CN115397841A - 杀伤或抑制癌细胞生长的方法 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本文提供了包含分离的重链‑透明质酸/正五聚蛋白3(“HC‑HA/PTX3”)复合物的组合物，用于在杀伤癌细胞的方法中使用。本文还提供了在有需要的个体中抑制肿瘤的癌细胞再生长的方法，所述方法包括在手术程序后使所述肿瘤周围的区域与分离的HC‑HA/PTX3复合物接触。本文还提供了用于实施所述方法的组合和试剂盒。

Description

杀伤或抑制癌细胞生长的方法
交叉引用
本申请要求于2020年2月12日提交的美国临时申请号62/975,599的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明内容
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地表明通过引用并入的程度相同。
本文公开了在有需要的对象中直接杀伤癌细胞的方法，所述方法包括使癌细胞与分离的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，癌细胞来自实体瘤或在实体瘤内。在一些实施方案中，癌细胞来自选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不可手术的。在一些实施方案中，CNS癌症是神经胶质瘤或转移癌。在一些实施方案中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤或间变性星形细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌或皮肤癌。在一些实施方案中，结肠癌是腺癌。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3复合物注射到肿瘤、周围组织或其组合中。在一些实施方案中，接触是在癌细胞的手术切除、冷冻消融或射频消融之前、期间或之后进行的。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3应用到手术切除癌细胞的手术切缘，或应用到肿瘤的任何剩余部分。在一些实施方案中，分离的HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和TSG-6。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3包含在包含药学上可接受的药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载剂的组合物中。在一些实施方案中，方法进一步包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，血管生成被减少或抑制。在一些实施方案中，杀伤癌细胞是通过细胞凋亡或坏死进行的。
本文公开了在有需要的对象中直接抑制癌细胞增殖的方法，所述方法包括使癌细胞与分离的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，癌细胞来自实体瘤或在实体瘤内。在一些实施方案中，癌细胞来自选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不可手术的。在一些实施方案中，CNS癌症是神经胶质瘤或转移癌。在一些实施方案中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤或间变性星形细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌或皮肤癌。在一些实施方案中，结肠癌是腺癌。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3复合物注射到肿瘤、周围组织或其组合中。在一些实施方案中，接触是在癌细胞的手术切除、冷冻消融或射频消融之前、期间或之后进行的。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3应用到手术切除癌细胞的手术切缘。在一些实施方案中，分离的HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和TSG-6。在一些实施方案中，包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载剂。在进一步的实施方案中，HC-HA/PTX3包含在包含施用治疗剂的组合物中。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，血管生成被减少或抑制。在一些实施方案中，在表达CD44或RHAMM的细胞中增殖受到抑制。
本文描述了在有需要的对象中直接降低癌细胞代谢活性的方法，所述方法包括使癌细胞与分离的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，癌细胞来自实体瘤或在实体瘤内。在一些实施方案中，癌细胞来自选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不可手术的。在一些实施方案中，CNS癌症是神经胶质瘤或转移癌。在一些实施方案中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤或间变性星形细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌或皮肤癌。在一些实施方案中，结肠癌是腺癌。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3复合物注射到肿瘤、周围组织或其组合中。在一些实施方案中，接触是在癌细胞的手术切除、冷冻消融或射频消融之前、期间或之后，或进入肿瘤的任何剩余部分。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3应用到手术切除癌细胞的手术切缘。在一些实施方案中，分离的HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和TSG-6。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3包含在包含药学上可接受的药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载剂的组合物中。在进一步的实施方案中，HC-HA/PTX3包含在包含施用治疗剂的组合物中。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，血管生成被减少或抑制。在一些实施方案中，在表达CD44或RHAMM的细胞中代谢活性降低。
本文描述了杀伤癌细胞的方法，所述方法包括在手术切除、冷冻消融或射频消融肿瘤之前、期间或之后用分离的HC-HA/PTX3复合物接触手术切缘或肿瘤的任何部分，从而杀伤手术切缘的癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤是选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不可手术的。在一些实施方案中，CNS癌症是神经胶质瘤或转移癌。在一些实施方案中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌或皮肤癌。在一些实施方案中，结肠癌是腺癌。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤。在一些实施方案中，肿瘤是前列腺癌。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和TSG-6。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3包含在包含药学上可接受的药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒介物或载剂的组合物中。在进一步的实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包括施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，杀伤癌细胞是通过细胞凋亡或坏死进行的。
在一些实施方案中，本文公开了在有需要的个体中抑制肿瘤的癌细胞再生长的方法，所述方法包括在手术程序后使肿瘤周围的区域与分离的重链-透明质酸/正五聚蛋白3(HC-HA/PTX3)复合物接触，从而抑制肿瘤周围的区域的癌细胞再生长。在一些实施方案中，手术程序包括肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融。在一些实施方案中，手术程序包括化学疗法、免疫疗法或靶向疗法。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域包括手术切缘。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域是瘤周区域。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤是选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不可手术的癌症。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是皮肤癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与约10微克至100毫克接触。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HA)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMWHA)。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是冷冻保存的。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物包含活细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使肿瘤周围的区域与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使肿瘤周围的区域与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使肿瘤周围的区域与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，所述方法通过杀伤癌细胞来抑制肿瘤细胞再生长。在一些实施方案中，癌细胞的杀伤是通过细胞凋亡或坏死来实现的。在一些实施方案中，所述方法通过抑制癌细胞增殖来抑制肿瘤细胞再生长。在一些实施方案中，所述方法通过抑制癌细胞的代谢活性来抑制肿瘤细胞再生长。
在一些实施方案中，本文公开了在有需要的个体中杀伤肿瘤癌细胞的方法，所述方法包括在手术程序之前、期间或之后用分离的重链透明质酸/正五聚蛋白3(HC-HA/PTX3)复合物接触肿瘤或肿瘤周围的区域，从而杀伤癌细胞。在一些实施方案中，手术程序包括肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融。在一些实施方案中，手术程序包括化学疗法、免疫疗法或靶向疗法。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域包括手术切缘。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域是瘤周区域。在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤是选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。在一些实施方案中，癌症是不能手术的癌症。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是皮肤癌。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与约10微克至100毫克接触。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。在一些实施方案中，重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是冷冻保存的。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物包含活细胞。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HA)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMWHA)。在一些实施方案中，接触包括将HC-HA/PTX3直接注射到肿瘤中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之前。在一些实施方案中，施用治疗剂发生在使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触之后。在一些实施方案中，施用治疗剂与使癌细胞与HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。在一些实施方案中，癌细胞的杀伤是通过细胞凋亡或坏死进行的。
附图说明
图1A显示在RPMI培养基中培养后LNCaP细胞的聚集。
图1B显示在RPMI培养基中培养后PC-3细胞分布均匀。
图2A-图2D显示LNCaP在一系列剂量的精制的BTGel或HC-HA/PTX3处理下的形态和细胞代谢活性。
图3A–图3D显示PC-3在一系列剂量的精制的BTGel或HC-HA/PTX3处理下的形态和代谢活性。
图4A显示在用UC提取物(使用在水中的UC提取物)、HC-HA/PTX3和HA处理后LNCaP细胞中的WST-1测定数据。
图4B显示在用UC提取物(使用在水中的UC提取物)、HC-HA/PTX3和HA处理后PC-3细胞中的WST-1测定数据。
图5A–图5C显示用HA(图5A)、HC-HA/PTX3(图5B)和脐带提取物(UCE)(图5C)处理后LNCaP细胞的形态。
图6A–图6C显示用HA(图6A)、HC-HA/PTX3(图6B)和脐带提取物(UCE)(图6C)处理后PC-3细胞的形态。
图7显示在层粘连蛋白和IV型胶原蛋白上生长的LNCaP细胞比在其他表面上生长的细胞表现出更多细胞聚集。
图8A显示10x和20x放大倍率下拍摄的PrEC前列腺细胞系形态的明场图像。
图8B显示10x和20x放大倍率下拍摄的PNT2前列腺细胞系形态的明场图像。
图9显示人原代正常前列腺细胞与不同浓度的HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图10A和图10B显示通过WST-1测定在与不同浓度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后在正常人原代前列腺上皮细胞PrEC(图10A)和正常人前列腺细胞系PNT2(图10B)中评估的代谢活性(％)。通过相对于未处理样品的双尾t检验计算P值。
图11A和图11B显示与不同浓度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3孵育48小时后在正常原代前列腺上皮细胞(PrEC)&细胞系(PNT2)以及前列腺癌细胞系：PC3&LNCaP中评估的代谢活性(％)(图11A)和对数标度代谢活性(图11B)的比较分析。
图12A和图12B显示与不同浓度的HA孵育48小时后在正常原代前列腺上皮细胞(PrEC)&细胞系(PNT2)以及前列腺癌细胞系：PC3&LNCaP中评估的代谢活性(％)(图12A)和对数标度代谢活性(图12B)的比较分析。
图13显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后A375(黑色素瘤)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图14显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后HT-29(结肠癌)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图15显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后A549(肺癌)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图16显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后MCF-7(乳腺癌)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图17A–图17D显示通过WST-1测定在与不同浓度的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后在4种人癌细胞系：A375(图17A)、HT-29(图17B)、MCF-7(图17C)和A-549(图17D)中评估的代谢活性(％)。
图18A显示用不同浓度的HC-HA/PTX3处理后针对不同时间点(分别是15-30分钟、1小时、5小时、24小时和48小时)的LNC(limbal niche cell，角膜缘微环境细胞)的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图18B显示用不同浓度的HMW-HA处理后针对不同时间点(分别是15-30分钟、1小时、5小时、24小时和48小时)的LNC(角膜缘微环境细胞)的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图18C显示与100μg/ml HC-HA/PTX3和HMW-HA孵育48小时后LNC(角膜缘微环境细胞)的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图19显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后，通过WST-1测定评估的角膜缘微环境细胞中的代谢活性(％)。
图20A和图20B显示在用不同浓度的HC-HA/PTX3(图20A)和HMW-HA(图20B)处理后针对不同的时间点的HTM(人小梁网)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图21显示在与不同浓度的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后，通过WST-1测定评估的人小梁网细胞中的代谢活性(％)。
图22A和图22B显示用不同浓度的HC-HA/PTX3(图22A)和HMW-HA(图22B)处理后针对不同的时间点的人角膜成纤维细胞(HCF)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
图23显示与不同浓度的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后，通过WST-1测定评估的人角膜成纤维细胞中的代谢活性(％)。
图24A和图24B显示与不同浓度的HC-HA/PTX3(图24A)和HA(图24B)孵育48小时后通过WST-1测定评估的三种类型的人正常原代间充质细胞：HCF、HTM&LNC中的代谢活性(％)的比较分析。
图25提供了具有代表性的明场显微图像(比例尺50μm)，显示HC-HA/PTX3(100μg/ml)对LNC和HCF细胞形态的瞬时影响，而在HTM细胞中没有相应的影响。
图26A显示与未经处理的细胞相比，用HC-HA/PTX3和HA处理后A375细胞形态的明场图像。
图26B显示使用A375细胞的BrdU细胞增殖测定曲线。
图26C显示使用A375细胞的半对数尺度BrdU细胞增殖测定曲线。
图27A显示用HA或HC-HA/PTX3处理后的PrEC细胞形态在两个放大倍率(10x&20x)下的明场图像。
图27B显示HC-HA/PTX3处理后的BrdU细胞增殖测定曲线。
图27C显示HA处理后的BrdU细胞增殖测定曲线。
图28A显示用HC-HA/PTX3、HMW-HA处理或未处理后的PNT2细胞形态的明场图像。
图28B显示用HC-HA/PTX3或HA处理后PNT2细胞中的BrdU细胞增殖测定曲线。
图29A显示用HC-HA/PTX3、HMW-HA处理或未处理后的PC3细胞形态的明场图像。
图29B显示用HC-HA/PTX3或HA处理后PC3细胞中的BrdU细胞增殖测定曲线。
图30A显示用HC-HA/PTX3、HMW-HA处理或未处理后的LNCaP细胞形态的明场图像。
图30B显示用HC-HA/PTX3或HA处理后LNCaP细胞中的BrdU细胞增殖测定曲线。
具体实施方式
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。除非另有说明，否则在本文的整个公开中提及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、网站和其他公布的材料都通过引用整体并入。如果本文中的术语有多种定义，以本节中的那些定义为准。在提及URL或其他此类标识符或地址时，应理解此类标识符可能会发生变化，并且因特网上的特定信息可能变化不定，但等效信息是已知的并且可以很容易地访问，例如通过搜索因特网和/或适当的数据库。对此的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约还包括确切的量或值。因此，“约5μg”意味着“约5μg”也意味着“5μg”。在一些实施方案中，术语“约”包括预期在实验误差内的量。在一些实施方案中，术语“约”是指该值的+/-20％、10％或5％。
如本文所用，HC-HA/PTX3复合物或分离的HC-HA/PTX3是指天然HC-HA/PTX3、重构的HC-HA/PTX3或其组合。如本文所用，重构的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物是通过复合物的组分分子在体外组装形成的HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物包含HA、IαI的HC1和HC2以及PTX3。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物包含HA、IαI的HC1和HC2、PTX3和TSG-6。组装rcHC-HA/PTX3的过程包括用纯化的天然蛋白质或从生物来源分离的分子进行的重构、通过重组方法产生重组蛋白质或通过体外合成来合成分子。在一些情况下，用于组装rcHC-HA/PTX3的纯化的天然蛋白质是与其他蛋白质复合的蛋白质(即多聚体、多链蛋白质或其他复合物)。在一些情况下，PTX3作为多聚体(例如同源多聚体)从细胞中纯化并用于组装rcHC-HA/PTX3复合物。
如本文所用，纯化的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物是指从生物来源如细胞、组织或生物流体纯化的HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3分离自胎儿支持组织，例如胎盘、羊膜、绒毛膜、脐带或脐带羊膜。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3分离自羊膜。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3复合物包含HA、IαI的HC1和PTX3。此类复合物通常在对象体内中组装，或在来自对象(包括人或其他动物)的细胞、组织或生物流体中离体组装。
如本文所用，“透明质酸(hyaluronan)”、“透明质酸(hyaluronic acid)”或“透明质酸盐”(HA)可互换使用，指具有D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的重复二糖单元(D-葡糖醛酸基-N-乙酰葡糖胺)的基本上非硫酸化的线性糖胺聚糖(GAG)。
如本文所用，如在高分子量透明质酸(HMW HA)中的术语“高分子量”或“HMW”意指重均分子量为大于约500千道尔顿(kDa)，例如在约500kDa和约10,000kDa之间、在约800kDa和约8,500kDa之间、在约1100kDa和约5,000kDa之间或在约1400kDa和约3,500kDa之间的HA。在一些实施方案中，HMW HA具有3000kDa或更大的重均分子量。在一些实施方案中，HMWHA具有3000kDa的重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA是
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具有约3000kDa的重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约500kDa至约10,000kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约800kDa至约8,500kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约3,000kDa的分子量。
如本文所用，如在低分子量透明质酸(LMWHA)中的术语“低分子量”或“LMW”意指重均分子量为小于500kDa，例如小于约400kDa、小于约300kDa、小于约200kDa、约200-300kDa或约1-300kDa的HA。
如本文所用，正五聚蛋白3或PTX3蛋白质或多肽是指任何PTX3蛋白质，包括但不限于重组产生的蛋白质、合成产生的蛋白质、天然PTX3蛋白质和从细胞或组织中提取的PTX3蛋白质。PTX3包括PTX3的多聚体形式(例如同源多聚体)，包括但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体和其他天然或人工产生的多聚体形式。
如本文所用，“透明质酸结合蛋白”、“HA结合蛋白”或“HABP”是指特异性结合HA的任何蛋白质。
如本文所用，“连接模块”是指透明质酸结合结构域。
