CN104619352B - 含有hc-ha/ptx3复合物的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于生产天然的和重建的乙酰透明质酸(HA)复合物的方法，该复合物含有五聚环蛋白‑3(PTX3)和间α抑制剂(IαI)的重链1(HC1)。提供了含有该复合物的组合物和使用该复合物的治疗方法。还提供了用于实施该方法的组合和试剂盒。

Description

含有HC-HA/PTX3复合物的组合物及其使用方法
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羊膜(AM)是充满围绕胎儿的羊水的无血管膜囊。像胎盘一样，AM衍生自在受精卵发育过程中形成的上胚层。AM构成羊膜腔中围绕胎儿的最内侧的膜。在胎盘哺乳动物中，脐带(即，funiculus umbilicalis)将发育中的胎儿与胎盘相连。脐带由羊膜(UCAM)和华顿氏胶(Wharton’s Jelly)组成。羊膜构成脐带的外层。UCAM用来调节UC内的流体压力。华顿氏胶是脐带内的凝胶状物质，主要由粘多糖(透明质酸和硫酸软骨素)组成。它还含有一些成纤维细胞和巨噬细胞。脐带进一步包含埋在华顿氏胶内的两条动脉(脐动脉)和一条静脉(脐静脉)。
发明内容
本文描述了鉴定胎儿组织如羊膜和脐带中的HC-HA/PTX3复合物的方法。本文还描述了从胎儿组织如羊膜和脐带中分离天然HC-HA/PTX3复合物的方法。本文还描述了生产重建的HC-HA/PTX3复合物的方法。本文还描述了使用本文提供的天然和重建的HC-HA/PTX3复合物的方法。
在某些实施方案中，本文描述了生产HC-HA/PTX3复合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括从由组织或细胞制备的提取物中分离天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物。在一些实施方案中，该方法包括生成重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物。
在某些实施方案中，本文描述了从羊膜组织如脐带或羊膜中分离天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物的方法。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从分离的细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从培养的细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从干细胞中分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从由诸如脐带或羊膜的组织制备的提取物的水溶性级分中分离。在一些实施方案中，该水溶性级分使用等渗盐溶液提取。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物从由诸如脐带或羊膜的组织制备的提取物的水不溶性级分中分离。在一些实施方案中，该不溶性级分使用GnHCl提取。
在某些实施方案中，本文描述了在体外生产重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物的方法：(a)将(i)固定至固体支持体上的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)，和(ii)五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质相接触，以形成固定化的PTX3和HMW HA的复合物(固定化的PTX3/HA)；和(b)使固定化的PTX3/HA与包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)接触，以形成固定化的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。在该方法的一些实施方案中，该方法包括使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质、包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)同时接触。在该方法的一些实施方案中，TSG-6催化IαI HC1与HA的共价连接。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(a)之后及进行步骤(b)之前除去未结合的PTX3蛋白质。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后除去未结合的TSG-6。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是从细胞中分离的天然PTX3蛋白质。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是羊膜细胞。在一些实施方案中，该细胞是脐带细胞。在一些实施方案中，该细胞是来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质包含具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质包含具有SEQ ID NO:32-45中任一个所示的序列的多肽或其物种变体或等位基因变体。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是同源多聚体(即由两个或更多个相同的组分组成的多聚体蛋白质)。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是八聚体。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质包含修饰的多聚化结构域或异源多聚化结构域。在一些实施方案中，在该方法中使用的TSG-6蛋白质是从细胞分离的天然TSG-6蛋白质。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是羊膜细胞。在一些实施方案中，该细胞是脐带细胞。在一些实施方案中，该细胞是来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，该TSG-6蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该TSG-6蛋白质包含具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的TSG-6蛋白质包含具有SEQ ID NO:1-31中任一个所示的序列的多肽或其物种变体或等位基因变体。在一些实施方案中，在该方法中使用的HC1包含具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中作为HC1来源使用的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质还包含通过硫酸软骨素链连接的HC2和尿抑胰酶素。在一些实施方案中，该HC1包含具有SEQ ID NO:46-47中任一个所示的序列的多肽或其物种变体或等位基因变体。在一些实施方案中，HC2包含具有SEQ ID NO:49所示序列的多肽或与具有SEQ IDNO:49所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的HC2包含具有SEQ ID NO:48-49中任一项所示的序列的多肽或其物种变体或等位基因变体。在一些实施方案中，尿抑胰酶素包含具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的尿抑胰酶素包含具有SEQ ID NO:52-53中任一项所示的序列的多肽或其物种变体或等位基因变体。在一些实施方案中，在该方法中使用的IαI蛋白质从血液、血清、血浆、羊膜、绒毛膜、羊水或其组合分离。在一些实施方案中，在该方法中使用的IαI蛋白质从血清分离。在一些实施方案中，在该方法中使用的IαI蛋白质从人血清分离。在一些实施方案中，在该方法中使用的IαI蛋白质由哺乳动物细胞产生。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是羊膜细胞。在一些实施方案中，该细胞是脐带细胞。在一些实施方案中，该细胞是来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，该IαI和TSG-6蛋白质以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1的摩尔比接触。在一些实施方案中，该IαI和TSG-6蛋白质以3:1的摩尔比接触。在该方法的一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa。在该方法的一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为3,000kDa。在一些实施方案中，HMW HA通过直接连接而固定至固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，HMW HA通过间接连接而固定至固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，HMW HA通过共价附接而固定至固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，HMW HA通过非共价附接而固定至固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，HMW HA经由可切割的连接体通过连接而固定至固体支持体上。在一些实施方案中，该连接体是化学或酶可切割的连接体。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后从固体支持体上解离rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，解离包括可切割的连接体的切割。在一些实施方案中，该方法进一步包括解离的rcHC-HA/PTX3复合物的纯化。在一些实施方案中，纯化包括亲和纯化、离心、过滤、色谱法或其组合。在该方法的一些实施方案中，PTX3、IαI HC1或TSG-6多肽包含亲和标签。在一些实施方案中，该亲和标签选自血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，HMW HA通过将HMW HA与中间多肽结合而固定。在一些实施方案中，该中间多肽共价附接至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA与中间多肽的结合是非共价的。在一些实施方案中，该中间多肽是HA结合蛋白质(HABP)。在一些实施方案中，该中间多肽是选自HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、TSG-6、CD44、斯塔比林-1(stabilin-1)、斯塔比林-2或足以结合HA的其一部分的HABP。在一些实施方案中，该中间多肽是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，该中间多肽包含连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1或斯塔比林-2的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含SEQ ID NO:54-99中任一个所示的多肽。在一些实施方案中，该中间多肽包含多肽连接体。在一些实施方案中，该连接体附接至固体支持体上。在一些实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后从中间多肽上解离rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，从中间多肽上解离rcHC-HA/PTX3复合物包括使复合物与解离剂接触。在一些实施方案中，该解离剂是盐酸胍或尿素。在一些实施方案中，该解离剂是约4M至约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，该中间多肽或连接体包含蛋白水解切割序列。在一些实施方案中，rcHC-HA/PTX3复合物的解离包括在蛋白水解切割序列处切割中间多肽或连接体。在一些实施方案中，切割包括使蛋白水解切割序列与蛋白酶接触。在一些实施方案中，该蛋白酶选自费林蛋白酶(furin)、3C蛋白酶、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶和TEV蛋白酶。
在某些实施方案中，本文描述了在体外生产重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物的方法，其包括使固定至固体支持体上的PTX3/HA复合物与包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和TSG-6接触。在一些实施方案中，该PTX3/HA复合物通过使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质在有效形成PTX3和HMW HA的复合物(PTX3/HA)的条件下接触而产生，其中该HMW HA固定至固体支持体上。在一些实施方案中，该方法进一步包括在PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触之前去除未结合的PTX3蛋白质。在一些实施方案中，该方法进一步包括去除未结合的TSG-6。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质包含具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是同源多聚体。在一些实施方案中，PTX3同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是八聚体。在一些实施方案中，PTX3包含修饰的多聚化结构域或异源多聚化结构域。在一些实施方案中，TSG-6是重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6包含具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，HC1包含具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，IαI蛋白质还包含HC2。在一些实施方案中，HC2包含具有SEQ ID NO:49所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:49所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，该IαI蛋白质还包含尿抑胰酶素。在一些实施方案中，尿抑胰酶素包含具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，IαI还包含硫酸软骨素链。在一些实施方案中，该IαI蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该IαI蛋白质从血液、血浆、血清、羊膜、绒毛膜、羊水或其组合分离。在一些实施方案中，该IαI蛋白质从血清分离。在一些实施方案中，该IαI蛋白质从人血清分离。在一些实施方案中，该IαI和TSG-6蛋白质以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1的摩尔比接触。在一些实施方案中，该IαI和TSG-6蛋白质以3:1的摩尔比接触。在一些实施方案中，该HMW HA的重均分子量为约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为3,000kDa。在一些实施方案中，HMWHA通过直接连接而固定至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA通过间接连接而固定至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA通过共价附接而固定至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA通过非共价附接而固定至固体支持体上。在一些实施方案中，该方法进一步包括从固体支持体上解离rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括解离的rcHC-HA/PTX3复合物的纯化。在一些实施方案中，纯化包括亲和纯化、离心、过滤、色谱法或其组合。在一些实施方案中，该PTX3、IαI HC1或TSG-6多肽包含亲和标签。在一些实施方案中，该亲和标签选自血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，HMW HA通过使HMW HA与中间多肽结合而固定。在一些实施方案中，该中间多肽共价附接至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA与中间多肽的结合是非共价的。在一些实施方案中，该中间多肽是HA结合蛋白质(HABP)。在一些实施方案中，该中间多肽是选自HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1、斯塔比林-2或足以结合HA的其一部分的HABP。在一些实施方案中，该中间多肽是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，该中间多肽包含连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1或斯塔比林-2的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含SEQ ID NO:54-99中任一个所示的多肽。在一些实施方案中，该中间多肽包含多肽连接体。在一些实施方案中，该连接体附接至固体支持体上。在一些实施方案中，该方法进一步包括从中间多肽上解离rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，从中间多肽上解离rcHC-HA/PTX3复合物包括使复合物与解离剂接触。在一些实施方案中，该解离剂是盐酸胍或尿素。在一些实施方案中，该解离剂为约4M至约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，该中间多肽或连接体包含蛋白水解切割序列。在一些实施方案中，解离包括在蛋白水解切割序列处切割中间多肽或连接体。在一些实施方案中，切割包括使蛋白水解切割序列与蛋白酶接触。在一些实施方案中，该蛋白酶选自费林蛋白酶、3C蛋白酶、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶和TEV蛋白酶。
在某些实施方案中，本文描述了通过本文提供的任何用于生成rcHC-HA/PTX3复合物的方法产生的重建的HC-HA(rcHC-HA/PTX3)复合物。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物促进巨噬细胞的M2极化。在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαI HC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物促进巨噬细胞的M2极化。在某些实施方案中，本文描述了诱导巨噬细胞的M2极化的方法，其包括使巨噬细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p40的表达，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p40水平相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p40水平较低。在一些实施方案中，IL-12p40 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-12p40蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p40的表达，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p40水平相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p40水平较低。在一些实施方案中，IL-12p40 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-12p40蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了降低由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p40的水平的方法，其包括使LPS刺激的巨噬细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，IL-12p40 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-12p40蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p70蛋白质的表达，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p70的量相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p70蛋白质的量较低。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p70蛋白质的表达，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p70蛋白质的量相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p70蛋白质的量较低。
