CZ288986B6 - Farmaceutický prostředek pro zabránění zuľování traumatizovaných tubulárních stěn cév ľivočichů - Google Patents

Abstract

Pou it slou enin kyseliny hyaluronov zvolen²ch ze souboru sest vaj c ho z kyseliny hyaluronov , jejich fragment nebo podjednotek a farmaceuticky vhodn²ch sol pro v²robu farmacetick ho prost°edku pro zabr n n zu ov n traumatizovan²ch tubul rn ch st n c v ivo ich a tento farmaceutick² prost°edek. Krom kyseliny hyaluronov a obvykl²ch °edidel a adjuvant m e tento farmaceutick² prost°edek d le obsahovat dal inidla, jako nesteroidn protiz n tliv l iva, l iva inhibuj c sten zu, vitamin C, antioxidanty, l tky pohlcuj c voln radik ly a jejich kombinace.\

Description

(5 7) Anotace:

Použití sloučenin kyseliny hyaluronové zvolených ze souboru sestávajícího z kyseliny hyaluronové, jejich fragmentů nebo podjednotek a farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmacetického prostředku pro zabránění zužování traumatizovaných tubulárních stěn cév živočichů a tento farmaceutický prostředek. Kromě kyseliny hyaluronové a obvyklých ředidel a adjuvantů může tento farmaceutický prostředek dále obsahovat další činidla, jako nesteroidní protizánětlivá léčiva, léčiva inhibující stenózu, vitamin C, antioxidanty, látky pohlcující volné radikály a jejich kombinace.

Farmaceutický prostředek pro zabránění zužování traumatizovaných tubulárních stěn cév živočichů

Oblast techniky

Vynález se týká použití forem kyseliny hyaluronové pro výrobu léčiva a dále též farmaceutického prostředku pro zabránění zužování (stenózy) traumatizovaných tubulárních stěn cév živočichů. Jedno výhodné provedení vynálezu se týká farmaceutického prostředku vhodného pro zabránění arteriální restenózy po balónkové angioplastice u člověka.

Dosavadní stav techniky

Balónková angioplastika je v širokém rozsahu akceptována metoda otevírání zablokovaných koronárních arterií. Balónkový katétr byl experimentálně zaveden v časných 60. letech tohoto století a poprvé byl aplikován klinicky koncem 70. let. Od té doby sehrál významnou terapeutickou úlohu při léčbě choroby koronálních arterií, při níž je postižena jedna nebo více cév (Baumgartner H. R., 1963, Z. Ges. Exp. Med. 137: 227). U některých pacientů však po úspěšné léčbě balónkovou angioplastikou dochází k arteriální restenóze. V tomto případě je však zúžení vnitřního průměru tepny způsobeni růstem (proliferací) buněk endothelu v oblastech podrážděných balónkovou angioplastikou. K novému zablokování tedy dochází nikoliv vylučováním cholesterolu, nýbrž hromaděním buněk endothelu na vnitřních stěnách arterie. Tím dochází ke zmenšení vnitřního průměru arterie, které může vést k infarktu,. U člověka jsou restenotické léze téměř úplně, nikoliv však výhradně, tvořeny vaskulámími buňkami hladkého svalstva (Glazier J. J., Williams M. G., Madden S. a Rickards A. F., 1990, J. Roy. Phys. Lond., 24:292). Akumulace těchto buněk v průsvitu artérie je důsledkem migrace a proliferace buněk. Tyto dva účinky jsou téměř určitě vyvolány koordinovanou interakcí řady různých cytokinů, k jejichž uvolňování pravděpodobně dochází při časné akumulaci makrofágů v místě původního poranění tkáně. Zužování vnitřního průměru tubulárních stěn nebo proliferace buněk však nejsou omezeny pouze na koronární arterie. Může k nim také docházet po operacích, jako například v případě restenózy periferních vaskulámích systémů.

Dosavadní stav techniky zahrnuje řadu návrhů jak zabraňovat restenóze.

V US 5 087 244 (Wolinsky et al.) je navrhováno použití katétru, který obsahuje na jednom konci neelastický balónek, na jehož povrchu jsou uspořádány malé otvory. Balónek obsahuje koncentrovaný roztok heparinů, který je těmito otvory uvolňován, a tak přichází do styku s arterií po angioplastice a zabraňuje vzniku restenózy.

V US 5 116 864 (Hathaway et al.) je popisována prevence restenózy nebo srdečních vaskulámích systémech po vaskulámí rekanalizaci, přičemž tato prevence zahrnuje podávání fotoaktivovatelného psorelenu. Tím se má dosáhnout takové hladiny psoralenu v séru, která inhibuje růst buněk hladkého svalstva.

V US 5 092 841 (Spears J. R.) je navrhována léčba arteriálních stěn poraněných během angioplastiky tím, že se mezi stěnu a katétr, použitý při angioplastice, dodává bioprotektivní materiál. Tento bioprotektivní materiál je zde zachycen a proniká do tkáně arteriálních stěn, když je proti nim umístěn katétr pro angioplastiku.

V EP 356 275-A (Petitou et al.) je navrhováno použití nových o-acylovaných derivátů glykosaminoglykanu při inhibici postoperační restenózy.

V publikaci Berk B. C. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1991, sv. 17, č. 6, dodatek B, strana 11 IB až 117B je diskutována farmakologická role heparinu a glukokortikoidů při prevenci restenózy po koronární angioplastice.

V přihlášce WO 92/09561 (Itoh et al.) je navrhováno použití nových amidových derivátů inhibujících ACAT při léčbě restenózy po perkutánní transluminální koronární angioplastice.

V přihlášce WO 92/08472 (Scarborough et al.) je navrhováno použití peptidu nebo peptidů zabraňujících slepování krevních destiček pro prevenci restenózy po angioplastice. Použité peptidy jsou získány z hadího jedu.

V přihlášce WO 92/07852 (Bovy et al.) je navrhováno použití určitých derivátů bifenylalkylxanthinu pro prevenci restenózy po angioplastice.

V přihlášce WO 92/05782 (Pili, j.) je navrhováno použití antagonistů (I) thromboxan-A2receptoru při výrobě léčiv, která mají sloužit pro inhibici proliferativního vývoje při obstruktivních vaskulámích poruchách, tj. arteriální restenózy.

V přihlášce WO 91/18639 (Gaj et al.) je navrhováno inhibice stenózy po balónkové angioplastice podáváním fibronektinu pomocí kontinuální infuse nebo velkoobjemové jednorázové infuse (bolus) nebo pomocí přímé infuse do stenotické oblasti prostřednictvím katétru pro angioplastiku.

Ve zveřejněné přihlášce CA 2 042 159(Ondetti et al.) je navrhováno použití inhibitoru ACE (podávaného orální nebo parenterální cestou) pro prevenci nebo snížení rizika restenózy po angioplastice.

V US 4 929 602 (Harker et al.) je popsán způsob inhibice arteriální restenózy podáváním peptidového derivátu D-fenylalanylprolylarginyl-halomethylketonu nebo jeho adičního produktu s kyselinou hydrohalovou.

V US 4 820 732 (Shell et al.) je navrhováno použití prostředku obsahujícího prostaglandinovou sloučeninu pro snížení restenózy a přerušení stenózy.

Přihlašovatel si je též vědom aktivity firmy Glycomed, která vyvinula fragment heparinu zabraňující arteriální restenóze po balónkové angioplastice.

V základním výzkumu konce 70. a počátku 80. let existovala značná roztříštěnost názorů, pokud se týče úlohy imunoterapie při léčbě rakoviny. Za důležitou byla považována aktivace (tzv. „hyping“) makrofágů. Výzkumy peritoneálních makrofágů získaných od pacientů s neoplastickou chorobou, které prováděl Romans aFalk, poskytly však jasný důkaz, že tyto makrofágy již byly aktivovány a přesto koexistovaly s rakovinnými buňkami a nezpůsobovaly jejich destrukci.

Několik nezávislých vědců ukázalo, že špatná funkce makrofágů nebo údajné blokování je způsobeno nadbytkem prostaglandinu, a je možno je v tkáňové kultuře modifikovat kortikosteroidy, ASA a nesteroidními protizánětlivými léčivy, jako je indomethacin a naproxen (Naprosyn^<R)). U zvířecích nádorů bylo opakovaně demonstrováno, že tyto látky mohou měnit odpověď na neoplastické buňky a že za použití různých kombinací těchto látek s činidly zvyšujícími imunitu se může dosáhnout velmi věrohodného úspěchu při odstraňování experimentálních nádorů. Lala a jeho spolupracovníci kombinovali léčbu indomethacinem s léčbou interleukinem 2 a ukázali, že je tak možno dosáhnout vyléčení experimentální neoplazmy.

Použití všech těchto činidel při skutečné praxi léčení člověka in vivo je však spojeno s neustálými problémy. Všechna nesteroidní protizánětlivá činidla (NSAID) vykazují značnou

-2CZ 288986 B6 toxicitu v gastzrointestinální, neurologické a v jiných oblastech. Podstatou nynějšího přistupuje, zajištění takových obecných podmínek, při nichž by bylo možno používat těchto činidel při léčbě humánních chorob v dostatečných množstvích a tak, aby léčivo proniklo do kterékoliv patologické tkáně a svým terapeutickým působením změnilo lokální produkci prostaglandinu. Indomethacin a nyní i jiná léčiva jsou sice k dispozici ve formě intravenosních prostředků, je však k dispozici velké množství dat, že používání těchto léčiv samotných způsobuje prohibitivní vedlejší účinky u humánních pacientů. Do těla je proto možno zavést pouze nedostatečné množství těchto léčiv, které má za následek jen příležitostnou odpověď novotvarů.

Na základě velkého množství důkazů je možno tvrdit, že základ neoplastického vývoje a způsob jakým počáteční buňky „proklouznou“ mechanismem imunitní kontroly, má vztah k produkci prostaglandinu. Pro stanovení mechanismu zablokování počáteční buňky při jakékoliv imunitní reakci, tj. makrofágu, je třeba předpokládat pouze jednu mutaci vyvolávající změnu množství prostaglandinu syntetizovaného buňkami, když se stanou maligními. Je tedy důležité vyvinout kombinaci nesteroidního protizánětlivého léčiva pro klinické použití, s níž by bylo možno dosáhnout podstatného zlepšení odpovědi při neoplastických chorobách a jiných chorobách, při nichž je základem pathogenese chorobného stavu nadměrná syntéze prostaglandinu, jako je například arthritida a různé jiné inflamatomí poruchy tzv. pojivových tkání a/nebo autogresivní choroby.

