CN104988119A - 沃顿胶消化液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沃顿胶消化液，包括透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶。采用本发明的沃顿胶消化液联合消化沃顿胶的过程中可克服胰酶和胶原酶长期消化对脐带间充质干细胞的影响，不会额外的造成干细胞的胞膜损伤，处理之后分离得到的干细胞具有更加优良的增殖活性和分化能力。本发明的方法制备得到的脐带间充质干细胞，相比现有采用胰酶和胶原酶消化制备干细胞的方法，从相同的脐带组织中，具有更高的干细胞获取率，并且获得的干细胞具有更高的细胞活性和分化潜能。

Description

沃顿胶消化液

技术领域

本发明属于干细胞制备技术领域，具体涉及一种沃顿胶消化液。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)可在体内或体外特定的诱导条件下，分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，且在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞根据存在组织的不通，主要包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞。其中，脐带间充质干细胞由于采自医疗废弃物新生儿脐带，相比骨髓间充质干细胞其具有来源丰富、成本低、对捐献者无损害等优势，具有更加广阔的前景。

脐带间充质干细胞大量存在于脐带沃顿胶(Wharton胶，或者又称华尔通胶)和血管周围组织中，具有自我更新、增殖和多向分化潜能。而其中由于沃顿胶的成分主要是胶原、透明质酸、硫酸软骨素(胶原占干重50％以上，以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原为主，还有Ⅴ型等胶原，占总胶原的95％以上；透明质酸、硫酸软骨素等糖胺多糖占脐带沃顿胶的近50％)，能更加利于脐带间充质干细胞的分离，因此目前脐带间充质干细胞多从沃顿胶中进行分离制备，而采用的方法一般为组织块贴壁法和酶消化法。其中，组织块贴壁法是将脐带组织切成小块，用间质细胞完全培养基在一定条件(5％CO₂、37℃、饱和湿度)的培养箱中培养，5～7d后将贴壁生长的长梭形细胞从组织中消化分离，再过5～7d后即获得脐带间充质干细胞。由于这一方法时间长，获取率和活性均不高，所以现有方式中多采用酶消化法进行。

现通常的酶消化法是将切成小块的脐带组织用含胶原酶和胰蛋白酶的消化液消化30min～16h。消化液中的胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有很强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞受到损伤导致活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞。

发明内容

本发明实施的目的在于克服上述从沃顿胶分离制备脐带间充质干细胞的不足，提供一种能够在制备过程中对干细胞损伤性更低、产率和细胞品质更高的沃顿胶消化液。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种沃顿胶消化液，包括透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶。

采用本发明的上述沃顿胶消化液，相比现有沃顿胶酶消化中采用的胶原酶和胰蛋白酶，特异性转变为针对沃顿胶中的硫酸软骨素和透明质酸进行酶解，破坏细胞之间的稳定粘合而进行分离，可以提升获取率；同时在联合消化沃顿胶的过程中避免了胰酶和胶原酶长期消化对脐带间充质干细胞自身膜蛋白的影响，不会额外的造成干细胞的胞膜损伤，处理之后分离得到的干细胞具有更加优良的增殖活性和分化能力。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提供一种用于酶消化法从沃顿胶制备脐带间充质干细胞的沃顿胶消化液，相比现有由胶原酶和胰蛋白酶组成的消化液，本发明的消化液包括透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶。

相比现有沃顿胶酶消化液中采用的胶原酶和胰蛋白酶，本发明消化液中硫酸软骨素ABC酶是特异性降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C的酶类，作用机理是通过β消除机理作用于二糖重复单元之间的β1-4糖苷键上并将其切断，生成寡糖(主要是不饱和二糖)。同时，沃顿胶细胞的间质中，大量存在的透明质酸是组织基质中具有限制水分及其它细胞外物质扩散作用的功能成分，也是细胞生长和形成组织结构的基质成分；因此本发明在消化液中添加透明质酸酶对透明质酸的专一性水解，水解之后首先可以破坏细胞之间的稳定粘合而利于分离，并且在水解的过程中能暂时降低细胞间质的粘性加强胞外物质的扩散和结合、以及吸收，能进一步协同增加硫酸软骨素ABC酶的扩散和结合，提升沃顿胶细胞间成分的降解的效率。并且，其中采用的一个酶活单位的硫酸软骨素ABC酶在pH 6.0和37℃条件下1min可以从硫酸软骨素A催化产生1.0μmol 2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸-4-烯)-4-O-硫酸-D-半乳糖(ΔDi-4S)或从硫酸软骨素C催化产生1.0μmol 2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸-4-烯)-6-O-硫酸-D-半乳糖(ΔDi-6S)，这个降解的效率是明显高于胶原蛋白类的降解的，能大大提升消化液的消化效率。