如本文所用，“生物活性”是指nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的体内活性或在体内施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物或含有nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物或混合物后产生的生理应答。因此，生物活性包括nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物及其组合物和混合物的治疗效果和药物活性。
如本文所用，术语“对象”、“个体”和“患者”可互换使用。任何这些术语均不得解释为需要医疗专业人员(例如，医生、护士、医师助理、护理员、临终关怀工作者)的监督。如本文所用，对象是任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人动物)和非哺乳动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”以及其他语法等同物包括缓解、消除或改善疾病或病况的一种或多种症状，改善、预防或减少疾病或病况的一种或多种其他症状的出现、严重性或频率，改善或预防疾病或病况的一种或多种症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，引起疾病或病况的消退，减轻由疾病或病况引起的病况，或预防性和/或治疗性地抑制疾病或病况的症状。在一个非限制性示例中，为了预防性益处，将本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物、天然HC-HA/PTX3复合物或组合物施用于有发展特定障碍风险、倾向于发展特定障碍的个体，或施用于被告知有障碍的一种或多种生理症状的个体。
如本文所用，“胎盘”是指将发育中的胎儿连接到母体子宫壁以允许通过母体血液供应吸收营养、排除废物和气体交换的器官。胎盘由三层组成。围绕胎儿的最内胎盘层称为羊膜。尿囊是胎盘的中间层(来源于胚胎后肠)；源自脐部的血管穿过该膜。胎盘的最外层，绒毛膜，与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合形成绒毛尿囊膜。
如本文所用，“绒毛膜”是指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜由两层组成：由滋养层形成的外层和由体细胞中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方体或棱柱状细胞的内层、细胞滋养层或朗汉斯层和没有细胞边界的富核原生质的外层、合胞体滋养层组成。无血管羊膜粘附在绒毛膜的内层。
如本文所用，“羊膜-绒毛膜”是指包含羊膜和绒毛膜的产物。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜不分离(即，羊膜自然粘附到绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜最初与绒毛膜分离，随后在加工过程中与绒毛膜结合。
如本文所用，“脐带”是指将发育中的胎儿连接到胎盘的器官。脐带由华顿氏胶(Wharton's jelly)组成，这是一种主要由粘多糖制成的凝胶状物质。它包含一条静脉(其将含氧、营养丰富的血液输送给胎儿)以及两条动脉(其将脱氧、营养耗尽的血液带走)。
如本文所用，“胎盘羊膜”(PAM)是指源自胎盘的羊膜。在一些实施方案中，PAM基本上是隔离的。
如本文所用，“脐带羊膜”(UCAM)是指源自脐带的羊膜。UCAM是半透明膜。UCAM有多个层：上皮层；基底膜；致密层；成纤维细胞层；和海绵层。它缺乏血管或直接的血液供应。在一些实施方案中，UCAM包括华顿氏胶。在一些实施方案中，UCAM包括血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包括华顿氏胶和血管和/或动脉。
如本文所用，术语“纯化的”、“分离的”是指材料(例如，nHC-HA/PTX3复合物)基本上或实质上不含通常在它天然状态下伴随它的组分。在一些实施方案中，“纯化的”或“分离的”是指如下材料(例如，nHC-HA/PTX3复合物)，所述材料约50％或更多地不含通常在它天然状态下伴随它的组分，例如约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％不含通常在它天然状态下伴随它的组分。
治疗方法
在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的个体的方法，所述方法包括向个体施用本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，包括直接杀伤癌细胞、直接抑制癌细胞增殖、降低癌细胞代谢活性或其组合的方法。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于直接杀伤癌细胞。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于直接抑制癌细胞的增殖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于降低癌细胞的代谢活性。在一些实施方案中，细胞来自实体瘤或在实体瘤内。
在一些实施方案中，治疗有需要的个体的方法包括通过任何合适的方法向个体施用本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，有需要的个体患有癌症。在一些实施方案中，有需要的个体患有不可手术的癌症。在一些实施方案中，有需要的个体患有选自胰腺癌、前列腺癌和多形性胶质母细胞瘤的不可手术的癌症。在一些实施方案中，个体患有实体瘤。在一些实施方案中，个体患有选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。
在一些实施方案中，在手术程序之前、期间或手术程序之后将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于个体。在一些实施方案中，手术程序包括肿瘤的切除。在一些实施方案中，手术程序包括肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融。在一些实施方案中，手术程序包括化学疗法、免疫疗法或靶向疗法。
在一些实施方案中，在肿瘤切除后施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物多达1天、多达2天、多达3天、多达5天或超过5天。在一些实施方案中，在肿瘤切除后施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、一年、两年、三年、四年、五年或超过五年。在一些实施方案中，在肿瘤切除后单次施用，或在一段时间内(例如每天、每周多次、每周、每两周、每月或更不频繁地)施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，在肿瘤切除后单次施用，或在一段时间内(例如每天、每周多次、每周、每两周、每月或更频繁地)施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，在肿瘤切除之前施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，在切除肿瘤前施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物多达1天、多达2天、多达3天、多达5天或超过5天。在一些实施方案中，在肿瘤切除之前单次施用，或在一段时间内(例如每天、每周多次、每周、每两周、每月或更不频繁地)施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，在肿瘤切除之前单次施用，或在一段时间内(例如每天、每周多次、每周、每两周、每月或更频繁地)施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，在肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融期间或之后向个体施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，在肿瘤的手术切除(例如，全部或部分)、冷冻消融或射频消融之后，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于手术切缘(例如，已经手术切除的肿瘤周围的明显组织区域)。
在一些实施方案中，治疗有需要的个体的方法包括通过任何合适的施用途径向个体施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。合适的施用方法将取决于待治疗的疾病或病况。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物局部施用至治疗部位。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物注射到肿瘤、肿瘤周围的组织或两者中。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物注射到肿瘤中。在一些实施方案中，在肿瘤已被手术去除或用冷冻消融或射频消融治疗后，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物应用于肿瘤周围的区域。在一些实施方案中，全身施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。用于施用本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的示例性方法包括但不限于肠胃外、肠内、皮下、经皮、透皮、皮内、静脉内、局部、吸入或植入。
本文证明分离的HC-HA/PTX3复合物直接杀伤癌细胞。在某些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)杀伤癌细胞的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物杀伤实体瘤中的癌细胞的用途。在一些实施方案中，本文提供了在手术去除或用冷冻消融或射频消融治疗肿瘤后，分离的HC-HA/PTX3复合物杀伤肿瘤周围的区域中的癌细胞的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中局部杀伤癌细胞的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中全身杀伤癌细胞的用途。
本文证明分离的HC-HA/PTX3复合物抑制癌细胞的增殖。在某些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)抑制癌细胞增殖的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物抑制实体瘤中的癌细胞增殖的用途。在一些实施方案中，本文提供了在手术去除或用冷冻消融或射频消融治疗肿瘤后，分离的HC-HA/PTX3复合物抑制肿瘤周围的区域中的癌细胞增殖的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中局部抑制癌细胞增殖的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中全身抑制癌细胞增殖的用途。在一些实施方案中，增殖被抑制或减少5-95％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％、50-95％、65-85％或75-95％。在一些实施方案中，增殖被抑制或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％。在一些实施方案中，增殖被抑制或减少至少5％。在一些实施方案中，增殖被抑制或减少至少10％。在一些实施方案中，增殖被抑制或减少至少50％。
本文证明分离的HC-HA/PTX3复合物降低癌细胞的代谢活性。在某些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)降低癌细胞中的代谢活性的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物降低实体瘤中的癌细胞的代谢活性的用途。在一些实施方案中，本文提供了在手术去除或用冷冻消融或射频消融治疗肿瘤后，分离的HC-HA/PTX3复合物降低肿瘤周围的区域中的癌细胞的代谢活性的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中局部降低癌细胞的代谢活性的用途。在一些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物在有需要的对象中全身降低癌细胞的代谢活性的用途。在一些实施方案中，代谢活性降低5-95％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％、50-95％、65-85％或75-95％。在一些实施方案中，代谢活性降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％。在一些实施方案中，代谢活性降低至少5％。在一些实施方案中，代谢活性降低至少10％。在一些实施方案中，代谢活性降低至少50％。
在某些实施方案中，本文提供了分离的HC-HA/PTX3复合物(包括包含HC-HA/PTX3的制剂或组合物)增加癌细胞死亡的用途。在一些实施方案中，癌细胞死亡增加约10％至约25％、约10％至约50％、约20％至约90％。在一些实施方案中，癌细胞死亡增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％。在一些实施方案中，癌细胞死亡是由细胞凋亡引起的。在一些实施方案中，癌细胞死亡是由坏死引起的。
在一些实施方案中，癌细胞来自实体瘤或在实体瘤内。在一些实施方案中，实体瘤是肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌或胃肠癌。在一些实施方案中，癌细胞来自液体肿瘤。在一些实施方案中，液体癌是淋巴癌或白血病。在一些实施方案中，CNS癌症是神经胶质瘤或转移癌。在一些实施方案中，神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤或间变性星形细胞瘤。在一些实施方案中，结肠癌是腺癌、类癌瘤、原发性结肠直肠淋巴癌、间质瘤或平滑肌肉瘤。在一些实施方案中，皮肤癌是黑色素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌。
产生分离的nHC-HA/PTX3复合物的方法
在一些实施方案中，在本文提供的方法中使用分离的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物。
在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物分离自羊膜组织。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物分离自羊膜或脐带。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物分离自新鲜、冷冻或先前冷冻的胎盘羊膜(PAM)，新鲜、冷冻或先前冷冻的脐带羊膜(UCAM)，新鲜、冷冻或先前冷冻的胎盘，新鲜、冷冻或先前冷冻的脐带，新鲜、冷冻或先前冷冻的绒毛膜，新鲜、冷冻或先前冷冻的羊膜-绒毛膜或其任何组合。此类组织可获自任何哺乳动物，例如但不限于人、非人灵长类动物、牛或猪。
在一些实施方案中，通过任何合适的方法纯化nHC-HA/PTX3。在一些实施方案中，通过离心(例如，超速离心、梯度离心)、色谱(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟磷灰石色谱)、切向流过滤(TFF)、凝胶过滤或差异溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的蛋白质纯化技术来纯化nHC-HA/PTX3复合物(参见，例如，Scopes,Protein Purification Principlesand Practice第2版,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编辑),Protein Expression:A Practical Approach,Oxford Univ Press,1999；和Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编辑),Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,第182卷),Academic Press,1997，均通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3从提取物分离。在一些实施方案中，提取物从羊膜提取物制备。在一些实施方案中，提取物从脐带提取物制备。在一些实施方案中，脐带提取物包含脐带基质和/或华顿氏胶。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过使用CsCl/4-6M盐酸胍梯度超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，提取物通过至少2轮的超速离心制备。在一些实施方案中，提取物通过多于2轮的超速离心制备(即nHC-HA/PTX3第2)。在一些实施方案中，提取物通过至少4轮的超速离心制备(即nHC-HA/PTX3第4)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含HC1、HA、PTX3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过在等渗溶液中提取制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，等渗溶液是PBS。例如，在一些实施方案中，组织在PBS中均质化以产生均质化样品。然后通过离心将匀质化的样品分离成可溶部分和不溶部分。在一些实施方案中，对PBS提取组织的可溶部分进行超速离心。在这样的实施方案中，通过对PBS提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3可溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA可溶性复合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3可溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过羊膜和/或脐带组织的直接盐酸胍提取(例如4-6MGnHCl)制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，然后将GnHCl提取物组织离心以产生GnHCl可溶部分和GnHCl不溶部分。在一些实施方案中，对GnHCl可溶部分进行超速离心。在这样的实施方案中，通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3被称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过PBS提取组织的不溶部分的进一步盐酸胍提取而制备的提取物进行超速离心。例如，在一些实施方案中，组织在PBS中均质化以产生均质化样品。然后通过离心将匀质化的样品分离成可溶部分和不溶部分。然后在盐酸胍(例如4-6MGnHCl)中进一步提取不溶部分并离心以产生盐酸胍可溶部分和不溶部分。在一些实施方案中，对盐酸胍可溶部分进行超速离心。在这样的实施方案中，通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3被称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HC1、HA、PTX3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
在一些实施方案中，纯化分离的nHC-HA/PTX3提取物的方法包括：(a)将分离的提取物(例如通过本文所述的可溶性或不溶性方法制备的)以1.35g/ml的初始密度溶解在CsCl/4-6M盐酸胍中以生成CsCl混合物，(b)在15℃下以125,000x g离心CsCl混合物48小时以生成第一纯化提取物，并将含有HA的级分汇集/调整至初始密度为1.40g/ml，在15℃下以125,000x g进行48小时的第二超速离心，(c)汇集纯化的级分并用蒸馏水透析以去除CsCl和盐酸胍，产生透析液。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括(d)将透析液与3体积的含有1.3％(w/v)乙酸钾的95％(v/v)乙醇在0℃混合1小时，以产生第一透析液/乙醇混合物，(e)以15,000x g离心第一透析液/乙醇混合物，以产生第二纯化提取物，和(f)提取第二纯化提取物。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括：(g)用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第二纯化提取物，以产生第二纯化提取物/乙醇混合物；(h)离心第二纯化提取物/乙醇混合物，以产生第三纯化提取物；(i)提取第三纯化提取物。在一些实施方案中，纯化分离的提取物的方法进一步包括：(j)用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第三纯化提取物，以产生第三纯化提取物/乙醇混合物；(k)离心第三纯化提取物/乙醇混合物，以产生第四纯化提取物；(l)提取第四纯化提取物。在一些实施方案中，纯化提取物包含nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过免疫亲和色谱纯化。在一些实施方案中，产生抗HC1抗体、抗HC2抗体或两者并固定到固定支持物上。在一些实施方案中，未纯化的HC-HA复合物(即流动相)通过支持物。在某些情况下，HC-HA复合物与抗体结合(例如，通过(a)抗HC1抗体和HC1，(b)抗HC2抗体和HC2，(c)抗PTX抗体和PTX3，(d)抗SLRP抗体和SLRP，或(e)其任何组合的相互作用)。在一些实施方案中，洗涤支持物(例如，用PBS)以去除任何未结合或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后用能够从支持物洗脱nHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％ SDS、6M盐酸胍或8M脲)洗涤支持物。
在一些实施方案中，通过亲和色谱纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，产生HABP并将其固定到固定支持物上。在一些实施方案中，未纯化的nHC-HA/PTX3复合物(即流动相)通过支持物。在某些情况下，nHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤支持物(例如，用PBS)以去除任何未结合或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后用能够从支持物洗脱HC-HA复合物的溶液洗涤支持物。
在一些实施方案中，通过HABP亲和色谱，和使用抗HC1抗体、抗HC2抗体、抗PTX3抗体、抗SLRP或SLRP的组合的抗体或其任何抗体组合的免疫亲和色谱纯化nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，使用一种或多种抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗SLRP抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗PTX3抗体从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含I类、II类或III类SLRP。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自I类SLRP，例如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自II类SLRP，例如纤调蛋白聚糖、基膜聚糖、PRELP(末端富含脯氨酸精氨酸的富亮氨酸蛋白质)、角蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自III类SLRP，例如表聚糖(epipycan)和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自bikunin、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖包含硫酸角质素。
产生rcHC-HA/PTX3复合物的方法
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物用于本文提供的方法中。这种重构的HC-HA/PTX3复合物可以含有或不含SLRP。
在一些实施方案中，用于产生重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使透明质酸(HA)与IαI和TSG-6接触以形成预结合TSG-6的HC-HA复合物和(b)在合适的条件下使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过这种方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法包括使与TSG-6预结合的HC-HA复合物与PTX3接触。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HW)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMW HW)。