Viz též následující citace:

1. Modulation of Immunity in Cancer Patients by Prostaglandin Antagonists, Immunity to Cancer II, Alan R. Liss, lne.;

2. Goodwin J. S. (1981) Prostaglandin E and Carcer Growth Potential for Immunotherapy with Prostaglandin Synthesis Inhibitors, Augmentive Agents in Cancer Therapy, Raven Press, New York, USA.

Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout přípravky či farmaceutické prostředky pro zabránění arteriální restenóze a její inhibici v různých případech, kdy je to zapotřebí, jako například po balónkové angioplastice, kdy dochází k proliferaci buněk endothelu na vnitřních stěnách arterie v důsledku podráždění těchto buněk balónkovou angioplastikou nebo po operaci periferních vaskulámích systémů.

Další úkoly, které vynález řeší, budou odborníkům v tomto oboru zřejmé z následujícího popisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití sloučenin kyseliny hyaluronové zvolených ze souboru sestávajícího z kyseliny hyaluronové, jejích fragmentů nebo podjednotek a farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro zabránění zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů, včetně zabránění arteriální restenózy po balónkové angioplastice u člověka.

Dále je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek pro zabránění zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů, jehož podstata spočívá v tom, že spolu s ředidly, adjuvanty a jinými farmaceutickými nosiči, kterých se používá podle potřeby, obsahuje sloučeninu kyseliny hyaluronové zvolenou z kyseliny hyaluronové, jejích farmaceuticky vhodných solí, fragmentů a podjednotek kyseliny hyaluronové a léčivo inhibující stenózu.

Ve výhodném provedení vynálezu je sloučeninou kyseliny hyaluronové kyselina hyaluronová a/nebo její sůl, jako je hyaluronát sodný, s relativní molekulovou hmotností nižší než 750 000.

-3CZ 288986 B6

S výhodou se vyrábí farmaceutický prostředek, který je vhodný pro intravenosní podávání. Vyráběný farmaceutický prostředek s výhodou obsahuje sloučeninu kyseliny hyaluronové v množství v rozmezí od 10 do 3000 mg, přednostně více než 200 mg, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu. Tento farmaceutický prostředek popřípadě dále obsahuje činidlo zvolené z nesteroidního protizánětlivého léčiva, léčiva inhibujícího stenózu, vitamínu C, antioxidantu, látky pohlcující volné radikály a jejich kombinací.

Vynález se opírá o zjištění, že různé formy hyaluronanu nebo kyseliny hyaluronové, zejména kyselina hyaluronová a její soli, zabraňují stenóze vnitřního průměru podrážděných tubulámích stěn a zejména zabraňují restenóze arteriálních stěn, k níž dochází například při proliferaci buněk endothelu po jejich podráždění balónkovou angioplastikou nebo jinou léčbou. Tyto formy kyseliny hyaluronové, například kyselina hyaluronová a soli kyseliny hyaluronové, je možno podávat intravenosně nebo injekčně (v případě přímé injekce malého množství), v účinné dávce v rozmezí od asi 10 mg/70 kg do více než 3000 mg/70 kg, přičemž podávání lze provádět před, v průběhu a/nebo po poranění.

Hyaluronan nebo kyselina hyaluronová je glykosaminoglykan, který je evolučně konzervován a skládá se z opakujících se disacharidových jednotek N-acetylglukosaminu a kyseliny glukuronové (Laurent and Fraser, 1991, Faseb J., 6:_ 2 397). Hyaluronan působí na adhezi, motilitu, růst a diferenciaci buněk a mnohé z těchto účinků jsou zprostředkovány expresí receptorů hyaluronanu v respondujících tkáních. Tak bylo ukázáno, že hyaluronan je schopen agregovat bílé krvinky při jeho interakci s receptory přítomnými v těchto buňkách (přehled viz Turley E. A., 1992, Can. Met. Rev. 11:21). Hyaluronan se akumuluje téměř výlučně v místech se zvýšenou expresí receptorů nebo za přítomnosti extracelulámích proteinů vázajících hyaluronan. Dva receptory na povrchu buněk byly charakterizovány na molekulární úrovni a zahrnující CD44 a RHAMM [zkratka receptorů pro hyaluronan (HA)-zprostředkující motilitu]. RHAMM je přítomný ve zvýšeném množství na buňkách, zejména makrofágách a buňkách hladkého svalstva při odpovědi na poranění.

Při zabraňování zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů, se kyselina hyaluronová může podávat před ošetřením, například balónkovou angioplastikou, v jeho průběhu nebo po něm (ihned po skončení tohoto ošetření).

Prostředky se přednostně podávají intravenosně v kapalné formě a zahrnují vhodná ředidla nebo jiné adjutanty, kterých je zapotřebí pro podávání. Podávání se přednostně provádí injekčně v místě bezprostředně sousedícím s ošetřením s ohledem na dosažení co nejvyšší koncentrace léčiva v tomto místě.

S kyselinou hyaluronovou se při podávání může kombinovat terapeuticky účinné množství léčiva inhibujícího stenózu. Tato léčiva mohou zahrnovat kterákoliv z výše uvedených léčiv, přičemž tato jiná léčiva jsou známa odborníkům v tomto oboru. Jedním z takových léčiv je heparin a jiným fragment heparinu.

Se sloučeninou kyseliny hyaluronové se může kombinovat terapeuticky účinné množství nesteroidního protizánětlivého léčiva, které zvyšuje účinek kyseliny hyaluronové při prevenci zužování tubulámích stěn. Přídavek nesteroidního protizánětlivého léčiva zvyšuje účinnost kyseliny hyaluronové při prevenci zužování tubulámích stěn a například zvyšuje preventivní účinnost kyseliny hyaluronové a/nebo jejích solí při prevenci arteriální restenózy tím, že omezuje zánět. Jako nesteroidního protizánětlivého léčiva se může použít jakékoliv léčiva vhodného k tomuto účelu například zvoleného ze souboru zahrnujícího diclofenac, indomethacin (solubilizovaný například v N-methylglukaminu), piroxicam, (±)-tromethaminovou sůl ketorolacu, kyselinu acetylsalicylovou, naproxen apod. Množství nesteroidního protizánětlivého léčiva odpovídá množství, které se pacientům přednostně podává a je jimi akceptováno. V některých případech může toto množství činit až lOmg/kg tělesné hmotnosti (například 1 až 2 mg/kg tělesné hmotnosti). V případě diclofenacu je možno použít podstatně vyšších množství. Pokud se

-4CZ 288986 B6 použije nesteroidního protizánětlivého léčiva v množství vyšším, než je obvyklé, může se za účelem snížení jeho vedlejších účinků, jako jsou podráždění gastrointestinálního traktu, neurologické abnormality, deprese atd., podávat hyaluronan nebo kyselina hyaluronová v množství vyšším než je 200 kg/70 kg tělesné hmotnosti.

Pro zvýšení účinnosti podávané kyseliny hyaluronové nebo hyaluronanu se do prostředku může také zahrnout terapeuticky účinné množství látky pohlcující volné radikály a antioxidantu, jako je vitamín C. Množství vitamínu C může být 50 až 100 g, poněvadž tato látka je propustná a vylučuje se ledvinami, přestože normálně se používá podstatně nižších množství. Také se může používat jiných antioxidantů a látek pohlcujících volné radikály. V jednom provedení obsahuje farmaceutický prostředek podle vynálezu určitou sloučeninu kyseliny hyaluronové, přednostně samotnou kyselinu hyaluronovou a/nebo její sůl, nesteroidní protizánětlivé léčivo, jakožto činidlo inhibující stenózu a/nebo vitamín C, přičemž tento prostředek se podává za účelem prevence zužování tubulámích stěn, například prevence arteriální restenózy po balónkové angioplastice. Farmaceutický prostředek může zahrnovat větší počet dávkovačích jednotek, přičemž při podávání se z prostředku, tj. balení, vyjme a podá jedna forma. Každá z těchto jednotkových dávkovačích forem obsahuje účinné množství všech složek.

Podle ještě dalšího provedení tohoto vynálezu obsahuje farmaceutický prostředek terapeuticky účinné množství nesteroidního protizánětlivého léčiva, jako je například diclofenac, indomethacin (solubilizovaný v N-methylglukaminu), piroxicam, (±)-tromethaminová sůl ketorolacu, kyselina acetylsalicylová apod., pro zvýšení účinku použité formy kyseliny hyaluronové při prevenci zužování tubulámích stěn.

Nesteroidního protizánětlivého léčiva se může používat v obvykle akceptovaných dávkách v závislosti na konkrétně použitém léčivu, přičemž dávkování může činit až například 10 mg/70 kg tělesné hmotnosti (například 1 až 2 mg/kg tělesné hmotnosti). V případě diclofenacu je možno použít podstatně vyšších množství. Pokud se použije nesteroidního protizánětlivého léčiva v množství vyšším, než je obvyklé, může se podávat kyselina hyaluronová nebo její sůl přednostně v množství vyšším než je asi 200 mg/70 kg tělesné hmotnosti.

Do prostředku se může dále také zahrnout terapeuticky účinné množství vitamínu C nebo jiné látky pohlcující volné radikály nebo antioxidantu pro zvýšení účinnosti použité formy kyseliny hyaluronové při prevenci zužování tubulámích stěn. Množství vitamínu C může být až 50 až 100 g, přestože normálně se používá podstatně nižších množství.

Tento farmaceutický prostředek může také obsahovat účinné množství léčiva inhibujícího stenózu.

Když prostředek obsahuje činidlo zvolené ze souboru zahrnujícího nesteroidní protizánětlivé léčivo, léčivo inhibující stenózu, vitamín C, látku pohlcující volné radikály, antioxidant a jejich kombinace, projevuje se působení kyseliny hyaluronové a/nebo jejich solí a/nebo homologů, analogů, derivátů, komplexů, esterů, fragmentů a/nebo podjednotek kyseliny hyaluronové usnadněním transportu činidla na místo podráždění, což se projevuje schopností činidla proniknout do buněk (v arterii do buněk endothelu) a má společně za následek zlepšení prevence například arteriální restenózy.