同时，由于上述两种酶类本身具有仅对特异性底物水解的单一性，联合消化沃顿胶的过程中可克服胰酶和胶原酶长期消化对脐带间充质干细胞的影响，不会额外的造成干细胞的胞膜损伤，处理之后分离得到的间充质干细胞具有更加优良的增殖活性和分化能力。

进一步在本发明的上述消化液实施中，为了使消化过程中胞间质和酶进行相继结合并同时消化，提升消化效率，消化液中透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶的质量/酶活比为0.05～2mg/U(购买的透明质酸酶是质量计，而硫酸软骨素ABC酶是按照活力单位U计)。在该量比范围下，酶降解的效率基本和细胞间质中成分的比例相当，避免比例不平衡产生产物抑制而降低效率。当然，根据透明质酸、硫酸软骨素等糖胺多糖占脐带沃顿胶的近50％的成分特点，透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶最优的质量/酶活比可以采用0.1mg/U。

同时，由于沃顿胶用消化液进行消化的过程中，大多数干细胞自身存在适宜生长的pH范围为7.2～7.4，通常低于pH6.8或者高于pH7.6可能对干细胞有害，同时造成消化分离得到的干细胞胞膜或者胞内代谢不正常，并且还会抑制或者降低得到的干细胞的活性。更重要地，上述消化液中的主要活性成分为蛋白酶类，在消化液制备和使用中，为了防止PH值过于剧烈的变化而造成蛋白质变性，因此在上述基础上，本发明的消化液中添加缓冲系作为透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶的溶剂。作为溶剂的缓冲系，根据细胞的适应性范围，可以采用pH相符合的常用pKa(酸度系数)＝7.2的PBS缓冲系、Tris-HCl缓冲系等。上述缓冲系作为溶剂添加在消化液后，在消化处理的过程中消化液自身存在无机离子，还可有利于维持细胞外的渗透压力，避免干细胞出现吸胀破裂等等。

在本发明上述沃顿胶消化液的基础上，本发明进一步还提出一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

S10，获取脐带沃顿胶的破碎组织；

S20，将脐带沃顿胶组织用沃顿胶消化液进行消化处理，并搜集消化液；

S30，从消化液中提取脐带间充质干细胞。

其中，步骤S10获取原料沃顿胶的破碎组织，具体实施中可以采用如下步骤进行：

S11，获取脐带；

该步骤S11获取脐带可以是生产手术中剪下的脐带，或者是其他途径保存的可以直接使用的脐带均可；获取之后的脐带为了保持其细胞组织形状，获取的脐带可以放入含抗凝剂的无菌注射用生理盐水中，4℃低温保存备用。

S12，从步骤S11获取的脐带中分离沃顿胶；

该步骤中用手术剪将脐带外壁剪开，并用镊子去除外壁；可见到透明的胶状物质即沃顿胶，用镊子仔细夹取即可得到沃顿胶。

S13，将步骤S12获取的沃顿胶剪切破碎，成为便于消化的破碎组织；

实施中，剪切破碎的可以采用实验室常用的手术剪进行，在培养皿中将沃顿胶剪碎成1-2mm³的组织块，剪碎的过程之前可以先在培养皿中添加破碎缓冲液，对组织细胞进行保护。同时，由于接来下的步骤是将破碎的组织用于消化，并且本发明的上述消化液中采用的溶剂即是PBS等缓冲系，因此可以直接采用消化液作为破碎缓冲液直接进行，剪碎之后然后直接转移至进行步骤S20的消化处理。

上述组织破碎完成之后，步骤S20进一步将获得的破碎组织进行消化处理，按照上述步骤S13以消化液作为破碎缓冲液进行切碎之后，破碎的组织浆液中含有消化液，因此不需要再继续添加，而可以直接转移至摇床上进行震荡消化；同时，震荡消化的过程中，可以控制消化的温度为35～37℃，以保证消化过程中酶的活性最优。同时，消化过程中，根据反复的实验和测试，在消化液的添加量合适的情况下，震荡消化40min消化即可比较完全(如果为了确定保证消化完全，可以适当延长消化的时间)，得到用沃顿胶消化液消化处理之后生成的消化浆液。

在步骤S20之后，所生成的消化浆液中就具有较多游离出来的脐带间充质干细胞，然后步骤S30从这消化浆液中进行分离提取即可得到脐带间充质干细胞。分离的方法可以参见如下步骤进行：

