CN110946988B

CN110946988B - 短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途

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Publication number: CN110946988B
Application number: CN201811123245.8A
Authority: CN
Inventors: 王育民; 杜军毅
Original assignee: Zhenwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhenwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN110946988A

Abstract

本发明提供一种短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的组合物的用途，其包含未糖基化的短肽作为有效成分，可显著抑制或减缓虾过敏反应的相关症状。

Description

短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途

技术领域

本发明是有关于一种抑制或减缓过敏反应的组合物，特别是有关于一种含短肽的组合物及短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应之药物组合物的用途。

背景技术

食物过敏是一种对食物所含外来、无害的抗原的急性过度免疫反应所引起的超敏状态。一般而言，容易引起过敏的食物有甲壳类海鲜(shellfish；例如虾类)、含人工食品添加物的食品、豆荚类食品、核果类食品、含咖啡因的食品、部分水果(例如芒果、草莓、蕃茄、柳橙类)、含酒精的饮料或食物、其它食物(例如蛋、牛奶、香菇、竹笋、残留农药的青菜)等。

虾类广泛应用在各种食材、菜肴及加工食品中。以虾过敏反应为例，除了与虾类本身有关，也与个人的遗传、年龄、气喘有关。要避免虾过敏反应，除了事前避免摄食虾类或含虾类成分的食物外，发生虾过敏反应后，可视症状轻重及过敏发作部位，投以适当的药物(例如抗组织胺类药物、类固醇类药物、色甘酸钠等)，抑制体内虾过敏反应。

然而，上述药物各有程度不等的副作用。举例而言，抗组织胺类药物常见的副作用为嗜睡、疲倦、注意力不集中等，类固醇类药物常见的副作用为月亮脸、水牛背等，而色甘酸钠常见的副作用为使用初期会有刺痛感。

有鉴于此，实有必要开发新的药物成份，以有效抑制或减缓食物过敏反应且降低副作用。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种含短肽的组合物，其包含未糖基化的短肽作为有效成分，以抑制或减缓受试对象的虾过敏反应。

本发明的另一目的是提供一种短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其包含未糖基化的短肽。

根据本发明的上述目的，提出一种含短肽的组合物，其包含短肽作为有效成分。在此实施例中，短肽可例如为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的未糖基化的短肽，以抑制或减缓受试对象的虾过敏反应。

在本发明的一实施例中，上述组合物可例如为食品组合物或药物组合物。

在本发明的一实施例中，上述受试对象可例如为动物细胞或哺乳类动物。

根据本发明之另一目的，提出一种短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途。在此实施例中，短肽为由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的未糖基化的短肽。

在本发明的一实施例中，上述虾过敏反应包括组织胺、β-己醣胺酶、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13、COX-2及/或IgE抗体的表达量提升。

在本发明的一实施例中，上述药物组合物是给予受试对象，且受试对象为动物细胞或哺乳类动物。

在本发明的一实施例中，上述短肽于药物组合物的有效剂量可例如为5.7μg/g体重至9.6μg/g体重。

应用本发明之含短肽之组合物，其包含未糖基化的短肽作为有效成分，可显著抑制或减缓虾过敏反应的相关症状，进而用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：

〔图1A〕显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予大鼠嗜碱性白血病(rat basophilic leukemia；RBL)细胞株RBL-2H3(以下简称RBL-2H3肥大细胞)后，其细胞存活率的柱形图。

〔图1B〕显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其组织胺释放率的柱形图。

〔图1C〕显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其β-己醣胺酶活性的柱形图。

〔图1D〕至〔图1H〕分别显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其TNF-αmRNA(图1D)、IL-4 mRNA(图1E)、IL-6 mRNA(图1F)、IL-13mRNA(图1G)、COX-2 mRNA(图1H)的相对含量变化的柱形图。

〔图1I〕显示根据本发明一实施例的RBL-2H3肥大细胞经IgE/DNP诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，由FcεRI主导的信号传递路径的相关基因表达的西方墨点分析图。

〔图2〕显示根据本发明一实施例的RBL-2H3肥大细胞经过敏血清诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，由FcεRI主导的信号传递路径的相关基因表达的西方墨点分析图。

〔图3〕显示根据本发明一实施例的小鼠经虾萃取物诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，其IgE抗体的相对含量变化的分散图。

具体实施方式

本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％～11％的A)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦A≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的B，或0.2％以下的B)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦B≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。

