI generado endógenamente (Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433-12444). Debido a que las células AM sintetizaron la proteína PTX3, que fue aumentada adicionalmente por TNF e IL-1, el objetivo del inventor fue determinar si producían HC-HA que también contenía PTX3. Se usó HSF como control, que expresaba PTX3 solo bajo estímulos proinflamatorios, por ejemplo, TNF e IL-1, en una condición que contiene suero (Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247-5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725-26730) (Figura 35) y en comparación con las AMEC y las AMSC cultivadas tanto en estado libre de suero como en estado que contiene suero con o sin TNF. También se superpuso agarosa al 3% sobre monocapas de células porque se ha descubierto que este método atrapa el procolágeno secretado en o cerca de la superficie celular, en lugar de en el medio en cultivos de queratocitos (Hassell et al. (2008) Experimental Eye Resarch.87:604- 611; Etheredge et al. (2010) Matrix Boil.29:519-524). Después de 5 días de superposición, HSF, AMSC y AMEC se hicieron más compactos, especialmente en la condición que contenía suero (Figura 36). La morfología epitelial se volvió más distinta en AMEC.
A continuación, se determinó si la superposición de agarosa al 3% también era eficaz para atrapar e1HA secretado midiendo la concentración de HA en los medios de cultivo mediante un ensayo ELISA de HA. Sin la capa de agarosa, el nivel de HA fue fácilmente detectable en el medio libre de suero tanto de AMSC como de AMEC, pero no en el de HSF. El TNF aumentó significativamente el nivel de HA de los tres cultivos celulares (Figura 37). El patrón anterior se promovió adicionalmente en el medio que contiene suero. La superposición de agarosa reduce el nivel de HA más del 50% bajo condiciones tanto libre de suero como con suero entre los tres cultivos. Estos resultados sugirieron que la superposición de agarosa de hecho redujo el nivel de HA en el medio de cultivo.
Para determinar cuándo el HA secretado estaba realmente atrapado en la matriz extracelular después de la superposición de agarosa, se realizó doble inmunotinción para PTX3/HA, HC1/HA y HC1/PTX3 con HABP marcado con biotina, anticuerpo específico para HC1 y HC2, y dos anticuerpos anti-PTX3, es decir, MNB4 y pAb marcado con biotina, respectivamente. En la condición libre de suero, se observó tinción HA positiva en la región pericelular en HSF, mientras que la tinción PTX3 fue negativa (Figura 38A). Con la estimulación con TNF, se observó tinción positiva de PTX3 en el citoplasma (Figura 38B), lo que confirma la expresión inducible de PTX3 por TNF en HSF. El TNF no aumentó mucho la intensidad de la tinción de HA pero indujo una estructura como la de un cable (Figura 38G) similar a lo que se ha informado en células epiteliales tubulares proximales renales cultivadas (Selbi et al. (2006) Kidney International. 70:1287-1295). No se observó colocalización de PTX3 con HA, lo que sugiere que PTX3 no se asoció con HA en HSF después de la estimulación con TNF. Por el contrario, se detectó tinción de hA positiva en AMSC en reposo como una red fibrilar sobre la superficie celular y la matriz extracelular colocalizada con HA en la matriz extracelular (Figura 38C y 6K). El TNF aumentó adicionalmente la intensidad de la tinción de PTX3 y la cantidad de fibrillas de HA (Fig. 38D y 38k ).
En AMEC en reposo, también se encontró tinción de HA positiva en espacios extracelulares con alguna apariencia fibrilar pero solo en áreas esporádicas donde las células no eran tan compactas (Fig. 38E y 38L). También se observó colocalización de PTX3 y HA en AMEC. El tratamiento con TNF aumentó adicionalmente la intensidad de la tinción de PTX3 y la cantidad de fibrillas de HA (Figura 38F). Estos resultados confirmaron además que PTX3 fue expresada constitutivamente por AMSC y AMEC, y su expresión puede incrementarse adicionalmente por TNF. Se observó tinción de HC1 positiva débil sólo en algunos HSF con (Fig. 38G y 38J) o sin tratamiento con TNF (no mostrado), y se colocalizó con HA especialmente en una estructura como la de un cable de HA (Fig. 38G). Sin embargo, no se notó colocalización entre HC1 y PTX3 (Figura 38J). En contraste, se observó una fuerte tinción positiva con HC1 en AMSC y se colocalizó con hA en la membrana celular (Figura 38H) y se colocalizó con PTX3 en el citoplasma (Figura 38K). AMEC también mostró una fuerte tinción positiva con HC1 y colocalización con HA en la membrana celular (Figura 38I) y con PTX3 en el citoplasma y la membrana celular (Figura 38L). En conjunto, estos resultados sugirieron que la matriz rica en HA estaba atrapada de manera efectiva por la capa de agarosa en AMSC, AMEC y HSF, y contenía tanto HC1 como PTX3 solo en AMSC y AMEC en la condición libre de suero, lo que confirma además que tal complejo HC-HA/PTX3 fue sintetizado por IaI endógeno.
Para confirmar además la formación del complejo HC-HA/PTX3 bajo una capa de agarosa, se extrajo la capa celular con GnHCl 6 M y se realizó análisis de transferencia Western en cultivos AMSC y HSF bajo condiciones tanto libre de suero como con suero con o sin tratamiento con NaOH. HSF libre de suero mostró una especie de 170 kDa y una de 140 kDa pero no una especie de 45 kDa correspondiente al control PTX3 con o sin estimulación con TNF y tratamiento con NaOH, lo que sugiere que estas dos bandas no eran específicas (Figura 38D, carril 2-5). HSF que contenía suero con TNF mostró una especie de 140 kDa tenue y algunas especies de MW pequeño similares a las observadas en HSF libre de suero (Figura 39, carriles 11 y l2). En contraste, AMSC libre de suero mostró una mancha de PTX3 de HMW débil, una especie de 90 kDa y una de 45 kDa (Figura 39, carril 6), de los cuales los dos últimos correspondieron al dímero y monómero de PTX3, respectivamente (Figura 39, carril 2). Estos resultados fueron similares a los observados en AME (Figura 34). También se observaron las mismas especies inespecíficas de 170 kDa y algunas especies moleculares pequeñas que se observaron en HSF libre de suero. El tratamiento con NaOH aumentó la mancha de PTX3 de h Mw pero no afectó al monómero y dímero de PTX3 (Figura 39, carril 7) y otras especies. El TNF aumentó la mancha de PTX3 de HMW, el dimmer y el monómero de PTX3 así como otras especies (Figura 39, carriles 8 y 9). AMSC que contenía suero con TNF mostró una fuerte mancha de HMW PTX3, dímero de PTX3 de 90 kDa y monómero de PTX3 de 45 kDa (Figura 39, carril 13). El tratamiento con NaOH aumentó en gran medida la mancha de HMW PTX3 y dos especies a 60 kDa y 50 kDa (Figura 39, carril 14). Debido a que el NaOH rompe el éster unido entre HC y HA conduciendo a la disolución de HC-HA, estos resultados sugirieron que HMW PTX3 se liberó del complejo HC-HA. En conjunto, los resultados anteriores sugirieron que AMSC, pero no HSF, producía un complejo HC-HA que contenía PTX3.
Reconstitución in vitro del complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3)
Para confirmar además cómo podría generarse el complejo HC-HA/PTX3, nos gustaría reconstituir el complejo HC-HA/PTX3 in vitro con HA, TSG-6, IaI y PTX3. Primero inmovilizamos HA sobre plástico y agregamos con éxito TSG-6 recombinante, IaI purificado o suero como fuente de IaI. Se ha informado que TSG-6 puede formar un complejo estable de TSG-6/hA al unirse a HA que está inmovilizado sobre una superficie sólida (Wisniewski et al. (2005) J Biol Chem. 280:14476-84), y que ambos TSG-6 libre como unido a HA puede transferir HC de IaI a HA inmovilizado para formar HC-HA (Colon (2009) J Biol Chem. 284:2320-31). La transferencia Western usando un anticuerpo anti-IaI no detectó ninguna especie en el iHA de control solo como se esperaba (Figura 40A, carril 2). Cuando IaI y TSG-6 se agregaron simultáneamente a iHA, se detectaron una IaI débil de 220 kDa, HC2 de 85 kDa, una HC1 fuerte de ~80 kDa y una especie de 50 kDa (Figura 40A, carril 3), lo que sugiere que tanto HC1 como HC2 se transfirieron a iHA en presencia de TSG-6 para formar HC-HA. La comparación de la intensidad de la banda de HC1 con la de HC2 sugirió que se transfirió más HC1 a iHA que HC2 por TSG-6, dando como resultado una especie de 50 kDa truncada. Cuando PTX3 fueron simultáneamente con IaI y TSG-6 a iHA, la intensidad de las especies de IaI disminuyó, pero la intensidad de HC1 aumentó de una manera dependiente de la dosis de PTX3 (Figura 40A, carriles 4-6), mientras que la HC2 no fue detectable, lo que sugiere que PTX3 promovió preferentemente la transferencia de HC1, pero no de HC2 a HA inmovilizada catalizada por TSG-6. Cuando se agregaron PTX3 después de la adición simultánea de IaI y TSG-6, se detectó HC1, pero no IaI o HC2, y la intensidad de HC1 también se incrementó de una manera dependiente de la dosis de PTX3 (Figura 40A, carriles 7-9), lo que confirma que PTX3 promovió la transferencia de HC1 pero no de HC2 a HA inmovilizada. Estos resultados sugirieron que PTX3 promovió de manera única la transferencia de manerta predominante HC1 a HA inmovilizado para formar el complejo HC1-HA independientemente de si fue simultánea o secuencial. La transferencia Western usando el anticuerpo anti-TSG-6 mostró que tanto el monómero TSG-6 de 35 kDa como el dímero de 75 kDa se detectaron en rcHC-HA formado por la adición simultánea o secuencial de PTX3 en medio de IaI y TSG-6 en iHA. Debido a que la intensidad de la banda de TSG-6 disminuyó en un PTX3 dependiente de la dosis, lo que sugiere que el TSG-6 unido a HA inmovilizado podría competir con PTX3 (Figura 40B). La transferencia Western usando el anticuerpo anti-PTX3 mostró una mancha de PTX3 HMW prominente en el pocillo de carga con bandas débiles de tetrámero y dímero cuando se agregó PTX3 simultáneamente con IaI y TSG-6, y su intensidad aumentó de una manera dependiente de la dosis de PTX3 (Figura 40C, carriles 4-6). Este hallazgo sugirió que PTX3 estaba preferencial y fuertemente unida al complejo rcHC-HA en el que la unión era resistente al lavado con GnHCl 8 M. Por el contrario, cuando se añadió PTX3 secuencialmente después de la adición de IaI y TSG-6, no se detectó HMW PTX3 ni especies de tetrámero y dímero (Figura 40C, carriles 7-9), lo que sugiere que la unión entre PTX3 y rcHC-HA preformado PTX3 no fue fuerte para resistir un lavado con GnHCl 8 M. Por lo tanto, estos experimentos de reconstitución in vitro sugirieron que PTX3 debe haberse producido simultáneamente con HA, IaI y TSG-6 in vivo para permitir la formación de HC-HA/PTX3. Esta interpretación fue apoyada por la inmunocolocalización de HA, HC y PTX3 en secciones de tejido in vivo, así como la matriz extracelular formada por AMSC.
Ejemplo 33: Efectos de los complejos HC-HA sobre la señalización de TGFp1
La HC-HA inmovilizada inhibe la señalización de TGFp1 subregulando la expresión de TGF-p1 pero sobrerregulando la señalización de TGF-p3. Tal inhibición de la señalización de TGFpl puede resistir la exposición mediante la adición de suero o TGF-p1 exógeno debido a la supresión adicional de TGFpRIl y TGFpRIII. En consecuencia, el HC-HA inmovilizado evita que los fibroblastos corneales se diferencien por miofibroblastos al inhibir la señalización de SMAD2/3 y la expresión de la formación de músculo liso alfa. Esta acción también es lo suficientemente potente como para convertir los fibroblastos corneales en queratocitos. HC-HA (Insoluble (I)) se diferencia de HC-HA (Soluble (S)) en que coniste en pequeñas proteínas adicionales ricas en leucina (SLRP) y activa la expresión de la señalización de TGFpl y BMP sobrerregulando la expresión de BMP y sus receptores, por lo tanto, activando pSMAD1/5/8, que juntos promueven además la formación de agregación. Estas acciones pueden adicionalmente desdiferenciar los fibroblastos corneales en progenitores de la cresta neural.
En este ejemplo, se examinó el efecto de HC-HA soluble e insoluble inmovilizado sobre la señalización de TGF-p en fibroblastos de córnea humanos con o sin exposición exógena de TGFpl. Además, se probó el efecto de los complejos HC-HA sobre la señalización de SMAD2/3 y la supresión de la expresión de aSMA.
Los estudios experimentales y clínicos apoyan una acción terapéutica anti-cicatrices mediante membrana amniótica (AM) criopreservada. Nuestros estudios demostraron que el complejo de cadena pesada-hialuronano (HC-HA) se produce de forma única y se puede purificar a partir de AM y suprime la actividad promotora de TGF-p1 en fibroblastos corneales humanos. No está claro si HC-HA suprime la expresión de ARNm y proteínas de TGF-p1 y promueve la expresión de proteínas y ARNm de TGF-p3 que se sabe que contrarrestan la señalización de TGF-p1 y, de ser así, si tal inhibición de la señalización de TGFp por HC-HA se traduce en supresión de la translocación nuclear de pSMAD2/3.
Los queratocitos de ratón pueden mantener un estado indiferenciado (que expresan queratocán) en DMEM/ITS libre de suero sobre plástico o en DMEM/FBS al 10% si se cultivan en AM. El tratamiento de queratocitos en DMEM/ITS libre suero con suero al 10% o TGF-p1 10 ng/ml induce la fosforilación y localización nuclear de Smad2/3 (3 h) y la expresión de a-SMA (5 días). Se suprime la activación de Smad2/3 y a-SMA en queratocitos en AM con suero o tratamiento con TGF-p1 (Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280 (29): 27085-92). Nuestros estudios demostraron que HC-HA suprime la actividad promotora de TGF-p1 en fibroblastos corneales humanos. Se esperaba que la señalización de pSmad2/3 y la formación de a-SMA fueran suprimidas por HC-HA.
Se sembraron fibroblastos corneales humanos (o células de nicho limbal, p3) en discos de plástico con o sin HA inmovilizado, HC-HA soluble (PBS) (2X o 4X) o Hc-HA insoluble (GnHCl) (2X o 4X) durante 48 h como se describió anteriormente. A continuación, las células se trataron con o sin TGFpl durante 24 h antes de recolectarse para la cuantificación del ARNm y la determinación de la señalización de SMAD2/3. Para la determinación de la proteína de los receptores de TGFp, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h antes de la recolección de muestras de proteína para dejar tiempo para la expresión de la proteína del ARNm expresado. Para el ELISA de TGF-p1, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 24 h, y luego se cultivaron en medio fresco durante 24 (y 48) h. Los sobrenadantes se recolectaron para ELISA de TGF-p1. Para el ELISA de TGF-p2 y TGF-p3, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h. Los sobrenadantes se recolectaron para ELISA de TGF-p2 y TGF-p3. Se tomaron imágenes de contraste de fase hasta 72 h para diversos cultivos.
Se realizaron los siguientes experimentos:
1. Semicuantificación de ARNm para TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3 y sus receptores mediante PCR en tiempo real: se utiliza para la estimación de la expresión del transcrito de ARNm de la familia TGF-p y sus receptores. El perfil de RT-PCR en tiempo real consistió en 10 minutos de activación inicial a 95°C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización de 15 segundos a 95°C y 1 minuto de hibridación y extensión a 60°C.
2. Determinación de la formación de músculo liso a y la señalización de SMAD2/3 mediante inmunotinción: realizada para monitorizar la formación de músculo liso a y la señalización de SMAD2/3 utilizando un procedimiento de inmunotinción estándar.
Los grupos experimentales para los experimentos 1 y 2 fueron:
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Figure imgf000098_0001
3. Cuantificación de TGFpR mediante transferencia Western: se utiliza para cuantificar la concentración de proteínas de TGFpRI, TGFpRIl y TGFpRMI utilizando sus correspondientes anticuerpos (R&D Systems). La secuencia de carga fue la siguiente:
Figure imgf000098_0002
4. ELISA para la cuantificación de TGFp en el medio: los kits de ELISA Quantikine Human TGF-p1 y TGF-p2 de R&D Systems y el kit de ELISA TGF-p3 de Norvus Biologicals son ELISA en fase sólida diseñados para medir TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p13 en sobrenadantes de cultivos celulares activados con ácido, suero, plasma y orina. Contienen TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3 humanos recombinantes y se ha demostrado que cuantifican con precisión los factores recombinantes. Los resultados obtenidos usando TGF-p1 natural, TGF-p2 TGF-p3 mostraron curvas lineales que eran paralelas a las curvas estándar obtenidas usando los estándares del kit recombinante. Estos kits se utilizaron para determinar TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3 en el medio. Los grupos experimentales para el experimento 4 fueron:
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Resultados
El HCF sembrado en DMEM/FBS al 10% formó agregados a las 72 h solo en HC-HA insoluble (Figura 41). Tal agregación persistió después de 24 h de privación de suero en medio DMEM/ITS (insulina/transferrina/selenio). A continuación, las células se cultivaron en tres medios de cultivo diferentes: A - DMEM/ITS durante 48 h; B -DMEM/ITS 24 h, DMEM 24 h/FBS al 10%; C-24 DMEM/ITS, 24 h DMEM/ITS con 10 ng/ml de TGF-p1. Las células cultivadas en HC-HA forman pequeños agregados en 4X HC-HA (Gn), pero no en otras condiciones de cultivo (Figura 41). Sin embargo, después de sembrar durante 2 horas en DMEM/FBS al 10% sobre sustratos inmovilizados, solo HCF en el control se adhirió bien. Las células en HA, HC-HA [HC-HA (4X, PBS) y 4X, GnHCl] estaban todas redondeadas, lo que sugiere que no estaban bien unidas. Después de la incubación durante 72 horas, todas las células se unieron bien, sin embargo, había muchas menos células en los HC-HA inmovilizados. El número de células en estos sustratos fue mayor en HC-HA (4X, PBS) que en HC-HA (4X, GnHCl). HCF comenzó a formar agregados en HC-HA (Gn) después de 24 h de cultivo y se condensó a agregados más grandes después de 72 h de cultivo. Después de la estimulación de TGFpl, se observó agregación de HCF cultivado en HC-HA (4X, PBS; 4X, Gn).
En resumen, HC-HA (Gn) promueve la agregación de HCF con/sin exposición de TGFpl mientras que HC-HA (PBS) promueve la agregación de HCF bajo exposición de TGFpl. Se desconoce la importancia de la agregación.