S31，将步骤S20所获得的消化液于200-400目无菌筛网上研磨并过滤后，取滤液(本次滤液中即含有消化过程中所游离出的脐带间充质干细胞)；

S32，将步骤S31的滤液用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12完全培养液进行终止消化处理；其中，上述完全培养液按照实验室手册配置中，均是按照10％的量比添加，实际实施中只要能满足细胞的生长要求，可以适当的增减，控制在8～12％的范围左右。

S33，将步骤S32终止消化处理后的滤液中加入PBS后，200g离心5min后弃去上清，则下层沉淀即为分离的脐带间充质干细胞，然后再次用PBS重悬细胞后离心洗涤；重复洗涤3次后，搜集细胞体即为脐带间充质干细胞。

本发明的上述实施过程完成之后，一般量较少，因此在本发明中可以需要进一步按照步骤S40进行传代扩增：

S40，向步骤S30分离提取得到的脐带间充质干细胞中用完全培养液进行大量培养；

在培养的过程中适时地更换新鲜培养液，同时观察并记录细胞形态。

本发明的上述制备的方法在酶消化的过程中采用透明质酸酶和ABC酶联合消化沃顿氏胶，整体上可以获得细胞品质最优的脐带间充质干细胞，并且避免了胰酶和胶原酶长期消化对细胞体的影响，最终制备得到的脐带间充质干细胞细胞活性较高，获取率较高。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明消化液制备脐带间充质干细胞的效率和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

(1)配置消化液：1g/L透明质酸酶(Sigma公司)、100U/ml ABC酶(北京思清源生物科技有限公司)

将透明质酸酶溶解于pH7.2的PBS中，得到质量浓度为1g/L透明质酸酶溶液50ml，备用；

将100U/mL硫酸软骨素ABC酶用pH7.2的PBS稀释为10U/mL，同样制备50ml备用；

最后将透明质酸酶溶液与硫酸软骨素ABC酶按1:1的体积比例混合即可。

然后采用上述配置的消化液通过酶消化法制备脐带间充质干细胞，具体：

S11，生产手术中剪下的15～20cm的脐带，放入含抗凝剂的无菌注射用生理盐水(最好还添加1％双抗)中，4℃低温运输到实验室，可以保证细胞的鲜活，避免因为材料处理不当影响后续干细胞分离的品质；

S12，用PBS或者注射用生理盐水洗涤脐带(清洗的次数和时间可以具体清洗过程定，以将脐带和血管中的血液清洗干净为准)，去除脐带和血管中的血液后，用手术剪将脐带外壁剪开，并用镊子去除外壁，可见到透明的胶状物质即沃顿胶，用镊子仔细夹取沃顿胶组织然后转移至培养皿中，并向培养皿中按照组织：消化液为1:2～5的体积比添加消化液；

S13，进一步用手术剪将培养皿中将沃顿胶剪碎成1-2mm³的组织块。

S20，将步骤S13剪碎之后的的组织块置于摇床上震荡消化40分钟。

S31，将步骤S20消化之后得到的消化浆液倾倒至300目无菌筛网上过滤并轻细研磨，弃残渣取悬浊滤液；

S32，将步骤S31中过滤得到的悬浊滤液用含10％FBS的DMEM/F12完全培养液终止消化；

S33，将步骤S32终止消化处理后的悬浊滤液进一步洗涤离心，搜集离心沉淀；其中，洗涤过程中采用2～3倍体积的PBS作为洗涤液，洗涤之后置于1500rpm离心5min；当然，为了保证搜集沉淀中细胞的洁净，洗涤和离心可以重复3～4次；最终搜集到的离心沉淀物即为从沃顿胶中分离制备的脐带间充质干细胞。

S40，将步骤S33中所获得的脐带间充质干细胞沉淀，用含10％FBS的DMEM/F12完全培养液进行大量培养；具体培养的细节的过程，向步骤S33离心获得的干细胞沉淀物中加入含10％FBS的DMEM/F12完全培养液，转移至培养箱中进行培养；

当培养12小时后，吸除旧培养液，并加入新鲜的含10％FBS的DMEM/F12完全培养液继续培养；之后每2天进行半量换液，同时观察细胞形态；

原代培养1～2d，倒置显微镜下即可看到贴壁细胞呈散在分布，为长梭状或扁平形细胞，少数为多突起的星形细胞，细胞有折光性，核仁明显；3～5d即可达到80％～90％融合；待细胞密度达80％时，即可收获细胞。培养的过程中，另外取第2代脐带来源贴壁细胞保存，用于定向诱导性能测试。