本发明提供一种含短肽的药物组合物，其包含未糖基化短肽作为有效成分，以抑制或减缓受试对象的虾过敏反应。

本发明此处所称的「虾过敏反应」是与食物过敏直接相关。目前已知的虾子过敏原仅有原肌球蛋白(tropomyosin)。在进食虾类等甲壳类海鲜(shellfish)后，食物中的过敏原(例如虾类过敏原为原肌球蛋白，tropomyosin)会刺激免疫系统，在身体各部位引起各种急性过敏症状，例如消化系统(如腹痛、恶心、呕吐或腹泻等)、皮肤(如皮肤红痒、荨麻疹、湿疹等)、呼吸系统(如流鼻水、打喷嚏、胸闷、呼吸急促或困难、气喘、咳嗽、双眼红痒肿痛、口咽部肿胀及刺痛感等)、头痛、晕眩、低血压、甚至过敏性休克(anaphylactic shock)等症状。

目前研究结果指出，前述「虾过敏反应」与肥大细胞(mast cell)具有高度相关性。在进食虾类等甲壳类海鲜后，食物中的过敏原与抗体IgE相互作用并结合到带有FcεRI的细胞(例如肥大细胞)表面，使肥大细胞(mast cell)进行去颗粒化(degranulation)，释放促炎性细胞因子(TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13)、组织胺、β-己醣胺酶等物质，经由FcεRI(IgE抗体的受体)主导的信号传递路径，活化FcεRI下游的AKT、ERK、JNK、p38等(例如mRNA的表达量及/或蛋白被磷酸化的量)，启动促炎性细胞因子的新(de novo)合成，增加抗体IgE的表达，进而加重过敏反应的症状。

本发明此处所称的「抑制或减缓虾过敏反应」是指一受试对象给予上述含短肽的药物组合物后，可通过直接或间接地抑制或减缓因虾过敏反应引起的下述任一情况：各种急性过敏症状(消化系统、皮肤、呼吸系统等)；促炎性细胞因子(TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13)、组织胺、β-己醣胺酶等物质于生体内的含量；FcεRI下游的AKT、ERK、JNK、p38等表达量(例如mRNA的表达量及/或蛋白被磷酸化的量)；促炎性细胞因子的新(de novo)合成；以及抗体IgE的表达量。另外，促炎性细胞因子或细胞激素(cytokines)刺激时，也会诱导生成环氧化酶-2(cyclooxygenase-2；COX-2)。由于本发明上述药物组合物含有特定序列的短肽，通过消耗性抑制或竞争性抑制的方式，可有效抑制或减缓上述虾过敏反应。

本发明此处所称的「短肽」指氨基酸残基总数不超过40个的短链多肽，然其氨基酸残基总数以不超过37个为较佳。在一实施例中，此短肽为由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的未糖基化的短肽，其中如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列是参考Genbank编号NP_002843.2的序列，在此一并列为本案的参考文献。在此说明的是，倘若短肽的氨基酸残基总数超过37个，则由此所得的短肽因分子量较大而难以提高有效剂量。其次，倘若短肽未完整包含如SEQ ID NO:1所示的特定序列，则由此所得的短肽所含的有效氨基酸区域不足，而有碍于后续应用至抑制或减缓虾过敏反应的效果。

在一实施例中，上述未糖基化的短肽可以利用任何习知方式，例如人工合成胜肽、或利用重组基因于表达系统中表达而得的重组蛋白。有关人工合成胜肽或重组蛋白之制造方法，应为本发明所属技术领域中任何具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

在此说明的是，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的短肽必需是未经糖化的。倘若短肽预先被糖化，其本身就相当于具有生物活性，无法通过消耗性抑制或竞争性抑制的方式抑制或减缓虾过敏反应。

在应用时，上述短肽可用于制备抑制或减缓虾过敏反应的组合物，例如食品组合物或药物组合物。在一实施例中，适合的药物组合物的剂型不拘，且短肽于药物组合物的有效剂量可视剂型及使用部位不同而弹性调整剂量。以口服医药组合物为例，短肽于药物组合物的有效剂量可例如为5.7μg/g体重至9.6μg/g体重，然以6.4μg/g体重至8.1μg/g体重为较佳。在其他剂型的药物组合物中，例如口鼻喷剂，短肽于药物组合物的有效剂量可随剂型不同而调整。

