TW201932126A - 抑制血管生成之方法 - Google Patents

Abstract

所揭示者係使用前驅細胞(諸如產後衍生細胞)及生產自該等細胞之條件培養基來治療眼科疾病及減少視網膜血管新生的方法及組成物。

Description

抑制血管生成之方法 【相關申請案之交互參照】

本申請案主張2017年11月3日申請之美國臨時專利申請案第62/581,399號的優先權，其全部內容以引用方式併入本文中。

本發明係關於用於眼科疾病及病症的基於細胞或再生性療法的領域，尤其是用於涉及血管生成的眼病況。本發明提供使用前驅細胞(諸如臍帶組織衍生細胞、胎盤組織衍生細胞)及製備自該等細胞之條件培養基來抑制血管新生及減低血管內皮生長因子(VEGF)的方法及組成物。

年齡相關性黃斑變性(AMD)是已開發國家中年齡65歲以上的人之視覺障礙及失明的主要原因。有兩種形式的AMD，即乾性(萎縮性)及濕性(滲出性)。濕性AMD之特徵在於脈絡膜血管新生(CNV)的形成，因而造成視力喪失。約85%患有AMD之患者具有可在眼部血管生成造成不可逆視覺障礙的任何時候變成濕性AMD的乾燥形式。

血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的關鍵調節子，且在濕性AMD之血管新生的形成中扮演關鍵角色，造成中心視覺劣化。視網膜色素上皮(RPE)細胞是濕性AMD中VEGF的主要來源，對CNV形成有顯著的貢獻。VEGF在患有AMD之剖檢眼睛的RPE及經手術切除之CNV膜的RPE細胞中過度表現。牽涉到AMD的 因素(諸如糖化終產物(advanced glycation end product)及反應性氧中間體)是RPE細胞中VEGF表現之有效的刺激物。

VEGF藉由結合至特定VEGF受體介導其血管生成效應。在主要受體中，VEGFR1及VEGFR2與血管生成相關聯，而VEGFR3與淋巴管生成(lymphangiogenesis)相關聯。VEGFR1的可溶性形式係由VEGFR1的替代剪接所致，且係VEGF之天然存在的內源性抑制劑，其藉由使VEGF與傳訊受體隔絕及與VEGFR2形成非傳訊異二聚體。目前，抗VEGF藥物係此病況的標準照護，但必須在很長一段時間內反覆投予，對患者造成負擔，且常造成治療不足及後續的視力喪失。

最近，已努力開發細胞療法以用於治療視網膜疾病，包括AMD。AMD患者一般先發展乾燥形式；濕性AMD在乾性AMD之背景上發生。因此，乾性AMD有時可被視為是濕性AMD的前驅狀態。地圖狀萎縮(geographic atrophy,GA)代表進行至濕性AMD之最大風險因子。新生血管病變常存在於患有GA之眼睛周邊。hUTC對眼睛內血管新生的效應尚不清楚。

本發明提供適用於眼科疾病及病症的基於細胞或再生性療法的組成物及方法。詳言之，本發明之特徵在於用於治療眼科疾病或病況之方法及組成物，包括使用諸如產後衍生細胞(PPDC)之前驅細胞來再生或修復眼組織。產後衍生細胞可為臍帶組織衍生細胞(UTC)或胎盤組織衍生細胞(PDC)。

本發明的一個態樣是一種抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生的方法，其包含向患有視網膜病變的個體之眼睛投予人類臍帶組織衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞(hUTC)係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞分泌VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為人類VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為可溶性VEGFR1。

另一實施例包括一種用於抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生的組成物，其包含人類臍帶組織衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。其他實施例係關於一種用於抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生的產後衍生細胞群。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞分泌VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為人類VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為可溶性VEGFR1。

在本文所述之實施例中，使用自產後臍帶組織分離之細胞的方法及組成物亦可使用生產自該等細胞之條件培養基。在本文之實施例中，臍帶組織衍生細胞或生產自該等細胞之條件培養基抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生。在所述之使用自產後組織(諸如臍帶組織)分離之細胞的實施例之各者中，可使用包含細該等細胞的組成物。

另一實施例是一種生產包含人類VEGFR1之條件培養基的方法。條件培養基係生產自人類臍帶組織衍生細胞。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞分泌VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為人類VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為可溶性VEGFR1。

一進一步實施例是一種抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生的方法，其包含投予包含VEGFR1之條件培養基。條件培養基係生產自人類臍帶組織衍生細胞。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織。在實施例中，人類臍帶組織衍生細胞分泌VEGFR1。在實施例中，VEGFR1為人類VEGFR1。

一個實施例是一種用於減少視網膜病變中之血管新生的組成物，其包含投予包含VEGFR1之條件培養基。在實施例中，VEGFR1為人類VEGFR1。

在本文所述的本發明之實施例中，產後衍生細胞係衍 生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在實施例中，細胞在培養物中能夠擴增並維持正常核型。該細胞進一步包含下列特徵中之一或多者：(a)在培養物中進行至少約40次倍增的潛能；(b)在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層；(c)生產組織因子、波形蛋白(vimentin)、或α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；(d)生產CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2及HLA-A、HLA-B、HLA-C中之至少一者；(e)不生產CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測；(f)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因；(g)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少：矮小同源盒(short stature homeobox)2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長停滯特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊 亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C-endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長插入物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)；類似於neuralin 1者；B細胞轉位基因1；假想蛋白質FLJ23191；及DKFZp586L151；及(h)缺少hTERT或端粒酶的表現。在一實施例中，臍帶組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。在另一實施例中，胎盤組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。

在如本文詳述的特定實施例中，產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)；細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)、細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。在一實施例中，衍生自臍組織之產後衍生細胞具有細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)或細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)之所有識別特徵。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。

在如本文詳述的實施例中，產後衍生細胞在一或多種酶活性存在下分離，該等酶活性包含金屬蛋白酶活性、黏液分解活性及中性蛋白酶活性。較佳地，該等細胞具有正常核型，其在細胞繼代培養時維持。

在實施例中，產後衍生細胞群係分離自實質上不含血 液之人類臍帶組織，能夠在培養物中擴增，且表現CD10、CD13、CD44、CD73、及CD90中之至少一者。在實施例中，細胞不表現CD31、CDE34、CD45、或CD117。在本文所述之實施例中，產後衍生細胞為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。在本文所述之實施例中，細胞缺少hTERT或端粒酶的表現。在一些實施例中，細胞表現CD13、CD90、及HLA-ABC，且不表現CD31、CD34、CD45、及CD117。

在較佳實施例中，產後衍生細胞表現CD10、CD13、CD44、CD73、及CD90中之各者。在一些實施例中，產後衍生細胞表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、及HLA-A、HLA-B、HLA-C中之各者。在較佳實施例中，產後衍生細胞不表現CD31、CD34、CD45、CD117中之任一者。在一些實施例中，產後衍生細胞不表現CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ中之任一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在上述實施例中，細胞群為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。在所述的實施例中，該等細胞缺少hTERT或端粒酶的表現。

在本文之實施例中，該細胞群為實質上均質性產後衍生細胞群。在特定實施例中，該族群為均質性產後衍生細胞群。在實施例中，該等產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在本文之實施例中，該細胞群可在組成物中；在一些實施例中，該組成物可係包含醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。

在某些實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群係與至少一種其他細胞型一起投予，該等其他細胞型諸如星狀細胞、寡樹突細胞、神經元、神經前驅、神經幹細胞、視網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、或其他多潛能性或多能性幹細胞。在這些實施例中，其他細胞型可與該細胞群或該條件培養基同時、在其之前、或在其之後投予。

在這些及其他實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群係與至少一種其他藥劑(諸如用於眼治療之藥品)、或另一有益的輔助劑(諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑或生長因子)一起投予。在這些實施例中，其他劑可與該細胞群或該條件培養基同時、在之前、或在之後投予。

在各種實施例中，產後衍生細胞群係向眼睛表面投予、或向眼睛內部或向靠近眼睛之位置(例如於眼睛後面)投予。產後衍生細胞群可藉由通過套管或自植入於眼睛內或靠近眼睛之患者體內之裝置對眼睛注射(諸如視網膜下注射)來投予，或可藉由植入具有產後衍生細胞群或條件培養基之基質或支架來投予。在本文之實施例中，產後衍生細胞群可在各種時間，作為單一時間點或在多個時間點投予。在特定實施例中，該等細胞可藉由作為單次注射或多於一次注射並在不同的時間點之注射來投予。

在某些實施例中，該組成物或醫藥組成物經調配用於向眼睛表面投予。或者，其可經調配用於向眼睛內部或靠近眼睛處(例如眼睛後面)投予。組成物亦可調配為含有產後衍生細胞或條件培養基之基質或支架。

圖1A至1C hUTC在體內抑制脈絡膜血管新生。

圖2A至2B hUTC在體內減少脈絡膜VEGF水準。

圖3A至3D hUTC在體外減少VEGF。(圖3A)將ARPE19細胞以60×10³個細胞/孔接種於24孔盤中，並在有或沒有密度依賴性hUTC下培養48小時，接著藉由ELISA進行VEGF測量。(圖3B)自個別培養在24孔盤中之ARPE19及hUTC收集條件培養，然後以1：1比率混合，並在37℃下分別培養5分鐘及2天，接著進行VEGF測量。(圖3C)在hUTC CM中添加重組人類VEGF(300pg/mL)，並在37℃下分別培養5分鐘及2天，接著進行VEGF 測量。(圖3D)在與廣效蛋白酶抑制劑混合物預培養之hUTC CM中添加重組人類VEGF(300pg/mL)，並在37℃下培養5分鐘。然後藉由ELISA測量VEGF。數據代表平均值±SEM(n=3)。

圖4針對sVEGFR1之中和抗體在hUTC條件培養基中恢復VEGF水準。將hUTC條件培養基與針對sVEGFR1之中和抗體(10ug/mL)在37℃下預培養1小時，接著以1ng/mL添加rhVEGF並再培養30分鐘。藉由ELISA測量VEGF水準。

圖5 hUTC條件培養基中之sVEGFR1的西方墨點分析。使來自VEGF下拉(pull-down)檢定之hUTC CM及對照培養基的洗提液經受SDS-PAGF。簡言之，將與樣本緩衝液及25ng的重組人類可溶性VEGFR1混合之40uL的tris洗出液在SDS-PAGE凝膠上運行，並將經凝膠離析之蛋白質轉移至PVDF膜上。將膜用5%(W/V)BSA阻斷，隨後用靶向VEGFR1之胞外區的生物素化之抗VEGFR1抗體探測。在洗滌之後，將膜與鏈黴親和素-HRP培養，並用ECL可視化免疫反應性條帶。(CON，hUTC對照培養基樣本；NEG：陰性對照(對照培養基)；REC，重組人類sVEGFR1。)

在下列說明性實施例之詳細說明中，參照形成本說明書之一部分的隨附圖式。這些實施例係以足夠詳細之方式描述以讓所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本發明，並會理解到尚可利用其他實施例，而且可在不偏離本發明之精神或範疇下作出邏輯變化。為了避免非為所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本文中所述之實施例所需之細節，本說明書可能會省略某些所屬技術領域中具有通常知識者所習知之資訊。

分離自產後組織之前驅細胞及衍生自前驅細胞(諸如根據所屬技術領域中已知之方法分離自產後臍帶或胎盤之細胞)之條件培養基為治療眼變性病況提供了新來源。因此，本文所述之各 種實施例之特徵為用於治療眼科疾病的方法及組成物，其包括使用前驅細胞(諸如產後衍生細胞)及生產自該等細胞之條件培養基來減少視網膜血管新生。

