CN115843780B

CN115843780B - 生物膜保存液及其制备方法和应用

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Publication number: CN115843780B
Application number: CN202211449595.XA
Authority: CN
Inventors: 林永亮; 何海娜; 吴有陵; 刘艳丽; 罗锦荣; 胡楚龙; 范文婷
Original assignee: Guangzhou Ruitai Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruitai Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-11-18
Also published as: CN115843780A; WO2024103704A1

Abstract

本发明公开了一种生物膜保存液及其制备方法和应用，所述生物膜保存液包括硫酸软骨素、稳定剂、透明质酸钠、甘油、冷冻保护剂、含硫化合物和HC‑HA/PTX3复合物。本发明的生物膜保存液在10℃～‑20℃的条件下均实现良好的保存效果；且经本发明的生物膜保存液保存后，生物膜的形态未改变，含有的活性因子丢失率低，同时具有提高生物膜材料的临床使用疗效的特点，可作为生物膜的长期保存液，广泛应用于生物制药、医疗领域中。

Description

生物膜保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，本发明涉及一种生物膜保存液及其制备方法和应用。

背景技术

在胎盘哺乳动物中，羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。脐带将发育中的胎儿连接到胎盘，脐带由羊膜(UCAM)和沃顿氏胶制成。

新鲜羊膜(包括来源于脐带的羊膜)中包含多种胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸等，这些活性物质可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化，防止上皮凋亡；羊膜细胞及基质中还包含多种生长因子，如神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)，角质细胞生长因子(KGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；此外，羊膜细胞及基质中还包含抑制血管生成、抗炎的蛋白以及一些天然蛋白酶抑制因子，这些因子成分能够促进上皮生长、抑制炎性反应、抑制纤维组织过度增生和新生血管形成。羊膜在促进上皮修复、愈合及分化，抑制炎症，抗新血管生成，抑制纤维化及瘢痕化，防止睑球粘连等眼科多个领域发挥着重要的作用。

包括羊膜在内的生物膜，需要采用不同的保存液进行保存。而不同的保存方法对生物膜的结构和生物学活性有不同的影响。现在使用较为普遍的生物膜保存液为DMEM和甘油混合液(体积比DMEM：甘油＝1：1)，将生物膜片放入装有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置于-70℃冰箱保存备用，该保存液会使生物膜上皮细胞形态改变，代谢酶活性和生长因子的表达降低，且过快的降温会造成细胞水肿，发生老化及功能减退，从而影响生物膜的品质。

申请号为200710150436.9的中国专利公开了“一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用”，该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：DMEM培养基9.0～12.0克，硫酸软骨素10.0～25.0克，透明质酸钠0.5～1.0克，HEPES 4.0～5.0克，右旋糖苷10.0～15.0克，庆大霉素1.0～3.0毫升，地塞米松24.0～30.0毫克，非必需氨基酸10.0～15.0毫升，还原型谷胱甘肽0.50～0.95克，胎牛血清20.00～50.0毫升，注射用水加至1000毫升。该新鲜羊膜保存液具有在4℃冰箱中保存，将新鲜羊膜保存期延长20～30天的优点。但该保存液中由于加入了血清成分，增加了跨种病毒在羊膜与保存液之间传播的机会。

有研究比较了Hank’s平衡盐/甘油溶液深低温(-80℃)保存、纯甘油4℃保存、冷冻干燥常温保存法对羊膜生物学性能的影响，结果显示：1、与新鲜羊膜相比，保存的羊膜在胶原酶Ⅳ溶液中降解速度均有所加快，其中纯甘油4℃保存的羊膜的降解速度最快，冷冻干燥保存的羊膜的降解速度最慢；2、冷冻干燥保存的羊膜中被检测的8种细胞因子残存量在40％左右；Hank’s平衡盐/甘油溶液深低温保存和纯甘油4℃保存的羊膜中的8种细胞因子残存量均低于20％。因此，3种方法中以冷冻干燥常温法保存羊膜的效果最好，但活性因子的丢失率还是很高。