在一些实施方案中，用于产生重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使高分子量透明质酸(HMW HA)与IαI和TSG-6接触以形成预结合TSG-6的HC-HA复合物和(b)在合适的条件下使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过这种方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法包括使与TSG-6预结合的HC-HA复合物与PTX3接触。
在一些实施方案中，IαI蛋白和TSG-6蛋白以约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1(IαI:TSG-6)的摩尔比与HMW HA接触。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比率范围是约1:1至约20:1，例如约1:1至约10:1，例如约1:1至5约:1，例如约1:1至约3:1。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比率是3:1或更高。在一些实施方案中，IαI:TSG-6的比率是3:1。
在某些情况下，TSG-6与IαI相互作用并与IαI的HC1和HC2形成共价复合物(例如，HC1·TSG-6和HC2·TSG-6)。在某些情况下，在HA存在的情况下，HC转移至HA以形成rcHC-HA。
在一些实施方案中，使透明质酸(HA)与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HA与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少2小时或更长时间。在一些实施方案中，使HA与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使HA与IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使固定化的HA与IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HW)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMW HW)。
在一些实施方案中，使高分子量透明质酸(HMW HA)与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HMW HA与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少2小时或更长时间。在一些实施方案中，使HMW HA与IαI和TSG-6接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使HMW HA与IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使固定化的HMW HA与IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。
在一些实施方案中，使PTX3与HC-HA复合物接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使PTX3与HC-HA复合物接触的步骤进行至少2小时或更长时间。在一些实施方案中，使PTX3与HC-HA复合物接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3与HC-HA复合物接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使PTX3与HC-HA复合物接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。
在一些实施方案中，所述方法包括使透明质酸(HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、包含重链1(HC1)和重链2(HC2)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白和肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)在合适的条件下同时接触形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HA与PTX3、IαI和TSG-6接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HW)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMW HW)。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、包含重链1(HC1)和重链2(HC2)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白和肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)在合适的条件下同时接触形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HMWHA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HMWHA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。
在一些实施方案中，所述方法包括使透明质酸(HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、包含重链1(HC1)和重链2(HC2)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白和肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)在合适的条件下以任何顺序依次接触形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HW)。在一些实施方案中，透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMWHW)。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量透明质酸(HMW HA)与正五聚蛋白3(PTX3)蛋白、包含重链1(HC1)和重链2(HC2)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白和肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)在合适的条件下以任何顺序依次接触形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在37℃。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤发生在PBS中的5mM MgCl2中。
在一些实施方案中，产生rcHC-HA/PTX3复合物的方法进一步包括添加一种或多种小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，用于产生重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使透明质酸(HA)与IαI和TSG-6接触以形成预结合TSG-6的HC-HA复合物，(b)使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触和(c)在合适的条件下使HC-HA复合物与一种或多种SLRPS接触以形成rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，用于产生重构的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使高分子量透明质酸(HMW HA)与IαI和TSG-6接触以形成预结合TSG-6的HC-HA复合物，(b)使HC-HA复合物与正五聚蛋白3(PTX3)接触和(c)在合适的条件下使HC-HA复合物与一种或多种SLRPS接触以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过这种方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，所述方法包括使预结合TSG-6的HC-HA复合物与PTX3接触。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)按顺序依次进行。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)、(b)和(c)同时进行。在一些实施方案中，进行所述方法的步骤(a)，然后依次进行所述方法的步骤(b)和(c)。在一些实施方案中，进行所述方法的步骤(a)，然后同时进行所述方法的步骤(b)和(c)。
在一些实施方案中，SLRP选自I类、II类或III类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，例如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自II类SLRP，例如纤调蛋白聚糖、基膜聚糖、PRELP(末端富含脯氨酸精氨酸的富亮氨酸蛋白质)、角蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自III类SLRP，例如表聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖选自bikunin、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖包含硫酸角质素。
PTX3
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)。适合于表达PTX3的示例性细胞包括但不限于动物细胞和植物细胞，其中动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母，其中植物细胞包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自人细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调PTX3表达的细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自羊膜细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激羊膜细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自脐带细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激脐带细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自脐带上皮细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自羊膜基质细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3分离自脐带基质细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激羊膜基质细胞或脐带基质细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3是从细胞中分离的天然PTX3蛋白。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，通过重组技术制备PTX3。在一些实施方案中，由重组表达载体表达PTX3。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，PTX3在转基因动物中表达。在一些实施方案中，PTX3是重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是从细胞分离的重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，从羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊水或其组合中纯化PTX3。在一些实施方案中，从羊膜细胞中纯化PTX3。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激羊膜细胞以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，PTX3并非分离自一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)。
在一些实施方案中，PTX3包含足以促进形成rcHC-HA/PTX3复合物的PTX3片段。用于所提供方法中的PTX3变体包括具有氨基酸修饰的变体，所述氨基酸修饰是氨基酸置换(取代)、缺失或插入。在一些实施方案中，此类修饰改善了PTX3多肽的一种或多种特性，例如改善rcHC-HA/PTX3复合物的一个或多个治疗特性(例如，抗炎、抗免疫、抗血管生成、抗瘢痕形成、抗粘连、再生或本文所述的其他治疗活性)。
在一些实施方案中，PTX3蛋白获自商业来源。PTX3的示例性商业来源是但不限于PTX3(目录号1826-TS；R&D Systems，Minneapolis，MN)。
在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3蛋白是多聚体蛋白。在一些实施方案中，用于所述方法中的PTX3蛋白是同多聚体。在一些实施方案中，同多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、五聚体或八聚体。在一些实施方案中，PTX3同多聚体是三聚体、四聚体或八聚体。在特定实施方案中，PTX3同多聚体是八聚体。在一些实施方案中，修饰多聚化结构域以改善PTX3蛋白的多聚化。在一些实施方案中，多聚化结构域被异质多聚化结构域(例如，Fc多聚化结构域或亮氨酸拉链)替换，其当与PTX3融合时改善PTX3的多聚化。
TSG-6
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)。适合于表达TSG-6的示例性细胞包括但不限于动物细胞和植物细胞，其中动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母，其中植物细胞包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自人细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调TSG-6表达的细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自羊膜细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自脐带细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调TSG-6表达的脐带细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自脐带上皮细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自羊膜基质细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自脐带基质细胞。在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6分离自用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调TSG-6表达的羊膜基质细胞或脐带基质细胞。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法中的TSG-6是从细胞中分离的天然TSG-6蛋白。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激细胞以上调TSG-6表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，通过重组技术制备TSG-6。在一些实施方案中，由重组表达载体表达TSG-6。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，TSG-6在转基因动物中表达。在一些实施方案中，TSG-6是重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是从细胞分离的重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，从羊膜、羊膜、绒毛膜、羊水或其组合中纯化TSG-6。在一些实施方案中，从羊膜细胞中纯化TSG-6。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜上皮细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，用一种或多种促炎细胞因子刺激羊膜细胞以上调TSG-6表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子是IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，TSG-6并非分离自一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)。
在一些实施方案中，TSG-6包含足以促进或催化IαI的HC1向HA转移的TSG-6片段。在一些实施方案中，TSG-6包括TSG-6的连接模块。
在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签。示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。此类亲和标签在本领域中用于纯化是众所周知的。在一些实施方案中，此类亲和标签作为融合蛋白或通过化学接头掺入TSG-6多肽中。在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签，以及通过亲和纯化从rcHC-HA/PTX3复合物中去除未结合的TSG-6。
在一些实施方案中，TSG-6蛋白获自商业来源。TSG-6的示例性商业来源是但不限于TSG-6(目录号2104-TS R&D Systems，Minneapolis，MN)。
IαI
在一些实施方案中，IαI包含HC1链。在一些实施方案中，IαI包含HC1和HC2链。在一些实施方案中，IαI包含HC1、HC2链和bikunin。在一些实施方案中，IαI包含通过硫酸软骨素链连接的HC1和HC2链和bikunin。
在一些实施方案中，从生物样品中分离IαI。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，从人血液、血浆或血清纯化IαI。在一些实施方案中，IαI分离自人血清。在一些实施方案中，IαI并非分离自血清。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在来自脐带的羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在羊膜基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在脐带基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法中的IαI在肝细胞中产生。在一些实施方案中，通过重组技术制备IαI。
在一些实施方案中，IαI的HC1分离自生物样品。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，从人血液、血浆或血清纯化IαI的HC1。在一些实施方案中，IαI分离自人血清。在一些实施方案中，IαI的HC1并非从血清纯化。在一些实施方案中，通过重组技术制备IαI的HC1。在一些实施方案中，从肝细胞纯化IαI的HC1。在一些实施方案中，从羊膜细胞纯化IαI的HC1。在一些实施方案中，从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞纯化IαI的HC1。在一些实施方案中，从羊膜基质细胞或脐带基质细胞纯化IαI的HC1。
在一些实施方案中，从生物样品分离IαI的HC2。在一些实施方案中，生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物样品是血清样品。在一些实施方案中，生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，从人血液、血浆或血清纯化IαI的HC2。在一些实施方案中，IαI的HC2分离自人血清。在一些实施方案中，IαI的HC2分离自人血清。在一些实施方案中，IαI的HC2并非分离自血清。在一些实施方案中，通过重组技术制备IαI的HC2。在一些实施方案中，从肝细胞纯化IαI的HC2。在一些实施方案中，从羊膜细胞纯化IαI的HC2。在一些实施方案中，从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞纯化IαI的HC2。在一些实施方案中，从羊膜基质细胞或脐带基质细胞纯化IαI的HC2。
HA
在一些实施方案中，从细胞、组织或流体样品纯化HA。在一些实施方案中，HA获自商业供应商(例如，Sigma Aldrich或Advanced Medical Optics，Irvine，CA(例如，Healon))。在一些实施方案中，HA作为粉末获自商业供应商。在一些实施方案中，HA在细胞中表达。适合于表达HA的示例性细胞包括但不限于动物细胞和植物细胞，其中动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、昆虫细胞、细菌和酵母，其中植物细胞包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。在一些实施方案中，HA在人细胞中表达。在一些实施方案中，HA在转基因动物中表达。在一些实施方案中，HA获自表达透明质酸合酶(例如HAS1、HAS2和HAS3)的细胞。在一些实施方案中，细胞含有表达HA合酶的重组表达载体。在某些情况下，当新生多糖通过细胞膜挤压到细胞外空间时，HA合酶通过反复添加葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺至新生多糖来延长透明质酸。
在一些实施方案中，用于在所述方法中使用的HA是高分子量(HMW)HA。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量大于约500千道尔顿(kDa)，例如在约500kDa和约10,000kDa之间、在约800kDa和约8,500kDa之间、在约1100kDa和约5,000kDa之间、或在约1400kDa和约3,500kDa之间。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为约3000kDa。
另外的组分
在一些实施方案中，添加一种或多种另外的组分以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，添加小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，SLRP是I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，例如核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自II类SLRP，例如纤调蛋白聚糖、基膜聚糖、PRELP(末端富含脯氨酸精氨酸的富亮氨酸蛋白质)、角蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自III类SLRP，例如表聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自bikunin、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含硫酸角质素。
在一些实施方案中，通过任何合适的方法固定HMW HA。在一些实施方案中，HMW HA被固定在固体支持物上，例如培养皿、珠、柱或其他合适的表面，例如可植入医疗器械的表面或其一部分，或固定在随后连接到如本文所述的可植入医疗器械或与如本文所述的可植入医疗器械组合的表面上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定到固体支持物上，例如通过化学键。在一些实施方案中，HMW HA通过接头或中间蛋白间接连接至固体支持物。用于在氨基基团和硫醇基团之间形成共价键并将硫醇基团引入蛋白质中的多种异双功能交联剂是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，HMW HA通过与固体支持物交联而直接固定在固体支持物上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定在固体支持物上而不与固体支持物交联。在一些实施方案中，HMW HA作为涂层直接固定在固体支持物上。在一些实施方案中，HMWHA固定在CovalinkTM-NH表面上。在一些实施方案中，HMW HA作为涂层直接固定在固体支持物上。在一些实施方案中，HMW HA在4℃固定在CovalinkTM-NH表面上约16小时。
在一些实施方案中，所述方法包括通过直接连接至固体支持物(即没有中间蛋白)将HMW HA固定至固体表面。在一些实施方案中，在使固定化的HA与IαI、TSG-6和PTX3接触之前，洗涤固体支持物以去除未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与IαI、TSG-6和PTX3接触之前，用8M GnHCl和PBS的清洗液洗涤固体支持物以去除未结合的HMWHA。