定義

本說明書及申請專利範圍中所使用之各種用語如以下闡述所定義且意欲闡明本發明。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學用語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法或材料可在用於測試本發明之實務中使用，但本文中係描述較佳材料及方法。在描述及請求本發明時，將使用下列用語。

幹細胞(stem cell)為未分化之細胞，其係以單一細胞同時具有自我更新及分化以生產後裔細胞(progeny cell)的能力來定義，包括自我更新前驅(self-renewing progenitor)、非更新前驅(non-renewing progenitor)與最終分化細胞(terminally differentiated cell)。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為多個胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞譜系之功能性細胞的能力，以及在移植後形成多個胚層之組織的能力，並且能夠在注入胚胞(blastocyst)後實質上促成大多數(如果不是全部)組織形成。

目前，幹細胞根據其發展潛能分類如下：(1)全能性(totipotent)；(2)多能性(pluripotent)；(3)多潛能性(multipotent)；(4)少能性(oligopotent)；與(5)單能性(unipotent)。全能性細胞能夠形成所有胚胎與胚外細胞型。多能性細胞能夠形成所有胚胎細胞型。多潛能性細胞包括該些能夠形成細胞譜系亞群，但全部在特定組織、器官、或生理系統內之細胞(例如，造血幹細胞(HSC)可生產後裔，包括HSC(自我更新)、血液細胞限制少能性前驅、及作為血液正常組分之所有細胞型及元件(例如，血小板))。少能性細胞可以形成比多潛能性幹細胞更受限之細胞譜系亞群；及單能性細胞能夠形成單一細胞譜系(例如生精幹細胞)。

幹細胞亦根據其獲得來源來分類。成體幹細胞(adult stem cell)通常為多潛能性未分化細胞，其在包含多重分化細胞型之組織中發現。成體幹細胞可自我更新。在正常環境下，其亦可分化以產生其始源組織之特化細胞型，並且亦可能產生其他組織型。誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)為轉變成多能性幹細胞之成體細胞。(Takahashi等人，Cell,2006；126(4)：663-676；Takahashi等人，Cell,2007；131：1-12)。胚胎幹細胞(embryonic stem cell)為來自胚胞階段胚胎之內細胞團(inner cell mass)的多能性細胞。胎體幹細胞(fetal stem cell)為源自胎體組織或膜之幹細胞。產後幹細胞(postpartum stem cell)為多潛能性或多能性細胞，其實質上源自生產後所能取得之胚外組織，亦即胎盤及臍帶。已發現這些細胞擁有多能性幹細胞之特性特徵，包括快速增生及分化為多種細胞譜系之潛能。產後幹細胞可為血液衍生(例如該些得自臍帶血之幹細胞)或非血液衍生(例如得自臍帶及胎盤之非血液組織)。

胚胎組織通常定義為源自胚胎(在人類係指自受精至發育約六週之期間)之組織。胎體組織係指源自胎體之組織，胎體在人類係指自發育約六週至分娩之期間。胚外組織為與胚胎或胎體相關但非源自胚胎或胎體之組織。胚外組織包括胚外膜(絨毛膜、羊膜、卵黃囊及尿囊)、臍帶及胎盤(其自身形成自絨毛膜及母體底蛻膜)。

廣義而言，前驅細胞(progenitor cell)為能夠產生較其本身更高分化之後裔，但又保有補充前驅池之能力的細胞。就此定義而言，幹細胞本身亦為前驅細胞，如同終末分化細胞之較直接前體細胞(more immediate precursor)。當提及本發明之細胞時，如以下所更詳述說明者，可使用此較廣之前驅細胞定義。狹義而言，前驅細胞通常定義為在分化路徑中作為中間者之細胞，即其係由幹細胞所形成並且在成熟細胞型或細胞型亞群之生產中作為中間者。此類型之前驅細胞通常無法自我更新。因此，如果在本文中提及此類型 之細胞，將會稱其為非新生前驅細胞(non-renewing progenitor cell)或中間前驅或前體細胞(intermediate progenitor or precursor cell)。

本文所例示且較佳用於本發明之細胞通常稱為產後衍生細胞(或PPDC)。其有時亦可更具體地被稱為臍衍生細胞(UDC)或胎盤衍生細胞(PDC)。此外，該些細胞可被描述為幹細胞或前驅細胞(progenitor cell)，後項用語係以廣義的方式來使用。用語衍生(derived)係用來指明細胞係得自其生物來源，且於體外生長或經其他方式調控(例如培養於生長培養基以擴增族群及/或生產細胞系(cell line))。臍幹細胞及胎盤幹細胞之體外調控以及本發明之臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之獨有特性係詳述於後文中。藉由其他手段分離自產後胎盤及臍之細胞亦被認為適合用於本發明中。這些其他細胞在本文中稱為產後細胞(而非產後衍生細胞)。

使用各種用語來描述在培養物中之細胞。細胞培養物(cell culture)通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中(in culture)」或「經培養(cultured)」)的細胞。初代細胞培養物(primary cell culture)為直接取自生物且在第一次亞培養前之細胞、組織或器官的培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及/或分裂之條件下時，其在培養物中擴增從而導致更大的細胞群。當細胞在培養物中擴增時，細胞增生之速率有時係以細胞數目倍增所需的時間量來量測。此稱為倍增時間(doubling time)。

細胞系(cell line)為由初代細胞培養物之一或多個亞培養(subcultivation)所形成的細胞群。每一輪亞培養稱為一個繼代(passage)。當細胞經過亞培養時，將它們稱為已繼代。特定之細胞群或細胞系有時會以其繼代次數來指稱或表徵。例如，繼代十次的經培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物(在細胞自組織分離出來後的第一次培養物)係命名為P0。在第一次亞培養後，該些細胞係描述為二次培養物(P1或繼代1)。在第二次亞培養後，該些細胞即變成三次培養物(P2或繼代2)，依此類推。所屬技術領域中具有通常知識者將會理解到，在繼代期間會有多次族群倍增；因此， 培養物之族群倍增次數大於其繼代次數。在繼代間隔期間的細胞擴增(即族群倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基材、培養基、生長條件及繼代間隔時間。

用語生長培養基(growth medium)通常係指足以培養PPDC之培養基。詳言之，用於培養本發明的實施例之細胞的一種目前較佳培養基包含達爾伯克改良必需培養基(Dulbecco's Modified Essential Media)(在本文中亦縮寫為DMEM)。尤其較佳的是DMEM-低葡萄糖(在本文中亦稱為DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。DMEM-低葡萄糖較佳係補充有15%(v/v)胎牛血清(例如特級胎牛血清(defined fetal bovine serum)，Hyclone,Logan Utah)、抗生素/抗黴劑(較佳為50至100個單位/毫升青黴素、50至100微克/毫升鏈黴素、及0至0.25微克/毫升兩性黴素B；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、及0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis Mo.)。如以下實例中所用，生長培養基係指具有15%胎牛血清及抗生素/抗黴劑之DMEM-低葡萄糖(當包括青黴素/鏈黴素時，其較佳分別為50U/ml及50微克/ml；當使用青黴素/鏈黴素/兩性黴素時，其較佳分別為100U/ml、100微克/ml、及0.25微克/ml)。在一些情況下，使用不同生長培養基，或提供不同補充劑，這些通常在文中指明為生長培養基之補充劑。

條件培養基(conditioned medium)為其中特定細胞或細胞群係經培養且隨後移除之培養基。當細胞培養於培養基中時，其可分泌可提供營養支持給其他細胞之細胞因子。此類營養因子包括但不限於荷爾蒙、細胞介素、細胞外基質(ECM)、蛋白質、囊泡、抗體、及顆粒。含有細胞因子之培養基為條件培養基。

通常，營養因子(trophic factor)係定義為促進細胞生存、生長、分化、增生及/或成熟之物質，或刺激細胞提高活性之物質。細胞之間經由營養因子的交互作用可發生在不同類型的細胞之間。藉助營養因子之細胞交互作用見於基本上所有的細胞型中，且為神經細胞型之通訊所尤其顯著的手段。營養因子亦可以自泌(autocrine) 之方式作用，亦即，細胞可生產影響其自身生存、生長、分化、增生及/或成熟之營養因子。

當指稱經培養之脊椎動物細胞時，用語衰老(senescence)(複製衰老(replicative senescence)或細胞衰老(cellular senescence)亦同)係指可歸因於有限細胞培養之性質；亦即，它們無能力生長超越有限的族群倍增次數(有時稱為海富利克限度(Hayflick’s limit))。儘管細胞衰老最先係使用纖維母細胞樣細胞(fibroblast-like cell)來描述，但是可在培養物中成功生長之大部分正常人類細胞型均經歷細胞衰老。不同細胞型之體外壽命不同，但是最大壽命通常少於100次族群倍增(此為培養物中之所有細胞變衰老且因此使培養物無法分裂之倍增次數)。衰老並非取決於時序時間，而是由培養物所經歷之細胞分裂、或族群倍增之次數所量測。

用語眼(ocular)、眼科(ophthalmic)及視(optic)在本文中可互換使用以定義「眼睛的、或有關眼睛、或與眼睛相關(of,or about,or related to the eye)」。用語眼變性病況(ocular degenerative condition)(或病症(disorder))為包括性用語，涵蓋涉及細胞損傷、變性或損失之眼睛(包括眼睛與腦之間的神經連接)的急性及慢性病況、病症或疾病。眼變性病況可與年齡有關，或可因受傷或創傷所致，或可與特定疾病或病症有關。急性眼變性病況包括但不限於與細胞死亡相關之病況或影響眼睛的損害，包括由以下引起之病況：腦血管機能不全、局灶性或瀰漫性腦創傷、瀰漫性腦損傷、傳染性或發炎性眼睛病況、視網膜裂開或脫附、眼內病灶(挫傷穿透、壓迫、撕裂)或其他身體受傷(例如，物理或化學灼傷)。慢性眼變性病況(包括進行性病況)包括但不限於視網膜病變及其他視網膜/黃斑病症，諸如色素性視網膜炎(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管膜(CNVM)；視網膜病變，諸如糖尿病視網膜病變、閉塞性視網膜病變、鐮狀細胞視網膜病變及高血壓視網膜病變、中央視網膜靜脈阻塞、頸動脈狹窄、視神經病變，諸如青光眼及相關症候群；水晶體及外眼之病症例如角膜緣幹細胞缺乏(LSCD)，亦稱為角膜緣 上皮細胞缺乏(LECD)，諸如發生於化學或熱受傷中、史蒂芬強森症候群症候群(Steven-Johnson syndrome)、隱形眼鏡誘導之角膜病變、眼瘢痕性類天皰瘡、先天無虹膜或外胚層發育不良疾病、及多發性內分泌缺乏相關角膜炎。

用語治療眼變性病況(treating an ocular degenerative condition)或眼變性病況之治療(treatment of an ocular degenerative condition)係指緩解如本文所定義之眼變性病況之作用，或延緩、暫停或逆轉眼變性病況之進展，或延緩或預防眼變性病況之發生。

用語有效量(effective amount)係指試劑或醫藥組成物諸如生長因子、分化劑、營養因子、細胞群或其他藥劑之濃度或量，該濃度或量可有效產生預期結果，包括如本文所述之體外或體內之細胞生長及/或分化，或治療眼變性病況。關於生長因子，有效量可在約1奈克/毫升至約1微克/毫升之範圍內。關於向患者體內投予之PPDC，有效量可在少至數百或更少、至多達數百萬或更多之範圍內。在特定實施例中，有效量可在10³至11¹¹個細胞之範圍內，更特定言之為至少約10⁴個細胞。應理解待投予之細胞數目將取決於待治療病症之細節，包括但不限於待治療之大小或總體積/表面積，以及投予位點與待治療區域之位置之靠近性，以及醫藥生物學家熟悉的其他因素而變化。