Usnadnění dodávky či transportu chemikálie na určité místo v těle savce je možno ilustrovat příkladem, při němž se do rakovinného nádoru přímo vstřikuje ethanol. Po přímém vstříknutí ethanolu ukazuje sonografícké vyšetření (vyšetření ultrazvukem), že ethanol není dispergován v nádoru. Když je ethanol podávaný do nádoru umístěn v kyselině hyaluronové a/nebo jejích solích, jako nosiči, sonografícké vyšetření nádoru ukazuje, že došlo kdispergaci ethanolu v nádoru.

-5CZ 288986 B6

Přihlašovatel sice učinil předpoklad, že kyselina hyaluronová usnadňuje dodávku a transport léčiv, ale tento předpoklad vynález žádným způsobem neomezuje. Vynálezu lze použít bez ohledu na to, že jaký je skutečný mechanismus působení při aplikaci kyseliny hyaluronové a/nebo jejích solí a/nebo homologů, analogů, derivátů, komplexů, esterů, fragmentů a podjednotek kyseliny hyaluronové v kombinaci s nesteroidním protizánětlivým léčivem, léčivem inhibujícím stenózu, vitamínem C, látkou pohlcující volné radikály a/nebo antioxidantem.

Kombinace kyseliny hyaluronové a jejích solí a jiných forem s různými chemikáliemi a léčivy, jako například léčivem inhibujícím stenózu, vitamínem C, nesteroidním protizánětlivým léčivem atd. mění distribuci těchto chemikálií a léčiv v lidském těle, ovlivňuje jejich účinnost a zajišťuje neobvyklé zacílení na špatně prokrvovanou a/nebo patologickou tkáň. Tak například použití kyseliny askorbové (vitamínu C), jako látky pohlcující volné radikály (v denní dávce 50 g, což je dávka 1000 x vyšší než je dávka, které se používá pro terapeutické účely jako vitamínu) při intravenosním podání v kombinaci s 300 až 500 mg kyseliny hyaluronové nebo hyaluronátu sodného snižuje záněty, předpokládá se, že zvýšení účinnosti projevuje eliminaci volných radikálů, a že tedy kyselina askorbová působí jako látka, která pohlcuje volné radikály.

K podobné situaci dochází u nestroidních protizánětlivých léčiv. Poněvadž je zapotřebí velkého množství rozpustného indomethacinu, převede se tento chemický produkt do roztoku za použití N-methylglukaminu při stupni zředění 5 mg/1 ml N-methylglukaminu (NMG). Vzniklá látka se potom nechá projít filtrem (Milipore, 22 pm), čímž dojde k její sterilizaci. Tato látka je při 16 násobném překročení terapeutické dávky u zvířat netoxická, a proto byla považována za vhodnou pro použití u humánních pacientů. Indocid^(R), rozpuštěný v NMG, je tedy například možno podávat humánním pacientům intravenosně nebo intravaskulámě v různých dávkách, až do 10 mg/kg, přičemž každá dávka indomethacinu se kombinuje například s 200 až 1000 mg kyseliny hyaluronové, například „LifeCore^“ (hyaluronát sodný). Tak vzniká vhodná směs, kterou lze bezpečně aplikovat jakýmikoliv cestami. Podobné klinické studie byly také provedeny s kyselinou hyaluronovou vyrobenou jinými metodami, například extrakcí. Extrahovaná látka se dobře hodí pro intravenosní aplikaci.

Když se nesteroidní protizánětlivé léčivo, například indomethacin (rozpuštěný v N-methylglukaminu) nebo jiné nesteroidní protizánětlivé léčivo aplikuje v kombinaci s více než 200 mg kyseliny hyaluronové, vztaženo na dávku 1 až 2 mg nesteroidního protizánětlivého léčiva na kg tělesné hmotnosti (v tomto konkrétním případě indomethacinu a NMG) nedochází ke vzniku větších toxických vedlejších účinků, jako jsou poruchy gastrointestinálního systému, neurologické poruchy, deprese, atd., i když se v případě potřeby použije zvýšených dávek indomethacinu. Když se množství kyseliny hyaluronové sníží zhruba pod tuto hodnotu, mohou se obvykle vedlejší účinky objevit znovu. Pozorovaná odpověď je kromě toho lepší, když se nesteroidní protizánětlivé léčivo (například Indocid^(R>) kombinuje s kyselinou hyaluronovou, což jasně ukazuje, že tato kombinace se nyní zacílila na tkáň, přestože byla podána systemicky, tj. intravenosní cestou. Bylo totiž pozorováno, že když se pacientům kromě jiných chemikálií (například kyseliny askorbové, tj. vitamínu C) a 500 až 200 mg nesteroidního protizánětlivého léčiva podá i kyselina hyaluronová (například v podobě hyaluronátu sodného), tj. když se například podá kombinace indomethacinu a kyseliny hyaluronové, pocítí pacienti okamžitě dramatickou úlevu od bolesti. Přihlašovatel se proto domnívá, že podání například nesteroidního protizánětlivého léčiva s kyselinou hyaluronovou (hyaluronátem sodným) zabraňuje enzymatické produkci prostaglandin synthetasy, která brání normální funkci makrofágů. Kyselina hyaluronová (a její soli a jiné formy) tedy nejen zvyšuje účinnost nesteroidních protizánětlivých léčiv, ale snižuje i vedlejší účinky a toxicitou spojenou s použitím inhibitorů syntézy prostaglandinu.

Kyseliny hyaluronové a jejích solí se může používat v různých dávkách v rozmezí od 10 do 1000mg/70kg tělesné hmotností. Jelikož kyselina hyaluronová, ani její různé formy, nejsou toxické, mohou se přirozeně podávat i ve vyšších dávkách, například 3000 mg/70 kg tělesné hmotnosti, aniž by se to projevovalo nežádoucími účinky.

-6CZ 288986 B6

Jedna forma hyaluronové kyseliny a/nebo její soli (například sodné soli), homologu, analogu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a podjednotek kyseliny hyaluronové, přednostně hyaluronové kyseliny samotné a její soli, která se hodí pro použití podle vynálezu, je tvořena frakcí dodávanou firmou Hyal Pharmaceutical Corporation. Jedna taková frakce je obsažená v 15ml lahvičce obsahující hyaluronát sodný 20 mg/ml (300 mg/lahvička - várka 2F3). Frakce hyaluronátu sodného je tvořena 2 % roztokem látky o střední molekulové hmotnosti přibližně 225 000. Tato frakce také obsahuje vodu q.s., která je trojnásobně předestilovaná a sterilní, v souladu s požadavky lékopisu U.S.P. pro injekční přípravky. Lahvičky s hyaluronovou kyselinou a/nebo její solí mohou být zhotoveny z borosilikátového skla typu 1 a uzavřeny butylkaučukovou zátkou, která nereaguje s obsahem lahvičky.

Frakce hyaluronové kyseliny a/nebo její soli (například sodné soli), homologu, analogu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/nebo podjednotek kyseliny hyaluronové, přednostně hyaluronové kyseliny samotné a její soli, může obsahovat hyaluronovou kyselinu a/nebo její sůl s následujícími vlastnostmi:

Přečištěná, v podstatě apyrogenní frakce hyaluronové kyseliny, získané z přírodního zdroje, která má alespoň jednu z vlastností zvolených z dále uvedeného souboru:

(i) molekulovou hmotnost v rozmezí od 150 000 do 225 000;

(ii) obsah sulfatovaných mukopolysacharidů nižší než asi 1,25 % hmotnostního, vztaženo na celkovou hmotnost;

(iii) obsah proteinu nižší než asi 0,6 % hmotnostního, vztaženo na celkovou hmotnost;

(iv) obsah železa nižší než asi 150 ppm, vztaženo na celkovou hmotnost;

(v) obsah olova nižší než asi 15 ppm, vztaženo na celkovou hmotnost;

(vi) obsah glukosaminu nižší než 0,0025 %;

(vii) obsah glukuronové kyseliny nižší než 0,025 %;

(viii) obsah N-acetylglukosaminu nižší než 0,025 %;

(ix) obsah aminokyselin nižší než 0,0025 %;

(x) UV-extinkční koeficient při 257 nm nižší než asi 0,275;

(xi) UV-extinkční koeficient při 280 nm nižší než asi 0,25; a (xii) hodnotu pH v rozmezí od 7,3 do 7,9.

Hyaluronová kyselina je přednostně smíchána s vodou a použitá frakce hyaluronové kyseliny má střední molekulovou hmotnost v rozmezí od 150 000 do 225 000. Frakce hyaluronové kyseliny s výhodou vyhovuje alespoň jedné vlastnosti zvolené z následujícího souboru:

(i) obsah sulfatovaných mukopolysacharidů nižší než asi 1 % hmotnostní, vztaženo na celkovou hmotnost;

(ii) obsah proteinu nižší než asi 0,4 % hmotnostního, vztaženo na celkovou hmotnost;

(iii) obsah železa nižší než asi 100 ppm, vztaženo na celkovou hmotnost;

-7CZ 288986 B6 (iv) obsah olova nižší než asi 10 ppm, vztaženo na celkovou hmotnost;

(v) obsah glukosaminu nižší než 0,00166 %;

(vi) obsah glukuronové kyseliny nižší než 0,0166 %;

(vii) obsah N-acetylglukosaminu nižší než 0,0166 %;

(viii) obsah aminokyselin nižší než 0,00166 %;

(ix) UV-extrikční koeficient při 257 nm nižší než asi 0,23;

(x) UV-extrikční koeficient při 280 nm nižší než asi 0,19; a (xi) hodnotu pH v rozmezí od 7,5 do 7,7.

