CN105663132B - 一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用 - Google Patents

一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，本发明选取选用完全无毒性浓度的吖啶琐辛进行抗疱疹病毒实验，结果显示该化合物具有显著的抗疱疹病毒病毒活性并呈剂量依赖相关，吖啶琐辛通过抑制病毒的复制来显示其抗疱疹病毒的效果。通过对不同亚型的疱疹病毒检测显示，吖啶琐辛具有广谱的抗疱疹病毒的活性，并且选择指数高，为临床上疱疹病毒的治疗提供一种安全高效毒副作用小的药物。吖啶琐辛在无毒性范围内能显著地抑制感染性疱疹病毒粒子的产生、抑制疱疹病毒的复制，可进一步开发为治疗疱疹病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

Description

一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体涉及一种吖啶琐辛或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。
背景技术
疱疹病毒科(Herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链DNA的病毒科。该科的成员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种，主要包括：单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(Her pes simplex virus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV),EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，人类疱疹病毒VI型(HHV-6)，人类疱疹病毒VII型(HHV-7)和卡波氏疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同,疱疹病毒科又可以分为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制,病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病的发生。
疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。
然而，治疗或者预防疱疹病毒感染的药物仍有待进一步开发。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，为临床上疱疹病毒的治疗提供一种安全高效毒副作用小的药物。吖啶琐辛在无毒性范围内能显著地抑制感染性疱疹病毒粒子的产生、抑制疱疹病毒的复制，可进一步开发为治疗疱疹病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种吖啶琐辛的分子式为：C25H28N2O2
吖啶琐辛(Acrisorcin)化学名为吖啶-9-胺，4-己基苯-1,3-二醇(Acridin-9-amine,4-hexyl benzene-1,3-diol)，是人工合成的小分子化合物。具有的结构式I所示的结构：
一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，其步骤是：
A、吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性实验：将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别用40微摩尔/升、20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升的吖啶琐辛进行处理，每组重复两个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，Alamarblue法检测细胞的存活率。结果显示，吖啶琐辛对Vero细胞的CC50约为11.53微摩尔/升。
B、吖啶琐辛抗HSV-1和HSV-2活性的评价：HSV-1和HSV-2都可以感染Vero，同时产生的细胞病变相似，因此利用相同的方法进行评价。提前24小时将Vero细胞接种到96孔板中，待细胞长满后，更换含2％血清的培养基，并接种病毒。病毒感染2小时后，分别用20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升、0.3125微摩尔/升、0.15625微摩尔/升的吖啶琐辛处理细胞。每组三个重复。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，48小时后检测细胞活性。结果显示吖啶琐辛抑制HSV-1复制的IC50为0.45微摩尔/升，抑制HSV-2复制的IC50为0.78微摩尔/升。
C、吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性实验：将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后,分别用浓度为：120微摩尔/升、40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升的吖啶琐辛处理细胞。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。48小时后，Alamarblue法检测细胞的存活率。结果显示，吖啶琐辛对iSLK.219细胞的CC50为12.17微摩尔/升。KSHV在多西环素和丁酸钠的诱导下才能进入裂解期复制，因此为了与抗KSHV裂解期复制实验一致，细胞毒性实验中吖啶琐辛用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的细胞培养基进行梯度稀释。
D、吖啶琐辛抗KSHV活性的评价：将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后,分别用浓度为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升的吖啶琐辛处理细胞，吖啶琐辛用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的细胞培养基进行梯度稀释。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48小时后，收取上清添加到Vero细胞中，感染Vero细胞1个小时后更换新鲜的培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。结果显示吖啶琐辛能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)为0.30微摩尔/升。同时，对iSL K.219细胞内KSHVDNA水平进行定量检测，结果显示吖啶琐辛依赖地抑制KSHV DNA复制水平；对KSHV DNA复制的半数抑制浓度(IC50)为1.41微摩尔/升。
E、吖啶琐辛抗疱疹病毒广谱性分析：吖啶琐辛或其药学上可接受的盐能剂量依赖地抑制KSHV DNA复制水平及可感染性病毒粒子的产生；剂量依赖地抑制HSV-1和HSV-2复制造成的细胞病变。说明其具有广谱的抑制疱疹病毒的活性，对其它疱疹病毒同样有一定的抗病毒活性。
F、利用吖啶琐辛或其药学上可接受的盐制备的治疗或预防疱疹病毒感染的药物，所述药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。
G、以上所述的疱疹病毒包括但不限于：选自卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒VI型(HHV6)、或人类疱疹病毒VII型(HHV7)。H、以吖啶琐辛或其药学上可接受的盐为活性成分的药物可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonicagent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.吖啶琐辛或其药学上可接受的盐在实验中表现抗多种疱疹病毒的活性，说明吖啶琐辛或其药学上可接受的盐具有广谱的抗疱疹病毒的活性。