En DMEM/ITS, la expresión de los transcritos de TGFpl y TGFp3 fue elevada por HC-HA (Gn), pero el transcrito de TGFp3 fue elevado por HC-HA (PBS) (Figura 42). Como se esperaba en la autoinducción, el ARNm de TGFpl y TGFp3 aumentaron 4 y 2 veces, respectivamente, en HCF cultivado en plástico por desafío con TGFpl, con el correspondiente aumento de la proteína TGFpl de 60 pg/ml a 105 pg/ml (no se detectó proteína TGFp3 en el experimento debido a un error experimental). Bajo condiciones libres de suero, 4X HC-HA soluble redujo la expresión de la proteína TGFpl. HC-HA insoluble también disminuyó el TGFpl secretado a pesar de su promoción de la expresión de ARNm de TGFpl, aunque todavía más alto que el control cultivado en DMEM/ITS. Además, se observó una notable supresión de TGFpRIl y TGFpRIII por HC-HA soluble e insoluble. En consecuencia, la señalización de TGFp autocrina se suprimió en HCF cultivado en HC-HA soluble o insoluble, pero la señalización de TGFp paracrina se conserva en HCF cultivado en HC-HA insoluble. Además, tanto la 4X HC-HA soluble como la insoluble sobrerregularon la expresión de ARNm de TGFp3 en 3 veces bajo condiciones libres de suero sin estimulación de TGFpl, que se sabe que contrarresta la señalización de TGF-p1. Bajo estimulación por TGFpl, la expresión de ARNm de TGFp3 aumenta en 5 y 8 veces cuando se cultivaron HCF en HC-HA soluble e insoluble respectivamente, lo que indica que HC-HA soluble e insoluble promueve fuertemente la expresión del transcrito de TGFp3. Estos resultados también indican que el HC-HA purificado de AM promueve la acción anti-cicatrización de AM no solo suprimiendo la señalización de TGFp1 sino también por una marcada sobrerregulación de la expresión de TGFP3. A partir de nuestros resultados, parece que HC-HA (PBS y Gn) no afecta la expresión de TGFp2 tanto a niveles de ARNm como de proteína. En resumen, HC-HA (PBS) inhibe TGFpl, pero activa la señalización de TGFp3 en HCF expuesto con TGFpl mientras que HC-HA (Gn) activa tanto la señalización de TGFpl como de TGFp3. En el control de plástico, el ARNm de TGFpRIl se sobrerreguló 8 veces bajo la exposición a TGFp (Figura 43). El ARNm de los receptores de TGFplI y TGFplII fue sobrerregulado por HC-HA (PBS y Gn) de 2 a 8 veces respectivamente en condición libre de suero, pero se inhibió completamente bajo la exposición a TGFpl. El mismo resultado se observa también para HA. La expresión de proteína correspondiente de TGFpRIl y TGFpRIII fue subregulada por 3 y 3, y 2 y 3 veces respectivamente cuando los HCF cultivados en HC-HA (PBS y Gn respectivamente) fueron expuestos por TGFp. Bajo esta situación, la expresión de estas proteínas no fue modificada por HA. Tal subregulación puede explicar parcialmente el mecanismo del efecto antiinflamatorio y anti-cicatrizante por AM. En resumen, la expresión de ARNm de TGFpR2 y TGFpR3 aumentó cuando se cultivaron HCF en HA y HC-HA (PBS y Gn).
La inmunotinción indicó que HC-HA (PBS y Gn) inhibió la translocación nuclear de pSMAD2/3 en DMEM/ITS con y sin exposición de TGFpl (Figura 44). Tal efecto fue más evidente con TGFp. Este hallazgo confirmó además que la supresión de TGFpl, TGFpRII y TGFpRIII se tradujo en supresión de la señalización mediada por SMAD.
Además, los resultados de la inmunotinción indican que tanto los HC-HA solubles como los insolubles inhibieron la formación de a-SMA después de la exposición a TGFpl, lo que respalda además que tal inhibición de la señalización de TGF-p1 por HC-HA soluble e insoluble inhibe la diferenciación de HCF en miofibroblasto con o sin adición de TGFp1 (Figura 45).
En resumen, HC-HA soluble subregula el TGF-p1 pero sobrerregula la expresión de TGF-p3, mientras que HC-HA insoluble sobrerregula tanto la expresión de TGF-p1 como de TGF-p3 en HCF bajo condiciones libres de suero y de exposición a TGFpl. Debido a que tanto el HC-HA soluble como el insoluble subregularon la expresión tanto de TGFpRII como de TGFpRIII, estos cambios dieron como resultado la inhibición de la señalización de TGFp como lo demuestra la falta de translocación nuclear de pSMAD2/3 y la supresión de la formación de músculo liso alfa.
Ejemplo 34: Efectos de los complejos HC-HA sobre la señalización de BMP
En este ejemplo, se examinó el efecto de HC-HA inmovilizado con TGF-p1 adicional sobre la señalización de BMP. También se determinó la activación de la señalización de BMP mediante la activación de pSMAD1/5/8.
Las BMP constituyen un subgrupo de la superfamilia de TGFp que incluye BMP1-3, BMP3b, BMP4-7, BMP8a, BMP8b, BMP9-15. BMP se une a los receptores de tipo II (ALK2, a Lk 3 o ALK6), que activa el receptor de tipo I para fosforilar a Smadl, Smad5 y Smad8, lo que da como resultado la translocación nuclear de pSmad1/5/8 (revisado en Massague 2000; Herpin, 2007). No estaba claro cuales BMP y receptores de BMP específicos están presentes en HCF y, de ser así, si la señalización de BMP puede ser activada por HC-HA (PBS y Gn) y TGFpl adicional cuando la señalización de TGFp es supresión y, de ser así, cuales formas de BMP y receptores de BMP juegan un papel importante en el control de la señalización de BMP y si dicha activación de la señalización de BMP es a través de pSMAD1/5/8.
Se sembraron fibroblastos de córnea humanos en plástico con o sin HA o HC-HA PBS (4X) o HC-HA Gn (4X) inmovilizados durante 48 h, y luego se trataron con o sin TGFpl durante 24 h para la cuantificación del ARNm y la determinación de pSMAD1/5/8 como se describe arriba. Para la determinación de la proteína de los receptores de BMP, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h antes de la recolección de muestras de proteína para permitir la expresión de la proteína. Para ELISA de BMP, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h. Los sobrenadantes se recolectaron para ELISA de BMP. Se tomaron imágenes de contraste de fase hasta 72 h para diversos cultivos.
Se realizaron los siguientes experimentos en los cultivos:
1. Semicuantificación de ARNm para BMP y sus receptores mediante PCR en tiempo real: se utiliza para estimar la expresión del transcrito de ARNm de la familia de BMP y sus receptores.
2. Determinación de la formación de músculo liso a y la señalización de SMAD1/5/8 mediante inmunotinción: realizada para controlar la formación de músculo liso a y la señalización de SMAD2/3 mediante inmunotinción. Los grupos experimentales para el experimento 1 y 2 son:
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3. Cuantificación de BMPR mediante transferencia Western utilizando anticuerpos BMPR1A, BMPR1B y BMPR2: se utiliza para cuantificar la concentración de proteínas de BMPR1A, BMPRlB y BMPR2, respectivamente. La secuencia de carga fue la siguiente:
Figure imgf000100_0002
4. ELISA para la cuantificación de las BMP en el medio: Se utilizaron kits de ELISA de BMP (R&D Systems) para determinar las BMP en el medio. Los grupos experimentales para el experimento 4 son:
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Resultados
Bajo estado de reposo, HA y tanto HC-HA (PBS) como HC-HA (Gn) activan la expresión de la transcripción de BMP6 en 7 y 4 veces, respectivamente (Figura 46). En presencia de TGFp1, HA y tanto HC-HA (PBS) como HC-HA (Gn) activan la expresión del transcrito de BMP4 en 6, 11 y 6 veces, y la expresión de ARNm de BMP6 en 30, 37 y 46 veces respectivamente en HCF, lo que indica que el HA y HC-HA soluble e insoluble pueden sobrerregular la expresión de BMP4/6, mientras que TGFp1 adicional sobrerregula drásticamente la señalización de BMP4 y BMP6. No se detectaron BMP7 y BMP9.
Si bien el TGFp1 en sí mismo no activó la expresión de la transcripción de BMPR1A, tanto HC-HA (PBS) como HC-HA (Gn), pero no HA, activaron la expresión de la transcripción de BMPR1A en 7 y 3 veces respectivamente en presencia de TGFp1, lo que indica que BMPR1A puede desempeñar un papel principal en la señalización de BMP activada por HC-HA TGFp1 (Figura 47). Además, TGFp1 activa BMPR1B 3 veces y BMPR23 veces, pero 4 veces en plástico con o sin HA y tanto HC-HA (PBS) como HC-HA (Gn), lo que indica que TGFp1 en sí misma no activa específicamente la expresión de ARNm de b Mp R1B y BMPR2. Hc-hA (PBS) o Hc-HA (Gn) potencia la expresión de la transcripción de BMPR2 a 4 veces. Se espera que BMP-BMPR1A active la señalización SMAD1/5/8 mientras que BMP-BMPRII activa la señalización no SMAD.
Los resultados de la inmunofluorescencia indican que el propio TGFp1 activa moderadamente la translocación nuclear de pSMAD1/5/8 en HCF a pesar del sustrato utilizado (Figura 48). HC-HA (PBS y Gn) facilita fuertemente la activación de la señalización de BMP4/6 a través de la translocación nuclear de pSMAD1/5/8, como se demuestra mediante más núcleos que tienen pSMAD 1/5/8 y una tinción nuclear mucho más fuerte de pSMAD1/5/8.
ID1 es una proteína de hélice-bucle-hélice (HLH) que puede formar heterodímeros con miembros de la familia HLH básica de factores de transcripción, un gen conocido corriente abajo regulado por la señalización SMAD1/5/8. Nuestros resultados demostraron que la activación de SMAD 1/5/8 dio como resultado una sobrerregulación de 4 y 8 veces del ARNm de ID1 cuando se cultivaron HCF en HC-HA (PBS) y HC-HA (Gn) respectivamente, lo que indica que la señalización de SMAD 1/5 de/8 en HCF es de hecho activada por HC-HA TGFp (Figura 49). Dado que ID1 no tiene actividad de unión al ADN y, por lo tanto, puede inhibir la capacidad de activación transcripcional y de unión al ADN de las proteínas HLH básicas con las que interactúa, se espera que ID1 desempeñe un papel importante en el crecimiento celular, la senescencia y la diferenciación.
Ejemplo 35: Efectos de los complejos HC-HA sobre la diferenciación de miofibroblastos y la reversión de fibroblastos corneales humanos a queratocitos o progenitores más jóvenes
Los queratocitos, una población única de células derivadas de la cresta neural incrustadas en el estroma corneal, expresan proteoglicanos que contienen queratán sulfato, incluido el queratocán específico de la córnea. El queratocán (Kera) es un proteoglicano de queratán sulfato específico de la córnea (KSPG) en el ojo de un vertebrado adulto. Pertenece a la familia de genes del pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP) y es uno de los componentes principales del KSPG extracelular en el estroma corneal de vertebrados. Los KSPG corneales desempeñan un papel fundamental en el ensamblaje de la matriz, que es responsable de la transparencia corneal. Lumican constituye aproximadamente la mitad del KSPG corneal. La mayor parte del queratán sulfato corneal restante modifica el queratocán. En los tejidos adultos, el queratocán se limita al estroma corneal y la expresión del queratocán se considera un marcador fenotípico de queratocitos (Liu et al. (2003) J. Biol Chem.278 (24): 21672-7; Carlson et al. (2005) J Biol Chem. 280 (27): 25541 -7). En platos de plástico, los queratocitos humanos, bovinos y de conejo pierden su morfología dendrítica característica y expresión de queratocán cuando se cultivan en medios que contienen suero (Espana et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12): 5136-41; Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9): 2985-91). Estas células expuestas subregulan la expresión de proteoglicanos que contienen queratán sulfato, queratocán y CD34, y sobrerregulan la de proteoglicanos que contienen condroitinadermatan sulfato y a-SMA, lo que indica que esas células se vuelven más diferenciadas.
Estudios previos han demostrado que queratocitos humanos (Espana et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12): 5136-41; Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci.45 (9): 2985-91) y murinos (Kawakita et al. (2005) J Biol Chem.280 (29): 27085-92) puede mantener su fenotipo sin diferenciación en miofibroblastos que expresan a­ SMA cuando se cultiva en la superficie del estroma de AM incluso cuando se agrega TGF-p en un medio que contiene suero debido a la subregulación de la vía de señalización de Simad. El estroma de la membrana amniótica puede mantener la expresión de queratocán en cultivos y evitar que los queratocitos se diferencien en miofibroblastos (Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280 (29): 27085-92). El queratocito mantuvo una morfología dendrítica, continuó expresando queratocán específico del estroma corneal durante al menos 5 pases (en una división 1:2) y no expresó a-SMA bajo condiciones que contenían suero o adición de TGF-p1 (Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9): 2985-91). Los queratocitos murinos también se pueden expandir en AM durante al menos 8 pases sin perder su fenotipo normal y esa supresión de la vía de señalización del TGF-p mediada por Smad es fundamental para mantener el fenotipo que expresa queratocán (Kawakita et al. (2005) J Biol Chem. 280 (29): 27085-92). En este ejemplo, se examinó si el HC-HA inmovilizado puede hacer lo mismo y, de ser así, si TGFpl adicional puede afectar su resultado.
Resultados
HA sobrerreguló 4 veces la expresión de ARNm de queratocán (Figura 50). Los fibroblastos corneales humanos se sembraron en plásticos con o sin HA inmovilizado durante 48 h, se privaron de suero durante 24 h y luego se trataron con o sin TGFp1 durante 24 h antes de recolectarse para la cuantificación del ARNm y la determinación de la señalización de SMAD2/3. Para la determinación de la proteína de los receptores de TGFp, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h antes de la recolección de muestras de proteína porque la expresión de la proteína va por detrás de la expresión del ARNm. Para el ELISA de TGF-p1, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 24 h, y luego se cultivaron en el medio fresco durante 24 (y 48) h. Los sobrenadantes se recolectaron para ELISA de TGF-p1. Para el ELISA de TGF-p2 y TGF-p3, las células se trataron con o sin TGF-p1 durante 48 h. Los sobrenadantes se recolectaron para ELISA de TGF-p2 y TGF-p3. Como era de esperar, HC-HA inmovilizado promovió la expresión de ARNm de queratocán en 14 y 16 veces, lo que indica que los HCF son mucho más jóvenes cuando se cultivaron en HC-HA sin TGFp1. Después de la exposición a TGFp1, la expresión de ARNm de Keratocan se redujo drásticamente en plástico y Ha . Sin embargo, la expresión de queratocán todavía se mantuvo a 3 veces en HC-HA (soluble, PBS). La expresión de queratocán estuvo ausente en HC-HA (Insoluble, Gn). Se espera que el fenotipo resultante en HC-HA (I) sea incluso más joven que los queratocitos.
En consecuencia, el HC-HA (I/S) inmovilizado promovió los niveles de proteína de queratocán en 8 y 10 veces, lo que indica que esos HCF de hecho se revierten a queratocitos cuando se cultivan en HC-HA (S/I) (Figura 51). No se vio ninguna expresión de proteína de queratocán correspondiente por otros tratamientos probados, incluyendo HA (aumento de 4 veces del ARNm de queratocán) y 4X HC-HA (PBS) (aumento de 3 veces del ARNm de queratocán), lo que indica tal aumento moderado de queratocán. El ARNm no fue suficiente para promover la expresión proteica correspondiente del queratocán.
Ejemplo 36: Efectos de los complejos HC-HA sobre la expresión del marcador ESC en HCF
El Ejemplo 35 mostró una fuerte evidencia de que no solo se evitó que HCF experimentara diferenciación de miofibroblastos bajo la exposición de TGF-p1 exógeno, sino que también revirtió a queratocitos con expresión de queratocán con o sin TGF-p1 exógeno. Por lo tanto, se examinó si HCF podría ser reprogramado en progenitores más jóvenes, especialmente cuando se siembra en HC-HA inmovilizado (insoluble, GnHCl) con TGF-p1 exógeno, que se ha demostrado que suprime la señalización de TGF-p, promueve la señalización de BMP, pero desactiva la expresión de queratocan. Se examinó la expresión de una serie de marcadores encontrados en ESC y progenitores endoteliales y pericitos, que como se ha informado recientemente se encuentran en progenitores de angiogénesis. Para examinar más a fondo la posible reprogramación de HCF bajo estas condiciones moduladas por HC-HA, también se examinó la expresión de los cuatro factores de transcripción clave, es decir, Sox2, Oct4, c-Myc y KLF4, que se ha informado que juegan un papel clave papel de la reprogramación de fibroblastos diferenciados adultos en iPSC.
Resultados
El examen de la expresión génica se realizó en los cultivos de HCF descritos anteriormente en el Ejemplo 35. Los resultados indicaron que HCF expresaba más marcadores ESC (de 2 a 6 veces) tal como cMYC, KLF-4, Nanog, nestin, Oct4, Rex-1, SOX-2 y SSEA-4 en 4X HC-HA, y de 2 a 4 veces más marcadores ESC incluso cuando los HCF fueron expuestos por TGF-p1 exógeno en comparación con el control plástico (p <0.05, n= 3) (Figura 52). Estos resultados sugieren que HC-HA, especialmente HC-HA (insoluble), puede reprogramar HCF en progenitores más jóvenes.
Ejemplo 37: HC-HA en solución inhibe la osteogénesis al afectar la viabilidad y diferenciación celular de MC3T3-E1 En este ejemplo, se evaluó el efecto de HC-HA (fracción soluble) y HA en solución sobre la viabilidad y diferenciación de células MC3T3-E1 indiferenciadas. MC3T3-E1 es una línea celular osteoblástica establecida a partir del ratón C57BL/6. Las células MC3T3-E1 tienen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos y osteocitos y se ha demostrado que forman tejido óseo calcificado in vitro.
Se cultivaron células MC3T3-E1 en el medio completo (a-MEM, FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina) con diversas concentraciones de HA (1, 5, 25, 100 |jg/ml) o HC-HA (1, 5, 25 jg/ml), con PBS como vehículo de control, y sembrado en cultivo de células de plástico tratado con 96 pocillos a 1.6 x 104 células/ml. La viabilidad celular se midió mediante ensayos MTT. El resultado mostró que la absorbancia a 550 nm aumentó de 24 a 48 h para todas las condiciones excepto para 25 jg/ml de HC-HA, lo que sugiere que la proliferación celular procede normalmente en el control, HA de 1 a 100 jg/ml y HC-HA de 1 a 5 jg/ml (figura 53). A continuación, se examinó el efecto de HC-HA o HA sobre la diferenciación de MC3T3-E1 en osteoblastos. Las células MC3T3-E1 se resuspendieron en medio de no inducción (1.6 x 105/ml) y se sembraron en 96 pocillos y se incubaron hasta la confluencia. Se retiró el medio de no inducción y se añadió medio de inducción 1 (medio completo con 2-fosfato de ácido ascórbico 0.2 mM y 2-fosfato de glicerol 10 mM, instrucciones del fabricante para el kit de ensayo de osteogénesis in vitro, #de cat. ECM810, Millipore). Después de 12 días de diferenciación, se utilizó tinción con rojo de Alizarina para medir y cuantificar la mineralización de osteoblastos. El resultado mostró que la AR fue de hecho promovida por el medio de inducción en el control. De acuerdo con un informe anterior (Kawano (2011) Biochemical and Biophysical Research Communications. 405:575-580), 100 jg/ml de HA pero no 25 jg/ml de HA promovieron adicionalmente la tinción de AR en comparación con el control. Por el contrario, la tinción AR no se redujo en 5 jg/ml de HC-HA (p = 0.11), sino que se redujo significativamente en 25 jg/ml de HC-HA (p = 0,00002) (Figura 54). Estos resultados sugirieron que el aumento de las concentraciones de HC-HA durante la inducción también redujo la formación de hueso.
Ejemplo 38: Respuesta dependiente de la dosis para HC-HA y AMP en la diferenciación de osteoblastos usando el sistema modelo MC3T3-E1.