为避免生物膜材料在使用过程中的感染风险，生物膜在临床使用之前，应进行灭活病毒或者灭菌处理。然而生物膜在经辐照灭活病毒或者灭菌处理时，通常会对生物膜材料的胶原结构造成一定的破坏，从而降低生物膜材料的物理性能以及生物性能。以往报道的生物膜保存液主要的关注点在于保护生物膜的细胞活性以及各项活性因子，较少关注到生物膜经保存液保存后，是否可以保护其不受辐照损伤。

因此，提供一种活性因子丢失率低，可避免生物膜材料在经辐照灭活病毒或者灭菌过程中损坏变性，生物膜临床使用疗效高的保存液，具有重大的临床意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种生物膜保存液及其制备方法和应用，所述生物膜保存液可以使保存的生物膜含有的活性因子丢失率低，且在经辐照灭活病毒或灭菌过程中不易损坏变性。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一个方面，是提供了一种生物膜保存液，所述生物膜保存液包括以下组分：10～25g/L硫酸软骨素、100～200mg/L稳定剂、5～50g/L透明质酸钠、200～500g/L甘油、0.1％～5％v/v冷冻保护剂、5000～20000ng/L含硫化合物、0.01～7g/L HC-HA/PTX3复合物。

本发明的第二个方面，是提供了所述生物膜保存液的制备方法。

所述生物膜保存液的制备方法，其步骤包括，将所有组分加入到注射用水中混合均匀后，调节pH为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，即得。

本发明的第三个方面，是提供了上述生物膜保存液在生物膜保存中的应用。

本发明的生物膜保存液，通过添加HC-HA/PTX3复合物和含硫化合物，并配合其他组分共同作用，使其在10℃～-20℃的条件下均实现良好的保存效果，保存后的生物膜的形态未改变，含有的活性因子丢失率低(10℃保存2周，活性因子保存率50％以上，-20℃下保存半年，活性因子保存率可达60％以上，-20℃下保存1年，活性因子保存率可达50％以上)，同时可避免生物膜材料在经辐照灭活病毒或者灭菌过程中损坏变性，经保存后的生物膜临床使用疗效比新鲜羊膜使用疗效更高，可以广泛应用于生物制药、医疗领域中。

附图说明

图1为本发明试验例1中不同样品中生长因子的含量对比结果；其中，实验组与对照组(新鲜羊膜)相比，**P＜0.01，*P＜0.05；实验组与对比例组相比，※※P＜0.01，※P＜0.05。

图2为本发明试验例3中实验组样品和对照组样品的颜色变化对比。

图3为本发明试验例3中实验组样品的柔韧性结果。

图4为本发明试验例4中新鲜羊膜、本发明实施例2的保存液保存的生物羊膜以及对比例2的保存液保存的生物羊膜的临床使用效果对比结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明的一些实施例中，公开了一种生物膜保存液，所述生物膜保存液包括以下组分：10～25g/L硫酸软骨素、100～200mg/L稳定剂、5～50g/L透明质酸钠、200～500g/L甘油、0.1％～5％v/v冷冻保护剂、5000～20000ng/L含硫化合物、0.01～7g/L HC-HA/PTX3复合物。作为优选的，所述生物膜保存液包括以下组分：14～16g/L硫酸软骨素、100～120mg/L稳定剂、15～25g/L透明质酸钠、250～350g/L甘油、1.5％～2.5％v/v冷冻保护剂、8000～12000ng/L含硫化合物、0.8～1.2g/LHC-HA/PTX3复合物

其中，HC-HA/PTX3复合物可从胎儿组织如胎盘、羊膜和脐带中分离得到(在本发明中，HC-HA/PTX3复合物参考申请号202210284199中的方法制备而得)。在本发明中首次将其作为生物膜保存液的主要成分之一，发现其可以延缓生物膜的降解速度，从而延缓生物膜的生长因子(EGF、bFGF、HGF、TGF-β1、NGF)的丢失，降低损失率，保存两个月后的生物膜的各生长因子的含量接近于新鲜生物膜，在临床使用时具有抗瘢痕以及抑制新生血管的作用，可赋予生物膜更好的治疗功效。

