JP2019178144A - Hc−ha/ptx3複合体を含む組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年6月11日に出願された米国特許出願第61/670,571号の利益を主張し、該文献は全体として引用されることで本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の作業に関する財政的援助は、米国メリーランド州ベテスダの国立眼学研究所、国立衛生研究所からの連邦政府の研究助成金RO1 EY06819、R44 EY017497、および、R43 EY021045から一部提供された。
本出願は配列表を包含しており、配列表は、EFS−WebによってASCIIフォーマットのコンピューターで読み取り可能なテキストファイルとして提出されており、本明細書で引用することで全体として組み込まれる。2013年7月8日に作成されたテキストファイルは、34157−732−601SEQ.txtと命名され、462KBの大きさである。
からのrcHC−HA/PTX3複合体の解離は、複合体を解離剤に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、解離剤は塩酸グアニジンまたは尿素である。いくつかの実施形態では、解離剤は約4M乃至約8Mの塩酸グアニジンである。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドまたはリンカーは、タンパク質切断配列を含む。いくつかの実施形態では、rcHC−HA/PTX3複合体の解離は、タンパク質切断配列で中間ポリペプチドまたはリンカーを切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、切断はプロテアーゼにタンパク質切断配列を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、フューリン、3Cプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、TEVプロテアーゼの中から選択される。
いくつかの実施形態では、IL−12p40 mRNAの値は減少する。いくつかの実施形態では、IL−12p40タンパク質の値は減少する。
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、請求項に係る主題が属する当該分野の知識を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。他に明記されない限り、本明細書の開示全体にわたって参照される特許、特許出願、公開された出願および出版物、GENBANK配列、ウェブサイト、および、他の出版物はすべて、全体として引用されることで組み込まれる。本明細書の用語に複数の定義がある場合、この表題の定義が優先される。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスについて言及する場合、そのような識別子は変更可能であり、インターネット上の特定の情報は変動することがあるが、同等の情報は、インターネットの検索および/または適切なデータベースなどによって、知られており、容易に入手可能である。そのようなものについての言及は、そのような情報の利用可能性と好適な普及を証拠づけるものである。
ヒアルロナン(HA)は、GlcUA−−β1,3−GlcNAc−β1,4−結合を介して、Dグルクロン酸およびN−アセチル−Dグルコサミンの反復二糖類サブユニット単位から構成された、十分に非硫酸化型のリニアグリコサミノグリカン(GAG)である。HAはHAシンターゼ(例えば、HAS1、HAS2、およびHAS3)によって合成されて、細胞外マトリックスに堆積し、組織の構造の完全性に寄与するとともに、細胞表面受容体を含むタンパク質との相互作用によって多くの細胞のプロセスも制御する。HAの分子量は一般に、約200乃至約10,000kDaまでの大きさに及ぶ。HAの標準レベルは、Hyal1などのヒアルロニダーゼによるHASの酵素および異化反応によって、生合成のバランスを介して組織中で維持される。
本明細書では、単離した天然のHC−HA/PTX3複合体(nHC−HA/PTX3)を生成する方法が開示される。
SLRPで、または、SLRPなしで、再構成されたHC−HA/PTX3複合体(rcHC−HA/PTX3)を生成する方法が本明細書で開示される。同様に、そのような方法によって生成された成分のrcHC−HA/PTX3複合体および中間の組み合わせが、本明細書で開示される。
特定の実施形態において、本明細書に記載のnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3複合体を含む医薬組成物が本明細書で開示される。特定の実施形態において、本明細書で提供された方法によって生成されるnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体を、薬学用途に適した調製物にする処理を促進する賦形剤および助剤を含む、1つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用する従来の方法で調剤される。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。修復の技術、担体、および、賦形剤のいずれも、適切に、当該技術分野で理解されているように、使用することができる。
特定の実施形態において、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、本明細書に記載されるnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体を個体に投与する工程を含む。特定の実施形態において、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、本明細書に記載された方法によって生成されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体を、個体に投与する工程を含む。以下は、本明細書で開示されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体の投与を含む、非限定的な処置方法の例である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体は、下記の少なくとも1つを阻害するために使用される:瘢痕、炎症、自己免疫または免疫の拒絶反応につながる免疫反応、接着、血管形成、および、細胞または組織の再生を必要とする状態。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体は、創傷治癒を促すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体は、幹細胞の拡張を促すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたnHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体は、組織再生を促すために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示された医療用の移植組織/nHC−HA/PTX3、または、移植組織/rcHC−HA/PTX3の複合体は、個体注入され、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3の複合体は、個体に部分的にまたは完全に放出される。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は、ステント(例えば骨ステントまたは冠状動脈ステント)である。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は骨ステントである。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は冠状動脈ステントである。
MCC−147(Mitsubishi Pharma);F12511((S)−2’,3’,5’−トリメチル−4’−ヒドロキシ−アルファ−ドデシルチオアセトアニリド);SMP−500(Sumitomo Pharmaceuticals);CL277082(2,4−ジフルオロ−フェニル−N[[4−(2,2−ジメチルプロピル)フェニル]メチル]−N−(ヘプチル)尿素);F−1394((1s,2s)−2−[3−(2,2−ジメチルプロピル)−3−ノニルウレイド(nonylureido)]アミノシクロヘキサン−1−イル 3−[N−(2,2,5,5−テトラメチル−1,3−ジオキサン−4−カルボニル)アミノ]プロピオネート);CP−113818(N−(2,4−ビス(メチルチオ)−6−メチルピリジン−3−イル)−2−(ヘキシルチオ)デカン酸アミド);YM−750;トルセトラピブ;アナセトラピブ(anacetrapid);JTT−705(Japan Tobacco/Roche);アブシキシマブ;エプチフィバチド;チロフィバン;ロキシフィバン;バリアビリン(variabilin);XV459(N(3)−(2−(3−(4−ホルムアミジノフェニル(formamidinophenyl))イソキサゾリン−5−イル)アセチル)−N(2)−(1−ブチルオキシカルボニル)−2,3−ジアミノプロピオネート(diaminopropionate);SR 121566A(3−[N−{4−[4−(アミノイミノメチル)フェニル]−1,3−チアゾール−2−イル}−N−(1−カルボキシメチルピペリド−4−イル)アミノールプロピオン酸、トリヒドロクロリド);FK419((S)−2−アセチルアミノ−3−[(R)−[1−[3−(ピペリジン−4−イル)プロビオニル]ピペリジン−3−イルカルボニル]アミノ]プロピオン酸三水和物);クロピドグレル;プラスグレル;カングレロール(cangrelor);AZD6140(AstraZeneca);MRS 2395(2,2−ジメチル−プロピオン酸3−(2−クロロ−6−メチルアミノプリン−9−イル)−(2−(2,2−ジメチル−プロピオニルオキシメチル)−プロピルエステル);Bx 667(Berlex Biosciences);Bx 048(Berlex Biosciences);ダラプラディブ(SB 480848);SB‐435495(GlaxoSmithKline);SB‐222657(GlaxoSmithKline);SB‐253514(GlaxoSmithKline);アレファセプト、エファリズマブ、メトトレキサート、アシトレチン、イソトレチノイン、ヒドロキシ尿素、ミコフェノール酸モフェチル、スルファサラジン、6−チオグアニン、ドボネックス、タクロネックス(Taclonex)、ベタメタゾン、タザロテン、水酸化クロロキン、スルファサラジン、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、アバタセプト、リツキシマブ、トラスツズマブ、抗CD45モノクローナル抗体AHN−12、ヨウ素−131抗B1抗体(Corixa Corp.)、抗CD66モノクローナル抗体BW 250/183(NCI,Southampton General Hospital)、抗CD45モノクローナル抗体(NCI,Baylor College Medicine)、抗体抗anb3インテグリン(NCI)、BIW−8962(BioWa Inc.)、抗体BC8(NCI)、抗体muJ591(NCI)、インジウム In 111モノクローナル抗体MN−14(NCI)、イットリウムY 90モノクローナル抗体MN−14(NCI)、F105モノクローナル抗体(NIAID)、モノクローナル抗体RAV12(Raven Biotechnologies)、CAT−192(ヒト抗−TGF−Beta1モノクローナル抗体,Genzyme)、抗体3F8(NCI)、177Lu−J591(Weill Medical College of Cornell University)、TB−403(BioInvent International AB))、アナキンラ、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、レフルノミド、d−ペニシラミン、アミトリプチリンまたはノルトリプチリン、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、プラステロン、LJP 394(abetimussodium)、LJP1082(La Jolla Pharmaceutical)、エクリズマブ、ベリムマブ(belibumab)、rhuCD40L(NIAID)、エプラツズマブ、シロリムス、タクロリムス、ピメクロリムス、サリドマイド、抗胸腺細胞グロブリン−ウマ(Atgam,Pharmacia Upjohn)、抗胸腺細胞グロブリン−ウサギ(サイモグロブリン、Genzyme)、ムロモナブ−CD3(FDA Office of Orphan Products Development)、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リルゾール、クラドリビン、ナタリズマブ、インターフェロンベータ−1b、インターフェロンベータ−1a、チザニジン、バクロフェン、メサラジン、アサコール、ペンタサ、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン、6−メルカプトプリン、AIN457(抗IL−17モノクローナル抗体、Novartis)、テオフィリン、D2E7(Knoll Pharmaceuticalsからのヒト抗TNF mAb)、メポリズマブ(抗−IL−5抗体,SB 240563)、カナキヌマブ(抗−IL−1ベータ抗体,NIAMS)、抗−IL−2受容体抗体(ダクリズマブ、NHLBI)、CNTO 328(抗IL−6モノクローナル抗体,Centocor)、ACZ885(完全にヒト抗インターロイキン−1ベータモノクローナル抗体,Novartis)、CNTO1275(完全にヒト抗−IL−12モノクローナル抗体,Centocor)、(3S)−N−ヒドロキシ−4−({4−[(4−ヒドロキシ−2−ブチニル)オキシ]フェニル}スルホニル)−2,2−ジメト−hyl−3−チオモルホリンカルボキサミド(アプラタスタット(apratastat))、ゴリムマブ(CNTO 148)、オネルセプト(Onercept)、BG9924(Biogen Idec)、セルトリズマブペゴル(CDP870,UCB Pharma)、AZD9056(AstraZeneca)、AZD5069(AstraZeneca)、AZD9668(AstraZeneca)、AZD7928(AstraZeneca)、AZD2914(AstraZeneca)、AZD6067(AstraZeneca)、AZD3342(AstraZeneca)、AZD8309(AstraZeneca)、[(1R)−3−メチル−1−({(2S)−3−フェニル−2−[(ピラジン(pyrazin)−2−イルカルボニル)アミノ]プロパノイル}アミノ)ブチル]ボロン酸(ボルテゾミブ)、AMG−714(抗IL15ヒトモノクローナル抗体、Amgen)、ABT−874(抗IL−12モノクローナル抗体,Abbott Labs)、MRA(トシリズマブ、抗IL−6受容体モノクローナル抗体,Chugai Pharmaceutical)、CAT−354(ヒト抗インターロイキン13モノクローナル抗体,Cambridge Antibody Technology,MedImmune)、アスピリン、サリチル酸、ゲンチジン酸、サリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸ナトリウム、ジフルニサル、カプロフェン、フェノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、フルロビプロフェン(flurobiprofen)、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブトン(nabutone)、ケトロラク(ketolorac)、ケトロラクトロメタミン、ナプロキセン、オキサプロジン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、meclofenamate、メクロフェナム酸ナトリウム(meclofenamate sodium)、メフェナム酸、ピロキシカム、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、CS−502(Sankyo)、JTE−522(Japan Tobacco Inc.)、L−745,337(Almirall)、NS398(Sigma)、ベタメタゾン(Celestone)、プレドニゾン(Deltasone)、アルクロメタゾン、アルドステロン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デオキシコルチコステロン、デソニド、デスオキシメタゾン、デスオキシコルトン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルドロコルチゾン、フルドロキシコルチド、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルチカゾン、ホルモコータル、ホルモテロール、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン(hydrocortisone aceponate)、ヒドロコルチゾンブテプレート(hydrocortisone buteprate)、酪酸ヒドロコルチゾン(hydrocortisone butyrate)、ロテプレドノール、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニソロン、メチルプレドニソロンアセポネート(methylprednisolone aceponate)、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、ウロベタゾール;シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン;シクロホスファミド、クロラムブシル、ビンクリスチン;ビンブラスチン、ビノレルビン;ビンデシン、アザチオプリン;メルカプトプリン、フルダラビン;ペントスタチン、クラドリビン、5−フルオロウラシル(5FU);フロクスウリジン(FUDR);サイトシンアラビノサイド;メトトレキサート、トリメトプリム;ピリメタミン;ペメトレキセド;パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、イリノテカン;トポテカン;アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン;バルルビシン(valrubicine);イダルビシン(idarubicine);エピルビシン;ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン;トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、フィナステリド;ゴセレリン;アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、エキセメスタン、4−アンドロステン−3,6,17−トリオン(「6−オキソ」);1,4,6−アンドロスタトリエン−3,17−ジオン(ATD);ホルメスタン;テストラクトン、ファドロゾール;またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3上で培養された単離した幹細胞は、誘導多能性/前駆体幹細胞(iPSC)である。いくつかの実施形態では、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3上で培養された単離した幹細胞は、生体の分化したまたは部分的に分化した細胞に由来する、誘導多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3上で培養された単離した幹細胞は、繊維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、nHC−HA/PTX3またはrcHC−HA/PTX3上で培養された単離した幹細胞は、ヒトの角膜の繊維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞である。
実施例1.ヒトの羊膜抽出物(AME)からの天然のHC−HA/PTX3(nHC−ha/PTX3)複合体の精製
実施例3.精製された天然のHC−HA/PTX3(nHC−ha/PTX3)複合体の活性
固定化したnHC−HA/PTX3によるM1またはM2の表現型へのLPS刺激したマクロファージの極性化を、RNAおよびタンパク質の分析によってM1およびM2のマーカーをコード化する遺伝子の発現を決定することによって検査した。