Hallazgos anteriores mostraron que HC-HA y AMP inhiben de forma dependiente de la dosis la diferenciación de osteoclastos de células RAW264.7 inducida por RANKL (véase Publicación PCT Internacional No. WO 2012/149486). AMP (polvo de membrana amniótica) es una forma liofilizada y luego pulverizada de la membrana amniótica. En este ejemplo, se determinó la IC50 de HC-HA y AMP para la osteogénesis y se compara con la de la osteoclastogénesis.
El ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) y la tinción con rojo de Alizarina (AR-S) son dos ensayos que se utilizan para medir la diferenciación de las células MC3T3-E1. La ALP es excretada por los osteoblastos y ha sido durante mucho tiempo un marcador bioquímico ampliamente reconocido de la actividad de los osteoblastos (Sabokbar (1994) Bone Miner. 27 (1): 57-67) y, por tanto, sirve como un marcador temprano de la osteogénesis. El tinte rojo de Alizarina (AR) forma un quelato con calcio y, por lo tanto, se usa AR-S para visualizar la mineralización. Debido a que el tinte ARS se puede extraer fácilmente, también se puede convertir en cuantificación de mineralización (Gregory et al. (2005) Analytical Biochemistry 329:77-84).
Parte A
Diseño experimental:
Cultivo de MC3T3-E1
Se empleó el sistema modelo de células MC3T3-E1 del kit de osteogénesis in vitro Millipore, que coniste enl medio base de a-MEM (Invitrogen, # de cat. ICM810) que contiene FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron a 50,000 células/cm2 y se cultivaron en aire al 95% y CO2 al 5% a 37.0°C en un plato de cultivo celular de 100 ml y se pasaron antes de la confluencia. Una vez que se obtuvo un número suficiente de células, las células se sembraron a 1.6 x 105 células/ml en una placa de cultivo de 96 pocillos con un volumen de 100 j l del medio base por pocillo (52 pocillos). Cada concentración se realizó en 4 pocillos con 2 pocillos para el ensayo de ALP y 2 pocillos para la tinción AR-S. Las células se cultivaron a 37°C en aire humidificado con CO2 al 5% y el medio se cambió cada 48-72 horas hasta la confluencia.
El rango de dosificación que se va a investigar se derivó de los datos preliminares realizados en la diferenciación de osteoblastos (véase más arriba) así como de las curvas de dosis-respuesta para HC-HA y AMP frente a la diferenciación de osteoclastos. Debido a que HC-HA a 25 jg/ml inhibió significativamente la proliferación y diferenciación de células MC3T3-E1 en osteoblastos e inhibió por completo la diferenciación de osteoclastos de células RAW264.7 (véase la Publicación PCT internacional No. w O 2012/149486), se seleccionó como la concentración más alta. Debido a que 5 jg/ml de HC-HA mostraron menos del 50% de inhibición, lo que sugiere que la IC50 de HC-HA para la diferenciación de osteoblastos podría ser más alta que la IC50 en P-214, se seleccionaron las concentraciones de HC-HA en el rango de 0.1, 0.5, 1,5, 10 y 25 jg/ml. Con base en datos preliminares sobre HC-HA, se seleccionó AMP a las siguientes concentraciones: 1, 5, 25, 125, 250 jg/ml. Debido a que la actividad de ALP alcanza su punto máximo en el día 12 de diferenciación en células MC3T3-E1 (Maeda (2004) Journal of Cellular Biochemistry 92:458-471; Wang, (2008) J Dent Res. 87 (7): 650-654), se seleccionó estudiar la osteogénesis el Día 12 después de la inducción.
Tras la confluencia, el medio de cada pocillo se reemplazó con 100 j l de medio #1 de inducción de osteogénesis. El medio de inducción de osteogénesis contiene 2-fosfato de ácido ascórbico 0.2 mM y fosfato de p-glicerol 10 mM (kit de ensayo de osteogénesis in vitro, # de cat. ECM810, Millipore). Se añadieron 10 j l de soluciones de trabajo de AMP y HC-HA al medio #1 de inducción. (Soluciones madre de AMP (AMP-4; Lote # CB102971, véase la Publicación PCT Internacional No. WO 2012/149486) (5 mg/ml) y HC-HA (He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284 (30): 20136-20146) (250 |jg/ml) en PBS y se diluyeron en consecuencia con el medio de cultivo apropiado (Medio #1 de inducción de osteogénesis) para cada concentración experimental (0.1, 0.5, 1, 5, 10 y 25 jg/ml para HC-HA y 1, 5, 25, 125, 250 jg/ml para a MP)). El medio se cambió cada 3 días.
En el día de diferenciación 6, se reemplaza el medio con 100 j l de medio #2 de inducción de osteogénesis fresco que contenga ácido ascórbico, p-glicerolfosfato y melatonina. Se añadieron 10 jL de soluciones de trabajo de AMP y HC-HA a 100 jL de Medio #2 de inducción de osteogénesis (2-fosfato de ácido ascórbico 0.2 mM, 2-fosfato de glicerol 10 mM y solución de melatonina 50 nM, instrucciones del fabricante para el kit de ensayo de la osteogénesis in vitro, cat # ECM810, Millipore) para hacer las concentraciones experimentales finales en los pocillos de cultivo. El medio se cambió cada 2-3 días. A continuación, las muestras se analizaron con el ensayo ALP (H-156) y el ensayo de tinción con ARS siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de ensayo de osteogénesis in vitro, (catálogo # ECM810)).
Tinción con rojo de Alizarina S
El medio de cultivo de cada pocillo se aspiró sin alterar las células. Las células se lavaron 1X con 200 jL de PBS. Las células se fijaron añadiendo 100 j l de etanol al 70% e incubando a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, se eliminó el fijador y las células se enjuagaron 3 veces (5 min cada una) con un exceso de agua destilada sin alterar la monocapa celular. Se eliminó el agua y se añadieron 100 jl/pocillo de solución de tinción roja de Alizarina. Los pocillos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el exceso de colorante y las células se lavaron 4X con agua desionizada (balanceo suave durante 5 min con cada lavado). Se añadieron 0.1 -0.15 ml de agua a cada pocillo para evitar que las células se secaran. Las células teñidas se fotografiaron bajo el microscopio.
Luego se eliminó el exceso de agua de cada pocillo. Se añadieron 100 j l de ácido acético al 10% a cada pocillo y se incubaron con agitación durante 30 min. La monocapa débilmente unida se eliminó cuidadosamente con un raspador de células y las células y el ácido acético se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y se agitaron vigorosamente durante 30 min. Las muestras se calentaron hasta 85°C durante 10 min, luego se transfirieron a hielo durante 5 min para enfriar los tubos. La suspensión espesa de los tubos se centrifugó a 20,000 xg durante 15 min. Se retiraron 400 j l de sobrenadante y se transfirieron a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. El pH se neutralizó con 150 j l de hidróxido de amonio al 10% dentro del intervalo de 4.1 a 4.5. Se añadieron 150 j l de cada muestra a una placa de 96 pocillos de fondo transparente y se leyó a OD405. Se hizo un gráfico de la concentración de rojo de Alizarina versus OD405.
Ensayo ALP (BioAssay Systems: QuantiChrom ALP Assay Kit, # de cat.: DALP-250)
Las células de cada pocillo (placa de 96 pocillos) se lavaron con PBS y se sometieron a lisis en 100 j l de Triton X-100 al 0.2% en agua destilada mediante agitación durante 20 min a temperatura ambiente. Se transfirieron 200 j l de agua destilada y 200 j l de solución calibradora (suministrada con el kit) a pocillos separados para los controles. Se transfirieron muestras de 50 j l a pocillos separados. Se añadieron 150 j l de solución de trabajo (200 j l de regulador de ensayo, 5 j l de acetato de Mg (5 mM), 2 j l de sustrato líquido pNPP (10 mM)) a los pocillos de muestra (el volumen de reacción final fue de 200 jl). La placa se golpeó brevemente para mezclar. Se leyó la OD405 a los 0 min y 4 min en un lector de placas.
Resultados
Microscopio de contraste de fases
El control negativo mantuvo una forma hexagonal durante 13 días de inducción (Figura 55). La monocapa fue más suave que el control positivo, lo que sugiere que se produjeron más células o más acumulación de células en este último. Las células del control positivo adquirieron una forma fusiforme después del comienzo de la inducción. Con más tiempo, se desarrolló un anillo en forma de husillo a lo largo del borde (~ 2-3 mm de distancia) del cultivo plástico alrededor del 4° día de inducción.
Desde 0.1 jg/ml a 10 jg/ml de HC-HA, la monocapa celular no difirió de la del control positivo, lo que sugiere que HC-HA a estas concentraciones no afectó negativamente a la inducción (Figura 55A). Al igual que el control positivo, las células también desarrollaron una forma fusiforme y la monocapa desarrolló un anillo en forma de husillo. Sin embargo, a 25 jg/ml, se observó una disminución espectacular de la densidad celular y un cambio en la morfología celular en D13 de inducción.
A concentraciones superiores a 25 jg/ml, el AMP depositó partículas que se asentaron en la monocapa (Figura 55B). Debido a que la concentración de AMP se reponía después de cada cambio de medio, el depósito de AMP en la parte superior de la monocapa aumentó durante el período de inducción. El tratamiento con AMP por debajo de 125 jg/ml no afectó la morfología celular ya que las células también desarrollaron formas fusiformes con anillos de husillo, lo que sugiere que el AMP no influyó negativamente en la inducción. A concentraciones superiores a 125 jg/ml, la densidad de las partículas de AMP aumentó hasta el punto de oscurecer la observación visual de la formación del anillo del husillo. Sin embargo, la densidad celular y la morfología se mantuvieron sin cambios con respecto a los controles positivos, lo que también confirma que el AMP no afectó negativamente a la inducción. Tinción con rojo de Alizarina
El control negativo produjo un color de fondo gris azulado con partes de la monocapa que mostraban un color flor de rosa claro. Por el contrario, el control positivo produjo un fondo rosa (figura 56).
0.1 |jg/ml de HC-HA produjeron un color rojo óxido con el anillo del husillo visible teñido de color marrón rojizo, que era dramáticamente diferente al del control positivo (Figura 56A). Esta tendencia continuó de 0.5 jg/ml a 1 jg/ml con un ligero aclaramiento de color a 10 jg/ml, lo que sugiere que la mineralización se mantuvo de 0.1 a 5 ug/ml y que podría haber una relación dependiente de la dosisi entre 0 y 0.1 ug/ml. A 25 jg/ml de HC-HA, el fondo rojo óxido desapareció y volvió a un rosa violeta claro con espacios blancos notables entre la unión celular.
AMP de 1 jg/ml a 125 jg/ml, produjo un cambio de color dependiente de la dosis de un marrón óxido más claro (1 jg/ml), que parecía ser más claro que 0.1 ug/ml de HC-HA, lo que sugiere que la respuesta a la dosificación fue más gradual, a un fondo rojo óxido (5 jg/ml y 25 jg/ml), marrón rojizo (125 jg/ml), y aumentó dramáticamente a marrón rojizo oscuro a 250 jg/ml (Figura 56B). Se observa que las partículas de AMP se encuentran en la parte superior de las monocapas de células tratadas con más de 5 jg/ml de AMP, y el tamaño de partícula era más pequeño que la propia célula y parecía coincidir con el color del fondo teñido.
Mediante análisis cuantitativo del valor de OD, la tinción con ARS con tratamiento de 0.1 jg/ml de HC-HA aumentó 3 veces desde el control positivo con significación estadística (p <0.05) (Figura 57A). Se observó alguna variación en las concentraciones de 0.1 jg/ml a 10 jg/ml, que puede atribuirse al pequeño tamaño de la muestra (N= 2). Se observó una disminución drástica del valor de OD a 25 jg/ml de tratamiento con HC-HA. Para AMP, el tratamiento con 125 jg/ml de AMP duplicó más del doble la cantidad de mineralización del control positivo y fue estadísticamente significativo (p <0.05) (Figura 57B). Se observó una pequeña disminución en el valor de OD del control positivo en 1 jg/ml de AMP, y de 1 jg/ml a 25 jg/ml, hubo un pequeño aumento dependiente de la dosis en los valores de OD. La OD405 disminuyó en 250 jg/ml de AMP en comparación con 125 jg/ml. Algunas variaciones pueden atribuirse al pequeño tamaño de la muestra (N= 2).
Tinción con ALP
En el grupo de ambos derivados de AM, el control negativo mostró 5 veces más actividad ALP que el control positivo, lo que podría haber ocurrido por la pérdida de muestra en el control negativo, lo cual disminuyó el tamaño de la muestra (Figura 58). El tamaño de muestra más pequeño contribuyó a que el valor de la desviación estándar fuera 8 veces mayor para el control negativo que para el control positivo, y esta variación mucho mayor podría contribuir al aumento.
El tratamiento de MC3T3-E1 inducido con cualquier cantidad de HC-HA disminuyó la actividad de ALP en comparación con el control positivo y negativo (Figura 58A). La actividad de ALP varió entre los diferentes grupos de concentración hasta 25 jg/ml donde la actividad de ALP disminuyó significativamente. Vale la pena señalar que hubo muy poca variación de la media en cada uno de los grupos experimentales y el control positivo.
A 1 jg/ml, la actividad de ALP fue casi 4 veces mayor que la del control positivo (Figura 58B). Este fenómeno se bloqueó a 5 jg/ml y 25 jg/ml con la actividad de ALP disminuyó casi 3 veces con respecto al control positivo. El aumento de la concentración de 125 jg/ml a 250 jg/ml restauró la actividad de la ALP a niveles cercanos a 1 jg/ml. Por lo tanto, parecía que la actividad de ALP no era congruente con la cantidad de mineralización.
Resumen de resultados
Comparado con el control negativo, el control positivo exhibió más células fusiformes y formó un "anillo" alrededor del borde del pocillo de plástico (Figura 55A), un cambio de color por tinción de Alizarina (Figura 56A), y un efecto detectable pero no significativo. cambio de OD405 (figura 57A). Previamente, las células MC3T3-E1 sembradas a 5x104 células/plato de plástico de 35 mm también revelaron la formación de fibrillas de colágeno en capas después del Día 4, fibrillas en capas el día 18 y formación de regiones nodulares el día 21 de inducción. (Sudo (1983) J. Cell. Biol. 96:191-198). Este estudio anterior no notó la misma formación de anillos que observamos. [Alternativamente, pueden interpretar el anillo como una fibrilla de colágeno en capas. Si este fuera el caso, el área del anillo debería ser propensa a la mineralización.]
La tinción con rojo Alizarina se ha descrito como un color rojo carmesí en la literatura para indicar mineralización. Se describió que la mineralización y los nódulos osteoblásticos se tiñeron de un rojo profundo y la intensidad del color aumentó con la mineralización (Wang, (2006) Biotechnol. Prog. 22 (6): 1697-701; Zhao, 2007). La tinción con ARS se lee a 405 nm, lo que corresponde a un color violeta en el espectro visible. A diferencia de nuestros resultados, las fotografías en color de la tinción con ARS de la mineralización MC3T3-E1 de los datos publicados no mostraron un color rojo óxido o marrón rojizo en la monocapa. El color más oscuro en nuestros resultados indica más tinción con ARS y, por lo tanto, más osteogénesis en comparación con los resultados publicados. La cantidad de cambio de OD en la tinción y cuantificación de ARS varió dependiendo de las condiciones de cultivo y el tipo de célula. Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) cultivadas en 6 pocilios (10 cm2/pocillo) durante 30 días alcanzaron un aumento de la OD405 de 0.5 a 4 (Gregory et al. (2005) Analytical Biochemistry 329:77-84). Las células MC3T3-E1 cultivadas durante 28 días (a-MEM, ácido ascórbico, p-glicerolfosfato) en placas de 24 pocillos alcanzaron una OD de 0.6. Sin embargo, el día 16 y el día 26 OD fue mucho más baja que el Día 28 por debajo de 0.05 y 0.2, respectivamente (Burkhardt (2006) Universidad de Basilea, Tesis de Maestría). La falta de cambio de color dramático en el control positivo podría deberse al tiempo de D13, que fue demasiado corto para ARS aunque es óptimo para ALP.
0.1 |jg/ml de HC-HA también indujo un "cambio de anillo" (Figura 55A), un claro aumento de color (Figura 56A) y un valor de OD 3 veces mayor que el control positivo (p <0.05) (Figura 57A), lo que sugiere que e1HC-HA a la dosis más baja promueve la mineralización y que existe una curva de respuesta a la dosis entre 0 y 0.1 ug/ml.
HC-HA de 0.5 a 10 jg/ml también mostró "anillos" (Figura 55A), mantuvo el mismo color que 0.1 ug/ml (Figura 56A) y produjo una OD405 sin significación estadística. HC-HA a 25 jg/ml disminuyó la densidad celular, cambió la morfología celular, perdió el "anillo" (Figura 55A), no produjo ningún cambio de color (similar al control negativo) (Figura 56A) y generó una OD405 insignificante (como el control negativo).
El AMP de 25 jg/ml de partículas izquierdas (Figura 55B), de 1 jg/ml aumentó el color con una relación positiva de respuesta a la dosis (Figura 56B), pero la OD405 mostró un aumento que no fue estadísticamente significativo hasta 125 jg/ml AMP (p <0.05), y luego disminuyó a 250 jg/ml, lo que no fue consistente con el cambio de color. A diferencia de HC-HA, AMP en la dosis más alta no causó ningún efecto nocivo sobre la morfología celular.
Parte B
El método de tinción con rojo de Alizarina se mejoró luego aumentando el tamaño de la muestra e incorporando la metodología con Gregory et al. ((2005) Analytical Biochemistry 329:77-84) utilizado para la tinción con Alizarina de MSC humana y otros métodos conocidos en la técnica. En la siguiente tabla se proporciona una comparación del método de Gregory et al, nuestro método anterior descrito anteriormente y el nuevo método descrito en este ejemplo. Estudios anteriores demostraron que la diferenciación de MC3T3-E1 bajo inducción se puede subdividir en tres etapas, es decir, proliferación (día 1 a 9), formación de ECM (día 9 a día 16) y mineralización (depósito de minerales en ECM formado) (día 16+). (Quarles et al. (1992) Bone Miner Res. 7 (6): 683-92; Hong et al. (2010) Exp Cell Res. 316 (14): 2291-300). Por lo tanto, para comparar estudios de diferentes grupos, era importante cronometrar el evento a partir de la confluencia como el día 0.
Tabla 5.
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Diseño experimental:
Las células se cultivaron y estimularon en medio de diferenciación como se describe en la Parte A y la Tabla 5. El medio de diferenciación se cambió cada 3 días durante 18 días. Para el ensayo se emplearon 0.1 pg/ml de HC-HA y 125 pg/ml de AMP. El ensayo ARS se realizó como se describe en la Parte A con los cambios como se indica en la Tabla 5.
Resultados
Morfología celular y formación de anillos
Las células no inducidas alcanzaron una forma cuboidal plana después de la siembra (Figura 59A). El borde celular se volvió más definido el día 4 con bordes elevados, y algunas células desarrollaron formas fusiformes el día 6. No se desarrollaron células fusiformes ni capas múltiples.
Desde el día 1 hasta el día 3, las células mantuvieron una forma cuboide y la monocapa permaneció plana (Figura 59B). Para el día 3, los bordes de las células se volvieron más distintos y los bordes de las células se elevaron. Además, en la monocapa eran visibles pequeñas estructuras redondas parecidas a células (indicadas por un círculo negro). La morfología celular cambió el día 4 con la aparición de células de forma fusiforme y células organizadas en múltiples capas. La apariencia de las pequeñas estructuras similares a células redondas continuó aumentando hasta el día 6 y el día 7.