在上述实施例中，上述药物组合物亦可选择性添加医药学上可接受的载体。此处所称的医药学上可接受的载体系指本身非属活性成分，而是用以将作为活性成分的短肽传递至个体的载体、稀释剂、填充剂及/或媒剂，或添加至上述组合物中以改善组合物的处理或储存性质，或允许或有助于组合物的剂量单位形成适于药物组合物并方便给药的赋形剂或任何成分。前述医药学上可接受的载体不应破坏活性成分的药理学活性，且在传递足够治疗剂量的活性成分时应无毒性。

前述适用的医药学上可接受的载体可为一般熟悉制造药物组合物的通常知识者所熟知，且包括但不限于缓冲剂、稀释剂、崩解剂、黏合剂、黏着剂、湿润剂、聚合物、润滑剂、滑动剂、为遮蔽或抵消不良味道或气味而添加的成分、染料、芳香剂及为改善组合物的外观而添加的成分。前述医药学上可接受的载剂的具体例子可包括但不限于柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸及硫酸的钠盐及钙盐、碳酸镁、滑石、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、果胶、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、淀粉、明胶、纤维素成分(诸如烷酸的纤维素酯及纤维素烷基酯)、氯化钠或其他盐、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或粉末、聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其他医药学上可接受的成分。

在一实施例中，给予上述含短肽的组合物的途径并无特别限制，可经口服途径或非口服途径(例如皮下注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、呼吸道吸入等)。

上述含短肽的组合物经动物细胞或哺乳类动物实验证实，具有抑制或减缓受试对象的虾过敏反应的功效。在一例示中，前述抑制或减缓受试对象的虾过敏反应的功效可包含但不限于抑制或减缓促炎性细胞因子(TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13)、组织胺、β-己醣胺酶、抗体IgE等过量表达。在其他例示中，前述抑制或减缓受试对象的虾过敏反应的功效可包含但不限于抑制或减缓FcεRI下游的AKT、ERK、JNK、p38等(例如mRNA的表达量及/或蛋白被磷酸化的量)，由此抑制或减缓虾过敏反应。

以下利用数个实施例以说明本发明之应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰。

实施例一、制备短肽

在此实施例中，使用人工合成的短肽RI37(具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)作为短肽，并以多肽pPTX3(具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)作为对照组。

上述短肽RI37可委托例如科罗耐国际科技有限公司进行合成。上述pPTX3则为本案发明人自行利用习知的原核表达系统(大肠杆菌)表达并纯化的重组蛋白。有关人工合成胜肽或重组蛋白的制造方法，应为本发明所属技术领域中任何具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

实施例二：建立细胞试验模型

1.细胞培养

本实施例选用大鼠嗜碱性白血病(rat basophilic leukemia；RBL)细胞株RBL-2H3(ATCC编号：CRL-2256；以下简称RBL-2H3肥大细胞)，评估实施例一的短肽对于肥大细胞去颗粒化的抑制或减缓效果。

上述RBL-2H3肥大细胞可使用其专用的细胞培养与传代方式进行培养。举例而言，RBL-2H3肥大细胞于含10％胎牛血清蛋白(Fetal Bovine Serum；FBS，已经由热不活化处理)以及抗生素(50μg/mL至100μg/mL的链霉素及50U/mL至100U/mL的青霉素)的杜贝可氏改良的伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM；Gibco Co.)细胞培养液进行培养，在37℃保持湿度的5％二氧化碳浓度下培养，此为本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，故不另赘述。

2.MTT试验

MTT为四唑盐(tetrazolium salt)，经活细胞内粒腺体去氢酶(dehydrogenase)分解后，由透明无色产生蓝色甲臜(formazan)晶体，以未添加实施例一的短肽的细胞存活率作为100％，由此判断实施例一的短肽对实施例二的RBL-2H3细胞存活率的影响。

首先，将实施例二的RBL-2H3肥大细胞培养至96孔细胞培养盘(细胞密度为2×10⁴cells/孔)，与实施例一的短肽RI37(300μg/mL)共同培养于37℃达24小时、48小时或72小时后，加入5mg/mL的MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenol tetrazoliumbomide](Sigma)于37℃再反应3小时。之后，利用DMSO溶出沉淀的MTT蓝色甲臜晶体，利用市售的微量盘读取仪(microplate reader；例如iMark^TM Microplate Absorbance Reader,Bio-Rad)测量细胞于570nm的吸光度，以评估细胞存活率。