在一些实施方案中，所述方法包括通过中间蛋白或接头将HA固定到固体表面。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，中间蛋白是HA结合蛋白(HABP)。在一些实施方案中，HABP首先连接至固体支持物(例如，通过交联、化学键或通过化学接头)。在一些实施方案中，然后使包含HABP的固体支持物与HA(例如，HMW HA)接触以通过HABP与HA的结合将HA固定到固体支持物上。在一些实施方案中，在使固定化的HMW HA与IαI、TSG-6和PTX3接触之前，洗涤固体支持物以去除未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与IαI、TSG-6和PTX3接触之前，用8M GnHCl和PBS的清洗液洗涤固体支持物以去除未结合的HMW HA。
在一些实施方案中，所述方法包括通过肽接头与固体支持物的连接和HA与肽接头的连接将HA固定到固体表面。在一些实施方案中，肽接头包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述方法包括通过连接可切割的化学接头，例如但不限于二硫化物化学接头，将HA固定到固体表面。
在一些实施方案中，选择用于所述方法中的HABP是在形成rcHC-HA/PTX3复合物后从HA解离的HABP。在一些实施方案中，HABP与HA非共价结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用一种或多种解离剂将rcHC-HA/PTX3复合物与HABP解离。用于破坏非共价相互作用的解离剂(例如，盐酸胍、脲和各种去污剂，例如，SDS)是本领域已知的。在一些实施方案中，解离剂是脲。在一些实施方案中，解离剂是盐酸胍。在一些实施方案中，解离剂是约4M至约8M盐酸胍。在一些实施方案中，解离剂是约4M、约5M、约6M、约7M、约8M盐酸胍。在一些实施方案中，解离剂是在pH 7.5的PBS中的约4M至约8M盐酸胍。
在一些实施方案中，此类解离剂用于将rcHC-HA/PTX3复合物与中间HABP解离。通常选择用于所述方法中的HABP，使得对HA的结合亲和力足够强以允许rcHC-HA/PTX3复合物的组装，但用合适的解离剂与rcHC-HA/PTX3复合物解离。在一些实施方案中，解离剂是盐酸胍。
与本文提供的方法一起使用的示例性HABP包括但不限于HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、TSG-6、CD44、stabilin-1、stabilin-2或其足以结合HA的部分(例如，其连接模块)。在一些实施方案中，HABP是多功能蛋白聚糖。在一些实施方案中，HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组人蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组多功能蛋白聚糖蛋白或其足以结合HA的部分。在一些实施方案中，HABP是重组聚集蛋白聚糖蛋白或其足以结合HA的部分。在一些实施方案中，HABP是天然HABP或其足以结合HA的部分。在一些实施方案中，天然HABP分离自哺乳动物组织或细胞。在一些实施方案中，HABP分离自牛鼻软骨(例如来自Seikagaku的HABP，其含有聚集蛋白聚糖的HA结合结构域和连接蛋白)。
在一些实施方案中，HABP包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、TSG-6、CD44、stabilin-1或stabilin-2的连接模块。在一些实施方案中，HABP包含多功能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，包含多功能蛋白聚糖的连接模块的HABP是重组蛋白。
在一些实施方案中，中间蛋白(例如HABP)含有被位点特异性蛋白酶(例如弗林蛋白酶、3C蛋白酶、半胱天冬酶、基质金属蛋白酶或TEV蛋白酶)识别并水解的蛋白水解切割序列。在此类实施方案中，通过使固定化的复合物与切割特定切割序列的蛋白酶接触而从固体支持物释放组装的rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，纯化rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，通过任何合适的方法或方法组合来纯化rcHC-HA/PTX3复合物。下面描述的实施方案不是排他性的，仅是示例性的。
在一些实施方案中，通过色谱法(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟磷灰石色谱)、切向流过滤(TFF)、凝胶过滤、离心(例如梯度离心)或差异溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的蛋白质纯化技术来纯化rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，通过免疫亲和色谱法纯化rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，产生针对rcHC-HA/PTX3复合物的组分的抗体(例如，抗HC1、抗PTX3、针对rcHC-HA/PTX3复合物的一个或多个SLRP的抗体(例如抗bikunin、抗核心蛋白聚糖、抗双糖链蛋白聚糖或抗骨黏附蛋白聚糖))并固定在固体支持物上。在一些实施方案中，未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即流动相)通过支持物。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与抗体结合。在一些实施方案中，洗涤支持物(例如，用PBS)以去除任何未结合或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后用能够从支持物洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％SDS、6M盐酸胍或8M脲)洗涤支持物。在一些实施方案中，从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中去除解离剂。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、切向流过滤(TFF)、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中去除解离剂。
在一些实施方案中，通过亲和色谱法纯化rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，HABP用于结合rcHC-HA/PTX3复合物以纯化复合物并固定至固定支持物。在一些实施方案中，未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即流动相)通过支持物。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤支持物(例如，用PBS)以去除任何未结合或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后用能够从支持物洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如解离剂)洗涤支持物。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、切向流过滤(TFF)、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中去除解离剂。
在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物通过HABP亲和色谱法和免疫亲和色谱法的组合来纯化，其中免疫亲和色谱法使用针对rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分的抗体。
在一些实施方案中，本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分包含亲和标签(例如，具有亲和标签的PTX3或HC1的融合蛋白)。在一些实施方案中，掺入rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分中的示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、聚组氨酸、myc标签、FLAG标签或谷胱甘肽-S-转移酶序列。在一些实施方案中，亲和标签的配体被固定到固体支持物上。在一些实施方案中，未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物通过支持物。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与配体结合。在一些实施方案中，洗涤支持物(例如，用PBS)以去除任何未结合或松散结合的分子。在一些实施方案中，然后用能够从支持物洗脱本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的溶液洗涤支持物。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、切向流过滤(TFF)、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中去除洗脱剂。
在一些实施方案中，PTX3、TSG-6和/或HC1与标记缀合。“标记”是指直接或间接与多肽缀合以产生经标记的多肽的可检测化合物或组合物。在一些实施方案中，标记本身(例如，放射性同位素标记或荧光标记)是可检测的，或者在酶标记的情况下，催化可检测的底物化合物组合物的化学改变。标记的非限制性示例包括荧光部分、染料、荧光标签、绿色荧光蛋白或荧光素酶。
评估nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3复合物活性的方法
本文提供的nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3复合物的特性通过任何合适的方法评估，包括体外和体内方法。本文提供了示例性体外方法，包括但不限于细胞培养方法，所述方法评估nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物促进巨噬细胞附着于固定化的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的能力、抑制或减少巨噬细胞聚集的能力、促进中性粒细胞凋亡、巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞和经刺激的巨噬细胞的M2极化的能力。在一些实施方案中，用于测定中的巨噬细胞受到刺激，例如通过暴露于LPS或IFN-γ。在一些实施方案中，在与nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触后评估受刺激的巨噬细胞中的基因或蛋白质表达。在此类评估nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性的方法中，使用合适的对照进行比较。在一些实施方案中，对照是不使用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物处理(即阴性对照)。
在一些实施方案中，将rcHC-HA/PTX3复合物的活性与天然HC-HA/PTX3复合物的活性进行比较。在一些实施方案中，天然HC-HA/PTX3分离自羊膜。
在一些实施方案中，通过PCR、RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹、斑点印迹、免疫组织化学、色谱法或其他合适的检测蛋白质或核酸的方法评估经处理的巨噬细胞中的基因表达。在一些实施方案中，评估IL-10、IL-12、IL23、LIGHT和SPHK1的表达水平。
药物组合物
在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在某些实施方案中，本文公开了包含通过本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在一些实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制药物组合物，所述载剂包括促进将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物加工成适用于药物用途的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于所选的施用途径。任何众所周知的技术、载剂和赋形剂都可以适当地并且如本领域所理解的那样使用。
在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含佐剂、赋形剂、防腐剂、延迟吸收剂、填充剂、粘合剂、吸附剂、缓冲剂和/或增溶剂。配制为含有本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的示例性药物组合物包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、颗粒、粉剂、药膏、片剂、胶囊、丸剂、酊剂、透皮贴、油膏、洗剂、乳膏、糊剂、泡沫、凝胶或气雾剂。
剂型
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为水性悬浮液施用。在一些实施方案中，水性悬浮液包含水、林格氏溶液和/或等渗氯化钠溶液。在一些实施方案中，水性悬浮液包含甜味剂或调味剂、着色物质或染料，以及，如果需要的话，还包括乳化剂或悬浮剂，连同稀释剂水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合。在一些实施方案中，水性悬浮液包含悬浮剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和/或阿拉伯树胶。在一些实施方案中，水性悬浮液包含分散剂或润湿剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七烷基乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene-oxycetanol))，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一些实施方案中，水性悬浮液包含防腐剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。在一些实施方案中，水性悬浮液包含甜味剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为油性悬浮液施用。在一些实施方案中，通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液体石蜡)中来配制油性悬浮液。在一些实施方案中，油性悬浮液包含增稠剂(例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇)。在一些实施方案中，油性悬浮液包含甜味剂(例如，上述那些)。在一些实施方案中，油性悬浮液包含抗氧化剂(例如，丁基化羟基茴香醚或α-生育酚)。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于肠胃外注射(例如，通过包括以下途径的注射或输注：动脉内、心内、皮内、十二指肠内、髓内、肌内、骨内、腹膜内、鞘内、血管内、静脉内、玻璃体内、硬膜外和/或皮下)。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为无菌溶液、悬浮液或乳液施用。
在一些实施方案中，用于肠胃外施用的制剂包括本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的水性和/或非水性(油性)无菌注射溶液，在一些实施方案中，该溶液含有抗氧化剂、缓冲液、抑细菌剂和/或使该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，在一些实施方案中，该悬浮液包括悬浮剂和/或增稠剂。在一些实施方案中，用于肠胃外施用的制剂包括合适的稳定剂或增加本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为水包油微乳剂施用，其中活性成分溶解在油相中。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物溶解在脂肪油(例如，芝麻油，或合成脂肪酸酯，(例如，油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体)中。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物溶解在大豆油和/或卵磷脂的混合物中。在一些实施方案中，将油溶液引入水和甘油混合物中并加工以形成微乳液。
在一些实施方案中，配制用于肠胃外施用的组合物作为单次推注施用。在一些实施方案中，配制用于肠胃外施用的组合物通过连续静脉内递送装置(例如，Deltec CADD-PLUSTM5400型静脉泵)施用。
在一些实施方案中，注射用制剂以单位剂型存在，例如，在安瓿或多剂量容器中，并添加了防腐剂。在一些实施方案中，注射用制剂以粉末形式或在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载剂，例如盐水或无菌无热原水。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于局部施用。局部制剂包括但不限于软膏、乳膏、洗剂、溶液、糊剂、凝胶、薄膜、棒状物、脂质体、纳米颗粒。在一些实施方案中，通过使用贴剂、绷带或伤口敷料来施用局部制剂。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制成固体、交联凝胶或脂质体形式的组合物。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制成不溶性交联水凝胶。
在一些实施方案中，局部制剂包含胶凝剂(或增稠剂)。合适的胶凝剂包括但不限于纤维素、纤维素衍生物、纤维素醚(例如，羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素)、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、藻酸盐(例如，海藻酸)、硅酸盐、淀粉、黄蓍胶、羧基乙烯基聚合物、角叉菜胶、石蜡、凡士林、阿拉伯胶(阿拉伯树胶)、琼脂、硅酸镁铝、海藻酸钠、硬脂酸钠、墨角藻、膨润土、卡波姆、角叉菜胶、卡波普、黄原胶、纤维素、微晶纤维素(MCC)、角豆胶、角叉菜、右旋糖、红藻胶、明胶、印度树胶、瓜尔胶、硅酸镁锂、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、甘露醇、山梨糖醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、梧桐胶、聚乙二醇(例如PEG 200-4500)、黄蓍树胶、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、氧聚明胶、果胶、聚明胶、聚维酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PVM/MA)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙酯)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)或其组合。
在一些实施方案中，本文公开的局部制剂包含润肤剂。润肤剂包括但不限于蓖麻油酯、可可油酯、红花油酯、棉籽油酯、玉米油酯、橄榄油酯、鱼肝油酯、杏仁油酯、鳄梨油酯、棕榈油酯、芝麻油酯、角鲨烯酯、石栗子油酯(kukui oil ester)、大豆油酯、乙酰化甘油单酯、乙氧基化甘油单硬脂酸酯、月桂酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸甲酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六烷酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸甲酯、己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸二己基癸酯、癸二酸二异丙酯、乳酸月桂基酯、乳酸肉豆蔻基酯和乳酸鲸蜡基酯、豆蔻酸油烯基酯、硬脂酸油烯基酯和油酸油烯基酯、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山萮酸、芥酸、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、十六烷基醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山嵛醇、瓢儿菜醇、2-辛基十二烷醇、羊毛脂和羊毛脂衍生物、蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻酸肉豆蔻基酯、硬脂酸硬脂基酯、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、卵磷脂和胆固醇。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与一种或多种天然聚合物一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与天然聚合物一起配制，所述天然聚合物是纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸类肝素、硫酸软骨素。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与由天然聚合物配制的聚合物凝胶一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与由天然聚合物配制的聚合物凝胶一起配制，所述天然聚合物例如但不限于纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸类肝素、硫酸软骨素及其组合。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与交联聚合物一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联聚合物一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联聚合物和交联聚合物一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与交联透明质酸凝胶一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与不溶性交联HA水凝胶一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联透明质酸凝胶一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与胶原基质一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与纤维蛋白基质一起配制。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与纤维蛋白/胶原基质一起配制。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于施用至肿瘤或与其相关的组织。适合施用于肿瘤的制剂包括但不限于溶液、悬浮液(例如水性悬浮液)、软膏、凝胶、乳膏、脂质体、泡囊、药质体、纳米颗粒或其组合。在一些实施方案中，本文公开的用于注射到实体瘤中的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物通过注射到肿瘤、周围组织或其组合中来施用。在一些实施方案中，在切除癌细胞或肿瘤的同时施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于切除癌细胞或肿瘤的手术切缘。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物
如本文所用，“长效制剂”是(例如皮下、肌内、玻璃体内或结膜下)植入肿瘤或与其相关的组织(例如，手术切缘)的控释制剂。在一些实施方案中，通过在可生物降解聚合物中形成本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的微胶囊化基质(也称为微胶囊化基质)来配制长效制剂。在一些实施方案中，通过将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包埋在脂质体或微乳液中来配制长效制剂。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于直肠或阴道施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为栓剂施用。在一些实施方案中，通过将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备适合直肠施用的组合物，所述无刺激性赋形剂在常温下为固体但在直肠温度下为液体且将因此在直肠中融化以释放药物。在一些实施方案中，通过将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与可可脂、甘油化明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇或聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物混合来制备适合于直肠施用的组合物。