好中球を、製造業者の指示に従い、デキストラン密度[Lymphocyte Poly(R), Cedarlane USA, Burlington, NC]の遠心分離を使用して、正常ヒト末梢血から単離した。単離した好中球を、固定化したHA(2μg/ウェル)、nHC−HA/PTX3(2μg/ウェル)またはPBS対照上でIMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Life Technologies, Grand Island, NY)中の2×106細胞/mlで播種し、24時間(n=3)、PBS(休止)、N−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(fMLP)(1μM)(Sigma− Aldrich, St Louis, MO)またはLPS(1μg/ml)で処置した。好中球のアポトーシスを、製造業者のプロトコルに従って、細胞可溶化物中でCell Death Detection ELISA (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)によって測定した。HAではない、固定化したnHC−HA/PTX3は、休止する好中球ではなく、fMLPまたはLPS活性の好中球のアポトーシスを促進する(図3のD)。
M2マクロファージ極性化における特定の受容体の関与を決定するために、受容体遮断抗体の存在または欠如下でのM1およびM2のマクロファージマーカーの定量的mRNA発現を行った。DMEM/10%のFBS中のRAW264.7細胞(2.5×105細胞/ml)を、氷上で30分間(n=3)、CD44(10μg/ml)、TLR4(10μg/ml)、またはCD44/TLR4(各々10μg/mlで)に対するPBS(対照)または遮断抗体で予めインキュベートした。その後、細胞を、LPS(1μg/ml)で刺激し、固定化したHA(2μg/ウェル)、nHC−HA/PTX3(2μg/ウェル)またはPBS対照上で4時間37℃でインキュベートした。総核酸を、総細胞から抽出した。M1マーカー(IL−12p40)およびM2マーカー(IL−10、LIGHT、およびSPHK1)の相対的なmRNA発現を、上に記載されるような内在性コントロールとしてGAPDHを用いて定量的PCRによって測定した(図4のA)。IL−12p40の発現を無効にし、一方で、IL−10、LIGHTおよびSPHK1の発現を、HAではなく、固定化したnHC−HA/PTX3によって促進した。この発現パターンは、TLR4遮断抗体よりもCD44遮断抗体によってより阻害された。対照的に、固定化したHAによるIL−12p40およびIL−10の転写物の発現は、CD44に対する遮断抗よりもTLR4に対する遮断抗体による影響をより受けた。
nHC−HA/PTX3(2nd)およびnHC−HA/PTX3(4th)の複合体を、マクロファージの細胞凝集を誘発する(不十分な細胞付着を示す)及び/又はM2マクロファージの極性化を促進する各複合体の能力を検査することによって比較した。RAW264.7細胞(2.5×105細胞/ml)を、固定化したHA(2、μg/ウェル)、nHC−HA/PTX3(2、μg/ウェル)またはPBS対照上のDMEM/10% のFBS中ので培養し、4時間または24時間(n=3)、200ユニット/mlのIFN−γ/1μg/mlのLPS(その両方は、InvivoGen, San Diego, CAからのもの)で刺激した。4時間後、細胞凝集を、光顕微鏡検査法によって検査し、撮影した(図5のA)。nHC−HA/PTX3(2nd)ではなく、固定化したnHC−HA/PTX3(4th)は、マクロファージの細胞凝集を促進し、これは、nHC−HA/PTX3(4th)が、プレートへの細胞付着を促進せず、一方で、nHC−HA/PTX3(2nd)が促進することを示している。
iHAに対するTSG−6の結合
固定化したHA(2μg/ウェルの投入量)を、上に記載されたように調製した。一連のヒトTSG−6(C端末10Hisタグを用いる、ヒトTSG−6のLeu277からTrp18でのマウス骨髄腫細胞株NS0中の過剰発現、Accession # P98066; R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat. No. 2104−TS)の濃縮物(concentrations)(1ウェル当たり、0、0.24、1.2、6、12、および24μg/ml、100μlの容量)を、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中で37°Cで2時間iHAでインキュベートした。非結合TSG−6を、8Mのグアニジン−HClおよびPBSの洗浄によって取り除いた。結合TSG−6を、修正したTSG−6 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって測定した。TSG−6がウェル中で連結されたiHAに既に結合されていたため、予めコーティングしたTSG−6抗体によってサンプルをインキュベートする工程を省略した。続く工程は製造業者のプロトコルに従うものであった(図7のA)。TSG−6は、iHAを用量依存的に結合し、iHAが約1.4μg(〜70%の結合効率に基づく1ウェル当たり2μgのHA)であるときに、約6μg/ml(または0.1mlの反応溶液中に0.6μg)でその最大の結合能力に達した。TSG−6のHAに対するモル比は、TSG−6が35kDaであること及びHAが〜3,000kDaであることに基づいて、約37:1であった。
TSG−6(100μl中に6μg/ml)を、37℃で2時間iHAでインキュベートした。非結合TSG−6を、PBS(対照として)による洗浄、あるいは異なる解離剤または還元剤:6MのグアニジンHCl/PBS、8MのグアニジンHCl/PBS、2%のSDS/PBS、100mMのDTT/PBS、および25mMのNaOH/H2Oによる洗浄によって取り除いた。結合TSG−6を、上に記載されるような修正したTSG−6 ELISAによって測定した(図7のB)。形成されたTSG−6/iHA複合体は安定しており、様々な解離剤及び/又は還元剤による処置に耐性があった。すべての群間で統計的有意差は言及されなかった。
固定化したHA(2μg/ウェルの投入量)を、上に記載されるように調製した。一連のPTX3(C端末6Hisタグを用いる、ヒトPTX3のGlu18からSer277でのマウス骨髄腫細胞株NS0中の過剰発現、Accession # P26022; R&D Systems, Minneapolis, MN)の濃縮物(1ウェル当たり、0、0.04、0.2、1、5、および25μg/ml、100μlの容量)を、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中で37°Cで2時間iHAでインキュベートした。非結合PTX3を、8MのGnHClおよびPBSでの洗浄によって取り除いた。結合PTX3を、修正したPTX3 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって測定した。PTX3がウェル中で連結されたiHAに既に結合されていたため、予めコーティングしたPTX3抗体によってサンプルをインキュベートする工程を省略した。続く工程は製造業者のプロトコルに従うものであった(図8のA)。PTX3は、iHAを用量依存的に結合し、iHAが約1.4μg(70%の結合効率に基づく1ウェル当たり2μgのHA)であるときに、約5μg/ml(または0.1mlの反応溶液中に0.5μg)でその最大の結合能力に達した。PTX3のHAに対するモル比は、PTX3が45kDaであること及びHAが〜3,000kDaであることに基づいて、約24:1であった。
iHA(2μg/ウェルの投入量)を、上に記載されるように調製した。6μg/mlのTSG−6および5μg/mlのPTX3(上に記載されるような最大の結合に対する濃縮物)を、iHA単独で又は反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中に混合してインキュベートした。結合TSG−6またはPTX3を、上に記載されるような、それぞれの修正したELISAによって測定した。TSG−6またはPTX3が単独で加えられたとき(p>0.05)と比較して、両方のタンパク質がiHAで同時にインキュベートされたときのTSG−6またはPTX3によるiHAへの結合に対する競合や相乗作用はなかった。これらのデータは、TSG−6およびPTX3に対するiHA上の結合部位が、異なっており、重なっていないかもしれないということを示した(図9)。
予め結合したTSG−6またはPTX3が、iHAに対する他のタンパク質の結合を阻害するかどうかを決定するために、iHAに対するTSG−6およびPTX3の逐次付加を検査した。6μg/mlのTSG−6または5μg/mlのPTX3を、上に記載されるように準備された、iHAに予め結合させた。8MのGnHClおよびPBSによる洗浄後、PTX3(0、5または5μg/ml)またはTSG−6(0、1.2、または6μg/ml)の連続する濃縮物を、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中で、それぞれ、予め結合したTSG−6/iHAまたは予め結合したPTX3/iHAによって続けてインキュベートした。続けて結合したTSG−6およびPTX3を、それぞれの修正したELISAによって測定した。
Covalink−NH 96ウェルを、上に記載されるように、PBS(対照)、HA(iHA)、または天然のHC−HA/PTX3(nHC−HA/PTX3)と共有結合させた。その後、TSG−6(6μg/ml)またはPTX3(5μg/ml)を、iHAに加えて結合させた。DMEM/10%のFBS中のRAW264.7マクロファージ(100μlの1×105細胞/ml)を、各々が連結したウェルへと播種し、1μg/mlのLPSで処置した。24時間のインキュベーション後、細胞形態を撮影した。
RAW264.7細胞を、実施例5におけるように培養し、PBS(対照)、固定化したHA(iHA)、TSG−6/iHA、PTX3/iHA、またはnHC−HA/PTX3上で4時間、1μg/mlのLPSで刺激した。総RNAを、細胞から単離し、M2マーカーIL−10およびM1マーカーIL−12p40のmRNA発現を、上に記載されるような定量的PCRによって測定さした(図12Aおよび図12D)。あるいは、細胞を、24時間、1μg/mlのLPS(図12Bおよび図12E)またはIFN−γ/LPS(図12C)で刺激し、IL−10、IL−12p70、およびIL−23のタンパク質発現を、それぞれのELISAを使用して、細胞培養培地中で測定した。
Covalink−NH 96ウェルを、上に記載されているような、PBS(対照)、HA(iHA)、または天然のHC−HA/PTX3(nHC−HA/PTX3)と共有結合させた。連続するTSG−6濃縮物(100μl中に0、0.24、1.2、6、12μg/ml)を、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中でiHAによって個々にインキュベートした。(Blom et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 298−304に従ってヒト血漿から調製した)ヒトIαI(5μg/ml)を、TSG−6と同時に又は連続して(2時間後)加えた。結合HC1、HC2(HC1およびHC2に対する抗体はアブカム,Cambridge,MAからのものであった)、またはIαI(DAKO、Carpinteria,CA)を、上に記載されるTSG−6およびPTX3のELISAに類似したそれぞれの修正したELISAによって測定した。
さらに、溶液中で遊離したまたはiHAに結合したTSG−6は、HCをIαIからiHAに移送しない(図13D)。
IαI(40μg/ml)およびTSG−6(6μg/ml)を、PTX3(20μg/mlまたは120μg/ml)とともに又はそれなしで、37℃で2時間、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中でインキュベートしれた。反応サンプルを、HC1(図14A)、HC2(図14B)、TSG−6(図14C)、ビクニン(アブカム、Cambridge,MA)(図14D)、およびPTX3(データは示されず)に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。HMW HAのない溶液中で、TSG−6は、HC1・TSG−6およびHC2・TSG−6の複合体を形成し、HMW IαI(図14Aおよび14B)を生成する。HMW IαIの形成は、図14Eで例証される。このデータは、HC1およびHC2の両方が、溶液中のTSG−6によってHMW HAに移送されることを示す。
固定化したHA(各ウェルにおける100μl中の〜14μg/mlまたは1.4μg)を、実施例3に記載されるように調製した。IαI(5μg/ml)およびTSG−6(12μg/ml)を、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中で37℃で2時間、PTX3(1、5または20μg/ml)とともに又はそれなしで、iHA上で同時にインキュベートした。8MのGnHClおよびPBSでの洗浄後、結合したHC1、TSG−6、およびPTX3を、それぞれの修正したELISA(それぞれ、図15のA、D、およびF)によって測定した。ウェルを、8MのGnHClおよびPBSで再び洗浄し、結合成分を有するiHAを、75mMのNaCl、pH6.0を用いて10mMの緩衝酢酸溶液中で60℃で2時間、1ユニット/mlのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、HC1(図15のB)、HC2(図15のC)、TSG−6(図15のE)、およびPTX3(図15のG)に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
固定化したHA(〜14μg/ml)を、実施例3に記載されるように調製した。IαI(5μg/ml)およびTSG−6(12μg/ml)を、37℃で2時間、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中のiHA上でインキュベートした。非結合のIαIおよびTSG−6を取り除いた後に、PTX3(1、5または20μg/ml)を有する又はそれなしでの反応緩衝液を、37℃で2時間、予め結合したHCおよびTSG−6でインキュベートした。8MのGnHClおよびPBSでの洗浄後、結合HC1、TSG−6、およびPTX3を、それぞれのELISA(それぞれ、図16のA、D、およびF)によって測定した。その後、ウェルを、8MのGnHClで再び洗浄した。その後、結合成分を有するPBS対照およびiHAを、60℃で2時間、1ユニット/mlのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、HC1(図16のB)、HC2(図16のC)、TSG−6(図16のE)、PTX3(図16のG)に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
しかしながら、PTX3は、TSG−6/HC−HA複合体中にこれ以上組み込むことはできない(図16のFおよびG)。iHA中の予め結合されたTSG−6はまた、PTX3がiHAに結合することを部分的に防ぐため(実施例4を参照)、この結果は、TSG−6およびIαIによるrcHC−HA/PTX3複合体の形成が、iHAへのPTX3結合が完全に除外される範囲で、TSG−6/iHAとは構造上異なることを示している。
固定化したHA(〜14μg/ml)を、実施例3に記載されるように調製した。PTX3(5μg/ml)およびiHAを、反応緩衝液(PBS中に5mMのMgCl2、pH7.5)中の37℃で2時間、反応緩衝液中でインキュベートした。非結合PTX3を取り除いた後に、TSG−6(6μg/ml)およびIαI(5、25および125μg/ml)を含有している反応緩衝液を、37℃で2時間インキュベートした。8MのGnHClおよびPBSでの洗浄後、結合HC1、TSG−6、およびPTX3を、それぞれのELISA(それぞれ、図17のA、C、およびE)によって測定した。その後、ウェルを、8MのGnHClで再び洗浄した。結合成分を有するPBSまたはiHAを、75mMのNaCl、pH6.0を用いて10mMの緩衝酢酸溶液中で60℃で2時間、1ユニット/mlのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、PTX3(図17のB)、TSG−6(図17のD)、HC1(図17のF)およびHC2(図17のG)に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
Covalink−NH 96ウェルを、実施例3に記載されるように、PBS(対照)、HA(iHA)、またはnHC−HA/PTX3と共有結合させた。IαI(5μg/ml)、TSG−6(6μg/ml)またはPTX3(5μg/ml)を、以下のように同時にまたは連続してiHAに結合させた:(1)(IαI/TSG−6/PTX3)/iHA:IαI、TSG−6、およびPTX3を、反応緩衝液中で37℃で2時間、iHAで同時にインキュベートした;(2)(IαI/TSG−6)/PTX3/iHA:IαIおよびTSG−6を、反応緩衝液中で37℃で2時間iHAで最初にインキュベートした。非結合のIαI/TSG−6を取り除いた後、8MのGnHClおよびPBSで洗浄し、PTX3を加え、反応緩衝液中で37℃で2時間インキュベートした;(3)(PTX3)/IαI/TSG−6/iHA:PTX3を、反応緩衝液中で37℃で2時間、iHAで最初にインキュベートさした。非結合のPTX3を取り除いた後、8MのGnHClおよびPBSで洗浄し、IαI/TSG−6を加え、反応緩衝液中で37℃で2時間インキュベートした。複合体の形成後、100μlのRAW264.7細胞(1×105細胞/ml)を、各々が連結したウェルへと播種し、1μg/mlのLPSで処置した。24時間のインキュベーション後、細胞形態を撮影した。
IαIの存在下で、iHA((IαI/TSG−6/PTX3)/iHAまたは(IαI/TSG−6)/PTX3/iHA)に対する同時に又は予め結合されたTSG−6は、細胞付着を阻害し、IαIのない状態に類似した細胞凝集(図18)を促進する(実施例5を参照)。対照的に、iHA[(PTX3)/IαI/TSG−6/iHA]に対する予め結合されたPTX3は、実施例5において示されるようなIαIのない予め結合されたPTX3に類似した細胞付着を促進する。後者は、nHC−HA/PTX3の陽性対照に似ている(図18)。
rcHC−HA/PTX3複合体上で培養されたマクロファージにおけるIL−10およびIL−12p40の発現
RAW264.7細胞を、実施例12に記載されるように、固定化した基質上でDMEM/10%のFBS中に培養し、4時間1μg/mlのLPSで刺激した。総RNAを単離した、IL−10およびIL−12p40 mRNAの発現を、上に記載されるように定量的PCRによって測定した(図19Aおよび図19C)。あるいは、細胞を、24時間1μg/mlのLPSで刺激し、細胞培養上清中のIL−10およびIL−12p70のタンパク質を、それぞれのELISAによって測定した(図19Bおよび図19D)。
別々の実験において、休止するRAW264.7細胞(無)の細胞培養上清、または24時間のDMEM/10%のFBS中のIFN−γ(200ユニット/ml)、LPS(1μg/ml)、IFN−γ/LPS、免疫複合体またはIC(LPS/IC)[ICは、150μg/mlのIgGオプソニン化のOVA(IgG−OVA)を含有し、25℃で30分間、OVA(Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)に対するウサギ抗OVA IgG(Cappel,Durham,NC)の10倍のモル過剰量を混合することによって作られた]を有するLPS(1μg/ml)、またはIL−4(10ng/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)の刺激による細胞培養上清中のIL−23タンパク質を測定した。細胞培養上清中のIL−23タンパク質を、製造業者のプロトコルに従って、IL−23 ELISA(Biolegend, San Diego, CA)によって測定した(図19E)。IL−23タンパク質は、休止するRAW264.7細胞、およびLPS(1μg/ml)、免疫複合体を有するLPS(LPS/IC)、またはIL−4(10ng/ml)による4時間の刺激下での細胞の細胞培養上清において検出できなかったが、IFN−γ(200ユニット/ml)およびIFN−γ/LPSによる24時間の刺激下で検知可能になった(図19E)。
別々の実験において、RAW264.7細胞を、上に記載されるような固定化した基質上で培養し、24時間IFN−γ/LPSで刺激した。細胞培養上清中のIL−23を、上に記載されるようにIL−23 ELISAによって測定した(図19F)。
同種異型の造血幹細胞移植(HSCT)は、血液悪性腫瘍のための治癒の可能性のある処置である。しかしながら、慢性移植片対宿主病(cGVHD)は、主な合併症のままである。GVHDは、45−60%でいくつかの眼症状発現を引き起こし、その中でも、眼乾燥は、同種異型のHSCTレシピエントのほぼ50%で生じる、最も頻繁な合併症である。実際に、眼乾燥は、cGVHDの診断に対する特有な兆候および症状である。cGVHDを有する患者は、cGVHDに関連する初期の軽度の眼乾燥疾患またはNIHのコンセンサス会議の分類に応じたいわゆる「cGVHDの示差的特徴」のいずれかを示す。