请参阅图1A，其显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其细胞存活率的柱形图，其中纵轴代表细胞于570nm的吸光度，横轴下方的图号「+」代表细胞培养时添加短肽，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽，图号「ns」代表在统计上无显著差异性(no significance；ns)。

由图1A的结果可知，本发明实施例一的短肽RI37与RBL-2H3肥大细胞共同培养24小时、48小时或72小时后，对于细胞存活率并无显著性的影响，代表不具细胞毒性。

另外，本发明实施例一的短肽RI37与RBL-2H3肥大细胞共同培养后，对于细胞数量以及FcεRI(IgE抗体的受体)mRNA亦无显著性的影响(图未绘示)，代表不具促进RBL-2H3肥大细胞及FcεRI的数量增加的功效。

3.评估细胞的去颗粒化

评估细胞的去颗粒化时，首先将实施例二的RBL-2H3肥大细胞培养至24孔细胞培养盘(细胞密度为2×10⁵cells/孔)，与0.2μg/mL的抗DNP(2,4-dinitrophenylhydrazine)-IgE抗体进行隔夜培养，进行细胞致敏(cell sensitization)反应。然后，利用1倍的PBS(1XPBS)清洗细胞。接着，利用短肽(300ng/mL)在37℃预处理细胞30分钟。然后，利用多肽pPTX3(300ng/mL，简称为PTX3)或1μg/mL的DNP-BSA(溶于PIPES缓冲溶液，含140mM NaCl,5mMKCl,0.6mM MgCl₂,1mM CaCl₂,5.5mM glucose,0.1％BSA以及10mM PIPES，pH 7.4，作为对照组)作为抗原(Ag)，刺激细胞30分钟。

之后，收集细胞上清液，分别测量所含的组织胺的含量及β-己醣胺酶(β-hexosaminidase)的活性，以作为评估细胞去颗粒化(degranulation)的指标。

3.1.评估细胞的组织胺的释放率

组织胺的释放率依照以下习知方法计算。首先，将100μL的细胞上清液与20μL的1MNaOH混合后，随即加入25μL的反应溶液﹝含1％(w/v)邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde)溶于甲醇中﹞，于室温(一般为10℃至40℃)下反应4分钟。然后，于上述反应物中加入10μL的3MHCl，使反应终止。之后，利用355nm的激发波长及460nm的发射波长检测荧光强度，其结果如图1B所示。

请参阅图1B，其显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其组织胺释放率的柱形图，其中横轴下方的图号「+」代表细胞培养时添加短肽或多肽PTX3，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽或多肽PTX3，图号「＊＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.001)，并以细胞裂解缓冲液(lysis buffer)打破细胞、使组织胺完全释出的量作为100％的基准。

由图1B的结果可知，IgE可活化RBL-2H3肥大细胞，引起去颗粒化并释放出组织胺。利用抗原(PTX3)刺激IgE致敏的肥大细胞，可加剧去颗粒化的反应，并释放出更多的组织胺。然而，IgE致敏的RBL-2H3肥大细胞在利用抗原(即PTX3)刺激及去颗粒化前，先经本发明实施例一的短肽RI37预处理，可显著抑制或减缓IgE/Ag活化RBL-2H3肥大细胞的去颗粒化，减少组织胺的释放率，且此差异具有统计上的显著差异性。

3.2.评估细胞的β-己醣胺酶的活性

评估β-己醣胺酶的活性时，原则上同上述第3点的方法进行，不同之处在于取25μL上述收集的细胞上清液，与等体积的5mM基质溶液〔substrate solution，含5mM的对硝基苯基-β-D-葡萄胺糖苷(p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide，p-NAG)，溶于0.2M柠檬酸钠缓冲溶液，pH 4.5〕混合后，随即加入25μL的反应溶液﹝含1％(w/v)邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde)溶于甲醇中﹞，于37℃下反应1.5小时。然后，于上述反应物中加入200μL的终止溶液(含0.1M的Na₂CO₃/NaHCO₃，pH 10.0)，使反应终止。之后，检测细胞于405nm的吸光度，判断β-己醣胺酶的活性，其结果如图1C所示。

请参阅图1C，其显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其β-己醣胺酶活性的柱形图，其中纵轴代表细胞于405nm的吸光度，横轴下方的图号「+」代表细胞培养时添加短肽或多肽PTX3，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽或多肽PTX3，图号「＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.01)的数据，图号「＊＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.001)。

