CN101444202A - 一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用 - Google Patents

一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用 Download PDF

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吴亮
聂卫
种影影
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Abstract

一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用。本发明羊膜保存液含有：DMEM培养基9.0～12.0克、硫酸软骨素10.0～25.0克、透明质酸钠0.5～1.0克、HEPES 4.0～5.0克、右旋糖苷10.0～15.0克、庆大霉素1.0～6.0毫升、地塞米松24.0～30.0毫克、非必需氨基酸10.0～15.0毫升、还原型谷胱甘肽0.50～0.95克、胎牛血清0.0～50.0毫升、注射用水加至到1000毫升。其保存方法：经用钝器将羊膜分离，冲洗干净再经抗生素处理；剪裁装入有羊膜保存液的容器中；4℃冰箱保存，用时用无菌磷酸缓冲液冲洗干净，其优点1.只需在4℃冰箱保存，2.保存期至少延长20至30天，3.可批量处理，集中存放，4.各种羊膜移植修补术的应用，如①结膜替代物眼表重建，②羊膜移植治疗睑球粘连，③治疗各种原因的角膜溃疡等。

Description

一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用
技术领域：
本发明涉及来自羊膜的医用生物材料的保存方法及应用，特别是一种新鲜羊膜组织，经保存液的保存后，仍具有新鲜羊膜的特征，尤其适合于眼部疾病的修复和治疗的使用。
背景技术：
羊膜是人胎膜最内层的一种无血管、神经和淋巴管的具有一定韧性的半透明组织。羊膜作为一种医用生物材料，在临床曾用于治疗皮肤溃疡和眼部疾病的损伤等表皮损伤的修补，近年来，羊膜移植手术成为研究和应用的热点。羊膜移植手术作为眼表重建的新技术已广泛应用于临床，并取得了良好的临床效果。
羊膜移植用于眼表重建的临床效果与所选用的羊膜自身的结构是否完整及其活性因子的含量有着直接的关系。
目前临床上采用的羊膜为冻干羊膜、羊膜细胞外基质或是临时剥离处理的新鲜羊膜(现采现用的)，国外多采用预先处理过的羊膜，经深低温的方法保存，因其方法技术工艺复杂，保存成本过高，很难在临床上使用。有临床报道，证明低温冷冻保存的羊膜会导致羊膜中的生长因子活性降低与丧失现象。目前临床上所使用的新羊膜多取自新鲜胎盘，经无菌处理、迅速剥离获得的羊膜，立即用于患者眼部的羊膜移植手术。但是，由于接收羊膜和眼部疾患手术的治疗时间，不是在同一个时间点上，急需羊膜移植用于眼部手术时，往往找不到胎盘和费时的供体检测和严格的处理程序，而耽误了临床急诊患者治疗使用。新鲜羊膜的使用是一次性的，用量不大，但浪费极大。眼部的羊膜早期移植的愈后疗效与所采用的羊膜质量有着密切的关系。现存最大的问题，是新鲜羊膜的保存问题。
由于新鲜羊膜的保存问题得不到解决，直接影响羊膜在临床医学上的扩大应用，特别是羊膜移植术在眼表疾病的各个领域的应用。
发明内容：
本发明目的是为了解决新鲜羊膜的保存问题，提供一种保存新鲜羊膜的方法和配制保存新鲜羊膜保存液的配方及在临床上的应用。
为了解决新鲜羊膜的保存问题，本发明人经过多年的实验研究，获得了一种新鲜羊膜的保存方法，并配制了一种新鲜羊膜保存液，经保存液保存后的羊膜，仍具有新鲜羊膜的特性，在反复多次治疗眼表疾病的试验研究中，获得了理想的治愈效果。各项愈后指标，均达到新鲜羊膜治疗眼表疾病的理想效果。应用羊膜保存液的新鲜羊膜，保质期至少延长20至30天，解决了临床急需新鲜羊膜的保存问题，为广大眼部疾患病人的治疗、为医生的眼部疾病治疗的术式选择，提供了有效时间和可靠的物质保证，为临床扩大病种的推广使用，提供了有效的羊膜保鲜库，使新鲜羊膜的保存使用，做到科学合理、安全方便。
本发明提供的新鲜羊膜保存液的组成及含量为：以配置1000毫升为单位
1.DMEM培养基         9.0～12.0克
2.硫酸软骨素         10.0～25.0克
3.透明质酸钠         0.5～1.0克
4.HEPES              4.0～5.0克
5.右旋糖苷           10.0～15.0克
6.庆大霉素           1.0～3.0毫升
7.地塞米松           24.0～30.0毫克
8.非必需氨基酸       10.0～15.0毫升
9.还原型谷胱甘肽     0.50～0.95克
10.胎牛血清          20.0～50.0毫升
11.注射用水          加至1000毫升
将上述各物品按常规组织保存液的方法和程序配成羊膜保存液。
上述新鲜羊膜保存液的配制及各种物质的含量优选为：以配置1000毫升为单位
1.0DMEM培养基            9.0克
2.硫酸软骨素             10.0克
3.透明质酸钠             0.5克
4.HEPES                  4.0克
5.低分子右旋糖苷         10.0克