在某些实施方案中，本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物任选地掺入控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒、纳米胶囊或其他增强或促进局部递送至皮肤的药剂。用于药物制剂的常规微胶囊化方法的一个示例描述于美国专利号3,737,337，此类公开内容通过引用并入本文。
剂量
施用的药物组合物的量部分取决于被治疗的个体。在将药物组合物施用于人对象的情况下，每日剂量通常由处方医师确定，剂量通常根据以下因素而变化：个体的年龄、性别、饮食、体重、一般健康和反应、个体症状的严重程度、正在治疗的确切疾病或病况、正在治疗的疾病或病况的严重程度、施用时间、施用途径、组合物的配置、排泄率、药物组合以及处方医师的判断。
在一些情况下，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物通过局部注射直接施用到肿瘤和/或周围组织中。在一些情况下，肿瘤不能通过手术切除，或者是“不可手术的”。在一些实施方案中，不可手术的肿瘤是不可接近的，或者患者具有限制承受手术能力的医学状况。在一些情况下，肿瘤位于敏感位置，例如脊髓、脑或其他组织，手术切除可能会严重损害周围组织。在一些情况下，肿瘤会浸润或侵入周围组织，例如某些脑癌，并且不可能在不伤害周围组织的情况下通过手术提取。不可手术的肿瘤可能来自但不限于中枢神经系统(CNS)癌症，例如多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌或膀胱癌。在一些情况下，癌症在身体其他部位有多个继发性肿瘤或转移灶。继发性肿瘤的数量可能太多而无法安全切除。转移癌的类型包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌或子宫癌。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的施用剂量在约0.001至约1000mg之间。在一些实施方案中，施用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量在约0.5至约50mg的范围内。在一些实施方案中，施用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.001至约7g。在一些实施方案中，施用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.01至约7g。在一些实施方案中，施用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.02至约5g。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.05至约2.5g。在一些实施方案中，施用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3的量为约0.1至约1g。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在疾病或病况发生之前、期间或之后施用。在一些实施方案中，在疾病或病况发生之前、期间或之后施用联合疗法。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在疾病或病况发生之前、期间或之后与联合疗法一起施用。在一些实施方案中，施用包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3的组合物的时间是不同的。因此，在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用作预防剂，并连续施用给有发展病况或疾病倾向的对象以预防疾病或病况的发生。在一些实施方案中，在症状发作期间或之后尽快将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于对象。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的施用是在症状发作的前48小时内开始的，优选在症状发作的前48小时内，更优选在症状发作的前6小时内，最优选在症状发作的3小时内。在一些实施方案中，初始施用是通过任何可行的途径，例如，静脉内注射、快速推注、5分钟至约5小时输注、丸剂、胶囊、透皮贴剂、口腔递送或其组合。优选地，在检测到或怀疑疾病或病况发作后可行时尽快施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，并持续治疗该疾病所需的时间长度，例如约1个月至约3个月。在一些实施方案中，每个对象的治疗时间长短不同，并且该长度使用已知标准来确定。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物或含有复合物的制剂至少2周，优选约1个月至约5年，更优选约1个月至约3年。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以单剂量施用，每日一次。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以多剂量施用，每日超过一次。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物每天施用两次。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物每天施用三次。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物每天施用四次。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物每天施用超过四次。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以单剂量施用。在一些实施方案中，结合肿瘤切除、冷冻消融或射频消融以单剂量施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，在一些实施方案中，将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以足以治愈或至少部分地抑制疾病或病况的症状的量施用给已经患有疾病或病况的个体。用于该用途的有效量将取决于疾病或病况的严重程度和病程、先前的疗法、个体的健康状况、体重和对药物的反应，以及治疗医师的判断。
在预防性应用中，在一些实施方案中，将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于处于特定障碍风险中的个体。这样的量被定义为“预防有效量或剂量”。在这样的用途中，精确的量还取决于个体的健康状况、体重和个体的其他身体参数。
在个体的病况没有改善的情况下，根据医生的判断，长期施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，即施用延长的时间段，包括在个体的整个生命期间，以改善或以其他方式控制或限制个体疾病或病况的症状。
在一些实施方案中，在个体状态确实改善的情况下，根据医生的判断，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被连续施用或暂时减少正在被施用的药物剂量或暂时中止一定时间段(即“药物假期”)。在一些实施方案中，药物假期的长度在2天和1年之间变化，仅作为示例，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在一些实施方案中，药物假期期间的剂量减少为10％-100％，仅作为示例，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦个体病况出现改善，如有必要，将施用维持剂量。在一些实施方案中，随后，根据症状将施用剂量或频率或两者降低至保持疾病、障碍或病况改善的水平。在一些实施方案中，个体在任何症状复发后需要长期的间歇性治疗。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物为单位剂型，适用于精确剂量的单次施用。在单位剂型中，制剂被分成含有适当量的本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量是包含离散量的制剂的包装形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。在一些实施方案中，水性悬浮液组合物包装在单剂量不可重新封闭的容器中。在一些实施方案中，使用多剂量可再封闭容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的制剂以单位剂型呈现，其包括但不限于安瓿，或以具有添加的防腐剂的多剂量容器呈现。
在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与至少或约1微克(ug)、10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug、70ug、80ug、90ug、100ug、200ug、300ug、400ug、500ug、600ug、700ug、800ug、900ug、1000ug或大于1000ug的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与至少或约1毫克(mg)、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或大于500mg的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与约1至10、1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至150、1至200、10至20、10至40、10至60、10至80、10至100、10至150、10至200、20至40、20至60、20至80、20至100、20至150、20至200、40至60、40至80、40至100、40至150、40至200、60至80、60至100、60至150、60至200、80至100、80至150、80至200、100至150、100至200或150至200微克(ug)范围的HC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，肿瘤周围的区域与约1至10、1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至150、1至200、10至20、10至40、10至60、10至80、10至100、10至150、10至200、20至40、20至60、20至80、20至100、20至150、20至200、40至60、40至80、40至100、40至150、40至200、60至80、60至100、60至150、60至200、80至100、80至150、80至200、100至150、100至200或150至200毫克(mg)范围的HC-HA/PTX3复合物接触。
适用于本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的日剂量为例如约0.01至100mg。大型哺乳动物(包括但不限于人)的指示日剂量范围为约10ug至约100mg、约0.5mg至约100mg，方便地以分剂量施用，包括但不限于每天多达四次或以缓释形式施用。适合口服施用的单位剂型包括约1至50mg活性成分。注射到肿瘤和/或周围组织中的合适剂量在每次注射约0.1至约100mg的范围内。上述范围仅是暗示性的，因为关于个体治疗方案的变量数量很大，并且与这些推荐值有相当大的偏差并不少见。在一些实施方案中，剂量根据许多变量而改变，不限于使用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性、待治疗的疾病或病况、施用方式、个体对象的要求、正在治疗的疾病或病况的严重程度以及医生的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，包括但不限于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。在一些实施方案中，毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它表示为LD50和ED50之间的比值。优选表现出高治疗指数的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于制定用于人的剂量范围。本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的剂量优选位于包括ED50(具有最小毒性)的循环浓度范围内。在一些实施方案中，剂量根据所使用的剂型和所使用的施用途径而在该范围内变化。
在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物包装为制品，所述制品含有包装材料、有效预防和/或治疗疾病或病况的药物组合物以及指示药物组合物将用于治疗疾病或病况的标签。在一些实施方案中，药物组合物被包装在单位剂型中，其含有一定量的单剂量或多剂量的药物组合物。在一些实施方案中，包装的组合物包含药物组合物的冻干粉末，其在施用前被重构(例如，用水或盐水)。
医疗装置
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在可植入医疗装置的表面上或配制为用于可植入医疗装置的涂层。用于将透明质酸共价连接至例如但不限于金属、聚合物、陶瓷、二氧化硅和复合材料表面的方法在本领域中是众所周知的，并且在一些实施方案中，与本文提供的用于在此类表面上组装nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的方法结合使用(参见例如，美国专利号5,356,433；5,336,518、4,613,665、4,810,784、5,037,677、8,093,365)。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在可植入医疗装置或其一部分的表面上。在一些实施方案中，已根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被纯化，然后直接附着在可植入医疗装置或其一部分的表面上。在一些实施方案中，已根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被纯化，然后配制成用于附着到医疗装置或其一部分的涂层。在一些实施方案中，涂层直接施加到表面上或施加到经预处理或经涂覆的表面，其中所述预处理或涂覆被设计成有助于涂层粘附到基材上。在一些实施方案中，已根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被纯化，然后附着到已经涂有促进nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附着的物质的医疗装置或其一部分。例如，在一些实施方案中，医疗装置或其一部分涂有粘性聚合物，该粘性聚合物在其表面上提供官能团以用于nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的透明质酸的共价连接。在一些实施方案中，使用偶联剂，例如但不限于碳二亚胺，以将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物连接至聚合物涂层。在一些实施方案中，采用光固定来将已经根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物共价连接至医疗装置或其一部分。在一些实施方案中，使用包含光化学或热化学反应性基团的间隔分子将已根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附着至医疗装置或其一部分。
在一些实施方案中，通过例如浸涂将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的涂层制剂施加到基材上。其他施加方法包括但不限于喷涂、洗涤、气相沉积、刷涂、辊涂、帘式涂布、旋涂和本领域已知的其他方法。
示例性的可植入医疗装置包括但不限于骨植入物、伤口引流管、分流器、尿道插入物、金属或塑料植入物、支架、支架移植物、血管移植物、小球、晶片、可植入药物泵、药物递送系统、微粒、纳米粒子和微胶囊。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物连接至微胶囊或直接组装在微胶囊上。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与用于形成微胶囊的材料组合并且产生包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的微胶囊。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于包被微胶囊的内表面。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于包被微胶囊的外表面。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于包被微胶囊的内表面和外表面。
组合
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与除了天然或重构的HC-HA/PTX3复合物之外的第二或另外的或额外的治疗剂结合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与两种或更多种治疗剂结合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与一种或多种治疗剂结合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种治疗剂结合使用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂以相同剂型施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂以单独的剂型施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂同时(例如，同时、基本上同时或在同一治疗方案内)施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂依次施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在第二治疗剂之前或之后施用。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二活性剂之间的时间段范围从几分钟到几小时，这取决于每种药剂的性质，例如药剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学曲线。在一些实施方案中，目标分子浓度的昼夜变化决定了最佳剂量间隔。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与第二活性剂之间的时间为约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月或更长时间。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的共同施用导致nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物所需的剂量低于单独施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物时所需的剂量。在一些实施方案中，第二治疗剂的共同施用导致第二药剂的所需剂量低于单独施用第二药剂时所需的剂量。用于通过实验确定用于联合治疗方案的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法是本领域已知和记载的。例如，节拍式给药的使用，即，提供更频繁、更低的剂量以使毒副作用最小化，已在本领域中广泛描述。联合治疗进一步包括在不同时间开始和停止的周期性治疗，以协助个体的临床管理。
在一些实施方案中，对nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和一种或多种另外治疗剂的联合治疗进行修改。在一些实施方案中，联合治疗被修改，由此nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量相对于第二治疗剂的量增加。在一些实施方案中，联合治疗被修改，由此nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量相对于第二治疗剂的量减少。在一些实施方案中，联合治疗被修改，由此第二治疗剂的量相对于nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量增加。在一些实施方案中，联合治疗被修改，由此第二治疗剂的量相对于nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量减少。
在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞毒剂、镇痛剂、抗炎剂、抗生素、抗微生物剂、抗血管生成剂、化疗剂、抗肿瘤剂、免疫疗法或放射疗法。在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自烷化剂、抗代谢物、表叶毒素(epidophyllotoxins)、抗肿瘤酶、拓扑异构酶抑制剂、丙卡巴肼、米托蒽醌、钯配位络合物、生物反应调节剂和生长抑制剂、激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、芳香酶抑制剂、抗雌激素、抗雄激素、皮质类固醇、促性腺激素激动剂、微管活性剂、亚硝基脲、脂质或蛋白激酶靶向剂、免疫调节药物(IMiD)、蛋白质或脂质磷酸酶靶向剂、抗血管生成剂、Akt抑制剂、IGF-I抑制剂、FGF3调节剂、mTOR抑制剂、Smac模拟物、HDAC抑制剂、诱导细胞分化的药剂、缓激肽1受体拮抗剂、血管紧张素II拮抗剂、环氧合酶抑制剂、乙酰肝素酶抑制剂、淋巴因子抑制剂、细胞因子抑制剂、IKK抑制剂、P38MAPK抑制剂、HSP90抑制剂、多激酶抑制剂、二膦酸盐、雷帕霉素衍生物、抗凋亡通路抑制剂、凋亡通路激动剂、PPAR激动剂、RAR激动剂、Ras同种型抑制剂、端粒酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、氨肽酶抑制剂、SHIP激活剂-AQX-MN100、Humax-CD20(奥法木单抗)、CD20拮抗剂、IL2-白喉毒素融合物或其组合。在一些实施方案中，抗微生物剂是抗病毒剂、抗细菌剂或抗真菌剂。一种或多种非限制性示例性抗细菌剂包括如下分类：氨基糖苷、β内酰胺、喹诺酮或氟喹诺酮、大环内酯、磺胺、磺胺甲噁唑、四环素、链阳菌素、噁唑烷酮(如利奈唑胺)、克林霉素、林可霉素、利福霉素、糖肽、多粘菌素、脂肽类抗生素以及药理学上可接受的钠盐、药理学上可接受的钙盐、药理学上可接受的钾盐、脂质制剂、上述的衍生物和/或类似物。一些示例性类别的先天肽或蛋白质是转铁蛋白、乳铁蛋白、防御素、磷脂酶、溶菌酶、抗菌肽、丝氨酸蛋白酶杀菌素、杀细菌透性增加蛋白、两亲性α螺旋肽和其他合成抗微生物蛋白。在一些实施方案中，抗微生物剂是防腐剂。
在一些实施方案中，第二治疗剂选自ARRY-797、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、放线菌素(actinomycins)C2、C3、D、和F1、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑(melphalan)、雌莫司汀(estramustine)、美登醇(maytansinol)、利福霉素(rifamycin)、曲张链菌素(streptovaricin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、地托比星(detorubicin)、洋红霉素(carminomycin)、依索比星(esorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(bleomycins)A、A2和B、喜树碱(camptothecin)、伊立替康(Irinotecan)、拓泊替康(Topotecan)、9-氨基喜树碱、10,11-亚甲二氧基喜树碱、9-硝基喜树碱、硼替佐米(bortezomib)、替莫唑胺(temozolomide)、TAS103、NPI0052、康普瑞汀(combretastatin)、康普瑞汀A-2(combretastatin A-2)、康普瑞汀A-4(combretastatin A-4)、加利车霉素(calicheamicins)、新制癌菌素(neocarcinostatins)、埃博霉素(epothilones)A、B、C和半合成变体、赫赛汀(Herceptin)、利妥昔单抗(Rituxan)、CD40抗体、天冬酰胺酶(asparaginase)、白介素(interleukins)-2、干扰素(interferons)、亮丙瑞林(leuprolide)、和培门冬酶(pegaspargase)、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine)、托拉弗(ptorafur)、5'-脱氧氟尿苷、UFT、MITC、S-1卡培他滨(S-1capecitabine)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、它莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremefine)、tolmudex、诺拉屈西二氢氯组胺(thymitaq)、氟他胺(flutamide)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、比卡鲁胺(bicalutamide)、非那雄胺(finasteride)、雌二醇(estradiol)、曲沃昔芬(trioxifene)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸亮丙瑞林(leuproelin acetate)、雌莫司汀(estramustine)、屈洛昔芬(droloxifene)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、睾内酯(testolactone)、睾酮(testosterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、羟孕酮(hydroxyprogesterone)、丝裂霉素(mitomycins)A、B和C、泊非霉素(porfiromycin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、四铂(tetraplatin)、铂-DACH(platinum-DACH)、奥玛铂(ormaplatin)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、CI-973、端粒抑素(telomestatin)、CHIR258、Rad 001、SAHA、烟草苷(Tubacin)、17-AAG、索拉非尼(sorafenib)、JM-216、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、特罗凯(Tarceva)、易瑞沙(Iressa)、伊马替尼(Imatinib)、米替福新(Miltefosine)、哌立福新(Perifosine)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲蝶呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤(dichloro-methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、别嘌呤醇(allopurinol)、克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、2-氯腺苷(2-chloroadenosine)、脱氧胞苷(deoxycytidine)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、5-氮杂胞嘧啶(5-azacytosine)、吉西他滨(gencitabine)、5-氮杂胞嘧啶-阿拉伯糖苷(5-azacytosine-arabinoside)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、环氧长春碱(leurosine)、异长春碱(leurosidine)和长春地辛(vindesine)、紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝(taxotere)和/或多西他赛(docetaxel)。