由图1C的结果可知，IgE可活化RBL-2H3肥大细胞，引起去颗粒化并释放出β-己醣胺酶。利用抗原(PTX3)刺激IgE致敏的肥大细胞，可加剧去颗粒化的反应，并释放出更多的β-己醣胺酶。然而，IgE致敏的RBL-2H3肥大细胞在利用抗原(即PTX3)刺激及去颗粒化前，先经本发明实施例一的短肽RI37处理，则可显著抑制或减缓IgE/Ag活化RBL-2H3肥大细胞的去颗粒化，减少β-己醣胺酶的活性，且此差异具有统计上的显著差异性。

4.评估细胞内促炎性细胞因子的基因表达

利用市售提取试剂盒(例如TRIsure RNA extraction reagent，Invitrogen)提取上述第3点利用抗原(PTX3)刺激IgE致敏的肥大细胞的总RNA。接着，利用市售反转录酶(例如SuperScript III，Invitrogen)对总RNA进行反转录反应，以合成cDNA。然后，利用市售荧光实时定量qPCR反应试剂盒(例如KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix，Life TechnologiesCorporation and Kapa Biosystems Inc.)以及SEQ ID NOs:3～14所列之引物，在市售实时PCR系统(例如CFX connect Real-Time PCR System，BIO-RAD)中进行每个目标基因的定量PCR(qPCR)，其结果如图1D至图1H。

请参阅图1D至图1H，其分别显示根据本发明一实施例的含短肽的药物组合物经给予RBL-2H3肥大细胞后，其TNF-αmRNA(图1D)、IL-4 mRNA(图1E)、IL-6 mRNA(图1F)、IL-13mRNA(图1G)、COX-2 mRNA(图1H)的相对含量变化的柱形图，其中以β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA含量作为内部控制组(图未绘示)。图1D至图1H的横轴下方的图号「+」代表细胞培养时添加短肽或多肽PTX3，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽或多肽PTX3，图号「＊」代表具有统计显著性(p＜0.05)之数据，图号「＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.01)之数据，图号「＊＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.001)，并以各组别的β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA含量作为内部控制组。

由图1D至图1H的结果可知，利用抗原(PTX3)刺激IgE致敏的肥大细胞，可显著增加TNF-α、IL-4、IL-6 mRNA、IL-13以及COX-2的mRNA表达量。然而，IgE致敏的RBL-2H3肥大细胞先经本发明实施例一的短肽RI37预处理后，再利用抗原(即PTX3)刺激IgE致敏的肥大细胞，可显著抑制或减缓TNF-α、IL-4、IL-6 mRNA、IL-13以及COX-2的mRNA表达量，且此差异具有统计上的显著差异性。

5.评估细胞内信号传递路径的基因表达(I)

评估细胞内信号传递路径的基因表达时，原则上同上述第3点的方法进行，不同之处在于利用不同浓度的短肽(150ng/mL或300ng/mL)在37℃预处理细胞30分钟后，再利用多肽PTX3、DNP-IgE/DNP刺激细胞。之后，收集所有细胞溶解产物，进行西方墨点分析法(Western bloting analysis)。

西方墨点分析法可使用习知方式进行。首先，利用修改配方的放射免疫沉淀测定(modified radioimmunoprecipitation assay；modified RIPA)缓冲溶液抽取上述细胞的蛋白质。前述修改配方的RIPA缓冲溶液含50mM Tris-HCl[pH 7.4]、150mM氯化钠、1mM的四醋酸乙二胺(ethylenediamine tetra-acetic acid；EDTA)、1％的乙基苯基聚乙二醇(octylphenoxypolyethoxyethanol，Nonidet P 40，NP40)、0.25％的脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)、1mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、1mM的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、1μg/ml的抑肽酶(aprotinin)以及1μg/mL的亮抑肽素(leupeptin)。

上述所得的细胞溶解产物于SDS-PAGE进行电泳后，将细胞蛋白质由SDS-PAGE胶体转渍至PVDF(polyvinylidene difluoride membrane)膜