用語有效期間(effective period)(或時間(time))及有效條件(effective condition)係指對於劑或醫藥組成物而言，為達成其預期結果所必需或較佳的時間期間或其他可控條件(例如，體外方法之溫度、濕度)。

用語患者(patient)或個體(subject)係指用本文所述之細胞或醫藥組成物、或根據本文所述之方法治療之動物，包括哺乳動物，較佳為人類。

用語醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)(或介質(medium))可與用語生物可相容之載劑或介質(biologically compatible carrier or medium)互換使用，係指試劑、細 胞、化合物、材料、組成物、及/或劑型，其不僅可與待治療性投予之細胞及其他藥劑相容，而且在合理的醫學判斷之範疇內適用於與人類及動物之組織接觸，而無過度毒性、刺激、過敏反應、或符合合理的利益/風險比的其他併發症。

在本文中使用數個關於細胞置換療法(cell replacement therapy)之用語。用語自體轉移(autologous transfer)、自體移植(autologous transplantation)、自體移接(autograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者亦為細胞置換療法之接受者之治療。用語同種異體轉移(allogeneic transfer)、同種異體移植(allogeneic transplantation)、同種異體移接(allograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為相同物種，但非相同個體之治療。捐贈者細胞與接受者組織相容性匹配之細胞轉移有時稱為同基因轉移(syngeneic transfer)。用語異種轉移(xenogeneic transfer)、異種移植(xenogeneic transplantation)、異種移接(xenograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為不同物種之治療。如本文中所使用之移植係指將自體、或同種異體捐贈者細胞置換療法引入至接受者。

說明

眼變性病況涵蓋成因分歧之急性、慢性及進行性病症及疾病，共同特徵為特定或易受傷害之眼細胞群的功能異常或損失。此共同性使能夠開發用於修復或再生易受傷害、受損或失去之眼組織或細胞之類似治療方式，其中之一為基於細胞之療法。眼變性病況之細胞療法的開發受限於相對較少類型的幹細胞或前驅細胞，包括眼衍生幹細胞本身(例如，視網膜及角膜幹細胞)、胚胎幹細胞及少數類型的成體幹細胞或前驅細胞(例如，神經、黏膜上皮及骨髓幹細胞)。分離自產後臍帶及胎盤之細胞已被識別為適用於此目的之前驅細胞之顯著新來源。(美國2005/0037491及美國2010/0272803)。此外，由分離自產後胎盤及臍帶組織之細胞所產生之條件培養基提 供另一種用於治療眼變性病況之新來源。因此，在本文所述之各種實施例中，本發明之特徵在於用於(修復及再生眼組織)之方法及醫藥組成物，該方法及醫藥組成物使用來自前驅細胞諸如分離自產後臍帶或胎盤之細胞之條件培養基。本發明適用於眼變性病況，但預期尤其適用於一些難以治療或治癒或無可得治療或療法之眼病症。這些包括但不限於視網膜病變，諸如年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、糖尿病性視網膜病變、血管新生、脈絡膜血管新生、及血管生成。

預期衍生自前驅細胞(諸如根據所屬技術領域中已知之任何方法分離自產後臍帶或胎盤之細胞)之條件培養基適合用於本發明中。然而，在一實施例中，本發明使用衍生自如上文所定義之臍帶組織衍生細胞(hUTC)或胎盤組織衍生細胞(PDC)之條件培養基，該等細胞係衍生自較佳地根據下文所述之方法使之實質上不含血液之臍帶組織或胎盤。hUTC或PDC能夠在培養物中擴增且具有分化成其他表型之細胞的潛能。某些實施例之特徵在於由此類前驅細胞所製備之條件培養基、包含條件培養基之醫藥組成物、及使用該醫藥組成物治療急性或慢性眼變性病況患者之方法。本發明之產後衍生細胞係經其在培養物中之生長性質、其細胞表面標記、其基因表現、其生產某些生化營養因子之能力、及其免疫性質表徵。衍生自產後衍生細胞之條件培養基係經該些細胞所分泌之營養因子表徵。

用於本發明之組成物及方法中之細胞、細胞群、及包含細胞溶解產物、條件培養基、及類似物之製劑係描述於本文，且詳細描述於美國專利第7,524,489號、及第7,510,873號、及美國公開申請案第2005/0058631號中，其各自以引用方式併入本文中。

細胞之特徵

本發明之前驅細胞諸如PPDC可藉由下列加以表徵：例如生長特徵(例如族群倍增能力、倍增時間、到達衰老之繼代數)、 核型分析(例如正常核型；母體或新生兒譜系)、流動式細胞測量術(例如FACS分析)、免疫組織化學法及/或免疫細胞化學法(例如偵測表位)、基因表現概況(例如基因晶片陣列分析；聚合酶連鎖反應(例如反轉錄酶PCR、即時PCR及傳統PCR))、蛋白質陣列分析、蛋白質分泌法(例如藉由血漿凝固檢定或PDC條件培養基分析(例如藉由酶聯免疫吸附檢定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)))、混合淋巴球反應(例如作為PBMC刺激作用之量測)及/或其他該項技術領域中所習知的方法。

衍生自臍組織之PPDC之實例係於2004年6月10日寄存於美國菌種保存中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代號UMB 022803(P7)所獲派之存取號為PTA-6067；以及(2)細胞株代號UMB 022803(P17)所獲派之存取號為PTA-6068。衍生自胎盤組織之PPDC之實例係寄存於ATCC(Manassas,Va.)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代號PLA 071003(P8)係於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6074；(2)細胞株代號PLA 071003(P11)於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6075；以及(3)細胞株代號PLA 071003(P16)於2004年6月16日寄存且所獲派之存取號為PTA-6079。

在各種實施例中，PPDC擁有以下生長特徵中之一或多者：(1)在培養中需要L-纈胺酸以供生長；(2)它們能夠生長於含有約5%至至少約20%之氧的氛圍中；(3)它們在培養中於達到衰老前具有至少約40次倍增之潛力；以及(4)它們在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層。

在某些實施例中，PPDC擁有正常核型，其在細胞繼代時維持。核型分析尤其可用於識別並區分衍生自胎盤之新生兒與 母體細胞。核型分析方法為所屬技術領域中具有通常知識者可使用且習知者。

在其他實施例中，PPDC可藉由生產某些蛋白質來表徵，包括：(1)生產波形蛋白(vimentin)與α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；以及(2)生產CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2與HLA-A、HLA-B、HLA-C細胞表面標記中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在其他實施例中，PPDC可藉由不生產下列之至少一者來表徵：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G以及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ細胞表面標記，如藉由流動式細胞測量術所偵測。尤其較佳者為生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白的細胞。

在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因。在一實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；或趨化激素(C--X--C模體)配體3。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由針對編碼腎素或氧化低密度脂蛋白受體1之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵。

在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少來表徵：矮小同源盒2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長停滯特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C-endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAAI034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長插入物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；以及細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)。

在其他實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由分泌選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之營養因子來表徵。在實施例中，PPDC可藉由分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、RANTES、MDC、及TIMP1中之至少一者來表徵。在一些實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在替代實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、及TIMP1中之至少一者，且不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF、及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在進一步實施例中，PPDC缺少hTERT或端粒酶的表現。

在較佳實施例中，細胞包含二或更多種以上列舉之生長、蛋白質/表面標記生產、基因表現或物質分泌之特徵。更佳者為該些包含三、四、或五或更多種該等特徵之細胞。再佳者為包含六、七或八或更多種該等特徵之PPDC。再佳者為該些包含所有上述特徵之細胞。

條件培養基

在一個態樣中，本發明提供來自經培養之前驅細胞諸如產後衍生細胞、或其他前驅細胞之條件培養基，其如下文所述用於體外及體內。此類條件培養基之使用允許由細胞分泌之有益營養因子同種異體地用於患者中，而無需引入可能引發排斥、或其他不良免疫反應之完整細胞。條件培養基係藉由於培養基中培養細胞(諸如細胞群)，隨後自培養基移除該些細胞來製備。在某些實施例中，產後細胞為UTC或PDC，更佳為hUTC。

由上文所述之細胞群所製備之條件培養基可按原樣使用、經進一步濃縮例如藉由超濾或凍乾、或甚至乾燥後使用、經部分純化後使用、如所述技術領域中已知與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合使用、或與其他化合物諸如生物製品例如醫藥上可用的蛋白質組成物組合使用。條件培養基可在體外或體內單獨使用，或例如與自體或同基因活細胞一起使用。條件培養基若經引入體內，可被引入局部治療位點、或引入遠端以提供例如需要的細胞生長或營養因子給患者。

先前已證明，人類臍帶組織衍生細胞會改善視覺功能並緩解視網膜變性(US 2010/0272803)。亦已證明，產後衍生細胞可在RCS模型中用於促進光受體救援且因此保留光受體。(US 2010/0272803)。將hUTC視網膜下注射至RCS大鼠眼睛中改善了視敏度並緩解了視網膜變性。此外，以衍生自hUTC之條件培養基(CM)進行治療，可使體外失養性RPE細胞恢復對ROS之吞噬。(US 2010/0272803)。在此，本發明之實施例揭示hUTC之正面效果以抑制或減少血管新生。

醫藥組成物

在另一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其於多種用於治療眼變性病況之方法中使用非胚胎幹細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、其細胞群、由此類細胞所生產之條件培養基、及由此類細 胞所生產之細胞組分及產物。某些實施例涵蓋包含活細胞(例如，單獨PPDC或PPDC與其他細胞型混合)之醫藥組成物。其他實施例涵蓋包含PPDC條件培養基之醫藥組成物。其他實施例可使用PPDC之細胞組分(例如，細胞溶解產物、可溶細胞部分、ECM、或前述任一者之組分)或產物(例如，由細胞天然生產或經由基因改質所生產之營養因子及其他生物因子、培養該些細胞之條件培養基)。在任一情況下，醫藥組成物可進一步包含其他活性劑，諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經營養因子或所屬技術領域中已知的神經再生、神經保護或眼科藥品。

本發明之醫藥組成物包含前驅細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、由該些細胞產生之條件培養基、或其組分或產物，其與醫藥上可接受之載劑或培養基調配。合適的醫藥上可接受之載劑包括水、鹽溶液(諸如林格氏溶液)、醇、油、明膠、及碳水化合物，諸如乳糖、直鏈澱粉、或澱粉、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、及聚乙烯吡咯啶。此類製劑可經滅菌，且若有需要與輔助劑諸如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、及著色劑混合。通常但不排他地，包含細胞組分或產物而非活細胞之醫藥組成物係經調配成液體。包含PPDC活細胞之醫藥組成物一般係經調配成液體、半固體(例如，凝膠)或固體(例如，基質、支架及類似物，以適用於眼科組織工程)。

用於注射之配方較佳經設計用於單次使用投予且不含有防腐劑。可注射溶液應具有等於0.9%氯化鈉溶液(290至300毫滲莫耳之滲透壓)之等滲度。此可藉由添加氯化鈉或如上文所列舉之其他共溶劑、或如上文所列舉之賦形劑諸如緩衝劑及抗氧化劑獲得。

眼前房之組織浸浴於前房液中，而視網膜係持續暴露於玻璃體。這些流體/凝膠以高度還原之氧化還原狀態存在，因為其含有抗氧化劑化合物及酶。因此，眼科組成物中包括還原劑可為有利的。合適的還原劑包括N-乙醯半胱胺酸、抗壞血酸或鹽形式、及 亞硫酸鈉或偏亞硫酸氫鈉，其中抗壞血酸及/或N-乙醯半胱胺酸或麩胱甘肽尤其適合用於可注射溶液。