HSCT後の2つのタイプの眼乾燥が言及されている;1つは、眼乾燥の発症後すぐに生じる反射涙の減少を有する、重度の眼表面および涙機能の損傷を有し、一方で、もう1つは、正常な反射涙を有して軽度である。眼乾燥は、典型的に移植の6か月後に生じ、重症度は、cGVHDおよびマイボーム腺疾患の存在と関連していることが報告された。cGVHD関連の重度の眼乾燥の発症は、軽度の眼乾燥の発症より早い。例えば、重度の眼乾燥は、HSCTの6.8±2.5か月後に生じ、一方、軽度の眼乾燥は、HSCTの13.2±9.1か月後に生じる。25人のHSCT後の患者の50の眼と14人の年齢が一致した健康な対照の28の眼との比較試験は、MG閉塞、減少した角膜知覚、角膜の感受性、増強された涙液蒸発速度、減少した結膜のGCD、増加した結膜の扁平上皮化生および炎症細胞が、眼乾燥の被験体のない正常な対照およびHSCT後よりもcGVHD関連の眼乾燥においてより顕著であったことを示した。さらに、結膜の炎症細胞は、軽度の眼乾燥と比較して、重度の眼乾燥において著しくより多かった(P<0.03)。さらに、最も重度の眼乾燥患者は、全身性のcGVHDを有していたが、軽度の眼乾燥患者の群においては、ほんの少しの患者しか全身性のcGVHDを有さなかった。これらの結果は、cGVHD関連の重度および軽度の眼乾燥疾患における異なる病理過程を示唆した。包括的な眼表面の変更が、HSCT後の患者において顕著であったため、患者がcGVHD関連の眼乾燥を有してしていたか否かにかかわらず、それらの結果は、炎症過程の程度がcGVHD関連の眼乾燥の結果における中心的な役割を有するようであることを示唆している。結膜のブラシ細胞診の検体は、眼乾燥の被験体のない正常な対照およびHSCT後と比較して、cGVHD関連の重度の眼乾燥および軽度の眼乾燥両方の患者における炎症細胞のかなりの増加を示した。その上、重度の眼乾燥の検体における炎症細胞の数は、軽度の眼乾燥の検体におけるよりも著しく多かった。さらに、多くの炎症性マーカーが、cGVHD関連の眼乾燥患者から、結膜および涙腺の生検サンプル中に現れ、炎症が、cGVHD関連の眼乾燥の病因に関係することが確認された。
この例では、抗炎症効能は、HSV−1壊死性の角膜実質性角膜炎のネズミモデルにおいて試験される。Charles River Wiga(Sulzfeld,Germany)から得た合計240匹の雌のBALB/cマウス(6−8週齢)は、2mgのケタミンHClおよび400ngのメピバカインHClの腹腔内注射によって麻酔をかけられる。各マウスに対して、片目の中央の角膜は、外科用顕微鏡の下で、27ゲージの針を使用して、8つの水平の引っかき傷および8つの垂直の引っかき傷を有する十字模様で引っ掻かれる。各々の損傷した角膜に、HSV−1ウイルス(KOS株)の1×105のプラーク形成単位を含有している5μlの懸濁液が適用され、それらは、Vero細胞上で慣例的に繁殖され、−80℃で保存され、および標準プラークアッセイによって定量化される。HSV−1注入後の14日目に、重度の潰瘍化する実質性角膜炎を進行させたマウスの角膜は、研究用に含まれ(約50%の収率)、3つの群に細分化され、その各々は、40の角膜(臨床検査に対してn=6、組織学的検査に対してn=5、免疫染色に対してn=5、サイトカインELISAに対してn=6、TUNELに対してn=5、およびフローサイトメトリーに対してn=10、および摩耗/バックアップ(backup)に対してn=3)から成る。無感染の僚眼は、陰性対照群として使用される。陽性対照群は、眼瞼を閉じるために、2 10−Oナイロン縫合を使用して瞼板縫合術を受ける。実験のHC−HA/PTX3群は、陽性対照と同じ瞼板縫合術を受け、精製されたHC−HA/PTX3複合体を含有している組成物の局所適用を1日4回受ける。実験のHA群は、同じ瞼板縫合術を受けるが、1日4回HA単独の組成物の局所適用を受ける。2日後に、瞼板縫合術は、すべての3つの群で除去される。手術用顕微鏡(Zeiss,Germany)を使用して、各角膜の間質炎症の重症度は、0乃至4+のスコアによって評価され、1+は25%未満、2+は50%未満、3+は75%未満、および4+は75%から100%の間の、角膜血管新生、角膜浮腫、および角膜菲薄化のある角膜混濁を有している。CO2チャンバー(chamber)による安楽死に続く頸椎脱臼後に、各群からの5つの角膜は、CD11b(好中球およびマクロファージ)、F4/80(マクロファージ)、Gr−1(PMN)、およびCD3(T細胞)に対する一次抗体を使用して、凍結切片の免疫染色にさらされ(方法(Method)を参照)、各群からの別の5つの角膜は、ヘマトキシリン−エンジン染色およびTUNEL染色を受ける。さらに、各群からの6つの角膜から調製された角膜のホモジェネートは、IL−1α、IL−2、IL−6、IFN−γおよびTNFαのレベルのELISA測定にさらされる。コラゲナーゼによって各群の10の角膜から放出された細胞は、MTTアッセイによって生細胞を、およびAnnexin V−PE Apoptosis Detection Kit(BD−Pharmingen,Heidelberg,Germany)によってアポトーシス細胞を定量するフローサイトメトリーのために調製される。
本実施例では、抗瘢痕化の効能が、エキシマーレーザー支援のレーザー屈折矯正角膜切除術(PRK)のウサギモデルにおいて試験された。いずれかの性別の、2.5−3.0kgの体重(BW)の合計30羽のNew Zealand白ウサギが、使用され、以下の3つの群(各々n=10)に細分化される:非PRK対照群、PRK HA群、およびPRK HC−HA/PTX3群。PRKの前に及びすべてのCMTF試験の間、ウサギは、5mg/kgのBWキシラジンおよび30mg/kgのBWケタミンの筋肉内注射によって、および局所的に0.5%のテトラカインHCl点眼剤(Ortopics Laboratories Corp,,Fairton,NJ)によって麻酔をかけられる。2つのPRK群について、各動物の片目の角膜上皮は、切除領域よりわずかに大きな領域で鈍いスパーテルで軽く削ることによって、手動で除去され、剥皮された間質は、通常生理食塩水で灌注され、および過剰流体は、セルローススポンジで軽く除去される。標準の6mmの直径の、9.0 D PRKの近視矯正PRKは、118μmの予測される理論的な間質の切除深さを達成するために、LaddarVision Excimer Laser (Alcon, Ft. Worth, TX)を使用して行なわれる。PRKの直後およびその後に、PRK HC−HA/PTX3基は、HC−HA/PTX3複合体を含有している組成物を適用され、一方で、PRK HA基は、HA単独を含有している組成物を、1日4回、その後、合計3週間の両方で適用される。さらに、すべてのPRK処置された眼は、局所的な0.1%のナトリウムジクロフェナク(PRK後に一滴)および0.3%の硫酸ゲンタマイシン(3日間毎日3回)を注入される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、アテローム性動脈硬化の処置のために投与される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、肥満症およびインシュリン抵抗性の処置のために投与される。
対照的に、肥満中に脂肪組織に蓄積するATMは、強く極性化された炎症促進性のM1表現型を有している。これらの細胞は、高レベルのTNFα、IL−6、およびIL−1βを生成し、それらのすべても、インスリン抵抗性の個体から脂肪組織の増加したレベルにおいて観察される。高レベルの炎症促進性のメディエーターは、内在するインスリン処理の(processing)細胞の機能を局所的に低下させる。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、1型糖尿病の処置のために投与される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、線維症または線維性障害の処置のために投与される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、関節リウマチなどの、慢性炎症疾患の処置のために投与される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、心筋梗塞、脳卒中または敗血症などの疾病によって引き起こされた急性炎症反応の処置のために投与される。本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、心筋梗塞、脳卒中または敗血症などの疾病によって引き起こされた急性炎症反応を有する被験体に投与される。HC−HA/PTX3複合体は、例えば、静脈注射によって溶液として投与される。HC−HA/PTX3複合体が、M1の炎症性マクロファージの抑制によって、急性炎症によって引き起こされた損傷を減少させるか又は防ぐと予期される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、癌の処置のために投与される。
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたHC−HA/PTX3複合体は、非治癒性の皮膚の創傷または潰瘍の処置のために投与される。
本実施例では、HC−HA/PTX3は、高リスクの角膜移植の処置のために投与される。EGFP+マクロファージが両眼に対してLPS(片目に5μg)とともに基質内に注入される、Mafiaマウス。各眼において、OS(左眼(oculus sinister);左目)は、PBS(2つまたは4つの注射部位)で処置され、一方で、OD(右眼(oculus dexter)、右目)は、LPS注入直後に、HC−HA/PTX3(2つまたは4つの注射部位;1つの注射部位当たり、HC−HA/PTX3を含有している1mg/mlのHA組成物5μl)で1回処置される。全体の角膜の画像は、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目に、インビボでの生体顕微鏡法によって得られる。EGFP陽性細胞は、EGFP浸潤のレベルを決定するために、緑色蛍光の強度に基づいて数えられる。角膜移植のマウスモデルでは、結膜下部位へのHC−HA/PTX3の注入は、PBSのビヒクル対照と比較したときに、炎症(すなわちマクロファージの浸潤)を減少させ、移植角膜の生存率を改善すると予期される。
本実施例では、HA、PTX3、TSG−6、HC1、HC2、HC3およびビクニンのインビボでの分配を、免疫染色によって臍帯(UC)中で検出した。UCの組織凍結切片を、HA、PTX3、TSG−6、およびHCおよびビクニンを含むIαIの様々な成分のための免疫染色にさらした。UCは上皮の層から成り、間質は、羊膜下の層および3つの道管、すなわち、1つは静脈、2つは動脈(図20a、1つの動脈管を有する、相)を含むワルトン膠様質から構成された。強力な陽性HA染色を、UC上皮、羊膜下の層およびワルトン膠様質において観察し、弱いHA染色を、血管壁(図20a、HA)において観察した。HAase消化により、HAに対する特異的な染色に一致する、前述のHA染色は消滅した(図20a、HA(+HAase))。
本実施例は、AMからのPBS抽出後の不溶性部分が、任意のPTX3、TSG−6およびIαIに加えて、HC−HA/PTX3複合体もまだ含有していたか否かを決定づけた。PTX3、TSG−6およびIαIがあったかどうか確かめるために、タンパク質を、PBS抽出後に4MのGnHClによってAMの不溶性部分から抽出した。さらに、これらの2つの異なる抽出物中のPTX3、TSG−6、HCおよびビクニンを検出するために、PBSを有するUCも、4MのGnHClによって連続して抽出した。
本実施例では、HC−HA複合体を、4回の連続する超遠心分離によってAMEおよびUCEから精製し、HC、ビクニンおよびTSG−6に加えて、PTX3の存在を、ウェスタンブロットによってAMおよびUC HC−HAの複合体中で検出した。
本実施例は、より多くのHC−HA複合体をAMおよびUCから得ることができ、HC−HA複合体が、PTX3およびHC−HAのより合理的な構成を有し、およびそれが診療所においてより有効な治療上の役割を有していたことを決定づけた。AMおよびUCを、6MのGnHCl緩衝剤(200mMのトリス−HCl、pH8.0、6MのGnHCl、10mMのEDTA、10mMのアミノカプロン酸、10mMのN‐エチルマレイミド、2mMのPMSF)によって抽出し:AMおよびUCからのGnHCl抽出を、1:4(g/ml)でAMおよびUCの粉末に6MのGnHCl緩衝剤を加えることによって行った。サンプルを、4℃で一晩混合し、30分間4℃で、48,000gでの遠心分離にかけた。上清は、GnHCl抽出物であった。4th HC−HA複合体を、PBS抽出物からの4th HC−HAの精製用の手順と同じ手順を使用して、AMおよびUC GnHClの抽出から精製した。PTX3、HC、ビクニン、TSG−6および恐らく他のタンパク質を検査するために、HC−HA複合体の特徴づけを、ウェスタンブロッティングによって行った。HC−HAのアガロースゲルを、HAの内容物および分子量を見るために流した(run)。
GnHCl HC−HA中のHAは、充填ウェルからHAスミアの開始までの間で休止したが、その強度は、PBS HC−HAにおけるよりも強かった。さらに、HAaseは、GnHCl HC−HAにおいてHAスミアおよびHMW HAバンドを完全には無効にしなかった(図28、レーン6)。4thの超遠心分離後のGnHCl抽出からの上部画分(1−6の画分)もまた、GnHCl HC−HAの「下部画分」と同じHAスミアのパターンを示した(図28、レーン7および8)。これらの結果は、GnHCl HC−HAが、(PBS HC−HAよりも小さなMWを有する)より多くのHMW HAを含有したが、GnHCl HC−HAのウェスタンブロットにおいてHMW PTX3スミアの欠如に対応したHMW HAスミアの一部分を欠いていたことを示した。これは、PBS HC−HA中に存在した、欠けているHMW HAスミアが、PTX3およびHC−HAの交差結合によって少なくとも部分的に形成され、GnHCl HC−HAの充填ウェル中のHMW HAが、PTX3以外の成分によって複合化されたことを示した。
本実施例は、SDS−PAGEのゲルを流した後に、脱グリコシルのある又はそれのない、AMおよびUCからのGnHCl HC−HAのCB染色またはウェスタンブロット解析のいずれかによって、GnHCl HC−HAにおいて未知のバンドの同一性を決定した。サンプルを、PBSおよびGnHClの抽出物両方からの凍結乾燥されたAMおよびUCの4x HC−HA(30μgのHAを含有した)であった。凍結乾燥されたHC−HAを、3時間氷上で50μlのTFMSおよび20μlのアニソールでインキュベートし、125μlのN−エチルモルホリンを有するTFMSで中和した。サンプルを、−20Cで一晩または−80Cで1時間、5−10容量のアセトンで沈殿させた。サンプルを、遠心分離にかけ、乾燥したペレットを、電気泳動のためにSDSサンプルの充填緩衝剤に溶解した。ケラチナーゼ(Endo−β−ガラクトシダーゼ)での酵素的脱グリコシル化を、ケラタン硫酸鎖およびN結合したオリゴ糖を除去するために行うか、あるいはコンドロイチナーゼ(Cabc)での酵素的脱グリコシル化を、コンドロイチン硫酸鎖を除去するために行った。HC−HA(30μgのHAを含有した)を、2時間37Cで、pH5.8の、50mMの酢酸ナトリウム中で、0.1U/mlのケラチナーゼでインキュベートするか、2時間37CでPBS中で5U/mlのCabcでインキュベートした。SDS−PAGEのゲルを、CB染色の試験のために流し、その後、ウェスタンブロット解析が続いた。
ケラチナーゼを使用してすべてのグリカンを除去するために、およびコンドロイチナーゼを使用して特異的なグリカンを除去するために、HC−HAを、TFMSAによって脱グリコシル化して、AM GnHCl HC−HAにおいて140kDおよび〜80kDのバンドに変化があったかどうかを確かめ、および〜80kDのケラチン硫酸プロテオグリカンが、ケラトカン、PRELPまたはオステオグリカン(Osteoglycan)であるかどうかを決定した。上述の脱グリコシル化の効果を確認する第一工程として、クーマシー青色染色を行った。
AMおよびUCのPBSおよびGnHClの抽出両方から、4x 超遠心分離によってHC−HA複合体を精製した。GnEから精製されたHC−HAは、収率および化学構造においてPBS抽出から精製されたHC−HAとはかなり異なっていた(表1を参照)。量において、GnEから精製されたHC−HAは、PBSから精製されたものより多くのHAを含有していた。化学構造において:GnHCl HC−HAは、より多くのHMW HA(PBS HC−HAよりわずかに小さいMW)を含有していたが、(アガロースゲルからの)PBS HC−HAによって示されたウェスタンブロッティングにおいてHMW PTX3スミアに対応した一片のHMW HAを欠いていた。HAase消化を有して又は有さずに、GnHCl HC−HAは、PBS HC−HAよりも少ないHC1およびHMW PTX3を含有していたが、ケラチナーゼ+HAaseの消化後、より多くのPTX3が、(ウェスタンブロットから)検出され、これは、HMW PTX3が、GnHCl HC−HAにおいてケラタン硫酸化のタンパク質に密に結合されたことを示唆している。PBS HC−HAおよびGnHCl HC−HAはいずれも、TSG−6、HC2およびHC3を含有していなかった。ビクニンは、UC GnHCl HC−HA中に存在していたが、UC PBS HC−HA、およびAM PBSおよびGnHCl HC−HAの両方においてはそうではなかった。AM GnHCl HC−HAは、UC GnHCl HC−HAよりも比較的多く、豊富なデコリンを含有していた。AMおよびUC PBS HC−HAの両方は、わずかな量のデコリンを含有していた。AMおよびUC GnHCl HC−HAは、特にUC GnHCl HC−HAにおいて、豊富なビグリカンを含有していた。PBS HC−HAの中にはビグリカンは存在しなかった。AMおよびUC GnHCl HC−HAは、オステオアドへリンを含有していた。AMおよびUC PBS HC−HAは、ビグリカン、ケラタン硫酸を含有している種、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、PRELP、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチン、およびオステオポンチン、TSP−1を含有していなかった。AMおよびUC GnHCl HC−HAにおいて、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、PRELP、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチンおよびオステオポンチン、TSP−1、アスポリンはなかった。GnHCl HC−HAは、主として、(クーマシー青色染色のゲルからの)PBS HC−HAにおいて発見されなかったMW 200 kDa、80kDa、および60kDaを有する、可視のタンパク質バンドを含有していた。
本実施例では、AMから精製されたHC−HAにおけるPTX3発現およびAMにおけるHC−HA/PTX3の複合体の形成に対するその効果を検査した。
1.材料
塩酸グアニジン、塩化セシウム、EDTA、無水アルコール、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス塩基、Triton X−100、3−(N(N,N−ジメチルアニリンパルミチルアンモニオ)プロパンスルフォナート(Zwittergent3−16)、(4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフッ化物塩酸塩、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、E−64、ロイペプチン、およびペプスタチンAを含む)プロテアーゼ阻害剤の混合物、およびフッ化フェニルメタンスルホニルを、Sigma−Aldrich (St. Louis, MO)から得た。ストレプトマイセスヒアルロニダーゼ(HAase)およびビオチン化されたHA結合タンパク質(HABP)は、Seikagaku Biobusiness Corporation (Tokyo, Japan)からのものであった。ダルベッコ変法イーグル培地、Ham’s F12の栄養素混合物、ウシ胎児血清、ハンクス液、ゲンタマイシン、アムホテリシンBおよびRIPA緩衝剤を、Invitrogen (Grand Island, NY)から購入した。Slide−A−Lyzer Dialysis Cassettes (3.5K MWCO)を、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)からのものであった。BCA Protein Assay Kitは、Pierce (Rockford, IL)からのものであった。HA Quantitative Test Kitは、Corgenix (Westminster, CO)からのものであった。4−15%の勾配のアクリルアミドのreadyゲルおよびニトロセルロース膜は、Bio−Rad (Hercules, CA)からのものであった。IαIを、公開された方法(1,38)に従って、我々の研究所でヒト血漿から調製した。PTX3 mAb(MNB4)およびpAbは、Enzo Life Sciences, Inc. (Plymouth, PA)からのものであった。組換え型のヒトTNF、組換え型のヒトPentraxin 3/TSG−14およびヒト/マウスのTSG−6 MAb(MAB2104)は、R&D Systems (Minneapolis, MN)からのものであった。全長ITIH1に対するマウス抗ヒトITIH1ポリクローナル抗体およびアミノ酸124−321に対するウサギ抗ヒトITIH2ポリクローナル抗体は、Abcam Inc.(Cambridge, MA)からのものであった。HiPerFect Transfection ReagentおよびRNeasy Mini RNAの単離キットは、QIAGEN(Valencia,CA)からのものであった。内在性ヒトPTX3(ACACUUGAGACUAAUGAAAGAGAGA)を標的とする、およびsiRNA対照オリゴヌクレオチド(スクランブルしたRNA)siRNAを標的としないための、小型干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドは、OriGene Technologies, Inc (Rockville, MD)からのものであった。Western Lighting(商標)Chemiluminesence Reagentは、 PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA)からのものであった。超遠心機(LM8モデル、SW41ローター)は、Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA)からのものであった。