在某些实施方案中，本文描述了降低由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-12p70蛋白质的水平的方法，包括使LPS刺激的巨噬细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-23的表达，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-23水平相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-23水平较低。在一些实施方案中，IL-23 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-23蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该复合物降低LPS刺激的巨噬细胞中IL-23的表达，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-23水平相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-23水平较低。在一些实施方案中，IL-23 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-23蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了降低由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-23的水平的方法，其包括使LPS刺激的巨噬细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，IL-23 mRNA的水平降低。在一些实施方案中，IL-23蛋白质的水平降低。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物提高LPS刺激的巨噬细胞中IL-10的表达，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-10水平相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-10水平较高。在一些实施方案中，IL-10 mRNA的水平升高。在一些实施方案中，IL-10蛋白质的水平升高。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该复合物提高LPS/IFNγ-刺激的巨噬细胞中IL-10的表达，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时LPS/IFNγ-刺激的巨噬细胞表达的IL-10的量相比，当LPS刺激的巨噬细胞与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，由LPS/IFNγ-刺激的巨噬细胞表达的IL-10的量较高。在一些实施方案中，IL-10 mRNA的水平升高。在一些实施方案中，IL-10蛋白质的水平升高。
在某些实施方案中，本文描述了提高由LPS刺激的巨噬细胞表达的IL-10的水平的方法，包括使LPS刺激的巨噬细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，IL-10 mRNA的水平升高。在一些实施方案中，IL-10蛋白质的水平升高。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物促进LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡，但不促进静息嗜中性粒细胞中的凋亡。在一些实施方案中，包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαI HC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物促进LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时在样品中凋亡的LPS刺激的嗜中性粒细胞的数目相比，当LPS刺激的嗜中性粒细胞样品与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中凋亡的LPS刺激的嗜中性粒细胞的数目较高。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物促进LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡，但不促进静息嗜中性粒细胞中的凋亡。在一些实施方案中，包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαI HC1的nHC-HA/PTX3复合物促进LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时在样品中凋亡的LPS刺激的嗜中性粒细胞的数目相比，当LPS刺激的嗜中性粒细胞样品与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中凋亡的LPS刺激的嗜中性粒细胞的数目较高。
在某些实施方案中，本文描述了诱导LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡的方法，其包括使LPS刺激的嗜中性粒细胞与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物促进凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时在样品中被LPS刺激的巨噬细胞吞噬的嗜中性粒细胞的数目相比，当凋亡嗜中性粒细胞和LPS刺激的巨噬细胞的样品与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中被LPS刺激的巨噬细胞吞噬的凋亡嗜中性粒细胞的数目较高。在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαI HC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该复合物促进凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用，其中与不存在该rcHC-HA/PTX3复合物时在样品中被静息巨噬细胞吞噬的嗜中性粒细胞的数目相比，当凋亡嗜中性粒细胞和静息巨噬细胞的样品与该rcHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中被静息巨噬细胞吞噬的凋亡嗜中性粒细胞的数目较高。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物促进凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时在样品中被LPS刺激的巨噬细胞吞噬的嗜中性粒细胞的数目相比，当凋亡嗜中性粒细胞和LPS刺激的巨噬细胞的样品与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中被LPS刺激的巨噬细胞吞噬的凋亡嗜中性粒细胞的数目较高。在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαI HC1的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物，其中该nHC-HA/PTX3复合物促进凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用，其中与不存在该nHC-HA/PTX3复合物时在样品中被静息巨噬细胞吞噬的嗜中性粒细胞的数目相比，当凋亡嗜中性粒细胞和LPS刺激的巨噬细胞的样品与该nHC-HA/PTX3复合物接触时，在该样品中被静息巨噬细胞吞噬的凋亡嗜中性粒细胞的数目较高。
在某些实施方案中，本文描述了诱导凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用的方法，其包括使包含凋亡嗜中性粒细胞和LPS刺激的或静息巨噬细胞的样品与rcHC-HA/PTX3或分离的nHC-HA/PTX3复合物接触。
在某些实施方案中，本文描述了包含高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)、PTX3和IαIHC1的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其中该rcHC-HA/PTX3复合物促进LPS刺激的巨噬细胞的附着，达到至少与从人脐带、人羊膜分离的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物或来自人脐带和人羊膜两者的nHC-HA/PTX3复合物的组合相同的水平，其中附着包括使LPS刺激的巨噬细胞与固定至固体支持体上的rcHC-HA/PTX3或nHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3从人脐带分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3从人羊膜分离。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3从来自人脐带和人羊膜两者的nHC-HA/PTX3复合物的组合分离。
在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的HMW HA的重均分子量为约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的HMWHA的重均分子量为约3,000kDa。
在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的HC1与HA共价连接。
在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物的PTX3蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物的PTX3包含具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是同源多聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是三聚体、四聚体或八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是八聚体。
在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物的IαI HC1包含具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物的IαI HC1是重组蛋白。
在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物包含TSG-6。在一些实施方案中，该TSG-6蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该TSG-6蛋白质包含具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。
在一些实施方案中，该rcHC-HA/PTX3复合物的PTX3、IαI HC1或TSG-6多肽包含亲和标签。在一些实施方案中，该亲和标签选自血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。
在某些实施方案中，本文描述了一种包含本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物为溶液、悬浮液、粉末、软膏、片剂、胶囊或气雾剂的形式。在一些实施方案中，药物组合物为固体、交联的凝胶或脂质体的形式。在一些实施方案中，药物组合物为交联的乙酰透明质酸水凝胶的形式。在一些实施方案中，药物组合物包含天然聚合物。在一些实施方案中，天然聚合物包含纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、血纤蛋白、血纤蛋白原、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素或其组合。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含抗炎剂、抗瘢痕形成剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、抗微生物剂或其组合。
在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于生产药物的用途。
在某些实施方案中，本文描述了一种组合，其包含：(a)本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物；和(b)抗炎剂、抗瘢痕形成剂、抗肿瘤剂、化疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、抗微生物剂或其组合。
在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其包括施用包含本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。
在某些实施方案中，本文描述了预防或逆转组织中的瘢痕形成或纤维化的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使该组织与有效量的该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，该瘢痕是皮炎瘢痕、瘢痕疙瘩、挛缩瘢痕、肥厚性瘢痕或由痤疮引起的瘢痕。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于减少或预防瘢痕形成的用途。在一些实施方案中，本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的施用通过减少或抑制组织中的TGF-β信号传导而减少或预防瘢痕形成或纤维化。
在某些实施方案中，本文描述了预防或减少有需要的受试者中的炎症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使发炎的组织与该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，该炎症是急性炎症或慢性炎症。在一些实施方案中，该受试者患有炎性病症。在一些实施方案中，该炎性病症是巨噬细胞介导的炎性病症、Th-17介导的免疫病症或T-细胞介导的炎性病症。在一些实施方案中，该受试者患有自身免疫性疾病、变态反应、白细胞缺陷、感染、移植物抗宿主病、组织移植排斥或其组合。在一些实施方案中，该炎性病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，该炎性病症是眼睛的炎性病症。在一些实施方案中，该炎性病症是结膜炎、角膜炎、眼睑炎、睑结膜炎、巩膜炎、表层巩膜炎、葡萄膜炎、视网膜炎或脉络膜炎。在一些实施方案中，该急性炎症是由心肌梗死、中风、内毒素休克或脓毒症引起的。在一些实施方案中，该受试者患有动脉粥样硬化。在一些实施方案中，该受试者患有癌症。在一些实施方案中，该受试者患有实体瘤的炎症。在一些实施方案中，向该受试者联合施用该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和额外的抗炎剂。在一些实施方案中，该额外的抗炎剂选自抗-TGF-β抗体、抗-TGF-β受体阻断抗体、抗-TNF抗体、抗-TNF受体阻断抗体、抗-IL1β抗体、抗-IL1β受体阻断抗体、抗-IL-2抗体、抗-IL-2受体阻断抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-6受体阻断抗体、抗IL-12抗体、抗IL-12受体阻断抗体、抗-IL-17抗体、抗-IL-17受体阻断抗体、抗-IL-23抗体或抗-IL-23受体阻断抗体。在一些实施方案中，该1型干扰素是IFN-α或IFN-β。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于减少或预防炎症的用途。
在某些实施方案中，本文描述了治疗有需要的受试者中的皮肤创伤或溃疡的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使皮肤创伤或溃疡与有效量的该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于治疗皮肤创伤或溃疡的用途。在一些实施方案中，该皮肤创伤或溃疡是未愈合的溃疡。
在某些实施方案中，本文描述了促进或诱导有需要的受试者中的骨形成的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物或nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该受试者患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨降解、佩吉特病或骨肿瘤。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于促进或诱导受试者中的骨形成的用途。
在某些实施方案中，本文描述了预防或减少有需要的受试者中的异常血管发生的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该受试者患有湿性年龄相关性黄斑变性(wARMD)或糖尿病增殖性视网膜病。在一些实施方案中，该受试者患有癌症。在一些实施方案中，该受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，向该受试者联合施用该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和抗癌疗法。在一些实施方案中，该抗癌疗法包括抗肿瘤剂、细胞毒性剂、抗血管发生剂、化疗剂或放射疗法的施用。在一些实施方案中，该抗癌疗法与该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物顺序、同时或断续施用。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于减少或预防血管发生的用途。
在某些实施方案中，本文描述了预防移植受者中的移植排斥的方法，其包括向移植受者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使移植物与该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在移植程序之前、移植程序之后或移植程序期间施用。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与免疫抑制剂联合施用。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于预防移植受者中的移植排斥的用途。在一些实施方案中，该移植物是角膜移植物。
在某些实施方案中，本文描述了诱导有需要的受试者中的干细胞扩充的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使干细胞与该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于诱导干细胞扩充的用途。在一些实施方案中，本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的施用通过TGF-β信号传导的抑制和/或BMP信号途径的上调而诱导干细胞扩充。在一些实施方案中，本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的施用通过将分化的细胞重新程序化为干细胞(或诱导的祖细胞，iPSC)而诱导干细胞扩充。
在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于细胞疗法的用途。
在某些实施方案中，本文描述了在有需要的受试者中实施细胞疗法的方法，其包括向受试者施用一种组合物，该组合物包含有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与治疗性细胞的组合。在一些实施方案中，该治疗性细胞和该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被局部施用至受损组织。在一些实施方案中，该治疗性细胞和该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物经全身性施用。在一些实施方案中，该治疗性细胞是干细胞。在一些实施方案中，该治疗剂是干细胞。在一些实施方案中，该细胞疗法包括干细胞的施用。在一些实施方案中，该干细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，该干细胞是诱导的祖干细胞。在一些实施方案中，该细胞疗法包括分化的细胞的施用。在一些实施方案中，治疗性细胞是胰岛素生产细胞。在一些实施方案中，该胰岛素生产细胞是胰岛细胞。在一些实施方案中，该受试者患有1型糖尿病。