利用一级抗体于4℃作用至隔夜，其中一级抗体包括抗p84抗体(型号：GTX70220，GeneTex)、抗磷酸化AKT(p-AKT)抗体(型号：GTX121937，GeneTex)、抗AKT抗体(型号：GTX128414，GeneTex)、抗p-ERK抗体(型号：4377，Cell Signaling)、抗ERK抗体(型号：9102，Cell Signaling)、抗p-p38抗体(型号：9211，Cell Signaling)、抗p38抗体(型号：9212，Cell Signaling)、抗p-JNK抗体(型号：4668，Cell Signaling)以及抗JNK抗体(型号：9252,Cell Signaling)。然后，利用结合过氧化酶(peroxidase)的二级抗体于室温感作1.5小时。之后，利用市售呈色套组(例如ECL kit，PerkinElmer)检测蛋白质的表达量，并以p84的蛋白表达量作为内部控制组。

关于提取蛋白质及西方墨点分析法诚属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述细节。

请参阅图1I，其分别显示根据本发明一实施例的RBL-2H3肥大细胞经IgE/DNP诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，由FcεRI主导的信号传递路径的相关基因表达的西方墨点分析图。在图1I中，图号「+」代表细胞培养时添加短肽或PTX3，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽或PTX3，三角形则代表特定的短肽的添加量递增。

由图1I的结果可知，利用抗原(PTX3)刺激IgE/DNP致敏的肥大细胞，可显著增加AKT、ERK1/ERK2、p38以及JNK1/JNK2等蛋白被磷酸化为p-AKT、p-ERK1/ERK2以及p-p38与p-JNK1/JNK2的量，使过敏反应加重(aggravation)。然而，IgE/DNP致敏的RBL-2H3肥大细胞先经本发明实施例一的短肽RI37预处理后，再利用抗原(即PTX3)刺激IgE/DNP致敏的肥大细胞，则可显著抑制或减缓AKT、ERK1/ERK2以及p38与JNK1/JNK2等蛋白被磷酸化为p-AKT、p-ERK1/ERK2以及p-p38与p-JNK1/JNK2的量。

6.评估细胞内信号传递路径的基因表达(II)

评估细胞内信号传递路径的基因表达时，原则上同上述第3点的方法进行，不同之处在于利用不同浓度的短肽(150ng/mL或300ng/mL)在37℃预处理细胞30分钟后，再利用经虾萃取物致敏的小鼠血清(血清添加量为10μL/mL)作为抗原刺激细胞。之后，收集所有细胞溶解产物，进行与第5点相同的西方墨点分析法，并以p84的蛋白表达量作为内部控制组。

上述虾萃取物的制备方法是利用下述方法制得。首先，将虾去头去壳，取肉质部分加入固定比例的再蒸馏水(double distilled water，ddH₂O；亦称二次水)(虾肉：二次水＝1:2)研磨成肉泥。前述肉泥经8000rpm转速低温离心30分钟后，收集上清液，经冷冻干燥后获得虾萃取物。所得的虾萃取物经由腹腔(intraperitoneal；i.p.)注射虾萃取物，对小鼠予以致敏(sensitization)及激发(challenge)，以引起小鼠的虾过敏反应。关于小鼠的致敏及激发请参阅第7点说明。之后，取得上述虾过敏小鼠的过敏血清作为抗原，刺激RBL-2H3肥大细胞。

请参阅图2，其显示根据本发明一实施例的RBL-2H3肥大细胞经过敏血清诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，由FcεRI主导的信号传递路径的相关基因表达的西方墨点分析图。在图2中，图号「+」代表细胞培养时添加短肽或PTX3，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽或PTX3，三角形则代表特定的短肽的添加量递增。

由图2的结果可知，利用过敏血清刺激IgE致敏的肥大细胞，可显著增加p-AKT、p-ERK1/ERK2、p-p38、以及p-JNK1/JNK2的蛋白表达量。然而，IgE致敏的RBL-2H3肥大细胞先经本发明实施例一的短肽RI37预处理后，再利用过敏血清刺激IgE致敏的肥大细胞，可显著抑制或减缓p-AKT、p-ERK1/ERK2、p-p38以及p-JNK1/JNK2的蛋白表达量。

7.评估活体内IgE的含量

此实施例以3至4周龄雌性Balb/c小鼠(每组6只)经由腹腔(i.p.)注射抗原(PBS或虾萃取物)引起虾过敏反应，评估短肽RI37抑制或减缓虾过敏反应的效果。上述3至4周龄雌性Balb/c小鼠的体重为平均为10.4g/只至17.4g/只。

