RU2184448C2 - Раствор для хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту, способ хранения ткани роговицы - Google Patents

Раствор для хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту, способ хранения ткани роговицы Download PDF

Info

Publication number
RU2184448C2
RU2184448C2 RU98119956/14A RU98119956A RU2184448C2 RU 2184448 C2 RU2184448 C2 RU 2184448C2 RU 98119956/14 A RU98119956/14 A RU 98119956/14A RU 98119956 A RU98119956 A RU 98119956A RU 2184448 C2 RU2184448 C2 RU 2184448C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hyaluronic acid
cornea
solution
corneal
cells
Prior art date
Application number
RU98119956/14A
Other languages
English (en)
Other versions
RU98119956A (ru
Inventor
Диего Понцин
Original Assignee
ФИДИА С.п.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ФИДИА С.п.А. filed Critical ФИДИА С.п.А.
Publication of RU98119956A publication Critical patent/RU98119956A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2184448C2 publication Critical patent/RU2184448C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Роговицу глаза хранят в растворе, который включает гиалуроновую кислоту с молекулярной массой от 50000 до 15000 Да и ее фармацевтически приемлемую соль в концентрации от 1 до 20 мг/мл, дополнительно может включать антибиотик из группы гентамицина, пенициллина G и стрептомицина, при этом хранение производят при температуре раствора 2-8oС. Изобретение позволяет производить хранение роговицы глаза эффективно, просто и недорого. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