在某些实施方案中，本文描述了在有需要的受试者中实施细胞疗法的方法，其包括向受试者联合施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与包含在细胞递送装置中的细胞。在一些实施方案中，该细胞包含于微胶囊中。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至微胶囊上。在一些实施方案中，该微胶囊被局部施用至受损组织。在一些实施方案中，该治疗性细胞和该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物经全身性施用。在一些实施方案中，该治疗性细胞是干细胞。在一些实施方案中，该治疗剂是干细胞。在一些实施方案中，该细胞疗法包括干细胞的施用。在一些实施方案中，该干细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，该干细胞是诱导的祖干细胞。在一些实施方案中，该细胞疗法包括分化的细胞的施用。在一些实施方案中，治疗性细胞是胰岛素生产细胞。在一些实施方案中，该胰岛素生产细胞是胰岛细胞。在一些实施方案中，该受试者患有1型糖尿病。
在某些实施方案中，本文描述了预防或减少有需要的受试者中的疼痛的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，其中该疼痛是由化学烧伤、重度细菌性角膜炎、Stevens-Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、眼部肿瘤的辐射引起的。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于减轻受试者的疼痛的用途，其中该疼痛是由化学烧伤、重度细菌性角膜炎、Stevens-Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、眼部肿瘤的辐射引起的。
在某些实施方案中，本文描述了诱导或促进有需要的受试者中的组织再生的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使受试者的受损组织与有效量的该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，该组织是骨或牙龈、角膜组织或结膜组织。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与治疗性细胞、多个治疗性细胞或组织移植物联合施用。在一些实施方案中，该组织移植物是同种异体移植物或自体移植物。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与基于组织的疗法联合施用。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于诱导或促进受试者中的组织再生的用途。
在某些实施方案中，本文描述了治疗有需要的受试者中的纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该治疗抑制或预防瘢痕形成。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于治疗受试者中的纤维化的用途。
在某些实施方案中，本文描述了治疗有需要的受试者中的肥胖或胰岛素抗性的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该治疗抑制或减少受试者中的M1脂肪组织巨噬细胞的量。在某些实施方案中，本文描述了抑制或减少有需要的受试者中M1脂肪组织巨噬细胞的量的方法：向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该受试者已被诊断为肥胖或胰岛素抗性。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于治疗受试者的肥胖或胰岛素抗性的用途。
在某些实施方案中，本文描述了治疗有需要的受试者中的结膜松弛的方法，其包括向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法包括使受试者的结膜与有效量的该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在某些实施方案中，本文描述了本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于治疗受试者中的结膜松弛的用途。
在某些实施方案中，本文描述了细胞培养物，其包含适合于培养细胞的基底和本文描述的或通过此处提供的方法产生的rcHA/PTX3复合物或nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该rcHA/PTX3复合物或nHC-HA/PTX3复合物固定至基底上。
在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其中向受试者联合施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与额外的治疗剂。在一些实施方案中，该额外的治疗剂选自干扰素、抗肿瘤坏死剂、白介素-1(IL-1)受体拮抗剂、白介素-2(IL-2)受体拮抗剂、白介素-6(IL-6)受体拮抗剂、白介素-12(IL-12)受体拮抗剂、白介素-17(IL-17)受体拮抗剂、白介素-23(IL-23)受体拮抗剂、细胞毒性剂、抗微生物剂、白介素、免疫调节剂、抗生素、T-细胞共刺激阻断剂、病症缓解抗风湿剂、免疫抑制剂、抗淋巴细胞抗体、抗血管发生剂、化疗剂、抗肿瘤剂、抗代谢物、Akt抑制剂、IGF-1抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、环加氧酶抑制剂、类肝素酶抑制剂、淋巴因子抑制剂、细胞因子抑制剂、IKK抑制剂、P38MAPK抑制剂、抗凋亡途径抑制剂、凋亡途径激动剂、PPAR激动剂、Ras的抑制剂、端粒酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、氨肽酶抑制剂、SHIP激活剂及其组合。在一些实施方案中，该抗微生物剂是抗病毒、抗细菌或抗真菌剂。
在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其中向受试者施用有效量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物且该受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。
在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至固体表面上。在一些实施方案中，该固体表面是纳米颗粒、珠子、微胶囊或植入式医疗装置的表面或其一部分。
在某些实施方案中，本文描述了医疗装置，其包含用本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物涂覆的基底。在一些实施方案中，该基底包含支架、关节、螺钉、杆、销、板、钉、分流器、钳、夹子、缝合线、缝合锚、电极、导管、导联、移植物、敷料、起搏器、起搏器外壳、复律器、复律器外壳、除颤器、除颤器外壳、假体、耳引流管、眼科植入体、矫形外科装置、脊椎盘、骨替代物、吻合装置、血管周缠绕物、结肠造瘘袋附接装置、止血屏障、血管植入体、血管支持体、组织粘合剂、组织密封剂、组织支架和管腔内装置中的至少一种。
在某些实施方案中，本文描述了包含固定至表面上的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的装置。在一些实施方案中，该表面是聚苯乙烯、聚乙烯、二氧化硅、金属或聚合物表面。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至微胶囊上。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至纳米颗粒上。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至珠子、芯片、载玻片或过滤器上。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至接触镜上。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至外科植入体或假体上。在一些实施方案中，该植入体或假体是人工关节、骨植入体、缝合线或支架。在一些实施方案中，该人工关节是人工髋关节、人工膝关节、人工肩关节或人工膝。在一些实施方案中，该支架是冠状动脉支架、输尿管支架、尿道支架、前列腺支架、食管支架或骨支架。
在某些实施方案中，本文描述了医疗装置，其包含：适合于植入患者内的结构，其中该结构的表面或表面的一部分附接于以包含本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，附接包括该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与该结构的表面或表面的一部分的共价或非共价附接。在一些实施方案中，附接包括用包含该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物涂覆该结构的表面或表面的一部分。在一些实施方案中，该结构是血管支架、人工关节、缝合线或微胶囊。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制细菌生物膜的形成。在一些实施方案中，该微胶囊含有治疗性细胞。在一些实施方案中，该治疗性细胞是干细胞。
在某些实施方案中，本文描述了用于调节巨噬细胞活性的方法，其包括使巨噬细胞与一定量的本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的接触，该量足以减少或抑制IL-12或IL-23的表达，但亦促进从M1到M2表型的极化巨噬细胞中IL-10的表达。在一些实施方案中，该巨噬细胞已用促炎介质刺激。在一些实施方案中，该促炎介质是脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素-γ(IFNγ)或其组合。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在受试者体内接触巨噬细胞。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该方法在体外进行。在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其包括施用已通过本文提供的用于调节巨噬细胞活性的方法调节的巨噬细胞。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含本文描述的或通过此处提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物、用于施用该组合物的装置以及任选的施用说明。
在某些实施方案中，本文描述了一种组合或混合物，其包含：(a)预结合到HMW HA的PTX3的复合物(PTX3/HA)；(b)包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质；和(c)TSG-6。
在某些实施方案中，本文描述了一种组合或混合物，其包含：(a)预结合到HC-HA的TSG-6的复合物；和(b)PTX3。
在某些实施方案中，本文描述了在体外生产重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物的方法，其包括：(a)将(i)固定至固体支持体上的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)，(ii)包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质，和(iii)TSG-6相接触，以形成预结合到TSG-6的rcHC-HA复合物；和(b)使预结合到TSG-6的rcHC-HA复合物与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质接触，以形成rcHC-HA/PTX3复合物。
在某些实施方案中，本文描述了在体外生产重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物的方法，其包括将(i)固定至固体支持体上的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)，(ii)五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质，(iii)包含重链1(HC1)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质，和(iv)肿瘤坏死因子α-刺激的基因6(TSG-6)相接触，以形成固定化的rcHC-HA/PTX3复合物。
在某些实施方案中，本文描述了一种包含固定化的与PTX3结合的HA的复合物。
在某些实施方案中，本文描述了在体外生产包含固定化的与PTX3结合的HA的复合物的方法，其包括使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与PTX3蛋白质在有效形成PTX3和HMWHA的复合物(PTX3/HA)的条件下接触，其中该HMW HA固定至固体支持体上。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质是从细胞分离的天然PTX3蛋白质。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该细胞是羊膜细胞。在一些实施方案中，该细胞是脐带细胞。在一些实施方案中，该细胞是来自脐带的羊膜细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，该羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质是重组蛋白。在一些实施方案中，该PTX3蛋白质包含具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，在该方法中使用的PTX3蛋白质是同源多聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是三聚体、四聚体或八聚体。在一些实施方案中，该PTX3同源多聚体是八聚体。在一些实施方案中，该PTX3包含修饰的多聚化结构域或异源多聚化结构域。在一些实施方案中，固定HMW HA包括非共价附接至固体支持体上。在一些实施方案中，固定HMW HA包括使HMW HA与中间多肽结合。在一些实施方案中，该中间多肽共价附接至固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA与中间多肽的结合是非共价的。在一些实施方案中，该中间多肽是HA结合蛋白质(HABP)。在一些实施方案中，该中间多肽是选自HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1、斯塔比林-2或足以与HA结合的其一部分的HABP。在一些实施方案中，该中间多肽是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，该中间多肽包含连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1或斯塔比林-2的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，该中间多肽包含SEQ ID NO:54-99中任一个所示的多肽。在某些实施方案中，本文描述了通过前述方法产生的PTX3/HA复合物。在某些实施方案中，本文描述了一种药物组合物，其包含通过前述方法产生的PTX3/HA复合物。在某些实施方案中，本文描述了该PTX3/HA复合物用于生产药物的用途。在某些实施方案中，本文描述了治疗方法，其包括施用该PTX3/HA复合物以用于预防或抑制瘢痕形成、炎症、血管发生、癌症、糖尿病、肥胖或纤维化。
在某些实施方案中，本文描述了诱导或维持细胞中的多能性的方法，其包括用nHC-HA/PTX3复合物或rcHC-HA/PTX3复合物培养细胞，从而诱导或维持细胞中的多能性。在一些实施方案中，该细胞异源地表达选自Sox2、myc、Oct4和KLF4的蛋白质。在一些实施方案中，该细胞异源地表达一种、两种或三种选自Sox2、myc、Oct4和KLF4的蛋白质。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物或rcHC-HA/PTX3复合物被固定化。在一些实施方案中，该细胞是成年分化细胞。在一些实施方案中，该细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中，该细胞是人角膜成纤维细胞。在一些实施方案中，该细胞是胚胎干细胞、成年干细胞、胎儿干细胞或诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，该细胞是缘上皮祖细胞、缘基质隔细胞、脐带干细胞、羊膜干细胞或脂肪干细胞。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3复合物是羊膜nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3是脐带nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对羊膜提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对在PBS缓冲液中制备的羊膜提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物，以产生nHC-HA/PTX3提取物(即可溶性的nHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对在GnHCl缓冲液中制备的羊膜提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物，以产生nHC-HA/PTX3提取物(即可溶性的nHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对脐带提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，该脐带提取物包含脐带羊膜、脐带基质、华顿氏胶或其任意组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对在PBS缓冲液中制备的脐带提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物，以产生nHC-HA/PTX3提取物(即可溶性的nHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过对在GnHCl缓冲液中制备的脐带提取物进行超速离心而纯化nHC-HA/PTX3复合物，以产生nHC-HA/PTX3提取物(即可溶性的nHC-HA/PTX3)。在一些实施方案中，该方法进一步包括进行两轮、三轮或四轮超速离心。在一些实施方案中，该方法进一步包括进行四轮超速离心。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包含PTX3。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，该nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包含PTX3和小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，该小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖、骨黏附蛋白聚糖、骺蛋白聚糖(epipycan)和骨甘蛋白聚糖(Osteoglycin)。在一些实施方案中，该小亮氨酸丰富蛋白聚糖共价附接至糖胺聚糖。在一些实施方案中，该糖胺聚糖是硫酸角质素。
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅仅是示例性的和说明性的，而不是对请求保护的任何主题的限制。
附图说明
图1例示了来自羊膜提取物(AME)的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物的纯化以及蛋白质组成和HA大小的分析。(A-B)通过CsCl/4M盐酸胍超速离心得到的级分中的总蛋白质和HA浓度。(C)在0.5％琼脂糖凝胶中用全染色剂染料(Stains-all dye)染色的HA。(D-J)使用针对HC1(D和F)、PTX3(E和G)、HC2(H)、HC3(I)、尿抑胰酶素(J)、TSG-6(K)或TSP-1(L)的抗体，通过Western印迹法对存在于nHC-HA/PTX3中的蛋白质的分析。NaOH或N＝用0.05NNaOH在25℃下处理1小时。HAase或H＝用20单位/ml的透明质酸酶在60℃下处理2小时(F-K)。使用针对包括IGFBP1-3、PF4或TIMP-1在内的各种抗原的抗体通过斑点分析确定的相对蛋白质量(M)的柱状图。
图2例示了CD44和TLR4受体介导LPS刺激的巨噬细胞向固定化的nHC-HA/PTX3的附着。(A)细胞附着。将RAW264.7细胞(100μl的2.5x105个细胞/ml)接种至固定化的HA(2μg/孔)或nHC-HA/PTX3(2μg/孔)中(n＝3)并用LPS(1μg/ml)刺激。孵育90分钟后，除去未附着的细胞，并通过CyQuant分析对附着的细胞进行计数。比例尺代表100μm。星号(*)表示p值<0.05(HA或nHC-HA/PTX3相对于PBS对照，或nHC-HA/PTX3相对于HA)。(B)细胞活力。LPS刺激的RAW264.7细胞在固定化的PBS对照、HA或nHC-HA/PTX3上孵育24小时(n＝3)。通过MTT分析测量细胞活力。在这些固定化的基底上在细胞之间未观察到细胞活力的显著性差异(所有p值>0.05)。(C)CD44和TLR4受体负责LPS刺激的巨噬细胞与固定化的nHC-HA/PTX3的附着。RAW264.7细胞(2.5x105/ml)与针对CD44、TLR2、TLR4、整联蛋白αv、β1、β2或β3或RGD肽的阻断抗体以及同种型对照抗体或RGD对照肽一起在冰上预孵育30分钟(n＝3)。加入LPS(1μg/ml)后，将细胞孵育90分钟，并与A中所述的一样进行细胞附着分析。星号(*)表示p值<0.05。