包含細胞或條件培養基、或細胞組分或細胞產物之醫藥組成物可以所屬技術領域中已知的數種遞送方式中之一或多者遞送至患者眼睛。在可適合用於一些情況中之一個實施例中，組成物以眼滴劑或洗眼劑之形式局部遞送至眼睛。在另一實施例中，組成物可經由週期性眼內注射或藉由輸注於灌洗溶液諸如BSS或BSS PLUS(Alcon USA,Fort Worth,Tex.)中遞送至眼睛內之各種位置。或者，組成物可以所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他眼科劑型施加，諸如預形成或原位形成之凝膠或脂質體，例如Herrero-Vanrell之美國專利第5,718,922號中所揭示。在另一實施例中，組成物可經由隱形眼鏡(例如Lidofilcon B,Bausch & Lomb CW79或DELTACON(Deltafilcon A))或其他暫時停留在眼睛表面上的物體遞送至或遞送通過需要治療之眼睛之水晶體。在其他實施例中，可採用諸如膠原蛋白角膜護罩(例如BIO-COR可溶性角膜護罩，Summit Technology,Watertown,Mass.)之支持物。組成物亦可藉由輸注至眼球中來投予，該輸注係經由滲透泵(ALZET,Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)之套管或藉由植入定時釋放膠囊(OCCUSENT)或可生物降解盤(OCULEX,OCUSERT)之任一者進行。此等投予途徑具有向眼睛提供醫藥組成物之連續供應之優點。此可有利於角膜之局部遞送。

縮寫

以下縮寫可出現於實例和說明書之其他地方及申請專利範圍中：ANG2(或Ang2)為血管生成素2；APC為抗原呈現細胞；BDNF為腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)；bFGF為鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)；CK18為細胞角蛋白(cytokeratin)18；CNS為中樞神經系統；CNTF為睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)；CXC配體3 為趨化激素受體配體(chemokine receptor ligand)3；DMEM為達爾伯克(Dulbecco’s)最低必需培養基；DMEM：lg(或DMEM：Lg、DMEM：LG)為具有低葡萄糖之DMEM；EDTA為乙二胺四乙酸；EGF(或E)為表皮生長因子(epidermal growth factor)；FACS為螢光活化細胞分選(fluorescent activated cell sorting)；FBS為胎牛血清；FGF(或F)為纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)；GBP為加巴噴丁(gabapentin)；GCP-2為顆粒性細胞趨化蛋白質(granulocyte chemotactic protein)-2；GDNF為膠細胞衍生神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor)；GFAP為膠細胞纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)；HB-EGF為肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor)；HCAEC為人類冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cell)；HGF為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)；hMSC為人類間葉幹細胞(Human mesenchymal stem cell)；HNF-1α為肝細胞特異性轉錄因子(hepatocyte-specific transcription factor)；HVVEC為人類臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell)；I309為趨化激素及CCR8受體之配體；IGF-1為類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)1；IL-6為介白素(interleukin)6；IL-8為介白素8；K19為角蛋白(keratin)19；K8為角蛋白8；KGF為角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)；LIF為白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)；MBP為髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein)；MCP-1為單核細胞趨化蛋白質(monocyte chemotactic protein)1；MDC為巨噬細胞衍生趨化激素(macrophage-derived chemokine)；MIP1α為巨噬細胞發炎蛋白質(macrophage inflammatory protein)1α；MIP1β為巨噬細胞發炎蛋白質1β；MMP為基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)；MSC為間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)；NHDF為正常人類皮膚纖維母細胞(Normal Human Dermal Fibroblast)；NPE為神經前驅細胞擴增培養基(Neural Progenitor Expansion media)；NT3為神經營養蛋白(neurotrophin)3；04為寡樹 突細胞(oligodendrocyte)或膠細胞分化標記(glial differentiation marker)04；PBMC為周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell)；PBS為磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline)；PDGF-CC為血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)C；PDGF-DD為血小板衍生生長因子D；PDGFbb為血小板衍生生長因子bb；PO為「經口(per os)」(經由嘴巴)；PNS為周邊神經系統(peripheral nervous system)；Rantes(或RANTES)為調控活化、正常T細胞表現與分泌(regulated on activation,normal T cell expressed and secreted)；rhGDF-5為重組人類生長及分化因子(recombinant human growth and differentiation factor)5；SC為皮下(subcutaneously)；SDF-1α為基質衍生因子(stromal-derived factor)1α；SHH為音蝟(sonic hedgehog)；SOP為標準作業程序；TARC為胸腺與活化調控趨化激素(thymus and activation-regulated chemokine)；TCP為組織培養塑膠(Tissue culture plastic)；TCPS為組織培養聚苯乙烯；TGFβ1為轉形生長因子(transforming growth factor)β1；TGFβ2為轉形生長因子(transforming growth factor)β2；TGF β-3為轉形生長因子β-3；TIMP1為基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase)1；TPO為血小板生成素(thrombopoietin)；TSP為血小板反應蛋白；TUJ1為BIII微管蛋白(tubulin)；VEGF為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)；vWF為馮威里氏因子(von Willebrand factor)；及αFP為α-胎蛋白(fetoprotein)。

實例

提供以下實例以更詳細描述本發明。該等實例意欲說明而非限制本發明。

實例1 人類臍組織衍生細胞對血管新生的效應

檢測人類臍組織衍生細胞對血管新生及VEGF的效應。

材料

VEGF ELISA套組係來自Thermo Scientific(Pittsburgh,PA)。sVEGFR1及大鼠VEGF ELISA套組係來自R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN)。重組人類VEGF165(VEGF的165個胺基酸剪接變體)係來自EMD Chemicals(Gibbstown,NJ)。Halt Protease inhibitor Single-Use Cocktail係來自Thermo Scientific(Pittsburgh,PA)，並如供應商所指示以1倍或3倍的濃度使用。抗人類VEGFR1抗體(AF321、BAF321)及正常山羊IgG同型對照抗體係來自R&D Systems(Minneapolis,MN)。重組人類sVEGFR1係來自Cell Science(Canton,MA)。

方法

動物及處理：所有程序皆嚴格遵守動物使用及實驗之準則。

視網膜下注射：將六週大的雄性Brown Norway大鼠(Charles River；Wilmington,MA)用氯胺酮(80mg/kg)/甲苯噻嗪(xylazine)(8mg/kg)(Henry Schein；Melville,NY)的腹腔注射(IP)麻醉。將其瞳孔用1%托吡卡胺(tropicamide)(Alcon Pharmaceuticals；Ft.Worth,TX)散瞳；將其等以側臥置於Zeiss Operating Microscope下(Zeiss；Peabody,MA)並將頭部藉由一隻手握住來固定。將GenTeal^®潤滑劑眼用凝膠(Alcon Pharmaceuticals)施加至角膜表面，並使眼底可視化。如下製備用於遞送hUTC的導孔：在使眼睛突出(proptosing)的同時，將眼球用19°斜角的30G針(Hamilton®；Reno,NV)緊接在角膜緣後面以陡峭的角度刺穿，以避免碰觸水晶體。將針在保持頭部固定的同時收回。配有33G鈍端針(Hamilton®)的Hamilton注射器預載有2μl的hUTC懸浮液。將此針以陡峭的角度 插入導孔以避免與水晶體接觸，並穿過眼睛前進直到刺穿視網膜並進入視網膜下腔(subretinal space)。將注射器由一個操作者固持定位，同時另一操作者緩慢地將其內容物遞送至視網膜下腔中，從而產生可見的視網膜剝離。在視網膜下遞送後，將針輕輕地抽出。緊接在注射程序後，將2至3滴的0.3%托吡卡胺眼用溶液(Allivet；Miami,FL)施加至眼睛的前表面以預防感染。

雷射誘導之脈絡膜血管新生：將六週大的成年Brown-Norway大鼠(Charles River)用氯胺酮(80mg/Kg)/(8mg/kg)甲苯噻嗪(Henry Schein)的IP注射麻醉。將瞳孔用1%托吡卡胺(Alcon)散瞳。使用手持蓋玻片作為接觸鏡片、及GenTeal^®潤滑劑眼用凝膠(Alcon)作為接觸蓋玻片及角膜服務的介質，使用在488/514nm下操作之AC-2000氬雷射光凝固器(NIDEK INC.,Fremont CA)(偶合至SL-1600狹縫燈(NIDEK INC.))，以在視網膜中周邊(mid-periphery)產生與視神經頭等距離的四個灼傷。病變係用雷射參數產生，包括100μm光斑大小、0.1秒持續時間、及120mW。

脈絡膜鋪片及組織染色：脈絡膜鋪片及組織染色係以與Bora等人(2005)所述類似的方式執行。將動物深度麻醉，並藉由頸椎脫位術安樂死。然後將眼睛摘出(enucleate)並置於10%福馬林(Sigma)2小時。藉由以下獲得視網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜-鞏膜複合物：將眼睛對切、移除水晶體、及自下面的RPE剝離神經視網膜。進行至少四次徑向切割以使此組織變平。脈絡膜新生血管病變之組成內皮細胞係用FITC共軛的加納穀物同工凝集素(Griffonia simplicifolia isolectin)B4(Sigma)識別，而細胞外基質之彈性蛋白係使用共軛至Cy3(Santa Cruz Biotech.,Inc；Santa Cruz,CA)之山羊抗彈性蛋白抗體識別。然後將平坦鋪片置於顯微鏡玻片上，其中RPE側朝上。將Gel Mount介質(Biomedia；Victoria,Australia)在用蓋玻片覆蓋玻片之前施加至組織。脈絡膜鋪片係使用落射螢光複合顯微鏡之10x物鏡可視化，該顯微鏡配有適當的激發和發射濾光器(Provis AX-70,Olympus；Japan)。新生血管病變之影像的擷取係使用 數位相機連接至Provis系統(DP71,Olympus；Japan)使用影像擷取軟體(DP Controller,Olympus；Japan)。使用DP Controller的自動縮放功能校準影像大小。

脈絡膜VEGF水準檢測：雷射誘導之布魯赫氏膜(Bruch’s membrane)破裂係用以在6週大的雄性Brown Norway大鼠中產生脈絡膜血管新生。將大鼠分成處理組，包括無雷射對照、或雷射加上無注射、媒劑注射、及雷射前7天投予的hUTC注射。在雷射後3天解剖脈絡膜組織，且VEGF蛋白係使用大鼠VEGF ELISA(R&D Systems；RRV00)測量。將VEGF蛋白水準標準化至脈絡膜組織中的總蛋白。所收集之組織包括脈絡膜、布魯赫氏膜、及RPE。

hUTC培養：如以下於實例2至實例8中所述將hUTC分離、培養、及凍存，且如先前描述於美國專利第7,524,489號及第7,510,873號、美國公開申請案第2005/0058631號、2016年7月5日申請之美國專利申請案第62/358,389號、及2017年6月2日申請之美國專利申請案第62/514,317號，其等之全文皆以引用方式併入本文中。簡言之，捐贈者同意活產後捐贈之人類臍帶係得自國家疾病研究交換中心(National Disease Research Interchange,Philadelphia,PA)。將組織絞碎且用酶消化。在用含有50U/mL膠原蛋白酶(Sigma,St.Louis)、玻尿酸酶、及中性蛋白酶之混合物的達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)-低葡萄糖(Lg)(Invitrogen,Carlsbad,CA)培養基幾乎完全消化之後，使細胞懸浮液過濾通過70μm過濾器，且將上清液以350g離心。將分離之細胞於DMEM-Lg中洗滌幾次，且將其以5,000個細胞/cm2之密度接種於含有15%(v/v)FBS(Hyclone,Logan,Utah)及4mM L-麩醯胺酸(Gibco,Grand Island,NY)之DMEM-Lg培養基中。當細胞達到大致70%長滿時，使用TrypLE(Gibco,Grand Island,NY)繼代。在數次繼代之後收集細胞並存庫。

hUTC及ARPE19條件培養基的製備：在第1天，將hUTC或ARPE19解凍，並以0.288×106個細胞/2.4ml/孔接種於6孔盤在含有15%(v/v)FBS(Hyclone,Logan,Utah)及4mM L-麩醯胺 酸(Gibco,Grand Island,NY)之DMEM-Lg培養基中。在第2天，吸出培養基，並補充含有10% v/v FBS及50U/ml青黴素(Invitrogen)、50μg/ml鏈黴素(Invitrogen)之DMEM/F12培養基(ATCC)。將細胞繼續培養48小時。在第4天，收集來自hUTC或ARPE19之CM以直接用於實驗，或冷凍在-70℃下以供未來使用。