Целью настоящего изобретения является улучшение и упрощение хранения роговиц, предназначенных для проникающей кератопластики, в течение времени между удалением от донора и трансплантацией, за счет использования рецептур жидкостей для хранения, содержащих гиалуpoновую кислоту.
Проникающая кератопластика широко используется для восстановления зрения при ряде заболеваний роговицы. В случае выраженной дистрофии роговицы, воспаления или дегенеративного процесса проникающая кератопластика является единственным эффективным лечением для восстановления зрения. Главной проблемой в таком лечении является способ, используемый для консервирования жизнеспособной ткани роговицы после ее удаления у донора.
Роговица представляет собой аваскулярную ткань с хорошо выраженной организацией толщиной 1 мм на периферии и 0,5 мм в центре. Часть, подвергаемая действию внешней окружающей среды, покрыта слоистым некератинизованным эпителием, образованным 3-4 слоями уплощенных чешуйчатых клеток, 1-3 слоями мидэпителиальных клеток и единственным слоем цилиндрических базальных клеток, связанных с базальной мембраной и лежащей ниже стромой за счет комплекса адгезии. При хранении роговицы эпителий может быть потерян, но если базальная мембрана не повреждена, то реэпителизация после трансплантации обычно является быстрой. Строма организована в три четких слоя экстрацеллюлярной матрицы. Начиная от эпителия, она включает тонкий слой Боумана, среднюю слоистую строму и базальную мембрану (мембрана Десцемета (Descemet)), генерируемую клетками эндотелия, расположенными на стороне ткани, обращенной к водянистой влаге. Другие части стромы продуцируются и поддерживаются фибробластами стромы, плоскими клетками, обычно называемыми термином кератоциты.
Из-за присутствия солей, коллагена и протеогликанов, строма является гипертонической по отношению как к слезам, так и к водянистой влаге. Вода в меньшей степени концентрируется на эпителиальной стороне, вероятно, из-за сухости в эпителиальных слоях. Аналогично глюкоза меньше концентрируется на эпителиальной стороне из-за того, что этот метаболит вытекает из водянистой влаги для использования большей частью эпителием. Строма содержит протеогликаны (дерматан и сульфат кератана) с большей концентрацией первого из них на эпителиальной стороне, а второго на эндотелиальной стороне. Эндотелий роговицы представляет собой единственный слой из кубоидального эндотелия, образующего гексагональную мозаику, лежащую на мембране Десцемета, если смотреть со стороны передней камеры глазного яблока. Гексагональные клетки связаны между собой прочным соединением, которое, однако, не образует полной герметизации вокруг клеток. Скорее они сконцентрированы в клеточной апикальной мембране. Целостность соединения зависит от присутствия Са2+ в окружающей среде. Подобная организация позволяет водянистой влаге и ее растворимым компонентам иметь доступ к параклеточному пространству. При нормальных условиях за отеком роговицы не следует приток жидкости, потому что эквивалентный объем жидкости активно удаляется комплексом откачки эндотелия. Na+-K+ АТФ является существенной частью такой системы откачки, требующей поэтому продуцирования АТФ за счет метаболической активности эндотелиальных клеток.
Для полной оценки функции эндотелиальных клеток представляет интерес наблюдение, что эти клетки имеют на стороне, обращенной к водянистой влаге, член семейства иммуноглобулинов, ICAM-1 (молекула межклеточного слипания-1), который служит сорецептором для работоспособности LFA-1 (αL,β2), расположенного на поверхности лейкоцита. ICAM-1 может также функционировать как рецептор гиалуроновой кислоты (McCourt, P.A.G. et al (1994) J.Biol. Chem., 269, 30081-30084). Это указывает на то, что эндотелиальные клетки взаимодействуют с лейкоцитами, когда те достигают водянистой влаги. Это также может указывать на то, что при нормальных условиях и в отсутствие лейкоцитов гиалуроновая кислота связывается с этим рецептором для предохранения целостности эндотелиального слоя.
Отек роговицы: при потере функции откачки эндотелием гипертоничность стромы вызывает отек ткани роговицы. Отек приводит к увеличению толщины роговицы и уменьшает ее прозрачность. Кроме того, наблюдается потеря протеогликанов из стромы в окружающую среду. Потеря эндотелиальной функции является следствием патологии (например, дистрофии, дегенерации, глаукомы). Старение может приводить к эндотелиальной декомпенсации вследствие того, что эндотелиальные клетки ухудшаются с возрастом (примерно 50% с момента рождения до старости). Поскольку эндотелиальные клетки имеют ограниченную регенеративную способность, повреждение целостности эндотелия может быть скомпенсировано только увеличением остаточных клеток, которые становятся тоньше. Повреждение эндотелия является также главным риском при хранении роговицы перед трансплантацией. Это приводит к отеку роговицы с потерей прозрачности и смерти прогрессивной эндотелиальной клетки. Сохранность целостности эндотелиального слоя является действительно главной целью в заявляемых способах для сохранения роговицы перед проникающей кератопластикой.
