CN105353113B - 洛拉曲塞或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用 - Google Patents

洛拉曲塞或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以胸苷酸合成酶为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用。胸苷酸合成酶可用于筛选抗单纯疱疹病毒I型（Herpes simplex virus‑1，HSV‑1）、单纯疱疹病毒II型（Herpes simplex virus‑2，HSV‑2）、水痘‑带状疱疹病毒（Varicella zoster virus,VZV）、EB病毒（Epstein‑Barr virus，EBV）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、人类疱疹病毒VI型（HHV‑6）、人类疱疹病毒VII型（HHV‑7）和卡波氏疱疹病毒（Kaposi's sarcoma‑associated herpesvirus，KSHV）等疱疹病毒的药物。本发明涉及的细胞靶点胸苷酸合成酶可以作为新的抗疱疹病毒靶点进行药物开发，用于治疗或者预防疱疹病毒感染。

Description

洛拉曲塞或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒 感染药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及以胸苷酸合成酶为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用。
背景技术
疱疹病毒科(Herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链DNA的病毒科。该科的成员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种，主要包括：单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex virus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV),EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，人类疱疹病毒VI型(HHV-6)，人类疱疹病毒VII型(HHV-7)和卡波氏疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同,疱疹病毒科又可以分为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制,病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病的发生。
疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。然而，治疗或者预防疱疹病毒感染的药物仍有待进一步开发。
然而，目前没有以胸苷酸合成酶作为靶点在筛选抗疱疹病毒药物方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供以胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供胸苷酸合成酶抑制剂在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明的思路为：申请人发现通过抑制胸苷酸合成酶酶活性可以显著抑制感染性疱疹病 毒粒子的产生、抑制疱疹病毒DNA的复制，因此，以胸苷酸合成酶为靶点可用于筛选治疗或者预防疱疹病毒感染的药物。
以胸苷酸合成酶为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括通过筛选胸苷酸合成酶的抑制剂来制备抗疱疹病毒的药物。
所述的疱疹病毒包括但不限于：选自卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒VI型(HHV6)、或人类疱疹病毒VII型(HHV7)。
所述的胸苷酸合成酶抑制剂包括但不限于以下的一种或多种：培美曲塞、雷替曲塞、洛拉曲塞、BGC945、GS7904L、ZD9331或其药学上可接受的盐。
还可以将胸苷酸合成酶抑制剂或其药学上可接受的盐与其他药物联合用于制备治疗或预防疱疹病毒感染药物。
所述的其他药物包括但不限于以下的一种或多种：阿昔洛韦、更昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、磷甲酸、西多福韦、缬更昔洛韦、喷昔洛韦、溴呋啶、类固醇、硼替佐米(Bortezomib)、美罗华(Rituximab)、安挺乐(Tocilizumab)、Siltuximab、雷帕霉素(Rapamycin)、紫杉醇、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松。所述的其他药物是疱疹病毒聚合酶抑制剂，以胸苷酸合成酶为靶点的抑制剂或其药学上可接受的盐可显著抑制疱疹病毒粒子的产生和DNA的复制，其他药剂和以胸苷酸合成酶为靶点的抑制剂或其药学上可接受的盐以病毒复制的不同阶段为靶标，从而，所述药物组合物可更加有效地用于治疗或者预防疱疹病毒感染。
以胸苷酸合成酶为靶点的抑制剂或其药学上可接受的盐为活性成分的药物可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.胸苷酸合成酶的抑制剂培美曲塞二钠及雷替曲塞在体外实验表现出广谱的抗疱疹病毒活性，说明以胸苷酸合成酶为靶标的抑制剂具有良好的抗疱疹病毒的活性。
2.临床上尚未将该靶点作为治疗或预防疱疹病毒感染的靶点，以胸苷酸合成酶作为抗疱疹病毒感染的靶点筛选或制备的药物具备广谱性和新颖性等特点。
附图说明
图1培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期复制的检测结果；
其中A显示了培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果和抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结果；
B显示了在iSLK.219细胞中，培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。
图2培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的活性检测结果；
其中A显示了培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测结果；
B显示了培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的结果图。
图3培美曲塞二钠抗HSV-1及HSV-2的活性检测结果；
其中A显示了培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；
B显示了培美曲塞二钠抗HSV-1的活性的结果图；
C显示了培美曲塞二钠抗HSV-2的活性结果图。
图4培美曲塞二钠抗HCMV的活性检测结果；
其中A显示了培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测结果图；