在一些实施方案中，第二治疗剂是烟酸、贝特类、他汀类、Apo-A1模拟多肽(例如，DF-4，Novartis)、apoA-I转录上调剂、ACAT抑制剂、CETP调节剂、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体拮抗剂、P2Y12受体拮抗剂、Lp-PLA2-抑制剂、抗肿瘤坏死因子(TNF)剂、白介素-1(IL-1)受体拮抗剂、白介素-2(IL-2)受体拮抗剂、白介素-6(IL-6)受体拮抗剂、白介素-12(IL-12)受体拮抗剂、白介素-17(IL-17)受体拮抗剂、白介素-23(IL-23)受体拮抗剂、细胞毒性剂、抗微生物剂、免疫调节剂、抗生素、T细胞共刺激阻滞剂、B细胞耗竭剂、免疫抑制剂、抗淋巴细胞抗体、烷化剂、抗代谢药、植物生物碱、萜类化合物、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素、单克隆抗体、激素疗法(例如，芳香酶抑制剂)或其组合。
在一些实施方案中，第二活性剂是抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体阻断抗体、抗TNF抗体、抗TNF受体阻断抗体、抗IL1β抗体、抗IL1β受体阻断抗体、抗IL-2抗体、抗IL-2受体阻断抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6受体阻断抗体、抗IL-12抗体、抗IL-12受体阻断抗体、抗IL-17抗体、抗IL-17受体阻断抗体、抗IL-23抗体或抗IL-23受体阻断抗体。
在一些实施方案中，第二活性剂是阿来西普(alefacept)、依法利珠单抗(efalizumab)、甲氨蝶呤(methotrexate)、阿维A酸(acitretin)、异维A酸(isotretinoin)、羟基脲(hydroxyurea)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)、达力士(Dovonex)、泰克龙(Taclonex)、倍他米松(betamethasone)、他扎罗汀(tazarotene)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿巴西普(abatacept)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、抗CD45单克隆抗体AHN-12(NCI)、碘-131抗-B1抗体(Corixa Corp.)、抗CD66单克隆抗体BW 250/183(NCI，Southampton General Hospital)、抗CD45单克隆抗体(NCI，Baylor College of Medicine)、抗体抗anb3整合素(NCI)、BIW-8962(BioWa Inc.)、抗体BC8(NCI)、抗体muJ591(NCI)、铟In 111单克隆抗体MN-14(NCI)、钇Y 90单克隆抗体MN-14(NCI)、F105单克隆抗体(NIAID)、单克隆抗体RAV12(Raven Biotechnologies)、CAT-192(人抗TGF-β1单克隆抗体，Genzyme)、抗体3F8(NCI)、177Lu-J591(Weill Medical Collegeof Cornell University)、TB-403(BioInvent International AB)、阿那白滞素(anakinra)、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢菌素A(cyclosporine A)、来氟米特(leflunomide)、d-青霉胺(d-penicillamine)、阿米替林(amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥(nitrogen mustard)、普拉睾酮(prasterone)、LJP 394(阿贝莫司钠(abetimus sodium))、LJP 1082(La Jolla Pharmaceutical)、依库珠单抗(eculizumab)、贝利木单抗(belibumab)、rhuCD40L(NIAID)、依帕珠单抗(epratuzumab)、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)、沙立度胺(thalidomide)、抗胸腺细胞球蛋白-马(Atgam，Pharmacia Upjohn)、抗胸腺细胞球蛋白-兔(胸腺球蛋白，Genzyme)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3，FDA Office of Orphan Products Development)、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、利鲁唑(riluzole)、克拉屈滨(cladribine)、那他珠单抗(natalizumab)、干扰素β-1b(interferon beta-1b)、干扰素β-1a(interferonbeta-1a)、替扎尼定(tizanidine)、巴氯芬(baclofen)、美沙拉嗪(mesalazine)、美沙拉嗪片(asacol)、颇得斯安(pentasa)、氨水杨酸(mesalamine)、巴柳氮(balsalazide)、奥沙拉秦(olsalazine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、AIN457(抗IL-17单克隆抗体，Novartis)、茶碱(theophylline)、D2E7(来自Knoll Pharmaceuticals的人抗TNF mAb)、美泊利单抗(Mepolizumab)(抗IL-5抗体，SB 240563)、卡那努单抗(Canakinumab)(抗IL-1β单克隆抗体，NIAMS)、抗IL-2受体抗体(达珠单抗(Daclizumab)，NHLBI)、CNTO 328(抗IL-6单克隆抗体，Centocor)、ACZ885(全人抗白介素-1β单克隆抗体，Novartis)、CNTO 1275(全人抗IL-12单克隆抗体，Centocor)、(3S)-N-羟基-4-({4-[(4-羟基-2-丁炔基)氧基]苯基}磺酰基)-2,2-二甲基-3-硫代吗啉甲酰胺(阿雷司他(apratastat))、戈利木单抗(golimumab)(CNTO 148)、奥那西普(Onercept)、BG9924(Biogen Idec)、培塞利珠单抗(CertolizumabPegol)(CDP870，UCB Pharma)、AZD9056(AstraZeneca)、AZD5069(AstraZeneca)、AZD9668(AstraZeneca)、AZD7928(AstraZeneca)、AZD2914(AstraZeneca)、AZD6067(AstraZeneca)、AZD3342(AstraZeneca)、AZD8309(AstraZeneca)、)、[(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸(硼替佐米(Bortezomib))、AMG-714、CNTO15(抗IL-15单克隆抗体，Amgen)、ABT-874(抗IL-12单克隆抗体，Abbott Labs)、MRA(托珠单抗(Tocilizumab)、抗IL-6受体单克隆抗体，Chugai Pharmaceutical)、CAT-354(人抗白介素-13单克隆抗体，Cambridge Antibody Technology,MedImmune)、阿司匹林(aspirin)、水杨酸、龙胆酸、胆碱水杨酸镁、水杨酸胆碱、胆碱水杨酸镁、水杨酸胆碱、水杨酸镁、水杨酸钠、二氟尼柳(diflunisal)、卡洛芬(carprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurobiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabutone)、酮咯酸(ketolorac)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolactromethamine)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、甲氯芬酯(meclofenamate)、甲氯芬酸钠(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamicacid)、吡罗昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、依托昔布(etoricoxib)、卢美昔布(lumiracoxib)、CS-502(Sankyo)、JTE-522(Japan Tobacco Inc.)、L-745,337(Almirall)、NS398(Sigma)、倍他米松(betamethasone，Celestone)、泼尼松(prednisone，Deltasone)、阿氯米松(alclometasone)、醛固酮(aldosterone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、环索奈德(ciclesonide)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龙(clocortolone)、氯泼尼醇(cloprednol)、可的松(cortisone)、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特(deflazacort)、脱氧皮质酮(deoxycorticosterone)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoximetasone)、去氧皮质酮(desoxycortone)、地塞米松(dexamethasone)、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(fluclorolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟氢缩松(fludroxycortide)、氟米松(flumetasone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟轻松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼定(fluprednidene)、氟替卡松(fluticasone)、福莫可他(formocortal)、福莫特罗(formoterol)、氯氟舒松(halcinonide)、卤米松(halometasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋丙氢可的松(hydrocortisone aceponate)、丙丁氢化可的松(hydrocortisone buteprate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、氯替泼诺(loteprednol)、甲羟松(medrysone)、甲泼尼松(meprednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、醋丙甲泼尼龙(methylprednisolone aceponate)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼卡酯(prednicarbate)、泼尼松(prednisone)、利美索龙(rimexolone)、替可的松(tixocortol)、曲安西龙(triamcinolone)、乌倍他索(ulobetasol)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、氟达拉滨(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、5-氟脲嘧啶(5FU)、氟尿苷(floxuridine，FUDR)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧苄啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、培美曲塞(pemetrexed)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、更生霉素(dactinomycin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicine)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、博来霉素(bleomycin)、普利霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、非那雄胺(finasteride)、戈舍瑞林(goserelin)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorozole)、依西美坦(exemestane)、4-雄烯-3,6,17-三酮(“6-OXO”；1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)、福美坦(formestane)、睾内酯(testolactone)、法倔唑(fadrozole)或其组合。
在一些实施方案中，第二治疗剂是抗生素。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗细菌剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、巴龙霉素(paromomycin)、格尔德霉素(geldanmycin)、除莠霉素(herbimycin)、氯碳头孢(loracarbef)、厄他培南(ertapenem)、多利培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)、西司他丁(cilastatin)、美洛培南(meropenem)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢噻吩(cefalotin)、头孢氨苄(cefalexin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、地氟丙嗪(defprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢托仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢吡肟(cefepime)、头孢比罗(ceftobiprole)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)、大观霉素(spectinomycin)、氨曲南(aztreonam)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(meticillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、盘尼西林(penicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillan)、杆菌肽(bacitracin)、粘菌素(colistin)、多粘菌素(polymyxin)B、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovfloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、百浪多息(prontosil)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺嘧啶(sulfanimilimde)、柳氮磺胺吡啶(sulfsalazine)、磺胺异噁唑(sulfsioxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)、地美环素(demeclocycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxtetracycline)、四环素(tetracycline)、胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、呋喃唑酮(furazolidone)、异烟肼(isoniazid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、平板霉素(platensimycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、奎奴普丁(quinuspristin)/达福普汀(dalfopristin)、利福平(rifampin)、替硝唑(tinidazole)及其组合。
在一些实施方案中，第二治疗剂是放射疗法。在一些实施方案中，第二治疗剂选自x射线疗法或质子束疗法。在一些实施方案中，放射疗法可以是外束放射或近距离放射疗法。
在一些实施方案中，第二治疗剂是靶向疗法。靶向疗法靶向有助于癌症生长和存活的特定基因、蛋白质或组织环境。在一些实施方案中，靶向疗法包括一种或多种单克隆抗体。在一些实施方案中，靶向疗法包括小分子，例如但不限于血管生成抑制剂，如本文所述。在一些实施方案中，靶向疗法包括一种或多种单克隆抗体和一种或多种小分子，如本文所述。
与细胞的组合
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与一个细胞、多个细胞或组织共同施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与治疗性细胞共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织移植物共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与干细胞移植物共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与器官移植物共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与免疫细胞共同施用。
在一些实施方案中，在肿瘤切除、冷冻消融或射频消融的同时(例如同时、基本上同时或在同一治疗方案内)施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合。在一些实施方案中，在肿瘤切除、冷冻消融或射频消融之前或之后施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与肿瘤切除、冷冻消融或射频消融之间的时间段范围从几分钟到几小时，这取决于每种药剂的性质，例如药剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学曲线。在一些实施方案中，目标分子浓度的昼夜变化决定了最佳剂量间隔。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与第二活性剂之间的时间为约少于一小时、少于一天、少于一周或少于一个月。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与肿瘤切除、冷冻消融或射频消融和免疫抑制剂共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与如下共同施用：肿瘤切除、冷冻消融、或射频消融和神经钙蛋白抑制剂(例如，环孢菌素(cyclosporin)或他克莫司(tacrolimus))；mTOR抑制剂(西罗莫司(sirolimus)；依维莫司(everolimus))；抗增殖剂(硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸(mycophenolic acid))；皮质类固醇(例如，泼尼松龙(prednisolone)或氢化可的松(hydrocortisone))；单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗(basiliximab)或达珠单抗(daclizumab))；多克隆抗T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或抗淋巴细胞球蛋白(ALG))；化疗剂；镇痛剂；抗炎剂；类固醇；和抗生素或其组合。
在一些实施方案中，用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包被组织。在一些实施方案中，用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包被多个干细胞。在一些实施方案中，用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包被器官。在一些实施方案中，用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包被组织防止组织受到宿主免疫系统的作用。
在一些实施方案中，使器官、组织或多个干细胞与本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，使器官、组织或多个干细胞与包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物接触。在一些实施方案中，组合物具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，组合物具有7.4的pH。在一些实施方案中，组合物还包含钾、镁和棉子糖。在一些实施方案中，组合物还包含腺苷、谷胱甘肽、别嘌醇和羟乙基淀粉中的至少一种。在一些实施方案中，组合物是补充有本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的UW溶液。
在一些实施方案中，使器官、组织或多个干细胞与本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触约30分钟、约1小时，约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约36小时或约48小时。在一些实施方案中，接触发生在保护组织和血管调节的温度(例如，低于环境温度)。在一些实施方案中，接触发生在4℃。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与免疫细胞共同施用于有需要的对象。在一些实施方案中，免疫细胞对于有需要的对象是同种异体的。在一些实施方案中，免疫细胞对于有需要的对象是自体的。在一些实施方案中，在施用于有需要的对象之前遗传修饰免疫细胞。在一些实施方案中，修饰免疫细胞以包含嵌合抗原受体(CAR T细胞疗法)。
实施例
以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制要求保护的主题的范围。
实施例1：确定前列腺癌细胞系在暴露于冷冻保存的AM和UC提取物或纯化的HC- HA/PTX3(AM)后的活力和代谢活性