所述含硫化合物为半胱氨酸、半胱胺、2-氨乙基硫代硫酸、硫脲中的至少一种。含硫化合物能及时清除保存液中保存的生物膜样品经辐照时产生的自由基，避免自由基对生物膜的破坏，使生物膜维持新鲜生物膜的颜色、柔韧性及优越的拉伸强度；同时，含硫化合物与HC-HA/PTX3复合物发挥协同作用，使保存的生物膜的生长因子(EGF、bFGF、HGF、TGF-β1、NGF)的损失率降低，保存两个月后的生物膜的各生长因子的含量接近于新鲜生物膜。

在其中一些实施例中，所述稳定剂为抗坏血酸、维生素E、维生素C、胡萝卜素、SOD中的至少一种，优选为维生素C。

在其中一些实施例中，所述冷冻保护剂至少包含右旋糖酐和二甲基亚砜中的一种。

作为优选的，所述生物膜保存液包括以下组分：14～16g/L硫酸软骨素、100～120mg/L维生素C、15～25g/L透明质酸钠、250～350g/L甘油、1.5％～2.5％v/v二甲基亚砜、8000～12000ng/L半胱氨酸、0.8～1.2g/L HC-HA/PTX3复合物。

在其中一些实施例中，所述生物膜可为任何动物(优选哺乳动物)的心包膜、羊膜或脐带来源组织(特别是华通氏胶Wharton's Jelly)，优选为羊膜。

本发明的另一些实施例中，还涉及了所述生物膜保存液的制备方法，其是将所有组分加入到注射用水中混合均匀后，调节pH为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，即得。

本发明的另一些实施例中，还涉及了一种生物膜的保存方法，其是将新鲜生物膜保存于上述生物膜保存液中。以羊膜为例进行说明，具体包括以下步骤：

(1)、取健康剖宫产胎膜，在无菌环境中利用无菌组织缓冲液或生理盐水将胎膜冲洗干净；

(2)、用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，弃去绒毛膜，保留羊膜；

(3)、去除羊膜的结缔组织与海绵层；

(4)、使用无菌组织缓冲液及抗生素平衡液进行处理；

(5)、将处理后的羊膜进行裁剪成适度大小、分装至装有本发明的生物膜保存液的容器中，密封保存；

(6)、转至-20℃～10℃的保温容器中，用辐照剂量为15kGy～45kGy的γ射线进行辐照18～30h，-20℃～10℃保存即可。

以下实施例中，所使用的试剂盒包括如下：

表皮生长因子(EGF)检测试剂盒：公司：R&D Systems,Inc.，试剂盒名称：HumanEGF Quantikine ELISAKit，货号：DEG00。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)检测试剂盒：公司：R&D Systems,Inc.，试剂盒名称：Human FGF basic/FGF2/bFGF Quantikine ELISAKit，货号：DFB50

肝细胞生长因子(HGF)检测试剂盒：公司：R&D Systems,Inc.，试剂盒名称：HumanHGF Quantikine ELISAKit，货号：DHG00。

β1转化生长因子(TGF-β1)检测试剂盒：公司：R&D Systems,Inc.，试剂盒名称：Human TGF-β1Quantikine ELISAKit，货号：PDB100B。

神经生长因子(NGF)检测试剂盒：公司：R&D Systems,Inc.，试剂盒名称：Humanbeta-NGF DuoSet ELISAKit，货号：DY256-05。