2.吖啶琐辛或其药学上可接受的盐在无毒性浓度下能有效抑制HSV-1、HSV-2对细胞造成的细胞病变效应及可以抑制KSHV DNA复制及病毒粒子的产生，这说明吖啶琐辛或其药学上可接受的盐具有良好的抗疱疹病毒的活性。
3.吖啶琐辛展现了抑制HSV-1、HSV-2及KSHV复制的活性，其抑制HSV-1、HSV-2及KSHV的IC50分别为及0.45微摩尔/升、0.78微摩尔/升及0.30微摩尔/升。SI(选择指数)分别为25.6、17.4及40.6。而且吖啶琐辛做一种临床用药，安全性良好。这说明吖啶琐辛是低毒高效的抗疱疹病毒的药物。
附图说明
图1A、1B为一种实施例1的吖啶琐辛抗HSV-1的活性检测结果示意图；
其中：图1A：显示了吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；
图1B：显示了吖啶琐辛抗HSV-1活性的结果图；
图2A、2B为一种实施例2的吖啶琐辛抗HSV-2的活性检测结果示意图；
其中：图2A：显示了吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；
图2B：显示了吖啶琐辛抗HSV-2活性的结果图；
图3A、3B为一种实施例3的吖啶琐辛抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果示意图；
其中：图3A：显示了吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；
图3B：显示了吖啶琐辛抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果图；
图4A、4B为一种实施例4的吖啶琐辛抑制KSHV DNA复制活性检测结果示意图；
其中：图4A：显示了吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；
图4B：显示了吖啶琐辛抑制KSHV DNA复制活性检测结果图；
具体实施方式
下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明实施例以吖啶琐辛为例对其抗疱疹病毒活性进行说明，吖啶琐辛药学上可接受的盐也能产生相同的抗疱疹病毒的效果。
实施例1:吖啶琐辛抗HSV-1活性的检测
一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，其步骤是：
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株(Ejercito,P.M.,E.D.Ki eff,and B.Roizman.1968.Characterization of herpes simplex virusstrains differing in the ir effects on social behaviour of infectedcells.J.Gen.Virol.2:357-364)，为中国病毒资源与信息中心保存(China VirusResource and Bio-information Center)吖啶琐辛购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。
1.2试剂：
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。
1.3实验仪器：
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermo fisher公司产品。
2.实验方法与结果：
2.1吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％血清(F BS)的DMEM培养基，培养基中添加1％的青霉素和链霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(吖啶琐辛)处理。药物浓度分别为：40微摩尔/升、20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图1A所示。
图1A结果显示：吖啶琐辛对Vero细胞的CC50为11.53微摩尔/升。
2.2吖啶琐辛抑制HSV-1导致的细胞病变效应的检测：
HSV-1感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-1感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度药物(吖啶琐辛)的培养基，药物浓度分别为：20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升、0.3125微摩尔/升、0.15625微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞3次。
(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-1曲线图，如图1B。
由图1B结果显示，吖啶琐辛抑制HSV-1复制的IC50为0.45，计算出吖啶琐辛抗HSV-1的SI(选择指数)为25.6。
实施例2:吖啶琐辛抗HSV-2活性的检测
一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，其步骤是：
1.实验材料
1.1细胞、病毒
Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-2为G株(Ejercito PM,KieffED,Ro izman B.Characterization of herpes simplex virus strains differing intheir effect on social behavior of infected cells.J Gen Virol.1968；2:357–64.)，中国病毒资源与信息中心保存(C hina Virus Resource and Bio-informationCenter)。吖啶琐辛购自翰香生物科技公司(Bioch empartner)。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermo fisher公司产品。
2.实验方法与结果
2.1吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(吖啶琐辛)处理。药物浓度分别为：40微摩尔/升、20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制吖啶琐辛对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图2A所示。
图2A结果显示：吖啶琐辛对Vero细胞的CC50为13.58微摩尔/升。
2.2吖啶琐辛抑制HSV-2导致的细胞病变效应的检测
HSV-2感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-2感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度药物(吖啶琐辛)的培养基，药物浓度分别为：20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、1.25微摩尔/升、0.625微摩尔/升、0.3125微摩尔/升、0.15625微摩尔/升。稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞3次。
(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-2曲线图，如图2B。
由图2B结果显示，吖啶琐辛抑制HSV-2复制的IC50为0.78，计算出吖啶琐辛抗HSV-2的SI(选择指数)为17.4。
实施例3:吖啶琐辛抑制KSHV裂解期复制的活性检测
一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，其步骤是：