El cambio de morfología celular en las células inducidas tratadas con HC-HA reflejó los cambios del control positivo (Figura 60A). HC-HA no dejó partículas en la monocapa como AMP. Al igual que el control positivo, las estructuras similares a células redondas pequeñas (mostradas en un círculo negro) aparecieron el día 3 y continuaron aumentando hasta el día 7.
Las partículas de AMP (señaladas con una flecha negra) se asentaron en la parte superior de la monocapa y obstruyeron la observación de la monocapa por debajo (Figura 60B). Las áreas desprovistas de partículas de AMP el día 0 y el día 1 mostraron formas redondas y cuboidales. El día 2, aparecieron algunas células de forma fusiforme en la monocapa. Fue difícil identificar y distinguir las pequeñas estructuras similares a células redondas de las partículas AMP más pequeñas y el desarrollo de estas estructuras sigue siendo desconocido. El día 5, las formas fusiformes se alargaron para formar células fusiformes. El día 6, las células fusiformes largas formaron interacciones en forma de red con las partículas de AMP (que se muestran en un círculo negro).
El Día 3, se desarrollaron células de forma fusiforme cerca del borde del pocillo (1 - 2 mm desde el borde) (Figura 61A). Las células en husillo y la formación de anillos no se desarrollaron desde el Día 4 en adelante. Las células parecían superponerse entre sí en el borde y crecer en formas fusiformes. Desde el Día 0 hasta el Día 2, no hay células fusiformes a lo largo del borde del pocillo (figura 61B). El Día 3, se observaron en el borde células fusiformes similares apiladas en una configuración de anillo. A partir del Día 5, estas células se concentraron como un anillo prominente a unos 2 mm del borde. El Día 6, las monocapas muestran desprendimiento de la superficie plástica a lo largo de ciertas áreas cercanas al borde (indicadas por blanco ^ ) .
Las células permanecieron lisas y en forma de cubo a lo largo del borde hasta el Día 2 (figura 62A). Se desarrollaron células de forma fusiforme cerca del borde en el Día 2. Algunas estructuras pequeñas y redondas similares a a células también fueron visibles cerca del borde en ese momento. Las células en forma de husillo se desarrollaron el Día 3 y continuaron espesándose en un anillo alrededor del borde del pocillo hasta el Día 5. Se observó desprendimiento de la monocapa del pocillo de plástico el Día 6 en las áreas cercanas al borde (señaladas con una flecha blanca). Las células de forma fusiforme aparecieron cerca del borde del pocillo el Día 2 (figura 62B). Se desarrollaron células en forma de husillo desde el borde el Día 3 (aproximadamente de 1 a 2 mm de distancia) y un anillo de células en forma de husillo se formó el Día 5. Se observó desprendimiento de monocapa del pocillo de plástico el Día 5 en algunas áreas cercanas al borde. El desprendimiento continuó el Día 6, pero las monocapas no se desprendieron tanto como las células tratadas con HC-HA y las células de control positivo.
Tinción y cuantificación de ARS
La monocapa de los controles negativos se tiñó de un color rosa claro en algunas áreas (Figura 63). El control positivo se tiñó de un rosa claro en el centro, pero mostró un color rojo carmesí brillante en el área del anillo del husillo, lo que indica que las células MC3T3-E1 depositan una fuerte mineralización en el anillo en lugar del resto de la monocapa. Tanto la intensidad como el color de la tinción en la monocapa central y el anillo del husillo entre 0.1 |jg/ml de HC-HA y el control positivo fueron los mismos. Las partículas de AMP en la parte superior de las células se tiñeron de un color marrón rojizo. La observación visual de las células debajo se vio obstruida por las partículas teñidas, pero las aberturas mostraron una falta de monocapa celular prominente con algunas células dispersas que se tiñeron de un color rosa claro similar al del control negativo. Dado que las células tratadas con AMP no mostraron un anillo de husillo visible, y el ARS no se tiñó de un rojo carmesí alrededor del borde similar al control positivo. El tratamiento con GnHCl solubilizó la matriz celular y eliminó el colorante ARS rojo carmesí dejando intacta la monocapa tanto en el control positivo como en las células tratadas con HC-HA. El GnHCl digirió y desnaturalizó la proteína celular, dejando atrás la matriz extracelular. En el grupo experimental de AMP, la densidad de las partículas de AMP disminuyó, pero la mayoría de las partículas aún permanecieron en el fondo del pocillo. Con el largo tiempo de cultivo, las partículas de a Mp pueden formar interacciones estrechas con la matriz de ECM que no fue disuelta por el GnHCl. Las partículas que alguna vez se tiñeron de un marrón rojizo brillante ahora mostraban un color marrón claro como el color que exhibe naturalmente AMP. Sin embargo, no se observó una estructura de monocapa distinta; esto apoyó la observación de una monocapa de células en los espacios entre el AMP. Es posible que las células hayan migrado de la monocapa a las partículas de AMP y las hayan utilizado como andamio para la diferenciación y mineralización.
El estándar ARS mostró una progresión desde el rojo carmesí hasta un color rosa crema a través de una dilución en serie de 2 mM a 31.3 pM (Figura 64A). Hubo un cambio de color notable entre las muestras tratadas con HC-HA y AMP. Los extractos de células tratados con HC-HA mostraron un color crema claro mientras que los extractos de células tratados con AMP mostraron un color rosa crema claro. El control positivo también mostró el mismo color y nivel de intensidad de color que las células tratadas con HC-HA, mientras que el control negativo mostró un color más claro y se parecía al blanco (no mostrado). Los valores de OD405 se mantuvieron en el mismo rango que los valores del ejemplo anterior (Figura 64B). En comparación con el control negativo, el control positivo mostró una disminución estadísticamente significativa de 2 veces en la OD. Las células tratadas con HC-HA (0.1 pg/ml) mostraron un ligero aumento en la OD que el control positivo, pero la diferencia no es estadísticamente significativa. El tratamiento con AMP (125 pg/ml) disminuyó ligeramente los valores de OD en comparación con el control positivo, pero esta disminución no fue estadísticamente significativa.
El estándar ARS mostró una progresión de rojo carmesí a un color rosa crema a través de una dilución en serie de 2 mM a 31.3 pM (Figura 65A). El extracto de control negativo mostró un color crema claro ligeramente más oscuro que el blanco (no mostrado). El control positivo mostró un color dorado claro y el color era visiblemente más oscuro que el control negativo. HC-HA también mostró un color dorado claro con la misma intensidad que el control positivo. Los extractos tratados con AMP mostraron un color naranja-dorado que era más oscuro que los grupos de extractos positivos y de HC-HA. Los valores de OD405 se mantuvieron en el mismo rango, siendo el más alto alrededor de 0.25 (Figura 65b ). Los controles negativos mostraron un valor de OD insignificante cercano a 0. Los controles positivos y los extractos tratados con HC-HA (0.1 pg/ml) mostraron un valor de OD promedio cercano a 0.05. Los extractos tratados con AMP (125 pg/ml) mostraron un aumento de 5 veces estadísticamente significativo en la OD (P = 0,039) tanto de los grupos positivos como de los tratados con HC-HA.
Resumen
Morfología celular
Las células MC3T3-E1 cultivadas en aMEM con 10% de FBS crecieron hasta la confluencia y desarrollaron una forma cuboidal. Al igual que los hallazgos en el Objetivo #1 y #2, las células no se diferenciaron sin la adición de ácido ascórbico, p-glicerolfosfato y melatonina. Sin medio de inducción, no se formaron células en forma de husillo ni anillos en forma de husillo (Figura 59). Se indujo la diferenciación de las células MC3T3-E1 con ácido ascórbico, pglicerolfosfato y melatonina. Después de la siembra, se formó una monocapa lisa con células en forma de cubo. Después de 3 días de inducción, las células adquirieron una forma fusiforme. El Día 5, las células se alargaron y se volvieron en forma de husillo.
En este ejemplo, los anillos de husillo se desarrollaron en el Día 3 de inducción, con células de husillo que se forman entre 1 y 2 mm de la pared del pocillo. El Día 6, se observó el desprendimiento de la monocapa del borde del pocillo y el fondo de plástico (figura 60). Se desarrollaron pequeñas estructuras redondas similares a células en la monocapa a partir del Día 2 y aumentaron en número hasta el Día 6 (Figura 59). No flotaban en el medio de cultivo y estaban firmemente adheridas a la monocapa, descansando principalmente entre los bordes de las células. Estas estructuras pueden representar vesículas de matriz (MVs) que son partículas extracelulares revestidas de membrana ubicadas en sitios de calcificación inicial en cartílago y hueso. La síntesis de vesículas de matriz se produce a través de la gemación y estrangulamiento de vesículas de regiones específicas de las membranas plasmáticas externas de condrocitos y osteoblastos de la placa de crecimiento diferenciados (Anderson et al. (2003) Curr Rheumatol Rep, 5 (3): 222-6).
El tratamiento con HC-HA no alteró el cambio morfológico de las células MC3T3-E1 a través de la diferenciación (Figura 60). La formación de células fusiformes, células en forma de husillo y anillo de husillo (Figura 61) siguió el curso temporal informado del control positivo. Las partículas de AMP se asentaron en la parte superior de la monocapa celular de forma similar a los hallazgos anteriores (Figura 60). Esto impidió la observación completa de la monocapa celular y el cambio de morfología celular por inducción. Sin embargo, se notaron algunas observaciones a través de aberturas donde las partículas de AMP no se asentaron. A diferencia de HC-HA, el tratamiento con AMP aceleró el cambio morfológico celular y algunas células fusiformes fueron visibles un día antes en el Día 2 de inducción. Las células tratadas con AMP formaron un anillo de husillo similar a las células tratadas con HC-HA y el control positivo (Figura 62). Sin embargo, la monocapa se desprendió antes (Figura 62) y luego los otros dos grupos experimentales (el Día 5 en lugar del Día 6).
Tinción y cuantificación de ARS
La tinción con ARS mostró un color drásticamente diferente al informado anteriormente (Figura 66). ARS tiñó de un color rosa claro en lugar de azul grisáceo en las monocapas de células de control negativo. La tinción con ARS también mostró un rojo carmesí brillante concentrado en el anillo de husillo en lugar de un color marrón óxido de los resultados anteriores en los controles positivos y las células tratadas con HC-HA. Las partículas de AMP se tiñeron de un marrón rojizo en lugar de un marrón oscuro, y las células debajo se tiñeron de un rosa claro en lugar de un marrón óxido. La degradación de la solución de ARS puede haber contribuido al cambio de color.
Después de la extracción con ácido acético, la monocapa todavía parecía tener una cantidad significativa de color teñido. El ácido acético no es eficaz para eliminar completamente la mancha de ARS de la monocapa. Con la extracción de ácido acético, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los valores de OD del control positivo y negativo (Figura 68) que coincidió con la observación visual de más tinción de ARS en el control positivo (Figura 66). Sin embargo, la extracción de ácido acético no fue eficaz para mostrar un aumento estadísticamente significativo en la OD de AMP en comparación con los grupos positivos y HC-HA (Figura 66) a pesar de la observación visual de los grupos de AMP que tienen más color en los extractos de ensayo que los otros dos grupos (Figura 67). Los depósitos de partículas de AMP pueden haber dificultado la eliminación de ARS de los grupos de AMP. La matriz y las células mineralizadas también pueden tener interacciones con las partículas de AMP que dificultan la extracción del ARS con ácido acético.
El GnHCl eliminó el ARS de la monocapa celular más completamente que el tratamiento con ácido acético (Figura 69). Además, el color se solubilizó en una solución de GnHCl sin el uso de un raspador de células para eliminar la monocapa. Ambos métodos parecen haber dejado partículas invisibles a simple vista y no afectadas por la centrifugación. Para GnHCl, esto podría ser calcio y una matriz disuelta que forma partículas finas. Esto provocó variaciones entre los duplicados en cada muestra. La lectura a 670 nm para eliminar las partículas resolvió este problema para el método de extracción de GnHCl.
La extracción de GnHCl no pudo establecer una significación estadística cuantificable entre el control negativo y el positivo (Figura 71) para coincidir con la observación visual de la tinción con ARS. La extracción con GnHCl también mostró que 0.1 pg/ml de HC-HA no promovió más mineralización en la diferenciación de células MC3T3-E1 (Figura 71), y esto coincidió con los resultados de la extracción con ácido acético. Al observar los colores del extracto de ensayo en 96 pocillos, el control positivo y los pocillos de HC-HA no mostraron diferencias en el color o la intensidad (Figura 70).
La extracción con GnHCl mostró que 125 pg/ml de AMP promovió más mineralización en la diferenciación de células MC3T3-E1 que el control positivo (Figura 71). Esto coincidió tanto con la tinción con ARS de la monocapa (Figura 66) como con la observación visual de los extractos en placas de ensayo de 96 pocillos (Figura 70), donde AMP mostró un color amarillo dorado mucho más profundo que el de HC-HA o el control positivo.
A partir de estos resultados, el GnHCl es el mejor método de extracción porque elimina la mancha de ARS más completamente de la monocapa y la deja intacta; hay menos error técnico porque no es necesario raspar la monocapa del pocillo. El color del extracto se puede cuantificar mediante la lectura del espectrofotómetro.
Parte C
El estudio preliminar anterior no mostró resultados estadísticamente significativos en las curvas de respuesta a la dosis para HC-HA y AMP en la diferenciación de osteoblastos debido al pequeño tamaño de la muestra y al desarrollo incompleto del ensayo ARS. Esto sugirió que 0.1 pg/ml de HC-HA puede potenciar la mineralización. Además, HC-HA a 10 pg/ml a 25 pg/ml podría afectar la viabilidad celular y reducir la mineralización. La curva de dosis para HC-HA debe incluir una concentración menor por debajo de 0.1 pg/ml, así como concentraciones superiores a 10 pg/ml. A diferencia de HC-HA, AMP de 5 pg/ml a 125 pg/ml puede promover la mineralización. En este experimento, se volvió a probar la respuesta a la dosis de HC-HA y AMP usando el método de la Parte B. En este experimento, se usó la tinción con ARS para analizar el Día 15, y se empleó el protocolo revisado que usaba ácido acético al 10% para teñir y cuantificar.
Diseño experimental
Se usó el mismo sistema modelo que se muestra en la Parte B con base en células 3T3-E1 sembrando 3x104 células/cm2/pocillo en placas de 96 pocillos en medio aMEM con FBS al 10%. Tras la confluencia, se indujo la diferenciación de las células mediante la adición de ácido ascórbico, p-glicerolfosfato, medio de inducción de melatonina. Para cada condición, se probó N= 3. Después de la confluencia (Día 0 = siembra), se añadió HC-HA a 0.02 pg/ml, 0.1 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml y 25 pg/ml mientras que se añadió AMP a 1 pg/ml, 5 pg/ml, 25 pg/ml y 125 pg/ml. Para la tinción con ARS, se empleó el método modificado de la Parte B.
Resultados
Las células MC3T3-E1 de control negativo no desarrollaron formas de husillo o anillos de husillo durante el cultivo (Figura 66A). El centro de la moncapa y el periférico se tiñeron de color beige. Las células de control positivo desarrollaron células fusiformes y similares a husillo, con la aparición de anillos de husillo alrededor de D5 de cultivo (D4 de inducción). La tinción con ARS mostró un color marrón claro en el centro y se concentró principalmente en los anillos del husillo con un color carmesí oscuro. El aumento de la concentración de HC-HA a 1.25 pg/ml no tuvo ningún efecto sobre la morfología celular o la intensidad y el patrón de tinción con ARS. A 2.5 pg/ml, el anillo del husillo de las células MC3T3-E1 comenzó a degradarse y el color del ARS cambió de carmesí a rojo marrón. Por 20 pg/ml, las células perdieron su forma fusiforme y en husillo; los bordes de las células también estaban menos definidos y elevados. La densidad celular disminuyó y la monocapa no pareció levantada como antes. GnHCl extrajo con éxito el colorante ARS y el coeficiente de variación en los valores de OD450 varió de 5% a 19%. El control positivo mostró valores de OD aumentados estadísticamente significativos (Figura 66B).
Las células MC3T3-E1 de control negativo no desarrollaron formas de husillo o anillos de husillo durante el cultivo (Figura 67A). El centro de la moncapa y el periférico se tiñeron de color beige. Las células de control positivo desarrollaron células fusiformes y en forma de husillo, con la aparición de anillos en forma de husillo alrededor de D5 de cultivo (D4 de inducción). La tinción con ARS mostró un color marrón claro en el centro de la monocapa. El tratamiento con AMP dejó partículas de AMP que se asentaron en la parte superior de la monocapa celular y oscurecieron la observación de la monocapa desde una concentración de 62.5 pg/ml hacia arriba. Las células MC3T3-E1 tratadas solo con AMP y sin inducción no mostraron anillos de husillo a lo largo del borde y la tinción con ARS mostró un carmesí oscuro con un fondo rosa claro. De 7.8 pg/ml a 31.25 pg/ml, las partículas de AMP no cubrieron completamente la monocapa y las células mostraron formas fusiformes y en forma de husillo. A lo largo del borde, se podían ver anillos de husillo. La tinción con ARS mostró que la monocapa central se tiñe de un granate claro y el tinte se concentró a lo largo del anillo del husillo hasta un color carmesí oscuro como el control positivo. GnHCl extrajo con éxito el colorante ARS y el coeficiente de variación en los valores de OD450 varió del 3% al 10% (Figura 67B).
Resumen de resultados
Morfología celular/tinción con ARS
De manera similar a los resultados anteriores, la diferenciación de MC3T3-E1 progresa desde que las células cambian de forma cuboidal a formas fusiformes y en forma de husillo. Con el aumento del tiempo de inducción, se forman anillos de husillo a lo largo del borde del pocillo (~ 2 mm de distancia) y contraen la monocapa con el tiempo. A diferencia del control positivo, el control negativo nunca desarrolló células en forma de husillo o anillos de husillo. Mientras que la monocapa de control negativo se tiñó de un color beige uniforme, el control positivo mostró un color granate claro/rosa en el centro y un carmesí oscuro concentrado en los anillos de husillo.
A 10 pg/ml de HC-HA, la morfología celular cambió desde concentraciones más bajas, con menos células mostrando las formas fusiformes y en forma de husillo. La densidad celular disminuyó y la monocapa parecía menos elevada. A 20 pg/ml de HC-HA, la densidad celular disminuyó drásticamente y pocas células tenían forma de husillo. La monocapa se veía suave como el control negativo. Para ambas concentraciones, estos cambios se notaron a partir del D5 del cultivo y la inducción. En ambas concentraciones, los anillos de husillo estaban mal formados o no existían. El aumento de la concentración de HC-HA provocó la desintegración del anillo de husillo a una concentración de 2.5 pg/ml y más.
En todas las células tratadas con AMP, las áreas alrededor de donde se asentaron las partículas de AMP se tiñeron de un carmesí oscuro. Alrededor del borde del pocillo, no se pudo ver ninguna monocapa a través de las aberturas de las partículas de AMP. El MC3T3-E1 no inducido tratado con 125 pg/ml de AMP mostró una tinción similar al MC3T3-E1 inducido tratado con 125 pg/ml de AMP. Las células con AMP sedimentado se tiñeron de carmesí oscuro en parches, sin observación de una monocapa teñida debajo. Desde 7.8 pg/ml hasta 15.6 pg/ml de AMP, la morfología celular era visible. Las células mostraron formas fusiformes y en forma de husillo con anillos de husillo formados a lo largo del borde del pocillo. La tinción con ARS se parecía al control positivo con un color granate claro en el centro y un carmesí oscuro en las áreas del anillo de husillo.