已发表的数据(Alvim等人，“The potential risk of tumor progression afteruse of dehydrated human amnion/chorion membrane allograft in a positivemargin resection model”,Ther Adv Uro 2019,第11卷:1-10)表明，与未治疗的小鼠相比，用脱水的人羊膜和绒毛膜同种异体移植产品治疗的小鼠在部分切除后肿瘤生长更快。进行实验以确定前列腺癌细胞系在暴露于冷冻保存的AM和UC提取物或纯化的HC-HA/PTX3(AM)后的活力和代谢活性。
在两次或更多次超速离心后，检查冷冻保存的AM和UC的提取物或纯化的HC-HA/PTX3，以确定它们是否抑制增殖并降低人前列腺癌细胞系(即PC-3和LNCaP)的整体细胞代谢活性。
对于初步可行性，使用WST-1测定测试了纯化的HC-HA/PTX3和精制的BTGEL(即，颗粒化AM和UC)的影响。WST-1测定用于量化总细胞代谢活性。
LNCaP和PC-3的扩增
收到购买的冷冻PC-3(
Figure BDA0003886219510000681
CRL-1435TM，批号70004013)和LNCaP(LNCaP克隆FGC
Figure BDA0003886219510000682
CRL-1740，批号64207637)并储存在液氮中。将LNCaP和PC-3的每个小瓶(1ml，未提供细胞的量)以200x g离心5分钟。除去储存培养基，将细胞重新悬浮于1ml RPMI 1640完全培养基中。将总共0.5ml转移到100mm培养皿中(每个细胞系两个培养皿)。细胞在37℃和5％CO2孵育。三天后更换培养基，继续孵育细胞四天，此时细胞达到70％汇合。注意到LNCaP倾向于形成聚集体(图1A)而PC-3生长为均匀分布的单细胞层(图1B)。通过0.25％胰蛋白酶-EDTA(货号25200-056，Fisher Scientific)收获细胞并通过血细胞计数器计数。LNCaP和PC-3的总细胞数分别为5.92x106和2.88x106。
将细胞重新悬浮于如下含有5％DMSO的RPMI1640完全培养基中：
LNCaP：10管，5.4x105/管，0.5ml/管(约1.08x106/ml)，液氮罐：S1R4B5，以及
PC-3：10管，2.6x105/管，0.5ml/管(约5.2x105/ml)，液氮罐：S1R4B5。
rBTGel和HC-HA/PTX3对LNCaP和PC-3的细胞代谢活性的影响
将来自扩增(上述)的2.9x105个LNCaP细胞或2.9x105个PC-3细胞在一个100mm培养皿中传代并培养4天。收获细胞(LNCaP：总细胞为1.24x106，活力为91％；PC-3：总细胞为4.08x106，活力为97％；所以PC-3细胞比LNCaP细胞生长得更快，这与报告一致，即LNCaP和PC-3的细胞倍增时间分别约为60小时和33小时)并以1x104/cm2或3.2x104/ml接种在96孔板(LNCaP一个板，PC-3一个板)。孵育过夜后，用0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50或100μg/ml的rBTGel(供体号BTR161857；HA：175μg/ml；蛋白质：165μg/ml)或HC-HA/PTX3(AM/PBS的第2超速离心的汇集的级分3-9，供体2用于稳定性验证，DI：TGLP17E002)(例如，添加11.1μl的10x剂量至100μl培养基以获得准确剂量)处理LNCaP和PC-3细胞(n＝3)。处理48小时后，通过显微镜图像记录细胞形态(图2A和图2B，以及和图3A和图3B)，然后用于根据制造商说明(OD450或OD450–OD670)进行细胞代谢活性的WST-1测定(货号10008883，CaymanChemical Company，Ann Arbor，MI)(图2C和图2D以及图3C和图3D)。
在形态学上，LNCaP生长为小细胞簇和大细胞簇。处理细胞48小时后，高剂量(50和100μg/ml)的精制的BTgel导致大多数梭形细胞变成圆形细胞，但大多数细胞仍然附着并成簇。基于较低的细胞密度也可能发生细胞死亡。类似的形态变化在低得多的HC-HA/PTX3剂量(6.25μg/ml或更高)时发生。这些数据表明精制的BTGel和HC-HA/PTX3均抑制LNCaP的细胞代谢活性。精制的BTGel是在盐水(约154mM NaCl)中制备的，而HC-HA/PTX3已经用蒸馏水进行了广泛透析，并且含有无法检测到的盐。因此，当将冻干的BTGel添加到细胞培养基中时，它可能会增加培养基中的盐浓度，如果将盐浓度增加约30mM或更高，则可能会降低细胞增殖。当精制的BTGel以0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml添加时，使培养基中的盐浓度分别增加了6.2、12.4、24.7、49.5、98.9、197.9、395.8、791.5mM(用公式剂量/175*154/0.111得到盐浓度；BTGel的HA浓度为175μg/ml，盐水含154mM NaCl，每孔中培养基总体积为0.111ml)。因此，精制的BTGel在6.25μg/ml或更高时的抑制可能是由盐引起的，而不必担心HC-HA/PTX3的盐效应。WST-1测定数据显示，当精制的BTGel的剂量为25μg/ml或更高时，LNCaP的代谢活性受到抑制(p<0.05)(图2C)。由于担心盐效应，精制的BTGel是否能在这些剂量下抑制LNCaP的细胞代谢活性尚无定论。相比之下，6.25μg/ml或更高浓度的HC-HA/PTX3抑制LNCaP的代谢活性(40％–85％)(图2C和图2D)。
在形态学上，PC-3生长为比LNCaP分布更均匀的细胞。然而，在处理细胞48小时后，更高剂量(50和100μg/ml)的精制的BTGel导致细胞更圆。基于较低的细胞密度也可能发生细胞死亡。类似的形态变化在低得多的HC-HA/PTX3剂量(12.5μg/ml或更高)时发生。这些数据暗示精制的BTGel和HC-HA/PTX3均抑制PC-3的增殖(活力)。但是，如上所述，精制的BTGel在6.25μg/ml或更高时的抑制可能是由盐引起的，而不必担心HC-HA/PTX3的盐效应。WST-1测定数据显示，当精制的BTGel的剂量为6.25μg/ml或更高时，PC-3的增殖受到抑制(p<0.05)(图3C)。由于担心盐效应，精制的BTGel是否能在这些剂量下抑制PC-3的增殖尚无定论。相比之下，3.125μg/ml或更高浓度的HC-HA/PTX3抑制PC-3的增殖(8％–100％)(图3C和图3D)。
两个治疗组均显示具有剂量依赖性效应，可显著降低PC-3和LNCaP前列腺癌细胞的代谢效应。根据形态，似乎存在与较高浓度的WST-1读出相关的细胞死亡。
这些数据显示HC-HA/PTX3不促进PC-3和LNCaP癌症的形成，允许在前列腺切除术后使用。此外，rBTGEL被证明具有抗癌作用。下面的实施例将表明UC提取物对前列腺癌细胞增殖的影响，而没有潜在的盐影响。
结论
6.25μg/ml或更高的精制的BTGel和3.125μg/ml或更高的HC-HA/PTX3抑制PC-3的增殖。25μg/ml或更高的精制的BTGel和6.25μg/ml或更高的HC-HA/PTX3抑制LNCaP的增殖。由于担心盐效应，羊膜和脐带(AMUC)或精制的BTGel中的盐是否能在这些剂量下抑制增殖尚无定论。
与LNCaP相比，可能需要较低浓度的rBTGEL和HC-HA/PTX3来抑制PC-3，因为已知PC-3细胞具有更快的倍增时间。因此，阴性对照组和治疗组之间的差异在PC-3中会更大。
因此，尽管公布的数据表明某些胎儿支持产物与更快的肿瘤复发和生长有关，但这里证明AM和UC产物不会促进前列腺切除术后的癌症复发。
实施例2：确定前列腺癌细胞系在暴露于冷冻保存的UC提取物、HA和纯化的HC-HA/ PTX3(AM)后的代谢活性。
实施例1的结果显示HC-HA/PTX3在两种前列腺细胞系的浓度低至6.25μg/ml时降低这两种细胞类型中的代谢活性。此外，显示rBTGEL在25μg/ml及以上时抑制活性。进行以下研究以排除较高剂量rBTGel中的盐浓度混淆数据解释的可能性。
使用相同的WST-1测定测试水中的UC提取物。此外，还测试了HC-HA/PTX3以与UC结果进行比较。HA用作对照组。基于HAμg/ml测试了一系列剂量。
PC3和LNCaP细胞以1x104/cm2接种于96孔板(100ul/孔)(每个组n＝3)。孵育过夜后，将细胞用一系列剂量(由HA浓度定义，0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400μg/ml，n＝3)的UC(用水提取)、纯化的HC-HA/PTX3(AM/PBS的第2超速离心的汇集的级分3-9，供体2用于稳定性验证，DI：TGLP17E002，于2017年9月19日制备)和HA处理。处理48小时后，记录细胞形态，然后根据制造商的说明(OD450或OD450–OD670)用WST-1(货号10008883,Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI)测量细胞的细胞代谢活性。
WST-1测定数据显示，当用UC提取物(≥100μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥6.25μg/ml)处理时，LNCaP细胞的代谢活性受到显著抑制(p<0.05)，但HA处理时没有(参见图4A)。同样，UC提取物(≥200μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥1.56μg/ml)显著抑制PC-3细胞中的代谢活性，但HA没有(参见图4B)。使用浓度≥25μg/ml的HC-HA/PTX3在LNCaP(图5A–图5C)和PC3(图6A–图6C)细胞两者中在显微镜下明显注意到细胞死亡。
WST-1和形态学评估确定HC-HA/PTX3明显抑制代谢活性。根据形态，PC3和LNCaP细胞都变圆，与基质的粘附性降低，并且当暴露于更高浓度的HC-HA/PTX3时，细胞数量较少。不同之处在于LNCaP细胞在较高的HC-HA/PTX3浓度下聚集为小直径、圆形细胞的簇，但PC3细胞不聚集。
WST-1测定数据显示，当用UC提取物(≥100μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥6.25μg/ml)处理时，LNCaP细胞的代谢活性受到显著抑制(p<0.05)，但HA处理时没有。同样，UC提取物(≥200μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥1.56μg/ml)显著抑制PC-3细胞中的代谢活性，但HA没有。使用浓度≥25μg/ml的HC-HA/PTX3在LNCaP和PC3细胞两者中在显微镜下明显注意到细胞死亡。
讨论
WST-1和形态学评估确定HC-HA/PTX3明显抑制代谢活性。根据形态，PC3和LNCaP细胞都变圆，与基质的粘附性降低，并且当暴露于更高浓度的HC-HA/PTX3时，细胞数量较少。不同之处在于LNCaP细胞在较高的HC-HA/PTX3浓度下聚集为小直径、圆形细胞的簇，但PC3细胞不聚集。在暴露于HC-HA/PTX3后LNCaP聚集而PC3没有聚集的原因仍然未知，但LNCaP细胞已被证明比PC3具有更快的聚集率。这可能是由于它们的附着依赖性，LNCaP和PC3分别是锚定依赖性和独立的。对于LNCaP，活力和增殖需要附着在表面上，而脱离会通过失巢凋亡过程诱导细胞死亡。文献比较了LNCaP在不同涂层试剂(聚-l-赖氨酸、聚-l-鸟氨酸、人胎盘IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)上生长的效果，并显示层粘连蛋白和IV型胶原蛋白促进细胞聚集(图7，在24小时时采集)。这种聚集类似于本文提供的实验中看到的形态，并且可能表明HC-HA/PTX3减少了LNCaP细胞表面附着。众所周知，不同的底物特性，包括表面电荷、形貌、疏水性/亲水性、表面化学和表面能可能会影响细胞行为，而经修饰的细胞-底物相互作用可能会影响细胞内信号的产生。事实上，液体覆盖技术通常用于该领域，通过在具有非粘附特性的表面上培养细胞来诱导聚集/球体，因此细胞间的相互作用比细胞和表面之间建立的相互作用更为突出。因此，对于细胞系中的大多数，细胞聚集导致在1-3天内形成球体。
结论
WST-1测定数据显示，当用UC提取物(≥100μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥6.25μg/ml)处理时，LNCaP细胞的代谢活性受到显著抑制(p<0.05)，但HA处理时没有。同样，UC提取物(≥200μg/ml)和HC-HA/PTX3(≥1.56μg/ml)显著抑制PC-3细胞中的代谢活性，但HA没有。使用浓度≥25μg/ml的HC-HA/PTX3在LNCaP和PC3细胞两者中在显微镜下明显注意到细胞死亡。
这些数据表明UC提取物对前列腺细胞代谢活性的抑制与盐作用无关。此外，这里证明AM和UC产物不会促进前列腺切除术后的癌症复发。
实施例3：确定HC-HA/PTX3和HA对正常前列腺细胞/细胞系的形态和代谢活性的影 响，并与前列腺癌细胞系进行比较。
前列腺上皮由两个组织学上不同的层构成：分泌腔层和基底细胞层。使用人正常前列腺上皮基底细胞和腔细胞。人正常前列腺上皮基底细胞(PrEC)获自Clonetics-BioWhittaker,Inc.(Walkersville,MD,USA)，并使用PrEgM BulletKit在前列腺上皮基底细胞培养基(都来自Clonetics)中培养，其含有补充剂和生长因子(BPE、氢化可的松、hEGF、肾上腺素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、庆大霉素/两性霉素B和视黄酸)。
人正常前列腺腔PNT2细胞系购自Sigma(货号95012613)。该细胞系是通过用含有具有缺陷复制起点的SV40基因组的质粒转染，使正常成人前列腺上皮细胞永生化而建立的。在37℃、在加湿培养箱中、在空气中5％ CO2的气氛中、在补充有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640培养基(RPMI 1640完全培养基)中培养PNT2细胞。在70％-80％汇合时，通过0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA溶液收获细胞，并在液氮气相中以等分试样形式将其储存在95％完全培养基和5％ DMSO中。
表1：WST-1测定的细胞代谢分析：
Figure BDA0003886219510000731
Figure BDA0003886219510000741
细胞在它们各自的生长培养基中复苏。然后将细胞以3.2x104/ml在96孔板(即3200个细胞+100ul/孔)(每个测定n＝3)中接种过夜以进行WST-1测定。纯化的HC-HA/PTX3[AM2P(F 3-9)[TGAM17H008]；储备量＝67μg]和HMW-HA(Healon；货号CE0344；批号UP30583；储备浓度＝10mg/ml)用相应的培养基连续稀释以获得上述浓度。用连续剂量的纯化HC-HA/PTX3或HA处理细胞，并在37℃保持48小时。在处理前和处理24小时和48小时后，在显微镜下(10x和20x放大倍率的明场)记录细胞形态。按照制造商的说明(OD450或OD450 OD670)在48小时时通过WST-1(货号10008883，Cayman Chemical Company，AnnArbor，MI)测量每个细胞系的代谢活性。
A.正常人前列腺细胞/细胞系的扩增
人正常前列腺上皮基底细胞(PrEC)比人正常前列腺腔细胞(PNT2)生长得更快。PrEC的倍增时间为18-24小时，而PNT2的倍增时间更长，约为36-48小时。
PrEC(图8A)和PNT2(图8B)前列腺细胞系的以10x和20x放大率拍摄的明场图像显示正常前列腺细胞的形态。
B.HC-HA/PTX3和HMW-HA对人正常前列腺细胞形态的影响
PrEC细胞通常快速增殖并且很好地附着在表面上。通常细胞很好地相互粘附。
HC-HA/PTX3处理24小时后：在6.25μg/ml时，细胞失去细胞间粘附；在12.5μg/ml时，细胞间粘附的损失增加；在25μg/ml时，细胞逐渐开始改变其形态；在50μg/ml时，细胞逐渐变圆并失去细胞-细胞粘附；在100μg/ml时，细胞变圆并尺寸变小，但它们并未死亡。HC-HA/PTX3处理48小时后：在3.13μg/ml时，细胞开始解离；在25μg/ml时，细胞完全相互分离，并且没有聚集生长；在50μg/ml时，细胞受到胁迫，尺寸变小，变得更小和更圆；在100μg/ml时，细胞死亡，细胞计数急剧下降(图9)。
没有观察到HA处理的显著影响。
C.HC-HA/PTX3和HA对人正常前列腺细胞代谢的影响
在用HC-HA/PTX3治疗后，PrEC和PNT2的代谢活性以剂量依赖性方式显著降低。相比之下，HA对细胞代谢没有显著影响(图10A和10B)。在这两种类型的正常前列腺细胞之间，PrEC(图10A)对极低浓度的HC-HA/PTX3(1.56和3.125μg/ml)更敏感。相同低浓度的HC-HA/PTX3(1.56和3.13μg/ml)不影响PNT2(图10B)细胞代谢活性。
与不同浓度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3或HA孵育48小时后，通过WST-1测定在正常人原代前列腺上皮细胞PrEC和正常人前列腺细胞系PNT2中评估代谢活性(％)。通过相对于未处理样品的双尾t检验计算P值。
D.HC-HA/PTX3和HA治疗的正常&癌症前列腺细胞/细胞系之间细胞代谢活性的比 较分析
比较不同浓度的HC-HA/PTX3(图11A和11B)和HA(图12A和图12B)对正常前列腺细胞(PrEC&PNT2)和前列腺癌细胞系(LNCaP&PC3)的代谢活性的影响。正常和癌细胞类型都以类似的方式对HC-HA/PTX3和HMW-HA作出反应。在25μg/ml HC-HA/PTX3时，与癌细胞系(LNCaP&PC3)相比，PrEC细胞和PNT2细胞系显示更低敏感性。用HMW-HA处理后PrEC、PNT2、PC3和LNCaP细胞的代谢活性没有显著差异。
图11A-图11B和图12A-图12B显示了与不同浓度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后，通过WST-1测定在正常原代前列腺上皮细胞(PrEC)和细胞系(PNT2)和前列腺癌细胞系：PC3和LNCaP中评估的代谢活性(％)的比较分析。半对数回归分析表明，HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式线性抑制所有类型的前列腺细胞的代谢活性，而HA没有任何显著影响*(p<0.05)；**(p<0.01)；****(p<0.001)。
总体而言，HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制所有类型的人前列腺细胞/细胞系(包括正常和癌症)的细胞代谢活性，而HMW-HA没有显著影响。在浓度高达25μg/ml时，PNT2细胞系对HC-HA/PTX3的敏感性较低(细胞代谢活性：60％；p<0.001)，而癌细胞系(PC3和LNCaP)的代谢活性降低至低于25％(p<0.001)。
实施例4：确定HC-HA/PTX3和HA对所选癌症上皮细胞系的形态和代谢活性的影响。
上述实施例表明HC-HA/PTX3调节两种前列腺癌细胞系(PC-3和LNCaP)的代谢活性。在这项研究中，通过WST-1测定检测了HC-HA/PTX3和HMW-HA(作为对照)对4种不同人癌细胞系：A-375(黑色素瘤)、A549(肺癌)、MCF-7(乳腺癌)和HT-29(结肠腺癌)的形态和代谢活性的影响。基于实施例1中所示的结果选择HC-HA/PTX3和HA的浓度。
在实施例1中注意到，HC-HA/PTX3-反应曲线在50μg/ml及以上的浓度下趋于平稳。HC-HA/PTX3浓度在50μg/ml和100μg/ml之间的代谢活性没有显著变化。因此，HC-HA/PTX3的最大浓度保持在100μg/ml。
将细胞解冻并重新悬浮于5ml预热的新鲜完全培养基中，然后以250g离心5分钟。小心去除上清液，将细胞沉淀物重新悬浮在10ml预热的新鲜完全培养基中，并接种在100mm培养板中，保持在37℃。培养5天后，A-549、HT-29&A357细胞几乎70％-80％汇合，而MCF-7细胞生长缓慢。将细胞板从培养箱中取出，小心去除培养基，然后用3-5ml D-PBS洗涤两次。然后使用5ml 0.25％胰蛋白酶-0.53mM EDTA收获来自每个100mm板的细胞。5-10分钟后，加入5ml新鲜培养基以中和胰蛋白酶-EDTA的作用，将细胞以250g离心5分钟。离心后，小心去除上清液，将细胞沉淀物重新悬浮于2ml新鲜培养基中。对于每个细胞系，将10μl细胞悬浮液与10μl台盼蓝混合以染色死细胞，并在显微镜下通过血细胞计数器计数活细胞数。在这项研究中，使用了四个96孔板，每个细胞系一个。待接种的细胞数根据前面的实施例确定(接种细胞计数：实施例1和2中1x104/cm2)。假设96孔板的每个孔的面积为0.32cm2，则需要3.2x104/ml细胞。用在100μl培养基中的3200个细胞接种每个孔。用以下浓度的HC-HA/PTX3和HA(作为对照)处理细胞：0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100(μg/ml)，一式三份。使用了两个未经处理的样品：未经WST-1试剂处理的样品和未经WST-1试剂处理的样品(作为WST-1测定的对照)。为避免移液错误，将细胞在培养基中稀释至最终体积为8ml，如表2所示。
表2：在100μl培养基中产生3200个细胞的稀释方案
Figure BDA0003886219510000771
在37℃孵育过夜后，在明场显微镜下以放大倍率分别为10x和20x捕获细胞形态。纯化的HC-HA/PTX3[AM2P(F 3-9)；于2018年2月2日纯化；储备量＝25.78μg]和HMW-HA(Healon；货号CE0344；批号UP30583；失效日期：2018年12月；储备浓度＝10mg/ml)用相应的培养基连续稀释以获得所需的浓度(即0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)。用连续剂量的纯化HC-HA/PTX3或HA处理细胞，并在37℃培养箱保持48小时。在处理前和处理24小时和48小时后，在显微镜下(10x和20x放大倍率的明场)记录细胞形态。按照制造商的说明(OD450或OD450–OD670)在48小时时通过WST-1(货号10008883，Cayman ChemicalCompany，AnnArbor，MI)测量每个细胞系的代谢活性。
HC-HA/PTX3或HMW-HA对人癌症上皮细胞形态的影响：a.A-375(黑色素瘤)：正常情况下，细胞增殖迅速并且很好地附着在表面。
i.HC-HA/PTX3处理：24小时后：在25(μg/ml)时：细胞趋于纺锤形。在50(μg/ml)时：细胞变成纺锤形。在100(μg/ml)时：细胞是圆形和死亡的。48小时后：在6.25(μg/ml)时：细胞显示出轻微失去细胞间粘附。在12.5(μg/ml)时：细胞失去更多的细胞间粘附。细胞倾向于单独生长而不是成团生长。在25(μg/ml)时：>80％的细胞正在收缩，呈纺锤形，其余细胞呈圆形。在50(μg/ml)时：>60％细胞死亡并呈圆形，其余细胞呈纺锤形。在100(μg/ml)时：所有细胞都呈圆形并死亡。参见图13。
ii.HA处理：没有观察到HA的显著影响。
iii.结果表明，随着HC-HA/PTX3浓度的增加，一般而言A-375细胞按以下步骤以剂量依赖性方式改变形态：
正常上皮细胞相互粘附>细胞失去细胞间附着并变成纺锤形。细胞收缩>细胞变圆并且死亡。
a.HT-29(结肠癌)：细胞通常呈圆形并聚集生长。每个聚合体看起来像球。
i.HC-HA/PTX3处理：24小时后：在50(μg/ml)时：细胞失去粘附并被分离。在100(μg/ml)时：细胞呈圆珠状，存活较少。48小时后：在1.56(μg/ml)时：细胞间粘附逐渐丧失。在6.25(μg/ml)时：每个团块中<10个细胞相互粘附。细胞失去更多的细胞间粘附。在25(μg/ml)时：细胞倾向于单个而不是聚集生长。在50(μg/ml)时：细胞单个生长。在100(μg/ml)时：单个细胞呈圆形，存活较少。参见图14。
ii.HA处理：没有观察到HA的显著影响。
iii.随着HC-HA/PTX3浓度以剂量依赖性方式增加，一般而言HT-29细胞按以下步骤改变形态：
>20个细胞相互粘附。看起来像葡萄。>细胞间粘附逐渐松动><10个细胞在每个团块中相互粘附>细胞逐渐从团块中出来。细胞间和细胞基质的粘附性降低，而不是呈聚集。>单个圆形细胞存活较少。
a.A549(肺癌)：通常细胞是上皮细胞并迅速增殖。
i.HC-HA/PTX3处理：24小时后：在25(μg/ml)时：细胞形态略微变为梭形。在50(μg/ml)时，细胞倾向于更多的纺锤形。在100(μg/ml)时：所有细胞均未死亡。死细胞是圆形的。48小时后：在12.5(μg/ml)时：细胞形态略微变为纺锤形。在50(μg/ml)时：细胞倾向于更多的纺锤形。在100(μg/ml)时：所有细胞均未死亡。死细胞是圆形的。参见图15。
ii.HA处理：没有观察到HA的显著影响。
iii.在HC-HA/PTX3处理下，一般而言A-549细胞按以下步骤改变其形态：
细胞增殖。细胞间粘附。>细胞圆形&点状。死亡
a.MCF-7(乳腺癌)：通常细胞是上皮细胞。缓慢生长。相互粘附。聚集生长。
i.HC-HA/PTX3处理：24小时后：在50μg/ml之前无影响。在100(μg/ml)时：圆珠状细胞死亡。48小时后，影响相同。参见图16。
ii.HA处理：没有观察到HA的显著影响。
iii.在HC-HA/PTX3处理下，一般而言MCF-7细胞按以下步骤改变其形态：
细胞聚集生长>细胞解离。死亡。
HC-HA/PTX3或HMW-HA对癌细胞系代谢活性的影响：
A375：A-375细胞代谢以剂量依赖性方式显著降低。用HC-HA/PTX3处理48小时后，细胞代谢从1.56μg/ml开始发生显著变化。没有观察到HA的显著影响。(图17A)
HT-29：HT-29细胞代谢以剂量依赖性方式显著降低。用HC-HA/PTX3处理48小时后，细胞代谢活性从6.25μg/ml开始发生显著变化。没有观察到HA的显著影响。(图17B)
A549：A549细胞代谢以剂量依赖性方式显著降低。用HC-HA/PTX3处理48小时后，细胞代谢活性从0.78μg/ml开始变化。没有观察到HA的显著影响。(图17D)
MCF-7：MCF-7显示对HC-HA/PTX3的敏感性最低。在高浓度(50μg/ml)下可以观察到HC-HA/PTX3的显著影响，但影响不如在A375和HT-29等其他细胞系中观察到的那么强。(图17C)