Хранение роговицы: целые глазные яблоки от донора могут храниться во влажной камере при 4oС, но их следует использовать в течение 24 ч. Успешно используется консервирование роговицы в замороженном состоянии (Kaufman Н.Е. and Capella J.A. (1968) J.Cryosurg., 1, 125-129). Перед замораживанием роговицы обрабатывают увеличенными концентрациями ДМСО и сахарозы, чтобы предотвратить образование межклеточного льда. Трудности при обработке и транспортировке замороженных роговиц при постоянной низкой температуре не дают широкого распространения такого способа. Альтернативно роговица может храниться при 37oС в органической культуральной среде (Doughman D.J. et al., (1976) Trans. Am. Acad. Ophtalmol. Otolaringol. , 81, 778-793). Поскольку культуральная среда дополняется сывороткой для оптимального сохранения клеток, этот метод имеет своим недостатком то, что глаз реципиента подвергается действию остаточного количества сыворотки, переносимой на роговице в момент трансплантации. Животная сыворотка может вызывать иммунный ответ, тогда как человеческая сыворотка может передавать вирусные заболевания.
В настоящее время большинство общепринятых способов для сохранения роговицы оказываются способами краткосрочного хранения в свободной от сыворотки среде при 4oС. При этой температуре метаболическая активность эндотелиальных клеток является минимальной. Таким образом, теряется функция откачки.
Отек роговицы может предотвращаться посредством добавления удерживающих воду соединений в среду для хранения. Среди них одним из наиболее используемых является декстран или сам по себе (McKarey B.E. and Kaufman H.E. (1974) Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.l3, 165) или в комплексе с глюкозаминогликан хондроитин сульфатом (Kaufman H. E. et al.,(1991) Arch.Ophthalmol. 109, 864-868). Однако хондроитин сульфат является гетерогенным соединением из-за различного распределения сульфатных молекул в полимере (Scott, 1995). В результате композиции используемые для хранения роговицы могут варьироваться для различных серий. Кроме того, за счет сульфатных молекул хондроитин сульфат несет сильный отрицательный заряд.
Недавно было выдвинуто предположение, что такой сильный отрицательный заряд является вредным при хранении роговицы, потому что сильный отрицательный заряд уменьшает адгезионную способность эндотелия роговицы (Chen et al., 1996). Далее сообщалось, что хондроитин сульфат может проникать в роговицу и вызывать ее отек, особенно при нагревании ткани от 4oС до комнатной температуры перед трансплантацией (Kaufman et al., 1991). При попытке снизить отек роговицы, вызываемый хондроитин сульфатом, составлялись композиции для хранения роговицы, содержащие такие удерживающие агенты, как декстран, в комбинации с хондроитин сульфатом (ЕР 0 517 972). Однако декстран может проникать в строму при хранении и может увеличивать давление при отеке при подогревании. Кроме того, в настоящее время также ясно, что декстран может быть токсичным для роговицы, вызывая физиологическое старение и вырождение (Chen et al., 1996).
Ogino с сотр. (Mokugan Zen-shi, Воздействие вновь созданных сред для хранения роговицы на эндотелий роговицы - Морфологическое исследование методом сканирующей электронной микроскопии, 1995) описал среды для хранения, содержащие гиалуроновую кислоту (ГК). Но гиалуроновая кислота, использованная Ogino и др., имела молекулярную массу 800 000. ГК с такой высокой молекулярной массой является слишком вязкой, чтобы она была подходящей в качестве компоненты среды для хранения, и ее нужно использовать в комбинации с другими водоудерживающими компонентами для предотвращения отека роговицы без увеличения вязкости раствора.
Следовательно, задачей настоящего изобретения является создание жидкости для хранения роговицы, способной обеспечить подходящие условия хранения для жизнеспособной роговицы, при исключении недостатков предшествующих жидкостей.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение, следовательно, относится к композиции жидкости для роговицы, включающей гиалуроновую кислоту, и использованию рецептуры, включающей гиалуроновую кислоту, которая является подходящей для хранения жизнеспособной роговицы при низкой температуре, особенно между 2-8oС. Изобретение основано на следующих предположениях, которые согласуются с исследованием организации и функционирования роговицы, обсуждавшимся выше:
(i) при хранении роговиц при низких температурах метаболическая активность эндотелиальных клеток гасится. Таким образом, факторы питания и роста (сыворотка или другие) не являются необходимыми. Функция откачки не осуществляется и не нуждается в поддержании;
(ii) cбалансированный солевой раствор, дополненный водоудерживающим соединением, должен быть достаточным для поддержания целостности роговицы. Если единственное водоудерживающее соединение является подходящим, то другие соединения, такие как декстран, не являются более необходимыми;