图3例示了固定化的nHC-HA/PTX3使LPS刺激的巨噬细胞向M2表型极化。(A)通过定量PCR测定的，与PBS对照或固定化的HA或nHC-HA/PTX3结合的巨噬细胞中M1(TNF-α、IL-12p40)或M2(IL-10、Arg-1、LIGHT和SPHK1)标记物的相对mRNA表达。(B)通过ELISA测定的相对TNF-α蛋白质的量。(C)在与PBS对照或固定化的nHC-HA/PTX3结合的巨噬细胞中，通过IRF5(其为M1标记物)的免疫荧光染色的Western印迹(左)和细胞定位(右)。(D)与固定化的nHC-HA/PTX3孵育后，静息的、fMLP-刺激的或LPS刺激的嗜中性粒细胞的凋亡。星号(*)表示p<0.05。(E)静息的或LPS刺激的巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用。星号(*)表示p<0.05。
图4例示了CD44在维持固定化的nHC-HA/PTX3上M2巨噬细胞极化中的作用。(A)通过qPCR测定的，在与PBS或针对CD44、TLR4或CD44/TLR4的阻断抗体预孵育的巨噬细胞与nHC-HA/PTX3结合后，M1(IL-12p40)和M2(IL-10、LIGHT和SPHK1)巨噬细胞标记物的相对mRNA表达。星号(*)表示与同一组中的无抗体处理(无)相比p<0.05。(B)通过ELISA测定的IL-12和IL-10蛋白质的量。星号(*)表示与同一组中的无抗体处理(无)相比p<0.05。
图5：nHC-HA/PTX3(第4)促进细胞聚集，但nHC-HA/PTX3(第2)和nHC-HA/PTX3(第4)均抑制IFN-γ/LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p40和IL-23蛋白质的产生。RAW264.7细胞(2.5x105/ml)在固定化的基底(PBS作为对照)上培养，并用IFN-γ/LPS刺激4小时(A)或24小时(B和C)。(A)接种后4小时的细胞形态。或者，用LPS刺激细胞24小时，并通过各自的ELISA测量细胞培养上清液中的IL-10和IL-12p70的蛋白质(B和C)。p值示于B和C中。
图6例示了HMW HA和nHC-HA/PTX3与96孔CovaLinkTM板表面的剂量依赖的和共价的偶联。(A)除去未结合的HMW HA和nHC-HA/PTX3后，结合的HMW HA和nHC-HA/PTX3的HAELISA。(B)来自HMW HA和nHC-HA/PTX3的结合和未结合的HA的HA ELISA。
图7例示了TSG-6与固定化的HA(iHA)的剂量依赖性结合以及对各种解离剂和还原剂的抗性。(A)通过TSG-6ELISA测量的与iHA结合的TSG-6。(B)在用6M盐酸胍、8M盐酸胍、2％SDS、100mM DTT或25mM NaOH处理后，通过TSG-6ELISA测量的与iHA结合的TSG-6。
图8例示了PTX3与固定化的HA(iHA)的剂量依赖性结合以及对各种解离剂和还原剂的抗性。(A)通过PTX3 ELISA测量的与iHA结合的PTX3。(B)在用6M盐酸胍、8M盐酸胍、2％SDS、100mM DTT或25mM NaOH处理后，通过PTX3 ELISA测量的与iHA结合的PTX3。
图9例示了在TSG-6与PTX3之间对结合iHA缺乏竞争或协同作用。对于结合的TSG-6或PTX3，针对各因子单独地与iHA孵育或组合地与iHA孵育，示出了通过ELISA测量的相对吸光度。对于TSG-6或PTX3与iHA的结合，在单独与组合之间未见统计学显著性(p>0.05)。
图10例示了PTX3与预结合有TSG-6的iHA的结合的部分抑制，以及TSG-6与预结合有PTX3的iHA的结合缺乏抑制。该图显示对于预结合的TSG-6/iHA(A)或预结合的PTX3/iHA(B)，TSG-6或PTX3的后续结合的TSG-6和PTX3 ELISA结果。p值示在(A)中示出，并且在(B)中在各组之间未见统计学显著性。
图11例示了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞与对PBS(对照)、HA(iHA)、nHC-HA/PTX3、TSG-6/iHA或PTX3/iHA的附着。孵育后24小时对细胞进行拍照。
图12例示了在PBS(对照)、HA(iHA)、nHC-HA/PTX3、TSG-6/iHA或PTX3/iHA上孵育后，在RAW264.7巨噬细胞中的相对基因表达。分离总RNA，并且通过定量PCR测量IL-12p40(A)和IL-10(D)的mRNA表达。或者，用LPS(B和E)或IFN-γ/LPS(C)刺激细胞24小时，并且使用各自的ELISA测量在细胞培养基中IL-12p70(B)、IL-23(C)和IL-10(E)的蛋白质表达。星号(*)表示与对照相比p<0.05。
图13例示了在溶液中游离的TSG-6与结合的TSG-6相比，用于将HC1和HC2从IαI转移到iHA的效率。(A，B)同时或顺序地将TSG-6和IαI加至iHA之后，通过各自的ELISA测定的相对结合的HC1(A)或IαI(B)。星号(*)表示当同时和顺序加入时，在相同的TSG-6浓度下p<0.05。(C)用透明质酸酶(HAase)消化并用抗TSG-6抗体分析的来自A的样品的Western印迹。(D)在PTX3和IαI同时与iHA孵育后，通过ELISA测定的与iHA结合的相对HC1和PTX3。
图14例示了在IαI和TSG-6同时与PTX3孵育或不与PTX3孵育后在溶液中形成的复合物。(A-D)用针对HC1(A)、HC2(B)、TSG-6(C)或尿抑胰酶素(D)的抗体获得的Western印迹。HAase＝用透明质酸酶处理。(E)TSG-6与IαI的相互作用的图示。(F)PTX3对HC2·TSG-6的形成的抑制的图示。(G)用抗IαI抗体获得的Western印迹。
图15例示了在IαI和TSG-6同时与PTX3孵育或不与PTX3孵育后在iHA上形成的复合物。在用8M GnHCl和PBS洗涤后，通过各自的ELISA测定结合的HCl、TSG-6和PTX3(A，D，F)。星号(*)表示与1μg/ml的PTX3相比p<0.05。该复合物再次用8M GnHCl和PBS洗涤，并将结合的组分用1单位/ml的透明质酸酶消化2小时。使用针对HC1(B)、HC2(C)、TSG-6(E)和PTX3(G)的抗体，通过Western印迹法对消化的样品进行分析。
图16例示了在顺序添加IαI与TSG-6及随后添加PTX3后在iHA上形成的复合物。通过各自的ELISA测定结合的HCl、TSG-6和PTX3(A，D，F)。该复合物再次用8M GnHCl和PBS洗涤，并且将结合的组分用1单位/ml的透明质酸酶消化2小时。使用针对HC1(B)、HC2(C)、TSG-6(E)和PTX3(G)的抗体，通过Western印迹法对消化的样品进行分析。
图17例示了在顺序添加PTX3及随后添加IαI与TSG-6后在iHA上形成的复合物。通过各自的ELISA测定结合的HCl、TSG-6和PTX3(A，C，E)。该复合物再次用8M GnHCl和PBS洗涤，并且将结合的组分用1单位/ml的透明质酸酶消化2小时。使用针对PTX3(B)、TSG-6(D)、HC1(F)和HC2(G)的抗体，通过Western印迹法对消化的样品进行分析。
图18例示了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞与PBS(对照)、HA(iHA)、nHC-HA/PTX3、(IαI/TSG-6/PTX3)/iHA(IαI、TSG-6或PTX3同时与iHA结合)、(IαI/TSG-6)/PTX3/iHA(将PTX3顺序添加至与IαI和TSG-6预孵育的iHA)或(PTX3)/IαI/TSG-6/iHA(将IαI和TSG-6顺序添加至与PTX3预孵育的iHA)的附着。孵育后24小时对细胞进行拍照。
图19例示了在固定化的基底上培养并用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中的基因表达。分离总RNA，并通过定量PCR测定IL-10和IL-12p40 mRNA的表达(A和C)。通过各自的ELISA测定在细胞培养上清液中的IL-10和IL-12p70蛋白质(B和D)。(E)通过IL-23ELISA测定，在静息的RAW264.7细胞(无)或用IFN-γ(200单位/ml)、LPS(1μg/ml)、IFN-γ/LPS、含有免疫复合物的LPS(LPS/IC)或IL-4(10ng/ml)刺激24小时的RAW264.7细胞的细胞培养上清液中的IL-23蛋白质。(F)通过IL-23ELISA测定，在固定化的基底上培养并用IFN-γ/LPS刺激24小时的RAW264.7细胞的细胞培养上清液中的IL-23。星号(*)表示p<0.05。
图20例示了在人脐带(A)或羊膜(B)中的HA、PTX3、TSG-6、HC和尿抑胰酶素的免疫染色。人脐带的冷冻切片在进行或不进行透明质酸酶消化的情况下并使用抗PTX3和TSG-6的抗体和针对示出的IαI和PαI组分的链特异性抗体，用生物素化的HABP进行探查。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。Epi，上皮。条代表100μm。
图21例示了来自AM、CH和UC的顺序PBS和GnHCl提取物中的PTX3水平的比较。A，在泳道2和3中，每条泳道含有2μg HA，而在泳道4-11中，每条泳道含有20μg总蛋白质。B，在泳道3-10中，每条泳道含有40μg总蛋白质。
图22例示了来自AM、CH和UC的顺序PBS和GnHCl提取物中的HC1、尿抑胰酶素和IαI的比较。在A和C中，每条泳道含有20μg总蛋白质，而在B中，除阳性对照外，每条泳道含有40μg总蛋白质。
图23例示了AM和UC GnHCl提取物中的TSG-6的比较。除阳性TSG-6对照外，每条泳道含有40μg总蛋白质。
图24例示了在第1至第4AM HC·HA复合物中的PTX3(A)、HC1(B)、HC2(C)和TSG-6(D)的Western印迹分析。除阳性对照外，每条泳道含有4μg HA。
图25例示了AME、AM GnHCl和第1至第4HC-HA复合物中的TSP-1的Western印迹分析。泳道3、4、10和11，每条泳道含有30μg总蛋白质。泳道5-8和12-15，每条泳道含有4μg HA。
图26例示了第4UC HC-HA复合物中的PTX3(A)、HC1(B)、HC2(C)、HC3(D)和TSG-6(E)的Western印迹分析。除阳性对照外，每条泳道含有4μg HA。
图27例示了来自PBS和GnHCl提取物的第4HC·HA复合物中的HC1(A)和PTX3(B)的比较。除阳性对照外，每条泳道含有4μg HA。
图28例示了来自PBS和GnHCl的第4HC-HA复合物在琼脂糖凝胶中的比较。除阳性HA对照外，每条泳道含有15μg HA。
图29例示了对GnHCl HC-HA和PBS HC-HA的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色。A，AMPBS和GnHCl HC-HA。B，UC PBS和GnHCl HC-HA。每条泳道含有30μg HA。
图30例示了硫酸角质素和骨黏附蛋白聚糖存在于AM GnHCl HC-HA中，而不存在于PBS HC-HA中。A，考马斯蓝染色。每条泳道含有30μg HA。B和C，硫酸角质素(B)和骨黏附蛋白聚糖(C)的Western印迹。每条泳道含有4μg HA。D，AM中硫酸角质素的免疫染色。
图31例示了AM GnHCl HC-HA的去糖基化和通过用CB(考马斯蓝)染色的SDS-PAGE或Western印迹的分析。A，考马斯蓝染色。除含有5μg HA的泳道6外，每条泳道含有30μg HA。B-H，骨黏附蛋白聚糖(B)、饰胶蛋白聚糖(C，D)、双糖链蛋白聚糖(E，F)、硫酸角质素(G)和PTX3(H)的Western印迹。H：透明质酸酶；C：软骨素酶(Cabc)；K：角蛋白酶(硫酸角质素内切-β-半乳糖苷酶)；T：TFMSA(三氟甲磺酸)。每条泳道含有4μg HA。
图32例示了饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖丰富地存在于UC GnHCl HC-HA中，而非PBS HC-HA中。硫酸角质素、骨黏附蛋白聚糖和尿抑胰酶素也存在于UC GnHCl HC-HA，而不存在于PBS HC-HA中(除硫酸角质素外)。A，考马斯蓝染色。除含有5μg HA的泳道6之外，每条泳道含有30μg HA。B-H，饰胶蛋白聚糖(B)、双糖链蛋白聚糖(C)、尿抑胰酶素(D)、PTX3(E)、硫酸角质素(F)和骨黏附蛋白聚糖(G)的Western印迹。H：透明质酸酶；C：软骨素酶(Cabc)；K：角蛋白酶(硫酸角质素内切-β-半乳糖苷酶)。每条泳道含有4μg HA。
图33例示了人AM中的PTX3的免疫定位。在进行或不进行透明质酸酶消化的情况下并且使用针对IαI组分的链特异性抗体，用抗PTX3、生物素化的HABP探查人胎儿膜的冷冻切片。用Hoechst 33342(蓝色)对细胞核进行复染。AM，羊膜；Epi，上皮；CH，绒毛膜。条，代表100μm。
图34例示了在AM可溶性提取物和纯化的HC-HA复合物中存在PTX3。纯化的PTX3、AM提取物(AME)和AM HC-HA复合物使用或不使用50mM NaOH在25℃下处理1小时，或用透明质酸酶(HAase)在37℃下处理1小时，之后使用抗-PTX3(A)和抗-HC1(B)抗体进行Western印迹分析，并在0.5％琼脂糖凝胶电泳上进行分析，之后用全染色剂染料进行染色(C)。在AM可溶性提取物和纯化的HC-HA复合物中发现了PTX3物质及其多聚体形式。M，蛋白质阶梯分子量标准。
图35例示了AMEC和AMSC的PTX3 mRNA和蛋白质表达。从人皮肤成纤维细胞(SkinFib.)以及AMEC和AMSC二者中提取RNA和蛋白质。对比了PTX3 mRNA(A)以及上清液和细胞裂解物中的蛋白质(B)的表达。进行PTX3 siRNA转染，以证实AMEC和AMSC中的PTX3的表达(C)。
图36例示了人皮肤成纤维细胞(HSF，A)、AMSC(B)和AMEC(C)在琼脂糖覆盖后的形态变化。在使用或不使用3％琼脂糖覆盖五天的情况下，在无血清和含血清的条件下培养HSF、AMSC和AMEC，并且对细胞的形态进行拍照。比例尺，50μm。
图37例示了琼脂糖覆盖降低了HSF、AMSC和AMEC培养物向培养基中释放HA。在无血清和含血清的条件下，使用或者不使用琼脂糖覆盖，在来自HSF、AMSC和AMEC的培养基中通过ELISA试验来测定HA浓度。
图38例示了在使用琼脂糖覆盖的细胞培养物中的PTX3、HA和HC1的免疫定位。在进行或不进行TNF处理的情况下以琼脂糖覆盖培养HSF、AMSC和AMEC，并探查乙酰透明质酸(红色)、PTX3(绿色，A-F；红色，J-L)和HC1(绿色)(核为蓝色)。HC1与HA的共定位见于所有培养物中，但PTX3与HA或HC1的共定位只见于AMSC和AMEC中。比例尺，50μm。
图39例示了在琼脂糖覆盖下AMSC中而非HSF中的HC-HA/PTX3复合物。来自琼脂糖覆盖的HSF和AMSC培养物的细胞层的GnHCl提取物在进行或不进行NaOH处理的情况下针对PTX3进行Western印迹分析。M，蛋白质阶梯分子量标准。
图40例示了在体外在固定化的HA上HC-HA/PTX3复合物的重建。iHA(～14μg/ml)、IαI(5μg/ml)和TSG-6(12μg/ml)同时与或不与PTX3(1、5或20μg/ml)在37℃下孵育2小时。对于顺序地，iHA(～14μg/ml)、IαI(12μg/ml)和TSG-6(12μg/ml)在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时，然后加入PTX3(1、5或20μg/ml)，并在37℃下再孵育2小时。用8M GnHCl和PBS洗涤后，具有结合的组分的iHA用1单位/ml的透明质酸酶在60℃下消化2小时。用针对IαI(A)、TSG-6(B)和PTX3(C)的抗体通过Western印迹对样品进行分析。
图41例示了在DMEM/10％FBS中培养2天(A)或在DMEM/10％FBS中培养2天±TGF-β1培养3天(B)，直至第3天的人角膜成纤维细胞的细胞形态。
图42例示了可溶性HC-HA(PBS)抑制TGFβ1但激活TGFβ3信号传导，而不溶性HC-HA(GnHCl)在无血清条件下激活TGFβ1和TGFβ3信号传导并且在TGFβ1刺激下得到进一步加强。
图43例示了可溶性HC-HA(PBS)和不溶性HC-HA(GnHCl)均在TGFβ1的激发下抑制TGFβR2和TGFβR3表达。A，TGFβR mRNA表达。B，TGFβR蛋白质表达。
图44例示了通过HC-HA抑制TGFβ1信号传导而对pSMAD2/3信号传导的核转位的抑制。
图45例示了α平滑肌肌动蛋白的形成的HC-HA抑制。
图46例示了HA和可溶性/不溶性HC-HA激活BMP6转录物。TGFβ1的加入激活了BMP6在塑料上的转录物表达，但显著激活了HCF中的BMP4/6在HA以及可溶性和不溶性HC-HA上的mRNA表达。
图47例示了HC-HA而非HA激活在用TGFβ1激发的HCF中的BMPR1A的转录物表达，而额外的TGFβ1非特异性地激活HCF中的BMPR1B和BMPR2的mRNA表达。
图48例示了可溶性HC-HA(PBS)和不溶性HC-HA(GnHCl)通过pSMAD1/5/8激活BMP4/6信号传导。
图49例示了SMAD/1/5/8的激活导致其下游基因——DNA结合抑制剂1、3和4(ID1、ID3和ID4)，BMP信号传导的下游靶标——的上调。
图50例示了HC-HA(PBS)和HC-HA(GnHCl)分别促进角膜蛋白聚糖mRNA表达达14倍和16倍，该表达被额外的TGFβ1显著下调。
图51例示了HC-HA(PBS)和HC-HA(GnHCl)促进角膜蛋白聚糖的蛋白质表达。
图52例示了HCF在4X HC-HA(PBS)和不溶性HC-HA(GnHCl)上比在塑料上以及当通过添加TGFβ1激发细胞时表达更多的ESC标记物。
图53例示了通过MTT测量的MC3T3-E1细胞的细胞活力。
图54例示了通过茜素红染色测量的MC3T3-E1细胞的矿化作用。
图55例示了在诱导的第13天使用HC-HA(A)或AMP(B)处理的MC3T3-E1细胞的形态。
图56例示了在诱导的第13天使用HC-HA(A)或AMP(B)处理的MC3T3-E1细胞的茜素红染色。
图57例示了在诱导的第13天使用HC-HA(A)或AMP(B)处理的MC3T3-E1细胞的ARS染色的定量分析。
图58例示了在诱导的第13天使用HC-HA(A)和AMP(B)处理的细胞的ALP活性(IU/L)。
图59例示了在从第3天诱导后对MC3T3-E1细胞的形态学变化的相差显微镜检查。(A)未诱导的细胞在含有10％FBS的αMEM中培养7天。(B)MC3T3-E1细胞在接种后一天(第0天)在平底96孔板中培养至汇合。然后用抗坏血酸和β-甘油磷酸盐诱导细胞。
图60例示了从第1天至第7天对使用HC-HA(A)或AMP(B)处理的诱导的MC3T3-E1细胞的形态变化的相差显微镜检查。
图61例示了从诱导的第3天对诱导的MC3T3-E1细胞中纺锤环形成的相差显微镜检查。
图62例示了用HC-HA(A)和AMP(B)处理的诱导的MC3T3-E1细胞中纺锤环形成的相差显微镜检查(第0天至第6天)。
图63例示了用HC-HA和AMP处理的诱导的MC3T3-E1细胞的ARS染色和使用GnHCl的提取。
图64例示了用乙酸和10％氢氧化铵对MC3T3-E1细胞的ARS提取和定量。通过乙酸处理而得到的ARS提取物用10％的氢氧化铵中和，随后加入到96孔透明底测定板中(A)，以供在分光光度计上读取(B)。*表示统计学显著性。
图65例示了用GnHCl对MC3T3-E1细胞的ARS提取和定量。将通过GnHCl处理而得到的ARS提取物加入到96孔透明底测定板中(A)，以供在分光光度计上读取(B)。*表示统计学显著性。
图66例示了在第19天(诱导的第18天)对使用HC-HA处理的MC3T3-E1细胞的ARS染色(A)和定量(B)。在培养的第19天(诱导的第18天)进行ARS染色。
图67例示了用AMP处理的MC3T3-E1细胞的ARS染色(A)和定量(B)。在培养的第19天(诱导的第18天)进行ARS染色。
图68例示了在诱导的第14天在诱导的MC3T3-E1细胞中观察到的纺锤样环。
图69例示了(A)不使用Transwell或(B)使用Transwell培养的，在诱导14天后用AMP处理的诱导的MC3T3-E1细胞的细胞形态的相差显微镜检查。
图70例示了在诱导的第14天，诱导的MC3T3-E1细胞的ARS染色。
图71例示了在诱导的第14天，诱导的MC3T3-E1细胞的ARS染色的定量。
图72例示了使用AMP处理的MC3T3-E1细胞的ARS染色和定量。(A)在培养的第21天(诱导的第20天)拍摄的MC3T3-E1细胞的相差照片和ARS染色照片。(B)在培养的第21天(诱导的第20天)对ARS染色进行定量。*符号表示p<0.05的统计学显著性。
图73图示了祖细胞向成骨细胞的不同分化的图片，其中显示了添加至培养基中的共同因子。
图74例示了MC3T3-E1细胞中的ARS染色和定量。(A)从第4天至第21天，HUVEC、hBMMSC和hAM间充质干细胞的进行或不进行ARS染色的相差显微照片。(B)ARS染色的定量。*符号表示与阴性对照相比p<0.05的统计学显著性。
图75图示了MC3T3-E1细胞中骨生成的时间线。
图76例示了MC3T3-E1细胞中的ARS染色和定量。(A)使用AMP处理(第1、2、7、10天)的MC3T3-E1细胞的细胞形态和ARS染色。(B)使用AMP处理(第1、2、7、10天)的MC3T3-E1细胞的ARS定量。*符号表示p<0.05的统计学显著性。
图77例示了通过MTT分析测定的细胞活力和增殖的时间线。(A)在第1天、第2天和第4天对MC3T3-E1细胞活力和代谢活性的MTT分析。*符号表示相对于第1天p<0.05的统计学显著性。(B)在第1天、第2天和第16天的MC3T3-E1细胞增殖的BrdU分析。*符号表示相对于第1天的p<0.05的统计学显著性。
图78例示了在使用或不使用AMP处理分化诱导之后通过QPCR测定的多个基因的mRNA表达。(A)hMSC和(B)MC3T3-E1细胞表达。