ヒト組織を、Declaration of Helsinkiに従って処理した。新鮮なヒト胎盤を、Baptist Health South Florida Institutional Review Boardによる認可(Protocol Number 03−028)によって、Baptist Hospital (Miami, FL)において選択的帝王切開で分娩した後の健康な母体から得た。主要なヒトAMの上皮のおよび間質の細胞(それぞれ、AMECおよびAMSCとして指定された)を、37℃で5%のCO2の加湿雰囲気下で、以前に記載されたように新鮮な胎盤から単離し(Chen et al. (2007) Stem Cells. 25: 1995−2005; Li et at. (2008) J. Cell. Physiol. 215:657−664)、補足的なホルモンの上皮培地(DMEM/F12(1:1、v/v)、5%(v/v)のFBS、0.5%(v/v)のジメチルスルホキシド、2ng/mlのEGF、5μg/mlのインスリン、5μg/mlのトランスフェリン、5ng/mlの亜セレン酸ナトリウム、0.5μg/mlのヒドロコルチゾン、0.1nMのコレラ毒素、50μg/mlのゲンタマイシン、1.25μg/mlのアンホテリシンBから成る、SHEM)中で培養した(Chen et al. (2007) Stem Cells 25:1995−2005; Chen et al. (2011) Tissue Eng Part C Methods 17:537−548)。培地を、2日ごとに変更した。80%のコンフルエンスでの細胞を、48時間、0.5%のFBSを含有しているDMEM/F12に切り替えて、細胞を休止させ、その後、RT−PCRおよびウェスタンブロット解析にさらす前に、4時間または24時間、20ng/mlのTNFまたは20ng/mlのIL−1βで処置した。アガロースオーバーレイの培養物に関して、AMEC、AMSCおよびHSFは、SHEM中の2x104/cm2の密度で、12ウェル(1x105細胞/ウェル)および6ウェル(2x105細胞/ウェル)のプレートにおいて播種される。培地は、1日目に、5%のKnockOut血清代替物および1mMの2−ホスホ−L‐アスコルビン酸を含有している無血清SHEMに変更され、さらに2日間インキュベートされる。培地の除去後、1mMの2−ホスホ−L‐アスコルビン酸を有するDMEM/F12における3%のアガロース(低融点型、VII型、Sigma、A9045)を、1mlまたは0.5mlでオーバーレイし、5ng/mlのTNFとともに又はそれなしで、6または12ウェルのプレートにつき、それぞれ、3mlまたは1.5mlの無血清SHEM培地を加える前に5−10分間、室温で1mmの厚さのゲル層を達成した。細胞を、5日目に培地変更の介入なしで採取した。
AMECおよびAMSCを、80%のコンフルエンスまで6ウェルのプレート中のSHEMにおいて培養した。細胞を、48時間0.5%のFBSによってDMEM/F12に切り替え、100nMのPTX3 siRNAまたはスクランブルされた(sc)核酸を用いてPepMute(商標) siRNA Transfection Reagentでトランスフェクトした。48時間後、細胞を採取し、RT−PCRおよびウェスタンブロット解析にさらした。
HC−HA複合体を、以前に記載されたように、AMおよび細胞培養から精製した(He et al. (2009) J. Biol. Chem. 284: 20136−20146; Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247−5257; He et al. (2008) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49:4468−447532)。簡潔に言うと、Bio−tissue, Inc. (Miami, FL)から得た、凍結保存されたヒトAMを、小片へとスライスし、液体窒素中で凍結し、BioPulverizerによって微粉末へと粉砕した。粉末を、1:1(g/ml)で冷たいリン酸緩衝食塩水(PBS)緩衝剤と混合した。混合物を、軽く撹拌しながら、1時間4℃で維持し、その後、4℃で30分間、48,000gで遠心分離にかけた。その後、上清(AM抽出物として指定される)を、10mMのEDTA、10mMのアミノカプロン酸、10mMのN−エチルマレイミド、および2mMのPMSFを含有している、8MのグアニジンHCl/PBS溶液(v/vの1:1の割合で)と混合し、塩化セシウムとの、それぞれ、1.35g/ml(AM抽出物)または1.40g/ml(細胞抽出物)の密度に調節され、48時間、15℃、35,000rpmで等密度遠心法にさらした。結果として生じる密度勾配を、12本のチューブに画分し(1ml/チューブ)、その中で、HAおよびタンパク質の内容物を、それぞれ、HA Quantitative Test KitおよびBCA Protein Assay Kitを使用して測定した。ほとんどのHAを含有していた、第1の超遠心分離からの画分を、貯蔵し、CsClの付加によって1.40g/mlの密度にし、超遠心分離にかけ、上に記載されるのと同じ方法で画分した。HAを含有していたが、検出可能なタンパク質を含有していなかった、第2の超遠心分離からの画分を、貯蔵し、CsClの付加によって1.42g/mlの密度で、第3および第4の超遠心分離を継続した。第2および第4の超遠心分離からの画分を、蒸留水中で透析し、その後、1時間0℃で、1.3%(w/v)の酢酸カリウムを含有している3容量の95%(v/v)のエタノールで2回沈殿させた。15,000gでの遠心分離後、ペレットを、簡単に空気乾燥し、−80℃で保存し、それぞれ、剤はされたので、簡潔に飛行機で乾かされ、AMの2nd HC−HAおよび4th HC−HAとして指定した。
アガロースオーバーレイを有する又は有さない、細胞培養物に加えてAMおよび絨毛膜切片(section)を含有しているヒト胎児膜を、15分間室温で、4%のパラホルムアルデヒドによって固定し、20分間、PBS中で0.2%(v/v)のTriton X−100で透過性にした。1時間PBS中で0.2%(w/v)のウシ血清アルブミンによって遮断した後に、切片を、4℃で湿度室において一晩、ビオチン化されたHABP(HAに対して、5μg/ml)、抗PTX3、抗HC1または抗HC2の抗体(すべて、ブロッキング溶液中で1:200に希釈された)でインキュベートした。PBSでの洗浄後、それらを、室温で1時間、Alexa Fluor 488 Streptavidin(HAに対して、1:100に希釈された)、またはそれぞれの二次抗体(すなわち、Alexa Fluor 488の抗マウスIgG、またはAlexa Fluor 555結合の抗ラットIgG)でインキュベートした。アイソタイプが一致した非特異的なIgG抗体を、対照として使用した。あるいは、切片を、固定前に、4時間37℃で、50U/mLストレプトマイセスのHAaseで処置した。核を、Hoechst 33342によって染色し、画像を、Zeiss LSM700の共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss,Germany)を使用して得た。
総RNAを、RNeasy Mini RNA単離キットを使用して、細胞培養物から抽出した。cDNAを、オリゴ(dT)プライマーにより、Cloned AMW First−Strand cDNA合成キットを使用して、1μgの総RNAから逆転写した。第1ストランドのcDNAを、AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mixおよび特異的なPTX3プライマー(46−48)を使用して、qPCRによって増幅した。グリセリンアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の遺伝子発現を、増幅された生成物の量を標準化するために使用した。
培養上清を集め、細胞可溶化物を、冷たいPBSで細胞を6回洗浄し、その後、軽く撹拌しながら4℃で30分間14,000gで遠心分離にかけ、1時間4℃でRIPA緩衝液中でインキュベートすることによって得た。培養上清および細胞可溶化物におけるタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kitで定量化した。サンプルを、25℃で1時間、50mMのNaOH中でインキュベートするか、または0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝剤(pH6.0)中に溶解し、20ユニット/mlのストレプトマイセスのHAaseで又はそれなしで、1時間60°Cでインキュベートした。その後、それらを、変性条件および還元条件下で、4−15%(w/v)の勾配アクリルアミドのreadyゲル上でSDS−PAGEによって分解し、ニトロセルロース膜に移した。その後、膜を、150mMのNaClおよび0.05%(v/v)のTween−20を含有している、50mMのTris−HCl、pH7.5の、緩衝液中で、5%(w/v)の無脂肪牛乳で遮断し、その後、異なる一次抗体および続くそれぞれのHRP結合の二次抗体での連続するインキュベーションを行った。免疫反応性のタンパク質を、Western Lighting(商標) Chemiluminesence Reagentによって視覚化した。
AMの上皮および緻密な間質における陽性PTX3染色。
抗ヒトPTX3抗体を使用する蛍光免疫染色を、上皮および無血管の間質の層からなる、新鮮なヒト胎児膜の断面上で行い、これは、緻密層および海綿層、および下位にある細胞が豊富な絨毛膜へとさらに細分化される(図33、相)。陽性PTX3染色は、上皮および緻密な間質の先端面において見られた。対照的に、PTX3染色は、海綿状の間質および絨毛膜(図33(PTX3))において著しく減弱された。HAase消化は、後者においてPTX3染色を増強せず、これは、これらの2つの領域内の弱いPTX3染色が、マスキング効果が原因ではなかったことを示唆している。ビオチン化されたHABPを使用して、強力な陽性HAの免疫染色が、AM間質で見られ、比較的弱い染色が、AM上皮において見られた(図33、HA)一方で、HAの弱い染色が、AM間質の下位にある絨毛膜の上部層おいて見られたが、強い染色が絨毛膜の下部層で見られた。この染色は、組織切片がHAaseによって予め消化されたときに消滅し(図33、HA(+HAase))、これは、HA染色が特異的であったことを示唆している。個々のHCの免疫染色はまた、AMの上皮、間質細胞およびマトリックス、および絨毛膜において、陽性染色を明らかにした(図33、HC1およびHC2)。これらの結果は、主に緻密な間質および上皮において優性なAM中のPTX3の存在を示唆した。
AMにおけるPTX3の存在をさらに調査するために、エステル結合を開裂する50mMのNaOHの処置前後に、等張塩緩衝剤によって得られたAM抽出物のウェスタンブロッティング分析を第1に行った。組換え型のPTX3は、45kDa、90kDa、180kDaおよびHMWの種として現われた(図34、レーン2)。可溶性のAM抽出物は、充填ウェル(主としてゲル化に入らない)の底部で、45kDaおよびHMWの種を明らかにした(図34、レーン3)。NaOH処置は、45kDaの種に影響を与えなかったが、HMWの種を完全に除去し、結果的に、PTX3のHMWスミアをもたらした(図34、レーン4)。これらの結果は、PTX3が、AMEにおいて単量体およびHMW複合体として存在していたことを示唆した。後者が、HC−HA間のエステル共有結合を開裂することができるNaOHによって、HMWスミアへと分離され得るため、充填ウェル中のHMW PTX3を含有している種は、HC−HAに結合するかもしれない。
PTX3が、AMの上皮および間質細胞培養物によって合成されたと、その後断定した。報告されたように、これらの細胞を培養し(Chen et al. (2007) Stem Cells 25(8):1995−2005; Li et al. (2008) J Cell Physiol. 215(3):657−64; Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433−12444)、RT−PCRのために総RNAをおよびウェスタンブロット解析のためにタンパク質を抽出し、それらをヒト皮膚線維芽細胞(HCF)と比較し、これは、TNFおよびIL−1などの炎症促進性のサイトカインの刺激下でのみPTX3 mRNAおよびタンパク質を発現すると報告された。予想通り、qRT−PCR結果は、PTX3転写物の発現率が、休止するHSFにおいて低かったが、TNFおよびIL−1βによってアップレギュレートされたことを示した(図35のA)。休止するAMECおよびAMSCにおけるPTX3転写物の発現は低かったが、TNFまたはIL−1βによって劇的に高められた(図35のA)。ウェスタンブロット解析は、PTX3タンパク質が、溶解物(45kDa)において低く、休止するHSFにおける培地中で検出不能であった(図35のB、レーン2)が、TNFまたはIL−1βの追加後に24時間、培地ではなく溶解物中で検出されたことを確認した。対照的に、PTX3タンパク質は、休止するAMECにおいて検出可能であり、溶解物(45kDa)および培地(45kDaおよび90kDa)の両方においてTNFまたはIL−1bよって顕著に増加され(図35のB、レーン5、6および7)、TNFは、IL−1bよりも有効であった。同じ結果が、AMSCで示された(図34のB、レーン8、9および10)。これらのバンドがTNFまたはIL−1bの下の変化しなかったことが原因で、すべての細胞からの溶解物中の75kDaおよび135kDaのバンドおよび培地中の50kDaのバンドが非特異的であったことを確認するために、PTX3 siRNAトランスフェクションを行い、溶解物中の45kDaの種および45kDaおよび90kDaの種の両方を実際にダウンレギュレートしたが、これらの非特異性のバンドではそうでなかった(図35のC)。これらの結果は、PTX3が、休止するAM細胞によって、実際に合成および分泌され、炎症誘発性の刺激によってさらにアップレギュレートされたことを集合的に示唆した。
以前の研究は、HC−HA(すなわち、SHAP−HA)複合体が、FBSを補足された培地中の培養されたマウス経皮線維芽細胞の細胞層からを単離され得、単離されたHC−HAが、FBSから派生したIαIのHC1およびHC2の両方を含有していることを示した(Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247−5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725−26730)。しかしながら、我々は、AM細胞が、その内因的に生成されたIαIを使用することによって、HC−HAを生成すると報告した(Zhang et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:12433−12444)。AM細胞が、TNFおよびIL−1によってさらに増加されたPTX3タンパク質を合成したため、我々は、それらが、PTX3をも含有していたHC−HAを生成したかどうかを決定することを目指した。血清添加の条件下で、炎症促進性の刺激、例えばTNFおよびIL−1)下のみでPTX3を発現した、対照としてのHSFを使用し(Yoneda et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:5247−5257; Huang et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:26725−26730)(図35)、TNFを有する又は有さない、無血清と血清添加の両方の条件下で培養された、AMECとAMSCを比較した。また、細胞単層上に3%のアガロースを重ね、なぜなら、この方法によって、分泌されたプロコラーゲンが、角膜実質細胞の培養物上の培地内よりもむしろ、細胞表面で又はその近くに捕捉されると分かったからである(Hassell et al. (2008) Experimental Eye Resarch. 87:604−611; Etheredge et al. (2010) Matrix Boil. 29:519−524)。
5日間のオーバーレイ後、HSF、AMSCおよびAMECは、特に血清添加の条件下で、より緻密になった(図36)。上皮の形態は、AMECにおいて、より異なった。
対照的に、陽性のHA染色は、細胞外マトリックスにおいてHAで共局在化されたため、細胞表面および細胞外マトリックス上の線維ネットワークとして休止するAMSCにおいて検出された(図38のCおよび6K)。TNFは、PTX3染色の強度およびHA原線維の量を増加させた(図38のDおよびK)。
NaOH処置は、60kDaおよび50kDaでHMW PTX3スミアおよび2つの種を大幅に増加させた(図39、レーン14)。NaOHが、HCとHAとの間のエステル結合を壊し、HC−HAの溶解につながったため、これらの結果は、HMW PTX3が、HC−HA複合体から放出されたことを示唆した。まとめると、上述の結果は、HSFではなくAMSCが、PTX3を含有しているHC−HA複合体を生成したことを示唆した。
HC−HA/PTX3複合体がどのように生成され得るかをさらに確証するために、我々は、HA、TSG−6、IαIおよびPTX3を用いて、インビトロでHC−HA/PTX3複合体を再構成したい。まず、プラスチック上でHAを固定化し、組換え型のTSG−6を加えることに成功し、IαIの源として、IαIまたは血清を精製した。TSG−6が、固体面上で固定化されるHAに結合することによって、安定したTSG−6/HA複合体を形成することができ(Wisniewski et al. (2005) J Biol Chem. 280:14476−84)、遊離した及びHA結合したTSG−6の両方が、HCをIαIから固定化したHAへと移動させ、HC−HAを形成することができる(Colon (2009) J Biol Chem. 284:2320−31)と報告されている。抗IαI抗体を使用するウェスタンブロットは、予想通り、対照iHA単独において種を検出しなかった(図40のA、レーン2)。IαIおよびTSG−6が、iHAに同時に加えられたときに、弱い220kDaのIαI、85kDaのHC2、強力な〜80kDaのHC1および50kDaの種が検出され(図40のA、レーン3)、これは、HC1およびHC2が両方とも、TSG−6の存在下のiHAに移動され、HC−HAを形成したことを示唆している。HC2のバンド強度に対するHC1のバンド強度の比較は、より多くのHC1が、TSG−6によってHC2よりもiHAに移動され、結果的に、先細りの50kDaの種をもたらしたことを示唆した。PTX3が、iHAへのIαIおよびTSG−6と同時であったときに、IαIの種の強度は減少したが、HC1強度は、PTX3の用量依存的な方法で増加した(図40のA、レーン4−6)一方で、HC2は、検知不能であり、これは、PTX3が、TSG−6によって触媒された固定化したHAへのHC2ではなくHC1の移動を優先的に促進したことを示唆している。PTX3がIαIおよびTSG−6の同時の追加後に加えられたときに、IαIまたはHC2ではなく、HC1が検知され、HC1強度も、PTX3の用量依存的な方法で増加され(図40のA、レーン7−9)、これは、PTX3が、固定化したHAへのHC2ではなくHC1の移動を促進したことを確証している。これらの結果は、PTX3が、固定化したHAへの優位なHC1の移動を一意に促進して、同時であろうが連続していようが、HC1−HA複合体を形成したことを示唆した。抗TSG−6抗体を使用するウェスタンブロットは、35kDaのTSG−6単量体および75kDaの二量体の両方が、iHA上のIαIおよびTSG−6の中央のPTX3の同時又は連続の付加によって形成されたrcHC−HAにおいて検出されたことを示した。TSG−6バンドの強度が、PTX3用量依存的に減少したため、固定化したHAに結合されたTSG−6が、PTX3によってはじき出され(competed out)得たことが示唆される(図40B)。抗PTX3抗体を使用するウェスタンブロットは、PTX3がIαIおよびTSG−6を同時に加えられたときの、弱い四量体および二量体のバンドを有する充填ウェルにおける顕著なHMW PTX3スミアを示し、それらの強度が、PTX3の用量依存的な方法で増加したことを示した(図40のCおよびレーン4−6)。この結果は、PTX3が、rcHC−HA複合体に優先的および強力に結合され、その中で、結合が、8MのGnHCl洗浄に耐性があったことを示唆した。対照的に、PTX3が、IαIおよびTSG−6の付加後に連続して加えられたときに、HMW PTX3および四量体および二量体の種(図40のC、レーン7−9)を検出せず、これは、PTX3と予め形成されたrcHC−HA PTX3との間の結合が、8MのGnHCl洗浄に対する耐性が強くなかったことを示唆している。故に、これらのインビトロの再構成実験は、HC−HA/PTX3の形成を可能にするために、PTX3が、インビボでのHA、IαIおよびTSG−6と同時に生成されなければならなかったことを示唆した。この解釈は、インビボの組織切片に加えてAMSCによって形成された細胞外マトリックスにおける、HA、HCおよびPTX3の免疫共局在化によって支持された。