Může se také používat hyaluronové kyseliny a/nebo její soli (například sodné soli), homologu, analogu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a/nebo podjednotek kyseliny hyaluronové od jiných výrobců, například hyaluronátu sodného, který vyrábí a dodává firma LifeCore^(R) Biomedical, lne., který má následující vlastnosti:

Vlastnost__________________________________________Podpis__________________ vzhled bílé až krémovitě zbarvené částice zápach žádný zápach není zjištěn viskozitní střední molekulová hmotnost

UV/Vis 190 až 820 nm optická hustota (OD), 260 nm citlivost na hyaluronidasu

IČ pH, 10 mg/g roztok voda protein acetát těžké kovy, maximální obsah (ppm)

As CdCr Co Cu Fe Pb

2,0 5,05,0 10,0 10,0 25,0 10,0

Mikrobiální biologické znečištění endotoxin

Zkoušení biologické bezpečnosti < 750 000 shodný s referenčním vzorkem < 0,25 jednotky OD pozitivní odpověď shodný s referenčním vzorkem 6,2 až 7,8 maximálně 8 % < 0,3 pg/mg NaHy < 10,0 pg/mgNaHy

Hg Ni

10,0 5,0 není pozorováno < 0,07 UE/mg NaHy úspěšně projde zkouškou toxicity v oku králíka

Také se může použít různých forem kyseliny hyaluronové, které jsou popsány v dosavadním stavu techniky.

Odkazy na potenciálně vhodnou hyaluronovou kyselinu, její zdroje, způsoby její výroby a její izolaci jsou uvedeny v následujících literárních citacích:

V US 4 141 973 jsou popsány frakce hyaluronové kyseliny (včetně jejích sodných solí), které mají

-8CZ 288986 B6

a) průměrnou molekulovou hmotnost vyšší než asi 750 000, přednostně vyšší než asi 1 200 000, tj. limitní viskozitní číslo vyšší než asi 1 400 cm³/g a přednostně vyšší než asi 2000 cm³/g;

b) obsah proteinu nižší než 0,5 % hmotnostního;

c) absorbanci ultrafialového světla 1 % roztoku hyaluronátu sodného nižší než 3,0 při vlnové délce 257 nm a nižší než 2,0 při vlnové délce 280 nm;

d) kinematickou viskozitu 1 % roztoku hyaluronátu sodného ve fyziologickém pufru vyšší než asi 10 “³ m²/s, přednostně vyšší než 10 “² m²/s;

e) molámí optickou otáčivost 0,1 až 0,2 % roztoku hyaluronátu sodného ve fyziologickém pufru nižší než -11 x 10³ rad. cm²/mol (disacharid), měřeno při 220 nm;

f) když se 1 ml 1 % roztoku tohoto hyaluronátu sodného rozpouštěného ve fyziologickém roztoku implantuje do sklivce oka opice (Owl monkey), přičemž se jím nahradí přibližně 1/2 přítomného kapalného sklivce, nedojde k žádné podstatné celulámí infiltraci Camera vitrea bubli a Camera oculi anterior, žádným zábleskům v Humor aquosus, žádnému zákalu nebo zábleskům ve sklivci a žádným patologickým změnám rohovky, čočky, duhovky, sítnice a choroidea;

přičemž tato hyaluronová kyseliny je dále

g) sterilní a prostá pyrogenů a

h) neantigenní.

Kanadský patent CA 1 205 031 (který cituje US 4 141 973, jako dosavadní stav techniky) se týká frakcí hyaluronové kyseliny o střední molekulové hmotnosti od 50 000 do 100 000; od 250 000 do 350 000 a od 500 000 do 730 000, přičemž jsou zde diskutovány způsoby jejich výroby.

Pokud se používá kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti (nebo jejích solí nebo jiných forem) musí se zředit, aby bylo možno ji podávat a zajistit, že nebude docházet kjejí koagulaci a interferenci s tělesnými funkcemi.

Jeden injekční prostředek na bázi kyseliny askorbové (vitamínu C) podle lékopisu USP vyrábí forma Steris Laboratories lne., Phoenix, Arizona, 85043 USA. Tento prostředek obsahuje 22 mg/ml kyseliny askorbové (což odpovídá 250 mg/ml askorbátu sodného) a je umístěn v zásobnících o objemu 30, 50 nebo 100 ml. Zásobníkům o objemu 30 ml se dává přednost.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je uvedena fotografie poraněných a simulované operovaných artérií.

Na obr. 2 je znázorněn graf ilustrující expresi RHAMM (receptor pro HA (hyaluronanem) zprostředkovanou motilitu) karotidovými artériemi (plné čtverečky přísluší poraněným, prázdné čtverečky kontralaterálním a plné trojúhelníky simulované operovaným artériím).

Na obr. 3 jsou uvedeny fotografie ilustrující expresi RHAMM a hyaluronanu v buňkách hladkého svalstva karotidové artérie 4 dny po jejím poranění.

-9CZ 288986 B6

Na obr. 4 je znázorněn sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázající HA (hyaluronan-(kyselinu hyaluronovou)) ( 401 až 411) a anti-RHAMM protilátek na chemotaxi makrofágových buněčných linií v odpovědi na komplement (C5a).

Na obr. 5 je znázorněn sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázajících HA (401 až 411) na chemotaxi neutrofílů v odpovědi na IL-8.

Na obr. 6 je znázorněn sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázajících HA (401 až 411) na migraci buněk hladkého svalstva 5 hodin po poranění.

Obr. 7, 8, 9, 10, 11 a 12 se vztahují k článku o názvu „Neointimal Formation after Ballon Catheter Injury: A Role of Hyaluronan adn the Hyaluronan Receptor RHAMM“, jehož obsah je reprodukován dále.

Na obr. 7 jsou uvedeny fotografie buněk endothelu a buněk hladkého svalstva karotidových artérií zjizvených krys, kterých bylo použito při zkoušení.

Na obr. 8 je ilustrována exprese různých isoforem RHAMM po specifikovaných dobách.

Na obr. 9 je ilustrována distribuce hyaluronanu.

Na obr. 10 je ilustrován sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázajících HA (401 až 411) na chemotaxi neutrofílů v odpovědi na IL-8.

Na obr. 11 je znázorněn sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázající HA (401 až 411) a anti-RHAMM protilátek na chemotaxi makrofágových buněčných linií v odpovědi na komplement (C5a).

Na obr. 12 je znázorněn sloupcový graf ilustrující účinek RHAMM peptidů vázajících HA (401 až 411) na migraci buněk hladkého svalstva 5 hodin po poranění.

Byly provedeny následující pokusy.

Anestetizuje se 10 králíků a provede se jim balónková angioplastika. Králíci se podrobí perfuzi hyaluronanem (5 mg/ml) nebo samotným pufrem a nechají se zotavit. Po 2, 24 a 48 hodinách od poranění se králíci usmrtí a jejich karotidová artérie se zpracuje na vzorek pro histologii. Pro další práci se používá 5 až 10 pm řezů. Tyto řezy se obarví hematoxylinem nebo anti-RHAMM protilátkami. Analyzuje se 10 řezů při každém ošetření.

Výsledky této analýzy jsou popsány dále ve vztahu k obrázkům.

Obr. 1: Poraněné karotidové artérie vykazují denudaci vrstvy buněk endothelu a adherenci bílých krvinek (obr. IA). Bílé krvinky jsou pozitivně vybarveny na RHAMM vzhledem klgG kontrolnímu pozadí (obr. IB). Karotidové artérie, které byly exponovány hyaluronanu (obr. 1C) nebo simulované operované artérie (obr. ID) vykazují intaktní vrstvu buněk endothelu, není na nich patrná akumulace bílých krvinek.

Obr. 2: Analýza Western Transblot exprese RHAMM karotidovými artériemi. Karotidové artérie se homogenizují, uvolněné proteiny se podrobí elektroforéze na SDS-PAGE a pomocí monospecifické protilátky se zjišťuje přítomnost RHAMM. Přítomnost protilátky se vizualizuje chemiluminiscencí a relativní množství vázané protilátky se kvantifikuje optickou densitometrií. Operovaná zvířata vykazují akutní velmi rychlý nárůst přítomnosti RHAMM. Hladina RHAMM klesne po 5 až 6 dnech od poranění tkáně. Simulované operovaná zvířata nevykazují nárůst exprese RHAMM.

-10CZ 288986 B6

Obr. 3: Na obr. 3 je znázorněna exprese RHAMM (obr. 3A) a hyaluronanu (obr. 3B) v buňkách hladkého svalstva karotidové artérie 4 dny po jejím poranění. Exprese RHAMM na bílých krvinkách se ihned zvýší (obr. 1), zatímco ke zvýšení exprese RHAMM na buňkách hladkého svalstva dojde později a současně se začátkem jejich lokomoce. Buňky hladkého svalstva simulované operovaných zvířat nevykazují podobné zvýšení exprese RHAMM (obr. 3C).

Obr. 4: Na tomto obrázku je znázorněn účinek RHAMM peptidů na chemotaxi neutrofílů v odpovědi na IL-8. RHAMM peptidy, které simulují vazebnou doménu pro hyaluronan RHAMM inhibují chemotaxi neutrofílů při zkoušce v Boydenově komoře.

Obr. 5: Z tohoto obrázku je zřejmé, že RHAMM peptidy a protilátky inhibují chemotaxi makrofágových buněčných linií (Sl, WEHI-3) v odpovědi na komplement. Komplement, ale nikoliv tepelně (56 °C) inaktivovaný komplement, stimuluje chemotaxi makrofágových buněčných linií. RHAMM peptidy, které simulují vazebnou doménu pro hyaluronan RHAMM a anti-RHAMM protilátky inhibují chemotaxi.

Obr. 6: RHAMM peptidy inhibují lokomoci buněk hladkého svalstva v odpovědi na poranění. RHAMM peptidy, které simulují vazebnou doménu pro hyaluronan RHAMM inhibují lokomoci buněk hladkého svalstva po poranění.

Pomíchaný (scrambled) peptid nevykazuje žádný účinek, což ukazuje specificitu na „sense“ peptid.

