CN102132697A - 一种羊膜长期保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种羊膜长期保存液，其特征在于：以1000ml保存液计，包括的组分为增稠剂10g～200g，血容量扩充剂10g～50g，氨基酸5ml～20ml，抗生素5ml～20ml，酸碱调节剂10ml～50ml，细胞稳定剂5ml～30ml，细胞营养成分5ml～20ml，培养液860ml-970ml。其制造方法为，将增稠剂、氨基酸，抗生素，血容量扩充剂，细胞稳定剂，细胞营养成分加入培养液混合均匀，用酸碱调节剂1％～5％调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得羊膜长期保存液。
Description
技术领域
本发明涉及一种羊膜保存液，尤其是一种羊膜长期保存液及其制备方法。
背景技术
羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。羊膜在促进上皮修复、愈合及分化，抑制炎症，抗新血管生成，抑制纤维化及瘢痕化，防止睑球粘连等眼科多个领域发挥着重要的作用。随着羊膜用量的不断增加，羊膜的保存，尤其是羊膜活性成分的保存，成了当前眼科界研究的一个热点。
现在使用较为普遍的羊膜保存液为DMEM和甘油混合液(体积比为DMEM∶甘油＝1∶1)，将羊膜片放入装有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置-70℃冰箱保存备用，该保存液会使羊膜上皮细胞形态有所改变，代谢酶活性和生长因子的表达有所降低，但过快的降温会造成细胞水肿，发生老化及功能减退，影响羊膜的品质。
申请号为200710150436.9、公开号为CN101444202A的专利申请公开了“一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用”，该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：DMEM培养基9.0-12.0克，硫酸软骨素10.0-25.0克，透明质酸钠0.5-1.0克，HEPES4.0-5.0克，右旋糖苷10.0-15.0克，庆大霉素1.0-3.0毫升，地塞米松24.0-30.0毫克，非必需氨基酸10.0-15.0毫升，还原型谷胱甘肽0.50-0.95克，胎牛血清20.00-50.0毫升，注射用水加至1000毫升。该新鲜羊膜保存液具有在4℃冰箱中保存，将新鲜羊膜保存期延长20-30天的特点。但具有如下不足之处：该保存液中加入了血清成分，增加了病毒在羊膜与保存液之间传播的机会；成分以多种粘稠剂为主，只加入了0.9-1.2％的普通DMEM培养液作为保存液的成分，远没有达到保持羊膜细胞活性的需求；没有加入细胞营养成分，细胞很快会凋亡甚至坏死，只是稍稍延长羊膜保存时间；没有加入血管扩容剂，容易使羊膜细胞和组织肿胀，从而使羊膜细胞凋亡和胶原破坏；加入的地塞米松虽有促进细胞分裂与分化作用，但损耗了部分羊膜细胞的能量，影响羊膜细胞的存活，此外还可能浸附于羊膜的衬里，影响羊膜发挥作用。
发明内容
本发明目的是提供一种保存时间长、质量高、无污染、成本低的羊膜长期保存液，以及该羊膜长期保存液的制备方法。
本发明采用如下技术方案：
一种羊膜长期保存液，其特征在于：以1000ml保存液计，包括的组分为增稠剂10g～200g，血容量扩充剂10g～50g，氨基酸5ml～20ml，抗生素5ml～20ml，酸碱调节剂10ml～50ml，细胞稳定剂5ml～30ml，细胞营养成分5ml～20ml，培养液860ml-970ml。优选组分为增稠剂20g～100g，血容量扩充剂15g～35g，氨基酸10ml～15ml，抗生素10ml～15ml，酸碱调节剂25ml～35ml，细胞稳定剂15ml～20ml，细胞营养成分10ml～15ml，培养液900ml-930ml。
所述增稠剂为硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖中的至少一种，优选硫酸软骨素。硫酸软骨素是一种高分子物质，其大分子基团带有负电荷，可与羊膜上皮形成共价结合，从而在羊膜上皮表面形成一个保护层。实验证明这一保护层对羊膜上皮具有保护作用，可以显著地提高保存羊膜上皮和基质的活性。右旋糖酐也是一种高分子化合物。溶液中的硫酸软骨素与低分子右旋糖酐一起产生胶体渗透压，使得保存羊膜保持脱水状态，维持正常的羊膜厚度和韧性，有利于手术操作。
所述氨基酸为非必需氨基酸，非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。
所述抗生素为庆大霉素、链霉素、妥布霉素等中的一种，最好采用妥布霉素。
所述酸碱调节剂为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES(英文名为2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为C8H18N204S)、硼酸-硼砂缓冲对中的一种，最好选用作用较强的HEPES。
所述血容量扩充剂为预胶化淀粉、羟乙基淀粉、糊精、甘露醇、山梨醇、木糖醇和乳糖中的至少一种。
所述细胞稳定剂为抗坏血酸、维生素E、SOD中的至少一种。
所述细胞营养成分为谷氨酰胺或丙酮酸钠，最好用丙酮酸钠。
所述培养液为DMEM培养液、KSFM培养液或者1640培养液。培养液包含了细胞生长发育所需的大部分营养成分，可以满足保存期间羊膜上皮和基质细胞的营养需要。
所述羊膜长期保存液的制备方法，其特征在于：按体积百分比，将增稠剂，氨基酸，抗生素，血容量扩充剂，细胞稳定剂，细胞营养成分加入培养液混合均匀，用酸碱调节剂10ml～50ml调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得羊膜长期保存液。
所述的渗透压缓冲剂选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一种。
本方法制得得羊膜长期保存液4℃保存60天，-20℃保存1年可维持羊膜上皮和间充质细胞形态和基底膜成分，易批量处理，集中存放，运输方便，可随时满足临床需要，并能维持部分细胞活性和生长因子的活性。
与现有的羊膜保存液相比，本发明具有以下优点：(1)利用本发明羊膜长期保存液进行病原菌培养、生物学性质检测及显微结构观察，发现较长时间保存(12月)的羊膜无污染，将其应用于人结膜修补术中，术后发现羊膜植片能存活2周-2月，并能促进结膜上皮在其表面生长，远期效果理想；(2)细胞稳定剂具有减轻羊膜组织损伤、保持细胞活性的作用，显著提高保存效果；(3)细胞营养成分有促进细胞增殖、保持羊膜细胞活性的作用，羊膜水肿较轻、皱褶较少、透明度较高，上皮和基质活性成份极高，细胞表型和基底膜完整破坏少，与DMEM/甘油(1∶1)保存的羊膜效果相当；(4)由于没有加入血清，减少了病毒传播，也避免羊膜细胞在保存期间分化；(5)本发明不仅有利于优化羊膜保存条件，同时将为羊膜产业化保存提供重要的技术支持。