B显示了培美曲塞二钠抗HCMV活性的检测结果图。
图5雷替曲塞抑制KSHV裂解期复制的活性检测结果。
图6雷替曲塞抗HSV-1及HSV-2的活性检测结果；
其中A显示了雷替曲塞对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；
B显示了雷替曲塞抗HSV-1的活性结果图；
C显示了雷替曲塞抗HSV-2的活性结果图。
图7雷替曲塞抗EBV活性检测结果；
其中A显示了雷替曲塞对B95-8细胞的细胞毒性检测结果图；
B显示了雷替曲塞抑制EBV裂解期DNA复制的结果图。
图8雷替曲塞抗HCMV活性检测结果；
其中A显示了雷替曲塞对HFF细胞的细胞毒性检测结果图；
B显示了雷替曲塞抗HCMV活性的结果图。
图9TS底物dTMP降低培美曲塞二钠及雷替曲塞抑制KSHV病毒粒子产生活性的检测结果。
图10TS底物dTMP回复培美曲塞二钠及雷替曲塞抗HSV-1活性的检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明实施例以已知为胸苷酸合成酶抑制剂的培美曲塞二钠和雷替曲塞为例进行说明，其他胸苷酸合成酶抑制剂，如洛拉曲塞、BGC945、GS7904L、ZD9331或其药学上可接受的盐均能产生相同的抗疱疹病毒的效果。
实施例1：
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知培美曲塞二钠为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞。在该细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；293T细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
培美曲塞二钠购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。
1.2试剂
DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；SYBR混合液(iTaqTM UniversalGreen Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器
定量RCP仪(Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.1培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测。
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：2000微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔/升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升、0.00512微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组*100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图1A所示。
由图1A可以得出，培美曲塞二钠对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)大于2000微摩尔/升。
2.2培美曲塞二钠抑制KSHV感染性病毒粒子的产生的检测。
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：2000微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔/升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，收取上清添加到293T细胞中，感染293T细胞1个小时后更换新鲜的培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抗KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图1A所示。
图1A结果显示培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；培美曲塞二钠对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)为90纳摩尔/升。
2.3培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的检测。
2.4.1在iSLK.219细胞中，检测培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA的复制的检测。
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以诱导KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠。药物(培美曲塞二钠)浓度分别为：200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。含药物(培美曲塞二钠)的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后去除上清，PBS洗细胞2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA，利用酒精沉淀DNA，然后将DNA晾干后溶解到TE中。
(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量RCR引物针对KSHV的LANA基因序列，引物如下：
5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'；
5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'。
选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对GADPH的定量RCR引物如下：
5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；
5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。
(5)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。结果如图1B所示。
图1B结果显示：在iSLK.219细胞中，培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DNA复制。
实施例2：
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知培美曲塞二钠为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
B95-8细胞由武汉大学基础医学院孙晓平教授惠赠，该细胞中含有EBV病毒基因组全序列。用20ng/mL TPA联合诱导可以使该病毒进入裂解期复制。
1.2试剂