(iii) защитная пленка поверх эндотелиальных клеток необходима для предотвращения их повреждения во время хранения. Природный лиганд, способный ассоциироваться с сорецептором ICAM-1, кажется подходящим.
Как подчеркивается ниже, гиалуроновая кислота была идентифицирована в качестве подходящего соединения, удовлетворяющего требованиям оптимального хранения роговицы при низких температурах.
Гиалуроновая кислота принадлежит к группе глюкозаминогликанов, которая также включает соединения, содержащие сульфатные группы (хондроитины, кератаны и гепараны). Как следствие различного распределения сульфатных остатков эта группа глюкозаминогликанов представляет собой гетерогенную совокупность различных молекул. Напротив, гиалуроновая кислота содержит только дисахаридное звено N-ацетил-глюкозамина и глюкуронат. Таким образом, гиалуроновая кислота представляет собой гомогенное соединение с определенной первичной структурой: прямые цепи, содержащие сотни дисахаридных звеньев и сотни анионов, зафиксированных в каждой цепи (карбоксилатные группы).
Недавно для гиалуроновй кислоты была установлена упорядоченная вторичная структура (Scott J.E. (1995) Eur.J.Rheumatol.Inflamm. 15, 3-8). Она поддерживается интенсивными водородными связями между звеньями сахаров и двухмерной спиральной структурой, образующейся при повороте на 180o между дисахаридными звеньями. Вторичная структура дает значительные гидрофобные участки в цепях гиалуроновой кислоты для примерно 8СН звеньев (длина короткой цепи жирной кислоты), которые способны ассоциироваться с мембранными фосфолипидами и другими липидами. Действительно положительный эффект гиалуроновой кислоты при воспалителении суставов может быть результатом ее ассоциации с липидоподобными воспалительными цитокинами, такими как тромбоцит-активирующий фактор.
При разбавленных концентрациях гиалуроновой кислоты в водной среде (1 мкг/мл или более) образуется трехмерная структура (Scott J.E. et al., (1991) Biochem. J. 274, 699-705). Она представляет собой сотовидную сетчатую структуру, образованную за счет агрегации цепей гиалуроновой кислоты, устанавливающих динамические контакты между всеми молекулами гиалуроновой кислоты. Сетчатая структура захватывает внутрь воду и растворенные вещества, таким образом ограничивая их взаимодействие с внешней окружающей средой. Клетки с рецепторами для гиалуроновой кислоты могут закреплять большую сетчатую структуру вокруг себя. Это может иметь защитный эффект, предотвращая проникновение в клетки химических соединений. Представляет интерес наблюдение, что такая организация становится менее компактной и может действительно разрываться под действием свободных ОН радикалов, которые вызывают деградацию цепей гиалуроновой кислоты. В заключение свойства гиалуроновой кислоты, относящиеся к настоящему изобретению и служащие в целях поддержания жизнеспособной роговицы, являются следующими:
1. Присутствие фиксированных анионов в цепях гиалуроновой кислоты, действующих как растворимый катионообменник и, следовательно, ограничивающих движение одновалентных и двухвалентных катионов к ткани роговицы.
2. Присутствие гидрофобных частей во вторичной структуре цепей гиалуроновой кислоты, позволяющее соединению контактировать и защищать гидрофобные сайты, возможно оставленные незащищенными от воздействия в клеточной мембране.
3. Образование сети цепей гиалуроновой кислоты, охватывающей воду и растворенные вещества и обеспечивающей максимальный водоудерживающий эффект.
4. Взаимодействие с ICAM-1, сосредоточенным на поверхности эндотелиальных клеток, обеспечивающее образование защитной пленки гиалуроновой кислоты вокруг самих клеток.
В принципе эти свойства являются достаточными для обеспечения защиты эндотелиальных клеток при низких температурах и для того, чтобы избежать отека роговицы. Поскольку гиалуроновая кислота высокой молекулярной массы (1 000 000 Да или более) образует вязкие растворы, следует использовать гиалуроновую кислоту более низкой молекулярной массы. В частности, гиалуроновая кислота должна иметь среднюю молекулярную массу менее примерно 600 000, предпочтительно она имеет среднюю молекулярную массу в пределах интервала от 50 000 до 250 000 Да, наиболее предпочтительно в пределах интервала от 50 000 до 150 000 Дальтон. При таком молекулярном размере все еще образуется сетчатая структура гиалуроновой кислоты, хотя ее организация может быть менее компактной.
Для медицинских растворов, включаемых в настоящее изобретение, гиалуроновые кислоты могут быть получены из нескольких источников. Например, гиалуроновая кислота может быть очищена из обычных источников, таких как петушиные гребни, с использованием способов, описанных в ЕР 0 138 572. Альтернативно гиалуроновая кислота может быть получена ферментативным способом, как описано в WO 95/04132, или путем энзиматического синтеза с использованием очищенного протеинового фактора, содержащего гиалуронат синтазу, как описано в WO 95/24497.