以下结合附图和具体实施例来对本发明作进一步的详细说明。

实施例1一种生物膜保存液及其制备方法

该实施例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

该实施例中的生物膜保存液的制备方法，包括以下步骤：

1、将所有组分加入到500ml注射用水中混合均匀；

2、继续加入注射用水至1000ml混合均匀；

3、调节pH为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，即得。

本实施例还提供了利用该生物膜保存液保存羊膜的方法，包括以下步骤：

(3)、去除羊膜的结缔组织与海绵层；

(4)、使用无菌组织缓冲液及抗生素平衡液进行处理；

(5)、将处理后的羊膜裁剪成适度大小、分装至装有本实施例的生物膜保存液的容器中，密封保存；

(6)、转至-20℃的保温容器中，用辐照剂量为25kGy的γ射线进行辐照24小时，-20℃保存即可。

使用前将羊膜从生物膜保存液中取出，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。

实施例2一种生物膜保存液及其制备方法

本实施例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

本实施例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

实施例3一种生物膜保存液及其制备方法

本实施例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

本实施例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

实施例4一种生物膜保存液及其制备方法

该实施例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

本实施例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

实施例5一种生物膜保存液及其制备方法

该实施例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

本实施例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

对比例1

该对比例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

该对比例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

对比例2

该对比例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

该对比例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

对比例3

该对比例中的生物膜保存液由以下组分制备而得：

该对比例中的生物膜保存液的制备方法同实施例1。

试验例1本发明的生物膜保存液对生物膜活性因子的保存效果

为验证本发明的生物膜保存液对生物膜活性因子的保存效果，本试验例分别检测了新鲜羊膜和使用本发明的生物膜保存液保存的羊膜中的各种生长因子的含量。

1、实验分组

实验组样品：利用实施例2的生物膜保存液保存了2个月的羊膜

对照组CK样品：实施例1中利用生物膜保存液保存羊膜的方法步骤(1)～(4)处理后的新鲜羊膜

对照组1样品：利用对比例1的生物膜保存液保存了2个月的羊膜

对照组2样品：利用对比例2的生物膜保存液保存了2个月的羊膜

对照组3样品：利用对比例3的生物膜保存液保存了2个月的羊膜

2、实验方法

分别称取一定量的实验组样品和对照组样品，干燥后超声粉碎，称取30mg羊膜加入到1ml 1×PBS缓冲液中，室温下摇床振荡24小时，然后在4℃，12000rpm离心30分钟，取上清进行定量检测(新鲜羊膜HGF等因子含量较高，可稀释一定比例后进行检测，其它材料是否稀释视具体情况而定)。

定量检测：按各生长因子检测试剂盒说明的方法进行操作，分别检测实验组样品及对照组样品的表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、β1转化生长因子(TGF-β1)、神经生长因子(NGF)的含量，并与对照组CK(新鲜羊膜)中各生长因子的含量进行对比，以评估对照组1、对照组2以及实验组制备的保存液对羊膜的保存效果。

3、实验结果

结果如图1所示。从图1结果可知，与对照组CK(新鲜羊膜)相比，所有样品组中的生长因子都呈现下降趋势，实验组的生长因子下降幅度最小。与对照组1相比，对照组2(含硫化合物的添加量是实验组中含硫化合物的添加量的2倍)和对照组3(HC-HA/PTX3复合物的添加量是实验组中HC-HA/PTX3复合物的添加量的2倍)中各生长因子的含量都有所提高，实验组中各生长因子含量都有了显著的提高，说明保存液中的HC-HA/PTX3复合物和含硫化合物两者发挥了协同作用，使保存的生物膜的生长因子丢失率显著降低。

试验例2本发明的生物膜保存液不同保存时长对生物膜活性因子的保存效果

本实施例使用实施例2中制备的保存液，对3份样品进行保存，分别为A组(10℃保存2周)、B组(-20℃下保存半年)以及C组(-20℃下保存1年)。参照试验例1的方法，分别检测A组、B组和C组样品的表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、β1转化生长因子(TGF-β1)、神经生长因子(NGF)的含量，并计算A组、B组和C组样品中各生长因子含量与新鲜羊膜中各生长因子的含量的比值。具体结果如表1所示。

表1不同保存时长对生物膜活性因子的保存效果

从表1可以看出，使用本发明实施例2的保存液保存羊膜，10℃保存2周，活性因子保存率50％以上，-20℃下保存半年，活性因子保存率可达60％以上，-20℃下保存1年，活性因子保存率可达50％以上。说明本发明提供的保存液，可用于生物膜材料的长期保存，并且具有良好的保存效果。

