CN113109570B - 一种评估nk细胞抗巨细胞病毒作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的系统，该系统包括：第一评估子系统，用于评估NK细胞的抗巨细胞病毒的功能；第二评估子系统，用于评估NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能；第三评估子系统，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力；第四评估子系统，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。通过本发明提供的系统，对自然杀伤细胞(NK细胞)的抗巨细胞病毒作用进行了科学、规范地评估，并为自然杀伤细胞在抗巨细胞病毒中的应用，提供了科学、系统的参考依据，因而，本发明提供的系统具有广阔的应用前景。

Description

一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法
技术领域
本发明属于医学和生物学检测领域，特别是涉及一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法。
背景技术
异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是根治恶性血液疾病有效乃至唯一的方式。感染是allo-HSCT后最常见的并发症，占移植相关死亡的近50％。Allo-HSCT后早期免疫细胞数量及功能未重建至正常水平，极易发生感染。其中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染成为Allo-HSCT后主要的死亡原因。移植后CMV感染发生率高达30-80％，且可引起GVHD和细菌或真菌感染，增加移植相关死亡风险，导致移植结果差。抗病毒药物的预防和治疗效果有限，且长时间应用抗病毒药物会导致病毒耐药株的出现，而且可引起明显的骨髓抑制和肾功能损害等一系列药物副作用。因此CMV感染的预防和治疗仍是目前亟待解决的重大难题。
自然杀伤细胞(NK细胞)作为一类天然免疫细胞，对刺激信号的快速效应能力能够很好地保护机体，成为适应性免疫启动之前的一道强有力的防线，NK细胞的抗CMV作用已有部分研究。对于NK细胞缺陷的小鼠，感染MCMV后较正常小鼠病毒复制加快，诱导肝炎加重，生存时间明显缩短。Scalzo等发现，NK能够识别MCMV感染的细胞以发挥抗病毒作用。Lanier团队发现Ly49H+NK“记忆样”细胞亚群遇到CMV时快速扩增，CMV控制后该亚群可在组织中潴留多个月，具有快速活化和分泌因子的潜能，在CMV二次感染时具有更强的保护性。然而，CMV具有严格的种属特异性。人NK细胞控制HCMV感染的作用也有部分描述。纯化的NK细胞体外可直接抑制CMV的复制。Biron等报道了NK细胞缺陷的病人易反复发生严重的疱疹病毒感染的病例。而发生CMV感染的T细胞缺陷的病人，血清中HCMV病毒载量与NK细胞数量和细胞因子水平成反比，提示NK细胞的功能与CMV的清除具有密切关系，且可以在不存在T细胞的情况下控制CMV的感染。另有研究表明HCMV血清阳性患者相比阴性患者，NK细胞表面有更强的NKG2C受体表达。对于这群NKG2C+NK亚群更深入的研究发现，HCMV急性感染期间NKG2C+NK会发生大量扩增，而HCMV血清阳性健康人NKG2C+NK可以较高比例持续多年，并在HCMV重激活时发挥作用。总结来看，现有研究多从临床现象为出发点，较零散的评估NK细胞的杀伤性。对于NK细胞抗HCMV的作用，缺乏较系统的评估。
NK细胞的过继性回输在肿瘤的治疗手段中极具前景。但是由于人外周血中NK细胞数量有限，当前多采用体外诱导和扩增技术获取大量的NK细胞用于肿瘤免疫。然而，体外扩增的NK细胞是否具有抗CMV作用，却是未知的。
因此，本领域中，关于NK细胞是否具有抗CMV作用，缺乏系统的评估方式；更甚者，关于体外扩增的NK细胞是否具有抗CMV作用，也是未知的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法，该方法是一种结合体外与体内的综合评估方法，从而该评估系统具有科学性、完整性、规范性以及有效性等特点，为生物医学检测领域提供了较优的参考价值。本发明的内容具体如下：
本发明提供了一种评估NK细胞具有抗巨细胞病毒作用的系统，所述系统包括：
第一评估子系统，用于评估NK细胞的抗巨细胞病毒的功能；
第二评估子系统，用于评估NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能；
第三评估子系统，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力；
第四评估子系统，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。
可选地，所述第一评估子系统包括：24孔板1号、37度孵箱1号和流式分析仪；
基于所述第一评估子系统的操作过程为：
以1×105每孔的剂量，将MRC-5种入24孔板1号，放入37度孵箱1号培养，待细胞全部贴壁后，以MOI＝2加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养；
加入1000IU/ml预刺激过夜的NK细胞，同时加入Golgi plug试剂和CD107a抗体，37度孵箱1号培养4h后收集细胞；