Примеры композиций
Свободный от сыворотки медицинский раствор, предлагаемый в настоящем изобретении, должен содержать:
1. Сбалансированный раствор электролита, забуференный до рН 7,2-7,4 с помощью фосфата, бикарбоната и HEPES (гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновая кислота). В целях изобретения минимальная незаменимая среда (например ТС 199, такая как доступная от Gibco BRL, Maryland; Signa, Missouri; Flow Laboratories, Maryland) является удовлетворительной. Эта среда широко используется при культивировании тканей и содержит в своем составе незаменимые неорганические соли, аминокислоты, витамины и предшественники АТФ.
2. Антибиотики такие как, но не ограничиваясь ими, гентамицин, стрептомицин, пенициллин G и их комбинации для предотвращения микробного загрязнения.
3. Натриевая соль гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 50000-150000 Да, добавленная от 1 до 20 мг/мл, 0,1 до 2% мас./объем, исходя из общего раствора.
Вариации могут быть сделаны при выборе солевого буферного раствора и антибиотиков. Эта простая композиция будет достаточной для удовлетворения всех требований оптимального хранения роговицы при низких температурах в течение по крайней мере недели.
Биологические оценки
1. Материалы и методы
Композиция свободной от сыворотки среды, включающей натриевую соль гиалуроновой кислоты, описана в таблице 1 в сравнении с коммерчески доступными средами для хранения роговицы, содержащими хондроитин сульфат и декстран (Optisol-GS) или один декстран (McKarey-Kaufman).
Парные человеческие глаза донора были удалены в течение 9-10 ч после смерти. Роговицы отделялись от глазных яблок с 2 мм ободком склеры и испытывались на жизнеспособность эндотелиальных клеток, плотность эндотелиальных клеток, толщину роговицы и прозрачность. Жизнеспособность эндотелиальных клеток оценивалась путем окрашивания с 0,3% трипаном синим. Смерть клеток обычно распределяется по двум видам: регулярный массив окрашенных клеток, соответствующих слоям, образующимся при механическом давлении на роговицу во время удаления, и диффузная смертность, указывающая на метаболическую дисфункцию эндотелиальных клеток. Анализ завершали в конце каждого эксперимента путем окрашивания ализариновым красным для оценки клеточной морфологии и площади мембраны Десцемета, не покрытой эндотелием. Смерть клеток выражали как процент окрашенных клеток по отношению к общему количеству клеток. Плотность эндотелиальных клеток оценивали, подсчитывая клетки в 5 областях центральной части роговицы с использованием оптического микроскопа с установленной 10 х 10 мм квадратной окулярной шкалой. Когда смертность клеток была менее 2% и число эндотелиальных клеток было >2000 мм2, роговицы рассматривались как подходящие для трансплантации. Толщина роговицы измерялась посредством вертикального микроскопа, установленного с цифровым микрометром для оценки расстояния между эпителием и эндотелием. Для каждой роговицы получали три главных показания. Прозрачность оценивалась с использованием вертикального микроскопа и сортировалась следующим образом: оценка 3 - превосходная; оценка 2 - хорошая с некоторой нерегулярностью в мембране Десцемета; оценка 1 - неудовлетворительная из-за отека стромы или выраженных нерегулярностей в мембране Десцемета. После анализа роговицы погружали в среду для хранения при 4oС до последующих испытаний на сохранность или до использования для проникающей кератопластики.
Исследования in vitro: эти эксперименты осуществляли с хорошо сохранившейся донорской роговицей, не подходящей для трансплантации по донорским противопоказаниям или заболеваниям.
Парные глаза человека-донора удаляли в течение 10 ч после смерти. Роговицы удаляли с глазных яблок с 2 мм ободком склеры и испытывали на жизнеспособность эндотелиальных клеток, плотность эндотелиальных клеток, толщину роговицы и прозрачность. Жизнеспособность эндотелиальных клеток оценивали путем окрашивания с 0,3% трипаном синим. Смерть клеток обычно распределяется по двум видам: регулярный массив окрашенных клеток, соответствующих слоям, образующимся при механическом давлении на роговицу во время удаления, и диффузная смертность, указывающая на метаболическую дисфункцию эндотелиальных клеток. Анализ завершали в конце каждого эксперимента путем окрашивания ализариновым красным для оценки клеточной морфологии и площади мембраны Десцемета, не покрытой эндотелием. Смерть клеток выражали как процент окрашенных клеток по отношению к общему количеству клеток. Плотность эндотелиальных клеток оценивали, подсчитывая клетки в 5 областях центральной части роговицы с использованием оптического микроскопа с установленной 10 х 10 мм квадратной окулярной шкалой.