El tratamiento con GnHCl tuvo éxito en la extracción del tinte ARS de la monocapa teñida. La extracción mostró un aumento estadísticamente significativo (p <0.01) de 2 veces en la OD450 desde el control negativo al control positivo. Las células tratadas con HC-HA mostraron una tendencia de mineralización decreciente al aumentar la concentración de HC-HA. A 10 pg/ml y 20 pg/ml de HC-HA, hubo una disminución estadísticamente significativa (p <0.05) en la mineralización del control positivo. AMP aumentó de forma dependiente de la dosis la mineralización de las células MC3T3-E1 diferenciadoras.
Las células no inducidas tratadas con AMP también mostraron mineralización, y parecería que AMP indujo y promovió la mineralización más que el control positivo (p <0.01). Además, a 125 pg/ml de AMP, el tratamiento de células no inducidas mostró más mineralización que las células cultivadas en medio de inducción (p <0.05).
Ejemplo 39. Efecto de AMP sobre la diferenciación de osteoblastos
Aunque la tinción con ARS mostró un claro aumento dependiente de la dosis de la tinción por AMP, y mostró un aumento estadísticamente significativo en la mineralización a 125 pg/ml, no estaba claro si tal cambio es causado por la unión no específica de ARS a AMP. Debido a que el AMP actuó de manera diferente a la HC-HA, especialmente en dosis altas, es decir, promoviendo la mineralización, pero no inhibiéndola, era importante descartar si la acción de AMP depende del contacto directo de la célula con AMP. Esta cuestión se abordó mediante el uso de Transwells con un tamaño de poro de 3 pm, que es suficiente para que pase HC-HA pero lo suficientemente pequeño como para excluir las partículas de a Mp . Debido a que la placa de Transwells disponible con este tamaño de poro cabe en una placa de 24 pocillos, las condiciones de cultivo del ensayo se modificaron en consecuencia. Para el ensayo se empleó una concentración de 125 pg/ml de AMP.
Diseño experimental:
Se sembraron células MC3T3-E1 (células en P2; ATCC, # de catálogo: CRL-2593™) en pocilios de fondo transparente, planos, de 12 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/ml. Se preparó la misma solución madre de AMP (AMP-4; lote # CB102971) que se utilizó anteriormente fue preparada como 5 mg/ml en PBS. Para los pocillos sin Transwells, se agregaron 17.5 pL de solución madre de AMP en 0.7 ml del medio de cultivo (base o medio de inducción) para lograr una concentración de AMP de 125 pg/ml en a-MEM con 10% de FBS (sin inducción) o medio # 1 de inducción seguido por # 2 (con inducción). Para los pocillos con Transwells, se añadieron 17.5 pl de reserva de AMP directamente al centro de la membrana de Transwell de la misma manera que se describió anteriormente. Los medios de cultivo (a-MEM con FBS al 10%; medio #1 de inducción y #2 como se describe anteriormente) se cambiaron cada 3 días después del D0 de inducción. Los procedimientos de tinción y cuantificación de ARS se realizaron como se describió anteriormente excepto que las monocapas de células se fijaron con paraformaldehído al 4% en lugar de etanol al 70% y se tiñeron durante 2 h en lugar de 1 h.
Resultados
Todas las células inducidas desarrollaron la formación de anillos en D4 de inducción (Figura 68). Los anillos estaban compuestos por capas de células alrededor del borde de los pocillos de plástico, a unos 2-3 mm de distancia. Crecieron en capas, se enrizaron y luego la monocapa se desprendió en muchos pocillos del plástico. Sin inducción, las células mantuvieron en su mayoría formas hexagonales con algunas formas fusiformes con el aumento del período de cultivo, y la monocapa permaneció lisa en comparación con las células inducidas (Figura 69). La inducción hizo que las células tuvieran una forma fusiforme y la monocapa se elevó y los bordes entre las células se hicieron más distintos. Con la inducción, el Día 4, se observó el desarrollo de un anillo en forma de husillo a lo largo del borde de la placa de cultivo. El tratamiento con AMP no afectó la viabilidad celular; tampoco afectó a la formación del anillo, lo que sugiere que el AMP no afectó negativamente a la inducción. La adición de Transwells no afectó al crecimiento celular ni a la morfología.
Sin Transwells, las partículas dejadas de AMP a 125 pg/ml se depositaron en la monocapa celular (Figura 69A). Sin inducción, el AMP, por sí mismo, no provocó que las células desarrollaran una forma de husillo y no generó un anillo, lo que sugiere que el AMP solo no era suficiente para provocar la inducción, similar al control negativo. Con la inducción, 125 pg/ml de AMP causaron el cambio de morfología celular como el control positivo, lo que sugiere que el AMP en sí no afectó negativamente a la inducción. A través de Transwells, 125 pg/ml de AMP dejaron partículas despreciables en la monocapa celular (Figura 69B). Sin inducción, el AMP no fue suficiente para inducir a las células a diferenciarse y las células se parecían al control negativo. Con la inducción y 125 pg/ml de AMP, las células desarrollaron formas fusiformes y en forma de husillo y D14 se asemejó al control positivo, lo que nuevamente sugiere que el AMP no afectó negativamente a la inducción.
El control negativo produjo un color de fondo gris pardo con parches de color rosa claro en la monocapa, que se diferenciaba del color gris azulado del control negativo del experimento anterior (figura 70). Sin inducción, pero con Transwell, las monocapas tiñeron un fondo gris pardo similar al control negativo incluso cuando se trataron con AMP, lo que sugiere que el AMP en sí mismo no provocó la inducción. Sin Transwell, en comparación con el control negativo, había zonas que mostraban una disminución notable del color de fondo, lo que sugiere que las partículas de AMP asentadas en la monocapa podrían haber bloqueado el color (marcado con **), y el AMP en sí no generó un color positivo que sugiera mineralización.
El control positivo produjo color flor de rosa con el anillo teñido de color rojo óxido, que era más oscuro que el color rojo rosa del control positivo en el experimento anterior. La adición de un Transwell no afectó el color del control positivo, lo que confirma que el Transwell en sí no afectó a la inducción. Con AMP, pero sin Transwell, las monocapas produjeron un color rojo óxido más fuerte que el control positivo, con el anillo teñido más oscuro, lo que sugiere que AMP ejerció una inducción positiva adicional. En contraste, con el Transwell, la intensidad del color de fondo disminuyó hasta el nivel del control positivo mientras el anillo mantenía el mismo color, lo que sugiere que el Transwell ejerció una influencia negativa sobre el efecto de AMP sobre la inducción.
Los resultados de la cuantificación no fueron adecuados para proporcionar significación estadística y no coincidieron con el análisis visual de la tinción con ARS (Figura 71). Sin embargo, la tendencia general sugirió que el control positivo mostró más mineralización que el control negativo. Además, hubo una tendencia que sugiere una menor OD405 cuando se incluyó Transwell en presencia de AMP e inducción.
Resumen de resultados
La formación del anillo (Figura 69A) fue fácil de observar, presumiblemente porque el tamaño del plato era mayor. Sin embargo, probablemente debido al cambio de fijador, el color de fondo del control negativo fue diferente al del experimento anterior. Además, hubo un cambio de color más dramático entre los controles negativos y positivos, especialmente en el área del anillo (Figura 70). La introducción de un Transwell en el control positivo no afectó a la morfología celular (Figura 69B) ni al color de tinción por ARS (Figura 70).
Sin inducción, AMP sin Transwell bloqueó claramente la tinción con ARS positiva (figura 70) y AMP con Transwell mostró el mismo color que el control negativo. El AMP en sí mismo no causa ARS inespecífico y no causa ninguna inducción. Con la inducción, AMP sin Transwell causó más color que el control positivo. Por el contrario, AMP con Transwell pareció producir el mismo color que el control positivo.
Los resultados de cuantificación de ARS anteriores mostraron AMP de 125 pg/ml que promueve 3 veces más mineralización que el control positivo (p <0.05) (Figura 67), pero no es así en la Figura 71.
No hubo diferencia en la morfología celular entre las células tratadas directamente con AMP y las células tratadas con AMP a través de Transwells (Fig. 69A, 69B). Ambos grupos de células desarrollaron la formación de anillos y la observación visual no mostró diferencias perceptibles entre las estructuras de los anillos. La tinción con ARS mostró una diferencia insignificante en el color de fondo entre los dos grupos experimentales. Sin embargo, las células tratadas directamente con AMP mostraron una formación de anillos más difusa, lo que podría ser un efecto de dispersión de las partículas de AMP (Figura 70).
AMP no necesita contacto directo con las células MC3T3-E1 para afectar la mineralización. Aunque no estaba claro a partir de este experimento, el AMP promueve la mineralización, se ha demostrado que el AMP no afecta la morfología celular o la viabilidad celular (Figura 69).
Parte B
Nuestros resultados mostraron que 125 pg/ml de AMP aumentaron significativamente la mineralización de las células MC3T3-E1 (Figura 65) en comparación con el control positivo el Día 15 de crecimiento y diferenciación. El AMP se administró directamente en medio de cultivo y las partículas de AMP se asentaron en la parte superior de la monocapa celular; por lo tanto, el efecto de AMP en el Objetivo 1B requirió contacto directo.
En la Parte A, se buscó investigar si el efecto de AMP es actuando como un andamio para las células diferenciadoras MC3T3-E1 o si se liberan factores de las partículas para promover la mineralización. Sin embargo, el tamaño pequeño de la muestra y los errores técnicos en la extracción de tinción con ARS con ácido acético al 10% afectaron los datos y no se encontró significación estadística. El experimento se repitió usando los métodos técnicos mejorados de tinción y extracción con ARS desarrollados en el Ejemplo 38 con guanidina HCl 4M.
Diseño experimental:
Se sembraron células MC3T3-E1 a 3 x 104 células/cm2/pocillo en 24 pocillos con medio aMEM más FBS al 10% como se describió anteriormente. Tras la confluencia, se indujo la diferenciación de las células mediante la adición de ácido ascórbico, p- glicerolfosfato, melatonina. Para cada condición, se probó N= 3. El Día 0 se contó como el Día de la siembra de células y la inducción siguió después de la confluencia celular. Tiempo total de inducción= 15 días. Había dos grupos experimentales: AMP añadido directamente al medio de inducción y AMP suministrado a través de Transwell. La concentración de AMP se mantuvo igual que antes a 125 pg/ml. Se añadió un control negativo (sin inducción) con o sin AMP, pero sin inserto. La tinción y cuantificación de ARS el Día 15 de inducción se realizaron como se describe anteriormente.
Resultados
Sin medio de inducción, las células de control negativo mantuvieron formas hexagonales con algunas formas fusiformes (Figura 72A). No se observaron formas de husillo y no se formó ningún anillo de husillo a lo largo de la periferia. ARS tiñó la monocapa de un color rosa claro. Con la inducción, las células de control positivo alcanzaron formas como de husillo. Los bordes de las células eran más prominentes y elevados; un anillo de husillo formado a lo largo de la periferia cerca del borde del pocillo. El centro de la monocapa se tiñó de un color granate y la tinción con ARS se concentró en el anillo de husillo con un intenso color rojo carmesí. El tratamiento con AMP provocó directamente que las partículas de AMP se depositaran en la monocapa y oscureció la morfología de las células. Sin embargo, cerca del borde del pocillo de cultivo, los espacios entre las partículas de AMP mostraron la falta de una monocapa prominente debajo en ambos grupos. No hubo diferencia en la morfología celular entre el tratamiento con AMP solo y el tratamiento con AMP con inducción. Las células que eran visibles tenían forma de husillo. No se observó ningún anillo de husillo como el control positivo. La tinción con ARS mostró una tinción color rojo carmesí en el centro con tinción marrón rojiza a lo largo de la periferia. El color y los patrones de tinción fueron indistinguibles entre los grupos de inducción y sin inducción. El tratamiento con AMP a través de un Transwell no produjo un asentamiento de partículas de AMP en la monocapa. Las células eran alargadas y en forma de husillo, con formación de anillos de husillo a lo largo del borde del pocillo. Al igual que el control positivo, el centro de la monocapa se tiñó de un color granate y el tinte ARS se concentró en el anillo de husillo con un intenso color rojo carmesí. GnHCl extrajo con éxito el colorante ARS y el coeficiente de variación en los valores de OD450 varió del 2% al 15% (Figura 72B).
Resumen de resultados
Morfología/tinción con ARS
El control negativo cultivado en a-MEM con 10% de FBS durante 21 días no desarrolló células similares a husillos o un anillo de husillo a lo largo del borde. El control positivo, después de 20 días de inducción con AA, p-glicerofosfato y melatonina, las células MC3T3-E1 desarrollaron células similares a husillos y un anillo de husillo alrededor del borde del pocillo (Figura 72). El color del ARS y el patrón de tinción de la monocapa celular fueron diferentes entre los controles negativos y positivos. La monocapa de control negativo no logró recolectar tanto colorante como el control positivo y mostró un color rosa claro uniforme. El centro de la monocapa de control positivo se tiñó de un color granate y el colorante ARS se concentró en el anillo de husillo en un color carmesí intenso (Figura 72).
El tratamiento con AMP directamente en medio de cultivo oscureció la observación de la monocapa celular en AMP y AMP con grupos de inducción debido al asentamiento de partículas de AMP. Sin embargo, no se observaron anillos de husillo a lo largo del borde del pocillo y algunas células a lo largo del borde mostraron una morfología similar a husillo. Las aberturas a través de las partículas de AMP mostraron una falta de monocapa debajo. La tinción con ARS no mostró diferencias de color o patrón entre el grupo de AMP solo y el grupo de AMP con inducción.
El tratamiento con AMP a través de Transwells no produjo partículas de AMP en la parte superior de la monocapa. La morfología celular fue similar a la del control positivo, con células similares a husillos y formación de anillos de husillo. El color y el patrón de tinción con ARS también se parecían al control positivo, con la tinción de la monocapa de fondo de color granate y la tinción de ARS concentrándose en los anillos de husillo en un color rojo carmesí. Cuantificación de ARS
El GnHCl fue necesario y suficiente para extraer la tinción con ARS de la monocapa. Comparando los controles, hubo un aumento estadísticamente significativo de 2 veces en la OD450 desde el control negativo al control positivo (p <0.01). Además, hubo un aumento de aproximadamente 6 veces en la OD del control negativo/positivo y la inducción de AMP+. Hay un aumento de 6.5x en el área de superficie de 96 pocillos a 24 pocillos, y esto podría explicar el aumento de la OD. También se realizó la tinción y cuantificación de ARS en D20 de cultivo, lo que aumentó el período de cultivo en 2 días y también podría haber aumentado la mineralización.
El AMP solo indujo un aumento estadísticamente significativo de 10 veces (p <0.01) y de 3 veces (p <0.01) en los valores de OD450 de los controles negativos y positivos, respectivamente. Por lo tanto, el AMP solo fue suficiente para inducir y promover la diferenciación. El AMP con inducción disminuyó ligeramente la OD450 del AMP solo (p <0.05), pero mostró un aumento de 3 veces en la OD del control positivo (p <0.01). El medio de inducción dificultó la diferenciación y mineralización.
El AMP administrado a través de Transwells con inducción mostró una OD 3 veces menor que el AMP administrado directamente con inducción (p <0.01), y mostró una OD ligeramente más baja que el control positivo (p <0.05). AMP requiere contacto directo para promover la diferenciación. Sin contacto directo, AMP inhibe la mineralización de MC3T3-E1.
Ejemplo 40: Efecto de AMP sobre la inducción de osteogénesis en MSCs
Nuestros resultados han demostrado que AMP promueve la diferenciación de MC3T3-E1 cuando está en contacto con los preosteoblastos. Sin embargo, no estaba claro cómo AMP afecta el crecimiento y la diferenciación de las líneas celulares menos diferenciadas y menos comprometidas con el linaje osteoblástico, tal como las células madre mesenquimales (MSCs).
Las células MC3T3-E1 son preosteoblastos, unipotentes y, por lo tanto, solo requieren suplementos para impulsar su diferenciación hacia los osteoblastos. Otras líneas de células progenitoras, tales como las células madre embrionarias (ESCs) o las células madre mesenquimales (MSCs), están menos diferenciadas y son oligopotentes y pluripotentes, respectivamente. Por lo tanto, al estudiar el efecto de AMP en MSCs derivadas de diferentes áreas del cuerpo humano, podemos comprender mejor el papel de AMP en la programación de diferenciación de osteoblastos y los factores involucrados. Esta investigación nos permitiría delimitar a qué tipos de células puede afectar el AMP y qué efectos tiene sobre la inducción de la osteogénesis en diferentes células progenitoras.
Diseño experimental
Se utilizaron las siguientes líneas celulares: MC3T3-E1 (ATCC, Manassas, VA), células madre mesenquimales derivadas de células de la médula ósea humana (Lonza, Wlakerfield, MD), células del nicho limbal (Tissue Tech, Miami, FL), membrana amniótica humana (hAM) células estromales (Tissue Tech, Miami, FL) y células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC) (ATCC, Manassas, VA).
Las células se sembraron a 3 x 104 células/cm2/pocillo en medio aMEM más FBS al 10% en placas de cultivo de plástico de 96 pocillos. Tras la confluencia, las células se indujeron a la diferenciación de osteoblastos mediante la adición de ácido ascórbico, p-glicerolfosfato y melatonina (AGM). Para cada condición, se probó N= 5. Tiempo total de inducción= 20 días. El Día 0 se contó como el Día de la siembra de células y la inducción siguió después de la confluencia celular. Cada tipo de célula tenía 3 grupos experimentales: control negativo, control positivo y tratamiento con AMP solamente. Para el tratamiento con AMP, se utilizó una concentración de AMP de 125 pg/ml. El medio (100 pl) se cambió cada 3 días por un tiempo de cultivo de 20 días. Se añadió un control negativo con AMP (sin inducción ni células). La tinción y la cuantificación de ARS se realizaron como se describió anteriormente en D20. Los extractos se leyeron entonces a 450 nm.
Resultados
Las células HUVEC formaron un patrón de crecimiento celular en forma de red el Día 4 (figura 74A). Sin embargo, hubo una muerte celular significativa con células muertas asentadas en la parte superior de la red de células hasta el Día 21. La mayoría de las células HUVEC no se pudieron fijar con paraformaldehído al 10% y las pocas células teñidas con ARS mostraron un color marrón oscuro. Aunque el AMP se depositó en la parte superior de las células HUVEC y cubrió la red de células, las partículas de AMP se desprendieron del pocillo de plástico con las células tras la tinción con ARS; las pocas partículas de AMP restantes también se tiñeron de un color marrón oscuro.
Las MSC de hBM, sin inducción, mantuvieron una forma fibroblástica larga (Figura 74A). Con la inducción, las MSC se alargaron con bordes celulares más elevados para el Día 4. Para el Día 10, las MSC inducidas desarrollaron células similares a husillos y las células crecieron en capas superpuestas entre sí en la monocapa. El Día 17, las células de husillo superpuestas formaron un anillo denso aproximadamente a 5 mm del centro del pocillo. La tinción con ARS mostró que la monocapa de MSC no inducida se tiñó de un color crema y el anillo de husillo se tiñó de un color rojo anaranjado. Las MSC tratadas con AMP contenían partículas de AMP que cubrían la monocapa. Con el tiempo, la monocapa se retrajo alrededor de áreas concentradas de partículas de AMP. La tinción con ARS mostró un color marrón rojizo intenso.