免疫沉澱：按製造商之說明使每mg Dynabeads(ThermoFisher Scientific,Rochester,NY)10μg的重組人類VEGF165(Peprotech,Princeton,NJ)共軛，最終濃度為10mg珠粒/ml(100μg VEGF/ml)。將15mL hUTC條件培養基或對照培養基與0.3mg的VEGF共軛之珠粒溶液混合。藉由在4℃下滾動30分鐘來培養樣本，並用緩衝液(100mM Tris，pH 7.4；100mM NaCl、100mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM EDTA緩衝液、1%蛋白酶抑制劑)洗滌。然後將樣本在50μl的50mM HCL中洗提5分鐘，且將洗出液最終與5μl的1.0M Tris pH 8.5混合。針對西方墨點分析，將與NuPAGE® LDS樣本緩衝液(4X)(Life Technologies,Carlsbad,CA)及25ng的重組人類可溶性VEGFR1混合之40uL的Tris洗出液在SDS-PAGE凝膠上運行，並將經凝膠離析之蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%(W/V)BSA阻斷，隨後用靶向VEGFR1之胞外區的生物素化之抗VEGFR1抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)探測。在洗滌後，將膜與鏈黴親和素-HRP(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)培養，並用增強化學發光西方墨點受質可視化免疫反應性條帶。將剩餘的洗出液用於質譜分析，以識別hUTC條件培養基中之VEGF結合因子。

質譜術：處理兩種免疫沉澱下拉(pull-down)樣本(製備自hUTC條件培養基及對照培養基(僅培養基))以用於質譜(MS)分析。將樣本濃縮、還原、烷基化、及消化。然後使用結合部分之肽消化完成MS要求(requisition)，接著進行肽圖譜及數據分析。

R&A肽消化：將樣本(各~150μL)在真空離心機中濃縮至大約15μL。藉由與2μL的100mM DDT混合將其等還原(R)； 其後將溶液在60℃下培養30分鐘。在還原後，藉由添加2μL的100mM IAA及在黑暗中在RT下培養20分鐘，將樣本烷基化(A)。最後，添加1.0-μL等分試樣的胰蛋白酶([C]=0.5μg/μL)，且將溶液在37℃下消化整夜(~16h)。

HPLC-MS數據產生：使用與Bruker Daltonics micrOTOF-Q II質譜儀偶合之Dionex U3000 HPLC分析肽消化物。針對各分析注射18-μL等分試樣的樣本。使用LC Packings Acclaim PepMap C18，180μm×150mm，3μm d_p管柱將消化物分離；溶劑A為於水中之0.1%甲酸(FA)，且溶劑B為乙腈。將管柱維持在65℃之溫度下。流速為6.0μL/min，且流直接傳至micrOTOF質譜儀中。但將電灑發射器保持接地，轉移毛細管電壓為-4.5kV，並將端板偏移電壓(end plate offset voltage)設定為-500V。對每樣本執行一項分析：前5個資料引導分析(data directed analysis,DDA)，其中前驅物係選自質量範圍m/z 400-1700。

數據分析：將結果針對NCBI非重複性(non-redundant)資料庫(02OCT11發布)以人類分類進行檢索。表1中所列之識別的蛋白質係由肽MS/MS數據完成，其具有p<0.05之顯著性且期望閾值係設定為0.05。

統計分析：統計顯著性係藉由非成對雙尾Student氏t檢定來評估。P值<0.05被視為具統計顯著性。所有變異性說明均係平均值標準誤差(SEM)，除非另有指明。

結果

hUTC在體外減少VEGF自ARPE-19細胞的釋放：將ARPE-19細胞在有或沒有劑量依賴性地接種之hUTC下培養，以檢測hUTC在體外對RPE VEGF生產的效應。VEGF係以大約220pg/ml分泌自單獨培養的接種2天後之ARPE-19，自與hUTC共培養之ARPE19的分泌大幅減少，且變成完全不可偵測的，其中接種高密度(30×10³或60×10³個細胞/孔)的hUTC(圖3A)。此外，當 ARPE19 CM係與hUTC CM培養時，ARPE19 CM中之VEGF顯著且迅速地在5分鐘內減少，並在2天內變成完全不可偵測的(圖3B)。hUTC CM中之VEGF水準低於偵測極限(數據未顯示)。類似地，當以300pg/mL添加於hUTC CM中時，重組人類VEGF(rhVEGF)在5分鐘培養後變為可忽略的，且在2天內變成不可偵測的(圖3C)。

為了檢測VEGF之蛋白分解降解的可能性，將hUTC CM用廣效蛋白酶抑制劑混合物預處理30分鐘，之後添加rhVEGF(300pg/ml)並培養5分鐘。然而，hUTC CM與蛋白酶抑制劑混合物之預培養對rhVEGF減少不具效應(圖3D)。類似地，rhVEGF在hUTC CM中在有或沒有蛋白酶抑制劑混合物下進一步培養15、30、60、或120分鐘之後皆低於可偵測水準(數據未顯示)。

識別hUTC條件培養基中之VEGF結合因子已報導許多因子會與VEGF結合，諸如神經纖毛蛋白(neuropilin)-1和-2、血小板反應蛋白、結締組織生長因子、血小板因子-4、α2-巨球蛋白、膠原蛋白、及硫酸肝素蛋白多醣。使用VEGF「下拉」檢定自hUTC CM及對照培養基製備免疫沉澱部分。hUTC CM中結合至VEGF的蛋白質被rhVEGF共軛之珠粒拉下。然後將蛋白質-珠粒複合物在緩衝液中洗提。將部分洗出液用於西方墨點分析，且進一步處理剩餘的洗出液以用於質譜(MS)分析。使用結合部分之肽消化完成MS要求，接著進行肽圖譜及數據分析。hUTC CM及對照培養基中之經識別蛋白質係總結於表1中。九個經識別肽展示出VEGFR1存在於hUTC條件培養基中，但不在對照培養基中。沒有識別出其他具有高可性度的蛋白質。吾人藉由使用ELISA偵測hUTC CM中高水準的sVEGFR1(1739.0±48.505pg/mL)而對此做進一步確認。當將CM與針對sVEGFR1之中和抗體預培養時，人類CM中之rhVEGF水準顯著恢復(圖4)。

此外，使自VEGF下拉免疫沉澱洗提之hUTC CM經受西方墨點分析，並評估hUTC CM中sVEGFR1的分子量。使用質量大約96kDa的重組人類sVEGFR1作為陽性對照。在hUTC CM樣本中sVEGFR1之抗體產出~110kDa之主要條帶及~150kDa之次要條帶。針對重組人類sVEGFR1偵測到~96kDa之單一條帶(圖5)。已報導sVEGFR1之分子量為醣基化及物種依賴性。sVEGFR1的大小在小鼠中已被記錄為60kDa，當由人類臍靜脈內皮細胞及初代人類真皮微血管內皮細胞表現時已被記錄為110kDa，當由黑色素瘤細胞生產時已被記錄為120至130kDa，且在人類胎盤組織溶解產物中已被記錄為116kDa。偵測到的次要條帶可為sVEGFR1之醣基化形式。

實例2 自產後組織衍生細胞

此實例描述自胎盤及臍帶組織製備產後衍生細胞。在足月或不足月生產後獲得產後臍帶及胎盤。細胞係收集自五位不同捐贈者之臍帶及胎盤組織。測試不同的細胞分離方法產出具有以下潛能之細胞的能力：1)分化成具有不同表型之細胞的潛能；或2)提供可用於其他細胞及組織之營養因子之潛能。

方法及材料

臍細胞分離：臍帶係獲自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)。組織係在正常分娩後獲得。細胞分離規 程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。為了移除血液及碎屑，將臍帶在磷酸鹽緩衝液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中於抗黴劑及抗生素(100單位/毫升的青黴素、100微克/毫升的鏈黴素、0.25微克/毫升的兩性黴素B)存在下來清洗。接著在150cm²組織培養盤上並且於50毫升的培養基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)存在下機械解離組織，直到將組織切碎為細泥。將切碎的組織轉移至50毫升錐形管(每管約5公克的組織)。

隨後將組織於DMEM-低葡萄糖培養基或DMEM-高葡萄糖培養基中消化，各培養基含有如上文所述之抗黴劑及抗生素。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)(膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)，500個單位/毫升；與分散酶(Invitrogen)，50個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖培養基中)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(「C：D：H」)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,N.Y)中以225rpm培養2小時。

在消化後，將組織以150 x g離心5分鐘，且將上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升的生長培養基(DMEM-低葡萄糖(Invitrogen)、15百分比(v/v)胎牛血清(FBS；特級牛血清(defined bovine serum)；批號AND18475；Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma)、每100毫升1毫升如上文所述之抗生素/抗黴劑。使細胞懸浮液通過70微米尼龍細胞濾器(BD Biosciences)過濾。使額外5毫升包含生長培養基的潤洗液通過濾器。接著使細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，然後用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。

將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150xg離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。

在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍染色來判定存活細胞數目。接著在標準條件下培養細胞。

將分離自臍帶的細胞以5,000個細胞/cm²接種於經明膠塗布T-75cm²培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)上並且於具有如上文所述之抗生素/抗黴劑的生長培養基中。2天後(在各種實驗中，細胞培養2至4天)，將用過的培養基自瓶吸出。用PBS清洗細胞三次以去除碎屑與血衍生細胞。接著用生長培養基補充細胞並讓其生長至長滿(自繼代0至繼代1約10日)。在後續繼代時(自繼代1至2等等)，細胞在4至5日後達到次長滿(75至85百分比長滿)。針對這些後續繼代，以5000個細胞/cm²接種細胞。使細胞在加濕培養器中於5百分比二氧化碳及大氣氧氣、37℃下生長。

胎盤細胞分離：胎盤組織係獲自NDRI(Philadelphia,Pa.)。該些組織係來自孕婦且在正常外科分娩時獲得。胎盤細胞係如臍細胞分離所述分離。

以下實例應用於自胎盤組織分離母體衍生及新生兒衍生之分開細胞群。

細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。將胎盤組織在磷酸鹽緩衝液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中於抗黴劑及抗生素(如上文所述)之存在下清洗，以移除血液及碎屑。隨後將胎盤組織解剖成三區：頂線(新生兒側或態樣)、中線(混合的細胞分離新生兒及母體)及底線(母體側或態樣)。