Смертность клеток выше 10% и прозрачность с оценкой 1 рассматривались как несовместимые с экспериментом. Толщина роговицы измерялась посредством вертикального микроскопа, установленного с цифровым микрометром для оценки расстояния между эпителием и эндотелием. Для каждой роговицы получали три главных показания. Прозрачность оценивалась с использованием вертикального микроскопа и сортировалась следующим образом: оценка 3 - превосходная; оценка 2 - хорошая с некоторой нерегулярностью в мембране Десцемета; оценка 1 - неудовлетворительная из-за отека стромы или выраженных нерегулярностей в мембране Десцемета. После анализа роговицы хранили в 10 мл испытываемой среды (натриевая соль гиалуроновой кислоты, Optisol-GS или McKarey-Kaufman) при 4oC в течение 7-14 дней.
Клинические исследования
Неконтролируемые открыто меченные исследования осуществляли с использованием роговицы, оцененной, как описано выше и хранившейся в среде, содержащей гиалуроновую кислоту. Роговицы, хранившиеся в среде Optisol-GS, служили контрольными. Донорам было от 46 до 86 лет. Их роговицы, собранные в промежуток времени от 2 до 9 ч после смерти, были в превосходных условиях сохранности согласно оценке прозрачности, толщины, жизнеспособности эндотелиальных клеток (отсутствие клеток положительных по трипану синему) и плотности (2200-3000 клеток/мм2). Время хранения при 4oС составляло 25-96 ч (смотри таблицу 2). Роговицы нагревали до комнатной температуры во время трансплантации. Всего было отобрано 16 реципиентов, нуждающихся в проникающей кератопластике по причине кератоконуса, буллезной кератопатии, дистрофии Гроеноу (Groenow), приобретенной дистрофии эндотелия и лейкомы. Оперативный и послеоперационный уход были одинаковыми во всех случаях. Через две недели для трансплантата записывали степень реэпителиализации, прозрачность роговицы, толщину (измеренную ультразвуковой пахиметрией) и эндотелиальную клеточную плотность (оцененную анализом с фиксированной рамкой отражающих фотографий). Пациенты дополнительно обследовались через два месяца.
2. Результаты
Исследования in vitro: пять пар роговиц хранили или в среде McKarey-Kaufman, Optisol-GS или в среде натриевой соли гиалуроновой кислоты. Прозрачность, толщину и смертность эндотелиальных клеток оценивали через 3, 7 или 14 дней, данные представлены в таблице 3. Превосходная сохранность роговицы наблюдалась в Optisol-GS и в среде гиалуроновой кислоты. Даже через 14 дней потеря эндотелиальных клеток не превышала 7%. Окрашивание ализарином красным и трипаном синим через 7 дней подтвердило целостность эндотелия. В соответствии с этим прозрачность роговицы и толщина хорошо сохранялись. Напротив, среда McKarey-Kaufman была менее эффективной. Прозрачность начинала пропадать через 3 дня, тогда как толщина увеличивалась до максимума в 40% через 7 дней. Потери эндотелиальных клеток достигали 22-25% через 14 дней. Эти результаты подтвердили слабую способность декстрана служить консервантом роговицы и указывают на большую эффективность как хондроитина сульфата, так и натриевой соли гиалуроновой кислоты. Натриевая соль гиалуроновой кислоты, однако, была способна достигать удовлетворительной сохранности роговицы в отсутствии декстрана, который требуется в среде Optisol-GS. Как констатировано выше, декстран может проникать в ткань роговицы и может увеличивать давление отека при подогревании.
Клинические исследования: группе из восьми пациентов, назначенных на проникающую кератопластику, была пересажена роговица, хранившаяся в среде гиалуроновой кислоты, параллельной группе из восьми пациентов пересадили роговицу, хранившуюся в Optisol-GS. Реэпителиализация роговицы завершалась через 3 дня после хирургического вмешательства. Через две недели прозрачность и толщина роговицы хорошо сохранялись. Анализ плотности эндотелиальных клеток осуществляли для 10 пациентов и он подтвердил эффективность этих двух сред. Все трансплантаты были в хороших условиях через два месяца, когда они продемонстрировали реэпителиализацию и прозрачность с оценкой 3 (таблица 4).
Выводы
В общем результаты проведенного исследования продемонстрировали, что гиалуроновая кислота представляет собой эффективный агент для консервации роговицы, даже в отсутствие других веществ в среде для хранения. Ее главным преимуществом является эффективность в отсутствии других добавок к среде для хранения. Это делает композицию среды простой и недорогой, исключающей сложные питательные смеси. Кроме того, отсутствие лабильных компонентов, таких как пептиды или протеины (факторы роста), увеличивает стабильность среды при хранении и предотвращает образование продуктов деградации. Дополнительное преимущество среды гиалуроновой кислоты заключается в консервировании тонкой ткани во время хирургического вмешательства. Это позволяет обеспечивать точную оценку состояния ткани и более легкое обращение с ней во время трансплантации.
Изобретение описано таким образом, но будет очевидно, что оно может варьироваться различными способами. Такие изменения не следует рассматривать как отход от духа изобретения и выход за объем притязаний, и предполагается, что все такие модификации, которые очевидны для специалиста в данной области, включаются в рамки следующих пунктов формулы изобретения.