图79例示了ARS分析的相差显微镜检查和定量。MC3T3-E1细胞在实验的持续时间(8天)中沉积矿化。然后将ARS用于定性分析。(A)PBS、HA和HC-HA固定化于其中的CovaLink-NH 96孔板。(B)具有阴性对照与AGM(诱导剂)和AMP作为阳性对照的常规96孔板。(C)ARS分析的定量。*符号表示相对于第1天p<0.05的统计学显著性。
图80例示了在进行或不进行HC-HA/PTX3处理的情况下分化诱导后，所测试的多个基因通过QPCR测得的mRNA表达。(A)在第1天、第7天和第14天，用于骨生成和软骨发生的主转录因子Runx2和Sox9。(B)在第14天的骨形态发生蛋白(BMP)表达。(C)在第7天和第14天表达的软骨发生标记物胶原蛋白2(COL2)和成骨标记物碱性磷酸酶(ALPL)。(D)在第14天表达的肥大标记物胶原蛋白10(COL10)和MMP13。(E)在第14天的成骨标记物胶原蛋白1(COL1)、Osterix(OSX)和骨唾液蛋白(BSP)。
图81例示了在第14天，在进行或不进行HC-HA/PTX3(可溶性或不溶性)处理的情况下，在分化诱导后的ARS分析的相显微镜检查(A)和定量(B)。
图82例示了CD4+T细胞活化和分化。在不同的刺激下，幼稚CD4+T辅助细胞(Th)被分化成Th1、Th2、Th17或Treg并且分泌不同的细胞因子。Th1型细胞因子(例如，IFN-γ和IL-2)倾向于产生促炎应答。
图83例示了用于测定细胞增殖和细胞因子产生的程序。从表达卵白蛋白(OVA)特异性转基因TCR的OT-II小鼠中分离脾细胞，并用OVA刺激最多4天。通过BrdU标记测定细胞增殖，并且通过各自的ELISA测定细胞因子(IFN-γ和IL-2)的表达。
图84例示了nHC-HA/PTX3对CD4+T细胞增殖的抑制。将分离自Ova T细胞受体转基因小鼠的脾细胞用OVA(0-10μM)刺激4天。AM提取物(AME，25μg/ml)和nHC-HA/PTX3(25μg/ml)抑制由增加的OVA浓度诱导的活化T细胞的克隆生长(上部)。通过流式细胞术测定用HA、AME或nHC-HA/PTX3处理并使用CFSE标记4天的脾细胞的增殖。AME和nHC-HA/PTX3均剂量依赖性地抑制细胞增殖(中部)。25μg/ml nHC-HA/PTX3抑制用BrdU标记的CD4+T细胞的增殖(底部)(*，与对照相比p<0.05)。
图85例示了nHC-HA/PTX3对Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的抑制。用PBS、25μg/mlHA、25μg/ml AME或25μg/ml nHC-HA/PTX3处理的脾细胞用10μM的OVA刺激4天。通过各自的ELISA测定培养上清液中的IFN-γ和IL-2。AME和nHC-HA/PTX3均抑制IFN-γ和IL-2的产生(*与对照相比p<0.05)。
图86例示了nHC-HA/PTX3减少巨噬细胞(由增强绿色荧光蛋白或EGFP所标记的)的流入。将LPS(2μl，2μg/ml)注射到Mafia小鼠的角膜基质中。立即将5μl PBS或nHC-HA/PTX3(1mg/ml)穿过结膜下组织注射到来自同一小鼠的一个角膜的每个象限中。在LPS处理后第1天、第2天、第3天和第6天使用体内活体显微镜检查监测EGFP+巨噬细胞的流入(顶部)。或者，使用PBS或nHC-HA/PTX3同时使用LPS处理小鼠角膜(预处理(-)或在LPS处理前三天(预处理(+))。在LPS处理后第4天，通过胶原酶消化分离角膜中的细胞，并通过FACS分选为EGFP-或EGFP+(巨噬细胞)(*和**与对照相比分别为p<0.05和p<0.01)。
图87例示了nHC-HA/PTX3使巨噬细胞向M2表型的极化。通过qPCR对浸润至LPS引发的鼠角膜的巨噬细胞(EGFP+)中的M2标记物(Arg-1和IL-10)和M1标记物(IL-12p40和IL-12p35)的mRNA表达进行定量(*和**与对照相比分别为p<0.05和p<0.01)。
图88例示了nHC-HA/PTX3对角膜异体移植物的存活的改善。鼠角膜异体移植物的存活通过在一个象限结膜下部位处注射nHC-HA/PTX3(10μg/次，2次/周，左上图)而得到显著改善，但通过在四个象限结膜下部位处注射nHC-HA/PTX3(20μg/次，2次/周，右上图)而更为显著地改善。下图，角膜异体移植物的PBS(术后第21天，左)或nHC-HA/PTX3处理(术后第40天，右)的照片。
图89例示了巨噬细胞的经典M1活化(例如，通过IFN-γ和/或TLR配体如LPS诱导的)以表达高水平的促炎细胞因子(诸如TNF-α、IL-12和IL23)，其激活Th1和Th17淋巴细胞，从而导致许多慢性炎性疾病。
图90例示了采用PBS(对照)、HC-HA/PTX3或AMP处理，LPS引发的巨噬细胞向鼠角膜的浸润。用LPS基质内注射(5μg)Mafia小鼠(巨噬细胞是EGFP+)的双眼。用PBS处理OS，用HC-HA(2个注射部位)(A)、HC-HA(4个注射部位)(B)、AMP(2个注射部位)(C)、AMP(4个注射部位)(D)处理OD，每次注射为5μl。在LPS注射后马上进行一次处理。在第1天、第2天、第3天和第6天进行拍照。基于绿色荧光的强度对细胞进行计数。
图91例示了采用PBS(对照)、nHC-HA/PTX3或AMP处理或预处理，LPS引发的巨噬细胞对鼠角膜的浸润以及它们的亚型(M1和M2)。Mafia小鼠的预处理和处理与图86所述的相同。在第4天，切割角膜钮，并用胶原酶在37℃下消化2小时。通过FACS分选出EGFP阳性/阴性细胞。计算EGFP-阳性巨噬细胞相对于EGFP-阴性细胞的比例，并用作任意单位来确定巨噬细胞浸润的程度(A)。从分选的EGFP-阳性巨噬细胞中提取总RNA，并将其转化成cDNA。通过定量PCR测定Arg-1、IL-10、IL-12p40和IL-12p35的表达(B)。
图92是注射部位的图示。注射位置将是接近穹窿的结膜下位置。nHC-HA/PTX3或AMP可减少鼠实验性干眼症模型中DS诱导的ALKC。
图93例示了HC-HA对IGF1-HIF1α-VEGF信号传导的激活以促进血管发生。当细胞处于静息状态时，HC-HA诱导IGF1 mRNA的2至6倍增加和VEGF mRNA的2倍增加。当细胞被TGFβ(10ng/ml)激发时，HC-HA诱导IGF1 mRNA的5至12倍增加和VEGF mRNA的5至9倍增加。n＝4，*p<0.05，**p<0.01。IGF1，胰岛素样生长因子1；HIF1α，低氧诱导因子1-α；VEGF，血管内皮生长因子。
具体实施方式
特定术语
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与如所请求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，本发明全文所涉及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站及其他公布的资料均通过引用整体并入本文。在本文中的术语存在多个定义时，以本节中的定义为准。当提及URL或其他此类标识符或地址时，应当理解，此类标识符可能变化，并且在互联网上的特定信息可能变化不定，但等效信息是已知的，并且可容易地进行访问，如通过搜索互联网和/或适当的数据库。参考文献证明了这些信息的可用性和公开传播。
如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”还包括准确的量。因此，“约5μg”指“约5μg”，并且还指“5μg”。通常，术语“约”包括预计在实验误差内的量。
如本文所用，重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物是通过在体外组装该复合物的组分分子而形成的HC-HA/PTX3复合物。组装rcHC-HA/PTX3的方法包括：采用来自生物来源的纯化的天然蛋白质或分子进行重建，通过重组方法产生重组蛋白，或通过体外合成进行分子的合成。在一些情况下，用于组装rcHC-HA/PTX3的纯化的天然蛋白质为与其他蛋白质形成的复合物(即多聚体、多链蛋白质或其他复合物)中的蛋白质。在一些情况下，PTX3作为多聚体(例如，同源多聚体)从细胞中纯化，并用于组装rcHC-HA/PTX3复合物。
如本文所用，纯化的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物指从生物来源(如细胞、组织或生物流体)中纯化的HC-HA/PTX3复合物。此类复合物通常在受试者体内组装，或者在来自受试者(包括人或其他动物)的细胞、组织或生物流体中离体组装。
如本文所用，PTX3/HA复合物指通过使PTX3与固定化的HA接触而形成的中间复合物。在本文提供的方法中，PTX3/HA复合物在盐酸加入至HA之前产生。
如本文所用，“乙酰透明质酸(hyaluronan)”、“透明质酸(hyaluronic acid)”或“透明质酸盐(hyaluronate)”(HA)可互换使用，指具有D-葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺(D-葡糖醛酸基-N-乙酰基葡糖胺)的重复二糖单元的基本上非硫酸化的线性糖胺聚糖(GAG)。
如本文所用，术语“高分子量”或“HMW”，如在高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)中，意指重均分子量大于约500千道尔顿(kDa)，例如，约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa的HA。在一些实施方案中，HMW HA具有3000kDa或更大的重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有3000kDa的重均分子量。在一些实施方案中，HMW HA是具有约3000kDa的重均分子量的
Figure GDA0003352411270000431
。在一些实施方案中，HMW HA具有约500kDa至约10,000kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约800kDa至约8,500kDa的分子量。在一些实施方案中，HMW HA具有约3,000kDa的分子量。
如本文所用，术语“低分子量”或“LMW”，如在低分子量乙酰透明质酸(LMW HA)中，意指重均分子量小于500kDa，例如，小于约400kDa、小于约300kDa、小于约200kDa，为约200-300kDa或约1-300kDa的HA。
如本文所用，五聚环蛋白3或PTX3蛋白质或多肽指任何PTX3蛋白质，包括但不限于重组产生的蛋白质、合成产生的蛋白质、天然PTX3蛋白以及从细胞或组织中提取的PTX3蛋白质。PTX3包括PTX3的多聚体形式(例如，同源多聚体)，包括但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、四聚体、八聚体及天然或人工产生的其他多聚体形式。
如本文所用，肿瘤坏死因子刺激的基因-6(TSG-6)指任何TSG-6蛋白质或多肽，包括但不限于重组产生的蛋白质、合成产生的蛋白质、天然TSG-6蛋白以及从细胞或组织中提取的TSG-6蛋白质。
如本文所用，间-α-抑制剂(IαI)指由通过硫酸软骨素链共价连接的轻链(即尿抑胰酶素)和HC1或HC2类型的一条或两条重链组成的IαI蛋白质。在一些实施方案中，IαI的来源来自血清，或在促炎细胞因子如IL-1或TNF-α的组成型模式刺激下来自产生IαI的细胞，例如，肝细胞或羊膜上皮或基质细胞或脐带上皮或基质细胞。
如本文所用，“乙酰透明质酸结合蛋白质”、“HA结合蛋白质”或“HABP”指与HA特异性结合的任何蛋白质。
如本文所用，“连接模块”指乙酰透明质酸结合结构域。
如本文所用，“生物活性”指在体内施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物或包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物或混合物时产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的体内活性或生理反应。因此，生物活性包括nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物及其组合物和混合物的治疗效果和药物活性。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用。这些术语均不应解释为需要医疗专业人员(如医生、护士、医师助理、护理员、临终关怀机构员工)的监督。如本文所用，受试者为任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人动物)和非哺乳动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)和其他语法等同词，包括减轻、缓和或改善疾病或病况的一种或多种症状，改善、预防或降低疾病或病况的一种或多种另外的症状的出现、严重性或频发性，改善或预防疾病或病况的一种或多种症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，使疾病或病况消退，减轻由疾病或病况引起的病况，或在预防和/或治疗上抑制疾病或病况的症状。在一个非限制性的实例中，为获得预防的有益效果，将本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物或组合物施用于处于患有特定病症、倾向于患有特定病症的风险中的个体，或施用于报告患有病症的一种或多种生理症状的个体。
如本文所用，“胎盘”指将发育中的胎儿连接到母体子宫壁以允许进行营养吸收、废弃物排泄以及通过母体血液供应进行气体交换的器官。胎盘由三层组成。围绕胎儿的最内层的胎盘层称为羊膜。尿囊是胎盘的中间层(衍生自胚胎后肠)；来源于肚脐的血管穿过这层膜。胎盘的最外层，即绒毛膜，与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合形成绒毛尿囊膜。
如本文所用，“绒毛膜”指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜由以下两层组成：由滋养层形成的外层和由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方体或棱柱形细胞内层，细胞滋养层或朗汉斯(Langhans)层，以及缺乏细胞边界的核丰富的原生质外层(即合体细胞滋养层)组成。无血管羊膜附着在绒毛膜的内层。
如本文所用，“羊膜-绒毛膜”指包含羊膜和绒毛膜的产物。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜不分离(即，羊膜自然地附着在绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜最初与绒毛膜分离，且随后在处理过程中与绒毛膜合并。
如本文所用，“脐带”指将发育中的胎儿连接到胎盘的器官。脐带由华顿氏胶，即一种主要由黏多糖制成的胶状物质组成。它包含一条静脉(其将含氧的营养丰富的血液携带至胎儿)，以及两条动脉(其将脱氧的营养耗尽的血液带走)。
如本文所用，“胎盘羊膜”(PAM)指从胎盘衍生的羊膜。在一些实施方案中，PAM基本被分离。
如本文所用，“脐带羊膜”(UCAM)意指从脐带衍生的羊膜。UCAM是半透明膜。UCAM具有多个层：上皮层(基膜)；致密层；成纤维细胞层；和海绵层。它缺乏血管或直接的血液供应。在一些实施方案中，UCAM包括华顿氏胶。在一些实施方案中，UCAM包括血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包括华顿氏胶和血管和/或动脉。
如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”意指实质上或基本上不含通常在其天然状态时与之伴随的组分的材料(例如，nHC-HA/PTX3复合物)。在一些实施方案中，“纯化的”或“分离的”意指以约50％或更高的比例不含通常在其天然状态时与之伴随的组分，例如，以约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％不含通常在其天然状态时与之伴随的组分的材料(例如，nHC-HA/PTX3复合物)。
概述：nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3复合物
乙酰透明质酸(HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的重复二糖亚单元通过GlcUA-β1,3-GlcNAc-β1,4-键组成的基本上非硫酸化的线性糖胺聚糖(GAG)。HA通过HA合酶(例如，HAS1、HAS2和HAS3)合成，并沉积到细胞外基质中，在那里它有助于组织的结构完整性，并且还通过与蛋白质(包括细胞表面受体)相互作用来调节许多细胞过程。HA的分子量范围通常为约200至约10,000kDa的大小。通过由HAS酶进行的生物合成与由透明质酸酶如Hyal1进行的分解代谢的平衡来保持组织中HA的正常水平。
高分子量HA(HMW HA)，通常大于500kDa，促进诸如眼睛中的软骨和玻璃体(体液)的组织中的细胞静止和结构完整性，并与无瘢痕胎儿创伤愈合相关。在某些情况下，HMW HA抑制促炎介质的基因表达和血管发生。
在某些致病条件下，HMW HA被降解成较小的片段和寡糖(例如，通过透明质酸酶或自由基氧化)。LMW HA片段通过促进促炎介质和促血管发生介质的基因表达来刺激大鼠皮肤、心肌梗死和冷冻受损皮肤移植模型中的血管内皮细胞增殖、迁移、胶原蛋白合成、芽形成和血管发生。
HA的生物功能是通过HA与HA结合蛋白质(HABP)(也称为透明质酸粘素)的相互作用介导的。此类蛋白质包括但不限于肿瘤坏死因子-α刺激的基因6(TSG-6)、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、LYVE-1、CD44和间-α-抑制剂(IαI)。在一些情况下，HABP包含与HA结合的连接模块结构域。TSG-6、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、LYVE-1、和CD44是包含连接模块的示例性HABP。
IαI包含两条重链(HC1和HC2)，这两条重链通过酯键连接至与轻链(即尿抑胰酶素)附接的硫酸软骨素链。在一些情况下，HA与IαI的一条或两条HC通过与IαI重链的共价连接而形成共价复合物(以下称为“HC-HA”)。在某些情况下，IαI发现于血清中，和/或在促炎细胞因子如IL-1或TNF-α的组成型模式刺激下从产生IαI的细胞，例如，肝细胞或羊膜上皮或基质细胞或脐带上皮或基质细胞获得。
在某些情况下，TSG-6促进IαI的HC1和HC2向HA的转移，催化该转移，和/或将IαI的HC1和HC2转移至HA。TSG-6与固定化的HA形成稳定的复合物(TSG-6·HA)，导致HC1和HC2向HA转移，从而形成HC-HA复合物并从该复合物中释放TSG-6。TSG-6的表达通常在类炎症过程如排卵和宫颈成熟过程中由炎性介质如TNF-α和白介素-1诱导。
羊膜(AM)调节成人创伤愈合，并促进组织再生。在某些情况下，AM在抑制基质炎症、血管发生和瘢痕形成的同时促进上皮形成。AM已成功用作用于治疗需要角膜和结膜表面重建的眼科病况的外科手术移植物或临时生物补片，该眼科病况包括但不限于持续性上皮缺损、深层角膜溃疡、感染性角膜炎、症状性大疱性角膜病变、急性Stevens Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症(SJS/TEN)、缘干细胞缺陷、翼状胬肉、结膜黄斑、结膜松弛、睑球粘连、穹隆(formix)重建和结膜肿瘤。
AM的无血管基质矩阵(stromal matrix)含有高含量的HA并组成型地表达IαI(Zhang等人(2012),J.Biol.Chem.287(15):12433-44)。AM中的HMW HA形成nHC-HA复合物(He等人(2009),J.Biol.Chem.284(30):20136-20146)。如本文所示，在所提供的实施例中，该nHC-HA复合物还含有五聚环蛋白3，PTX3(图1)，并因此在本文中称为“nHC-HA/PTX3复合物”。从AM提取的天然HC-HA/PTX3复合物表现出抑制TGF-β启动子活性，促进巨噬细胞死亡，以及抑制血管发育。因此，AM的nHC-HA/PTX3复合物在AM的抗炎、抗瘢痕形成和抗血管发生作用中发挥积极作用。
如本文所述，nHC-HA/PTX3复合物还见于脐带(UC)中。这些UC HC-HA/PTX3复合物在它们关于HA含量和复合物的各种组分(包括蛋白聚糖，诸如小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP))的存在和/或相对丰度的生化组成上不同。在一些实施方案中，SLRP是饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和/或骨黏附蛋白聚糖。如本文所述，这些复合物还在关于特定的硫酸化的糖胺聚糖如硫酸角质素的存在的含量上不同。此外，如本文所述，使用不同的提取方法(例如，PBS与GnHCl提取)从AM或UC中分离的复合物导致复合物具有不同的生化组成和生物学性质。在某些情况下，发现通过GnHCl提取从脐带组织得到的不溶性级分中分离的复合物表现出改善的性质。
PTX3是已被证明与TSG-6和IαI HC直接相互作用的多聚体蛋白质。PTX3响应于炎性调节剂而被上调，并已被证明在卵母细胞成熟期间在卵丘(cumulous oophorous)的细胞外基质中的HA组织化方面发挥重要作用。如本文所证实的，PTX3还发现于羊膜和脐带的nHC-HA复合物(即nHC-HA/PTX3)内，并在M2巨噬细胞极化中发挥关键作用。
M1巨噬细胞或经典活化的促炎巨噬细胞由单独的或与脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子(TNF)α组合的干扰素(IFN)诱导。M1巨噬细胞的典型特征是白介素-12(IL-12)和IL-23的高表达以及IL-10的低水平。相比之下，M2巨噬细胞或“替代活化的”巨噬细胞显示出创伤愈合和组织再生特性，并且特征为低IL-12/IL-23和高IL-10或大致相同的IL-12与IL-10的比例。在某些情况下，M2巨噬细胞也具有TGF-β的高表达。