Exprese RHAMM stanovená detekční metodou označovanou názvem „Anylýza Western Blot“ za použití monospecifických protilátek vzhledem k RHAMM (Turley E. A., Austin L., Vandeligt K. a Clary C., 1991, J. Cell. Biol. 112: 1 041) vykazuje akutní nárůst, který je detekovatelný do dvou hodin (obr. 2), což je časový rámec, v němž je u kontrolních zvířat pozorována adheze bílých krvinek k endothelu (obr. 2). [Další diskuze RHAMM je uvedena v článku „Identification of Two Hyaluronan-binding Domains in the Hyaluronan Receptor RHAMM“, Baihua Yang, Liying Zhang a Eva Turley, The Joumal of Biological Chemistry, sv. 268, č. 12, dubnové číslo 25, str. 8 617 až 8 623, 1993]. Hladina RHAMM je také zvýšena v kontralaterální artérii, což ukazuje, že z poraněné tkáně se uvolňuje rozpustný faktor regulující expresi RHAMM. Simulované operovaná zvířata však vykazují malý nárůst exprese RHAMM (obr. 2). U experimentálních zvířat se exprese RHAMM udržuje po dobu několika dnů a potom hladina RHAMM poklesne. Vyšetření fixované tkáně ukazuje, že hlavními buňkami exprimujícími RHAMM jsou aktivované bílé krvinky a buňky hladkého svalstva (obr. 1 a 3). Podíl RHAMM na lokomoci bílých krvinek a buněk hladkého svalstva se zjišťuje in vitro za použití obrazové analýzy k měření nahodilé lokomoce a Boydenovy komory k měření chemotaxe.

Peptidy (100 mg/miska), které simulují oblasti RHAMM (zejména oblasti vázající hyaluronan), inhibují migraci makrofágů (obr. 4), neutrofílů (obr. 5) a buněk hladkého svalstva (obr. 6) s vysokým stupněm statistické významnosti (p > 0,0001 při Studentově T-testu). Kolektivně tyto výsledky ukazují, že RHAMM a zejména jeho schopnost vázat hyaluronan, jsou podstatné pro lokomoci bílých krvinek a buněk hladkého svalstva a že exprese RHAMM se na místě poranění tkáně po experimentální balónkové katetrizaci u králíků zvýší.

Ošetření králíků hyaluronanem těsně před jejich poraněním má za následek odstranění adherence bílých krvinek endothelu, což se projevuje tím, že tkáň vypadá intaktní při detekci za použití histologických kritérií (obr. 1). Několik dnů po poranění vypadají karotidové artérie králíků ošetřených hyaluronanem podobně jako karotidové artérie kontrolních králíků, v nichž je endothel intaktní.

Tyto výsledky lze objasnit tím, že hyaluronan se navázal na buňky exprimující vysokou hladinou svého receptorů RHAMM a zabránil následným interakcím těchto buněk s endothelem. Očekává se, že exprese jiného receptorů hyaluronanu, CD44, bude také zvýšena.

-11 CZ 288986 B6

Diskuze a ilustrace různých termínů použitých v tomto popisu jsou uvedeny v dosud nepublikovaném článku o názvu „Neointimal Formation after Balloon Catheter Injury: A Role of Hyaluronan and the Hyaluronan Receptor RHAMM“, který je reprodukován dále.

„Tvorba neointimy po poranění balónkovým katétrem: úloha hyaluronanu a hyaluronanového receptoru RHAMM

Abstrakt

Jelikož hyaluronan (HA) a jeho interakce sHA receptorem RHAMM (Receptor for HA-Mediated Motility) byly implikovány při migraci buněk hladkého svalstva in vitro, zkoumali jsme expresi těchto molekul při in vitro modelovém poranění, kterým dochází k postižení buněk hladkého svalstva za použití deendothelizace karotidové artérie krysy při balónkové katetraci. Expresí RHAMM po poranění byly zasaženy převážně leukocyty a buňky hladkého svalstva. Dvě hodiny po poranění došlo k adhezi neutrofilů a makrofágů k místu poranění a k silné expresi RHAMM. Do 6 hodin bylo možno v blízkosti interní elastické laminy identifikovat subpopulaci mediálních buněk hladkého svalstva, což ukazuje zvýšenou expresi RHAMM. 48 hodin po deendothelizaci se v sousedství lumenu vytvořila vrstva buněk hladkého svalstva silně se vybarvující jak na RHAMM, tak na HA. V rozmezí od 7 do 14 dnů od poranění tato neointimální vrstva pokračovala v v expresi vysoké hladiny RHAMM, ale exprese HA byla omezena na buňky nalézající se na spojení mezi mediální a neointimální vrstvou. V kontrolních artériích byly zaznamenány dvě isoformy RHAMM (65 000 a 84 000). Současně se zvýšeným vybarvováním na RHAMM a HA pozorovaným v poraněných artériích byla v rozmezí od 36 do 72 hodin po poranění pozorovány 70 000 isoforma, kterou může být membránová forma RHAMM. Chemotaxe makrofágů a neutrofilů byla inhibována anti-RHAMM antisérem a peptidem kódujícím HA-vazebnou doménu RHAMM. Těmito reagenty byla inhibována migrace buněk hladkého svalstva po poranění in vitro. Kolektivně tyto výsledky ukazují, že HA a RHAMM mají svou při migračních odpovědích na vaskulámí poranění.

Úvod

Deendothelizace karotidové artérie krysy indukovaná balónkovým katétrem je dobře zavedený model restenózy po balónkové angioplastice¹. Sekvence jevů zahrnující adherenci inflamatomích buněk, proliferaci buněk hladkého svalstva a migraci do intimy, která je následována nadměrnou produkcí extracelulámí matrice, se projevuje stenózou postižené cévy po poranění endothelu^1-5. Tento proces je regulován růstovými faktory, jako je růstový faktor z krevních destiček (PDGF)⁶ a transformační růstový faktor β (TGF-β)⁷, hormony, jako je angiotensin⁸ a proteasami, jako jsou aktivátory tkáňového a urokinasového plazminogenu. Inflamatomí buňky mohou také modulovat odpověď produkcí širokého spektra růstových faktorů, včetně PDGF a TGF-βι. Po poranění dojde k proliferaci malé části buněk hladkého svalstva v mediální vrstvě a migrací těchto buněk interní elastickou laminou se vytvoří neointimální vrstva¹¹. Nadbytečné ukládání extracelulámí matrice těmito buňkami hladkého svalstva vede ke snížení velikosti průsvitu poraněné artérie¹². Mechanismus nebo mechanismy, jakými dochází k chemotaxi inflammatomích buněk a migraci buněk hladkého svalstva po in vivo poranění zůstávají nejasné.

Již dříve jsme ukázali in vitro, že pro migraci ras-transformovaných buněk¹³ a buněk hladkého svalstva do ran (Sáváni et al.,) je nutná interakce RHAMM a HA. Poranění monovrstvy se projevilo zvýšením HA asociované s buňkami, expresí nové 70 000 isoformy RHAMM a lokalizací RHAMM na povrchu buněk současně s vysokou rychlostí lokomoce po poranění. Polyklonální RHAMM antiséra blokující vazbu HA ke svému receptoru kromě toho inhibují migrační odpověď na poranění (Sáváni et al.,). Při této studii jsme zkoumali rozdělení a expresi jak RHAMM, tak HA při poranění karotidové artérie krysy balónkovým katétrem v průběhu vývoje neointimy a studovali jsme účinky antiRHAMM antisér a RHAMM peptidů na chemotaxi a migraci vaskulámích buněk.

-12CZ 288986 B6

Materiály a metody

Zvířata

Při těchto pokusech bylo použito samců krysy Sprague-Dawley (Charles River) o hmotnosti 325 až 350 g a stáří 15 týdnů.

Poranění balónkovým katétrem

Zvířata byla anestetizována intramuskulámím podáním 80 mg/kg ketaminu (Aveco) a 6 mg/kg xylazinu (Haver). Levá karotidová artérie byla vystavena působení balónkového katétru 2F Fogarty (Baxter, model 12-060-2f), který byl zaveden do průsvitu tepny. Balónkovým katétrem bylo po nafouknutí balónku třikrát posunuto, aby došlo k odstranění endothelu. Byly izolovány obě karotidové artérie poraněných zvířat. U simulované operovaných zvířat byla levá karotidová artérie exponována katétrem bez pohybu a pro studii byla izolována pravá artérie.

Anti-RHAMM antisérum a peptid vázající HA RHAMM

Polyklonální antisérum anti-peptid aa Ab (Sáváni et al.) bylo vypěstováno v králících v odpovědi na peptid aa^269-288 kódovaný v RHAMM cDNA¹⁴. Bylo ukázáno, že toto antisérum blokuje jak HA-stimulovanou nahodilou lokomoci, tak migraci buněk hladkého svalstva po poranění a že zčásti blokuje vazbu HA na RHAMM (Sáváni et al.).

Oblast vázající HA v RHAMM se skládá ze dvoudesetiaminokyselinových domén umístěných v blízkosti karboxylového konce proteinu¹⁵. Peptid simulující doménu I (aminokyseliny⁴⁰¹ YKQKIKHVVKLK a „pomíchaný“ (scrambled) peptid, který se skládá ze stejných aminokyselin, ale uspořádaných nahodilým způsobem, byl syntetizován v Ústavu buněčné biologie (Manitoba Institute of Cell Biology, Kanada). Obou peptidů bylo při zkouškách lokomoce použito v konečné koncepci 2 pg/ml.

Imunocytochemie

Artérie izolované pro imunocytochemii byly fixovány v 10% formulínu pufrovaném fosfátem, uloženy do parafinu a zpracovány na 5pm řezy. Nespecifická místa tkáně byla blokována jednohodinovým působením 1,5 % kozího séra v 0,01M fysiologickém solném roztoku pufrovaném Tris-pufrem (TBS). Řezy byly inkubovány přes noc buď s antipeptidem aa^269_288Ab (při zředění 1 : 100) rozpuštěným v 0,01 M TBS s 1,5 % kozím sérem pro detekci RHAMM, nebo s biotinylovanou HA vázající oblast aggrekanu (zředění 1 : 300) izolovaného z nosní chrupavky skotu¹⁶ pro detekci HA. Řezy určené pro barvení RHAMM byly inkubovány s biotinylovaným kozím protikráličím IgG (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 5 μΐ/ml 0,01M TBS. Aktivita endogenní peroxidasy byla odstraněna jednohodinovým působením 0,6 % peroxidu vodíku v methanolu (Mallinckrodt) při teplotě místnosti. Všechny řezy byly potom inkubovány s komplexem avidin-biotin-peroxidasa (Vectastain, Vecto Labs.) 1 hodinu při teplotě místnosti. Vybarvení bylo získáno za použití diaminobenzadinu (DAB, Sigma, 10 mg/ml v 0,05M TBS) a reakce byla zastavena destilovanou vodou. Zbarvení reakčního produktu bylo zesíleno desetiminutovým působením 0,5 % síranu měďnatého v 0,9 % roztoku chloridu sodného. Dobarvení bylo provedeno patnáctiminutovým působením 0,25 % roztoku methylové zeleni. Po vyjasnění v n-butanolu a xylenu byly řezy upevněny v zařízení Permount^(R) (Fisher Scientific). Specificita barvení na RHAMM byla potvrzena výrazně nižším vybarvením, které bylo pozorováno po použití séra, z něhož byly rhamm protilátky odstraněny afinitní chromatografií. Specificita barvení na HA byla potvrzena jednak inkubací vzorku s nadbytkem HA před barvením a jednak předběžným zpracováním řezů s Streptomyces hyaluronidasa za účelem degradace HA před barvením. Jako negativní kontroly bylo použito normálního králičího IgG (5 pg/ml, Sigma) a jako pozitivní kontroly bylo použito anticytoskeletální aktinové protilátky (zředění 1 : 1000, Sigma).