固定化したHC−HAは、TGF−β1の発現をダウンレギュレートすることによってTGFβ1シグナル伝達を阻害するが、TGF−β3シグナル伝達をアップレギュレートする。TGFβ1シグナル伝達のそのような阻害は、GFβRIIおよびTGFβRIIIのさらなる抑制が原因の、血清または外因性のTGF−β1の付加によるチャレンジ(challenge)に抵抗し得る。したがって、固定化したHC−HAは、SMAD2/3シグナル伝達アルファ平滑筋形成の発現を阻害することによって、角膜の線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を防ぐ。この作用はまた、角膜の線維芽細胞を角膜実質細胞に戻すのに十分強力である。HC−HA(不溶性(I))は、追加の小さなロイシンが豊富なタンパク質(SLRP)の構成においてHC−HA(可溶性(S))とは異なり、BMPおよびそれらの受容体の発現をアップレギュレートすることによって、TGFβ1およびBMPのシグナル伝達の発現を活性化し、それ故、凝集の形成を一緒にさらに促進する、pSMAD1/5/8を活性化する。これらの作用は、角膜の線維芽細胞を神経冠前駆体にさらに脱分化することができる。
DMEM/10%FBS中で播種されたHCFは、不溶性HC−HA上でのみで72時間ごとに凝集物を形成した(図41)。そのような凝集は、DMEM/ITS(インスリン/トランスフェリン/セレン)の培地中の24時間の血清飢餓後も持続した。その後、細胞を、3つの異なる培養培地へと培養した:A−48時間のDMEM/IT;B−24時間のDMEM/IT、24時間のDMEM/10%のFBS;C−24時間のDMEM/ITS、10ng/mlのTGF−β1での24時間のDMEM/ITS。HC−HA中で培養された細胞は、4X HC−HA(Gn)上で小さな凝集物を形成するが、他の培養条件では違った(図41)。しかしながら、固定化した基質上のDMEM/10%のFBSにおける2時間の播種後に、対照中のHCFだけがよく付着した。HA、HC−HA[HC−HA(4X、PBS)および4X、GnHCl]上の細胞は、すべて丸まっており、これは、それらが十分に付着されていなかったことを示している。72時間のインキュベーション後、すべての細胞は、よく付着したが、固定化したHC−HA上に細胞はほとんどなかった。これらの基質上の細胞の数は、HC−HA(4X、GnHCl)上よりもHC−HA(4X、PBS)上でより多かった。HCFは、24時間の培養後にHC−HA(Gn)上で凝集物を形成し始め、72時間の培養後に、より大きな凝集物に凝縮された。TGFβ1の刺激後、HC−HA(4X、PBS;4X、Gn)上で培養されたHCFの凝集を観察した。
本実施例では、BMPシグナル伝達に対する追加のTGF−β1による固定化したHC−HAの効果を検査した。pSMAD1/5/8の活性化を介するBMPシグナル伝達の活性化も決定した。
休止状態下では、HAおよびHC−HA(PBS)およびHC−HA(Gn)の両方は、BMP6の転写物の発現を、それぞれ、7倍および4倍活性化する(図46)。TGFβ1の存在下で、HAおよびHC−HA(PBS)およびHC−HA(Gn)の両方は、HCFにおいて、それぞれ、BMP4の転写物の発現を6倍、11倍および6倍、およびBMP6のmRNA発現を30倍、37倍および46倍活性化し、これは、HAおよび可溶性および不溶性両方のHC−HAが、BMP4/6発現をアップレギュレートすることができる一方で、追加のTGFβ1が、BMP4およびBMP6のシグナル伝達をさらに劇的にアップレギュレートしたことを示している。BMP7およびBMP9は検出されなかった。
角膜基質に埋め込まれた神経冠由来の細胞の特有の集合体である、角膜実質細胞は、角膜に特異的なケラトカンを含む、硫酸ケラタンを含有しているプロテオグリカンを発現する。ケラトカン(Kera)は、成人の脊椎動物の眼中の角膜に特異的なケラタン硫酸プロテオグリカン(KSPG)である。それは、小さなロイシンが豊富なプロテオグリカン(SLRP)の遺伝子ファミリーに属し、脊椎動物の角膜基質における細胞外のKSPGの主成分の1つである。角膜のKSPGは、マトリックス集合において中心的な役割を果たし、これは、角膜の透明度の要因である。ルミカンは、角膜のKSPGのおよそ半分を構成する。残りの角膜のケラタン硫酸のほとんどは、ケラトカンを変性する。成人の組織では、ケラトカンは、角膜基質に限定され、ケラトカン発現は、角膜実質細胞のための表現型マーカーと考えられる(Liu et al.(2003) J. Biol Chem. 278(24):21672−7; Carlson et al. (2005) J Biol Chem. 280(27):25541−7)。プラスチック皿上で、ヒト、ウシ、およびウサギの角膜実質細胞は、血清添加培地中で培養されたときに、それらの特徴的な樹状形態およびケラトカン発現を失う(Espana et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12): 5136−41 ; Espana et al. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985−91)。これらの露出した細胞は、ケラタン硫酸を含有しているプロテオグリカン、ケラトカンおよびCD34の発現をダウンレギュレートし、コンドロイチンデルマタン硫酸を含有しているプロテオグリカンおよびα−SMAの発現をアップレギュレートし、これは、これらの細胞が、より分化されるようになることを示している。
HAは、ケラトカン mRNAの発現を4倍アップレギュレートした(図50)。ヒト角膜の線維芽細胞を、固定化したHAで又はそれなしで、48時間プラスチック上で播種し、24時間血清なしで飢えさせ、その後、mRNA定量化およびSMAD2/3シグナル伝達の決定のために採取される前に24時間、TGFβ1で又はそれなしで処置した。TGFβ受容体のタンパク質の決定に関して、タンパク質発現がmRNA発現に遅れているため、細胞を、タンパク質サンプルの収集前に48時間、TGF−β1で又はそれなしで処置した。TGF−β1 ELISAに関して、細胞を、24時間、TGF−β1で又はそれなしで処置し、その後、24時間(および48時間)新鮮な培地中で培養した。上清を、TGF−β1 ELISAのために収集した。TGF−β2およびTGF−β3のELISAに関して、細胞を、48時間、TGF−β1で又はそれなしで処置した。上清を、TGF−β2およびTGF−β3のELISAのために収集した。予想通り、固定化したHC−HAは、ケラトカンのmRNA発現を14倍および16倍促進し、これは、これらのHCFが、TGFβ1なしでHC−HA上で培養されたときに、はるかに若いことを示している。TGFβ1チャレンジ後、ケラトカンのmRNA発現は、プラスチックおよびHA上で劇的にダウンレギュレートされた。しかしながら、ケラトカン発現はそれでも、HC−HA(可溶性、PBS)上で3倍に維持された。ケラトカンの発現は、HC−HA(不溶性、Gn)上で存在しなかった。我々は、HC−HA(I)上の結果として生じる表現型が、角膜実質細胞よりもさらに若いはずであると予想している。
実施例35は、HCFが、外因性のTGF−β1によるチャレンジ下で、筋線維芽細胞の分化を受けるのを防がれるだけでなく、外因性のTGF−β1によって又はそれなしで、ケラトカンの発現により角膜実質細胞に戻されたという強い証拠を示した。それ故、HCFが、特に固定化したHC−HA(不溶性、GnHCl)上で外因性のTGF−β1で播種されたときに、より若い前駆体へとさらに再プログラムされ得るかどうかを検査し、これは、TGF−βシグナル伝達を抑制し、BMPシグナル伝達を促進するが、ケラトカン発現を止めると示された。血管新生前駆体において見られると我々が最近報告したように、ESCおよび内皮の前駆体および周細胞において見られる多くのマーカーの発現を検査した。HC−HAによって調節されたこれらの条件下でのHCFの再プログラミングの可能性をさらに調査するために、成人の分化した線維芽細胞をiPSCへと再プログラムする重要な役割を果たすと報告された、4つの重要な転写因子、すなわち、Sox2、Oct4、c−Myc、およびKLF4の発現を検査した。
遺伝子発現の検査を、実施例35において上に記載されたHCF培養物上で行った。結果は、HCFが、プラスチック対照(p<0.05、n=3)と比較して、外因性のTGF−β1によってチャレンジされたときでさえ、4X HC−HA上で、cMYC、KLF−4、Nanog、ネスチン、Oct4、Rex−1、SOX−2、およびSSEA−4などの、より多くの(2乃至6倍)ESCマーカー、および2乃至4倍以上のESCマーカー発現したことを示した(図52)。これらの結果は、HC−HA、特にHC−HA(不溶性)が、HCFをより若い前駆体へと再プログラムすることができることを示唆している。
本実施例では、未分化のMC3T3−E1細胞の生存度および分化に対する溶液中のHC−HA(可溶性画分)およびHAの効果を評価した。MC3T3−E1は、C57BL/6マウスから確立された骨芽細胞の細胞株である。MC3T3−E1細胞は、骨芽細胞および骨細胞に分化する能力を有し、インビトロで鉱化された骨組織を形成することが実証された。
以前の結果は、HC−HAおよびAMPが、RANKL(International PCT Publication No. WO 2012/149486を参照)によって誘発されたRAW264.7細胞からの破骨細胞の分化を用量依存的に阻害することを示した。AMP(羊膜粉末(Amniotic Membrane Powder))は、羊膜の凍結乾燥された及びその後微粉砕された形態である。本実施例では、骨形成のためのHC−HAおよびAMPのIC50を測定し、破骨細胞形成のためのIC50と比較する。
実験計画:
MC3T3−E1培養物
10%のFBS、100ユニット/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを含有している、α−MEM(Invitrogen, Cat. # ICM810)の基本培地から成る、Millipore In Vitro Osteogenesis KitからのMC3T3−E1細胞のモデル系を利用した。細胞を、50,000個の細胞/cm2で播種し、100mLの細胞培養皿において37.0℃で95%の空気および5%のCO2中に培養し、コンフルエンス前に継代した。一旦十分な細胞数が得られると、細胞を、1ウェル当たり100μL容量の基本培地(52ウェル)で、96ウェルの培養皿中で1.6x105細胞/mlで播種した。各濃縮を、ALPアッセイに対して2ウェルおよびAR−S染色に対して2ウェルの、4ウェルで行った。細胞を、5%のCO2の加湿空気中で37℃で培養し、培地を、コンフルエンスまで48−72時間ごとに変更した。
各ウェルからの培地を、細胞を妨害することなく、吸引した。細胞を、200μLのPBSで1X洗浄した。細胞を、100μLの70%のエタノールを加えて、15分間R.T.でインキュベートすることによって固定した。その後、固定剤を除去し、細胞を、細胞単層を妨害することなく、過剰な蒸留水によって3X(各5分)で洗い流した。水を除去し、100μL/ウェルのアリザリンレッド染色液を加えた。ウェルを、1時間R.T.でインキュベートした。過剰な色素を除去し、細胞を、脱イオン水で4X洗浄した(各洗浄による5分間の軽い揺れ(rocking))。0.1−0.15mLの水を、各ウェルに加え、細胞が乾燥するのを防いだ。染色された細胞を、顕微鏡下で撮影した。
150μLの各サンプルを、透明な下部の96ウェルのプレートに加え、OD405で読み取った。アリザリンレッド濃度対OD405のプロットを作成した。
各ウェル(96ウェルのプレート)中の細胞を、PBSで洗浄し、R.T.で20分間振とうすることによって、蒸留水中の100μLの0.2%のTriton X−100中で溶解した。200μLの蒸留水および200μLのCalibrator溶液(キットによって供給された)を、対照のための別々のウェルに移した。50μLのサンプルを、別々のウェルに移した。150μLの使用液(200μLのアッセイ緩衝剤、5μLのMg酢酸塩(5mM)、2μLのpNPP液体基質(10mM))を、サンプルウェルに加えた(最終的な反応容積は、200μLであった)。プレートを、短い間軽く叩いて混合した。OD405を、プレートリーダー上で0分および4分で読み取った。
位相差顕微鏡法
陰性対照は、13日間の誘発(図55)にわたって、六角形の形状を維持した。単層は、陽性対照よりも滑らかであり、これは、後者において、より多くの細胞または細胞のより多くの堆積が生じたことを示唆している。陽性対照中の細胞は、誘発が始まった後に、紡錘形状になった。時間が経てば経つほど、スピンドル状の環は、誘発の4日目ごろに、プラスチック培養物の(〜2−3mm離れた)縁に沿って発達した。
陰性対照は、淡いピンクを示す単層の部分を有する青灰色の背景色をもたらした。対照的に、陽性対照は、ローズピンク色の背景をもたらした(図56)。
両方のAM誘導体の群において、陰性対照は、陽性対照よりも5倍以上のALP活性を示し、これは、陰性対照におけるサンプルの喪失から生じ得、サンプルサイズを縮小させた(図58)。より小さなサンプルサイズは、陽性対照よりも陰性対照に対して8x高い標準偏差値に寄与し、このはるかに大きな変化は、その増加に起因し得る。
陰性対照と比較して、陽性対照は、より多くの紡錘状細胞を示し、プラスチックウェルの縁のまわりで環を形成し(図55のA)、アリザリン染色による変色(図56のA)、およびOD405の検出可能であるが有意でない変化(図57のA)を示した。以前に、5x104細胞/35mmのプラスチック皿で播種されたMC3T3−E1細胞はまた、4日目の後に層状の膠原細線維の形成、18日目までに層状の原線維の形成、および21日目の誘発までに結節状領域の形成を明らかにした。(Sudo (1983) J. Cell. Biol. 96: 191−198)。この事前の研究は、我々が観察したのと同じ環の形成を示さなかった。あるいは、それは、環を層状の膠原細線維として解釈したかもしれない。もしそうであれば、環領域は、鉱化を起こしやすいはずである。
その後、アリザリンレッド染色法は、サンプルサイズを増加させ、ヒトMSCのアリザリン染色および当該技術分野で既知の他の方法に使用される、Gregory et al. ((2005) Analytical Biochemistry 329: 77−84)による方法論を組み入れることによって改善された。Gregory et alの方法、上に記載される我々の先の方法、および本実施例で概説される新しい方式の比較は、下記の表に提供される。以前の研究は、誘発下でのMC3T3−E1の分化が、3つの段階、すなわち、増殖(1〜9日目)、ECM形成(9〜16日目)、および鉱化(形成されたECM中の鉱質沈着物(deposit minerals))(16日目+)へと細分化され得ることを示した。(Quarles et al. (1992) Bone Miner Res. 7(6):683−92; Hong et al. (2010) Exp Cell Res. 316(14):2291−300)。異なる群からの研究を比較するために、コンフルエンスから始まる事象を0日目として設定することが重要であった。
細胞を、パ−トAおよび表5に記載されるように、分化培地中で培養且つ刺激した。分化培地を、18日間3日ごとに変更した。0.1μg/mlのHC−HAおよび125μg/mlのAMPを、アッセイのために利用した。ARSアッセイを、表5に言及されるような変化とともにパ−トAに記載されているように行った。
細胞形態および環の形成
非誘発性の細胞は、播種(図59のA)後に水平な立方体形状を達成した。細胞の境界は、4日目に隆起した縁とともにより画定され、6日目に紡錘形状を発達させた細胞もあった。スピンドル細胞または多層は発達されなかった。
陰性対照の単層は、幾つかの領域(図63)において淡いピンク色に染色された。陽性対照は、中心で淡いピンク色に染色されたが、スピンドル環の領域で明るい深紅色を示し、これは、MC3T3−E1細胞が、単層の残りよりも、環に鉱化を多量に堆積させることを示している。0.1μg/mlのHC−HAと陽性対照との間の中心の単層およびスピンドル環における染色の強度および色の両方は、同じであった。細胞の上部のAMPの粒子状物質は、赤褐色に染色された。真下の細胞の目視観測は、染色された粒子状物質によって妨害されたが、開口部は、顕著な細胞単層の欠如を示し、陰性対照に類似して、淡いピンク色に染色される低密度細胞もあった。AMPで処置された細胞は、可視性のスピンドル環を示さず、ARSは、陽性対照に類似して、縁のまわりを深紅色に染色しなかった。
AMP処置された(125μg/ml)抽出物は、陽性およびHC−HAの両方の処置群からのOD(P=0.039)の統計的に有意な5倍の増加を示した。
細胞形態
αMEM w/10%のFBS中で培養されたMC3T3−E1細胞は、コンフルエンスまで成長し、立方体形状を発達させた。Aim #1および#2における結果のように、細胞は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニンの付加なしでは分化しなかった。誘発培地なしでは、スピンドル細胞およびスピンドル環は形成されなかった(図59)。MC3T3−E1細胞は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸およびメラトニンによって分化へと誘発された。播種後、滑らかな単層が、立方体形状の細胞によって形成された。3日間の誘発後、細胞は、紡錘形状を達成した。5日目までに、細胞は、伸張し、スピンドル状になった。
ARS染色は、以前に報告されたよりも劇的に異なる色を示した(図66)。ARSは、陰性対照の細胞単層において灰青色の代わりに淡いピンク色を染色した。ARS染色はまた、陽性対照およびHC−HAで処置された細胞における以前の結果から、茶さび色の代わりにスピンドル環において濃縮された明るい深紅色を示した。AMPの粒子状物質は、暗褐色の代わりに赤褐色で染色され、真下の細胞は、茶さび色の代わりに淡いピンク色に染色された。ARS溶液の分解は、変色に寄与し得る。
上述の予備的研究は、小さなサンプルサイズおよびARSアッセイの不完全な発達が原因で、骨芽細胞分化上のHC−HAおよびAMPのための用量−反応曲線に対する統計的に有意な結果を示さなかった。これは、0.1μg/mlのHC−HAが、鉱化を増強し得ることを示唆した。さらに、10μg/ml乃至25μg/mlでのHC−HAは、細胞の生存率に影響を与え、鉱化を減少させるかもしれない。HC−HAに対する用量曲線は、10μg/mlを超える濃度と同様に、0.1μg/mlより下のより低い濃度も含むはずである。HC−HAとは異なり、5μg/ml乃至125μg/mlでのAMPは、鉱化を促進し得る。この実験では、HC−HAおよびAMPの用量応答を、パートBの方法を使用するので再試験した。この実験では、ARS染色を、15日目にアッセイするために使用し、染色且つ定量するための、10%の酢酸を使用する修正されたプロトコルを利用した。
3T3−E1細胞に基づいてパートBで示されるのと同じモデル系を、αMEM培地w/10%のFBSにおいて96ウェルプレート中で3x104細胞/cm2/ウェルを播種することによって使用した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンの誘発培地を加えることによって分化するように誘発した。
各条件について、N=3を試験した。コンフルエンス後に(0日目=播種)、HC−HAを、0.02μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、および25μg/mlで加え、一方で、AMPを、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、および125μg/mlで加えた。ARS染色のために、パートBの修正された方法を使用した。