标记所收集的细胞表面抗体CD3和CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用流式分析仪检测CD107a的百分比和IFN-r分泌量；
其中，所述CD107a的百分比和IFN-r分泌量，用于评估所述NK细胞抗巨细胞病毒功能的强弱。
可选地，在所述第一评估子系统中，所述NK细胞与所述MRC-5的效靶比为1～10:1。
可选地，所述第二评估子系统包括：24孔板2号、37度孵箱2号、巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器；
基于所述第二评估子系统的操作过程为：
将AD169感染的MRC-5细胞种入24孔板2号中，并加入1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测上清液中的CMV-DNA拷贝数；
其中，所述CMV-DNA拷贝数，用于评估NK细胞抑制抗巨细胞病毒扩增的功能强弱。
可选地，在所述第二评估子系统中，所述NK细胞与所述AD169感染的MRC-5细胞的效靶比为1～10:1；
所述AD169感染的MRC-5细胞的培养过程为：向含有MRC-5培养基中，以MOI＝0.5加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。
可选地，所述第三评估子系统包括：24孔板3号、37度孵箱3号、巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器；
基于所述第三评估子系统的操作过程为：
收集第二评估子系统(12)中所述第五天的培养上清，并将所述培养上清加入已有预先培养贴壁有MRC-5的24孔板3号中，于37度孵箱3号中培养1小时后更换新鲜培养基；
将更换培养基后的24孔板3号置于37度孵箱3号培养5天后收集上清液，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测该上清液中的CMV-DNA拷贝数；
通过0.05％胰蛋白酶消化通过所述孵箱培养5天后的MRC-5，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测MRC-5内CMV-DNA拷贝数；
其中，所述上清液中的CMV-DNA拷贝数和所述MRC-5内CMV-DNA拷贝数，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力的强弱。
可选地，所述第四评估子系统包括：X线亚致死剂量、流式细胞分析仪、HCMV DNA探针；
基于所述第四评估子系统的操作过程为：
对6-8周雌性NSG小鼠，以X线亚致死剂量进行照射后，通过尾静脉回输HCMV血清阳性的G-CSF动员的供者外周血干细胞1×106/只；
2周后，向回输所述外周血干细胞的NSG小鼠，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞；
移植后4周，过继性回输NK细胞1×107/只，并从回输NK细胞开始隔天腹腔注射50000个单位IL-2；
回输NK细胞后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式细胞分析仪检测NK细胞的比例，基于原位杂交法，使用HCMV DNA探针检测CMV-DNA的含量；
其中，所述CMV-DNA的含量，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。
可选地，在所述第四评估子系统中，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞的数量为1×106/只。
可选地，所述NK细胞为原代NK细胞或体外扩增的NK细胞。
本发明实施例提供了一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的系统，该系统包括：第一评估子系统，用于评估NK细胞的抗巨细胞病毒的功能；第二评估子系统，用于评估NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能；第三评估子系统，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力；第四评估子系统，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。通过本发明提供的系统，对自然杀伤细胞(NK细胞)的抗巨细胞病毒作用进行了科学、规范地评估，并为自然杀伤细胞在抗巨细胞病毒中的应用，提供了科学、系统的参考依据，因而，本发明提供的系统具有广阔的应用前景。
附图说明
图1示出了本发明实施例中的一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的系统的结构示意图；
图2(a)示出本发明实施例1中原代NK细胞和扩增的NK细胞分泌CD107a对比；
图2(b)示出本发明实施例1中原代NK细胞和扩增的NK细胞分泌IFN-r对比；
图3(a-c)示出本发明实施例1中培养第一天至第五天，AD169对照组，原代NK处理组和扩增NK处理组上清中CMV拷贝数的变化；
图3(d)示出本发明实施例1中培养第五天AD169对照组，原代NK处理组和扩增NK处理组上清中CMV拷贝数差异；
图4(a)示出本发明实施例1中再感染第五天三组培养上清中CMV拷贝数；
图4(b)示出本发明实施例1中再感染第五天三组培养细胞内CMV拷贝数；
图5(a)示出本发明实施例1中人源化小鼠CMV模型示意图；