將分開的區個別於具有抗生素/抗黴劑之PBS中清洗數次以進一步移除血及碎屑。接著在150cm²組織培養盤上於50毫升的DMEM-低葡萄糖存在下機械解離各區，直到將各區切碎為細泥。將泥轉移至50毫升錐形管中。各管含有大致5公克組織。將組織於含有抗黴劑及抗生素(100U/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B)及消化酶之DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖培養基中消化。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與 分散酶的酶混合物(「C：D」)，其於DMEM-低葡萄糖培養基中含有500個單位/毫升之膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)與50個單位/毫升之分散酶(Invitrogen)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(C：D：H)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm培養2小時。

在消化後，將組織以150^xg離心5分鐘，將所得上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升的具有青黴素/鏈黴素/兩性黴素B之生長培養基中。使細胞懸浮液過濾通過70微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。使總細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，接著用額外5毫升的生長培養基作為潤洗液。

將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150xg離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍排除測試來判定細胞計數。接著在標準條件下培養細胞。

LIBERASE細胞分離：於具有LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)(每毫升2.5毫克，Blendzyme 3；Roche Applied Sciences,Indianapolis,Ind.)及玻尿酸酶(5個單位/毫升，Sigma)之DMEM-低葡萄糖培養基中將細胞自臍組織分離。組織消化與細胞分離係如以上之其他蛋白酶消化所述，但使用LIBERASE/玻尿酸酶混合物代替C：D或C：D：H酶混合物。用LIBERASE消化組織會使來自產後組織迅速擴增的細胞族群得以分離出來。

使用其他酶組合的細胞分離：對於使用不同酶組合以 自臍帶分離出細胞的程序進行比較。用於消化比較之酶包括：i)膠原蛋白酶；ii)分散酶；iii)玻尿酸酶；iv)膠原蛋白酶：分散酶混合物(C：D)；v)膠原蛋白酶：玻尿酸酶混合物(C：H)；vi)分散酶：玻尿酸酶混合物(D：H)；與vii)膠原蛋白酶：分散酶：玻尿酸酶混合物(C：D：H)。觀察利用這些不同酶消化條件之細胞分離的差異(表2-1)。

結果

使用不同酶組合之細胞分離：C：D：H之組合提供最佳分離後細胞產率，並且比起其他條件在培養中產生擴增更多代的細胞(表2-1)。單獨使用膠原蛋白酶或玻尿酸酶無法獲得可擴增的細胞群。未試圖判定此結果是否專屬於所測試之膠原蛋白。

使用不同酶組合及生長條件分離細胞：在所有針對酶消化及生長所測試的條件下，細胞皆在繼代0與1之間附著及擴增良好(表2-2)。實驗條件5至8與13至16中之細胞皆在接種後良好增生多達4次繼代，將這些細胞在此時點凍存。所有細胞皆經凍存以備進一步研究。

總結：可使用膠原蛋白酶(基質金屬蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)、及玻尿酸酶(分解玻尿酸之黏液分解酶)的酶組合，可有效地將細胞群自臍帶及胎盤組織衍生出來。亦可使用名為Blendzyme之LIBERASE。特定言之，亦可使用Blendzyme 3並搭配玻尿酸酶來分離細胞，Blendzyme 3為膠原蛋白酶(4 Wunsch單位/g)與嗜熱菌蛋白酶(1714酪蛋白單位/g)。當在明膠塗布之塑膠上的生長培養基中培養時，這些細胞迅速擴增許多個繼代。

實例3 產後衍生細胞之核型分析

細胞療法所用之細胞系較佳為均質性並且不含任何汙染細胞型。細胞療法所用之細胞應具有正常染色體數目(46)及結 構。為了要識別出均質性且不含非產後組織來源之細胞的胎盤及臍帶衍生細胞系，對於細胞樣本之核型進行分析。

方法及材料

在含有青黴素/鏈黴素之生長培養基中培養來自男新生兒之產後組織的PPDC。選用來自男新生兒(X,Y)的產後組織以能夠區別新生兒衍生細胞與母體衍生細胞(X,X)。將細胞以每平方公分5,000細胞接種於T25培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的培養基中並且擴增至80%長滿。將含有細胞之T25培養瓶用生長培養基填充至頸部。由快遞員將樣本送至臨床細胞遺傳學實驗室(估計實驗室至實驗室交通時間為一小時)。在中期(metaphase)分析細胞，此時染色體係最佳可視化。在所計數之二十個處於中期的細胞中，有五個分析出具有正常均質性核型數目(兩個)。如果觀察到兩個核型，即將細胞樣本歸類為均質性。如果觀察到超過兩個核型，即將細胞樣本歸類為異質性。當識別出異質性核型數目(四個)時，即計數額外中期細胞並加以分析。

結果

所有送交染色體分析的細胞樣本皆判讀為展現正常外觀。16個經分析之細胞系中的三個展現異質性表型(XX與XY)，從而指示同時存在衍生自新生兒及母體來源的細胞(表3-1)。將衍生自組織胎盤-N之細胞自胎盤之新生兒態樣分離。在繼代零，此細胞系顯現出均質性XY。然而，在繼代九，該細胞系為異質性(XX/XY)，指出先前未偵測出的母體來源細胞存在。

總結：染色體分析識別出核型顯現為正常(由臨床細胞遺傳學實驗室判讀)的胎盤及臍衍生細胞。核型分析亦識別出不含母體細胞的細胞系，此係由均質性核型來判定。

實例4 藉由流動式細胞測量術評估人類產後衍生細胞表面標記

藉由流動式細胞測量術來特徵化細胞表面蛋白質或「標記」可用來判定細胞系的身份(identity)。表現的一致性可由多個捐贈者來判定，並且在暴露於不同處理與培養條件的細胞中判定。自胎盤及臍分離出的產後衍生細胞(PPDC)系係經表徵(藉由流動式細胞測量術)，從而提供用於識別這些細胞系的概況。

方法及材料

培養基及培養容器：將細胞培養於具有青黴素/鏈黴素之生長培養基(Gibco Carlsbad,Calif.)中。使細胞在經血漿處理之 T75、T150與T225組織培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中培養直到長滿。培養瓶的生長表面係藉由在室溫下培養2%(w/v)明膠(Sigma,St.Louis,Mo.)20分鐘來塗布明膠。

抗體染色及流動式細胞測量術分析：將瓶中之貼附細胞於PBS中清洗且用胰蛋白酶/EDTA脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×10⁷的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。根據製造商規範，將關注的細胞表面標記之抗體(請見後文)添加至一百微升的細胞懸浮液，然後將混合物在黑暗中在4℃下培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除未結合的抗體。將細胞再懸浮於500微升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。流動式細胞測量術分析係用FACScalibur^TM儀器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)來執行。表4-1列出所使用之細胞表面標記之抗體。

胎盤與臍比較：在繼代8將胎盤衍生細胞與臍衍生細胞進行比較。

繼代對繼代比較：在繼代8、15、及20分析胎盤衍生細胞及臍衍生細胞。

捐贈者對捐贈者比較：為了比較捐贈者之間的差異，將來自不同捐贈者之胎盤衍生細胞互相比較，且將來自不同捐贈者之臍衍生細胞互相比較。

表面塗層比較：將培養在經明膠塗布之培養瓶上的胎盤衍生細胞與培養於未經塗布之培養瓶上的胎盤衍生細胞進行比較。將培養於經明膠塗布培養瓶上的臍衍生細胞與培養於未塗布培養瓶上之臍衍生細胞進行比較。

消化酶比較：對四種用於分離及製備細胞的處理進行比較。分離自用1)膠原蛋白酶；2)膠原蛋白酶/分散酶；3)膠原蛋白酶/玻尿酸酶；與4)膠原蛋白酶/玻尿酸酶/分散酶處理之胎盤之細胞係經比較。

胎盤層比較：將衍生自胎盤組織之母體態樣的細胞與衍生自胎盤組織之絨毛區的細胞以及衍生自胎盤之新生胎兒態樣的細胞進行比較。

結果

胎盤與臍比較：藉由流動式細胞測量術分析之胎盤衍生細胞及臍衍生細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，此係由相對於IgG對照組的螢光值增加來指示。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的可偵測表現為陰性，此係由螢光值與IgG對照組可相比來指示。考慮到陽性曲線之螢光值之變異。陽性曲線之平均值(亦即CD13)及範圍(亦即CD90)顯示一些變異，但曲線顯現正常，證實為均質性族群。兩個曲線個別展現大於IgG對照組之值。

繼代對繼代比較-胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15、及20的胎盤衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，如相對於IgG對照組的螢光值增加所反映。該些細胞之CD31、CD34、 CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

繼代對繼代比較-臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15、及20之臍衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，此係由相對於IgG對照組的螢光增加來指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

捐贈者對捐贈者比較-胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自不同捐贈者之胎盤衍生細胞各表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，其相對於IgG對照組具有增加的螢光值。該些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

捐贈者對捐贈者比較-臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自不同捐贈者之臍衍生細胞各顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，此係反映在相對於IgG對照組增加的螢光值。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

明膠表面塗層對胎盤衍生細胞的效果：藉由流動式細胞測量術分析在經明膠塗布或未經塗布之培養瓶上擴增的胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，此係反映在相對於IgG對照組增加的螢光值。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

明膠表面塗層對臍衍生細胞的效果：藉由流動式細胞測量術分析在明膠上及在未經塗布之培養瓶上擴增的臍衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、 HLA-B、HLA-C，其相對於IgG對照組具有增加的螢光值。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

用於製備細胞之酶消化程序對細胞表面標記概況的效果：藉由流動式細胞測量術分析之使用各種消化酶分離的胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C，如藉由相對於IgG對照組之螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。

胎盤層比較：藉由流動式細胞測量術分析之分別分離自胎盤之母體、絨毛、及新生兒層的細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A、HLA-B、HLA-C之陽性表現，如藉由相對於IgG對照組之螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。

總結：胎盤衍生細胞及臍衍生細胞的流動式細胞測量術分析已建立這些細胞系的身份。胎盤衍生細胞及臍衍生細胞為CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，且為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。此身份在變項包括捐贈者、繼代、培養容器表面塗層、消化酶與胎盤層的變異間皆一致。觀察到在個別螢光值直方圖曲線平均值與範圍上有一些變異，但在所有測試條件下的所有陽性曲線皆為正常並且表現出大於IgG對照組的螢光值，因而確認該些細胞包含具有該些標記之陽性表現的均質性族群。

實例5 產後組織表型的免疫組織化學特徵

人類產後組織(即臍帶及胎盤)中所發現的細胞之表型係以免疫組織化學法分析。

方法及材料

組織製備：收穫人類臍帶及胎盤組織並在4℃下浸漬固定於4%(w/v)多聚甲醛中整夜。使用針對下列表位的抗體來執行免疫組織化學法：波形蛋白(1：500；Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(desmin，1：150，對抗兔而生成；Sigma；或1：300，對抗小鼠而生成；Chemic on,Temecula,Calif.)，α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，測試以下標記：抗人類GROα--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGO-A(1：100；Santa Cruz Biotech)。用解剖刀修剪經固定之樣品，然後將其置於在含乙醇之乾冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,Calif)內。接著使用標準低溫恒溫器(Leica Microsystems)將冷凍之包埋塊切片(10μm厚)然後固定於玻片上以備染色。

免疫組織化學：類似於先前研究執行免疫組織化學(例如，Messina等人，2003,Exper.Neurol.184：816-829)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗組織切片然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中1小時以獲取細胞內抗原。在感興趣表位會位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上的情況中，省略該程序的所有步驟中之Triton以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2,ox-LDL R1,NOGO-A)而生成的情況中，整個程序中使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於切片歷時4小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250； Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150；Santa Cruz Biotech)。清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。高於對照組染色的螢光信號即代表陽性染色。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif.)來製備分層合成影像(Layered montage)。