HC-HA/PTX3抑制细胞聚集、细胞间连接、细胞形状和细胞粘附，从而以剂量依赖性方式抑制所测试的所有4种癌细胞类型的细胞代谢活性。相比之下，透明质酸对所有四种细胞类型的细胞形态和代谢活性没有显著影响。这些影响发生得很快，例如，在24小时内，强烈表明HC-HA/PTX3在与CD44结合后会导致细胞骨架/膜相互作用发生变化，这是特异性的并且与HMW HA不同。
在4种细胞系中，A375和HT-29对HC-HA/PTX3比A549和MCF-7更敏感。由于MCF-7不显著表达CD44，这四种肿瘤细胞之间的差异可能与CD44表达的程度有关。
A375和HT-29在与HC-HA/PTX3接触后在细胞间粘附和底物粘附方面的变化是不同的。对于A375，脱离后出现形态变化：细胞首先变成纺锤形，然后变成圆形。相比之下，HT-29没有表现出任何形态变化。细胞从一开始就保持圆形。在高浓度的HC-HA/PTX3下，它们逐渐失去了细胞间附着。这些结果表明，在不同类型的癌症中，HC-HA/PTX3可能通过不同的途径调节细胞粘附信号传导。
在这些癌细胞系中观察到的主要事件是：细胞代谢活性的抑制，导致细胞形状改变，导致细胞死亡。
实施例5：确定HC-HA/PTX3和HA对间充质细胞的影响。
在实施例2和4中，已鉴定HC-HA/PTX3影响正常前列腺上皮细胞的形态和代谢活性，与对肿瘤细胞的形态和代谢活性的影响相似。为了解决这种影响是否也适用于正常间充质细胞，检查了HC-HA/PTX3是否也对一系列间充质细胞的形态和代谢活性产生类似的影响。
分别使用了三种正常的间充质原代细胞：(a)角膜缘微环境细胞(LNC)、(b)人小梁网(HTM)和(c)人角膜成纤维细胞(HCF)。细胞在它们各自的生长培养基中培养。LNC在HSCM培养基中在5％基底胶(无血清)上培养。HTM细胞在具有5％ FBS的ESCM培养基中5％基底胶上培养。HCF细胞仅在具有5％ FBS的DMEM中在塑料上培养。在6孔板的每个孔中培养细胞。对于LNC和HTM细胞，首先用1000μl 5％基底胶包被孔，并在37℃孵育1小时。随后，将细胞接种在每个孔中在1000μl培养基中。在细胞达到充分汇合后，将它们用胰蛋白酶消化，然后以200g短暂离心5分钟。除去培养基并用新鲜培养基补充细胞沉淀物。将96孔板的选定孔包被50μl 5％基底胶，并在37℃孵育1小时。之后，将LNC和HTM细胞接种在基底胶包被的96孔板中，并在37℃孵育过夜。在每个孔中，将3200个细胞接种在100μl培养基中。第二天，将细胞用一系列剂量(由HA浓度定义，例如0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml，n＝3)的纯化的HC-HA/PTX3和HA处理。HC-HA/PTX3和HA的浓度通过如实施例3中所做的连续稀释计算。分别在处理15-30分钟、1小时、5小时、24小时和48小时后记录细胞形态。孵育48小时后，根据制造商的说明(OD450或OD450–OD670)，通过WST-1(货号10008883,Cayman ChemicalCompany,Ann Arbor,MI)测量细胞代谢活性。
使用25至100μg/ml HC-HA/PTX3在15分钟内观察到角膜缘微环境细胞(LNC)形态的变化。然而，在与HC-HA/PTX3孵育较长时间(1小时)后，细胞再次恢复到原始形状。细胞形态没有进一步改变(参见图18A)。
用高剂量HMW-HA(100μg/ml)处理的细胞收缩更多并变成线状(图18B)。当用100μg/ml HC-HA/PTX3处理48小时时，LNC变得扁平但相对较短。图18C显示在与100μg/ml HC-HA/PTX3或HMW-HA孵育48小时后LNC(角膜缘微环境细胞)的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
LNC在代谢上对HC-HA/PTX3具有很强的抗性。孵育48小时后，总体细胞代谢活性保持在75％左右，表明HC-HA/PTX3对LNC的影响很小，尽管随着HC-HA/PTX3浓度的逐渐增加，细胞代谢活性迅速下降。HC-HA/PTX3的显著影响始于浓度12.5μg/ml。用HMW-HA处理时未检测到LNC代谢活性的显著变化。图19显示与不同浓度(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3孵育48小时后，通过WST-1测定评估的角膜缘微环境细胞中的代谢活性(％)。通过相对于未处理样品的双尾学生t检验计算p值。
与LNC相比，人小梁网(HTM)细胞对HC-HA/PTX3的抗性更强。在HTM细胞中在短时间内没有观察到形态变化。在与不同浓度的HC-HA/PTX3孵育48小时期间，细胞形状没有改变。培养基中5％FBS可使细胞对HC-HA/PTX3的抗性更强。细胞形态在用HMW-HA处理时没有改变。图20A和图20B显示在用不同浓度的HC-HA/PTX3(图20A)和HMW-HA(图20B)处理后针对不同的时间点(分别是15-30分钟、1小时、5小时、24小时和48小时)的HTM(人小梁网)细胞的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
HTM细胞对HC-HA/PTX3具有很强的抗性，如在细胞形态学中观察到的(图20A)。孵育48小时后，总细胞代谢活性保持在高于75％，表明HC-HA/PTX3对HTM的影响很小，尽管最高浓度的HC-HA/PTX3(100μg/ml)显著降低细胞代谢活性(p＝0.04)。在用HMW-HA处理时未检测到HTM代谢活性的显著变化(图20B)。
图21显示与用不同浓度(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3孵育48小时后，通过WST-1测定评估的人小梁网细胞中的代谢活性(％)。通过相对于未处理样品的双尾学生t检验计算p值。如图所示，HC-HA/PTX3和HMW-HA对HTM几乎没有影响。
HC-HA/PTX3对人角膜成纤维细胞(HCF)形态的影响与对LNC的影响几乎相似。在用100μg/ml HC-HA/PTX3处理后15-30分钟内，细胞变成圆形，但它们在一个小时后恢复到原来的形态。之后，即使与高浓度HC-HA/PTX3孵育较长时间(48小时)，细胞形状也不再改变。HMW-HA对HCF细胞形态没有显著影响。图22A和图22B显示在用不同浓度的HC-HA/PTX3(图22A)和HMW-HA(图22B)处理后针对不同的时间点(分别是15-30分钟、1小时、5小时、24小时和48小时)的人角膜成纤维细胞(HCF)的代表性明场显微图像(比例尺50μm)。
HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制HCF细胞的细胞代谢活性，而HMW-HA无显著影响。在浓度为12.5μg/ml开始观察到显著抑制。图23显示与不同浓度(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3和HA孵育48小时后，通过WST-1测定评估的人角膜成纤维细胞中的代谢活性(％)。通过相对于未处理样品的双尾学生t检验计算p值。
总体而言，与上皮细胞(正常和癌症)相比，人正常间充质原代细胞对HC-HA/PTX3表现出更高的抗性(表3)，尽管HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式显著抑制细胞代谢活性。HMW-HA对原代间充质细胞的细胞形态和代谢活性没有显著影响。在三种类型的间充质细胞中，HTM对高浓度(100μg/ml)的HC-HA/PTX3更加严格(代谢活性：84.8％；p＝0.04)，而相同浓度的HC-HA/PTX3可以更多地抑制HCF(50％；p＝0.01)和LNC(61.4％；p＝0.04)的代谢活性。图24A和图24B显示在与不同浓度(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的HC-HA/PTX3(图24A)和HA(图24B)孵育48小时后通过WST-1测定评估的三种类型的人正常原代间充质细胞：HCF、HTM&LNC中的代谢活性(％)的比较分析。通过相对于未处理样品的双尾学生t检验计算p值。*表示p<0.05。
LNC和HCF对HC-HA/PTX3更敏感，细胞形状随着高剂量的HC-HA/PTX3变化非常快(在15-30分钟内)，尽管它没有持续存在更长时间。1小时内，细胞恢复到其正常形态，之后即使与高浓度的HC-HA/PTX3长时间孵育(48小时)，细胞形态也不再受到影响。相反，无论对于更短的还是更长的孵育期，HC-HA/PTX3不能在高浓度下调节HTM细胞形状。代表性明场显微图像(比例尺50μm)(图25)显示，在短时间内受到HC-HA/PTX3(100μg/ml)的激发时，间充质细胞(LNC&HCF)形态异常并快速恢复。HTM细胞不会像其他正常的间充质细胞那样对HC-HA/PTX3起反应。
表3.用高浓度HC-HA/PTX3(例如100μg/ml)处理48小时的时候间充质细胞和上皮细胞之间的差异。
Figure BDA0003886219510000841
实施例6：确定HC-HA/PTX3在抑制人正常细胞和癌细胞中的细胞增殖中的作用。
我们在实施例4中观察到，A375(黑色素瘤)细胞的代谢活性(通过WST-1测量)和形态对HC-HA/PTX3敏感。随着HC-HA/PTX3浓度的增加，代谢活性受到抑制，细胞形态由上皮细胞形变为梭形，然后变为圆形，失去细胞间和细胞-基质粘附。由于细胞代谢活性与细胞增殖率成正比，因此将通过量化增殖细胞的DNA含量将确定HC-HA/PTX3在抑制细胞增殖中的作用。通过BrdU细胞增殖检测试剂盒(货号6813；Cell Signaling Technology,USA)使用抗BrdU抗体检测在细胞增殖过程中掺入到细胞DNA中的5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)。
考虑到实施例4中的结果，其中从25μg/ml起的HC-HA/PTX3开始在24小时处理后A375细胞显示出显著的形态变化，用以下浓度的HC-HA/PTX3处理细胞：0、25、50和100μg/ml，持续24小时。将100μg/ml的HA用作对照，因为HA对细胞形态和代谢活性缺乏显著影响，如实施例5所示。基于这项初步研究，对增殖测定方案进行了优化并应用于评估HC-HA/PTX3对人前列腺细胞(正常&癌症)的影响。测试组如表4所示。
A375细胞接种在96孔板中(3200个细胞在100μl培养基/孔中)并孵育过夜。用上述浓度的HC-HA/PTX3和HA处理细胞48小时。每孔加入10μl 10xBrdU溶液，将细胞置于培养箱中4小时。去除培养基，以100μl/孔加入固定/变性溶液，保持30分钟。去除溶液，以100μl/孔加入1x检测抗体溶液，保持1小时。去除溶液并用洗涤缓冲液适当洗涤三次，然后在室温下以100μl/孔加入1x HRP缀合二抗溶液，保持30分钟。去除溶液并用洗涤缓冲液适当洗涤三次，并在室温下以100μl/孔添加TMB底物保持30分钟。以100μL/孔添加STOP溶液，并且在450nm处读取吸光度。
表4：实验设计-A375细胞
Figure BDA0003886219510000851
在A375(黑色素瘤)细胞中研究了HC-HA/PTX3和HA的抗增殖活性。用不同浓度的HC-HA/PTX3(25、50&100μg/ml)和100μg/ml HA孵育48小时对A375细胞形态表现出如实施例4中观察到的相同影响(图26A)。BrdU掺入测定显示HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式显著抑制A375细胞生长(p<0.005)，而HA没有显著贡献(图26B)。从学生t检验计算统计显著性(p值)。半对数线性回归分析确定HC-HA/PTX3对A375细胞生长具有线性抑制作用(R2＝0.9681)。(图26C)
使用BrdU细胞增殖检测试剂盒(货号6813；Cell Signaling Technology,USA)对 前列腺细胞系进行细胞增殖分析
表5：实验设计——PrEC、PNT2、PC-3&LNCaP细胞
Figure BDA0003886219510000861
将PrEC、PNT2、PC-3和LNCaP细胞以3.2x103个细胞/孔接种在96孔板中并孵育过夜。然后用五种浓度的HC-HA/PTX3(1.56、3.13、6.25、12.5&25μg/ml)和100μg/ml HMW-HA处理细胞48小时，一式三份，如表5所示。最后，将10μM BrdU添加到孔中，并将细胞孵育4小时。去除培养基，并且以100μl/孔添加固定/变性溶液30分钟。去除溶液，添加1x检测抗体溶液，并在室温下以100μl/孔添加1x HRP缀合的二抗溶液30分钟。去除溶液并用洗涤缓冲液适当洗涤三次，并在室温下以100μl/孔添加TMB底物30分钟。以100μL/孔添加STOP溶液，并且在450nm处读取吸光度。
通过明场相差显微镜对PrEC细胞的细胞形态分析(图27A)和BrdU掺入测定证明HC-HA/PTX3对PrEC细胞具有抗增殖作用。HA不抑制细胞增殖。在本实验中，使用的HC-HA/PTX3的最大浓度为25μg/ml。在12.5和25μg/ml HC-HA/PTX3时，O.D.值变为负值，表明孔中没有细胞。由于分析过程中的偏差，这些数据可能无法表明HC-HA/PTX3暴露的影响。
图27A和27B显示HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制PrEC细胞增殖，而HMW-HA(图27C)对细胞增殖没有显著影响，如通过BrdU细胞增殖检测试剂盒#6813(Cell Signaling,USA)检测。图27A以两个放大倍率(10x&20x)显示PrEC细胞形态的明场图像；图27B和27C显示BrdU细胞增殖测定曲线。从学生t检验计算统计显著性(p值)。
通过明场相差显微镜和PNT2细胞的BrdU掺入测定进行的细胞形态分析证明了HC-HA/PTX3对PNT2细胞的抗增殖作用。HA不抑制细胞增殖。通常细胞聚集生长。随着HC-HA/PTX3浓度的增加，它抑制细胞-细胞粘附(图28A)。在BrdU测定中，由于高标准误差，未观察到HC-HA/PTX3的显著影响(图28B)。P值大于0.05。BrdU数据显示与较早期WST-1数据相似。
HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制PNT2细胞增殖，而HMW-HA对细胞增殖没有显著影响，如通过BrdU细胞增殖检测试剂盒#6813(Cell Signaling,USA)检测。PNT2细胞以3.2x103个细胞/孔接种在96孔板中并孵育过夜。然后用五种浓度的HC-HA/PTX3(1.56、3.13、6.25、12.5&25μg/ml)和两种浓度的HMW-HA(25&100μg/ml)处理细胞48小时，一式三份。最后，将10μM BrdU添加到孔中，并将细胞孵育4小时。
HC-HA/PTX3，但不是HA，对PC-3前列腺癌细胞系具有抗增殖作用，如实施例7中所观察到的。BrdU测定显示，在25μg/ml浓度下，HC-HA/PTX3显著抑制PC-3的增殖(p＝0.04)。BrdU数据显示与WST-1数据相似。
HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制PC3细胞增殖，而HMW-HA对细胞增殖没有显著影响，如通过BrdU细胞增殖检测试剂盒#6813(Cell Signaling,USA)所检测。PC3细胞以3.2x103个细胞/孔接种在96孔板中并孵育过夜。然后用五种浓度的HC-HA/PTX3(1.56、3.13、6.25、12.5&25μg/ml)和两种浓度的HMW-HA(25&100μg/ml)处理细胞48小时，一式三份。最后，将10μM BrdU添加到孔中，并将细胞孵育4小时。图29A显示PC3细胞形态的明场图像。图29B显示BrdU细胞增殖测定曲线。
在HC-HA/PTX3处理下，LNCaP的细胞形态以剂量依赖性方式发生变化。出人意料的是，尽管LNCaP是癌细胞，但它的增殖不如PC-3或PNT2或PrEC细胞快。这一观察结果在所有细胞类型的BrdU数据中得到了很好的证实。在未经处理的情况下，LNCaP细胞的O.D.值为0.5，而其余其他细胞的值为>0.75。有趣的是，对于LNCaP，即使在高浓度的HC-HA/PTX3下，细胞仍保持聚集生长，但它们的形态发生了变化，因此暗示HC-HA/PTX3对细胞-基质附着而不是细胞-细胞粘附的影响更多。HC-HA/PTX3浓度为3.13和12.5μg/ml以及HA为100μg/ml时的高标准误差代表错误的图。由于空白样品中的移液错误，在25μg/ml HC-HA/PTX3时的O.D.值是负的(参见图30A)。可以在对象孔中观察到足够的细胞(参见图30B)。
HC-HA/PTX3以剂量依赖性方式抑制LNCaP细胞增殖，而HMW-HA对细胞增殖没有显著影响，如通过BrdU细胞增殖检测试剂盒#6813(Cell Signaling,USA)检测。LNCaP细胞以3.2x103个细胞/孔接种在96孔板中并孵育过夜。然后用五种浓度的HC-HA/PTX3(1.56、3.13、6.25、12.5&25μg/ml)和两种浓度的HMW-HA(25&100μg/ml)处理细胞48小时，一式三份。最后，将10μM BrdU添加到孔中，并将细胞孵育4小时。图30A显示LNCaP细胞形态的明场图像。图30B显示BrdU细胞增殖测定曲线。
对四种类型的前列腺上皮细胞/细胞系(正常和癌症)的BrdU测定表明HC-HA/PTX3，而非HMW-HA，以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。由于技术错误，PrEC和LNCaP的结果反映的印象与WST-1测定数据中观察到的不同。然而，相应的细胞形态图像支持HC-HA/PTX3和HA对前列腺细胞的影响与先前实验中观察到的相似。
虽然已经示出和在本文描述了优选的实施方案，但是对本领域技术人员将是明显的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。现在可能会发生许多改变、变化和替换。应当理解，在实施所描述的方法中可以采用对本文描述的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定实施方案的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (64)

1.一种在有需要的个体中抑制肿瘤的癌细胞再生长的方法，所述方法包括在手术程序后使所述肿瘤周围的区域与分离的重链-透明质酸/正五聚蛋白3(HC-HA/PTX3)复合物接触，从而抑制所述肿瘤周围的所述区域的癌细胞再生长。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述手术程序包括所述肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述手术程序包括化学疗法、免疫疗法或靶向疗法。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域包括手术切缘。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域是瘤周区域。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是不可手术的癌症。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是皮肤癌。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域与约10微克至100毫克接触。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和肿瘤坏死因子α-刺激基因6(TSG-6)。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HA)。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMW HA)。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物是冷冻保存的。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物包含活细胞。
25.如权利要求1所述的方法，其进一步包括施用治疗剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。
27.如权利要求25所述的方法，其中施用所述治疗剂发生在使所述肿瘤周围的所述区域与所述HC-HA/PTX3复合物接触之前。
28.如权利要求25所述的方法，其中施用所述治疗剂发生在使所述肿瘤周围的所述区域与所述HC-HA/PTX3复合物接触之后。
29.如权利要求25所述的方法，其中施用所述治疗剂与使所述肿瘤周围的所述区域与所述HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述方法通过杀伤癌细胞来抑制肿瘤细胞再生长。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌细胞的杀伤是通过细胞凋亡或坏死进行的。
32.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述方法通过抑制癌细胞增殖来抑制肿瘤细胞再生长。
33.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述方法通过抑制癌细胞的代谢活性来抑制肿瘤细胞再生长。
34.一种在有需要的个体中杀伤肿瘤的癌细胞的方法，所述方法包括在手术程序之前、期间或之后使肿瘤或所述肿瘤周围的区域与分离的重链透明质酸/正五聚蛋白3(HC-HA/PTX3)复合物接触，从而杀伤所述癌细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述手术程序包括所述肿瘤的手术切除、冷冻消融或射频消融。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述手术程序包括化学疗法、免疫疗法或靶向疗法。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域包括手术切缘。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域是瘤周区域。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤是选自以下的癌症：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌、骨癌、淋巴癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、唾液腺癌、肾上腺癌和胃肠癌。
41.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是不可手术的癌症。
42.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
43.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
44.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。
45.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是皮肤癌。
46.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
47.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
48.如权利要求34所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
49.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤周围的所述区域与约10微克至100毫克接触。
50.如权利要求34至49中任一项所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物是天然HC-HA/PTX3复合物、重构的HC-HA/PTX3复合物或其组合。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述天然HC-HA/PTX3复合物分离自胎儿支持组织。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述重构的HC-HA/PTX3复合物包含间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HC1)和重链2(HC2)、透明质酸(HA)和PTX3。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述重构的HC-HA/PTX3复合物包含HC1、HC2、HA、PTX3和肿瘤坏死因子α-刺激基因6(TSG-6)。
54.如权利要求34所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物是冷冻保存的。
55.如权利要求34所述的方法，其中所述HC-HA/PTX3复合物包含活细胞。
56.如权利要求34所述的方法，其中所述透明质酸(HA)是高分子量透明质酸(HMW HA)。
57.如权利要求34所述的方法，其中所述透明质酸(HA)是低分子量透明质酸(LMW HA)。
58.如权利要求34所述的方法，其中所述接触包括将所述HC-HA/PTX3直接注射到肿瘤中。
59.如权利要求34所述的方法，其进一步包括施用治疗剂。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述治疗剂选自化疗剂、镇痛剂、抗炎剂、类固醇、免疫疗法、细胞疗法、放射疗法、靶向药物治疗剂和抗生素。
61.如权利要求59所述的方法，其中施用所述治疗剂发生在使所述癌细胞与所述HC-HA/PTX3复合物接触之前。
62.如权利要求59所述的方法，其中施用所述治疗剂发生在使所述癌细胞与所述HC-HA/PTX3复合物接触之后。
63.如权利要求59所述的方法，其中施用所述治疗剂与使所述癌细胞与所述HC-HA/PTX3复合物接触同时发生。
64.如权利要求34所述的方法，其中所述癌细胞的杀伤是通过细胞凋亡或坏死进行的。
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