图5(b)示出本发明实施例1中NK细胞回输后第7天和第14天，NK细胞在组织和外周血中的分布；
图5(c)示出本发明实施例1中NK细胞回输后第7天和第14天，小鼠不同组织CMV清除情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
基于生物医学检测领域的特殊性，本发明实施例提出了将体外评估与体内评估相结合的技术构思，为生物医学检测领域提供了一套评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的系统。
基于上述构思，本发明实施例提供了一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的系统，具体实施时，如图1所示，该系统包括：
第一评估子系统，用于评估NK细胞的抗巨细胞病毒的功能。具体实施时，第一评估子系统包括：24孔板1号、37度孵箱1号和流式分析仪。而基于该第一评估子系统的操作过程为：
将人成纤维细胞MRC-5种入24孔板1号，每孔的细胞数为1×105，然后，放入37度孵箱培养，待细胞贴壁后，以MOI＝2向每孔中加入AD169病毒液，以使MRC-5感染人MRC-5病毒株AD169。感染1h后去除AD169病毒液，并更换新鲜DMEM完全培养基(即，本领域中常用的一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)过夜培养。然后，以一定效靶比加入1000IU/ml预刺激过夜的NK细胞，同时加入Golgi plug(BD Biosciences)和CD107a抗体(BD Biosciences)，然后进行共孵育。37度孵箱1号培养4h后收集细胞，标记表面抗体CD3，CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用BD LSR Fortessa流式分析仪检测CD107a和IFN-r分泌情况。其中，CD107a的百分比和IFN-r分泌量，用于评估NK细胞抗巨细胞病毒功能的强弱。
最后，根据CD107a和IFN-r分泌情况，判断NK细胞是否具有抗巨细胞病毒作用，以及抗巨细胞病毒作用的强弱。
在第一评估子系统中，由于CD107a是一个脱颗粒的分子，因而在NK细胞体现对巨细胞病毒杀伤作用的时候，CD107a会通过高尔基体转运到细胞膜，然后释放到培养基中。因此，在最终的检测CD107a时，由于CD107a已被释放到培养基中，从而影响了CD107a的最终检测值。针对这种情况，本系统的操作过程中，发明人在NK细胞与肿瘤细胞共孵育之前加Golgi plug。该Golgi plug的作用是让高尔基体停止转运，而当高尔基体停止转运后，CD107a就会被积累在高尔基体里面，从而使得在最终破膜后，可以顺利检测到CD107a；同时检测的CD107a的值是不受其他因素影响的值，可以作为衡量NK细胞的抗巨细胞病毒作用的参考值。
在本实施例的第一评估子系统中，可选地，NK细胞与所述MRC-5的效靶比可以为1～10:1。
第二评估子系统，用于评估NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能。具体实施时，第二评估子系统包括：24孔板2号、37度孵箱2号、巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器。而基于该第二评估子系统的操作过程为：
将AD169感染的MRC-5细胞种入24孔板2号中，并加入1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，并使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测说收集的上清液中的CMV-DNA拷贝数。其中，CMV-DNA拷贝数，用于评估NK细胞抑制抗巨细胞病毒扩增的功能强弱。
最后，在实际评估过程中，可根据检测的CMV-DNA拷贝数，判断出NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能的强弱。
在本实施例的第二评估子系统中，以MRC-5细胞作为靶细胞，用AD169(甘草酸体外抗人巨细胞病毒)感染MRC-5细胞。
在本实施例的第二评估子系统中，可选地，NK细胞与AD169感染的MRC-5细胞的效靶比为1～10:1。
在本实施例的第二评估子系统中，AD169感染的MRC-5细胞的培养过程为：向含有MRC-5培养基中，以MOI＝0.5加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。
需要说明的是，在本实施例的第二评估子系统中，目的是检测NK细胞对CMV传播的抑制作用，则需要NK细胞与AD169病毒共孵育5天，当使用较小MOI，例如以MOI＝0.5局部感染靶细胞1h，然后在共培养5天的期间，病毒可以在钯细胞内大量复制且在靶细胞间传播扩散并大量复制，并最终裂解靶细胞，以此探究NK细胞的加入是否能够抑制病毒传播扩散的过程。如果，按照MOI＝2，则病毒可直接感染90％以上MRC-5细胞，并迅速把MRC-5细胞裂解掉，从而也就无法准确地检测出NK细胞的加入是否能够抑制病毒传播扩散的过程。因而，为了防止这种情况发生，在上述AD169感染的MRC-5细胞的培养过程中，以MOI＝0.5加入AD169病毒液。其中，MOI＝病毒数量/感染的细胞数量(MRC-5)。