控制组(第1组及第2组)在第1、4、7、10、13、16、19及22天对小鼠经腹腔注射PBS与含铝佐剂[氢氧化铝；Al(OH)₃](溶于PBS中)，并在第30天对小鼠经腹腔注射PBS。虾过敏组(第3组及第4组)在第1、4、7、10、13、16、19及22天对小鼠经腹腔注射1倍剂量的虾萃取物与含铝佐剂[氢氧化铝；Al(OH)₃](溶于PBS中)予以致敏(sensitization)，并在第30天对小鼠经腹腔注射5倍剂量的虾萃取物予以激发(challenge)，以引起虾过敏反应。前述1倍剂量的虾萃取物为0.5mg/g体重。

短肽RI37处理组(第2组及第4组)在第19、22及30天时，对小鼠经腹腔注射短肽RI37(溶于PBS中，第2组)，或短肽RI37与虾萃取物(溶于PBS中，第4组)。

在第30天刺激后2小时，由小鼠眼窦(orbital sinus)采集上述所有小鼠全血，以评估小鼠体内IgE的含量。

上述取得的全血静置(即未搅动)于室温30分钟，使全血凝固。接着，在低温离心机(refrigerated centrifuge)中以2000g的速度离心10分钟。然后，利用市售酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)试剂盒，根据制造商的使用手册，检测各孔在波长450nm处的吸亮度，由此获得IgE(1:20稀释)的含量。

请参阅图3，其显示根据本发明一实施例的小鼠经虾萃取物诱导过敏反应再给予含短肽的药物组合物后，其IgE抗体的相对含量变化的分散图。在图3中，纵轴代表波长450nm处的吸光度，横轴由左至右分别为第1组至第4组，第1组及第2组代表控制组，第3组及第4组代表虾过敏组，第2组及第4组另并以短肽处理，图号「+」代表细胞培养时添加短肽，图号「－」代表细胞培养时未添加短肽，图号「＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.01)之数据，图号「＊＊＊」代表具有统计显著性(p＜0.001)，图号「ns」代表在统计上无显著差异性(nosignificance；ns)。

由图3的第1组及第2组的结果可知，利用短肽RI37刺激小鼠与否，对于IgE抗体的含量变化在统计上并无显著差异。由图3的第1组及第3组的结果可知，利用虾萃取物刺激小鼠，可显著增加IgE抗体的含量。然而，由图3的第4组的结果可知，虾过敏小鼠在第19、22及30天经本发明实施例一的短肽RI37处理后，可显著抑制或减缓IgE抗体的含量，且此差异具有统计上的显著差异性，达到抑制或减缓虾过敏反应的目的。

补充说明的是，本发明以短肽RI37作为有效成分，经由体外及体内试验证实，确实可抑制或减缓虾过敏反应，有潜力应用于制备抑制或减缓虾过敏反应的食品组合物或药物组合物的用途。在应用时，可以在虾过敏反应引起的肥大细胞去颗粒化前，或服用虾类本身或含有虾类成分的食品后的30分钟内，先给予本发明的上述食品组合物或药物组合物，以预防、抑制或减缓虾过敏反应。

综言之，本发明虽以特定序列的短肽、特定的剂型、特定的对象、特定的给予方式、或特定的评估方式作为例示，说明本发明的含短肽的组合物及其用于抑制或减缓虾过敏反应的用途，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明亦可使用其他的剂型、其他的对象、其他的投予方式或其他的评估方式进行。

由上述实施例可知，本发明的含短肽的组合物的优点，在于其包含未糖基化的短肽作为有效成分，可显著抑制或减缓虾过敏反应的相关症状，进而用于制备抑制或减缓虾过敏反应的医药组合物的用途。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求范围所界定者为准。

【序列表】

<110> 王育民

<120> 含短肽的组合物及短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途

<130> 无

<160> 14

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Human sapiens PTX3 第200至236个氨基酸 (RI37) 的重组蛋白

<400> 1

Arg Pro Met Arg Leu Glu Ser Phe Ser Ala Cys Ile Trp Val Lys Ala

1 5 10 15

Thr Asp Val Leu Asn Lys Thr Ile Leu Phe Ser Tyr Gly Thr Lys Arg

20 25 30

Asn Pro Tyr Glu Ile

35

<210> 2

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Human sapiens PTX3 第1至381个氨基酸的重组蛋白

<400> 2

Met His Leu Leu Ala Ile Leu Phe Cys Ala Leu Trp Ser Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asp Leu Met Tyr Val Asn Leu Asp Asn