結果

臍帶之表徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CKI8、vWF、及CD34標記係表現於臍帶內發現之細胞亞群中。特定而言，vWF與CD34表現限制於臍帶內所含之血管。CD34+細胞係位於最內層(管腔側)上。波形蛋白表現係發現於整個臍帶基質與血管中。SMA限於動脈及靜脈的基質與外壁，但血管本身則不含。僅在血管內觀察到CK18與肌間線蛋白，且肌間線蛋白限於中層及外層。

胎盤之表徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CKI8、vWF、及CD34全部在胎盤內觀察到且為區域特異性。

GROα、GCP-2、ox-LDL RI、及NOGO-A組織表現：此等標記皆未在臍帶或胎盤組織內觀察到。

總結：人類臍帶及胎盤內的細胞中皆會表現波形蛋白、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白18、馮威里氏因子、及CD 34。

實例6 使用寡核苷酸陣列分析產後組織衍生細胞

Affymetrix GENECHIP陣列係用來比較臍衍生與胎盤衍生細胞與纖維母細胞、人類間葉幹細胞與另一個衍生自人類骨髓之細胞系的基因表現概況。此分析提供產後衍生細胞之特徵並識別這些細胞的獨特分子標記。

方法及材料

細胞之分離及培養：人類臍帶與胎盤係獲自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)，其等係來自正常足月分娩並且獲得患者同意。如實例5中所述接收組織並分離細胞。將細胞培養於經明膠塗布的組織培養塑膠培養瓶上之生長培養基(使用DMEM-LG)中。培養物係在37℃下以5% CO₂培養。

人類皮膚纖維母細胞係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號9F0844)與ATCC CRL-1501(CCD39SK)。將兩個細胞系在DMEM/F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中培養，培養基含有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)與青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。使細胞生長於標準組織處理塑膠上。

人類間葉幹細胞(hMSC)係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號2F1655、2F1656與2F1657)並根據製造商規範在MSCGM Media(Cambrex)中培養。使細胞在37℃下以5% CO₂生長於標準組織培養塑膠上。

人類髂骨崤骨髓係接受自NDRI並獲得患者同意。骨髓係根據Ho等人(W003/025149)所概述之方法來處理。將骨髓與裂解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO₃與0.1mM EDTA，pH 7.2)混合，並且混合比例為1份骨髓對20份裂解緩衝液。使細胞懸浮液渦動、在環境溫度下培養2分鐘然後以500^xg離心10分鐘。將上清液丟棄，並將細胞團塊再懸浮於補充10%(v/v)胎牛血清與4mM麩醯胺酸之最低必需培養基α(Invitrogen)中。將細胞再次離心然後將 細胞團塊再懸浮於新鮮培養基中。使用台盼藍排除法(Sigma,St.Louis,Mo.)來計數存活單核細胞。將單核細胞以5×10⁴個細胞/cm²接種於組織培養塑膠瓶中。將細胞在37℃下以5% CO₂、在標準大氣O₂或在5% O₂下培養。將細胞培養5日並且未進行培養基更換。在5日的培養後將培養基與非貼附細胞移除。將貼附細胞維持於培養中。

mRNA之分離及GENECHIP分析：將活性生長之細胞培養物用細胞刮勺自培養瓶移除於冷PBS中。將細胞以300^xg離心5分鐘。將上清液移除，然後將細胞再懸浮於新鮮PBS並再次離心。將上清液移除，並將細胞團塊立刻冷凍並儲存於-80℃。萃取細胞mRNA並將細胞mRNA轉錄成cDNA，然後將cDNA轉錄成cRNA並進行生物素標記。使經生物素標記之cRNA與HG-U133A GENECHIP寡核苷酸陣列(Affymetrix,Santa Clara,Calif.)雜交。雜交及數據收集係根據製造商規範執行。分析係使用「Significance Analysis of Microarrays」(SAM)第1.21版電腦軟體(Stanford University；Tusher,V.G.等人，2001,PNAS USA 98：5116-5121)。\

結果

分析了十四個不同細胞群。細胞連同繼代資訊、培養基材、及培養基係列於表6-1中。

數據藉由主組分分析(Principle Component Analysis)評估，分析在細胞中有差別表現的290個基因。此分析允許族群之間相似性之相對比較。

表6-2顯示用於比較細胞對而計算之歐幾里德距離(Euclidean distance)。歐幾里德距離係根據基於290個基因的細胞比較結果，這些基因在不同細胞型間有差別表現。歐幾里德距離與290個基因之表現之間的相似性成反比(亦即，距離越大，存在的相似性越小)。

表6-3、表6-4、及表6-5顯示在胎盤衍生細胞中表現增加(表6-3)、在臍衍生細胞中表現增加(表6-4)、及在臍與胎盤衍生細胞中表現減少(表6-5)之基因。標題「探針組ID」之欄係指製造商對於定位於晶片上具體位點上之數種寡核苷酸探針組之識 別碼，該等探針組與經列名之基因(「基因名稱」欄)雜交，該等基因包含可在NCBI(GenBank)資料庫內以指定存取號(「NCBI存取號」欄)查找之序列。

表6-6、表6-7、及表6-8顯示在人類纖維母細胞(表6-6)、ICBM細胞(表6-7)、及MSC(表6-8)中表現增加之基因。

總結：本檢測係為了提供衍生自臍帶及胎盤之產後細胞的分子表徵而執行。此分析包括衍生自三個不同臍帶與三個不同胎盤的細胞。此檢測亦包括兩個不同的皮膚纖維母細胞系、三個間葉幹細胞系與三個髂骨崤骨髓細胞系。這些細胞所表現之mRNA係使用寡核苷酸陣列來分析，該陣列含有22,000個基因的探針。結果顯示，290個基因在這五種不同細胞型中有差別表現。這些基因包括十個在胎盤衍生細胞中特異地增加的基因，以及七個在臍帶衍生細胞中特異地增加的基因。發現相較於其他細胞型，四十四個基因具有在胎盤與臍帶中特異地較低的表現水準。選定基因之表現已藉由PCR來確認(參見以下實例)。此等結果證明，產後衍生細胞具有獨特的基因表現概況，例如相較於骨髓衍生細胞及纖維母細胞。

實例7 產後衍生細胞之細胞標記

在前述實例中，衍生自人類胎盤及人類臍帶之細胞的相似性及差異性係藉由比較其基因表現概況與衍生自其他來源之細胞的基因表現概況來評估(使用寡核苷酸陣列)。識別六個「簽名(signature)」基因：氧化LDL受體1、介白素-8、凝乳酶、內質網蛋白、趨化激素受體配體3(CXC配體3)、及顆粒性細胞趨化蛋白質2(GCP-2)。此等「簽名」基因在產後衍生細胞中以相對高的水準表現。

進行此實例中所述之程序以驗證微陣列數據且找出基因與蛋白質表現之間的一致性/不一致性，以及建立一系列可靠的檢定以用於偵測胎盤衍生細胞與臍衍生細胞之唯一識別符。

方法及材料

細胞：胎盤衍生細胞(三個分離株，包括一個經核型分析所識別主要為新生兒之分離株)、臍衍生細胞(四個分離株)、及正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF；新生兒及成人)，生長於經明膠塗布之T75瓶中具有青黴素/鏈黴素之生長培養基中。間葉幹細胞(MSCS)係生長於間葉幹細胞生長培養基Bullet套組(MSCGM；Cambrex,Walkerville,Md.)。

至於IL-8規程，將細胞自液態氮解凍並以5,000個細胞/cm²接種於經明膠塗布之瓶中，於生長培養基中生長48小時，然後於10毫升的血清饑餓培養基[DMEM--低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,Calif.)、青黴素/鏈黴素(Gibco,Carlsbad,Calif.)及0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma,St.Louis,Mo.)]中再生長8小時。在此處理之後，萃取RNA且將上清液以150xg離心5分鐘以移除細胞碎屑。然後將上清液冷凍在-80℃下以供ELISA分析。

ELISA檢定之細胞培養物：將衍生自胎盤及臍之產後細胞、以及衍生自人類新生兒包皮之人類纖維母細胞培養在經明膠 塗布之T75培養瓶中的生長培養基中。將細胞在繼代11時冷凍於液態氮中。將細胞解凍且轉移至15毫升離心管。在以150xg離心5分鐘之後，將上清液丟棄。將細胞再懸浮於4毫升培養基中且計數。使細胞以375,000個細胞/培養瓶生長於含有15毫升生長培養基之75cm²培養瓶中24小時。將培養基更換成血清饑餓培養基8小時。在培養結束時以14,000^xg離心5分鐘來收集血清饑餓培養基(且保存在-20℃下)。

為了估計各培養瓶中細胞之數目，各培養瓶中添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)。在細胞自培養瓶脫離之後，用8毫升的生長培養基中和胰蛋白酶活性。將細胞轉移至15毫升離心管且以150xg離心5分鐘。移除上清液且將1毫升生長培養基添加至各管以再懸浮細胞。使用血球計估計細胞數目。

ELISA檢定：由細胞分泌至血清饑餓培養基的IL-8之量係使用ELISA檢定(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)來分析。所有檢定皆根據製造商所提供之說明書來測試。

總RNA分離：將RNA自長滿之產後衍生細胞及纖維母細胞萃取出、或就IL-8表現而言自如上文所述處理之細胞萃取。將細胞用350微升含有β-巰基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)之緩衝液RLT溶解，此係根據製造商之說明書進行(RNeasy^® Mini Kit；Qiagen,Valencia,Calif)。RNA係根據製造商之說明書萃取(RNeasy^® Mini Kit；Qiagen,Valencia,Calif)，並使其進行DNase處理(2.7U/樣本)(Sigma St.Louis,Mo.)。用50微升經DEPC處理水將RNA沖提出來然後儲存於-80℃下。

反轉錄：RNA亦自人類胎盤及臍萃取出。將組織(30毫克)懸浮於700微升含有2-巰基乙醇之緩衝液RLT中。將樣本機械均質化且根據製造商之規範進行RNA萃取。用50微升經DEPC處理水將RNA萃取出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan^®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)來反轉 錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。樣本儲存於-20℃。

藉由cDNA微陣列識別為在產後細胞中所獨特調節之基因(簽名基因--包括氧化LDL受體、介白素-8、凝乳酶、及內質網蛋白)係使用即時及傳統PCR進一步研究。

即時PCR：使用Assays-on-Demand^®基因表現產物對cDNA樣本執行PCR：使用具有ABI Prism 7000 SDS軟體之7000序列偵測系統(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，根據製造商之說明書(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，將氧化LDL受體(Hs00234028)；凝乳酶(Hs00166915)；內質網蛋白(Hs003825 15)；CXC配體3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；及GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)與cDNA及TaqMan^® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件初始為50℃歷時2min及95℃歷時10min，接著為40個95℃歷時15秒及60℃歷時1分鐘之循環。根據製造商之規範分析PCR數據(Applied Biosystems關於ABI Prism 7700序列偵測系統之使用者佈告#2)。

傳統PCR：使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Mass.,USA)執行傳統PCR以確認即時PCR之結果。使用2微升cDNA溶液、1x AmpliTaq Gold通用混合物PCR反應緩衝液(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)及在94℃下初始變性歷時5分鐘來執行PCR。擴增係針對各引子組最佳化。針對IL-8、CXC配體3、及內質網蛋白(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續30個循環)；針對凝乳酶(94℃歷時15秒、53℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續38個循環)；針對氧化LDL受體與GAPDH(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續33個循環)。擴增所使用之引子係列於表7-1中。最終PCR反應中之引子濃度為1微莫耳，除了GAPDH為0.5微莫耳。GAPDH引子與即時PCR相同，除了未將製造商之TaqMan^®探針添加至最終PCR反應。將樣本於2%(w/v)瓊脂糖凝膠上運行(run)且用溴化乙錠 (Sigma,St.Louis,Mo.)染色。使用667 Universal Twinpack膜(VWR International,South Plainfield,N.J.)，使用焦距Polaroid照相機(VWR International,South Plainfield,N.J.)擷取影像。