Claims (6)

1. Раствор для хранения роговицы, который включает гиалуроновую кислоту, имеющую среднюю молекулярную массу от 50000 до 150000 Да или ее фармацевтически приемлемую соль в концентрации от 1 до 20 мг/мл.
2. Раствор для хранения роговицы по п. 1, который дополнительно включает сбалансированный раствор электролита и, по крайней мере, один антибиотик.
3. Раствор по п. 2, в котором рН раствора сбалансированного электролита равен 7,2-7,4.
4. Раствор по п. 3, в котором антибиотик представляет собой, по крайней мере, один член, выбранный из группы, состоящей из гентамицина, пенициллина G и стрептомицина.
5. Способ хранения ткани роговицы, который включает воздействие на ткани роговицы раствором по любому из пп. 1-4.
6. Способ по п. 5, в котором указанный медицинский раствор поддерживают при температуре 2-8oС.
RU98119956/14A 1996-04-04 1997-04-04 Раствор для хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту, способ хранения ткани роговицы RU2184448C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT96PD000084A IT1287227B1 (it) 1996-04-04 1996-04-04 Acido ialuronico quale componente del liquido di conservazione della cornea
ITPD96A000084 1996-04-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU98119956A RU98119956A (ru) 2000-09-20
RU2184448C2 true RU2184448C2 (ru) 2002-07-10