1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；SYBR混合液(iTaqTM UniversalGreen Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪购自PerkinElmer公司；荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TouchTM Real-Time PCR detection system)购自伯乐公司；1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.1培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测。
(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。细胞在37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。
(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mL TPA的1640培养基梯度稀释培美曲塞二钠，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(培美曲塞二钠)的终浓度分别为：2000微摩尔/升、200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性,并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物为对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝ 药物组/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对B95-8细胞的细胞毒性检测结果图。结果如图2A所示。
由图2A结果显示：培美曲塞二钠对B95-8细胞的CC50大于2000微摩尔/升。
2.2培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的检测。
(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。细胞在37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。
(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mL TPA的1640培养基梯度稀释培美曲塞二钠，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(培美曲塞二钠)的终浓度分别为：2000微摩尔/升、200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升、0.002微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)药物处理48h后，离心收集细胞，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA。
(4)通过定量PCR方法(QPCR)检测EBV基因组复制水平。定量PCR的引物为特异性针对EBV的EBNA1基因的序列。引物如下：
5'-GCCGGTGTGTTCGTATATGG-3'；
5'-CAAAACCTCAGCAAATATATGAG-3'。
选择管家基因GADPH为校正的内参对照基因。针对GADPH的定量PCR引物，引物如下：
5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；
5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抑制EBV裂解期DNA复制的结果图。结果如图2B所示。
图2B结果显示：培美曲塞二钠能剂量依赖地抑制EBV裂解期复制，对EBV裂解期DNA复制的IC50为2微摩尔/升。
实施例3:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知培美曲塞二钠为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。HSV-2为G株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；结晶紫染色液。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermo公司产品。
2.实验方法与结果
2.1培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测。
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。
在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(培美曲塞二钠)处理。药物浓度分别为：2000微摩尔/升、400微摩尔/升、80微摩尔/升、16微摩尔/升、3.2微摩尔/升、0.64微摩尔/升、0.128微摩尔/升、0.0256微摩尔/升、0.00512微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图3A所示。
图3A结果显示：培美曲塞二钠对的Vero细胞的CC50大于2000微摩尔/升。
2.2培美曲塞二钠抑制HSV-1感染导致的细胞空斑的形成的检测。
(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加了梯度药物(培美曲塞二钠)的培养基，药物浓度分别为：20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升、0.002微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500微升的结晶紫染液，摇晃20分钟，用大量水清洗至空斑清晰，统计空斑数目。
(5)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抗HSV-1病毒复制的检测结果图。结果如图3B所示。
由图3B结果显示，培美曲塞二钠对HSV-1感染导致的细胞空斑的形成的IC50为0.17微摩尔/升。
2.3培美曲塞二钠抑制HSV-2感染导致的细胞空斑形成的检测。
(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度药物(培美曲塞二钠)的培养基，药物浓度分别为：200微摩尔/升、20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500微升的结晶紫染液，摇晃20分钟，用大量水清洗至空斑清晰，统计空斑数目。
(5)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抗HSV-2病毒复制的检测结果图。检测结果如图3C所示。
图3C结果显示：培美曲塞二钠对HSV-2感染导致的细胞空斑形成的IC50为1微摩尔/升。
实施例4:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知培美曲塞二钠为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