陰性対照のMC3T3−E1細胞は、培養中に、スピンドル形状またはスピンドル環を発達させなかった(図66のA)。単層の中心および周辺は、ベージュ色に染色された。陽性対照の細胞は、紡錘状およびスピンドル状の細胞を発達させ、培養する(4日目の誘発)D5のまわりにスピンドル環は出現した。ARS染色は、中心に淡い栗色を示し、主として、濃い深紅色でスピンドル環において濃縮された。1.25μg/mlまでのHC−HA濃度の増加は、細胞形態またはARS染色の強度およびパターンに対する効果がなかった。2.5μg/mlで、MC3T3−E1細胞のスピンドル環は分解し始め、ARSの色は、深紅色から赤褐色に変わった。20μg/mlによって、細胞は、その紡錘およびスピンドルの形状を失い;細胞の縁も、それほど画定されず、それほど隆起しなかった。細胞密度は減少し、単層は以前のように隆起されて出現しなかった。GnHClは、ARS色素を抽出することに成功し、OD450値の変動係数は、5%から19%までの範囲であった。陽性対照は、統計的に有意な増加したOD値を示した(図66のB)。
細胞形態/ARS染色
先の結果に類似して、MC3T3−E1の分化は、立方体形状から、紡錘およびスピンドルの形状に変化する細胞から進行する。誘導時間が増加するとともに、スピンドル環が、ウェルの縁に沿って(〜2mm離れて)形成され、単層を時間とともに収縮する。陽性対照とは異なり、陰性対照は、スピンドル状の細胞やスピンドル環を決して発達させなかった。陰性対照の単層は、均一なベージュ色で染色されたが、陽性対照は、中心で淡い栗色/ピンク色を示し、スピンドル環で濃縮された濃い深紅色を示した。
ARS染色は、AMPによる染色の明らかな用量依存的増加を示し、125μg/mlで鉱化の統計的に有意な増加を示したが、そのような変化が、AMPへのARSの非特異的結合によってもたらされるかどうかは不明瞭であった。AMPが、特に高用量でHC−HAとは異なって作用した、すなわち、鉱化作用を促進するが、それを阻害しなかったため、AMPの作用が、AMPとの細胞の直接的な接触に依存するかどうかについては除外することが重要であった。この問題は、HC−HAが通り抜けるのに十分であるが、AMPの粒子状物質を排除するのに十分に小さい、3μmの孔径を有するトランスウェルの使用によって対処された。この孔径を有する利用可能なトランスウェルのプレートが、24ウェルのプレートに合うため、アッセイの培養条件は、それにしたがって変更された。125μg/mlのAMPの濃度を、アッセイのために使用した。
MC3T3−E1細胞(P2での細胞;ATCC、カタログ番号:CRL−2593(商標))を、1x105細胞/mlの密度で、12ウェルの水平で、透明な底部ウェル上に播種した。上で使用されるのと同じAMPの貯蔵溶液(AMP−4;Lot #CB102971)を、PBS中で5mg/mlとして調製した。トランスウェルのないウェルに関して、17.5μLのAMPの貯蔵溶液を、0.7mlの培養培地(基剤または誘発培地)中に加え、α−MEM w/10%のFBS(誘発なし)または誘発培地#1に続いて#2(誘発あり)のいずれかにおいて、125μg/mlのAMPの濃度を達成した。トランスウェルを有するウェルに関して、17.5μLのAMPの貯蔵溶液を、上に記載されるのと同じ方法で、トランスウェルの膜の中心へと直接加えた。培養培地(10%のFBSを有するα−MEM;上に記載されるような誘発培地#1および#2)を、0日目の誘発後に3日ごとに変更した。細胞単層が、70%のエタノールの代わりに4%のパラホルムアルデヒドで固定され、1時間の代わりに2時間染色されたことを除いて、ARSの染色および定量化の手順を、上に記載されるように行った。
すべての誘発細胞は、誘発の4日目に環の形成を発達させた(図68)。環は、約2−3mm離れて、プラスチックウェルの縁のまわりで細胞の層から構成された。それらは、層において成長し、巻き付けられ、その後、単層は、多くのウェル中でプラスチックから分離された。誘発なしで、細胞は、培養期間の増加とともに、幾つかの紡錘形状と、主として六角形形状を維持し、単層は、誘発細胞と比較して、滑らかなままであった(図69)。誘発は、細胞を紡錘形状にし、単層は隆起され、細胞間の境界は、より明確になった。誘発によって、4日目までに、スピンドル状の環は、培養皿の縁に沿って発達すると観察された。AMPでの処置は、細胞の生存率に影響を与えず;また環の形成にも影響を与えず、これは、AMP誘発に悪影響を与えなかったことを示唆している。トランスウェルの付加は、細胞の成長または形態に影響を与えなかった。
恐らく皿のサイズがより大きかったため、環の形成を容易に観察した(図69のA)。しかしながら、恐らく固定剤の変更が原因で、陰性対照用の背景色は、先の実験とは異なっていた。さらに、特に環領域において、陰性および陽性の対照の間に、より劇的な変色があった(図70)。陽性対照中のトランスウェルの導入は、細胞形態(図69のB)またはARS染色の色(図70)に影響を与えなかった。
我々の結果は、成長および分化の15日目の陽性対照と比較されたときに、125μg/mLのAMPが、MC3T3−E1細胞(図65)の鉱化を著しく増加させたことを示した。AMPは、培地に直接送達され、AMPの粒子状物質は、細胞単層の上部に沈降し;それ故、Aim 1BにおけるAMPの効果は、直接的な接触を必要とした。
MC3T3−E1細胞を、上に記載されるように、αMEM培地+10%のFBSを用いて、24ウェル中で、3x104細胞/cm2/ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンを加えることにより分化するように誘発した。各条件について、N=3を試験した。0日目は細胞播種の日として見なされ、誘発が細胞コンフルエンス後に続いた。合計の誘発時間=15日。2つの実験群があった:AMPは誘発培地に直接加えられ、AMPはトランスウェルによって送達された。AMPの濃度を、125μg/mlで以前と同じように維持した。陰性対照(誘発なし)を、AMPとともに又はそれなしで、しかし挿入物なしで加えた。上に記載されるように、ARSの染色および定量化を、誘発の15日目に行った。
誘発培地なしで、陰性対照の細胞は、幾つかの紡錘形状を有する六角形形状を維持した(図72のA)。スピンドル状の形状は観察されず、スピンドル環も周辺に沿って形成されなかった。ARSは、単層を淡いピンクに染色した。誘発によって、陽性対照の細胞は、スピンドル状の形状を達成した。細胞の境界はより顕著であり隆起され;スピンドル環が、ウェルの縁の近くの周辺に沿って形成された。単層の中心は、栗色で染色され、ARS染色は、強い深紅色を有するスピンドル環において濃縮された。AMPでの処置によって直接、AMPの粒子状物質は、単層上に沈降し、細胞の形態を不明瞭にした。しかしながら、培養ウェルの縁の近くで、AMPの粒子状物質間の間隙は、両方の群における真下の顕著な単層の欠如を示した。AMP処置単独と誘発を有するAMP処置との間の細胞形態に差はなかった。可視性の細胞は、形状がスピンドル状であった。陽性対照のようなスピンドル環は観察されなかった。ARS染色は、中心に深紅色を示し、周辺に沿って赤茶色染色を示した。染色する色およびパターンは、誘発群と非誘発群との間で判別不能であった。トランスウェルを介するAMPでの処置は、単層上のAMP粒子の沈降をもたらさなかった。細胞は、伸張し、スピンドル状になり、ウェルの縁に沿ってスピンドル環が形成された。陽性対照のように、単層の中心は、栗色に染色され、ARS色素は、強い深紅色を有するスピンドル環において濃縮された。GnHClは、ARS色素の抽出に成功し、OD450値の変動係数は、2%から15%までの範囲であった(図72のB)。
形態/ARS染色
21日間、α−MEM w/10%のFBS中で培養された陰性対照は、縁に沿ったスピンドル状の細胞またはたスピンドル環を発達させなかった。AA、β―グリセロリン酸塩、およびメラトニン、MC3T3−E1細胞による20日間の誘発後の陽性対照は、ウェルの縁のまわりの、スピンドル状の細胞およびスピンドル環を発達させた(図72)。細胞単層のARSの色および染色パターンは、陰性および陽性の対照間で異なっていた。陰性対照の単層は、陽性対照と同じくらいの量の色素を収集できず、均一な淡いピンク色を示した。陽性対照の単層の中心は、栗色に染色され、ARS色素は、強い深紅色へとスピンドル環中で濃縮された(図72)。
GnHClは、単層からのARS染色の抽出において必要であり、十分であった。対照を比較すると、陰性対照から陽性対照(p<0.01)へのOD450の統計的に有意な2倍の増加があった。また、陰性/陽性対照からAMP+誘発へのODの約6倍の増加があった。96ウェルから24ウェルへの表面積の6.5x増加があり、これは、ODの増加の原因となり得る。また、20日目の培養でARSの染色および定量化を行ない、これによって、培養期間を2日伸ばし、鉱化も増加し得る。
我々の結果は、AMPが、前骨芽細胞に接しているときにMC3T3−E1の分化を促進することを示した。しかしながら、AMPが、間葉系幹細胞(MSC)などの骨芽細胞系に対する、それほど分化しなかった及びそれほどコミット(committed)しなかった細胞株の成長および分化にどれほど影響を与えるかは不明確であった。
以下の細胞株を使用した:MC3T3−E1(ATCC,Manassas, VA)、ヒト骨髄細胞由来の間葉系幹細胞(Lonza,Wlakerfield,MD)、角膜輪部由来ニッチェ細胞(Tissue Tech, Miami, FL)、ヒト羊膜(hAM)間質細胞(Tissue Tech, Miami, FL)、およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(ATCC,Manassas, VA)。
HUVEC細胞は、4日目までに細胞成長の網状パターンを形成した(図74A)。しかしながら、細胞死があり、21日目まで細胞の網の上部に死細胞が沈降していた。ほとんどのHUVEC細胞は、10%のパラホルムアルデヒドで固定され得ず、ARSによって染色されたわずかな細胞が、暗褐色を示した。AMPが、HUVEC細胞の上部に沈降し、細胞の網を覆ったが、AMPの粒子状物質は、ARS染色後に、細胞によってプラスチックウェルから分離され;わずかな残りのAMPの粒子状物質も、暗褐色に染色された。
結果は、誘発剤またはAMPのいずれかによって、HUVECの陰性対照において鉱化が示されなかったことを示した。hBM MSCおよびhAMの両方の間質幹細胞に関して、鉱化が、誘発剤によって促進され、これは、AMPによって促進されたものよりも少なかった。
MC3T3−E1細胞は、成熟した骨芽細胞になる前に、以下の3つの主要な段階を受ける:増殖、マトリックス沈着/成熟、および鉱化(図75)。我々の結果は、AMPが、MC3T3−E1細胞において鉱化を促進することを示した。ARS染色を考察すると、AMPで処置された細胞が、陽性および陰性の対照より濃く及び密に染色されたことを示す(図72)。さらに、AMPの粒子状物質が単層を覆ったときに、AMPの粒子状物質の真下の単層が欠如していた(図77)。1つの可能性として、AMPが、MC3T3−E1細胞用のスキャフォールドとして作用しており、3Dマトリックス中のこの相互作用によって、細胞が成長し、鉱石化したことが挙げられる。したがって、AMPは、MC3T3−E1細胞の増殖を増加させることによって鉱化を促進しているのかもしれない。
MC3T3−E1細胞を、上に記載されるように、αMEM培地+10%のFBSを用いて、24ウェル中で3x104細胞/cm2/ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンを加えることによって分化を誘発させた。各条件について、N=3が試験された。1日目は細胞播種の日として見なされ、誘発が細胞コンフルエンス後に続いた。合計の誘発時間=20日。4つの時間点をサンプリングした:1日目、2日目、7日目、10日目、13日目、20日目。各時間点は、以下の4つの群を有した:陰性対照、陽性対照、AMP処置のみ、AMP+(w/誘発)。利用したAMP濃度は、125μg/mlであった。
鉱化
1日目に、細胞を、24時間播種し、誘発培地またはAMPによっては処置しなかった(図76)。細胞は、円形であり、単層上でより隆起したようである。ARS染色は、淡いベージュ色を示し、鉱化がほとんどなかった。2日目に、誘発なしで、陰性対照の細胞は六角形になった。ARSは、単層を汚れた、淡い桃色に染色した。誘発によって、陽性対照の細胞は、鉱化がほとんどなく及び淡い桃色でのARS染色を有する陰性対照と同一に見えた。AMPでの処置は、MC3T3−E1細胞形態を変化させ、紡錘形状の細胞およびスピンドル細胞が観察された。ARS染色は、1日目から鉱化の増加を示したが、単層を淡いピンク色に染色した。しかしながら、AMPの粒子状物質が沈降した領域は、赤褐色に染色された。誘発を有するAMP処置はまた、幾つかの細胞形態を変化させた。紡錘形状の細胞が存在し、単層はまた、淡いピンク色に染色され、AMPの粒子状物質のまわりの領域は、赤茶色に染色された。7日目に、陰性対照の細胞は、より六角形に現れ、細胞の境界がより定義される。鉱化が増加し、単層は、淡いいベージュ色に染色された。陽性対照は、誘発によって、スピンドル形状の細胞およびスピンドル環を発達させた。ARSはまた、鉱化するにつれて、濃いピンク色を染色した。AMPおよび誘発を有するAMPでの処置によって、AMPの粒子状物質が沈降し、細胞形態は見られなかった。個々の細胞の細胞単層は見られなかった。ARSは、AMPの粒子状物質のまわりの領域が赤褐色に染色され、単層が淡いピンク色に染色されたことを示した。GnHClは、ARS色素の抽出に成功し、OD450値の変動係数は、6%から16%までの範囲であった。
陰性対照のMC3T3−E1細胞は、2日後にARS染色の増加、およびそれ故、細胞培養が増加する鉱化を示す(図76)。先の結果に類似して、誘発培地によって培養された陽性対照のMC3T3−E1細胞は、7日目までに、細胞形態の変化を受け、紡錘形状の細胞およびスピンドル環を発達させた(図76)。1日目のAMP処置後(D2)、誘発によって又はそれなしで、細胞形態の変化が見られた。細胞は、スピンドルになり、線維芽細胞さえ作られた(図76のA)。この変化は、陰性または陽性の対照で観察されなかった。さらに、この変化は、少なくとも4日間の培養後に、誘発されたMC3T3−E1細胞で観察された(図76のA)。
決定するために、AMPが、細胞増殖の促進によって鉱化を促進したかどうかを決定するために、MC3T3−E1細胞を、αMEM培地+10%のFBS中で、96ウェル中の3x104細胞/cm2/ウェルで播種した。コンフルエンス後に、AMP群を、培地中で3日ごとに加えた、新鮮な125μg/mlのAMPによって処置した。MTTアッセイを、1、2および4日目に行い、BrdUアッセイを、1、2および16日目に行った。
細胞の生存度は、MTTアッセイによって示されるように、1日目から4日目までMC3T3−E1細胞で増加した。AMP処置されたMC3T3−E1細胞は、1日目から2日目までの細胞の生存度の減少を示したが、未処置の細胞にように増加傾向が続いた。しかしながら、AMP処置された細胞における4日目の細胞の生存度は、未処置のMC3T3−E1細胞の約半分であった。細胞増殖は、BrdUによって測定されるように、1日目から16日目までずっと減少した。AMP処置された細胞とは異なり、未処置のMC3T3−E1細胞におうて、細胞増殖は、2日目までに半分以上減少した。16日目までに、AMP処置された及び未処置のMC3T3−E1細胞は、同じレベルの細胞増殖を示した。
ヒト骨髄間葉系幹細胞(hBMMSCs)は、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞などの、複数の組織タイプに分化することができる(Born, 2012 J Cell Biochem. 113(1):313−21.)。インビボに移植されたときに、それらは、新しい骨を形成することができ、インビトロで、hBM MSCは、β−グリセロリン酸塩、アスコルビン酸、ビタミンD3、および低用量のデキサメタゾン中の培養によって、骨形成に向けられる。hBMMSCsに対する骨形成は、ECMの具体的な転写因子、接着分子およびタンパク質を含む、骨芽細胞関連の遺伝子の発現によって調節される(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313−21;Vater (2011) Acta Biomater. 7(2):463−77.)。成熟した骨芽細胞への進行は、MC3T3−E1の進行を反映し、細胞の拡大能力の損失、骨形成のマーカー発現の増加、およびECMの鉱化とともに生じる(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313−21)。最初に、細胞は、コラーゲンI(Col I)の発現によってECMの合成を開始する。同時に、骨特異的なアルカリフォスファターゼ(bALP)の発現は増加し、4日目までに、対照から誘発された細胞(6x104細胞/60mmの培養皿)中のALPレベルの著しい増加を観察することができた(Born (2012) J Cell Biochem. 113(1):313−21; Jaiswal (1997) J Cell Biochem. 64:295−312)。分化が継続と、細胞は、骨シアロタンパク質(BSP)、オステオポンチン、オステオネクチンおよびオステオカルシンなどの、タンパク質を生成する。最終的に、ECMの鉱化は、MC3T3−E1細胞における骨形成のように、成熟した骨芽細胞を示す。
MC3T3−E1またはヒト骨髄MSCの細胞を、上に記載されるように、αMEM培地+10%のFBSを用いて、24ウェルのプレート中で3x104細胞/cm2/ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸およびβ−グリセリンリン酸を加えることによって分化を誘発させた。各時間点での各々のアッセイについて、N=2を試験した。4つの時間点をサンプリングした:0日目(コンフルエンス後だが、誘発/処置の前)、1日目、4日目、および6日目。各時間点は、以下の3つの群を有した:陰性対照、陽性対照、AMP処置のみ。使用されるAMP濃度は、125μg/mlであった。
hMSC発現
AMPは、24時間の培養期間内に、BMP2およびBMP6の転写物の強い内因性の発現を誘発する(それぞれ、60倍および5倍)(図78A)。BMP2は、D1(120倍)でそのピークに達し、低下を示す前の4日目まで、高レベル(60乃至10倍)を維持した。対照的に、BMP6は、4時間でピークに達し、その後、1日目から徐々に低下した。比較として、AMPは、BMP4、BMP7およびBMP9の発現レベルを変化させなかった。それにもかかわらず、AGは、4日目にのみBMP2およびBMP6の軽度のアップレギュレーション(1−2倍)および1日目の後にBMP4の顕著なアップレギュレーション(4−10倍)を誘発した。比較として、AGMは、BMP7およびBMP9の発現をいずれも変化させなかった。
MSCは、骨前駆体が、さらに系列経路の下に既に押されているため、多能性であり、骨形成のみをもたらすはずであることが知られている。予想とは異なり、BMP2発現は、特にヒトMSCと比較して、マウス細胞においてかろうじて発現された(図79)。BMPは、ヒトにおいて骨形成促進において有効でないことが示され、マウス細胞においても有効であるともいえない(Osyzka et al. (2004) Cells Tissues Organs. 176(1−3):109−19. , Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res. 52(5):408−14)。BMP−2の発現は、遺伝子アレイによって示されるように、MC3T3細胞において顕著ではない(Beck et al. (2001) Cell Growth & Differentiation 12: 61−83)。ヒト細胞と齧歯類細胞との間で見られる違いは、ヒト細胞におけるSmad1とは異なり、齧歯類Smad1が、骨形成中にERKリンカーのリン酸化を受けないことを示し得る。あるいは、齧歯類細胞におけるSmad1活性は、ERK媒介性のリンカーのリン酸化によって抑制されないかもしれない(Skarzynska et al. (2011) Connect Tissue Res. 52(5):408−14)。不十分な反応性のヒトMSCにおけるBMP誘発性の骨形成は、ERKの調節(阻害)およびホスファチジルイノシトール 3−キナーゼ(PI3−K)の経路を必要とし;インスリン/IGF−I活性化されたPI3K/AKTの経路の阻害によって、ヒトMSCの無血清培養中のBMP誘発性のアルカリフォスファターゼおよびオステオポンチンの発現は減少するが、SmadsのBMP活性化は増加する(Osyzka et al. (2005) Endocrinology. 2005 (8):3428−37)。
先の実験は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニン(AGM)などの誘発剤とは関係なく、鉱化を促進するAMPの特有の特性を明確に実証した。これらの実験では、AMPの効能を決定するために、AGMの存在下または不存在下で、AMPを、ネズミの骨芽細胞の始原細胞株(MC3T3)に加えた。GnHCl抽出方法によるアリザリンレッド染色を、さらなる定量化のために、複数の時間点で使用した。AMPが、AGMとは関係なく鉱化を増強しただけでなく、より速い速度で鉱化を増強したと結論付けた。AMPのさらなる検査は、AMPによって示された骨誘発性の効果が、直接的な細胞の接触を必要とすることを示した。すなわち、AMPとの直接的な接触の下では、細胞は、AGMの導入なしで、鉱化を加速し増強するであろう。