而在本实施例的第一评估子系统中，是在AD169感染MRC-5后的第二天，就做NK细胞抗巨细胞病毒功能实验，所以在本系统的操作过程中，需要让AD169病毒快速感染MRC-5细胞，才能实现第二天大概有90％以上的MRC-5细胞发生病变，从而才能进行下一步的抗巨细胞病毒功能实验的步骤。
第三评估子系统，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力。该第三评估子系统包括：24孔板3号、37度孵箱3号、巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器。而基于该第三评估子系统的操作过程为：
收集第二评估子系统中第五天的培养上清，并将该培养上清置于24孔板3号中，向每个孔的培养上清中加入MRC-5细胞，再于37度孵箱3号中培养1小时后更换新鲜DMEM完全培养基；将更换培养基后的24孔板3号置于37度孵箱3号培养5天后收集上清液，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测该上清液中的CMV-DNA拷贝数；通过0.05％胰蛋白酶消化通过孵箱培养5天后的MRC-5细胞，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测MRC-5细胞内CMV-DNA拷贝数。其中，上清液中的CMV-DNA拷贝数和MRC-5细胞内的CMV-DNA拷贝数，用于评估被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力的强弱。
第三评估子系统的操作过程在具体实施时，可以为：收集第二评估子系统中每个孔第五天的培养上清，并将这些培养上清置于24孔板3号中；将每个培养上清中的MOI值调整成相同值，得到再感染病毒液体系(该体系中包括：实验组和阴性对照组)；再向24孔板3号每个孔的培养上清中加入MRC-5细胞，得到一个新的病毒感染靶细胞体系(该体系中，含有实验组中的病毒感染靶细胞组，与含有阴性对照组中的病毒感染靶细胞组)，将这个新的病毒感染靶细胞体系于37度孵箱3号中培养1小时后更换新鲜DMEM完全培养基；将更换培养基后的24孔板3号置于37度孵箱3号培养5天后，得到第二共孵育体系；对第二共孵育体系中的每个上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测该上清液中的CMV-DNA拷贝数；通过0.05％胰蛋白酶消化通过孵箱培养5天后的MRC-5细胞，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测MRC-5细胞内CMV-DNA拷贝数；比较第二共孵育体系中实验组和阴性对照组，各自的病毒对细胞的感染力。
本实施步骤中，需将每个上清液中的MOI值调整成相同值，是因为：由于第一共孵育体系中存在实验组(即被待测对象作用的病毒组)和阴性对照组(即未被待测对象作用的病毒组)，而实验组上清液中的病毒数量由于待测对象的存在而减少，从而实验组上清液中的病毒数量少于阴性对照组上清液中的病毒数量，而为了确保病毒再感染力的检测，需要将实验组上清液中的病毒数量与阴性对照组上清液中的病毒数量调为相等。
相应地，根据第二评估子系统检测结果和第三评估子系统检测的再感染力，确定NK细胞是否具有抗巨细胞病毒作用。
在本实施例的第三评估子系统的操作过程中，为了节约时间和精力，简化操作者的实验过程，在评估巨细胞病毒的再感染力时，可直接将第二评估子系统中第五天收集的培养上清，作为再感染实验所需的病毒液。
第四评估子系统，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。具体实施时，第四评估子系统包括：X线亚致死剂量、流式细胞分析仪、HCMV DNA探针。而基于该第四评估子系统的操作过程为：
对6-8周雌性NSG小鼠，以X线亚致死剂量进行照射后，通过尾静脉回输HCMV血清阳性的G-CSF动员的供者外周血干细胞1×106/只；2周后，向回输外周血干细胞的NSG小鼠，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞；移植后4周，过继性回输NK细胞1×107/只，并从回输NK细胞开始隔天腹腔注射50000个单位IL-2；回输NK细胞后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式细胞分析仪检测NK细胞的比例，基于原位杂交法，使用HCMV DNA探针检测CMV-DNA的含量。其中，CMV-DNA的含量，用于评估NK细胞对巨细胞病毒的清除功能。
在本实施例的第四评估子系统中，可选地，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞的数量为1×106/只。
本实施例中，最终通过这4个子系统所得的实验数据，综合判断NK细胞是否具有抗巨细胞病毒作用，以及抗巨细胞病毒作用的强弱。因而，基于本发明实施例提供的系统，实现了通过实验科学地证实NK细胞具有抗巨细胞病毒作用，为NK细胞的应用提供了理论依据。
本实施例中，可选地，NK细胞可以为原代NK细胞或体外扩增的NK细胞。因而，基于本发明实施例提供的系统，还科学地证实体外扩增的NK细胞具有抗巨细胞病毒作用，为体外扩增的NK细胞的应用提供了理论依据。并且，由于体外扩增的NK细胞具有数量充裕，在应用过程中不受数量限制，因而，基于本发明实施例提供的系统，不仅拓宽了体外扩增的NK细胞的应用领域，还避免了原代NK细胞在应用过程中所存在的数量有限的缺陷。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的系统。