-13CZ 288986 B6

Imunobloty

Kartidové artérie byly zmrazený v kapalném dusíku a udržovány při teplotě -80 °C až do další analýzy. Tkáň byla homogenizována v pufru pro lysi [25mM Tris-Hcl, 0,1 % dodecylsulfát sodný, 1 % Triton X-100, 1 % deoxycholát sodný, 0,15M chlorid sodný, lmM EDTA s přísadou inhibitoru proteasy leupeptinu (1 pg/ml) fenylmethylsulfonylfluoridu (2mM) a pepstatinu A (1 pg/ml), aprotininu (0,2 TlU/ml) a 3,4-dichlorisokumarinu (200μΜ)]. Koncentrace proteinu byla stanovena zkušební metodou pro proteiny DC (BioRad, Richmond, CA, USA) za použití stejného vzorku pufru pro lysy stanovení pozadí. 5 pg proteinu bylo odděleno z každého vzorku na 10 % SDS PAGE a potom byl protein transblotován na nitrocelulózovou membránu. Další místa vázající protein byla blokována 5 % odtučněným mlékem v TTBS (0,01M Tris-báze, 150mM chlorid sodný, pH 7,4 s přísadou 0,05% Tween 20, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Bloty byly inkubovány s primární protilátkou (antipeptidem aa^269_288Ab zředěným v poměru 1 :250 1 % odtučněným mlékem v TTBS) přes noc při teplotě 4 °C. Primární protilátka byla detekována za použití kozí protikráličí IgG protilátky konjugované ke křenové peroxidase (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA, 0,2 pg/ml v 1 % odtučněném mléce v TTBS) po jednohodinové inkubaci při teplotě místnosti a byla vizualizována chemiluminescencí (ECL, Amersham) podle instrukcí výrobce.

Buňky a buněčné linie

Zaorty skotu byly izolovány buňky hladkého svalstva způsobem popsaným dříve pro izolaci buněk z krysí aorty¹⁷. Izolované buňky byly udržovány v Dulbeccem modifikovaném Eaglesově médiu (DME), které bylo doplněno fetálním telecím sérem (FCS) (10 %) a pufrem HEPES (20mM), při pH 7,2, teplotě 37 °C a v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Všechny pokusy byly prováděny za použití definovaného média [DM, Dulbeccem modifikovaného Eaglesova média doplněného pufrem HEPES, pH 7,2 a 0,5 U/ml inzulínu (suspenze zinku, skot a vepř; Novo Laboratories Ltd., Willowdale, Ontario, Kanada) a 4 pg/ml transferrinu (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)]Kuitivační médium se nahradí 24 hodin před vytvořením filmu. Poškození konfluentních monovrstev poraněním spočívalo v odstranění poloviny monovrstvy za použití odběrového zařízení pro buňky a přidání čerstvého DM za přítomnosti buď RHAMM peptidu aa^401-411, nebo pomíchaného peptidu na bázi stejné domény, který byl popsán výše.

Pro analýzu účinku protilátek a syntetického peptidu na chemotaxi makrofágů na endotoxinem aktivované myší sérum (AS) byly použity makrofágové buněčné linie SI a WEHI-3. Tyto buněčné linie byly také uchovávány v DME s 10 % FCS a 20mM pufrem HEPES a pH 7,2 při 37 °C v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu.

Ze vzorků periferní krve normálních dobrovolníků byly izolovány humánní neutrofily. Tyto neutrofily byly smíseny s roztokem ACD (0,085M citran trojsodný, 0,065M kyselina citrónová, 2 % dextrosa), aby se zabránilo sražení. Ke směsi byl přidán 5 % dextran a byla odstraněna oddělená plazma a bílé krvinky. Buňky byly promyty dvakrát v PBS o pH 7,2 a pro separaci lymfocytů bylo použito Ficollova gradientu. Izolované neutrofily byly potom promyty a resuspendovány v PBS. Červené krvinky byly podrobeny lysi krátkou expozicí hypotonickému PBS.

Průběžná cinemikrografie

Poškozené buněčné monovrstvy byly monitorovány na motilitu za použití inversního mikroskopu IM 35 Zeiss, k němuž byla připojena videokamera (Hamamatsu CCD, lne., Japonsko). Buňky byly uchovávány při teplotě 37 °C za použití topné desky (TRZ 3 700, Zeiss, Německo). Lokomoce buněk byla sledována pomocí obrazové analýzy (Image 1, Universal Imaging Corp., Westchester, PA, USA). Tento program umožnil kvantifikaci přesunu jader ze sekvence

-14CZ 288986 B6 digitalizovaných obrazů. Motilita 30 buněk při každém pokusu byla sledována po dobu 24 hodin a každou hodinu byla vypočtena střední rychlost pohybu.

Zkouška chemotaxe

Chemotaxe byla stimulována buď za použití myšího séra aktivovaného bakteriálním endotoxinem (AS) vyrobeného způsobem podle Stevensona et al.¹⁸ pro makrofágové buněčné linie, nebo 100 ng/ml interleukinu-8 (IL-8) pro neutrofíly. V prvním případě bylo pro kontrolu použito teplem inaktivovaného séra (20 minut při 56 °C) a ve druhém samotného média. Použita 10 zkouška chemotaxe představuje kolorimetrické stanovení vyvinuté v naší laboratoři, které bylo podrobně popsáno jinde¹⁹. V krátkosti lze tuto zkoušku popsat takto: Použije se 96jamkové komory pro chemotaxi se spodním zahloubením, které je dostatečně široké, aby mohlo přidržovat mikrotitrovou desku (Neuro Probe, skladové číslo MBA 96) a rámečkového filtru 5 pm (Neuro Probe, skladové číslo PED 5/A). Mikrotitrová deska se naplní chemoatraktanty a kontrolními 15 reagenty a umístí do zahloubení komory pro chemotaxi. Na horní část naplněné mikrotitrové desky se položí rámečkový filtr. Potom se komora uzavře a do jamek vrchní desky se umístí 200 μΐ buněčné suspenze (2,5 x 10⁵ buněk/ml v DME). Komora se inkubuje při 37 °C po dobu 4 až 6 hodin v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Po inkubaci se médium v jamkách vrchní desky nahradí 200 μΐ PBS s obsahem 20μΜ EDTA a následuje třicetiminutová 20 inkubace při 4 °C. Buňky, které zůstanou na vrchní straně polykarbonátové membrány se odstraní vatovými Q-tampony. Buňky, které migrovaly do filtru nebo filtrem se odstraní centrifugací za použití 50ml zkumavkového adaptoru (10 minut, 500 g) a přenesou do 96jamkové desky. Počet přemístných buněk se kvalifikuje přídavkem 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5difenoltetrazolium bromidu (MTT) do konečné koncentrace 250 pg(ml se čtyřhodinovou 25 inkubací při 37 °C. Tmavě purpurové krystaly vzniklé redukcí MTT se rozpustí smícháním se 100 μΐ isopropanolové kyseliny chlorovodíkové (2mM). Deska se analyzuje do 2 hodin za použití čtecího zařízení pro mikrotitrové desky ELISA s filtrem 540 nm. Stupeň redukce MTT odpovídá relativnímu počtu buněk¹⁹.

Výsledky

Bylo zjištěno, že po poškození karotidové artérie balónkovým katétrem dochází ke zvýšené expresi RHAMM a HA.

Buňky endothelu a hladkého svalstva karotidových artérií získaných od neporaněných krys byly mírně pozitivní na RHAMM (obr. 7 A). Dvě hodiny po poranění došlo k přilnutí neutrofilů a makrofágů k obnažené oblasti a k silné expresi RHAMM (obr. 7B). Do 6 hodin po poranění však část buněk hladkého svalstva vykazovala zvýšenou expresi RHAMM (obr. 7C) a do 48 hodin buňky hladkého svalstva, které vytvořily neointimu, se silně vybarvovaly na RHAMM 40 (obr. ID). Po 7 dnech a až do 14 dnů po poranění docházelo ke zvětšování neointimální vrstvy.

Buňky v této vrstvě pokračovaly v expresi vysoké hladiny RHAMM (obr. 7E a 7F). Řezy inkubované spreimunním IgG a anti-RHAMM antisérem, které byly chromatografovány na sloupci RHAMM-GST (fúze proteinů) za účelem odstranění anti-RHAMM protilátek, se nevybarvovaly (data nejsou uvedena).

Exprese RHAMM byla dále zkoumána za použití analýzy Western Blot artérií poraněných a simulované operovaných zvířat za použití anti-peptidu aa^{269 288}Ab. U neporaněných artérií byla pozorovány významná exprese dvou isoforem RHAMM o molekulové hmotnosti 84 000 a 65 000 (data nejsou uvedena). U poraněných artérií však byla pozorována konsistentní zvýšená 50 exprese isoformy RHAMM o molekulové hmotnosti 84 000 v rozmezí od 2 do 24 hodin po deendothelizaci (obr. 8) a po této době exprese této isoformy poklesla (obr. 8). Následující nárůst hladiny isoformy o molekulové hmotnosti 84 000 byl pozorován v rozmezí od 72 do 168 hodin (obr. 8). Změny v expresi 65 000 isoformy byly u poraněných artérií pouze minimální (obr. 8). Zajímavé je, že v rozmezí od 36 do 72 hodin po poranění byla přídavně stanovena 70 000

-15CZ 288986 B6 isoforma (obr. 8), která se dočasně překrývala se silným barvením na RHAMM a HA pozorovaným u poraněných artérií (obr. 7).