6.庆大霉素               1.0毫升(4万单位/毫升)
7.地塞米松               24.0毫克
8.非必需氨基酸           10.0毫升
9.还原型谷胱甘肽         0.50克
10.胎牛血清              20.0毫升
11.注射用水              加至1000毫升
将上述各物品按常规组织保存液的方法和程序配成羊膜保存液。
经以上方式和方法保存的新鲜羊膜，使用前将羊膜从新鲜羊膜保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学上各种表皮损伤重建。
本发明提供的新鲜羊膜的保存方法是通过以下步骤实现的：
第一、取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；
第二、用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；
第三、保留羊膜，再去除结缔组织及海棉层；
第四、将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；
第五、将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有以上配制的新鲜羊膜保存液的容器中；
第六、放入4℃冰箱冷藏保存，随用随取。
第七、使用前将羊膜从保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学中。
本发明所述的新鲜羊膜保存液保存的新鲜羊膜，用作临床医学中各种表皮损伤的修补和治疗的生物材料，特别是眼表疾病的各个领域的修补和治疗的生物材料。
本发明的优点和突出效果是：(1)新鲜羊膜经保存液的保存，只需在4℃冰箱保存。(2)新鲜羊膜保存期至少延长20至30天，其生物学特性无任何改变，羊膜上皮细胞活性染色显示细胞形态正常。(3)可行成批量处理，集中存放羊膜保鲜库的形式，满足临床扩大使用。(4)适用于临床上各种需要羊膜移植修补疾病的应用，尤其是采用羊膜移植手术用于眼表疾病患者，如1.作为结膜替代物用于眼表重建。2.羊膜移植治疗睑球粘连；3.治疗各种原因的角膜溃疡；4.联合角膜缘移植治疗角膜缘干细胞缺陷；5.作为角膜接触镜治疗角膜上皮缺损；6.治疗载体体外培养角膜缘干细胞后移植；7.用于抗青光眼手术。
附图说明
图1为经过本发明新鲜羊膜保存液保存30天后的电镜照片。
具体实施方式
实施例1：新鲜羊膜保存液的配制
精密称取配方中的各种物质，按照医学组织保存液的方法、操作程序，在无菌的状态下进行，注意保持保存液的适宜细胞生理需求的PH值(6.8-7.4)。可以是含有以下物质：
1.DMEM培养基            9.0克
2.硫酸软骨素            10.0克
3.透明质酸钠            0.5克
4.HEPES                4.0克
5.低分子右旋糖苷       10.0克
6.庆大霉素             1.0毫升(4万单位/毫升)
7.地塞米松             24.0毫克
8.非必需氨基酸         10.0毫升
9.还原型谷胱甘肽       0.50克
10.胎牛血清            20.0毫升
11.注射用水            加至1000毫升。
经过上述溶液保存30天后的电镜照片，如图1所示，该照片为保存新鲜羊膜30天4000倍的电镜照片，可见细胞形态完好，细胞长、扁平附着于基膜上，游离端大量微绒毛，胞质丰富，细胞核近圆形，核仁明显。
实施例2：
精密称取配方中的各种物质，按照医学组织保存液的方法、操作程序，在无菌的状态下进行，注意保持保存液的适宜细胞生理需求的PH值(6.8-7.4)。还可以是这种含量配比：
1.DMEM培养基            12.0克
2.硫酸软骨素            25.0克
3.透明质酸钠            1.0克
4.HEPES                 5.0克
5.低分子右旋糖苷        15.0克
6.庆大霉素              3.0毫升(4万单位/毫升)
7.地塞米松              30.0毫克
8.非必需氨基酸          15.0毫升
9.还原型谷胱甘肽        0.95克
10.胎牛血清             50.0毫升
11.注射用水             加至1000毫升
实施例3：
精密称取配方中的各种物质，按照医学组织保存液的方法、操作程序，在无菌的状态下进行，注意保持保存液的适宜细胞生理需求的PH值(6.8-7.4)。还可以是以下含量配制：
1.DMEM培养基             12.0克
2.硫酸软骨素             25.0克
3.透明质酸钠             1.0克
4.HEPES                  5.0克
5.低分子右旋糖苷         15.0克
6.(抗生素)庆大霉素       3.0毫升(4万单位/毫升)
7.地塞米松               30.0毫克
8.非必需氨基酸           15.0毫升
9.还原型谷胱甘肽         0.95克
10.注射用水              加至1000毫升。