Family

ID=11391368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98119956/14A RU2184448C2 (ru) 1996-04-04 1997-04-04 Раствор для хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту, способ хранения ткани роговицы

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6838448B2 (ru)
EP (1) EP0891133B1 (ru)
JP (1) JP2000508637A (ru)
CN (1) CN1128574C (ru)
AT (1) ATE281761T1 (ru)
AU (1) AU732648B2 (ru)
BR (1) BR9708502A (ru)
CA (1) CA2251032A1 (ru)
DE (1) DE69731525T2 (ru)
ES (1) ES2234013T3 (ru)
HK (1) HK1018583A1 (ru)
IT (1) IT1287227B1 (ru)
RU (1) RU2184448C2 (ru)
WO (1) WO1997037537A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11154052B2 (en) 2018-09-14 2021-10-26 University Of Miami Dual-chamber vial for corneal graft preservation

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7507723B2 (en) 2000-07-07 2009-03-24 Seikagaku Corporation Hyaluronic acid oligosaccharide fractions and drugs containing the same
AU2002214443B2 (en) * 2000-11-03 2005-12-15 Vitrolife Ab Evaluation and preservation solution
RU2308954C2 (ru) * 2002-05-09 2007-10-27 Медиджинез Фармацевтическая композиция для лечения ран, содержащая плазму или сыворотку крови
WO2005056763A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 University Of Utah Research Foundation Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue
BRPI0400935A (pt) * 2004-04-02 2005-11-22 Ernesto Rodriguez Salas Solução para conservação de membranas biológicas e seu uso
WO2006110552A2 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 Cleo Cosmetic And Pharmaceutical Co., Llc Composition and method for in vitro preservation of corneal tissues
US7323184B2 (en) * 2005-08-22 2008-01-29 Healagenics, Inc. Compositions and methods for the treatment of wounds and the reduction of scar formation
US20140371771A1 (en) * 2006-09-05 2014-12-18 Amo Development, Llc. System and method for resecting corneal tissue
DE102006049580A1 (de) * 2006-10-20 2008-04-24 Rochel, Michael, Dr. med. Topische Zusammensetzung zur Behandlung von Ekzemen
US20080141628A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Bausch & Lomb Incorporated Packaging Solutions
US20100120013A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-13 Mb Research Laboratories, Inc. Procedure for long term corneal culture
FR2948286B1 (fr) * 2009-07-27 2011-08-26 Jean-Noel Thorel Composition injectable associant un agent de comblement et un milieu de croissance des fibroblastes
RU2498570C1 (ru) * 2012-05-03 2013-11-20 Государственное бюджетное учреждение "Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан" Раствор для хранения роговицы
CN104094925B (zh) * 2014-07-18 2015-11-18 广州优得清生物科技有限公司 一种板层角膜保存液
CN105284788B (zh) * 2015-11-20 2017-11-07 厦门大学 一种角膜中期保存液及其制备方法
CN106135197B (zh) * 2016-07-04 2018-03-02 拜欧迪赛尔（北京）生物科技有限公司 一种无血清成分的眼角膜中期保存液
RU2690153C2 (ru) * 2017-06-28 2019-05-31 Альвина Давидовна Мусина Способ асептического пролонгированного хранения и транспортировки аллогенных имплантатов, донорских тканей, на примере донорской роговицы, в специальном контейнере с наномодифицированной поверхностью
EP4368021A1 (en) * 2022-11-10 2024-05-15 AL.CHI.MI.A. S.r.l. Preservation solution, preservation system and method for preserving bioological tissues in vitro, in particular corneal tissues
EP4368020A1 (en) * 2022-11-10 2024-05-15 AL.CHI.MI.A. S.r.l. Preservation solution, preservation system and method for peserving bioological tissues

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1229075B (it) * 1985-04-05 1991-07-17 Fidia Farmaceutici Medicamenti per uso topico, ottenuti tramite l'impiego dell'acido ialuronico
DE3482812D1 (de) * 1983-10-11 1990-08-30 Fidia Spa Fraktionen von hyaluronsaeure mit pharmazeutischer aktivitaet, verfahren zu deren herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
CA2041828A1 (en) 1990-03-05 1992-11-04 Richard L. Lindstrom Viscoelastic solution
JPH06107538A (ja) * 1992-03-31 1994-04-19 Shiseido Co Ltd 角膜移植用眼球保存液

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAUFMAN H.E. et. al. Arch. Ophtalmol., 1991, v. 109, р. 864-868. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11154052B2 (en) 2018-09-14 2021-10-26 University Of Miami Dual-chamber vial for corneal graft preservation

Also Published As

Publication number Publication date
DE69731525D1 (de) 2004-12-16
DE69731525T2 (de) 2005-10-20
CN1128574C (zh) 2003-11-26
WO1997037537A1 (en) 1997-10-16
AU732648B2 (en) 2001-04-26
BR9708502A (pt) 1999-07-03
EP0891133A1 (en) 1999-01-20
ITPD960084A0 (it) 1996-04-04
US6838448B2 (en) 2005-01-04
ATE281761T1 (de) 2004-11-15
US20010009908A1 (en) 2001-07-26
HK1018583A1 (en) 1999-12-30
CN1215306A (zh) 1999-04-28
AU2508797A (en) 1997-10-29
EP0891133B1 (en) 2004-11-10
JP2000508637A (ja) 2000-07-11
ES2234013T3 (es) 2005-06-16
IT1287227B1 (it) 1998-08-04
CA2251032A1 (en) 1997-10-16
ITPD960084A1 (it) 1997-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2184448C2 (ru) Раствор для хранения роговицы, включающий гиалуроновую кислоту, способ хранения ткани роговицы
EP0517972B1 (en) Define serum-free medical solution and use thereof
KR101344602B1 (ko) 눈의 처치를 위한 안과용 조성물 및 방법
US5104787A (en) Method for apparatus for a defined serumfree medical solution useful for corneal preservation
US4971955A (en) Protection of human and animal cells during surgical trauma
JP2008520671A5 (ru)
US5166048A (en) Protection of human corneal endothelial cells
JPH057619A (ja) 血清不含医療用規定溶液およびその溶液を用いた角膜の保存方法
AU2486201A (en) Corneal storage fluid comprised of hyaluronic acid
CA2044494C (en) Methods and apparatus of a defined serumfree medical solution
Dropcova et al. The influence of some organic compounds used for the preparation of eye drops on the hydration of the cornea a histochemical study

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20050405