试验例3使用本发明的生物膜保存液保存的生物膜经辐照后的变化

本试验例分别检测了使用常规生物膜保存液(DMEM和甘油体积比为1:1的混合液，记为对照组CK)、对比例1～3(分别记为对照组1、对照组2、对照组3)及本发明实施例1～3(分别记为实验组1～3)的生物膜保存液，保存的羊膜经辐照后的变化。

具体方法为：

(3)、去除羊膜的结缔组织与海绵层；

(4)、使用无菌组织缓冲液及抗生素平衡液进行处理；

(5)、将处理后的羊膜裁剪成适度大小、分别装至装有实施例1～3和对照组的生物膜保存液的容器中，密封保存；

(6)、转至-20℃的保温容器中，用辐照剂量为25kGy的γ射线进行辐照；

(7)、将各组样品置于10℃的恒温环境中，每周观察样品的颜色变化，2周后将样品从各生物膜保存液中取出，观察样品的颜色变化、柔韧性，测试其拉伸强度。

颜色变化结果如图2所示，从图2可以看出，实验组1、实验组2、实验组3以及对照组2中的样品，置于10℃的恒温环境中2周，其颜色基本没变化，和新鲜羊膜一致；而对照组CK、对照组1和对照组3样品肉眼可见变黄。

实验组1、实验组2、实验组3以及对照组2的样品的柔韧性，也基本和新鲜羊膜一致(图3所示)；而对照组CK、对照组1和对照组3的样品质地变硬，易撕裂。

通过电子万能试验机(型号：RGM-6002T)对各组样品进行拉伸强度测试，其结果显示实验组1、实验组2、实验组3以及对照组2中的样品的拉伸强度最优，其次为对照组3，对照组1，对照组CK最差(详见表2)。

表2各组样品拉伸强度测试(n＝5)

本试验例的结果表明，经辐照后，相比现有常规的保存液和对比例1、对比例3的保存液保存的生物膜，本发明实施例1～3以及对比例2的保存液保存的生物膜，性能更优越，具体表现在颜色、柔韧性及拉伸强度与新鲜羊膜几乎一致。这表明保存液中的含硫化合物能及时清除辐照时产生的自由基，避免自由基对生物膜的破坏，使生物膜维持新鲜羊膜的颜色、柔韧性及优越的拉伸强度，其中实施例2的保存液效果最优。

试验例4使用本发明的生物膜保存液保存的生物膜的临床使用效果

为了验证本发明的生物膜保存液保存后的生物膜的临床修复效果，使用兔角膜酸烧伤后无法完全自愈的动物实验模型，按照临床要求对生物羊膜产品进行模拟使用，对使用本发明提供的保存液保存后的生物膜产品性能、修复角膜创面的有效性进行检验。

1、建立动物模型

取12只新西兰兔(2±0.5kg)采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，右眼向上侧身固定，用剃须刀去除右眼周围绒毛和睫毛，用碘伏进行消毒处理。用奥布卡因对眼表进行局部麻醉，干滤纸吸去角膜上多余水分，用浸润了浓度为1mol/L的H₂SO₄溶液的直径约6mm的单层圆形滤纸，贴附于角膜中央区域表面，计时30秒除去滤纸。用干滤纸吸去角膜上多余酸液后用大量生理盐水冲洗5min。造模一周后观察创面愈合情况，去除烧伤较轻已自愈和过重烧伤角膜全层的模型，取中轻度烧伤。

自身修复能力不能使创面愈合的9个模型用于修复实验，随机分为3组，分别D组、E组和F组。D组所使用的羊膜为新鲜羊膜；E组所使用的羊膜为置于实施例2制备的保存液中，-20℃保存2周的羊膜；F组所使用的羊膜为置于对比例2制备的保存液中，-20℃保存2周的羊膜。