Las células madre del estroma hAM, sin inducción, mantuvieron una forma rectangular (Figura 74A). Para el Día 4, con la inducción, la morfología celular cambió y las células se alargaron con algunas formas fusiformes en desarrollo. Las partículas de AMP se asentaron y cubrieron parte de la monocapa para el Día 4 en las células de estroma tratadas con AMP. Las células no cubiertas por partículas de AMP en el Día 4 tenían forma rectangular. El Día 17, las células no cubiertas por partículas de a Mp se alargaron de forma similar a las células inducidas en el control positivo. El Día 21, las partículas de AMP cubrieron el pocillo y no se pudo observar la morfología celular. La tinción con ARS mostró que las células no inducidas se tiñeron de un color crema, mientras que las células inducidas se tiñeron de un color rosa claro. Las células tratadas con AMP se tiñeron de un color marrón rojizo intenso similar a las MSC de hBM tratadas con AMP.
El extracto con GnHCl 4 M dio como resultado el coeficiente de variación en los valores de OD450 comprendidos entre 2% y 15% (Figura 74B).
Resumen de resultados
Los resultados indicaron que no se observó mineralización en el control negativo de HUVEC bien sea con agente inductivo o AMP. Tanto para las células madre del estroma hBM MSC como para las hAM, la mineralización fue promovida por el agente inductivo, que fue menor que la promovida por AMP.
Ejemplo 41: Efecto del AMP sobre la mineralización y la proliferación celular durante la diferenciación de MC3T3-E1
Las células MC3T3-E1 pasan por tres etapas principales antes de convertirse en un osteoblasto maduro: proliferación, deposición/maduración de la matriz y mineralización (Figura 75). Nuestros resultados han demostrado que AMP promueve la mineralización en las células MC3T3-E1. Al observar la tinción con ARS, muestra que las células tratadas con AMP se tiñeron de una forma más oscura y más densa (Figura 72) que los controles positivo y negativo. Además, había una falta de monocapa debajo de las partículas de AMP (Figura 77) cuando las partículas de AMP cubrían la monocapa. Una posibilidad era que AMP estuviera actuando como un andamio para las células MC3T3-E1 y esta interacción en la matriz 3D permitió que las células crecieran y se mineralizaran. Por lo tanto, AMP puede estar promoviendo la mineralización aumentando la proliferación de células MC3T3-E1.
Diseño experimental
Se sembraron células MC3T3-E1 a 3 x 104 células/cm2/pocillo en 24 pocillos con medio aMEM más FBS al 10% como se describió anteriormente. Tras la confluencia, se indujo la diferenciación de las células mediante la adición de ácido ascórbico, p-glicerolfosfato, melatonina. Para cada condición, se probó N= 3. El Día 1 se contó como el Día de la siembra celular, y la inducción siguió después de la confluencia celular. Tiempo total de inducción= 20 días. Se muestrearon cuatro puntos de tiempo: D1, D2, D7, D10, D13, D20. Cada punto de tiempo tenía cuatro grupos: control negativo, control positivo, solo tratamiento con AMP, AMP+ (con inducción). La concentración de AMP empleada fue de 125 pg/ml.
Para el ensayo de proliferación medido por el ensayo MTT, el período de cultivo fue de 9 días para la proliferación.
Se muestrearon 4 puntos de tiempo: D1, D2, D4 y D9. Cada punto de tiempo tenía 3 grupos: solo células, solo AMP, células AMP+. La concentración de AMP empleada fue de 125 pg/ml.
Resultados
Mineralización
El Día 1, las células se sembraron durante 24 horas y no se trataron con medio de inducción o AMP (Figura 76). Las células eran redondas y parecen más elevadas en la monocapa. La tinción con ARS mostró un color beige claro con poca o ninguna mineralización. El Día 2, sin inducción, las células de control negativo se volvieron hexagonales. ARS tiñó la monocapa de un color melocotón claro. Con la inducción, las células de control positivo parecían idénticas al control negativo con poca mineralización y tinción con ARS de un color melocotón claro. El tratamiento con AMP provocó un cambio en la morfología de las células MC3T3-E1 y se observaron células fusiformes y células en forma de husillo. La tinción con ARS mostró un aumento en la mineralización desde el Día 1 y la monocapa se tiñó de un color rosa claro. Sin embargo, el área donde se asentaron las partículas de AMP se tiñó de un color marrón rojizo. El tratamiento con AMP con inducción también cambió parte de la morfología celular. Estuvieron presentes células de forma fusiforme y la monocapa también se tiñó de un color rosa claro con áreas alrededor de las partículas de AMP teñidas de color marrón rojizo. El Día 7, las células de control negativo parecían más hexagonales y los límites de las células están más definidos. Hay un aumento de mineralización y la monocapa se tiñe de un color beige claro. El control positivo, con inducción, desarrolló células en forma de husillo y anillos de husillo. El ARS también tiñó un color rosa intenso con más mineralización. El tratamiento con AMP y AMP con inducción hizo que las partículas de AMP se sedimentaran y no se pudiera ver la morfología celular. No se pudo ver una monocapa celular con células individuales. ARS mostró áreas alrededor de las partículas de AMP que se tiñeron de un color marrón rojizo y la monocapa se tiñó de un color rosa claro. GnHCl extrajo con éxito el tinte ARS y el coeficiente de variación en los valores de OD450 varió del 6% al 16%.
Resumen de resultados
Las células MC3T3-E1 de control negativo muestran un aumento en la tinción con ARS y, por lo tanto, la mineralización con el aumento del cultivo celular después del Día 2 (Figura 76). De manera similar a los resultados anteriores, las células MC3T3-E1 de control positivo cultivadas con medio de inducción experimentaron un cambio de morfología celular y desarrollaron células de forma fusiforme y anillos de husillo el Día 7 (Figura 76). Después de 1 Día de tratamiento con AMP (D2), con o sin inducción, se pudo observar un cambio en la morfología celular. Las células adquieren forma de husillo e incluso de fibroblasto (Figura 76A). Este cambio no se observó en el control positivo o negativo. Además, este cambio se observó en células MC3T3-E1 inducidas después de al menos 4 días de cultivo (Figura 76A).
Las células tratadas con AMP y con AMP tratadas con inducción mostraron un aumento estadísticamente significativo en la mineralización del control positivo en el Día 2, como se muestra mediante la cuantificación de ARS (Figura 76B). La monocapa se tiñó de un color rosa claro, pero las áreas pequeñas donde se asentaron las partículas de AMP mostraron una mineralización incrementada y se tiñeron de un color marrón rojizo intenso (Figura 76A). Este aumento en la mineralización continuó durante todo el período de cultivo.
No hubo un aumento en la promoción de la mineralización con AMP solo en comparación con AMP con tratamiento de inducción.
Proliferación
Para determinar si el AMP promovió la mineralización mediante la promoción de la proliferación celular, se sembraron células MC3T3-E1 a 3 x 104 células/cm2/pocillo en 96 pocillos con medio aMEM más FBS al 10%. Tras la confluencia, el grupo de AMP se trató con 125 pg/ml de AMP nuevo añadido cada 3 días en el medio de cultivo. El ensayo MTT se realizó los Días 1, 2 y 4, mientras que el ensayo BrdU se realizó los Días 1, 2 y 16.
En las células MC3T3-E1 no tratadas, la viabilidad celular aumenta desde el Día 1 hasta el Día 4 (figura 77A). En las células tratadas con AMP, la viabilidad celular disminuyó el Día 2 y luego más del doble el Día 4, siguiendo la tendencia del grupo de solo células. El ensayo de BrdU mostró una disminución en la proliferación celular después del Día 1 tanto en el grupo de células solamente como en el grupo de células tratadas con AMP (Figura 77B). La proliferación celular en el grupo de solo células disminuyó en más de la mitad el Día 2 y continuó disminuyendo el Día 16. En las células tratadas con AMP, la proliferación celular mostró una disminución estadísticamente significativa solo el Día 16. Estos hallazgos sugieren que el AMP no promovió la proliferación durante el período de cultivo de 16 días.
Resumen de resultados
La viabilidad celular aumentó en las células MC3T3-E1 desde el Día 1 hasta el Día 4, como se muestra a través del ensayo MTT. Las células MC3T3-E1 tratadas con AMP mostraron una disminución en la viabilidad celular desde el Día 1 hasta el Día 2, pero siguieron una tendencia ascendente como las células no tratadas. Sin embargo, la viabilidad celular el Día 4 en las células tratadas con AMP fue aproximadamente la mitad de las células MC3T3-E1 sin tratar. La proliferación celular, medida a través de BrdU, disminuyó desde el Día 1 hasta el Día 16. A diferencia de las células tratadas con AMP, la proliferación celular disminuyó en más de la mitad el Día 2 en las células MC3T3-E1 no tratadas. El Día 16, las células MC3T3-E1 tratadas con AMP y las no tratadas exhibieron los mismos niveles de proliferación celular.
Ejemplo 42: Identificación de genes expresados durante las etapas tempranas de la osteogénesis en MSC MC3T3-E1 y hBM tratadas con AMP.
Las células madre mesenquimales de la médula ósea humana (hBMMSC) son multipotentes y pueden diferenciarse en múltiples tipos de tejidos tales como osteoblastos, condrocitos y adipocitos (Born, 2012 J Cell Biochem. 113 (1): 313-21.). Cuando se trasplantan in vivo, son capaces de formar hueso nuevo e in vitro, las MSC hBM pueden dirigirse hacia la osteogénesis cultivando en p-glicerofosfato, ácido ascórbico, vitamina D3 y dosis bajas de dexametasona. La osteogénesis de las hBMMSC está regulada por la expresión de genes asociados a osteoblastos, incluidos factores de transcripción específicos, moléculas de adhesión y proteínas de la ECM (Born (2012) J Cell Biochem. 113 (1): 313-21; Vater (2011) Acta Biomater 7 (2): 463-77.). La progresión a osteoblastos maduros refleja la de MC3T3-E1 y ocurre con la pérdida de la capacidad de expansión celular, el aumento de la expresión de marcadores osteogénicos y la mineralización de la ECM (Born (2012) J Cell Biochem. 113 (1): 313- 21). Primero, las células inician la síntesis de ECM con expresión de colágeno I (Col I). Simultáneamente, la expresión de fosfatasa alcalina específica del hueso (bALP) aumenta y para el Día 4, se pudo observar un aumento significativo en los niveles de ALP en las células inducidas (6x104 células/placa de cultivo de 60 mm) del control (Born (2012) J Cell Biochem. 113 (1): 313-21; Jaiswal (1997) J Cell Biochem. 64:295-312). A medida que continúa la diferenciación, las células producen proteínas tales como la proteína sialo ósea (BSP), osteopontina, osteonectina y osteocalcina. Finalmente, la mineralización de la ECM, al igual que la osteogénesis en las células MC3T3-E1, indica un osteoblasto maduro.
En este ejemplo, se determinaron genes y factores de transcripción expresados en las etapas tempranas de la osteogénesis en tres líneas celulares: células MC3T3-E1 y células hBM MSC. Nuestros resultados han demostrado que se pudo ver un aumento estadísticamente significativo en la mineralización en las células MC3T3-E1 tratadas con AMP en comparación con el control positivo el Día 2 (Día 1 de tratamiento). Por lo tanto, el experimento se centró en las primeras etapas de la osteogénesis para identificar el efecto de AMP en genes específicos después del tratamiento.
Diseño experimental
Se sembraron MC3T3-E1 o células MSC de médula ósea humana a 3 x 104 células/cm2/pocillo en placas de 24 pocillos con medio aMEM más FBS al 10% como se describió anteriormente. Tras la confluencia, se indujo la diferenciación de las células mediante la adición de ácido ascórbico y p-glicerolfosfato. Para cada ensayo en cada punto de tiempo, se probó N= 2. Se tomaron muestras de 4 puntos de tiempo: D0 (después de la confluencia, pero antes de la inducción/tratamiento), D1, D2, D4 y D6. Cada punto de tiempo tenía tres grupos: control negativo, control positivo, solo tratamiento con AMP. La concentración de AMP utilizada fue de 125 pg/ml.
Resultados
Expresión de hMSC
El AMP induce una expresión endógena robusta de los transcritos de BMP2 y BMP6 dentro de las 24 horas de cultivo (60 y 5 veces, respectivamente) (Figura 78A). BMP2 alcanzó su pico en D1 (120 pliegues) y mantuvo un nivel alto (entre 60 a 10 pliegues) hasta D4 antes de mostrar una disminución. Por el contrario, BMP6 alcanzó su pico a las 4 h y luego mostró una disminución gradual desde D1 en adelante. Como comparación, AMP no cambió el nivel de expresión de BMP4, BMP7 y BMP9. No obstante, AG indujo una leve sobrerregulación de BMP2 y BMP6 (1-2 veces) sólo en D4 y una notable sobrerregulación de BMP4 (4-10 veces) después de D1. Como comparación, AGM tampoco cambió la expresión de BMP7 y BMP9.
Runx2 alcanzó su pico en D1 para AMP pero D2 para AGM (Figura 78A). Ambos grupos tuvieron entonces una disminución gradual seguida de otro pico en el Día 6. Runx2 induce la diferenciación de células mesenquimales multipotentes en osteoblastos inmaduros, dirigiendo la formación de hueso inmaduro. Además, Runx2 desencadena la expresión de los principales genes de la matriz ósea durante las etapas tempranas de la diferenciación de los osteoblastos, pero Runx2 no es esencial para el mantenimiento de estas expresiones génicas en osteoblastos maduros (Komori (2010) Adv Exp Med Biol.658:43-9).
Tanto ALP como Sox9 alcanzaron su pico en D4, siendo el nivel sobrerregulado por AMP menor que AGM (Figura 78A). Esta tendencia concuerda con la opinión de que ALP y Sox9 están corriente debajo de Runx2. La ALP se expresa en la fase temprana de la osteogénesis y crea un ambiente alcalino que hace que el calcio salga de la solución y cristalice.
El AMP sobrerreguló el VEGF que alcanzó su pico a las 4 h y D4, pero AGM sobrerreguló el VEGF sólo en D4 (Figura 78A). AMP sobrerregulo CXCR4 mientras que AGM sobrerreguló SDF1 en D1, con un rápido descenso para el primero pero más lento para el segundo. Kortesidis et al. ((2005) Blood. 105 (10): 3793-801) sugieren que SDF-1 puede actuar para localizar poblaciones primitivas de BMSSC no comprometidas dentro de su nicho perivascular hasta que se requiera que proliferen y se diferencien en respuesta a señales ambientales que pueden actuar para interrumpir interacciones de SDF-1/CXCR4. En 7 experimentos de preacondicionamiento de MSCs, la expresión de CXCR4 normalmente aumenta de 2 a 4 veces Cencioni et al. ((2012) Cardiovasc Res.94 (3): 400-7) sin embargo, nuestros resultados con AMP mostraron un aumento de 60 veces después del Día 1.
La expresión de SDF-1 fue muy alta en todos los grupos de las MSC, aunque no lo parece en la Figura 78A. Se observó SDF-1 alrededor del Ciclo 20, mientras que GAPDH se observó alrededor del Ciclo 17. Según la literatura, se sabe que el factor 1 derivado de células estromales activa moléculas de adhesión en células progenitoras, y mAb contra s DF-1 inhibe la migración transendotelial de células progenitoras hematopoyéticas (Imai et al. (1999) Blood 93 (1): 149-56). SDF-1 activa las células CXCR4+/CD34+ y conduce a su adhesión y migración transendotelial (Bhakta et al. (2006) Cardiovasc Revasc Med. 7:19-24.). La expresión de GAPDH sí aumentó en el grupo AMP desde el Día 2 al Día 6, por lo que se supondría proliferación. Esta tendencia no se observó en las otras muestras. Además, BMP9 no fue detectable (después del Ciclo 40), CXCR4 se detectó alrededor del Ciclo 33, VEGF se detectó alrededor del Ciclo 19 y SOX-9 se detectó alrededor del Ciclo 27. BMP4 se detectó alrededor del Ciclo 28, BMP7 no se detectó (después del Ciclo 40), BMP2 se detectó alrededor del Ciclo 20, Runx2 se detectó alrededor del Ciclo 25, BMP6 se detectó alrededor del Ciclo 27 y ALPL se detectó alrededor del Ciclo 24.
Expresión de MC3T3-E1
Se sabe que las MSC son multipotentes, ya que los osteoprogenitores ya están más abajo en la ruta del linaje y solo deberían producir formación de hueso. Al contrario de lo que se esperaba, la expresión de BMP2 apenas se expresó en células de ratón, especialmente en comparación con las MSC humanas (Figura 79). Se ha demostrado que las BMP son ineficaces para promover la osteogénesis en humanos, pero son más que capaces en células de ratón (Osyzka et al. (2004) Cells Tissues Organs. 176 (1-3): 109-19., Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res.52 (5): 408-14). La expresión de BMP-2 no es prominente en células MC3T3 como lo indica la matriz de genes (Beck et al. (2001) Cell Growth & Differentiation 12:61-83). Las diferencias observadas entre las células humanas y de roedores pueden indicar que, a diferencia de Smad1 en las células humanas, el Smad1 de roedor no sufre la fosforilación del enlazador ERK durante la osteogénesis. Alternativamente, la actividad de Smad1 en células de roedores puede no ser suprimida por la fosforilación del enlazador mediada por ERK (Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res. 52 (5): 408-14). La osteogénesis inducida por BMP en m Sc humanas con poca respuesta requiere la modulación (inhibición) de las rutas ERK y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-K); La inhibición de la ruta PI3-K/AKT activada por insulina/IGF-I disminuye la expresión de fosfatasa alcalina y osteopontina inducida por BMP en cultivos libres de suero de MSC humana, pero aumenta la activación de BMP de Smads (Osyzka et al. (2005) Endocrinology.2005 (8): 3428-37).
Runx2 también mostró ser diferente en las células MC3T3 en comparación con las hMSC. Claramente, hay un incidente en el Día 2 que causa una sobrerregulación de genes en las células MC3T3. Los grupos AGM parecían tener efectos opuestos a los del grupo AMP, que puede estar relacionado con las rutas Pi3K, mAp K. Ibsp, también conocida como sialproteína ósea (BSP), se sibrerregula el Día 2 en AMP pero no se expresa en otras ocasiones. En el grupo positivo, BSP se expresa mucho después del Día 2.
Bglap-rs1, también conocido como osteocalcina (OCN), también se sobrerregula el Día 2 en AMP, pero no se expresa en ningún otro lugar. De acuerdo con BSP, OC se expresa altamente después del Día 2 en el grupo positivo. A través del análisis de estos resultados, uno pensaría que BSP y OCN deben sobrerregularse, ya que se sabe que se expresan por osteoblastos maduros. Runx2 regula la expresión de Coll, BSP y OCN en MC3T3, lo cual es consistente con nuestros resultados. Runx2 aumenta el Día 2, al igual que BSP y OCN, y no se expresa en ningún otro lugar. En resumen, el AMP subregula la expresión de genes osteogénicos pero promueve la mineralización.
Ejemplo 43: Efecto de nHC-HA/PTX3 purificado a partir de AM sobre la mineralización usando el sistema modelo MC3T3-E1.
Experimentos anteriores han demostrado claramente las propiedades únicas de AMP para promover la mineralización independientemente de los agentes inductores tales como el ácido ascórbico, el fosfato de p-glicerol y la melatonina (AGM). En estos experimentos, se añadió AMP a la línea celular progenitora de osteoblastos murinos (MC3T3) en presencia o ausencia de AGM para determinar la potencia del AMP. La tinción con rojo de Alizarina con el método de extracción de GnHCl también se utilizó en múltiples puntos de tiempo para una cuantificación adicional. Se concluyó que AMP no solo potenció la mineralización independiente de Ag M, sino que también potenció la mineralización a un ritmo más rápido. Una investigación adicional de AMP mostró que el efecto osteoinductivo exhibido por AMP requiere contacto celular directo. Es decir, bajo contacto directo con AMP, las células habrán acelerado y potenciado la mineralización sin la introducción de AGM.