20 25 30

Glu Ile Asp Asn Gly Leu His Pro Thr Glu Asp Pro Thr Pro Cys Ala

35 40 45

Cys Gly Gln Glu His Ser Glu Trp Asp Lys Leu Phe Ile Met Leu Glu

50 55 60

Asn Ser Gln Met Arg Glu Arg Met Leu Leu Gln Ala Thr Asp Asp Val

65 70 75 80

Leu Arg Gly Glu Leu Gln Arg Leu Arg Glu Glu Leu Gly Arg Leu Ala

85 90 95

Glu Ser Leu Ala Arg Pro Cys Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu Ala Arg

100 105 110

Leu Thr Ser Ala Leu Asp Glu Leu Leu Gln Ala Thr Arg Asp Ala Gly

115 120 125

Arg Arg Leu Ala Arg Met Glu Gly Ala Glu Ala Gln Arg Pro Glu Glu

130 135 140

Ala Gly Arg Ala Leu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Arg Gln Thr Arg

145 150 155 160

Ala Asp Leu His Ala Val Gln Gly Trp Ala Ala Arg Ser Trp Leu Pro

165 170 175

Ala Gly Cys Glu Thr Ala Ile Leu Phe Pro Met Arg Ser Lys Lys Ile

180 185 190

Phe Gly Ser Val His Pro Val Arg Pro Met Arg Leu Glu Ser Phe Ser

195 200 205

Ala Cys Ile Trp Val Lys Ala Thr Asp Val Leu Asn Lys Thr Ile Leu

210 215 220

Phe Ser Tyr Gly Thr Lys Arg Asn Pro Tyr Glu Ile Gln Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Tyr Gln Ser Ile Val Phe Val Val Gly Gly Glu Glu Asn Lys Leu

245 250 255

Val Ala Glu Ala Met Val Ser Leu Gly Arg Trp Thr His Leu Cys Gly

260 265 270

Thr Trp Asn Ser Glu Glu Gly Leu Thr Ser Leu Trp Val Asn Gly Glu

275 280 285

Leu Ala Ala Thr Thr Val Glu Met Ala Thr Gly His Ile Val Pro Glu

290 295 300

Gly Gly Ile Leu Gln Ile Gly Gln Glu Lys Asn Gly Cys Cys Val Gly

305 310 315 320

Gly Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Phe Ser Gly Arg Leu Thr Gly Phe

325 330 335

Asn Ile Trp Asp Ser Val Leu Ser Asn Glu Glu Ile Arg Glu Thr Gly

340 345 350

Gly Ala Glu Ser Cys His Ile Arg Gly Asn Ile Val Gly Trp Gly Val

355 360 365

Thr Glu IIe Gln Pro His Gly Gly Ala Gln Tyr Val Ser

370 375 380

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因上游引物

<400> 3

gcattgctga caggatgcag 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因下游引物

<400> 4

gtaacagtcc gcctagaagc a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-α基因上游引物

<400> 5

gcctcttctc attcctgctt g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-α基因下游引物

<400> 6

ctgatgagag ggaggccatt 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-4基因上游引物

<400> 7

agatggatgt gccaaacgtc ctca 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-4基因下游引物

<400> 8

aatatgcgaa gcaccttgga agcc 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6基因上游引物

<400> 9

acggccttcc ctacttcaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6基因下游引物

<400> 10

catttccacg atttcccaga 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-13基因上游引物

<400> 11

tgaggagctg agcaacatca caca 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-13基因下游引物

<400> 12

tgcggttaca gaggccatgc aata 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2基因上游引物

<400> 13

caagggagtc tggaacattg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> COX-2基因下游引物

<400> 14

acccaggtcc tcgcttatga 20

Claims

1.一种短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该短肽为由如S EQ ID NO:1所示的氨基酸序列所组成的一未糖基化的短肽。

2.根据权利要求1所述的短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该药物组合物的剂型为口服组合物。

3.根据权利要求1所述的短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该虾过敏反应包括组织胺、β-己醣胺酶、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13、C OX-2和/或IgE抗体的表达量提升。

4.根据权利要求1所述的短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该药物组合物给予一受试对象，且该受试对象为一动物细胞或一哺乳类动物。

5.根据权利要求4所述的短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该短肽在该药物组合物的有效剂量为5.7μg/g体重至9.6μg/g体重。

6.根据权利要求4所述的短肽用于制备抑制或减缓虾过敏反应的药物组合物的用途，其特征在于其中该短肽在该药物组合物的有效剂量为6.4μg/g体重至8.1μg/g体重。