本文提供的实施例证明PTX3直接与固定化的HA结合，如通过对解离剂的抗性所证明的。本文中证实，与PTX3结合的HA的体外重建的复合物表现出与结合TSG-6的HA的体外重建的复合物不同的特性。例如，在一些实施方案中，PTX3/HA复合物促进LPS刺激的巨噬细胞的附着而不发生聚集，并且诱导LPS刺激的巨噬细胞中IL-10的表达。在一些实施方案中，与不存在PTX3/HA复合物时的IL-10表达相比，本文公开的PTX3/HA复合物使LPS刺激的巨噬细胞中IL-10的表达提高了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。相比之下，在一些实施方案中，TSG-6/HA复合物减少了细胞附着并促进LPS刺激的巨噬细胞的聚集，并且不诱导LPS刺激的巨噬细胞中IL-10的表达。此外，在一些实施方案中，预结合到HA的TSG-6抑制PTX3与复合物的后续结合。在一些实施方案中，TSG-6/HA复合物和PTX3/HA复合物均降低了LPS刺激的巨噬细胞中IL-12的表达。在一些实施方案中，与不存在PTX3/HA复合物或TSG-6/HA复合物时IL-12的表达相比，本文公开的PTX3/HA复合物或TSG-6/HA复合物将LPS刺激的巨噬细胞中IL-12的表达降低或抑制了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，TSG-6/HA复合物和PTX3/HA复合物均提高了LPS/IFNγ刺激的巨噬细胞中IL-23的表达。在一些实施方案中，与不存在PTX3/HA复合物或TSG-6/HA复合物时的IL-23表达相比，本文公开的PTX3/HA复合物或TSG-6/HA复合物将LPS/IFNγ刺激的巨噬细胞中IL-23的表达降低或抑制了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
此外，本文中证实，在体外重建的rcHC-HA/PTX3复合物具有不同的生物活性，这取决于是否采用以下步骤形成rcHC-HA/PTX3复合物：在IαI的存在下使HA与TSG-6预结合，随后加入PTX3或预结合至PTX3的HA，然后加入具有IαI的TSG-6。本文提供了用于重建采用预结合至TSG-6的HA或预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物的示例性方法。在一些实施方案中，采用固定化的预结合至TSG-6的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物导致LPS刺激的巨噬细胞的聚集。在一些实施方案中，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物促进LPS刺激的巨噬细胞的附着而不发生聚集。
在一些实施方案中，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物降低或抑制了M1巨噬细胞标记物如IL-12和IL-23的表达。在一些实施方案中，与不存在rcHC-HA/PTX3复合物时IL-12的表达相比，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物降低了LPS刺激的巨噬细胞中IL-12的表达。在一些实施方案中，与不存在rcHC-HA/PTX3复合物时IL-12的表达相比，本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物将LPS刺激的巨噬细胞中IL-12的表达降低或抑制了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，与不存在rcHC-HA/PTX3复合物时IL-12的表达相比，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物降低或抑制了LPS/IFNγ刺激的巨噬细胞中IL-23的表达。在一些实施方案中，与不存在rcHC-HA/PTX3复合物时IL-23的表达相比，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物将LPS/IFNγ刺激的巨噬细胞中IL-23的表达降低或抑制了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，采用固定化的预结合至PTX3的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物复制从羊膜中分离的nHC-HA/PTX3复合物的活性。
在一些实施方案中，用固定化的预结合至TSG-6的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物降低或抑制了M1巨噬细胞标记物如IL-12的表达，但提高了IL-23的表达。在一些实施方案中，采用固定化的预结合至TSG-6的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物降低或抑制了IL-12的表达。在一些实施方案中，采用固定化的预结合至TSG-6的HA形成的rcHC-HA/PTX3复合物提高了IL-23的表达。
本文提供了使用固定化的预结合至PTX3的HA制备重建的HC-HA/PTX3复合物的方法及其用途。本文还提供了固定化的预结合至PTX3的HA的复合物及其用途。本文还提供了使用固定化的预结合至TSG-6的HA制备重建的HC-HA/PTX3复合物的方法及其用途。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗很多种疾病或病况，包括但不限于治疗，如抑制、减少、预防或降低炎症、导致自身免疫或免疫排斥的免疫反应、粘连(adhesion)、瘢痕形成、血管发生、需要细胞或组织再生的病况、由于缺血引起的组织再灌注损伤(包括心肌梗死和中风)，以及由此引起的症状的风险。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗炎症。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗瘢痕形成。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗血管发生。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗导致自身免疫或免疫排斥的免疫反应。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗需要抑制细胞粘连的病况。在一些实施方案中，施用本文提供的重建的HC-HA/PTX3复合物以治疗需要细胞或组织再生的病况。
此外，本文提供的实施例在人角膜成纤维细胞模型中证明了HC-HA/PTX3复合物维持干细胞处于未分化状态以及将成年分化成纤维细胞诱导为较年轻的祖细胞的能力。这些人角膜成纤维细胞是从角膜细胞且经加入外源性TGF-β1分化而来，它们进一步分化成形成瘢痕的肌成纤维细胞。本文提供的数据表明在HC-HA的存在下培养细胞阻止细胞在TGF-β1刺激下分化为肌成纤维细胞。在不存在TGF-β1时，HC-HA/PTX3复合物将人角膜成纤维细胞恢复为表达角膜蛋白聚糖和CD34的角膜细胞。在存在TGF-β1时，人角膜成纤维细胞被进一步重编程为缺乏角膜蛋白聚糖表达但表达多种神经嵴细胞标记物(如Osr2、FGF10和Sox9)和胚胎干细胞标记物(如c-myc、KLF4、Nanog、巢蛋白、Oct 4、Rex-1、Sox-2和SSEA-4)的较年轻的祖细胞。
已知转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在从成年分化细胞诱导为祖干细胞(iPSC)的过程中发挥重要作用。因此，在一些实施方案中，采用本文提供的HC-HA/PTX3复合物来将成人分化细胞重编为iPSC。在一些实施方案中，使用HC-HA/PTX3复合物与Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4中的一种或多种的组合进行iPSC的诱导比使用这四种转录因子而不使用HC-HA/PTX3的常规方法具有高得多的效率。在一些实施方案中，加入HC-HA/PTX3复合物通过关闭TGF-β信号传导阻止分化以及通过开启BMP信号传导促进重编程为年轻祖细胞如iPSC，来促进干细胞诱导。在一些实施方案中，加入HC-HA/PTX3复合物通过将细胞重编程为较年轻的祖细胞以及诱导干细胞标记物来促进干细胞诱导。在一些实施方案中，加入HC-HA/PTX3复合物有助于在体外扩增中保持干细胞的特性，从而消除使用由鼠胚胎成纤维细胞组成的饲养层的需要。因此，在一些实施方案中，将HC-HA/PTX3复合物用作载体或支架，以帮助将已进行体外扩增的干细胞递送至人患者，从而提升所述干细胞疗法的疗效。
制备分离的nHC-HA/PTX3复合物的方法
本文公开了产生分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)的方法。
在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从羊膜组织中分离的。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从羊膜或脐带中分离的。在一些实施方案中，分离的nHC-HA/PTX3复合物是从新鲜的、冷冻的或先前冷冻的胎盘羊膜(PAM)，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的脐带羊膜(UCAM)，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的胎盘，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的脐带，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的绒毛膜，新鲜的、冷冻的或先前冷冻的羊膜-绒毛膜，或其任何组合中分离的。此类组织可获自任何哺乳动物，例如，但不限于人、非人灵长类动物、牛或猪。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3通过任何合适的方法进行纯化。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过离心(例如，超速离心、梯度离心)、色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和羟基磷灰石色谱法)、凝胶过滤或差别溶解法、乙醇沉淀法或通过用于蛋白质纯化的任何其他可行技术(参见，例如，Scopes,ProteinPurification Principles和Practice,第2版,Springer-Verlag,New York,1987；Higgins,S.J.和Hames,B.D.(编著),Protein Expression:A Practical Approach,OxfordUniv Press,1999；以及Deutscher,M.P.,Simon,M.I.,Abelson,J.N.(编著),Guide toProtein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol182),Academic Press,1997，所有这些文献均通过引用并入本文)进行纯化。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3从提取物中分离。在一些实施方案中，所述提取物由羊膜提取物制备。在一些实施方案中，所述提取物由脐带提取物制备。在一些实施方案中，所述脐带提取物包含脐带基质和/或华顿氏胶。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含在通过使用CsCl/4-6M盐酸胍梯度进行的超速离心制备的提取物中。在一些实施方案中，所述提取物通过至少2轮超速离心而制备。在一些实施方案中，所述提取物通过多于2轮超速离心而制备(即nHC-HA/PTX3，第2)。在一些实施方案中，所述提取物通过至少4轮超速离心而制备(即nHC-HA/PTX3，第4)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。
在一些实施方案中，在等渗溶液中对通过提取制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，等渗溶液是PBS。例如，在一些实施方案中，使组织在PBS中匀浆化，以制备匀浆样品。随后将匀浆样品通过离心分离成可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对PBS提取的组织的可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对PBS提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3可溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA可溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3可溶性复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过对羊膜和/或脐带组织进行直接盐酸胍提取(例如4-6MGnHCl)制备的提取物进行超速离心。在一些实施方案中，随后对GnHCl提取物组织进行离心，以产生GnHCl可溶性和GnHCl不溶性部分。在一些实施方案中，对GnHCl可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物含有HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对通过对PBS-提取的组织的不溶性部分进行进一步的盐酸胍提取而制备的提取物进行超速离心。例如，在一些实施方案中，使组织在PBS中匀浆化以制备匀浆样品。随后将匀浆样品通过离心分离成可溶性部分和不溶性部分。然后将不溶性部分在盐酸胍(例如，4-6M GnHCl)中进一步提取，并进行离心以产生盐酸胍可溶性部分和不溶性部分。在一些实施方案中，对盐酸胍可溶性部分进行超速离心。在此类实施方案中，将通过对盐酸胍提取的组织进行超速离心而纯化的nHC-HA/PTX3称为nHC-HA/PTX3不溶性复合物。在一些实施方案中，nHC-HA不溶性复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3不溶性复合物包含HCl、HA、PTX3和/或小亮氨酸丰富蛋白聚糖。
在一些实施方案中，对分离的nHC-HA/PTX3提取物进行纯化的方法包括：(a)将分离的提取物(例如，通过本文所述的可溶性或不溶性方法制备的)溶解于初始密度为1.35g/ml的CsCl/4-6M盐酸胍中，以产生CsCl混合物，(b)将氯化铯混合物在15℃下以125,000x g离心48h，以产生第一纯化提取物，(c)提取第一纯化提取物并将其相对于蒸馏水进行透析以除去氯化铯和盐酸胍，从而产生透析液。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(d)在0℃下将透析液与含有1.3％(w/v)乙酸钾的3倍体积的95％(v/v)乙醇混合1h，以产生第一透析液/乙醇混合物，(e)将第一透析液/乙醇混合物在15,000x g下进行离心，以产生第二纯化提取物，以及(f)提取第二纯化提取物。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(g)采用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第二纯化提取物，以产生第二纯化提取物/乙醇混合物；(h)对第二纯化提取物/乙醇混合物进行离心，以产生第三纯化提取物；以及(i)提取第三纯化提取物。在一些实施方案中，对分离的提取物进行纯化的方法进一步包括：(j)采用乙醇(例如，70％乙醇)洗涤第三纯化提取物，以产生第三纯化提取物/乙醇混合物；(k)对第三纯化提取物/乙醇混合物进行离心，以产生第四纯化提取物；以及(l)提取第四纯化提取物。在一些实施方案中，纯化的提取物包含nHC-HA/PTX3复合物。
]在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过免疫亲和色谱法进行纯化。在一些实施方案中，产生抗HC1抗体、抗HC2抗体或两者，并将其附着在固定支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的HC-HA复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，HC-HA复合物与抗体结合(例如，通过(a)抗HC1抗体和HCl，(b)抗HC2抗体和HC2，(c)抗PTX抗体和PTX3，(d)抗SLRP抗体和SLRP，或(e)它们的任何组合的相互作用)。在一些实施方案中，洗涤(例如，采用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后采用能够从支持体上洗脱nHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％SDS、6M盐酸胍或8M尿素)洗涤支持体。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过亲和色谱法进行纯化。在一些实施方案中，产生HABP并将其附着在固定支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的nHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，nHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后采用能够从支持体上洗脱HC-HA复合物的溶液洗涤支持体。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物通过HABP亲和色谱法以及使用抗HC1抗体、抗HC2抗体、抗PTX3抗体、针对SLRP或SLRP的组合的抗体或其抗体的任何组合进行的免疫亲和色谱法进行纯化。
在一些实施方案中，使用一种或多种抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗SLRP抗体从如本文所述的不溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使用抗PTX3抗体从如本文所述的可溶性级分中纯化nHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3复合物包含I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖(lumican)、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包含硫酸角质素。
生产rcHC-HA/PTX3复合物的方法
本文公开了产生含有或不含有SLRP的重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)的方法。本文还公开了通过此类方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物和组分的中间组合。
在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，以及(b)使PTX3/HA复合物与IαI和肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG-6)接触。本文提供了通过该方法生产的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。
在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。
在一些实施方案中，用于产生与PTX3结合的HA的复合物的方法包括使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物。本文提供了通过该方法产生的PTX3/HA复合物。
在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括(a)使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与针对HA的IαI和TSG-6接触以形成预结合至TSG-6的HC-HA复合物，以及(b)使HC-HA复合物与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。在一些实施方案中，该方法包括使预结合至TSG-6的HC-HA复合物与PTX3接触。
在一些实施方案中，所述方法包括：首先使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，然后使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。
在一些实施方案中，使IαI蛋白与TSG-6蛋白以约1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、15：1或20：1(IαI：TSG-6)的摩尔比接触而形成复合物。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例范围为约1：1至约20：1，例如约1：1至约10：1，例如约1：1至约5：1，如约1：1至约3：1。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例范围为3：1或更高。在一些实施方案中，IαI：TSG-6的比例为3：1。
在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)按顺序相继进行。在一些实施方案中，所述方法包括使PTX3/HA复合物与IαI和TSG-6接触。