本发明羊膜长期保存液用于新鲜羊膜的长期保存，能被广大患者接受并应用于临床。
附图说明
图1为经过本发明羊膜长期保存液4℃保存60天的羊膜HE染色照片(200×)；
图2为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜HE染色照片(200×)；
图3为经过DMEM和甘油混合液(1∶1)-80℃保存12月的羊膜HE染色照片(200×)；
图4为经过本发明羊膜长期保存液4℃保存60天的羊膜Laminin 5染色照片(200×)；
图5为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜Laminin 5染色照片(200×)；
图6为经过DMEM和甘油混合液(1∶1)-80℃保存12月的羊膜Laminin 5染色照片(200×)；
图7为经过本发明羊膜长期保存液4℃保存60天的羊膜Collagen IV染色照片(200×)；
图8为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜Collagen IV染色照片(200×)；
图9为经过DMEM和甘油混合液(1∶1)-80℃保存12月的羊膜Collagen IV染色照片(200×)；
图10为经过本发明羊膜长期保存液4℃保存60天的羊膜β-catenin染色照片(200×)；
图11为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜β-catenin染色照片(200×)；
图12为经过DMEM和甘油混合液(1∶1)-80℃保存12月的羊膜β-catenin染色照片(200×)；
图13为经过本发明羊膜长期保存液4℃保存60天的羊膜MUC 16染色照片(200×)；
图14为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜MUC 16染色照片(200×)；
图15为经过DMEM和甘油混合液(1∶1)-80℃保存12月的羊膜MUC 16染色照片(200×)；
图16为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔角膜层间植入后1月的裂隙灯照片；
图17为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔角膜层间植入后1月的HE照片；
图18为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔前房内植入后1月的裂隙灯照片；
图19为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔前房内植入后1月的HE照片；
图20为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔羊膜-结膜修补术后2周的裂隙灯照片；
图21为经过本发明羊膜长期保存液-20℃保存12月的羊膜片兔羊膜-结膜修补术后2周的手术区结膜K19染色照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
实施例1
以1000ml保存液计，包括羟乙基淀粉20g、硫酸软骨素25g和低分子右旋糖酐10g，100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml，DMEM/F12培养液为935ml。pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将25g硫酸软骨素、10g低分子右旋糖酐、20g羟乙基淀粉加入到含100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml及935ml DMEM/F12培养液中混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后4℃保存即得本保存液。
制备方法2：将100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、1M HEPES 25ml、500mM抗坏血酸10ml、10％妥布霉素10ml及435ml DMEM/F12培养液中混合，然后将25g硫酸软骨素、20g羟乙基淀粉和10g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加500ml DMEM/F12培养液混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，100ml分装后4℃保存即得本保存液。
实施例2
以1000ml保存液计，包括羟乙基淀粉20g、硫酸软骨素25g和低分子右旋糖酐10g，100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml，KSFM培养液为935ml。pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将25g硫酸软骨素、10g低分子右旋糖酐、20g羟乙基淀粉加入到含100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml及935mlKSFM培养液中混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后4℃保存即得本保存液。
制备方法2：将100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、1M HEPES 25ml、500mM抗坏血酸10ml、10％妥布霉素10ml及435ml DMEM/F12培养液中混合，然后将25g硫酸软骨素、20g羟乙基淀粉和10g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加500ml KSFM培养液混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，100ml分装后4℃保存即得本保存液。
实施例3