HFF细胞及HCMV(Towen株)为中科院武汉病毒所罗敏华研究员惠赠。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；含0.5％琼脂糖的DMEM；4％的甲醛；1％(W/V)结晶紫染液。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.1培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测。
(1)将每孔104个HFF细胞铺入96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁。
(2)细胞贴壁后添加梯度药物(培美曲塞二钠)处理。药物浓度分别为：1000微摩尔/升、200微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.32微摩尔/升、0.064微摩尔/升、0.0128微摩尔/升、0.00256微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的HFF细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养5天后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠对HFF细胞的细胞毒性检测结果图。结果如图4A所示。
由图4A结果得出：培美曲塞二钠对HFF细胞的CC50大于1000微摩尔/升。
2.2培美曲塞二钠抗HCMV活性检测。
(1)提前将每孔105个HFF细胞铺入24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁。
(2)细胞贴壁后，感染MOI为0.001的HCMV，感染3个小时后，更换含梯度药物(培美曲塞二钠)和0.5％琼脂的培养基。待培养基凝固后放入培养箱培养。药物浓度分别为：200微摩尔/升、40微摩尔/升、8微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.32微摩尔/升。
(3)培养5天后，吸弃覆盖物，每孔加入一定量的3.7％甲醛，室温放置30分钟；吸弃甲醛，加入1％(W/V)结晶紫，于室温放置30分钟，用流水冲洗，凉干后即可数斑。
(4)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制培美曲塞二钠抗HCMV病毒复制的检测结果图。结果如图4B所示。
图4B结果显示：培美曲塞二钠对HCMV感染导致的细胞空斑形成的IC50为5.77微摩尔/升。
实施例1～4检测的培美曲塞二钠对宿主细胞的CC5O和对疱疹病毒的IC50的结果如表1所示。
表1
“a”和“b”表示在Vero细胞中检测的结果
“c”表示在HFF细胞中检测的结果
“d”表示在B95-8细胞中检测的结果
“e”表示iSLK.219细胞中检测的结果
“f”表示选择指数(SI)，计算公式：SI＝CC50/IC50
由以上实验结果可以看出，培美曲塞二钠具有广谱的抗疱疹病毒裂解期复制的效果，因此以胸苷酸合成酶为靶点筛选出的胸苷酸合成酶抑制剂可作为抗疱疹病毒药物。
实施例5:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知雷替曲塞为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西 环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞。在该细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
雷替曲塞购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。
1.2试剂
DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.1雷替曲塞对iSLK.219细胞的细胞毒性检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释雷替曲塞。药物(雷替曲塞)浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升、0.00001微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组*100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制雷替曲塞对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图 (即存活率曲线图)。存活率曲线图如图5A所示。
由图5A可以得出，雷替曲塞对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)大于1000微摩尔/升。
2.2雷替曲塞抑制KSHV感染性病毒粒子的产生的检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释雷替曲塞。药物(雷替曲塞)浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升、0.00001微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，收取上清添加到293T细胞中，感染293T细胞1个小时后更换新鲜的培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制雷替曲塞抗KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图5A所示。
图5A结果显示雷替曲塞能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；雷替曲塞对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)为1纳摩尔/升。
实施例6:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知雷替曲塞为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。HSV-2为G株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermo公司产品。
2.实验方法与结果
2.1雷替曲塞对Vero细胞的细胞毒性检测
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。
在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(雷替曲塞)处理。药物浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升、0.00001微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制雷替曲塞对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图6A所示。
图2A结果显示：雷替曲塞对Vero细胞的CC50大于2000微摩尔/升。