Claims (4)

1、一种新鲜羊膜保存液，其特征是该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：
第一、DMEM培养基              9.0～12.0克
第二、硫酸软骨素              10.0～25.0克
第三、透明质酸钠              0.5～1.0克
第四、HEPES                   4.0～5.0克
第五、低分子右旋糖苷          10.0～15.0克
第六、庆大霉素                1.0～6.0毫升
第七、地塞米松                24.0～30.0毫克
第八、非必需氨基酸            10.0～15.0毫升
第九、还原型谷胱甘肽          0.50～0.95克
第十、胎牛血清                0.0～50.0毫升
第十一、注射用水              加至到1000毫升
将上述各物品按常规组织保存液的方法和程序配成羊膜保存液。
2、根据权利要求1所述的新鲜羊膜保存液，其特征是该新鲜羊膜保存液的组成及含量优选为：
第一、DMEM培养基              9.0克
第二、硫酸软骨素              10.0克
第三、透明质酸钠              0.5克
第四、HEPES                   4.0克
第五、低分子右旋糖苷          10.0克
第六、庆大霉素                1.0毫升
第七、地塞米松                24.0毫克
第八、非必需氨基酸            10.0毫升
第九、还原型谷胱甘肽          0.50克
第十、胎牛血清                20.0毫升
第十一、注射用水              加至到1000毫升
将上述各物品按常规组织保存液的方法和程序配成羊膜保存液。
3、一种使用权利要求1或2所述的新鲜羊膜保存液对新鲜羊膜的保存方法，其特征是通过以下步骤实现的：
第一、取健康剖宫产胎膜，胎膜在无菌环境中经无菌组织缓冲液或生理盐水冲洗干净；
第二、用钝器将胎膜的羊膜与绒毛膜剥离，去除绒毛膜；
第三、保留羊膜，再去除结缔组织及海棉层；
第四、将新鲜羊膜再经无菌组织缓冲液及抗生素平衡液处理；
第五、将新鲜羊膜裁剪成适度大小、分装、装入有以上配制的新鲜羊膜保存液的容器中；
第六、放入4℃冰箱冷藏保存，随用随取。
第七、使用前将羊膜从保存液中取出，用无菌磷酸缓冲液或生理盐水冲洗干净，即可应用于临床医学的羊膜修补术上。
4、由权利要求1或2所述的新鲜羊膜保存液保存的新鲜羊膜，用作临床医学中各种表皮损伤的修补和治疗的生物材料，特别是眼表疾病的各个领域的修补和治疗的生物材料。
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