Estudios anteriores demostraron que la diferenciación de MC3T3-E1 bajo inducción se puede subdividir en tres etapas, es decir, proliferación (Día 1 a 9), formación de ECM (Día 9 a Día 16) y mineralización (depósito de minerales en ECM formado) (Día 16+) (Quarles et al. (1992) J Bone Miner Res. 7 (6): 683-92; Hong et al. (2010) Exp Cell Res. 316 (14): 2291-300). Sin embargo, nuestro Objetivo 4 anterior ha demostrado que la mineralización se puede detectar fácilmente dentro de 7 a 10 días usando AMP. Por lo tanto, se realizó el ensayo ARS el Día 8 para determinar si nHC-HA/PTXS purificado de AM es responsable de promover la mineralización. Se eligió el Día 8 porque los resultados deberían ser notables como se ve en el Objetivo 4 y los medios solo tendrán que reemplazarse el Día 0, el Día 3 y el Día 6.
Ya se sabe que nHC-HA/PTX3 es responsable de las conocidas acciones terapéuticas antiinflamatorias, antiangiogénicas y anti-cicatrices de la membrana amniótica. Nuestra hipótesis es que e1HC-HC/PTX3 inmovilizado es responsable del efecto de AMP en la promoción de la mineralización. Debido a que también contiene HA, también compararemos nHC-HA/PTX3 con HA para ver que el efecto putativo está presente únicamente en nHC-HA/PTX3 pero no en HA. El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que coniste en una única unidad de disacárido repetida. Es un componente importante en el tejido conectivo que promueve el ensamblaje de la matriz y la hidratación del tejido. Luben et al especularon que el Ha actúa como un agente de unión al calcio para actuar como una barrera para la difusión de enzimas fuera del sitio de resopción o para regular la movilidad de los osteoclastos. Stern y Raisz afirmaron que "el ácido hialurónico parece ser el más apropiado para estudiar porque se ha relacionado claramente con la reabsorción ósea. Por la naturaleza de sus propiedades higroscópicas, e1HA puede ocupar 10,000 veces su propio volumen. Por lo tanto, el HA permite que las células en proliferación eviten los contactos de inhibición. La síntesis de ácido hialurónico precede a la mitosis y disocia la célula en división de su sustrato, permitiendo el movimiento celular (Balazs (2001) Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 280: R466-R472).
Diseño experimental:
Las células murinas MC3T3-E1 (C-136) se tomaron del congelador de nitrógeno líquido y se cultivaron en un plato de 100 mm (cinco platos) en medio aMEM (10 ml por plato de 100 mm) más FBS al 10% cambiado cada 3 días hasta una confluencia del 80% ~1.5 x 106 células [4*(3.1x104)*9 = 1,116.000 células]. A continuación, las células se sembraron a 3.1 x 104 células/cm2/96 pocillos de plástico. El medio (100 ul por 96 pocillos) se reemplazó cada 2-3 días, es decir, los días 0 (miércoles), 2 (viernes) y 5 (lunes) y los cultivos se interrumpirán el Día 8. Se analizaron N= 4 por condición.
Un resumen de los Grupos fue el siguiente:
Grupos de control:
Control negativo: nada en la placa convencional de 96 pocillos
Control positivo 1: AGM en placa convencional de 96 pocillos
Control positivo 2: 125 pg/ml de AMP añadidos cada 3 días en una placa convencional de 96 pocillos
Grupos experimentales:
Control negativo: placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 1: AGM añadido cada 3 días añadido a la placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 2: 20 pg/ml de HA inmovilizado en placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 3: 20 pg/ml de HA inmovilizado en placa de 96 pocillos Covalink-NH con AGM añadido cada 3 días (H-124)
Grupo experimental 4: 20 pg/ml de nHC-HC/PTX3 inmovilizados en 96 pocillos de Covalink-NH
Grupo experimental 5: 20 pg/ml de nHC-HC/PTX3 inmovilizados en una placa de 96 pocillos Covalink-NH con AGM añadido cada 3 días
Para los grupos AGM: En los días 0 y 3, se reemplazó el medio # 1 de inducción de osteogénesis (ácido ascórbico, p-glicerolfosfato). El Día 6, se reemplazó el medio # 2 de inducción de osteogénesis (ácido ascórbico, pglicerolfosfato, melatonina). El Día 0, solo se prepararon 0.2 ml de medio de inducción 10X. Los días 3 y 6, se prepararon frescos 10 ml del medio de inducción de osteogénesis. Instrucciones para los medios de inducción obtenidos del kit de ensayo de osteogénesis in vitro (Millipore).
Medio de inducción # 1: 9.88 ml de medio aMEM más 10%, 20 pl de 2-fosfato de ácido ascórbico 500X (Millipore, Part. 2004011), 100 pl de 2-Fosfato de glicerol 100X (Millipore, Part. 2004011).
Medio de inducción # 2: 9.87 ml de medio aMEM más 10%, 20 pl de 2-fosfato de ácido ascórbico 500X (Millipore, Part. 2004011), 100 pl de 2-fosfato de glicerol 100 X (Millipore, Part. 2004011), 10 pl de melatonina 50 pM (Millipore, Parte 2004011). Agregar 500 ul de dH20 a 6 ug de melantonina suministrada.
La tinción y cuantificación de ARS se realizó como se describe anteriormente. Las fotografías se tomaron a 10X usando Nikon Eclipse CFI60.
Resultados
Las células MC3T3-E1 se cultivaron en diferentes placas de pocillos durante 8 días. El Día 8, se tomaron imágenes de contraste de fase de los pocillos y se pueden ver a continuación (Figuras 79A, 79B). Los pocillos de control negativo mostraron células redondas y el ARS se tiñó de un color rosa muy claro. Los pocillos con medio de inducción mostraron un color rojo mucho más brillante y se observaron células en husillo en la periferia de los pocillos. La tinción con ARS se observó más en abundancia en el anillo periférico exterior. El tratamiento con AMP mostró un color rojo carmesí después del tratamiento con ARS y las células eran bastante difíciles de ver porque el AMP se asentaba encima de ellas. No se observó agregación durante el experimento (aunque se ha observado agregación con otros tipos de células en HC-HA inmovilizado). Se tomaron fotografías de microscopía los Días 6, 7 y 8.
El Día 8 se utilizó el método de extracción con clorhidrato de guanidina y las placas de pocillos se incubaron durante la noche. GnHCl pudo extraer el tinte ARS, aunque era difícil de decir a simple vista; todos los pocillos parecían tener el mismo color rosa claro/rojo. La extracción de ARS se cuantificó a 450 nm porque el lector de placas no tenía la capacidad de leer a 490 nm o menos. Los resultados se pueden ver en la fIGURA 79C. El símbolo * denota una significancia estadística de p <0.05. (+ denota con AGM, - denota sin AGM)
De acuerdo con los resultados anteriores, AMP pudo promover con éxito la mineralización sin la necesidad de agentes de inducción. Este experimento solo duró 8 días, por lo que los resultados no son tan notables como en el Objetivo 4, que duró 20 días. Todas las condiciones que fueron tratadas con AGM mostraron un aumento en la mineralización de su contraparte de control negativo. Nuestros resultados también muestran que el nHC-HA/PTXS inmovilizado no es responsable de promover la mineralización en AMP. Por lo tanto, debe haber otro componente activo de AMP que promueva la mineralización.
Ejemplo 44: Efecto de HC-HA/PTX3 (PBS) y HC-HA/PTX3 (Gn) sobre la osificación endocondral
Los factores de transcripción maestros para la osteogénesis y la condrogénesis (Runx2 y Sox9, respectivamente) fueron expresados por células en ambas condiciones de HC-HA durante el período de cultivo de 14 días. HC-HA/PTX3, tanto soluble como insoluble, fueron capaces de promover la expresión de BMP2 y hasta cierto punto de BMP6 sin los agentes osteoinductores AGM (es decir, ácido ascórbico, glicerolfosfato, melatonina) suministrados comercialmente (véase más abajo).
El marcador condrogénico Colágeno 2 fue altamente expresado por HC-HA/PTX3 (PBS) sin necesidad de AGM. HC-HA/PTX3 (Gn) con la adición de AGM también fue capaz de sobrerregular el colágeno 2. Los marcadores osteogénicos (BSP, ALPL, Osx) fueron sobrerregulados por las condiciones de HC-HA el Día 14, confirmando así una transición de un cartílago al hueso genotipo.
Diseño experimental:
Condiciones de cultivo: Se tomaron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana adquiridas en Lonza (Basilea, Suiza) de un congelador de nitrógeno líquido y se cultivaron en un plato de 100 mm en el mismo medio cambiado cada 3 días hasta una confluencia del 80%. El medio de cultivo celular era aMEM que contenía suero bovino fetal al 10% y antibióticos. El medio de cultivo (10 ml por plato de 100 mm) se cambió cada 3 días, y las células se subpasaron al 80% de confluencia hasta que alcanzaron los números de células deseables anteriores. Para el experimento, las células se sembraron a 3.1 x 104 células/96 pocillos de plástico en HA, HC-HA (PBS) o HC-HA (Gn) inmovilizados con o sin agentes osteoinductores 2-fosfato de ácido ascórbico, 2-fosfato de glicerol y melatonina (AGM). La concentración final de AGM añadida fue 0.2 mM, 10 mM y 50 nM, respectivamente. Se añadió AGM simultáneamente cuando se sembraron las células (D0) y se extrajo el ARNm en los Días 1, 7 y 14. Para cuantificar la expresión génica, se realizó qPCR. El medio de cultivo (100 ul por 96 pocillos) se reemplazó cada 3 días.
Un resumen de los grupos experimentales fue el siguiente:
Control negativo: placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 1: AGM añadido cada 3 días añadido a la placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 2: 20 pg/ml de HA inmovilizado en placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 3: 20 pg/ml de HA inmovilizado en placa de 96 pocillos Covalink-NH con AGM añadido cada 3 días
Grupo experimental 4: 20 pg/ml de 4X nHC-HC/PTX3 inmovilizados en una placa de 96 pocillos Covalink-NH Grupo experimental 5: 20 pg/ml de 4X nHC-HC/PTX3 inmovilizados en una placa de 96 pocillos Covalink-NH con AGM añadido cada 3 días
Grupo experimental 6: 20 pg/ml de 4X nHC-HC/PTX3 (extracción con GuHCl) inmovilizados en una placa de 96 pocillos Covalink-NH
Grupo experimental 7: 20 pg/ml de 4X nHC-HC/PTX3 (extracción con GuHCl) inmovilizados en una placa de 96 pocillos Covalink-NH con AGM añadido cada 3 días
Para los grupos de inducción de AGM: los Días 0 y 3, el medio # 1 de inducción de osteogénesis (ácido ascórbico, glicerolfosfato) sustituyó al medio. El Día 6, el medio # 2 de inducción de osteogénesis (ácido ascórbico, glicerolfosfato, melatonina) reemplazará al medio. El Día 0, se preparó medio de inducción 10X. Los Días 3 y 6, se prepararon frescos 10 ml del medio de inducción de osteogénesis. Instrucciones para la preparación de medios de inducción obtenidos del kit de ensayo de osteogénesis in vitro (Millipore).
Medio de inducción # 1: 9.88 ml de medio aMEM más 10%, 20 pl de 2-fosfato de ácido ascórbico 500X (Millipore, Part. 2004011), 100 pl de 2-Fosfato de glicerol 100X (Millipore, Part. 2004011)
Medio de inducción # 2: 9.87 ml de medio aMEM más 10%, 20 pl de 2-fosfato de ácido ascórbico 500X (Millipore, Part. 2004011), 100 pl de 2-fosfato de glicerol 100 X (Millipore, Part. 2004011), 10 pl de melatonina 50 pM (Millipore, Parte 2004011). Agfregar 500 ul de dH20 a 6 ug de melantonina suministrada.
Se extrajo ARNm de las células los Días 1, 7 y 14 y se determinó la expresión génica mediante QPCR (Figuras 80A-E). Se ensayaron los siguientes genes: marcadores de osteogénesis Runx2, fosfatasa alcalina (ALPL), marcadores de Colágeno 1 (COL1), osterix (OSX) y sialoproteína ósea (BSP) y marcadores de condrogénesis Sox9 y Colágeno 2 (COL2), marcadores hipertróficos de Colágeno 10 (COL10).) y MMP13. La tinción y cuantificación de ARS se realizó en cultivos del Día 14 como se describió anteriormente (Fig. 81A, 81B).
BMP4 sobrerreguló AGM en plástico. HA sobrerreguló BMP4 (temprano) pero subregulo BMP6 (tarde) y no afectó a BMP2 (Figura 80B). No hay datos de la literatura que sugieran que HA por sí mismo sobrerregule BMP. Sin embargo, la adición de AGM sobrerreguló BMP2 y Bm P6.
HC-HA soluble 4X inicialmente sobrerreguló BMP4, pero subreguló BMP4 tarde (como HA) y sobrerreguló BMP2 marcadamente (como AMP, pero sin la BMP6 transitoria) (figura 80B). Por el contrario, la adición de AGM no cambió el patrón de expresión de las BMP.
HC-HA insoluble 4X inicialmente sobrerreguló BMP4, pero subreguló BMP4 (tarde) (como HA) y sobrerreguló marcadamente a BMP2 (como HCHA soluble) (Figura 80B). [Idéntico a soluble] De manera similar, la adición de AGM no cambió el patrón de expresión.
Nuestros resultados muestran que HC-HA soluble y HC-HA insoluble pudieron formar la diferenciación y mineralización ósea a través de un mecanismo endocondral. La expresión de marcadores óseos (Coll, Osx, ALP y BSP) fue evidente al igual que la expresión de marcadores de condrocitos (Col2) y marcadores de hipertrofia (Col10 MMP13) (Fig. 80A-E). La diferencia entre estas condiciones de HC-HA es que HC-HA insoluble fue capaz de promover una mayor amplitud de expresiones génicas y nódulos óseos más notables (incluso sin AGM), mientras que HC-HA soluble requiere AGM (datos no mostrados). Por lo tanto, HC-HA/PTX3, tanto soluble como insoluble, pudieron promover la expresión de BMP2 sin los agentes osteoinductores AGM.
HA sin AGM también mostró marcadores condrogénicos (COL2) pero también mostró signos de formación ósea con mineralización definida por ARS y un ligero aumento en ALP y OC. Sin embargo, HC-HA/PTX3 (PBS) tuvo mayor expresión condrogénica y mayor expresión de marcadores óseos ALP, Osx y BSP que HA. Sin embargo, ninguna de estas condiciones expresó marcadores hipertróficos significativos. HC-HA/PTX3 (Gn) expresó una expresión mucho mayor de ALP, OSX y BSP que las dos condiciones antes mencionadas. El marcador hipertrófico MMP13 también se expresó como una ligera expresión del marcador condrogénico COL2.
HA más AGM promueve la osteogénesis con una mayor expresión de BMP2, ALP, Osx, BSP y OC y exhibe marcadores hipertróficos COL10 y MMP13. Sin embargo, HA produjo menos expresión de ARNm específico de hueso y formación de nódulos óseos que los grupos HC-HA. Otra diferencia clave fue que HA subreguló SOX9, pero aumentó la expresión de BMP6 tardíamente.
Todos los datos anteriores indican que el HCHA insoluble es el inductor más fuerte de hueso y, lo que es más importante, induce un mecanismo endocondral.
Ejemplo 45. nHC-HA/PTX3 suprime las respuestas inflamatoria e inmunitaria y mejora la supervivencia del aloinjerto corneal murino
Los estudios experimentales y clínicos han demostrado que la membrana amniótica (AM), el extracto de AM y nHC-HA/PTX3 [un complejo covalente formado por la cadena pesada (HC) del inhibidor de inter-a-tripsina (IaI) y el hialuronano (HA)] suprimen respuestas proinflamatorias. Este ejemplo demuestra que nHC-HA/PTX3/PTX3 puede regular las respuestas de las células T y reducir el rechazo del aloinjerto corneal murino.
La activación de las células T puede evaluarse mediante la proliferación y producción de diversas citoquinas (Figura 82). En este caso, se aislaron esplenocitos de ratones OT-II que expresan un TCR transgénico específico para ovoalbúmina (OVA), y se estimularon con OVA hasta 4 días (Figura 83). La proliferación celular se midió mediante marcaje con BrdU y la expresión de citoquinas (IFN-y e IL-2) se midió mediante el ELISA respectivo. nHC-HA/PTX3 pero no HA a 1 mg/ml suprimió significativamente la proliferación (Figura 84) y la producción de IFN-y e IL-2 (Figura 85) en esplenocitos con péptido OVA el Día 2 y el Día 4 (todos p <0.05). Además, las células T corneales se activaron in vivo mediante inyección de LPS.
La optimización de los sitios de inyección, el volumen y la frecuencia con nHC-HA/PTX3 antes o durante la inyección intracorneal de LPS se determinó mediante el influjo de macrófagos positivos para EGFP en las córneas de ratones MAFIA. El régimen de inyección se optimizó además dando 5 pl en cada inyección entre la subconjuntiva y el fornix en los cuatro cuadrantes. El Día 4 después del tratamiento con nHC-HA/pTX3, las córneas se digirieron con 820 unidades/ml de colagenasa a 37°C durante 1 h. Las células EGFP- y EGFP+ se aislaron mediante FACS. El pretratamiento de nHC-HA/PTX3 3 días antes de la inyección de LPS suprimió significativamente el influjo de macrófagos EGFP+ a las córneas con traumatismo con LpS (9.1 ± 0.3 versus 12.3 ± 0.4, nHC-HA/PTX3 verus PBS, p = 0.02) (Figura 86). Es importante destacar que, aunque los macrófagos EGFP+ migraron a las córneas, algunos de ellos se polarizaron en el fenotipo M2 como lo sugiere la sobrerregulación significativa de Arg-1 e IL-10, pero la subregulación de IL-12 (p <0.05) (Figura 87). La expresión de ARNm de Arg-1, IL-10 e IL-12 se midió mediante qPCR. Finalmente, se realizó un trasplante de córnea alogénico utilizando ratones BALB/c de tipo silvestre como receptores y ratones C57BL/6 como donantes, y su resultado se puntuó mediante la claridad del injerto medida dos veces por semana utilizando biomicroscopía con lámpara de hendidura. Los injertos que recibieron dos puntuaciones consecutivas > 3 sin resolución se consideraron rechazados. En comparación con el control de PBS, el rechazo del aloinjerto se suprimió significativamente mediante la inyección de 10 pl de nHC-HA/PTX3 en un cuadrante dos veces por semana (p <0.05) y se redujo además mediante la inyección de 5 pl en 4 cuadrantes dos veces por semana (p <0,002) (Figura 88).
Estos experimentos demuestran que nHC-HA/PTX3 suprime significativamente el rechazo del aloinjerto corneal murino. El mecanismo de esta acción puede estar contribuido por la capacidad de nHC-HA/PTX3 para subregular los macrófagos proinflamatorios y suprimir la respuesta inmune de las células T.
Ejemplo 46: Tratamiento del ojo seco de ratón causado por estrés desecante por nHC-HA/PTX3 y AMP
El ojo seco, también conocido como síndrome lagrimal disfuncional, es una enfermedad común de la superficie ocular con alta prevalencia y morbilidad significativa en todo el mundo. Es una enfermedad inflamatoria de base autoinmune caracterizada por inflamación crónica autorreactiva mediada por células T y disfunción de la unidad de función lagrimal (LFU; córnea, conjuntiva, glándulas lagrimales y glándulas de Meibomio). El síndrome de Sjogren (SS) es un trastorno autoinmunitario crónico prevalente que se caracteriza por la infiltración de las glándulas salivales y lagrimales por células mononucleares, lo que provoca la destrucción secundaria del tejido parenquimatoso.