2.2雷替曲塞影响HSV-1感染导致的细胞病变的检测
(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加了梯度药物(雷替曲塞)的培养基，药物浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500μl的PBS，利用高内涵细胞分析系统观测细胞病变情况。
由图6B结果显示，雷替曲塞在0.1微摩尔/升可以完全抑制HSV-1复制导致的细胞病变,其IC50为0.05微摩尔/升。
2.3雷替曲塞抑制HSV-2感染导致的细胞病变的检测
(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度药物(雷替曲塞)的培养基，药物浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500μl的PBS，利用高内涵细胞分析系统观测细胞病变情况。
由图6C结果显示，雷替曲塞在0.1微摩尔/升可以完全抑制HSV-2复制导致的细胞病变,其IC50为0.005微摩尔/升。
实施例7:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知雷替曲塞为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
B95-8细胞由武汉大学基础医学院孙晓平教授惠赠，该细胞中含有EBV病毒基因组全序列。用20ng/mL TPA联合诱导可以使该病毒进入裂解期复制。
1.2试剂
1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；SYBR混合液(iTaqTM UniversalGreen Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪购自PerkinElmer公司；荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TouchTM Real-Time PCR detection system)购自伯乐公司；1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.2雷替曲塞对B95-8细胞的细胞毒性检测
(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。细胞在37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。
(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mL TPA的1640培养基梯度稀释雷替曲塞，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(雷替曲塞)的终浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升、0.00001微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性,并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物为对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组*100。
结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(4)中的计算结果绘制雷替曲塞对B95-8细胞的细胞毒性检测结果图。结果如图7A所示。
由图7A结果显示：雷替曲塞对B95-8细胞的CC50大于1000微摩尔/升。
2.2雷替曲塞抑制EBV基因组复制的检测
(1)B95-8细胞为半贴壁细胞，实验时，按照5×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，培养基添加1％青霉素和链霉素。细胞在37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。
(2)TPA可以激活EBV裂解期复制。用含20ng/mL TPA的1640培养基梯度稀释雷替曲塞，将含药物的培养基直接添加到B95-8细胞中，使细胞悬液中所含药物(雷替曲塞)的终浓度分别为：100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)药物处理48h后，离心收集细胞，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA。
(4)通过定量PCR方法(QPCR)检测EBV基因组复制水平。定量PCR的引物为特异性针对EBV的EBNA1基因的序列。引物如下：
5'-GCCGGTGTGTTCGTATATGG-3'；
5'-CAAAACCTCAGCAAATATATGAG-3'。
选择管家基因GADPH为校正的内参对照基因。针对GADPH的定量PCR引物如下：
5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；
5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制雷替曲塞抗EBV裂解期DNA复制的结果图。结果如图7B所示。
图7B结果显示：雷替曲塞能剂量依赖地抑制EBV裂解期复制，对EBV裂解期DNA复制的IC50为0.34微摩尔/升。
实施例8:
以胸苷酸合成酶(TS)为靶点在筛选抗疱疹病毒药物中的应用，包括以下步骤：
已知雷替曲塞为胸苷酸合成酶抑制剂，以该抑制剂来验证其是否具备抗疱疹病毒的作用：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
HFF细胞及HCMV(Towen株)为中科院武汉病毒所罗敏华研究员惠赠。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司；含0.5％琼脂糖的DMEM；4％的甲醛；1％(W/V)结晶紫染液。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
2.1雷替曲塞对HFF细胞的细胞毒性检测
(1)将每孔104个HFF细胞铺入96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁。
(2)细胞贴壁后添加梯度药物(雷替曲塞)处理。药物浓度分别为：1000微摩尔/升、100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升、0.0001微摩尔/升、0.00001微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的HFF细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养5天后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，并用PerkinElmer 多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制雷替曲塞对HFF细胞的细胞毒性检测结果图。结果如图8A所示。
由图8A结果得出：雷替曲塞对HFF细胞的CC50大于1000微摩尔/升。
2.2雷替曲塞抗HCMV活性检测