2、手术方法

手术操作均使用无菌手术器械，严格按照临床手术要求进行。

将烧伤模型(2±0.5kg)采用戊巴比妥钠静脉注射麻醉后，前后肢用绳子固定，手术洞巾包裹实验兔全身，用电动剃须刀将兔右眼周围绒毛去除干净，用碘伏进行消毒处理，尽量减少对手术过程和后期角膜修复的影响。手术部位为角膜酸烧伤模型创面区域，在显微镜下首先对受损部位进行清创，用宝石刀将坏死的角膜上皮、组织彻底清理干净。用生物羊膜(上皮面向上)平铺覆盖在整个角膜表面，接下来在整个角膜上(覆盖羊膜)覆盖一层隐形眼镜，将多余羊膜材料翻起包裹隐形眼镜边缘作为保护，防止缝线拉裂隐眼镜。用10-0尼绒线“米”字型缝合固定隐形眼镜8针。术后两周酌情更换羊膜材料。第四周后均完全去除羊膜及隐形眼镜。

3、术后评价

观察并拍照记录如下评价项目：

(1)、每天观察实验兔子的精神状态及活动情况、观察角膜修复情况。

(2)、评价方法：于术后1周、4周、8周观察各组兔子角膜浑浊度及角膜新生血管情况。综合评估使用本发明提供的保存液保存后的生物羊膜修复眼表有效性。

4、结果

结果如图4所示，D组、E组以及F组的实验兔子术后4周时已全部完成上皮化，但E组兔子角膜清晰透明，直接观察无明显瘢痕，D组和F组实验兔子的角膜有轻微瘢痕；术后8周时，E组兔子角膜清晰透明，直接观察无瘢痕，D组和F组实验兔子的角膜依旧有轻微瘢痕。术后8周时观察，E组无新生血管长入创面区域，D组和F组实验兔子角膜可见少量新生血管长入创面区域。

由此可见，使用本发明提供的保存液保存的生物羊膜，在临床使用时，具有抗瘢痕以及抑制新生血管的作用，且效果比新鲜羊膜和对比例2的保存液保存的生物羊膜的效果更好，说明本发明的保存液可赋予生物膜更好的治疗功效。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种生物膜保存液，其特征在于，包括以下组分：10~25 g/L硫酸软骨素、100~200mg/L稳定剂、5~50 g/L透明质酸钠、200~500 g/L甘油、0.1%~5% v/v 冷冻保护剂、5000~20000 ng/L含硫化合物、0.01~7 g/LHC-HA/PTX3复合物；所述含硫化合物为半胱氨酸、半胱胺、2-氨乙基硫代硫酸、硫脲中的至少一种；所述稳定剂为维生素C或SOD。

2.根据权利要求1所述的生物膜保存液，其特征在于，包括以下组分：14~16 g/L硫酸软骨素、100~120 mg/L稳定剂、15~25 g/L透明质酸钠、250~350 g/L甘油、1.5%~2.5% v/v 冷冻保护剂、8000~12000 ng/L含硫化合物、0.8~1.2 g/LHC-HA/PTX3复合物。

3.根据权利要求1或2所述的生物膜保存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为右旋糖酐或二甲基亚砜。

4.根据权利要求1所述的生物膜保存液，其特征在于，包括以下组分：14~16g/L硫酸软骨素、100~120 mg/L维生素C、15~25 g/L透明质酸钠、250~350 g/L甘油、1.5%~2.5% v/v二甲基亚砜、8000~12000 ng/L半胱氨酸、0.8~1.2 g/LHC-HA/PTX3复合物。

5.权利要求1~4任一项所述的生物膜保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所有组分加入到注射用水中混合均匀后，调节pH为7.2~7.4，渗透压为350~380 mOsm/L，即得。

6.权利要求1~4任一项所述的生物膜保存液在生物膜保存中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物膜为心包膜、羊膜或脐带来源组织。

8.一种生物膜的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜生物膜放入权利要求1~4任一项所述的生物膜保存液中，γ射线进行辐照，置于-20℃~10℃保存。

9.根据权利要求8所述的生物膜的保存方法，其特征在于，所述辐照剂量为15 kGy~45kGy，辐照时间为18~30 h。