实施例1(该实施例是基于本发明提供的评估系统，实施的具体操作过程)
实验1，体外扩增NK细胞的制备
使用丝裂霉素C(20ug/ml)处理负载了mbIL-21-41BBL的K562细胞待用。从健康供者外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，以1:1的效靶比于含10％胎牛血清和1000单位/ml IL-2的NK细胞完全培养基(GT-T551 H3)中共孵育两细胞(K562细胞与外周血单个核细胞)，孵育7天后转移两细胞至含1000单位/ml IL-2的NK细胞维持培养基再培养7天，得到体外扩增的NK细胞。
实验2，评估体外扩增的NK细胞与原代NK细胞各自的抗cmv功能实验
第一部分，评估原代NK细胞的抗cmv功能实验：
将人成纤维细胞MRC-5种入24孔板，每孔的细胞数为1×105，放入37度孵箱1号培养24h后，向每孔中加入病毒液，以使MRC-5细胞感染人MRC-5病毒株AD169(MOI＝2)。感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。以5:1效靶比加入1000IU/ml预刺激过夜的原代NK细胞，同时加入Golgi plug(BD Biosciences)和CD107a抗体(BDBiosciences)，然后通过37度孵箱1号进行共孵育。培养4h后收集细胞，标记表面抗体CD3，CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用BD LSR Fortessa流式分析仪检测CD107a和IFN-r分泌情况。
第二部分，评估体外扩增的NK细胞的抗cmv功能实验：
将人成纤维细胞MRC-5种入24孔板，每孔的细胞数为1×105，放入37度孵箱1号培养24h后，向每孔中加入病毒液，以使MRC-5细胞感染人MRC-5病毒株AD169(MOI＝2)。感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。以5:1效靶比加入1000IU/ml预刺激过夜的体外扩增的NK细胞，同时加入Golgi plug(BD Biosciences)和CD107a抗体(BDBiosciences)，然后通过37度孵箱1号进行共孵育。培养4h后收集细胞，标记表面抗体CD3，CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用BD LSR Fortessa流式分析仪检测CD107a和IFN-r分泌情况。
本实施例的实验结果，如图2(a)和图2(b)所示，并且，由图2(a)和图2(b)可知，体外扩增NK细胞相比原代NK细胞，对AD169感染的MRC-5有更强的杀伤作用，具体体现在：两者具有相似的脱颗粒能力(CD107A的百分比无差异)，但体外扩增NK细胞表现出了更高水平的IFN-r的分泌。
实验3，原代NK细胞和体外扩增的NK细胞各自抑制CMV扩增的实验
第一部分，原代NK细胞抑制CMV扩增的实验：
将AD169感染的MRC-5细胞(MOI＝0.5，1h)种入24孔板2号中，待细胞全部贴壁后加入1000IU/ml IL-2预刺激的原代NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/ml IL-2预刺激的原代NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒(Liferiver，中国)和ABI Prism 7300qPCR仪器检测所收集的培养上清中的CMV-DNA拷贝数。
第二部分，体外扩增的NK细胞抑制CMV扩增的实验：
将AD169感染的MRC-5细胞(MOI＝0.5，1h)种入24孔板2号中，待细胞全部贴壁后加入1000IU/ml IL-2预刺激的体外扩增的NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/mlIL-2预刺激的体外扩增的NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒(Liferiver，中国)和ABI Prism 7300qPCR仪器检测所收集的培养上清中的CMV-DNA拷贝数。
由图3所示的检测数据可知，AD169感染的MRC-5对照组和加入原代NK细胞实验组中，第5天培养上清中HCMV拷贝数均明显高于第一天，同时，对于第5天培养上清，体外扩增NK细胞实验组的CMV拷贝数低于原代NK细胞实验组。而体外扩增的NK细胞实验组第5天培养上清中HCMV拷贝数低于第一天。因此，通过本实验的评估可知：NK细胞能够抑制CMV在宿主细胞间的传播，且体外扩增的NK细胞相比原代NK细胞具有更强的功能。
实验4，针对被原代NK细胞和体外扩增的NK细胞各自作用过的CMV的再感染力检测实验
首先，收集实验3中第一部分和第二部分两者各自第5天的培养上清。然后，将MRC-5细胞种入24孔板3号中并进行培养(其中，24孔板3号中每孔的MRC-5细胞量是1×105/孔)，待MRC-5细胞全部贴壁后，将收集的培养上清分别加入到已预先培养MRC-5细胞的24孔板3号中，于37度共培养1小时后更换新鲜培养基。更换后继续置于37度孵箱3号培养5天，然后收集上清液，检测上清液中的CMV-DNA拷贝数；使用0.05％胰蛋白酶消化MRC-5细胞，检测细胞内CMV-DNA拷贝数。