La queratoconjuntivitis seca (KCS) en SS es una enfermedad epitelial de la superficie ocular grave y potencialmente mortal que se caracteriza por la infiltración de células T CD4+ que producen IL-17 e interferón (IFN)-y. Los compuestos que inhiben la activación de las células T (por ejemplo, ciclosporina A) atenúan la enfermedad del ojo seco tanto en animales como en humanos. Los macrófagos pueden sufrir la activación clásica de M1 (por ejemplo, por ligandos de IFN-y y/o TLR tal como LPS) para expresar altos niveles de citoquinas proinflamatorias (tales como TNF-a, IL-12 e IL23), que activan los linfocitos Th1 y Th17 (Fig 89) que conduce a muchas enfermedades inflamatorias crónicas. Este ejemplo demuestra que la administración de nHC-HA/PTX3 y AMP puede ser útil en el tratamiento de tales afecciones.
La infiltración de macrófagos en las córneas se inhibe con cuatro puntos de inyección para cada ojo.
Los ratones MAFIA permiten el seguimiento in vivo del influjo de macrófagos a medida que se marcan con EGFP. Estos ratones se utilizaron para determinar si nHC-HA/PTX3 o AMP previenen la entrada de macrófagos inducida por LPS a la córnea, un modelo de queratitis. Se inyectó LPS entre la subconjuntiva y el fornix a un volumen adecuado de 5 pl o menos en cada lugar de inyección. Los ojos de los ratones MAFIA (los macrófagos son EGFP+) se inyectaron intraestrómicamente con LPS (5 pg por ojo). En cada ojo, la OS se trató con PBS (2 o 4 sitios de inyección) mientras que la OD se trató una vez con nHC-HA/PTX3 (2 o 4 sitios de inyección; 5 pl de 1 mg/ml de HA en nHC-HA/PTX3 por sitio de inyección) o AMP (2 o 4 sitios de inyección; 5 pl de proteína 10 mg/ml en AMP por lugar de inyección). El tratamiento fue inmediatamente después de la inyección de LPS. Se tomaron imágenes de córneas completas con microscopía intravital in vivo el Día 1, el Día 2, el Día 3 y el Día 6. Se contaron las células positivas a EGFP basándose en la intensidad de la fluorescencia verde.
En el Día 1, se detectan macrófagos positivos para EGFP en el área más periférica de la córnea después de la inyección de LPS con tratamiento con PBS. El tratamiento bien sea con nHC-HA/PTX3 o AMP no aumentó ni disminuyó significativamente los macrófagos en las córneas.
En el Día 2, los macrófagos en las córneas con tratamiento con PBS aumentaron significativamente (p <0.05) desde el Día 1, al igual que con el tratamiento de nHC-HA/PTX3 (2 y 4 sitios de inyección, p <0.05) y de a Mp (2 y 4 sitios de inyección, p <0.05). Específicamente, se infiltraron más macrófagos en las córneas tratadas con 2 inyecciones de nHC-HA/PTX3 que aquellos con tratamiento con PBS (p> 0.05), pero menos en las córneas con 4 inyecciones de nHC-HA/PTX3 (p> 0.05). Para el tratamiento con AMP, 2 inyecciones no tuvieron un efecto significativo, pero 4 inyecciones disminuyeron ligeramente la infiltración de macrófagos, lo que sugiere que se necesitan 4 inyecciones bien sea de nHC-HA/PTX3 o AMP para cada ojo para tener un efecto en la reducción de la infiltración de macrófagos.
En el Día 3, la infiltración de macrófagos continuó con el tratamiento de PBS, nHC-HA/PTX3 y AMP.
No hubo inhibición de la infiltración con el tratamiento bien sea de 2 inyecciones, 4 inyecciones de nHC-HA/PTX3 o 2 inyecciones de AMP. El único tratamiento que muestra la inhibición es las 4 inyecciones de AMP (p <0.05).
En el Día 6, la infiltración de macrófagos disminuyó. Sin embargo, ningún tratamiento de HC-HA/PTX3 o AMP tuvo un efecto inhibidor significativo en comparación con el control.
Estos datos mostraron que los macrófagos positivos para EGFP continúan infiltrándose en las córneas inyectadas con LPS desde el Día 1 al Día 3 y alcanzan su pico en el Día 4 o el Día 5, luego disminuyen en el Día 6. Esto es consistente con los datos informados anteriormente (Figura 90). La infiltración de macrófagos fue ligeramente inhibida por el tratamiento con 4 inyecciones de nHC-HA/PTX3 por ojo el Día 2 o con 4 inyecciones de AMP el Día 2 y el Día 3. Esto sugiere que a Mp tiene una mejor potencia que nHC-HA/PTX3 en el bloqueo del influjo de macrófagos provocada por LPS.
El pretratamiento con AMP inhibe significativamente la infiltración de macrófagos provocada por lesiones debido a inyecciones adicionales si es seguido por inyecciones posteriores bien sea de nHC-HA/PTX3 o de AMP
El ojo izquierdo (OS) de cada ratón MAFIA se pretrató con PBS (5 jl) o AMP (5 j l de 10 mg/ml de proteína) en 4 sitios de subconjuntiva/fórnix como se definió anteriormente. El ojo derecho (OD) de cada ratón se dejó sin tratar. Tres días después, cada ojo fue inyectado con LPS (5 jg ) en la córnea e inmediatamente seguido de tratamiento con PBS (5 jl), HC-HA/PTX3 (5 j l de 1 mg/ml HA) o a Mp (5 j l de 10 mg/ml de proteína) en 4 sitios. La infiltración de macrófagos EGFP+ se contó usando microscopía intravital in vivo, que no divulgó ningún significado (P> 0.05) en la reducción del influjo de macrófagos a las córneas de ratón (datos no mostrados). Luego se investigó la precisión de este método cuantitativo mediante microscopía de fluorescencia in vivo.
Para medir con mayor precisión los macrófagos infiltrados y examinar el fenotipo de macrófagos resultante (por ejemplo, M1 versus m2), se decidió cuantificar los macrófagos positivos para EGFP sometiendo las córneas extraídas en el Día 4 a digestión con colagenasa y FACS. A continuación, los macrófagos positivos para EGFP se normalizaron mediante células negativas para EGFP como una relación para evaluar el grado de infiltración de macrófagos. En los grupos sin pretratamiento, la inyección de LPS provocó una infiltración de macrófagos en el grupo de control de PBS (Figura 91, A, la barra azul). Esta infiltración fue inhibida significativamente por nHC-HA/PTX3 (9.1 ± 0.3 versus a 2.3 ± 0.4, p = 0.02) o AMp (2.1 ± 0.1 versus 12.3 ± 0.4, p = 0.02). El tratamiento con AMP fue mejor que el tratamiento con nHC-HA/PTX3 en la inhibición de la infiltración de macrófagos (p = 0.02). En los grupos con pretratamiento, la inyección de LPS provocó una infiltración significativa de macrófagos en el grupo de control de PBS en comparación con ningún pretratamiento (37.2 ± 1.3 frente a 12.3 ± 0.4, p = 0.01) (Figura 91, A, la barra roja). Se esperaba esta diferencia, ya que 4 inyecciones subconjuntivales realizadas durante el pretratamiento causaron lesiones que provocaron inflamación, lo que aumentó el influjo de macrófagos a la córnea que luego fue tratada por LPS. No obstante, este dramático aumento de la infiltración fue completamente inhibido por el pretratamiento con AMP seguido bien sea de nHC-HA/PTX3 (8.2 ± 0.3 vs 37.2 ± 1.3, p = 0.02) o tratamiento con a Mp (2.3 ± 0.1 vs 37.2 ± 1.3, p = 0.02). De nuevo, el pretratamiento con AMP seguido del tratamiento con AMP fue mejor que el pretratamiento con AMP seguido del tratamiento con nHC-HA/PTX3 en la inhibición de la infiltración de macrófagos (2.3 ± 0.1 frente a 8.2 ± 0.3, p = 0.02). Sin embargo, no hubo una diferencia significativa en la inhibición entre el grupo sin pretratamiento y el grupo con pretratamiento de AMP bien sea para nHC-HA/PTX3 o AMP (p> 0.05). Los datos de qPCR (Figura 91, B) muestran que el pretratamiento de nHC-HA/PTX3 disminuye los marcadores M1 si IL-12p40 e IL-12p35 mientras que aumenta los marcadores M2 de Arg-1. El tratamiento y el pretratamiento con AMP disminuyen significativamente IL-12p40 e IL-12p35, pero aumentan considerablemente Arg-1 e IL-10. En total, el pretratamiento con AMP puede eliminar por completo la infiltración de macrófagos provocada por lesiones adicionales durante el pretratamiento. Este efecto se mantiene mediante la inyección posterior bien sea de nHC-HA/PTX3 o AMP simultáneamente con la inyección de LPS. Este beneficio se nota 4 días después y el AMP es más potente que el nHC-HA/PTX3.
nHC-HA/PTX3 o AMP pueden reducir la ALKC inducida por DS en un modelo de ojo seco experimental murino. Diseño
Especie: ratones C57BL/6
Puntos finales: función de la barrera epitelial corneal (tinción con OGD)
Tamaño de la muestra: 15 ratones por grupo
Grupos: 2 controles y 3 grupos de tratamiento (PBS, nHC-HA/PTX3 y AMP): 1) Ojo no seco, control no tratado (UT) -mantenido en una sala de vivero separada; 2) Ojo seco experimental, control no tratado (EDE); 3) PBS; 4) nHA-HC/PTX; 5) AMP.
Estrés desecante (DS)
El modelo de estrés por desecación se crea mediante el bloqueo colinérgico farmacológico de la secreción de lágrimas y la exposición a una corriente de aire y baja humedad en una habitación con control ambiental durante 5 días (de lunes a viernes). Los ratones se colocan en jaulas perforadas especialmente diseñadas que consisten en jaulas regulares para ratones cuyos lados se reemplazan por una malla de alambre para permitir que el aire fluya a través de la jaula. Cada jaula se coloca frente a un flujo de aire constante (ventilador eléctrico). La secreción de la glándula lagrimal se inhibe mediante la administración subcutánea de escopolamina (0.5 mg en 0.2 ml, Sigma-Aldrich) 4 veces al Día durante 5 días (8:30 am, 11:30 am, 1:30 pm, 4:30 pm). La humedad en la habitación con control ambiental se mantiene a ~25-30% de humedad relativa, lo que se logra mediante 4 deshumidificadores portátiles y una unidad deshumidificadora en el techo.
Procedimiento de tratamiento (protocolo de 5 días)
Durante cada experimento, se incluyen 3 controles:
El control no tratado, consiste en un grupo de ratones que se mantienen en el vivero, bajo una humedad relativa del 40-70%. Estos ratones nunca se exponen al DS ni reciben ningún tratamiento tópico.
Control de ojo seco, que consiste en un grupo de ratones que se colocan en la cámara ambiental de ojo seco, pero no reciben tratamiento.
Vehículo de control, consiste en un grupo de ratones que se someten a DS pero reciben PBS.
Además, se incluyen dos grupos experimentales: nHA-HC/PTX3 y AMP
Para la inyección, se usó nHC-HA/PTX3 (que contiene 1 mg/ml de HMW HA) y AMP (que contiene 10 mg/ml de proteína total) con PBS como control del vehículo. Todas las soluciones (PBS, nHC-HA/PTX3 y AMP) se introdujeron en una jeringa de tuberculina con 30 G. Los sitios de inyección son subconjuntiva cerca del fornix (figura 92). Se administraron cuatro (4) inyecciones a las 3, 6, 9 y 12 en punto con 5 pl por sitio de inyección. La solución difundida cubrió completamente toda la periferia de la conjuntiva y causó una mínima congestión/hinchazón de la conjuntiva o del globo ocular (si la hubiera, debería desaparecer en 15 minutos) que impidió el cierre de los ojos y la ruptura o inflamación de la superficie corneal. La inyección se administró el Día 1 y el Día 3 (para todos los reactivos), haciendo un total de 2 veces. Este protocolo de inyección se resume en la Tabla 6.
Tabla 6. Grupos experimentales y reactivos necesarios para la reducción de nHC-HA/PTX3 o AMP de ALKC inducida por DS en un modelo de ojo seco experimental murino.
Figure imgf000124_0001
Medición de la tinción corneal
En la mañana del quinto día, los ratones recibieron una dosis s.c. de escopolamina después de la medición del volumen de lágrimas. 2 horas después de esa dosis de escopolamina, se realizó la tinción corneal usando Oregon Green Dextran (OGD-488), que es un colorante fluorescente conjugado de un tamaño molecular de 70 kDa (Molecular Probes). El procedimiento consistió en la instilación de 0.5 pl de OGD en la córnea utilizando una pipeta capilar de vidrio, 1 minuto antes de la eutanasia. Los ratones se sacrificaron mediante la inhalación de gas anestésico de isoflurano seguida de dislocación cervical. Luego se enjuagaron los ojos con 2 ml de BSS. El exceso de líquido se eliminó cuidadosamente de la superficie ocular con papeles de filtro sin tocar la córnea. Se capturaron imágenes digitales de ambos ojos bajo una excitación de 470 nm y longitudes de onda de emisión de 488 nm utilizando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ-1500 con cámara CCD refrigerada CoolSnap HQ2, con un tiempo de exposición de 1 segundo. Se evaluaron ambos ojos de cada animal. La intensidad de la fluorescencia en una región fija de interés (un círculo de 1 mm de diámetro) en la córnea central se midió en 3 imágenes digitales utilizando el software Nikon Elements y los datos se almacenaron en una base de datos (Excel, Microsoft). Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar de los niveles de gris. Los resultados de 3 experimentos separados se promediaron para las comparaciones estadísticas de grupos.
Los efectos de nHC-HA/PTX3 y polvo de membrana amniótica (AMP) liofilizada sobre los niveles de mediadores de la ruta de las células T colaboradoras se compararon en un modelo experimental de ojo seco (EDE) creado en ratones C57BL/6 durante 5 días. La expresión de Th1 (IL-12, IFN-y y T-Bet), Th-17 (IL-23, IL-17, ROR-yt, IL-6, TGF-p1, MMP-3 y MMP-9) y los factores relacionados con Th2 (IL-4, IL-13 y GATA3) se midieron en el epitelio corneal y la conjuntiva en los siguientes grupos mediante PCR en tiempo real.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc). Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para determinar las diferencias generales entre los grupos, seguido de una prueba post-hoc (post hoc de Tukey). Se utiliza una prueba t para datos no apareados para evaluar las diferencias estadísticas entre 2 grupos experimentales.
Ejemplo 47: HC-HA activa la señalización de IGF1-HIF1a-VEGF para promover la angiogénesis, que se promueve adicionalmente mediante la adición de TGFB1 en fibroblastos corneales humanos.
En este ejemplo, se examinó el efecto de los complejos HC-HA sobre la inducción de marcadores angiogénicos en fibroblastos corneales humanos.
Se sembraron fibroblastos corneales humanos (3000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos) en platos de plástico con o sin HA inmovilizado, HC-HA soluble (PBS) (4X) o HC-HA insoluble (GnHCl) (4X) durante 48 h como se describió anteriormente. A continuación, las células se trataron con o sin TGFp1 durante 24 h antes de recolectarlas para la cuantificación del ARNm de IGF1, HIF1a y VEGF. Los grupos experimentales fueron:
Figure imgf000125_0001
Los ARN totales se extrajeron utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se transcribieron de forma reversa utilizando el kit de transcripción reversa de alta capacidad (Applied Biosystems). El ADNc de cada componente celular se amplificó mediante RT-PCR en tiempo real utilizando mezclas específicas de cebador-sonda y ADN polimerasa en el sistema de PCR en tiempo real 7000 (Applied Biosystems). El perfil de RT-PCR en tiempo real consistió en 10 minutos de activación inicial a 95°C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización de 15 segundos a 95°C y 1 minuto de hibridación y extensión a 60°C. La identidad de cada producto de PCR (IGF1, HIF1a y VEGF) se confirmó mediante la determinación del tamaño usando geles de agarosa al 2% seguido de tinción con bromuro de etidio junto con un marcador de PCR de acuerdo con EC3 Imaging System (Biolmaging System).
HC-HA indujo un aumento de 2 a 6 veces del ARNm de IGF1 y un aumento de 2 veces del ARNm de VEGF cuando las células se encontraban bajo condiciones de reposo (Figura 92). Por el contrario, HC-HA indujo un aumento de 5 a 12 veces del ARNm de IGF1 y un aumento de 5 a 9 veces del ARNm de VEGF cuando las células fueron expuestas por TGFp (10 ng/ml). Se ha demostrado que VEGF es un contribuyente importante a la angiogénesis, aumentando el número de capilares en una red determinada. La activación de VEGF está controlada por reguladores corriente arriba tales como IGF1 y HIF1a. Nuestros resultados demuestran que HC-HA activa la red IGF1-HIF1a-VEGF para promover la angiogénesis, que se promueve adicionalmente mediante la adición de TGFp1 en fibroblastos corneales humanos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo HC-HA/PTX3 (rcHC-HA/PTX3) reconstituido que comprende hialuronano (HA) de alto peso molecular, proteína inter-a-inhibidora (IaI) de cadena pesada 1 (HC1), proteína inter-a-inhibidora (IaI) de cadena pesada 2 (HC2), proteína pentraxina 3 (PTX3) y gen 6 estimulado con factor de necrosis tumoral a (TSG-6), en el que el complejo se puede obtener mediante reconstitución usando una relación molar de al menos 3:1 de IaI a TSG-6.
2. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en la prevención o reversión de la formación de cicatrices o fibrosis en un tejido de un sujeto.
3. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en la prevención o reducción de la inflamación en un sujeto.
4. Un complejo rcHC-HA/PTX3 para el uso como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la inflamación está asociada con un trastorno autoinmune, una alergia, un defecto leucocitario, una infección, una enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de tejido o combinaciones de los mismos.
5. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una herida o úlcera cutánea en un sujeto.
6. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en promover o inducir la formación de hueso en un sujeto, en el que el sujeto tiene artritis, osteoporosis, degradación del hueso alveolar o enfermedad de Paget.
7. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en la prevención o reducción de la angiogénesis no deseada en un sujeto.
8. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 para uso en la inhibición o prevención del rechazo de trasplante en un receptor de trasplante.
9. Un método para inducir la expansión de células madre, que comprende poner en contacto una célula madre in vitro con una cantidad eficaz del complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1.
10. Un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1 en combinación con una célula terapéutica para uso en la provisión de una terapia celular a un sujeto.
11. Un complejo rcHC-HA/PTX3 para el uso como se reivindica en la reivindicación 10, en el que la célula terapéutica se selecciona del grupo que consiste en una célula madre, una célula madre adulta, una célula madre mesenquimatosa, una célula diferenciada, una célula productora de insulina, y una célula de islote.
12. Un dispositivo médico que comprende un sustrato recubierto con un complejo rcHC-HA/PTX3 de la reivindicación 1.
13. Un complejo rcHC-HA/PTX3 para el uso como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la inflamación está asociada con un trastorno autoinmune.
14. Un complejo rcHC-HA/PTX3 para el uso como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la inflamación está asociada con una infección.
15. Un complejo rcHC-HA/PTX3 para el uso como se reivindica en la reivindicación 3, en el que la inflamación está asociada con la enfermedad de injerto contra huésped.
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