Distribuce HA u nepomněných karotidových artérií byla omezena na endothel a adventitia (obr. 9A). Dvě hodiny po poranění přilnuly neutrofíly a makrofágy k obnažené oblasti, což se projevilo mírným zvýšením barvení na HA (obr. 9B). Až do 48 hodin byly buňky hladkého svalstva vytvářející neointimu silně pozitivní na HA (obr. 9C), což se překrývalo s expresí vysoké hladiny RHAMM (obr. 9D). V rozmezí od 7 do 14 dnů barvení na HA klesalo a postupně se omezovalo na buňky na spojení mezi médiem a neointimu (obr. 9D a E).

Řezy, které byly předběžně ošetřeny hyaluronidasou nebo preinkubovány s biotinylovanou sondou vázající HA s HA, se nebarvily (data nejsou uvedena), což ukazuje, že zkouška je specifická.

Dále bylo zjištěno, že interakce RHAMM:HA reguluje chemotaxi inflamatomích buněk.

Jelikož exprese RHAMM byla zvýšena v inflamatomích buňkách přilnutých k poraněné oblasti karotidové artérie, byla studována úloha interakce RHAMM:HA při chemotaxi neutrofílů a makrofágů jednak za použití peptidu kódujícího jednu ze dvou domén vázajících HA RHAMM (aa^401-411)¹⁴ a jednak anti-peptidu aa^269-288Ab, u něhož bylo již dříve ukázáno, že interferuje s vazbou HA na RHAMM (citace 14 a Sáváni et al.). Chemotaxe humánních neutrofílů k IL-8 byla značně inhibována peptidem aa^401-411 (obr. 10) a oba peptidy, tj. (aa^401-411)¹⁴ a anti-peptid aa^269-288Ab, inhibovaly chemotaxi dvou humánních buněčných linií makrofágů S1 a WEHI-3 na endotoxinem aktivované myší sérum (obr. 11).

Dále bylo zjištěno, že interakce RHAMM:HA reguluje migraci buněk hladkého svalstva po poškození poraněním.

Již dříve jsme ukázali, že anti-RHAMM antisérum inhibuje orientovanou migraci monovrstev buněk hladkého svalstva do ran (Sáváni et al.). Za účelem dalšího potvrzení úlohy interakce RHAMM:HA při odpovědi na poranění jsme zkoumali účinek peptidu kódujícího jednu z domén vázajících HA RHAMM (aa^40Ml1)¹⁴. Tento peptid podstatně snižoval rychlost translokace buněk hladkého svalstva po poranění monovrstev (obr. 12). Pomíchaný peptid obsahující stejné aminokyseliny jako peptid aa⁴⁰¹“⁴¹¹, neměl žádný vliv na odpověď na poranění (obr. 12).

Diskuze

Hyaluronan, což je složka extracelulámí matrice, byl implikován při lokomoci buněk v průběhu embryogenese^{20, 21},invase nádorů²², transformace onkogenů¹³ a při odpovědi na poranění^23-25. Účinek HA na lokomoci buněk se zdá být zprostředkován specifickými receptory^13,26, jako je CD44²⁷ a RHAMM¹⁴. HA byl implikován při migraci buněk endothelu a buněk hladkého svalstva^28-30 a byla konstatována důležitost RHAMM při migraci embryonických buněk hladkého svalstva³¹ a buněk hladkého svalstva dospělých po poškození poraněním (Sáváni et al.). Jelikož migrace buněk hladkého svalstva představuje kritickou složku patogenese restenózy po balónkové angioplastice³, učinili jsme hypotézu, že exprese a distribuce RHAM a HA by mohla hrát také úlohu po deendothelizaci in vivo krysí karotidové artérie působením balónkového katétru.

Časná akumulace inflamatomích buněk v obnažené oblasti poraněných artérií již byla popsána dříve³² a naše výsledky tuto skutečnost potvrzují. Akumulace inflamatomích buněk na místech poranění vyžaduje jejich chemotaktickou migraci na toto místo a následující přilnutí³³. Přilnutí (adheze) je iniciováno interakcí se selekcemi a vede k odvalování buněk podél cévní stěny s následným silným přilnutím prostřednictvím specifických vaskulámích integrinů. Poté následuje extravasance (přehled je uveden v citaci 34). Zvýšená exprese RHAMM v inflammatomích buňkách přilnutých k obnaženému endothelu může vykonávat několik funkcí.

-16CZ 288986 B6

Ze zjištění, že jak chemotaxe neutrofilů, tak chemotaxe makrofágů, může být blokována za použití anti-RHAMM antiséra nebo peptidu simulující některou z domén vázajících HA RHAMM ukazuje, že interakce RHAMM:HA by mohly přispívat k akumulaci inflamatomích buněk na místě poranění prostřednictvím chemotaxe. Také jsme ukázali, že interakce RHAMM:HA regulují pseudopodání extensi ve fíbroblastech, což je proces potřebný pro extravasaci. Podobně má RHAMM svou úlohu při tomto procesu během extravasace makrofágů.

V současné době zkoumáme tuto možnost.

Nedávno jsme zjistili, že klidové monovrstvy buněk hladkého svalstva významně exprimují 65 000 isoformu RHAMM a že spolu se zvýšenou migrací, k níž dochází po poškození poraněním se také vytváří 70 000 isoforma. O posledně uvedené formě bylo předpokládáno, že představuje membránovou formu RHAMM, poněvadž její výskyt se shoduje se zvýšenou imunofluorescencí RHAMM lokalizovaného v membráně při analýze FACS (Sáváni et al.).

V této práci ukazujeme, že podobně jako buňky hladkého svalstva in vitro i neporaněné karotidové artérie exprimují 65 000 RHAMM a že po poranění se objevuje 70 000 isoforma. Tato isoforma RHAMM byla exprimována pouze v rozmezí od 36 do 72 hodin po poranění, což souhlasí se zprávami o časovém rámci buněk hladkého svalstva na místo poranění^1,3.Uloha této isoformy RHAMM při lokomoci buněk je v současné době studována. Jelikož 84 000 protein nebyl produkován buňkami hladkého svalstva in vitro, jeho povaha a typ buněk, které jej exprimují, nejsou v současné době známy.

Nedávno jsme ukázali, že poškození poraněním se zvyšuje asociace HA s monovrstvami buněk hladkého svalstva současně s lokalizací RHAMM v membráně a expresí 70 000 isoformy (Sáváni et al.). Ke zvýšenému barvení na HA při současné studii docházelo v období maximální migrace a exprese 70 000 isoformy RHAMM. Tyto výsledky podporují hypotézu, že interakce RHAMM:HA regulují motilitu buněk. Schopnost reakčních činidel, jako je anti-RHAMM antisérum a RHAMM peptid, blokovat funkci RHAMM in vitro, je konsistentní s tímto předpokladem.

Již dříve byla řada růstových faktorů, zejména PDGF-BB³⁵ a TGF-β³⁶, implikována a migrací buněk hladkého svalstva a s patogenesí restenózy^6,7. PDGF-BB pocházející jak z adherentních destiček, tak z buněk hladkého svalstva samotných, má větší vliv na migraci, než na proliferaci buněk hladkého svalstva⁶. TGF-β 1 je produkován buňkami hladkého svalstva v poraněném místě a přispívá k proliferaci buněk hladkého svalstva a abnormálnímu ukládání extracelulámí matrice v pozdějších stádiích procesu restenózy⁷. Růstové faktory byly také implikovány při regulaci lokomoce inflamatomích buněk. Tak, TGF-β 1 reguluje chemotaxi monocytů³⁷. Zvýšená lokomoce fibroblastů stimulované TGF-β 1 je zprostředkováno interakcí RHAMM:HA a TGF-β 1 reguluje jak expresi RHAMM, tak syntézu HA ve fíbroblastech³⁸. Regulace exprese RHAMM a HA v buňkách hladkého svalstva prostřednictvím TGF-β 1 a PDGF-BB je v současné době zkoumána.

V této studii jsme tedy ukázali, že po vaskulámím poranění in vivo dochází k hlubokým změnám exprese RHAMM a HA a že pro chemotaxi inflamatomích buněk a pro migraci buněk hladkého svalstva in vitro je nutná interakce RHAMM:HA. Tato data ospravedlňují předpoklad, že činitel blokujících interakce RHAMM:HA in vivo by bylo možno použít pro snižování nebo prevenci vývoje restenózy po poranění balónkovým katétrem. Takové studie jsou v současné době prováděny v naší laboratoři.

Poděkování

Tento výzkum byl financován Kanadskou radou pro lékařský výzkum (Medical Research Council of Canada (MRC), číslo grantu 10 948 (EAT) a Manitobskou nadací lékařských služeb (Manitoba Medical Services Foudation (RCS)). EAT je příjemcem stipendia „Chilren‘s Hospital of Winnipeg Research Foundation Scholarschip“. Vysoce oceňována je odborná pomoc paní Elaine Garagonové a paní Laurie Langeové.

-17CZ 288986 B6

Citace

1. Fems, GAA Stewart-Lee, AL a Ánggárd, EE: Arterial response to mechanical injury: balloon catheter de-endothelialization. Atherosderosis 1992, 92:89-104

2. Ross, R: The pathogenesis of atherosderosis: a perspective for thel990’s. Nátuře 1993,362:801-809

3. Casscells, W: Migration of smooth musde and endothelial cells: Critical events in restenosis. Circulatíon 1992, 86(3):723-729

4. Tanaka, Y, Adams, DH a Shaw, S: Proteoglycans on endothelial cells present adhesion-inducing cytokines to leukocytes. Immunol Today 1993,14(3):111-115

5. Lovqvist, A. Emanuelsson, H, Nilsson, J, Lundqvist, H a. Carlsson, J: Pathophysiological mechanisms for restenosis following coronary angioplasty: possible preventative altematives. J Int Med 1993, 233:215-226

6. Jawien, A, Bowen-Pope, DF, Lindner, V, Schwartz, SM a Clowes, AW: Platelet-derived Growth Factor promotes smooth musde cell migration and intimal thickening in a rat model of balloon angioplasty. J Clin Invest 1992,89:507-511

7. Majesky, MW, Linder, V, Twardzik, DR, Schwartz, SM a Reidy, MW.: Production of Transforming Growth Factor during repair of arterial injury. J Clin Invest 1991,88:904-910

8. Rakugi, H, Jacob, HJ, Krieger, JE, Ingelfinger, JR a Pratt, RE: Vascular injury induces aníotensinogen gene expression in the media and neointima. Circulatíon 1993,87:283-290

9. Clowes, AW, Clowes, MM, Au, YPT, Reidy, MA a Bělin, D: Smooth musde cells express urokinase during mitogenesis and tissue

-18CZ 288986 B6 type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery. CircRes 1990,67:61-67

10. Miano, JM, Vlasic, N, Tota, RR a Stemerman, MB:

Smooth muscle cell immediate-early gene and growth factor activation follows vascular injury: A putative in vivo mechanism for autocrine growth.. Arterioscler Ihromb 1993,13211-219

11· Clowes, AW a Schwartz, SM: Significance of quiescent smooth muscle cell migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985,56:139-?