由图4所示的检测数据可知，AD169感染的MRC-5对照组上清再感染的MRC-5的胞内和上清中CMV拷贝数均高于NK细胞共孵育后的实验组，而原代NK处理组和体外扩增的NK处理组无明显差异。说明NK细胞能够降低CMV的感染能力，同时体外扩增的细胞相比原代NK具有更强的功能。
实验5，体外扩增的NK细胞清除CMV小鼠实验
对6-8周雌性NSG(NOD-Prkdcscid IL2Rrnull)小鼠(购自南京模式动物中心)，以X线亚致死剂量(150cGy)照射后，通过尾静脉回输HCMV血清阳性的G-CSF动员的供者外周血干细胞1×106/只，2周后腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞1×106/只。移植后4周，过继性回输体外扩增的NK细胞1×107/只。从回输体外扩增的NK细胞开始隔天腹腔注射50000个单位IL-2。回输后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式细胞分析仪检测NK细胞的比例，使用HCMV探针原位杂交法检测CMV-DNA研究CMV的清除情况。
由图5所示的检测数据可知，在小鼠肝，脾，肺中可检测到回输的NK细胞。小鼠脏器内的CMV得到有效清除，分别为：回输后第14天，肺CMV清除率为88.9％，肝CMV清除率为66.7％，脾CMV清除率为38.9％。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的系统一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (5)

1.一种检测NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括：
检测NK细胞的抗巨细胞病毒的功能，包括：
以1×105 每孔的剂量，将MRC-5种入24孔板1号，放入37度孵箱1号培养，待细胞贴壁后，以MOI=2加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养；加入1000IU/ml预刺激过夜的NK细胞，同时加入Golgi plug试剂和CD107a抗体，37度孵箱1号培养4h后收集细胞；标记所收集的细胞表面抗体CD3和CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用流式分析仪检测CD107a的百分比和IFN-r分泌量；
检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能，包括：
将AD169感染的MRC-5细胞种入24孔板2号中，并加入1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测上清液中的CMV-DNA拷贝数；
检测被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力，包括：
收集在所述检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能中所述第五天的培养上清，并将所述培养上清加入已有预先培养贴壁有MRC-5的24孔板3号中，于37度孵箱3号中培养1小时后更换新鲜培养基；将更换培养基后的24孔板3号置于37度孵箱3号培养5 天后收集上清液，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测该上清液中的CMV-DNA拷贝数；通过0.05% 胰蛋白酶消化通过所述孵箱培养5 天后的MRC-5，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测MRC-5内CMV-DNA拷贝数；
检测NK细胞对巨细胞病毒的清除功能，包括：
对6-8周雌性NSG小鼠，以X线亚致死剂量进行照射后，通过尾静脉回输HCMV血清阳性的G-CSF动员的供者外周血干细胞1×106 /只；2周后，向回输所述外周血干细胞的NSG小鼠，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞；移植后4周，过继性回输NK细胞1×107 /只，并从回输NK细胞开始隔天腹腔注射50000个单位IL-2；回输NK细胞后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式细胞分析仪检测NK细胞的比例，基于原位杂交法，使用HCMV DNA探针检测组织中CMV感染和清除情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞的抗巨细胞病毒的功能中，所述NK细胞与所述MRC-5的效靶比为1~10:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能中，所述NK细胞与所述AD169感染的MRC-5细胞的效靶比为1~10:1；
所述AD169感染的MRC-5细胞的培养过程为：向含有MRC-5培养基中，以MOI=0.5加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞对巨细胞病毒的清除功能中，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞的数量为1×106 /只。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞为原代NK细胞或体外扩增的NK细胞。
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