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generationof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Maintenance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SL K细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在该细胞中，RTA表达序列被构建入p Retro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
1.2试剂：
DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaqTMUniversalGreen Supermix)购自Bio-Rad公司。1.3实验仪器：
定量RCP仪(Bio-Rad CFX96TouchTMReal-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。
2.实验方法与结果：
2.1吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释吖啶琐辛。药物(吖啶琐辛)浓度分别为：120微摩尔/升、40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图3A所示。
由图3A可以得出，吖啶琐辛对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)为12.17微摩尔/升。
2.2吖啶琐辛抑制KSHV感染性病毒粒子产生的检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释吖啶琐辛。药物(吖啶琐辛)浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，收取上清添加到Vero细胞中，感染Vero细胞1个小时后更换新鲜的培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制吖啶琐辛抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图3B所示。
图3B结果显示吖啶琐辛能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；吖啶琐辛对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)为0.30微摩尔/升，计算得吖啶琐辛抑制KSHV可感染性病毒产生的SI(选择指数)为40.6。
实施事例4：吖啶琐辛抑制KSHV DNA复制的检测。
一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用，其步骤是：
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generationof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Maintenance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SL K细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在该细胞中，RTA表达序列被构建入p Retro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
1.2试剂：
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaqTMUniversalGreen Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器：
定量RCP仪(Bio-Rad CFX96TouchTMReal-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。
2.实验方法与结果：
2.1吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释吖啶琐辛。药物(吖啶琐辛)浓度分别为：120微摩尔/升、40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升。含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102MultilabelReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制吖啶琐辛对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图4A所示。
由图4A可以得出，吖啶琐辛对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)为14.36微摩尔/升。
2.2吖啶琐辛抑制KSHV DNA复制的检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以诱导KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释吖啶琐辛。药物(吖啶琐辛)浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升。含药物(吖啶琐辛)的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后去除上清，PBS洗细胞2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA，利用酒精沉淀DNA，然后将DNA晾干后溶解到TE中。
(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量RCR引物针对KSHV的LANA基因序列，定量RCR引物如下：
5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'；
5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'。
选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对GADPH的定量RCR引物如下：
5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'；
5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'。
(5)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制吖啶琐辛抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。结果如图1B所示。
图4B结果显示：在iSLK.219细胞中，吖啶琐辛能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DNA复制水平,吖啶琐辛对KSHV DNA复制的的IC50(半数抑制浓度)为1.41微摩尔/升。
综合以上实验结果可以看出，吖啶琐辛具有了广谱的抗疱疹病毒裂解期复制的效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种吖啶琐辛在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用；
所述的疱疹病毒为：EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒VI型或人类疱疹病毒VII。
2.一种吖啶琐辛药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染药物中的应用。
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