12· Clowes, AW, Reidy, MA a Clowes, MM: Mechanisme of stenosis after arterial injury. Lab Invest 1983,49(2):208-215

13. Turley, EA, Austen, L, Vandeligt, K a Clary, C: Hyaluronan and a cell-associated hyaluronan binding protein regulate the locomotion of ras-transfonned cells. J Cell Biol 1991,112(5): 1041-1047

14. Hardwick, C, Hoare, K, Owens, R, Hohn, HP, Hook, M, Moore, D, Cripps, V, Austen, L, Nance, DM a Turley, EA: Molecular cloning of a novel Hyaluronan receptor that mediates tumor cell motility. J Cell Biol 1992,117(6): 1343-1350

15. Tang, B, Zhang, L a Turley, EA: Identification of two hyaluronan-binding domains in the hyaluronan receptor RHAMM. J Biol Chem 1993,268:8617-8623

16. Ripellino, JA, Killinger, MM, Margolis, RU a Margolis, RK: The hyaluronic acid binding region as a specific probe for the localization of hyaluronic acid in tissue sections. J Hisotchem Cytochem 1985,33:1066-1086

17. Majack, RA a Clowes, AW: Inhibition of vascular smooth muscle cell migration by heparin-like glycosaminoglycans. J Cell Physiol 1984,118253-256

- 19CZ 288986 B6

18. Stevenson, MM, Kongshovn, AL a Skamen, E: Genetic linkage of resistance to Listeria monocytogenes with macrophage inflammatory responses. J Immunol 1981,127:402

19. Shi, Y, Komovski, BS, Sáváni, RC a Turley, EA: A rapid, multíwell colormetric assay for chemotaxis. J Immunol Methods 1993, v tisku

20. Laurent, TC a Fraser, JRE: Hyaluronan FASEB J 1992, 6:2397-2404

21. Toole, BP: Developmental role of hyaluronate, Conn Tiss Res 1982,10:93-100

22. Turley, EA: Hyaluronan and cell locomotion. Cancer Met Rev 1992,11:21-30

23. Waldenstróm, A, Martinussen, HJ, Gerdin, B a Ha Ugren, R: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 1991,88:1622-1628

24. Weigel, PH, Fuller, GM a LeBoeuf, RD: A model for the role of hyaluronic add and fíbrinogen in the early evenls of inflammatory response and wound healing. J Theoret Biol 1986,119:219-234

25. Bray, BA, Sampson, PM, Osman, M, Giandomenico, A a Turino, GM: Early changes in lung tissue hyaluronan (hyaluronic acid) and hyaluronidase in bleomycin-induced alveolitis in hamsters. Am Rev Resp Dis 1991,143:284-288

26. Toole, BP: Hyaluronan and its binding proteins, the hyaladherins. Curr Opn Cell Biol 1990,2:839-844

27. Haynes, BF, Liao, H-X a Patton, KL: The transmembrane hyaluronate receptor (CD44): multiple functions, multiple forms. Cancer Cells 1991,3(9):347-350

-20CZ 288986 B6

28· Ausprunk, DH, Boudreau, CL a Nelson, DA: Proteoglycans in the microvasculature Π: Histochemical localization in proliferating capillaries of the rabbit comea. Am J Pathol 1981,103:367-375

29. West, DC a Kumar, S: The effect of hyaluronate and its oligosaccharides on endothelial cell proliferation and monolayer integrity. Exp Cell Res 1989,183:179-196

30. Boudreau, N a Rabinovitch, M: Developmentally regulated changes in extracellular matrix in endothelial and smooth Muscle Cells in the ductus arteriosus may be related to intimal proliferation. Lab Invest 1991,64(2):187-199

31. Boudreau, N, Turley, EA a Rabinovitch, M: Fibronectin, Hyaluronan, and a Hyaluronan Binding Protein contribute to increased ductus arteriosus smooth muscle cell migration. Develop Biol 1991, 143:235-247

32. Kockx, MM, De Meyer, GRY, Jacob, WA, Bult, H a Herman, AG: Triphasic sequence of neointimal formation in the cuffed carotid artery of the rabbit. Arterioscl Thromb 1992,12:1447-1457

33. Lásky, LA: Selections: Interpreters of cell-specific carbohydrate information during inflammation. Science 1992, 258:964-969

34. Dustin, ML a Springer, TA: Annu Rev Immunol 1991, 9:27-66

35. Welsh, CJ, Schmeichel, K a McBride, K: Platelet-Derived Growth Factor activates Phospholipase D and chemotactic responses in vascular smooth muscle cells. In Vitro Cell Dev Biol 1991, 27A:425-431

36. Merwin, JR, Roberts, A, Kondaiah, P, Tucker, A a Madri, JA: Vascular cell responses to TGF-fi₃ mimic those TGF-fij in vitro. Growth Factors 1991,5(149-158)

-21 CZ 288986 B6

37. Wahl, SM, Hunt, DA, Wakefield, LM, McCartney-Francis, N, Wahl, LM, Roberts, AB a Spom, MB: Transforming growth factor type beta induces monocyte chemotaxis and growth factor production. Proč Nati Acad Sci, USA 1987,84 ( Srpen 1987):5788-5792

38. Samuel, SK, Hurta, RAR, Spearman, MA, Wright, JA, Turley, EA a Greenberg, AH: TGF-Bj stimulation of cell locomotion is mediated by the hyaluronan receptor RHAMM and hyaluronan. J Cell Biol 1993, v tisku.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (18)

1. Použití sloučenin kyseliny hyaluronové zvolených ze souboru sestávajícího z kyseliny hyaluronové, jejích fragmentů nebo podjednotek a farmaceuticky vhodných solí pro výrobu farmaceutického prostředku pro zabránění zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů.

2. Použití podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku, kde sloučeninou kyseliny hyaluronové je kyselina hyaluronová a/nebo její sůl s relativní molekulovou hmotností nižší než 750 000.

3. Použití podle nároků 1 nebo 2, pro výrobu farmaceutického prostředku, který je vhodný pro intravenosní podávání.

4. Použití podle některého z předchozích nároků, pro výrobu farmaceutického prostředku, kde množství sloučeniny kyseliny hyaluronové leží v rozmezí od 10 do 3000 mg, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu.

5. Použití podle nároku 4, pro výrobu farmaceutického prostředku obsahujícího více než 200 mg sloučeniny kyseliny hyaluronové, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu.

6. Použití podle některého z předchozích nároků, pro výrobu farmaceutického prostředku vhodného pro zabránění arteriální restenózy po balónkové angioplastice u člověka.

7. Použití podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku pro zabránění zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů kde farmaceutický prostředek dále obsahuje činidlo zvolené z esteroidního protizánětlivého léčiva, léčiva inhibující stenózu, vitamínu C, antioxidantu. látky pohlcující volné radikály a jejich kombinací.

8. Použití podle nároku 7, pro výrobu farmaceutického prostředku, kde kyseliny hyaluronová a/nebo její soli mají relativní molekulovou hmotnost nižší než 750 000.

9. Použití podle nároků Ί nebo 8, pro výrobu farmaceutického prostředku vhodného pro intravenosní podávání.

-22CZ 288986 B6

10. Použití podle některého z nároků 7 až 9, pro výrobu farmaceutického prostředku obsahujícího kyselinu hyaluronovou a/nebo její sůl v množství od 10 do 3000 mg, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu.

11. Použití podle nároku 10, pro výrobu farmaceutického prostředku obsahujícího kyselinu hyaluronovou a/nebo její sůl v množství vyšším než 200 mg, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu.

12. Použití podle některého z nároků 7 až 11, pro výrobu farmaceutického prostředku vhodného pro zabránění arteriální restenózy po balónkové angioplastice u člověka.

13. Farmaceutický prostředek pro zabránění zužování traumatizovaných tubulámích stěn cév živočichů, vyznačující se tím, že spolu s ředidly, adjuvanty a jinými farmaceutickými nosiči, kterých se používá podle potřeby, obsahuje sloučeninu kyseliny hyaluronové zvolenou z kyseliny hyaluronové, jejích farmaceuticky vhodných solí, fragmentů a podjednotek kyseliny hyaluronové a léčivo inhibující stenózu.

14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že dále obsahuje činidlo zvolené z nesteroidního protizánětlivého léčiva, vitamínu C, látky pohlcující volné radikály, antioxidantu ajejich kombinací.

15. Farmaceutický prostředek podle nároků 13 nebo 14, vyznačující se tím, že jako sloučeninu kyseliny hyaluronové obsahuje kyselinu hyaluronovou a/nebo její farmaceuticky vhodnou sůl, která má relativní molekulovou hmotnost nižší než 750 000.

16. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 13ažl 5, vyznačující se tím, že jako sloučeninu kyseliny hyaluronové obsahuje hyaluronát sodný a je ve formě vhodné pro injekční nebo intravenosní podávání.

17. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 13 až 16, vyznačující se tím, že sloučeninu kyseliny hyaluronové obsahuje v množství v rozmezí od 10 do 3000 mg, vztaženo na jednotkovou dávkovači formu.

18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že sloučeninu kyseliny hyaluronové obsahuje v množství vyšším než 200 mg, vztaženo na jednotlivou dávkovači formu.