以1000ml保存液计，包括羟乙基淀粉20g、硫酸软骨素25g和低分子右旋糖酐10g，100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml，1640培养液为935ml。pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将25g硫酸软骨素、10g低分子右旋糖酐、20g羟乙基淀粉加入到含100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、500mM抗坏血酸10ml、1M HEPES 25ml、10％妥布霉素10ml及935ml1640培养液中混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌100ml分装后4℃保存即得本保存液。
制备方法2：将100mM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸钠10ml、1M HEPES 25ml、500mM抗坏血酸10ml、10％妥布霉素10ml及435ml DMEM/F12培养液中混合，然后将25g硫酸软骨素、20g羟乙基淀粉和10g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加500ml 1640培养液混合均匀，调pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，100ml分装后4℃保存即得本保存液。
参见图1～15，使用目前常用的DMEM/甘油(1∶1)羊膜保存液，保存6月可维持羊膜部分活性；加上在美国等国家很多临床应用的产妇羊膜需要在保存6个月后再次进行检测，这段保存期可容许工作人员对供体羊膜进行详细的检查，以排除恶性肿瘤、传染性疾病，从而为临床提供健康、优质的羊膜片。但这种羊膜长期保存液需要在-80℃保存，很多基层医院没有这种条件实施，不适合在我国推广使用。本发明所述的羊膜长期保存液的配制方便，成本较低，4℃保存60d及-20℃保存12月后经HE染色(图1，2)及各种荧光染色(图4，5，7，8，10，11，13，14)检查证实其保存的效果(保存时间、活性成分及基底膜)与相应天数的DMEM/甘油(1∶1)羊膜保存液(图3，6，9，12，15)相当。经过本发明保存的羊膜，具有以下特点：羊膜上皮细胞完整(MUC 16染色)，胶原排列整齐破坏少(Collagen IV染色)，细胞连接存在(β-catenin染色)，基底膜破坏少(Laminin5)等，使其在形态学，活性成分保持，基底膜存留及生物学方面更接近于自然的新鲜羊膜。
图16，17是经过本发明所述羊膜长期保存液的羊膜片在临床应用上的一个具体实施例。经过本发明-20℃保存12月的羊膜应用于兔角膜层间植入后经过1个月的观察，羊膜片尚未完全溶解，植片透明，无明显的排斥反应和炎症反应。
图18，19是经过本发明所述羊膜长期保存液的羊膜片在临床应用上的另一个具体实施例。经过本发明-20℃保存12月的羊膜应用于兔前房内植入后经过1个月的观察，发现其羊膜部分溶解，体积变小，但基底膜尚完整，植片变白，但无明显的排斥反应和炎症反应。
图20，21是经过本发明所述羊膜长期保存液的羊膜片在临床应用上的另一个具体实施例。经过本发明-20℃保存12月的羊膜应用于兔羊膜-结膜修补术后2周的观察，发现其羊膜基底膜尚完整，羊膜上有兔结膜上皮长入，无明显的排斥反应和炎症反应，说明其能作为结膜上皮的细胞基底膜用于结膜重建。
Claims (10)
1.一种羊膜长期保存液，其特征在于：以1000ml保存液计，包括的组分为增稠剂10g～200g，血容量扩充剂10g～50g，氨基酸5ml～20ml，抗生素5ml～20ml，酸碱调节剂10ml～50ml，细胞稳定剂5ml～30ml，细胞营养成分5ml～20ml，培养液860ml-970ml。
2.如权利要求1所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：以1000ml保存液计，所包括的组分为增稠剂20g～100g，血容量扩充剂15g～35g，氨基酸10ml～15ml，抗生素10ml～15ml，酸碱调节剂25ml～35ml，细胞稳定剂15ml～20ml，细胞营养成分10ml～15ml，培养液900ml-930ml。
3.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述增稠剂为硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖中的至少一种，优选硫酸软骨素。
4.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述氨基酸为非必需氨基酸，非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。
5.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述抗生素为庆大霉素、链霉素、妥布霉素中的一种，最好采用妥布霉素。
6.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述酸碱调节剂为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES(英文名为2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为C8H18N204S)、硼酸-硼砂缓冲对中的一种，最好选用作用较强的HEPES。
7.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述血容量扩充剂为预胶化淀粉、羟乙基淀粉、糊精、甘露醇、山梨醇、木糖醇和乳糖中的至少一种。
8.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，，其特征在于：所述细胞稳定剂为抗坏血酸、维生素E、SOD中的至少一种。
9.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液，其特征在于：所述细胞营养成分为谷氨酰胺或丙酮酸钠，最好用丙酮酸钠。
10.如权利要求1、2所述的一种羊膜长期保存液的制备方法，其特征在于：按体积百分比，将增稠剂、氨基酸，抗生素，血容量扩充剂，细胞稳定剂，细胞营养成分加入培养液混合均匀，用酸碱调节剂10ml～50ml调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得羊膜长期保存液。
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