免疫螢光：將PPDC在室溫下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固定10分鐘。使用臍衍生細胞及胎盤衍生細胞各者在繼代0(P0)(分離後直接使用)的一個分離株，及臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之繼代11(P 11)(兩個胎盤衍生細胞分離株、兩個臍衍生細胞分離株)及纖維母細胞(P 11)。使用針對以下表位的抗體執行免疫細胞化學：波形蛋白(1：500,Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(1：150；Sigma--對抗兔而生成；或1：300；Chemicon,Temecula,Calif--對抗小鼠而生成)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，於繼代11產後細胞上測試以下標記：抗人類GRO α--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGA-A(1：100；Santa Cruz,Biotech)。

用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma,St.Louis,Mo.)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。當感興趣表位係位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上時，省略該程序的所有步驟中之Triton X-100以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)而生成的情況中，全程會使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150,Santa Cruz Biotech)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus®倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro®軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop®軟體(Adobe,San Jose,Calif)來製備分層合成影像(Layered montage)。

製備細胞以進行FACS分析：將培養瓶中之貼附細胞於磷酸鹽緩衝液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中清洗且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×107的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。將一百微升等分遞送至錐形管中。細胞內抗原經染色之細胞係用Perm/Wash緩衝液(BD Pharmingen,San Diego,Calif)穿透。將抗體按製造商規範添加至等分中且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。培養後，用 PBS清洗細胞並離心以去除過量抗體。將需要二級抗體之細胞再懸浮於100微升3% FBS中。將二級抗體按製造商規範添加且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除過量二級抗體。將經清洗之細胞再懸浮於0.5毫升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。使用以下抗體：氧化LDL受體1(sc-5813；Santa Cruz,Biotech)、GROa(555042；BD Pharmingen,Bedford,Mass.)、小鼠IgG1κ(P-4685及M-5284；Sigma)、驢抗山羊IgG(sc-3743；Santa Cruz,Biotech.)。流動式細胞測量術分析係用FACScalibur^TM(Becton Dickinson San Jose,Calif.)來執行。

結果

在來自衍生自人類胎盤、成體及新生兒纖維母細胞與間葉幹細胞(MSC)之細胞的cDNA上所執行之針對選定「簽名」基因之即時PCR之結果指出，氧化LDL受體及凝乳酶兩者在胎盤衍生細胞中相較於其他細胞以較高水準表現。獲自即時PCR之數據係藉由AACT方法分析且以對數標度之形式表達。臍衍生細胞中內質網蛋白與氧化LDL受體表現水準相較於其他細胞為較高的。在產後衍生細胞與對照組之間未發現CXC配體3及GCP-2之表現水準有顯著差異。即時PCR之結果係藉由傳統PCR確認。PCR產物之定序進一步驗證這些觀察。使用上表7-1中所列之傳統PCR CXC配體3引子，發現產後衍生細胞與對照組之間CXC配體3之表現水準沒有顯著差異。

產後細胞介素IL-8之生產在經生長培養基培養及經血清饑餓培養之產後衍生細胞兩者中均提高。所有即時PCR數據皆用傳統PCR及藉由定序PCR產物來驗證。

當檢測生長於無血清培養基中之細胞的上清液中IL-8之存在時，最高量係在衍生自臍細胞及胎盤細胞之一些分離株之培養基中偵測出(表7-2)。在衍生自人類皮膚纖維母細胞之培養基中未偵測出IL-8。

亦藉由FACS分析檢測胎盤衍生細胞的氧化LDL受體、GCP-2及GROα之生產。經測試細胞為GCP-2陽性。此方法未偵測到氧化LDL受體及GRO。

亦藉由免疫細胞化學分析測試胎盤衍生細胞之選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將衍生自人類胎盤之細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。經染色細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式直到繼代11仍保留。在繼代0時僅一些細胞(<5%)為細胞角蛋白18染色陽性。

衍生自人類臍帶之細胞在繼代0時藉由免疫細胞化學分析探查到選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。臍衍生細胞為α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性，其中染色模式直到繼代11仍一致。

總結：對於以下四種基因，已確立藉由微陣列及PCR(即時及傳統兩者)所量測之基因表現水準之間的一致性：氧化LDL受體1、凝乳酶、內質網蛋白、及IL-8。這些基因之表現在PPDC 中的mRNA水準上受到差別調節，其中IL-8在蛋白質水準上亦受差別調節。藉由FACS分析，在衍生自胎盤之細胞中的蛋白質水準上未偵測出氧化LDL受體之存在。藉由FACS分析，GCP-2及CXC配體3於胎盤衍生細胞中在mRNA水準上之差別表現未經確認，但是在蛋白質水準上偵測出GCP-2。儘管此結果未由最初獲自微陣列實驗之數據反映出，但是此可能由於方法之靈敏度不同所致。

在分離後(繼代0)，立即染色衍生自人類胎盤之細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式亦在繼代11的細胞中觀察到。波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白表現可在繼代(在生長培養基中及在這些程序中所利用之條件下)細胞中保留。在繼代0之衍生自人類臍帶之細胞係經探查α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白之表現，且兩者皆為陽性。此染色模式直到繼代11仍保留。

實例8 臍組織衍生細胞中之端粒酶表現

端粒酶的功能是合成端粒重複序列(telomere repeat)，端粒重複序列用來保護染色體完整性並延長細胞的複製壽命(Liu,K，等人，PNAS,1999；96：5147-5152)。端粒酶由兩個組分所組成，即端粒酶RNA模板(hTER)與端粒酶反轉錄酶(hTERT)。端粒酶的調控係由hTERT而非hTER的轉錄來決定。hTERT mRNA的即時聚合酶連鎖反應(PCR)因而是一種已獲認可的用於判定細胞端粒酶活性的方法。

細胞分離.執行即時PCR實驗以判定人類臍帶組織衍生細胞的端粒酶生產。根據上文所述之實例製備人類臍帶組織衍生細胞。一般而言，得自國家疾病研究交換中心(Philadelphia,Pa.)的臍帶在正常分娩後會經過清洗以去除血液與碎屑然後進行機械解離。接著，將組織於37℃下以包括膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶之消化酶培養。根據上文實例中所述之方法培養人類臍帶組織衍生細胞。間葉幹細胞與正常皮膚纖維母細胞(cc-2509批號9F0844)係得自 Cambrex,Walkersville,Md。多能性人類睪丸胚胎性癌(畸胎瘤)細胞系nTera-2細胞(NTERA-2 cl.Dl)(參見Plaia等人，Stem Cells,2006；24(3)：531-546)係購自ATCC(Manassas,Va.)並且將其根據上文中所述之方法來培養。

總RNA分離.使用RNeasy®套組(Qiagen,Valencia,Ca.)將RNA自細胞萃取出來。用50微升經DEPC處理水將RNA洗脫出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Ca.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。將樣本儲存在-20℃下。

即時PCR.使用Applied Biosystems Assays-On-Demand^TM(亦已知為TaqMan® Gene Expression Assays)根據製造商規範(Applied Biosystems)在cDNA樣本上執行PCR。此商用套組廣泛用來檢定人類細胞中的端粒酶。簡言之，使用7000序列偵測系統(搭載ABI prism 7000 SDS軟體(Applied Biosystems))，將hTert(人類端粒酶基因)(Hs00162669)及人類GAPDH(內部對照組)與cDNA及TaqMan® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件初始為50℃歷時2分鐘然後95℃歷時10分鐘，接著進行40次95℃歷時15秒鐘然後60℃歷時1分鐘的循環。依據製造商規範來分析PCR數據。

人類臍帶組織衍生細胞(ATCC存取號PTA-6067)、纖維母細胞及間葉幹細胞係針對hTert及18S RNA來檢定。如表8-1中所示，hTert及因此端粒酶皆未在人類臍帶組織衍生細胞中偵測到。

人類臍帶組織衍生細胞(分離株022803，ATCC存取號PTA-6067)與nTera-2細胞經檢定，而結果顯示在兩批人類臍帶組織衍生細胞中皆沒有端粒酶表現，然而畸胎瘤細胞系則顯露出高表現水準(表8-2)。

因此，可做出本發明之人類臍組織衍生細胞不表現端粒酶之結論。

本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。

儘管上文已藉由實例與較佳實施例說明本發明之各種態樣，但是應理解，本發明之範疇並不由前文描述限定，而是以下根據專利法原理正確解讀的申請專利範圍來限定。

在描述本發明及其各種實施例中，為了清楚起見，採用特定用語。不過，本發明不意欲被限制於所選擇的特定用語。在相關技術領域中具有通常知識者將理解可在不脫離目前發明的廣泛概念下，採用其他均等組件且開發其他方法。在本說明書中任一處所引述之所有參考係以引用方式併入，如同各參考被個別併入。

<110> 哈瑞斯‧伊恩羅斯(HARRIS,IAN ROSS)

<110> 曹靜(CAO,JING)

<120> 抑制血管生成之方法

<130> JBI5127WOPCT

<140>

<141>

<150> 62/581,399

<151> 2017-11-03

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

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Claims (10)

1. 一種人類臍帶組織衍生細胞於製造用於抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生之藥物的用途，其包含向個體之眼睛投予人類臍帶組織衍生細胞之均質性族群，其中該細胞群(cell population)係分離自實質上不含血液的人類臍帶組織，且在培養物中能夠擴增，並表現CD13、CD90、及HLA-ABC，且不表現CD31、CD34、CD45、及CD117。
2. 如請求項1所述之用途，其中該細胞群進一步具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)表現CD10、CD44、及CD73；c)不表現CD141；及d)缺少hTERT或端粒酶的表現。
3. 如請求項1所述之用途，其中該細胞群相對於纖維母細胞、間葉幹細胞、或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，具有編碼介白素8及內質網蛋白(reticulon)1之基因表現增加。
4. 一種生產包含人類VEGFR1之條件培養基的方法，其中該條件培養基係自人類臍帶組織衍生細胞之均質性族群製備，其中該細胞群係分離自實質上不含血液的人類臍帶組織。
5. 如請求項4所述之方法，其中該細胞群進一步具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)表現CD10、CD44、及CD73；c)不表現CD141；及d)缺少hTERT或端粒酶的表現。
6. 如請求項4所述之方法，其中該細胞群相對於纖維母細胞、間葉幹細胞、或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，具有編碼介白素8及內質網蛋白1之基因表現增加。
7. 一種如請求項4中所生產之條件培養基於製造用於抑制或減少視網膜病變中之視網膜血管新生之藥物的用途，其包含向患有該視網膜病變的個體之眼睛投予該條件培養基。
8. 一種用於減少血管新生的組成物，該組成物包含VEGFR1及人類臍帶組織衍生細胞之均質性族群，其中該細胞群係分離自實質上不含血液的人類臍帶組織，且在培養物中能夠擴增，並表現CD13、CD90、及HLA-ABC，且不表現CD31、CD34、CD45、及CD117。
9. 如請求項8所述之組成物，其中該細胞群進一步具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)表現CD10、CD44、及CD73；c)不表現CD141；及d)缺少hTERT或端粒酶的表現。
10. 如請求項8所述之組成物，其中該細胞群相對於纖維母細胞、間葉幹細胞、或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，具有編碼介白素8及內質網蛋白1之基因表現增加。