ネズミのMC3T3−E1細胞(C−136)を、液体窒素フリーザーから取り出し、80%のコンフルエンス〜1.5x106細胞[4*(3.1x104)*9=1,116,000細胞]まで3日ごとに変更された、αMEM培地(100mmの皿当たり10ml)+10%のFBS中で、100mmの皿(5皿)上で成長させた。その後、細胞を、3.1x104細胞/cm2/96のプラスチックウェルで播種した。培地(96ウェル当たり100ul)を、2−3日ごとに、すなわち、0日目(水曜)、2日目(金曜)、および5日目(月曜)に交換し、培養を8日目に終了する。N=4を、条件に従って試験した。
対照群:
陰性対照:従来の96ウェルプレートではなし。
陽性対照1:従来の96ウェルプレート上のAGM。
陽性対照2:3日ごとに従来の96ウェルプレート上で125μg/mlのAMPを加えた。
実験群:
陰性対照:Covalink−NH 96ウェルプレート
実験群1:3日ごとにCovalink−NH 96ウェルプレートAGMを加えた。
実験群2:20μg/mlのHAをCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化した。
実験群3:20μg/mlのHAをCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化し、3日ごとにAGMを加えた(H−124)。
実験群4:20μg/mlのnHC−HC/PTX3をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化した。
実験群5:
20μg/mlのnHC−HC/PTX3をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化し、3日ごとにAGMを加えた。
MC3T3−E1細胞を、8日間、異なるウェルプレート上で培養した。8日目に、位相コントラスト写真を、ウェルから撮り、それは以下で見られる(図79A、79B)。陰性対照ウェルは、円形細胞を示し、ARSは非常に淡いピンク色を染色した。誘発培地を有するウェルは、はるかに明るい赤色を示し、スピンドル細胞は、ウェルの周辺上で見られた。ARS染色は、外側周辺の環でより豊富に見られた。AMPでの処置は、ARS処置後に深紅色を示し、細胞は、AMPがそれらの上に沈降したため、確認はかなり難しかった。(固定化したHC−HA上に他の細胞型で凝集が見られたが)実験中に凝集は見られなかった。顕微鏡写真を、6、7および8日目に撮った。
骨形成および軟骨形成に対する主要な転写因子(それぞれ、Runx2およびSox9)は、14日間の培養期間にわたって、両方のHC−HA条件下の細胞によって発現された。可溶性および不溶性の両方である、HC−HA/PTX3は、BMP2の発現を促進することができ、骨誘発性の薬剤のないBMP6の程度まで、AGM(すなわち、アスコルビン酸、グリセリンリン酸、メラトニン)が、市販で提供されている(以下を参照)。
培養条件:Lonza(Basel,Switzerland)から購入したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を、液体窒素フリーザーから取り出し、80%のコンフルエンスまで3日ごとに変更された同じ培地中で、100mmの皿上で成長させた。細胞培養培地は、10%のウシ胎児血清および抗生物質を含有しているαMEMであった。培養培地(100mmの皿当たり10ml)を、3日ごとに変更し、細胞は、上述の所望の細胞数に達するまで、80%のコンフルエンスでサブ流路で処理された(subpassaged)。実験のために、細胞を、骨誘発性の薬剤、アスコルビン酸 2−リン酸塩、グリセロール 2−リン酸塩およびメラトニン(AGM)によって又はそれらなしで、固定化したHA、HC−HA(PBS)またはHC−HA(Gn)上で、3.1x104細胞/96プラスチックウェルで播種した。加えたAGMの終末濃度は、それぞれ、0.2mM、10mMおよび50nMであった。細胞が播種されたときに(0日目)、AGMを同時に加え、mRNAを、1、7および14日目に抽出した。遺伝子発現を定量化するために、qPCRを行った。培地(96ウェル当たり100ul)を、3日ごとに取り替えた。
陰性対照:Covalink−NH 96ウェルプレート
実験群1:3日ごとにCovalink−NH 96ウェルプレートAGMを加えた。
実験群2:20μg/mlのHAをCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化した。
実験群3:20μg/mlのHAをCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化し、3日ごとにAGMを加えた。
実験群4:20μg/mlの4X nHC−HC/PTX3をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化した。
実験群5:20μg/mlの4X nHC−HC/PTX3をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化し、3日ごとにAGMを加えた。
実験群6:20μg/mlの4X nHC−HC/PTX3(GuHCl抽出)をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化した。
実験群7:20μg/mlの4X nHC−HC/PTX3(GuHCl抽出)をCovalink−NH 96ウェルプレート上に固定化し、3日ごとにAGMを加えた。
ARSの染色および定量化を、上に記載されるように、14日目の培養物上で行った(図81A、81B)。
実験的および臨床的な研究は、羊膜(AM)、AM抽出物、およびnHC−HA/PTX3[インター−α−トリプシンインヒビター(IαI)およびヒアルロナン(HA)の重鎖(HC)によって形成された共有結合型錯体]が、炎症促進性の反応を抑制することを示した。本実施例は、nHC−HA/PTX3/PTX3が、T細胞応答を調節することができ、ネズミの角膜の同種移植片拒絶反応を減少させることができることを実証している。
機能障害の涙症候群としても知られている、眼乾燥は、世界的に高い罹患率および際立った死亡率を有する一般的な眼表面の疾患である。それは、涙機能ユニット(LFU;角膜、結膜、涙腺、およびマイボーム腺)の慣性的な自己反応性T細胞媒介性の炎症および機能不全によって特徴付けられた、自己免疫性ベースの炎症性疾患である。シェーグレン症候群(SS)は、単核細胞による唾液および涙腺の浸潤によって特徴付けられた、慢性的自己免疫疾患であり、実質組織の続発性損傷を引き起こす。
種:C57BL/6マウス
エンドポイント:角膜の上皮性関門機能(OGD染色)
サンプルサイズ:1群当たり15匹のマウス
群:2つの対照群および3つの処置群(PBS、nHC−HA/PTX3、およびAMP):1)非眼乾燥、未処置の対照(UT)― 別々の動物施設の部屋で保持される;2)実験的な眼乾燥、未処置の対照(EDE);3)PBS;4)nHA−HC/PTX;5)AMP。
乾燥応力のモデルは、5日間(月曜−金曜)、環境的に管理された部屋で、涙分泌の薬理学的なコリン作用遮断および空気通風および低湿度への曝露によって作り出される。マウスは、ケージを通る気流を可能にするワイヤーメッシュと交換された側面を有する一般的なマウスケージから成る、特別に設計された穿孔されたケージに入れられる。各ケージは、一定の空気の流れの前に置かれる(電気ファン)。涙腺分泌は、5日間1日4回(8:30am、11:30am、1:30pm、4:30pm)、スコポラミン(0.2mL中に0.5mg、Sigma−Aldrich)の皮下投与によって阻害される。環境的に管理された部屋の湿度は、〜25−30%の相対湿度に維持され、これは、4つの持ち運び可能な除湿器および天井の1つの除湿器ユニットによって達成される。
各実験中に、3つの対照が含まれている:
未処置の対照は、40〜70%の相対湿度下で、動物施設で保持される一群のマウスから成る。
これらのマウスは、決して、DSにさらされたり、局所的処置を受けることはない。
眼乾燥の対照は、環境的な眼乾燥チャンバーに入れられるが処置を受けない、一群のマウスから成る。
ビヒクル対照は、DSにさらされるがPBSを受ける、一群のマウスから成る。
さらに、2つの実験群が含まれる:nHA−HC/PTX3およびAMP
5日目の朝に、マウスは、涙量の測定後に、スコポラミンの1回のS.C.投与を受けた。スコポラミン投与2時間後に、角膜染色を、70kDaの分子サイズ(Molecular Probes)の結合した蛍光色素である、Oregon Green Dextran (OGD−488)を使用して行った。その手順は、安楽死の1分前の、ガラスの毛管ピペットを使用する、角膜上の0.5μlのOGDの滴下から成った。マウスを、イソフルラン麻酔ガスの吸引に続く、頸椎脱臼によって安楽死させた。その後、眼を2mlのBSSで洗い流した。余分な液体を、角膜に触れることなく、濾紙によって眼表面から慎重にふき取って乾かした(blotted)。両眼のデジタル像を、1秒の曝露時間の中、CoolSnap HQ2の冷却CCDカメラを有するNikon SMZ−1500の立体顕微鏡を使用して、470nmの励起および488nmの発光波長下で捕らえた。各動物からの両眼を評価した。中心角膜における固定された定関心領域(1mm直径の円)の蛍光強度を、Nikon Elementsのソフトウェアを使用して、3枚のデジタル像において測定し、データは、データベース(Excel, Microsoft)に保存される。結果を、階調の平均±標準偏差として表わした。3回の別々の実験からの結果を、群の統計的な比較のために平均化した。
統計分析を、GraphPad Prism 5.0のソフトウェア(GraphPad Inc)を使用して行った。群間の全体的な違いを決定するために、一元配置分散分析(ANOVA)を使用し、その後ポストホックテスト(Tukey’s post hoc)が続いた。非対合t検定は、2つの実験群間の統計的な違いを評価するために使用される。
HC−HAは、血管新生を促進するために、IGF1−HIF1α−VEGFシグナル伝達を活性化し、これは、ヒト角膜の線維芽細胞中のTGFβ1の付加によってさらに促進される。
Claims (148)
- 再構成されたHC−HA/PTX3(rcHC−HA/PTX3)複合体を生体外で生成する方法であって、
固定化したrcHC−HA/PTX3複合体を形成するために、(i)固形の支持体に固定した高分子量ヒアルロナン(HMW HA)、(ii)ペントラキシン 3(PTX3)タンパク質、(iii)重鎖1(HC1)を含むインターαインヒビター(IαI)タンパク質、および、(iv)腫瘍壊死因子αで刺激された遺伝子6(TSG−6)を接触させる工程を含む、方法。 - (a)PTX3とHMW HAの固定化した複合体(固定化したPTX3/HA)を形成するために、(i)固形の支持体に固定化した高分子量ヒアルロナン(HMW HA)と、(ii)ペントラキシン 3(PTX3)タンパク質を接触させる工程、および、
(b)固定化したrcHC−HA/PTX3複合体を形成するために、重鎖1(HC1)を含むインターαインヒビター(IαI)タンパク質と、腫瘍壊死因子αで刺激した遺伝子6(TSG−6)とに、固定化したPTX3/HAを接触させる工程、を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)TSG−6にあらかじめ結合したrcHC−HA複合体を形成するために、(i)固形の支持体に固定された高分子量ヒアルロナン(HMW HA)、(ii)重鎖1(HC1)を含むインターαインヒビター(IαI)タンパク質、および、(iii)TSG−6を接触させる工程、および、
(b)rcHC−HA/PTX3複合体を形成するために、TSG−6にあらかじめ結合したrcHC−HA複合体を、ペントラキシン 3(PTX3)タンパク質に接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。 - TSG−6は、HAとのIαI HC1の共有結合を触媒する、請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)の後で、かつ、工程(b)を行う前に、結合していないPTX3タンパク質を取り除く工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 工程(b)の後に、結合していないTSG−6を取り除く工程をさらに含む、請求項2乃至5のいずれかに記載の方法。
- PTX3タンパク質は、天然のPTX3タンパク質または組み換えのPTX3タンパク質であり、TSG−6タンパク質は、天然のTSG−6タンパク質または組み換えのTSG−6タンパク質である、請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- IαIタンパク質はHC2、ビクニン、コンドロイチン硫酸鎖、または、これらの組み合わせをさらに含む、請求項1乃至7のいずれかに記載の方法。
- IαIタンパク質は、血液、血漿、血清、羊膜、絨毛膜、羊水、またはその組み合わせから単離される、請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。
- IαIタンパク質、天然のTSG−6タンパク質、および/または、天然のPTX3タンパク質は、羊膜細胞から生成される、請求項7乃至9に記載の方法。
- 羊膜細胞は、羊膜の上皮細胞、臍の緒の上皮細胞、羊膜の間質細胞、または、臍の緒の間質細胞である、請求項10に記載の方法。
- PTX3タンパク質はホモ多量体である、請求項1乃至11のいずれかに記載の方法。
- PTX3ホモ多量体は八量体である、請求項12に記載の方法。
- PTX3は、修飾された多量体化ドメインまたは異種起源の多量体化ドメインを含む、請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
- PTX3、IαI HC1、またはTSG−6のポリペプチドは、アフィニティタグを含む、請求項1乃至14のいずれかに記載の方法。
- 親和性タグは、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、mycタグ、FLAGタグ、グルタチオン−S−転移酵素(GST)タグの中から選択される、請求項15に記載の方法。
- IαIとTSG−6のタンパク質は3:1のモル比で接触する、請求項1乃至16のいずれかに記載の方法。
- HMW HAの重量平均分子量は3,000kDaである、請求項1乃至17のいずれかに記載の方法。
- HMW HAは固形の支持体に直接結合によって固定される、請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- HMW HAは固形の支持体に間接結合によって固定される、請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- HMW HAは、切断可能なリンカーを介して固形の支持体に対する結合によって固定化される、請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- 切断可能なリンカーは、化学的に、または、酵素的に切断可能なリンカーである、請求項21に記載の方法。
- HMW HAは、固形の支持体に共有結合または非共有結合によって固定化される、請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- HMW HAは、中間ポリペプチドにHMW HAを結合することによって固定化される、請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- 中間ポリペプチドは、固形の支持体に共有結合される、請求項24に記載の方法。
- HMW HAは、非共有結合によって中間ポリペプチドに結合される、請求項24または25に記載の方法。
- 中間ポリペプチドはHA結合タンパク質(HABP)である、請求項24乃至26のいずれかに記載の方法。
- HABPは、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、TSG−6、CD44、スタビリン−1、スタビリン−2、または、HAと結合するのに十分なこれらの一部の中から選択される、請求項27に記載の方法。
- HABPはバーシカンである、請求項27に記載の方法。
- 中間ポリペプチドはリンクモジュールを含む、請求項24乃至29のいずれかに記載の方法。
- リンクモジュールは、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、TSG−6、CD44、スタビリン−1、またはスタビリン−2のリンクモジュールである、請求項30に記載の方法。
- 中間ポリペプチドはポリペプチドリンカーを含む、請求項24乃至31のいずれかに記載の方法。
- ポリペプチドリンカーは固形の支持体に結合する、請求項32に記載の方法。
- 中間ポリペプチドはタンパク質切断配列を含む、請求項24乃至33のいずれかに記載の方法。
- 解離したrcHC−HA/PTX3複合体を形成するために、固定化したrcHC−HA/PTX3複合体を解離する工程をさらに含む、請求項1乃至22のいずれかに記載の方法。
- 固定化したrcHC−HA/PTX3複合体からの解離は、切断リンカーの切断を含む、請求項35に記載の方法。
- 固定化したrcHC−HA/PTX3複合体の解離は、複合体を解離剤と接触させる工程を含む、請求項35に記載の方法。
- 解離剤は、塩酸グアニジンまたは尿素である、請求項37に記載の方法。
- 解離したrcHC−HA/PTX3複合体を精製する工程をさらに含む、請求項35乃至38のいずれかに記載の方法。
- 精製は、アフィニティ精製、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、またはその組み合わせを含む、請求項39に記載の方法。
- 固定化したPTX3/HA複合体またはrcHC−HA/PTX3複合体を、小ロイシン豊富なプロテオグリカン(SLRP)に接触させる工程をさらに含む、請求項1乃至40のいずれかに記載の方法。
- SLRPは、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、PRELP(プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質)、ケラトカン、オステオアドへリン、エピピカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項41に記載の方法。
- SLRPは、デコリン、バイグリカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項41に記載の方法。
- SLRPは、グリコサミノグリカンに共有結合する、請求項41乃至43のいずれかに記載の方法。
- グリコサミノグリカンは硫酸ケラタンである、請求項44に記載の方法。
- 請求項1乃至45の方法によって生成された再構成されたHC−HA/PTX3(rcHC−HA/PTX3)複合体。
- (i)高分子量ヒアルロナン(HMW HA)、(ii)ペントラキシン 3(PTX3)タンパク質、および、(iii)重鎖1(HC1)を含むインターαインヒビター(IαI)タンパク質を含む、再構成されたHC−HA/PTX3(rcHC−HA/PTX3)複合体。
- 固形の支持体に固定した請求項47のrcHC−HA/PTX3。
- 羊膜抽出物または臍の緒の抽出物から精製された、単離した天然のHC−HA/PTX3(nHC−HA/PTX3)複合体。
- 羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、羊膜、臍の緒の羊膜、臍の緒の間質、または、その組み合わせから調製される、請求項49に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- nHC−HA/PTX3複合体は、羊膜抽出物または臍の緒の抽出物の超遠心分離によって精製される、請求項49または50に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、非水溶性の抽出物である、請求項51に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 非水溶性の抽出物は塩酸グアニジンを用いて抽出される、請求項52に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 小ロイシン豊富なプロテオグリカン(SLRP)をさらに含む、請求項51乃至53のいずれかに記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- SLRPは、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、PRELP(プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質)、ケラトカン、オステオアドへリン、エピピカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項54に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- SLRPは、デコリン、バイグリカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項54に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- SLRPは、グリコサミノグリカンに共有結合する、請求項54乃至56のいずれかに記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- グリコサミノグリカンは硫酸ケラタンである、請求項57に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、水溶性の抽出物である、請求項49乃至51のいずれかに記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 水溶性の抽出物は等張塩溶液で抽出される、請求項59に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 等張塩溶液はPBSである、請求項60に記載の単離した天然のnHC−HA/PTX3複合体。