S50，细胞的获取率和活性测试：

(1)细胞体数量检测：将步骤S40搜获的细胞，取标准体积作为样品，用台盼蓝法进行细胞计数，做3次重复，得到细胞数量为2～3×10⁷。

(2)免疫表型分析：将细胞常规消化后，以PE标记的CD13、CD29、CD31、CD45、CD34、CD73(SH3)、MHC-Ⅱ、FITC标记的CD105(SH2)、CD44抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪上机检测。

(以上流式细胞仪和其中所用的抗体购自于美国BD Biosciences公司)

流式细胞术检测结果表明，高表达的表面为CD13、CD29、CD44、CD73(SH3)、CD105，极低表达的表面为CD31、CD34、CD45、MHC-Ⅱ，这一表面表达的结果与间充质干细胞相关的细胞表面标志呈高表达，而造血干细胞相关的细胞表面标志极低表达的情形相符，因此可以判定本发明的消化液制备得到的细胞确实是间充质干细胞。

(3)分化潜能鉴定：

①向脂肪细胞诱导分化：以每孔2×10⁴的密度将步骤S40获取的细胞接种在25cm×25cm塑料培养瓶和6孔板，诱导分化体系为含10％FBS、10^-6mol/L地塞米松、100μg/mL1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/mL抗坏血酸的IMDM培养基，每3天半量换液1次。第14天采用油红O染色,于倒置显微镜下观察脂肪滴的形成。

成脂诱导分化结果：定向诱导14d后，本实施例获取的细胞可见油红O染色呈强阳性，倒置显微镜下可见细胞浆中含有脂肪空泡，说明分离出的细胞具有向脂肪细胞分化的能力。

②向成骨细胞诱导分化：细胞以每孔2×10⁴的密度接种于25cm×25cm塑料培养瓶和6孔板，诱导分化体系为含1.0×10^-8mol/L地塞米松，2.0×10^-4mol/L抗坏血酸，7.0×10^-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基，每3天半量换液1次。第14天用Von Kossa染色检测钙化基质沉淀。

成骨诱导分化结果：定向诱导14d后，本实施例测试过程中可见细胞间充满黑色颗粒，大小不均一，提示有矿化基质沉积，具有向成骨细胞分化的能力，说明本发明分离出的脐带间充质干细胞能具有良好的成骨分化能力。

实施例2

本实施例2为对比实施例，在该实施例2中所采用的脐带的处理过程与实施例1相同，而作为对比的不同点在于本实施例2中采用含有0.1％(质量百分数)胶原酶Ⅰ型和0.25％(质量百分数)胰酶(均采购于美国AMRESCO公司)的PBS溶液作为消化液，按照与实施例1相同中相同的步骤进行脐带间充质干细胞的分离制备。

同样，本实施例2中将收获间充质干细胞按照上述实施例1的测试方式进行各项数据和性能测试，其结果如下：

(1)细胞体数量检测结果：将搜获的细胞，取标准体积作为样品，用台盼蓝法进行细胞计数，做3次重复，平均得到细胞数量为1×10⁷。采用该现有通常经典常规消化法制备的细胞，本身可以确定为间充质干细胞，可以省略免疫测试的证明步骤。

(2)成脂诱导分化结果：与实施例1同样取第2代脐带来源贴壁细胞定向诱导14d后，细胞油红O染色阴性，在倒置显微镜下也看不见细胞浆中含有脂肪空泡。

成骨诱导分化结果：与实施例1同样取第2代脐带来源贴壁细胞定向诱导14d后，本组细胞von Kossa染色未见黑色矿化物沉积。

从上述两个实施例的对比的结果中可以看出，本发明的消化液相比现有通常采用的胶原酶和胰蛋白酶所获得的细胞数目的2-3倍，干细胞制备的获取率要高；同时，在相同的诱导条件下，细胞分化的程度，本发明消化液制备的干细胞分化程度更为明显。虽然，在上述实施例2的14d诱导之后持续延长诱导，细胞传代更长之后，再次进行诱导结果的测试，也能得到阳性的测试结果。但是明显可以看出，通常消化液制备的细胞需要诱导的程度比本发明消化液制备的干细胞分化潜能和活性要低。本发明制备的间充质干细胞的方法在效果上更加突出和明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种沃顿胶消化液，其特征在于，包括透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶。

2.如权利要求1所述的沃顿胶消化液，其特征在于，所述透明质酸酶和硫酸软骨素ABC酶的质量/酶活比为0.05～2mg/U。

3.如权利要求1或2所述的沃顿胶消化液，其特征在于，所述沃顿胶消化液还包括缓冲体系。

4.如权利要求3所述的沃顿胶消化液，其特征在于，所述缓冲体系为PBS缓冲系或Tris-HCl缓冲系。

5.如权利要求3或4所述的沃顿胶消化液，其特征在于，所述缓冲体系的pKa为7.2。