在某些情况下，TSG-6与IαI相互作用并与IαI的HCl和HC2形成共价复合物(即HCl·TSG-6和HC2·TSG-6)。在某些情况下，在HA的存在下，使HC向HA转移，以形成rcHC-HA。在一些实施方案中，将TSG-6·HCl复合物添加至预结合的PTX3/HA复合物中以催化HCl向HA的转移。在一些实施方案中，所述方法包括：首先使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMWHA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，然后使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物接触。在一些实施方案中，将HC1·TSG-6复合物和HC2·TSG-6复合物的组合添加至PTX3/HA复合物中。
在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时后、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少2小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使PTX3与固定化的HMW HA接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl2中进行。
在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与针对HA的IαI和TSG-6接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少2小时或更长的时间。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC2·TSG-6复合物接触的步骤进行至少2小时。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使PTX3/HA复合物与HC1·TSG-6复合物和/或HC1·TSG-6复合物接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl2中进行。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质、包含重链1(HCl)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α刺激的基因6(TSG-6)在适当的条件下同时接触，以形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl2中进行。
在一些实施方案中，所述方法包括使高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)蛋白质、包含重链1(HCl)的间-α-抑制剂(IαI)蛋白质和肿瘤坏死因子α刺激的基因6(TSG-6)在适当的条件下以任何顺序相继接触，以形成HC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，使HMW HA与PTX3、IαI和TSG-6的接触进行至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少12小时或至少24小时或更长的时间。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在37℃下进行。在一些实施方案中，使HMW HA、PTX3、IαI和TSG-6接触的步骤在于PBS中的5mM MgCl2中进行。
在一些实施方案中，用于生产rcHC-HA/PTX3复合物的方法进一步包括添加一种或多种小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与五聚环蛋白3(PTX3)在适当的条件下接触，以形成PTX3/HA复合物，(b)使PTX3/HA复合物与IαI和肿瘤坏死因子刺激的基因6(TSG-6)接触，以及(c)使PTX3/HA复合物与一种或多种SLRP接触。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，TSG-6催化间-α-抑制剂(IαI)的重链1(HCl)向HA的转移。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，按顺序相继进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，同时进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后按顺序相继进行该方法的步骤(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后同时进行该方法的步骤(b)和(c)。
在一些实施方案中，用于产生重建的HC-HA/PTX3复合物的方法包括：(a)使固定化的高分子量乙酰透明质酸(HMW HA)与针对HA的IαI和TSG-6接触以形成预结合至TSG-6的HC-HA复合物，(b)使HC-HA复合物与五聚环蛋白3(PTX3)接触，以及(c)使HC-HA复合物与一种或多种SLRP在适当的条件下接触，以形成rcHC-HA/PTX3复合物。本文提供了通过该方法产生的rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，IαI的HC1与HA形成共价键。在一些实施方案中，该方法包括：使预结合至TSG-6的HC-HA复合物与PTX3接触。在一些实施方案中，按顺序相继进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，同时进行该方法的步骤(a)、(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后按顺序相继进行该方法的步骤(b)和(c)。在一些实施方案中，进行该方法的步骤(a)，且随后同时进行该方法的步骤(b)和(c)。
在一些实施方案中，SLRP选自I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包含硫酸角质素。
PTX3
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。适于表达PTX3的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于，哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)和植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从人细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从采用一种或多种促炎细胞因子刺激以上调PTX3表达的细胞中分离。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从来自脐带的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带细胞中分离。在一些实施方案中，所述脐带细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从羊膜基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3从脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，所述羊膜基质细胞或脐带基质细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3为从细胞中分离的天然PTX3蛋白。在一些实施方案中，所述细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，PTX3通过重组技术制备。在一些实施方案中，PTX3从重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码PTX3的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，PTX3在转基因动物中表达。在一些实施方案中，PTX3是重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是从细胞中分离的重组蛋白。在一些实施方案中，PTX3是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，PTX3从羊膜、脐带、脐带羊膜、绒毛膜、羊水或它们的组合中纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调PTX3表达。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，PTX3不从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。
在一些实施方案中，PTX3包含具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽或其变体，该变体与具有SEQ ID NO:33所示序列的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性。示例性的变体包括，例如，物种变体、等位基因变体和包含保守和非保守氨基酸突变的变体。在一些实施方案中，PTX3包括足以与HA结合并促进rcHC-HA/PTX3复合物的形成的PTX3片段。在一些实施方案中，PTX3包括人PTX3的Glu18至Ser277。用于所提供的方法的PTX3的变体包括具有氨基酸修饰(该修饰为氨基酸置换(替代)、缺失或插入)的变体。在一些实施方案中，该修饰改善了PTX3多肽的一种或多种性质，如改善了rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种治疗性质(例如，如本文所述的抗炎、抗免疫、抗血管发生、抗瘢痕形成、抗粘连、再生或其他治疗活性)。
在一些实施方案中，PTX3蛋白从商业来源获得。PTX3的示例性商业来源是但不限于PTX3(目录号1826-TS；R&D Systems，Minneapolis，MN)。
在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3蛋白是多聚体蛋白质。在一些实施方案中，用于所述方法的PTX3蛋白是同源多聚体。在一些实施方案中，所述同源多聚体是二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、五聚体或八聚体。在一些实施方案中，PTX3同源多聚体是三聚体、四聚体或八聚体。在具体的实施方案中，PTX3同源多聚体是八聚体。在一些实施方案中，对多聚化结构域进行修饰，以改善PTX3蛋白的多聚化。在一些实施方案中，采用当与PTX3融合时改善PTX3的多聚化的异源多聚化结构域(例如，Fc多聚化结构域或亮氨酸拉链)替代多聚化结构域。
TSG-6
]在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。适合用于表达TSG-6的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于，哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)以及植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从人细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的细胞中分离。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从来自脐带的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜细胞中分离。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的脐带细胞中分离。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中分离。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从羊膜基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6从采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6表达的羊膜基质细胞或脐带基质细胞中分离。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，用于所述方法的TSG-6为从细胞中分离的天然TSG-6蛋白。在一些实施方案中，所述细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6的表达。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，TSG-6通过重组技术制备。在一些实施方案中，TSG-6从重组表达载体表达。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码TSG-6的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，TSG-6在转基因动物中表达。在一些实施方案中，TSG-6是重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是从细胞中分离的重组蛋白。在一些实施方案中，TSG-6是在无细胞提取物中产生的重组蛋白。
在一些实施方案中，TSG-6从羊膜、羊膜、绒毛膜、羊水或其组合中纯化。在一些实施方案中，PTX3从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜上皮细胞是脐带上皮细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是羊膜基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞是脐带基质细胞。在一些实施方案中，所述羊膜细胞采用一种或多种促炎细胞因子进行刺激以上调TSG-6的表达。在一些实施方案中，所述促炎细胞因子为IL-1或TNF-α。
在一些实施方案中，TSG-6不从一个细胞或多个细胞(例如，组织提取物)中分离。
在一些实施方案中，TSG-6包括足以促进或催化IαI的HC1向HA转移的TSG-6片段。在一些实施方案中，TSG-6包括TSG-6的连接模块。在一些实施方案中，TSG-6包含TSG-6的氨基酸Trp18至Leu277。在一些实施方案中，TSG-6包括具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽或其变体，该变体与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性。示例性的变体包括，例如，物种变体、等位基因变体和含有保守和非保守氨基酸突变的变体。人TSG-6的天然等位基因变体包括，例如含有氨基酸置换Q144R的TSG-6。用于所提供的方法的TSG-6的变体或其HA结合片段包括具有氨基酸修饰(该修饰为氨基酸置换(替代)、缺失或插入)的变体。在一些实施方案中，该修饰改善了TSG-6多肽的一种或多种性质，例如改善了IαI的HC1向HA的转移或者改善了在IαI的HC1向HA转移之后TSG-6多肽从rcHC-HA/PTX3复合物中的释放。
在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签。示例性的亲和标签包括但不限于：血凝素标签、聚组氨酸标签、myc标签、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签。此类亲和标签在本领域中公知用于纯化。在一些实施方案中，这样的亲和标签作为融合蛋白或通过化学连接体引入TSG-6多肽中。在一些实施方案中，TSG-6包含亲和标签，且将未结合的TSG-6通过亲和纯化从rcHC-HA/PTX3复合物中除去。
在一些实施方案，TSG-6蛋白从商业来源获得。TSG-6的示例性商业来源是但不限于，TSG-6(目录号2104-TS R&D Systems，Minneapolis，MN)。
IαI
在一些实施方案中，所述IαI包含HC1链。在一些实施方案中，所述IαI包含HC1和HC2链。在一些实施方案中，所述IαI包含HC1和尿抑胰酶素。在一些实施方案中，所述IαI包含HCl和HC2链以及尿抑胰酶素。在一些实施方案中，所述IαI包含由硫酸软骨素链连接的HCl和HC2链以及尿抑胰酶素。
在一些实施方案中，IαI从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，所述IαI从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI并不从血清中分离。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在来自脐带的羊膜细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带上皮细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在羊膜基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在脐带基质细胞中产生。在一些实施方案中，用于所述方法的IαI在肝细胞中产生。在一些实施方案中，IαI通过重组技术制备。
在一些实施方案中，IαI的HC1从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC1从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC1并不从血清中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1通过重组技术制备。在一些实施方案中，IαI的HC1从肝细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC1从羊膜基质细胞或脐带基质细胞中纯化。
在一些实施方案中，HC1包含具有SEQ ID NO:47所示序列的多肽或与具有SEQ IDNO:47所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。
在一些实施方案中，IαI的HC2从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述生物样品是来自哺乳动物的生物样品。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清、血浆、肝脏、羊膜、绒毛膜或羊水样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液、血清或血浆样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血清样品。在一些实施方案中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施方案中，IαI的HC2从人的血液、血浆或血清中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2从人血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2并不从血清中分离。在一些实施方案中，IαI的HC2通过重组技术制备。在一些实施方案中，IαI的HC2从肝细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜上皮细胞或脐带上皮细胞中纯化。在一些实施方案中，IαI的HC2从羊膜基质细胞或脐带基质细胞中纯化。
在一些实施方案中，HC2包含具有SEQ ID NO:49所示序列的多肽或与具有SEQ IDNO:49所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。
在一些实施方案中，IαI包含尿抑胰酶素。在一些实施方案中，尿抑胰酶素包括具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:53所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，IαI包含硫酸软骨素链。
HA
在一些实施方案中，HA从细胞、组织或流体样品中纯化。在一些实施方案中，HA从商业供应商(例如，Sigma Aldrich或Advanced Medical Optics，Irvine，CA(例如，Healon))获得。在一些实施方案中，HA作为粉末从商业供应商获得。在一些实施方案中，HA在细胞中表达。适合用于表达HA的示例性细胞包括但不限于动物细胞(包括但不限于哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、昆虫细胞、细菌以及酵母)和植物细胞(包括但不限于藻类、被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物)。在一些实施方案中，HA在人细胞中表达。在一些实施方案中，HA在转基因动物中表达。在一些实施方案中，HA从表达透明质酸合酶(例如，HAS1、HAS2和HAS3)的细胞中获得。在一些实施方案中，所述细胞含有表达HA合酶的重组表达载体。在某些情况下，HA合酶在被挤压穿过细胞膜进入细胞外隙时通过将葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺反复添加到新生多糖上而使乙酰透明质酸延长。
用于所述方法的HA通常为高分子量(HMW)HA。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量大于约500千道尔顿(kDa)，例如，约500kDa至约10,000kDa、约800kDa至约8,500kDa、约1100kDa至约5,000kDa或约1400kDa至约3,500kDa。在一些实施方案中，HMW HA的重均分子量为约3000kDa。