- 複合体がマクロファージのM2極性化を促す、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体。
- (i)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、LPSで刺激されたマクロファージ中のIL−12p40の発現を減少させ、LPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−12p40の値は、rcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体の不在下でLPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−12p40の値と比較すると、LPSで刺激したマクロファージにrcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体が接触した際の方が一層低く、
(ii)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、LPSで刺激されたマクロファージ中のIL−12p70タンパク質の発現を減少させ、LPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−12p70タンパク質の量は、rcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体の不在下でLPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−12p70タンパク質の量と比較すると、LPSで刺激したマクロファージにrcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体が接触した際の方が一層低く、
(iii)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、LPSで刺激されたマクロファージ中のIL−23の発現を減少させ、LPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−23の値は、rcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体の不在下でLPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−23の値と比較すると、LPSで刺激したマクロファージにrcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体が接触した際の方が一層低く、
(iv)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、LPSで刺激されたマクロファージ中のIL−10の発現を増加させ、LPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−10の値は、rcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体の不在下でLPSで刺激したマクロファージによって発現されたIL−10の値と比較すると、LPSで刺激したマクロファージにrcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体が接触した際の方が一層高く、
(v)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、LPSで刺激された好中球のアポトーシスを促し、LPSで刺激された好中球のサンプル中でアポトーシス性のLPSで刺激された好中球の数は、rcHC−HA/PTX3、または、単離したnHC−HA/PTX3の複合体の不在下で、サンプル中でアポトーシス性のLPSで刺激された好中球の数と比較すると、サンプルがrcHC−HA/PTX3複合体に接触する際の方が多く、
(vi)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、アポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中のLPSで刺激されたまたは休止したマクロファージと、LPSで刺激されたマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、rcHC−HA/PTX3複合体の不在下で、サンプル中のLPS刺激されたマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがrcHC−HA/PTX3複合体に接触する際の方が多い、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体。 - (i)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、IL−12p40mRNAまたはIL−12p40タンパク質のレベルを減少させ、
(ii)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、IL−12p70タンパク質のレベルを減少させ、
(iii)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、IL−23mRNAまたはIL−23タンパク質のレベルを減少させ、
(iv)rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、IL−10mRNAまたはIL−10タンパク質のレベルを増加させ、あるいは、
(i)乃至(iv)の任意の組み合わせである、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体。 - 複合体は、ヒトの羊膜から単離した天然のHC−HA/PTX3(nHC−HA/PTX3)と少なくとも同じレベルに達するまで、LPSで刺激されたマクロファージの結合を促進し、結合は、固形の支持体に固定されたrcHC−HA/PTX3または単離したnHC−HA/PTX3の複合体に、LPSで刺激されたマクロファージを接触させることを含む、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体。
- マクロファージのM2極性化を誘導する方法であって、
rcHC−HA/PTX3または単離したnHC−HA/PTX3の複合体に、LPSで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む、方法。 - rcHC−HA/PTX3または単離したnHC−HA/PTX3の複合体は、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体である、請求項66に記載の方法。
- rcHC−HA/PTX3または単離したnHC−HA/PTX3の複合体に、LPSで刺激されたマクロファージを接触させる工程は、
(i)マクロファージによって発現されたIL−12p40のレベルを減少させ、
(ii)マクロファージによって発現されたIL−12p70のレベルを減少させ、
(iii)マクロファージによって発現されたIL−23のレベルを減少させ、あるいは、
(iv)マクロファージによって発現されたIL−10のレベルを増加させ、
(v)LPSで刺激された好中球のアポトーシスを誘導し、
(vi)アポトーシス性の好中球の貪食を促し、または、
(i)乃至(vi)の任意の組み合わせを含む、請求項66または67に記載の方法。 - 請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体、および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
- フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項69に記載の医薬組成物
- 抗炎症剤、抗瘢痕剤、抗腫瘍薬、化学療法剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬、抗菌剤、またはその組み合わせをさらに含む、請求項69または70に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、粉末、軟膏、錠剤、カプセル、またはエアロゾルである、請求項69乃至71のいずれかに記載の医薬組成物。
- ゲルは架橋ゲルまたはリポソームである、請求項72に記載の医薬組成物。
- ゲルは架橋ヒアルロナンヒドロゲルである、請求項72に記載の医薬組成物。
- 組織内の瘢痕形成または繊維症を予防するまたは逆行させるための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用であって、
請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量に、組織を接触させる工程を含む、使用。 - 瘢痕は、皮膚炎の瘢痕、ケロイド瘢痕、痙縮瘢痕、肥厚性瘢痕、ざ瘡に由来する瘢痕である、請求項75に記載の使用。
- 被験体の炎症を防ぐまたは減少させるための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 炎症は急性炎症または慢性炎症である、請求項77に記載の使用。
- 炎症は、マクロファージ媒介性の炎症性疾患、Th−17−媒介性の免疫障害、または、T細胞媒介性の炎症性疾患である、請求項77または78に記載の使用。
- 炎症は、自己免疫疾患、アレルギー、白血球欠損、感染症、移植片対宿主病、組織移植拒絶反応、またはその組み合わせに関連付けられる、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 炎症は関節リウマチに関連付けられる、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 炎症は、結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、眼瞼結膜炎、強膜炎、上強膜炎、ぶどう膜炎、網膜炎、または脈絡膜炎に関連付けられる、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 炎症は、心筋梗塞、脳卒中、エンドトキシンショック、または敗血症に関連付けられる、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 炎症はアテローム性動脈硬化に関連付けられる、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 被験体は癌を患っている、請求項77乃至79のいずれかに記載の使用。
- 被験体への追加の抗炎症剤と併せて投与するための、請求項77乃至85のいずれかに記載の使用。
- 追加の抗炎症剤は、抗TGF−β抗体、抗TGF−β受容体遮断抗体、抗TNF抗体、抗TNF受容体遮断抗体、抗IL1β抗体、抗IL1β受容体遮断抗体、抗IL2抗体、抗IL2受容体遮断抗体、抗IL6抗体、抗IL6受容体遮断抗体、抗IL12抗体、抗IL12受容体遮断抗体、抗IL17抗体、抗IL17受容体遮断抗体、抗IL23抗体、または、抗IL23受容体遮断抗体の中から選択される、請求項86に記載の使用。
- 1型インターフェロンは、IFN−αまたはIFN−βである、請求項87に記載の使用。
- 被験体の皮膚創傷または潰瘍を処置するための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 皮膚創傷または潰瘍は、非治癒性である、請求項89に記載の使用。
- 被験体の骨形成を促進するまたは引き起こすための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 被験体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている、請求項91に記載の使用。
- 被験体の望ましくない血管新生を防ぐまたは減少させるための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 望ましくない血管新生は、滲出型加齢黄斑変性(wARMD)または糖尿病性の増殖網膜症に関連付けられる、請求項93に記載の使用。
- 望ましくない血管新生は、癌に関連付けられる、請求項93に記載の使用。
- 被験体は固形腫瘍を患っている、請求項93に記載の使用。
- 抗癌治療とともに投与するための、請求項95または96のいずれかに記載の使用。
- 抗癌治療は、抗腫瘍薬、細胞毒性薬、抗血管新生薬、化学療法剤の投与、または、放射線療法を含む、請求項97に記載の使用。
- 移植レシピエントでの移植拒絶反応を防ぐための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 移植手順の前、移植手順の後、または移植手順中に、投与するための、請求項99に記載の使用。
- 免疫抑制剤と組み合わせて投与するための、請求項99または100に記載の使用。
- 被験体の幹細胞の拡張を引き起こす方法であって、有効な量の、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体に、幹細胞を生体外で接触させる工程を含む、方法。
- 被験体に細胞治療を施すために、治療用細胞と組み合わせた、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体、および、治療用細胞に、損傷を受けた細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項103に記載の使用。
- rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体、および、治療用細胞は、1つの組成物で、または、別々の組成物で、調剤される、請求項103に記載の使用。
- 治療用細胞はマイクロカプセルに入れられる、請求項103に記載の使用。
- rcHC−HA/PTX3複合体、または、単離したnHC−HA/PTX3複合体は、マイクロカプセルに結合する、請求項104に記載の使用。
- 治療用細胞は幹細胞である、請求項103乃至107のいずれかに記載の使用。
- 治療用細胞は成体幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項108に記載の使用。
- 治療用細胞は角膜縁上皮前駆細胞、角膜縁間質ニッチ細胞、臍の緒の幹細胞、羊膜幹細胞、または脂肪の幹細胞である、請求項108に記載の使用。
- 治療用細胞は分化細胞である、請求項103乃至108に記載の使用。
- 治療用細胞はインスリン産生細胞である、請求項103乃至108に記載の使用。
- インスリン産生細胞は島細胞である、請求項112に記載の使用。
- 被験体は1型糖尿病を患っている、請求項112または113に記載の使用。
- 被験体の組織再生を引き起こすまたは促進するための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 組織は、骨または歯ぐき、角膜の組織、または、結膜の組織である、請求項115に記載の使用。
- 治療用細胞または組織移植片と組み合わせて投与するための、請求項115または116に記載の使用。
- 組織移植片は同種移植片または自家移植片である、請求項117に記載の使用。
- 被験体のM1脂肪組織マクロファージの量を抑制するまたは減少させるための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 被験体は、肥満またはインスリン抵抗性であると診断される、請求項119に記載の使用。
- 被験体の結膜弛緩症を処置するための、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体の有効な量の使用。
- 細胞を培養するのに適した基質と、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体とを含む、細胞培養物。
- rcHC−HA/PTX3複合体、または、nHC−HA/PTX3複合体は、基質に固定化される、請求項122に記載の細胞培養物。
- 請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体でコーティングした基質を含む、医療装置。
- 基質は、ステント、ジョイント、ねじ、ロッド、ピン、プレート、留め金、シャント、鉗子、クリップ、縫合糸、縫合糸アンカー、電極、カテーテル、リード線、移植片、包帯材、ペースメーカー、ペースメーカーの筐体、電気除細動器、電気除細動器の筐体、除細動器、除細動器の筐体、装具、耳のドレナージ管、眼の移植組織、整形外科装置、椎間板、骨の代用品、吻合装置、血管周囲用包装材料、結腸瘻バッグ取り付け装置、止血バリア、血管移植片、血管支持部、組織接着剤、組織シーラント、組織スキャフォールド、および、腔内の装置の少なくとも1つを含む、請求項124に記載の医療装置。
- 基質は、マイクロカプセル、ナノ粒子、または、ビーズである、請求項124に記載の医療装置。
- マイクロカプセルは幹細胞を含む、請求項126に記載の医療装置。
- 基質はコンタクトレンズである、請求項124に記載の医療装置。
- 基質は手術移植片または装具である、請求項124に記載の医療装置。
- 移植組織片または装具は、人工関節、骨インプラント、縫合糸、またはステントである、請求項129に記載の医療装置。
- 人工関節は、人工股関節、人工膝、人工の肩関節、または人工膝である、請求項130に記載の医療装置。
- ステントは、冠動脈ステント、尿管ステント、尿道ステント、前立腺ステント、食道ステント、または骨ステントである、請求項130に記載の医療装置。
- rcHC−HA/PTX3複合体または単離したnHC−HA/PTX3複合体は、細菌性バイオフィルムの形成を阻害する、請求項124乃至132のいずれかに記載の医療装置。
- マクロファージ活性を調節するための方法であって、
(i)IL−12またはIL−23の発現を減少させるまたは阻害するか、または、(ii)IL−10の発現を促進するのに十分な量の、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体に、マクロファージを接触させる工程を含む、方法。 - マクロファージは炎症誘発性メディエーターで刺激された、請求項134に記載の方法。
- 炎症誘発性メディエーターは、リポ多糖類(LPS)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターフェロン・ガンマ(IFNγ)、または、これらの組み合わせである、請求項135に記載の方法。
- rcHC−HA/PTX3複合体または単離したnHC−HA/PTX3複合体は、生体外でマクロファージに接触する、請求項134乃至136のいずれかに記載の方法。
- 請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体、組成物を投与するための装置、および、随意に投与の説明書を含む、キット。
- 細胞の多能性を誘導するまたは維持するための方法であって、
nHC−HA/PTX3複合体またはrcHC−HA/PTX3複合体を含む細胞を培養する工程を含み、それによって、細胞の多能性を誘導するまたは維持する、方法。 - 細胞は、Sox2、myc、Oct4、および、KLF4の中から選択されたタンパク質を異種発現する、請求項139に記載の方法。
- 細胞は、Sox2、myc、Oct4、および、KLF4の中から選択された1つ、2つ、または3つのタンパク質を異種発現する、請求項139に記載の方法。
- nHC−HA/PTX3複合体またはrcHC−HA/PTX3複合体は固定される、請求項139に記載の方法。
- 細胞は成体の分化細胞である、請求項139に記載の方法。
- 細胞は線維芽細胞である、請求項139に記載の方法。
- 細胞は、ヒトの角膜の線維芽細胞である、請求項144に記載の方法。
- 細胞は、成体幹細胞、または、誘導多能性幹細胞である、請求項139に記載の方法。
- 細胞は、角膜縁上皮前駆細胞、角膜縁間質ニッチ細胞、臍の緒の幹細胞、羊膜幹細胞、または脂肪の幹細胞である、請求項139に記載の方法。
- nHC−HA/PTX3複合体またはrcHC−HA/PTX3複合体は、請求項46乃至48のいずれかに記載のrcHC−HA/PTX3複合体、または、請求項49乃至61のいずれかに記載の単離したnHC−HA/PTX3複合体である、請求項139乃至147のいずれかに記載の方法。
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