(1)提前将每孔105个HFF细胞铺入24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁。
(2)细胞贴壁后，感染MOI为0.001的HCMV，感染3个小时后，更换含梯度药物(雷替曲塞)和0.5％琼脂的培养基。待培养基凝固后放入培养箱培养。药物浓度分别为：100微摩尔/升、10微摩尔/升、1微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.01微摩尔/升、0.001微摩尔/升。
(3)培养5天后，吸弃覆盖物，每孔加入一定量的3.7％甲醛，室温放置30分钟；吸弃甲醛，加入1％(W/V)结晶紫，于室温放置30分钟，用流水冲洗，凉干后即可数斑。
(4)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制雷替曲塞抗HCMV病毒复制的检测结果图。结果如图8B所示。
图8B结果显示：雷替曲塞对HCMV感染导致的细胞空斑形成IC50为0.9微摩尔/升。
实施例5～8检测的雷替曲塞对宿主细胞的CC5O和对疱疹病毒的IC50的结果如表2所示。
表2
“a”和“b”表示在Vero细胞中检测的结果
“c”表示在HFF细胞中检测的结果
“d”表示在B95-8细胞中检测的结果
“e”表示iSLK.219细胞中检测的结果
“f”表示选择指数(SI)，计算公式：SI＝CC50/IC50
由以上实验结果可以看出，雷替曲塞具有广谱的抑制疱疹病毒裂解期复制的效果，因此以胸苷酸合成酶为靶点筛选出的胸苷酸合成酶抑制剂可作为抗疱疹病毒药物。
实施例9:dTMP降低培美曲塞二钠及雷替曲塞的抗KSHV的活性
1.实验材料
1.1细胞、病毒
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞。在该细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；293T细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
培美曲塞二钠、雷替曲塞购自翰香生物科技公司(Biochempartner)，dTMP购自阿拉丁生物科技公司(Aladdin Industrial)。
1.2试剂
DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermo公司。
2.实验方法与结果
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血 清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％的青霉素、1％的链霉素、100μg/mLG418、100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释培美曲塞二钠及雷替曲塞。稀释后的培美曲塞二钠的浓度分别为：40微摩尔/升、4微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.04微摩尔/升、0.004微摩尔/升；稀释后的雷替曲塞的浓度分别为：200钠摩尔/升、66.6钠摩尔/升、22.2钠摩尔/升、7.4钠摩尔/升、2.4钠摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每孔50微升。每孔加入50微升含2000微摩尔/升dTMP或不含dTMP的DMEM培养基(含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠)。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，收取上清，将上清添加到293T细胞中，感染293T细胞1个小时后更换新鲜的培养基，293T细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠(图9A)和雷替曲塞(图9B)抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)。
图9A，9B结果显示dTMP的添加能够降低培美曲塞二钠及雷替曲塞抑制KSHV病毒粒子产生的活性。
实施例10:dTMP降低培美曲塞二钠及雷替曲塞的抗HSV-1活性
1.实验材料
1.1细胞、病毒
Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株，为中科院武汉病毒所保藏中心保存。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Promega公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermo公司产品。
2.实验方法与结果
2.1dTMP影响培美曲塞二钠及雷替曲塞抗HSV-1活性检测
(1)提前24小时将vero细胞接种到24孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加了1000微摩尔/升dTMP的DMEM培养基梯度药物(培美曲塞二钠及雷替曲塞)，稀释后的培美曲塞二钠的浓度分别为：20微摩尔/升、2微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.02微摩尔/升；稀释后的雷替曲塞的浓度分别为：100纳摩尔/升、20纳摩尔/升、4纳摩尔/升、0.8纳摩尔/升。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞，之后加入500μl的结晶紫染液，摇晃20分钟，用大量水清洗至空斑清晰，统计空斑数目。
(5)各组数据以未加药对照组作为标准进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组*100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制培美曲塞二钠(图10A)及雷替曲塞(图10B)抗HSV-1病毒复制的检测结果图。
由图10A，10B结果显示，dTMP能回复培美曲塞二钠及雷替曲塞抗HSV-1活性的效果。
胸苷合成酶以5，10-二甲基四氢叶酸(5,10-Methylenetetrahydrofolate)为甲基供体催化尿嘧啶脱氧核苷酸(Deoxyuridine monophosphate,dUMP)甲基化而生成胸腺嘧啶脱氧核苷酸(Deoxythymidine monophosphate，dTMP)。因此实施例9-10表明，病毒的复制确实因为dTMP含量的降低而被抑制，因此已知的胸苷酸合成酶抑制剂可用于制备抗疱疹病毒药物，也可以胸苷酸合成酶为靶点筛选抗疱疹病毒药物。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (3)

1.洛拉曲塞或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疱疹病毒包括选自卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒VI型、人类疱疹病毒VII型的至少之一。
3.根据权利要求1所述的应用，洛拉曲塞或其药学上可接受的盐与其他药物联合在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。
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