额外的组分
在一些实施方案中，加入一种或多种额外的组分以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，加入小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)以产生rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，SLRP是I类、II类或II类SLRP。在一些实施方案中，SLRP选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自II类SLRP，如纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，SLRP包含硫酸角质素。
HA固定化
在一些实施方案中，通过任何合适的方法将HMW HA固定化。在一些实施方案中，HMW HA固定于固体支持体，如培养皿、珠子、柱或其他合适的表面，例如，植入式医学装置的表面或其一部分，或固定在随后与如本文所述的植入式医学装置连接或合并的表面上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体，例如通过化学连接。在一些实施方案中，HMW HA通过连接体或中间蛋白质间接附接至固体支持体上。用于在氨基和硫醇基之间形成共价键并将硫醇基引入蛋白质的众多异双功能交联试剂是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，HMW HA通过与固体支持体交联而直接固定于固体支持体上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体而不与固体支持体交联。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体上作为涂层。在一些实施方案中，HMW HA固定于CovalinkTM-NH表面上。在一些实施方案中，HMW HA直接固定于固体支持体上作为涂层。在一些实施方案中，HMW HA在4℃下固定于CovalinkTM-NH表面上约16h。
在一些实施方案中，所述方法包括将HMW HA通过与固体支持体直接连接(即没有中间蛋白质)而固体于固体表面上。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前洗涤固体支持体以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前用8M GnHCl和PBS的洗液洗涤固体支持体，以除去未结合的HMW HA。
在一些实施方案中，所述方法包括通过中间蛋白质或连接体将HA固定于固体表面上。在一些实施方案中，所述连接体是肽连接体。在一些实施方案中，所述中间蛋白质是HA结合蛋白质(HABP)。在一些实施方案中，首先将HABP附接至固体支持体上(例如，通过交联、化学连接或通过化学连接体)。在一些实施方案中，随后使包含HABP的固体支持体与HA(例如，HMW HA)接触，以通过将HABP与HA结合而将HA固定于固体支持体上。在一些实施方案中，在使固定化的HMW HA与PTX3接触之前洗涤固体支持体以除去未结合的HMW HA。在一些实施方案中，在使固定化的HA与PTX3接触之前用8M GnHCl和PBS的洗液洗涤固体支持体，以除去未结合的HMW HA。
在一些实施方案中，所述方法包括通过将肽连接体附接至固体支持体以及将HA附接至肽连接体而将HA固定于固体表面上。在一些实施方案中，所述肽连接体包含蛋白酶切割位点。
在一些实施方案中，所述方法包括通过附接可切割的化学连接体(例如，但不限于二硫化物化学连接体)而将HA固定于固体表面上。
在一些实施方案中，选择用于所述方法的HABP是在rcHC-HA/PTX3复合物形成后从HA上解离的HABP。在一些实施方案中，HABP与HA非共价结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用一种或多种解离剂从HABP上解离rcHC-HA/PTX3复合物。用于破坏非共价相互作用的解离剂(例如，盐酸胍、尿素和各种洗涤剂，例如，SDS)是本领域已知的。在一些实施方案中，所述解离剂是尿素。在一些实施方案中，所述解离剂是盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为约4M至约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为约4M、约5M、约6M、约7M、约8M的盐酸胍。在一些实施方案中，所述解离剂为在PBS中的约4M至约8M的pH 7.5的盐酸胍。
在一些实施方案中，采用此类解离剂从中间物HABP上解离rcHC-HA/PTX3复合物。选择用于所述方法的HABP使得对于HA的结合亲和力足够强以允许rcHC-HA/PTX3复合物的组装，但可采用合适的解离剂从rcHC-HA/PTX3复合物上解离下来。在一些实施方案中，所述解离剂是盐酸胍。
用于与本文提供的方法一起使用的示例性HABP包括但不限于，HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1、斯塔比林-2或足以结合HA的其一部分(例如，其连接模块)。在一些实施方案中，HABP包含具有SEQ ID NO:54-99中任一个所示序列的多肽或与具有SEQID NO:54-99中任一个所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，HABP是多能蛋白聚糖。在一些实施方案中，HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，HABP是重组哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，HABP是重组人蛋白质。在一些实施方案中，HABP是重组多能蛋白聚糖蛋白质或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，HABP是重组聚集蛋白聚糖蛋白或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，HABP是天然HABP或足以与HA结合的其一部分。在一些实施方案中，天然HABP从哺乳动物组织或细胞中分离。在一些实施方案中，HABP从牛鼻软骨中分离(例如，来自Seikagaku的含有聚集蛋白聚糖的HA结合结构域和连接蛋白质的HABP)。
在一些实施方案中，HABP包括HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、TSG-6、CD44、斯塔比林-1或斯塔比林-2的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP包括具有SEQ ID NO:54-99的任何连接结构域所示序列的多肽或与具有SEQ ID NO:54-99的任何连接结构域所示序列的多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列氨基酸同一性的多肽。在一些实施方案中，HABP包含多能蛋白聚糖的连接模块。在一些实施方案中，包含连接模块的HABP是重组蛋白。在一些实施方案中，包含多能蛋白聚糖的连接模块的HABP是重组蛋白。
在一些实施方案中，中间蛋白质，诸如HABP，包含由位点特异性蛋白酶(如费林蛋白酶、3C蛋白酶、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶或TEV蛋白酶)识别并水解的蛋白酶切割序列。在此类实施方案中，通过使固定化的复合物与切割特异性切割序列的蛋白酶接触而从固体支持体上释放组装的rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，通过任何合适的方法或这些方法的组合来对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。下文描述的实施方案并非是排他性的，仅仅是示例性的。
在一些实施方案中，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和羟基磷灰石色谱法)、凝胶过滤、离心(例如，梯度离心)或差别溶解法、乙醇沉淀法或通过用于蛋白质纯化的任何其他可行技术对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。
在一些实施方案中，通过免疫亲和色谱法对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，产生针对rcHC-HA/PTX3复合物的组分的抗体(例如，抗HCl、抗PTX、抗rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种SLRP的抗体，例如，抗尿抑胰酶素、抗饰胶蛋白聚糖、抗双糖链蛋白聚糖或抗骨黏附蛋白聚糖)并将其附着在固体支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与抗体结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后使用能够从支持体洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，1％SDS，6M盐酸胍或8M尿素)洗涤支持体。在一些实施方案中，从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。
在一些实施方案中，通过亲和色谱法对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。在一些实施方案中，HABP用于与rcHC-HA/PTX3复合物结合以纯化该复合物，并附着在固定的支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物(即，流动相)通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与HABP结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后用能够从支持体洗脱rcHC-HA/PTX3复合物的溶液(例如，解离剂)洗涤支持体。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去解离剂。
在一些实施方案中，通过HABP亲和色谱法与使用针对rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分的抗体进行的免疫亲和色谱法的组合来对rcHC-HA/PTX3复合物进行纯化。
在一些实施方案中，本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分包含亲和标签(例如，PTX3或HC1与亲和标签的融合蛋白)。在一些实施方案中，引入rcHC-HA/PTX3复合物的一种或多种组分中的示例性亲和标签包括但不限于血凝素标签、聚组氨酸、myc标签、FLAG标签或谷胱甘肽-S-转移酶序列。在一些实施方案中，亲和标签的配体附着在固体支持体上。在一些实施方案中，使未纯化的rcHC-HA/PTX3复合物通过支持体。在某些情况下，rcHC-HA/PTX3复合物与配体结合。在一些实施方案中，洗涤(例如，用PBS)支持体以除去任何未结合的或松散结合的分子。在一些实施方案中，随后用能够从支持体洗脱本文公开的rcHC-HA/PTX3复合物的溶液洗涤支持体。在一些实施方案中，通过包括但不限于离子交换色谱法、透析、凝胶过滤色谱法、超滤或渗滤的方法从解离的rcHC-HA/PTX3复合物中除去洗脱剂。
在一些实施方案中，将PTX3、TSG-6和/或HC1与标记偶联。“标记”指直接或间接地与多肽偶联以便产生标记的多肽的可检测的化合物或组合物。在一些实施方案中，标记是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，催化可检测的底物化合物组成的化学变化。标记的非限制性实例包括荧光部分、染料、荧光标签、绿色荧光蛋白或萤光素酶。
评估nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3复合物的活性的方法
通过任何合适的方法(包括体外和体内方法)评估本文提供的nHC-HA/PTX3和rcHC-HA/PTX3复合物的性质。示例性的体外方法在本文中提供，并且包括但不限于，评估nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的促进巨噬细胞附着于固定化的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，抑制或减少巨噬细胞的聚集，促进嗜中性粒细胞的细胞凋亡、凋亡嗜中性粒细胞的巨噬细胞吞噬作用以及受刺激的巨噬细胞的M2极化的能力的细胞培养方法。在一些实施方案中，对用于试验的巨噬细胞进行刺激，例如通过暴露于LPS或IFN-γ。在一些实施方案中，在与nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触之后评估受刺激的巨噬细胞中的基因或蛋白质表达。在此类评估nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性的方法中，采用合适的对照进行比较。在一些实施方案中，对照缺乏采用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物进行的处理(即阴性对照)。
在一些实施方案中，将rcHC-HA/PTX3复合物的活性与天然HC-HA/PTX3复合物的活性进行比较。在一些实施方案中，从羊膜中分离天然HC-HA/PTX3。
在一些实施方案中，通过PCR、RT-PCR、Northern印迹法(Northern blotting)、Western印迹法(western blotting)、斑点印迹法、免疫组织化学法、色谱法或检测蛋白质或核酸的其他合适的方法来评估经处理的巨噬细胞中的基因表达。在一些实施方案中，评估IL-10、IL-12、IL23、LIGHT和SPHK1的表达水平。
用于评估本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性的示例性体外方法包括但不限于各种疾病和病况的动物模型。针对疾病和病况的多种动物模型是可获得的且本领域中公知的，包括但不限于，针对各种炎症和自身免疫性疾病和病症，包括但不限于：缺血再灌注损伤、1型和2型糖尿病、炎性疾病、胶原诱导的关节炎、风湿性关节炎、抗原诱导的自身免疫性疾病，例如胶原诱导的关节炎和髓鞘肽(myelin peptide)诱导的实验性过敏性脑脊髓炎、炎性肠病(IBD)/溃疡性结肠炎、多发性硬化、手术诱导的骨关节炎和肾炎、银屑病、炎性皮肤病、LPS诱导的内毒素休克、LPS诱导的肺损伤、过敏性鼻炎、肝损伤、慢性应激、哮喘的动物模型(例如，啮齿类动物和灵长类动物模型)以及针对各种癌症的异种移植和同种异体移植模型。
在一些实施方案中，动物模型是炎症，诸如慢性移植物抗宿主病(cGVHD)、HSV1诱导的坏死性基质角膜炎或高风险角膜移植的啮齿类动物模型。在一些实施方案中，通过测定T细胞的增殖和活化以及免疫细胞因子如IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的产生来评估通过进行nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3处理引起的炎症的减少。在一些实施方案中，动物模型是瘢痕形成，诸如准分子激光辅助屈光性角膜切削术(PRK)的啮齿类动物模型。在本文提供的实施例中提供了用于此类动物模型的示例性方法。
在一些实施方案中，动物模型是包含一个或多个引起疾病或病症的遗传修饰的炎性和自身免疫性疾病和病症的遗传模型。在一些实施方案中，此类模型从商业来源获得。在一些实施方案中，将本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用于特定疾病或病况的动物模型，并评估rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少该疾病或病况的一种或多种症状的能力。
药物组合物
在某些实施方案中，本文所公开了包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在某些实施方案中，本文所公开了包含通过本文所提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在一些实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括便于将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物加工成适合于制药用途的制剂的赋形剂和助剂)以常规的方式配制药物组合物。适当的制剂依赖于选择的给药途径。任何公知的技术、载体和赋形剂均可作为如本领域所理解的合适的技术、载体和赋形剂。
在某些实施方案中，本文所公开了包含本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物还包含佐剂、赋形剂、防腐剂、用于延迟吸收的药剂、填充剂、粘合剂、吸附剂、缓冲剂和/或增溶剂。被配制成包含本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的示例性的药物组合物包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒剂、粉剂、软膏、片剂、胶囊剂、丸剂或气雾剂。
剂型
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为水性悬浮液进行施用。在一些实施方案中，水性悬浮液包含水、林格溶液和/或等渗氯化钠溶液。在一些实施方案中，水性悬浮液包含甜味剂或调味剂、着色物质或染料，以及若需要时的乳化剂或悬浮剂，并随同包含稀释剂水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合。在一些实施方案中，水性悬浮液包含悬浮剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和/或阿拉伯胶。在一些实施方案中，水性悬浮液包含分散剂或润湿剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七氧乙烯鲸蜡醇(heptadecaethylene-oxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一些实施方案中，水性悬浮液包含防腐剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。在一些实施方案中，水性悬浮液包含甜味剂。在一些实施方案中，水性悬浮液包含蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为油状悬浮液施用。在一些实施方案中，通过将活性成分悬浮在植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配制油状悬浮液。在一些实施方案中，油状悬浮液包含增稠剂(例如，蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇)。在一些实施方案中，油状悬浮液包含甜味剂(例如，上述列举的那些)。在一些实施方案中，油状悬浮液包含抗氧化剂(例如，丁基化羟基苯甲醚或α-生育酚)。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于肠胃外注射(例如，通过注射或输注，包括动脉内、心脏内、皮内、十二指肠内、髓内、肌肉内、骨内、腹膜内、鞘内(intrathecal)、血管内、静脉内、玻璃体内、硬膜外和/或皮下)。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为无菌溶液、悬浮液或乳液施用。
在一些实施方案中，用于肠胃外给药的制剂包括本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的水性和/或非水性(油状)无菌注射溶液(其在一些实施方案中，含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或使制剂与预期受体的血液等渗的溶质)；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液(其在一些实施方案中，包括悬浮剂和/或增稠剂)。在一些实施方案中，用于肠胃外给药的制剂包括合适的稳定剂或提高本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为水包油微乳液(其中活性成分溶解于油相中)施用。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物溶解于脂肪油(例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯))或脂质体中。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物溶解于大豆油和/或卵磷脂的混合物中。在一些实施方案中，将油溶液引入水和甘油的混合物中并进行处理以形成微乳液。
在一些实施方案中，配置用于肠胃外给药的组合物作为单次团注施用。在一些实施方案中，配制用于肠胃外给药的组合物通过连续静脉内递送装置(例如，Deltec CADD-PLUSTM 5400型静脉泵)进行施用。
在一些实施方案中，用于注射的制剂以单位剂量形式呈现，例如，在安瓿瓶中或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。在一些实施方案中，将用于注射的制剂以粉末形式或在冷冻干燥(冻干)条件下储存，从而仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(例如，盐水或无菌无热原水)。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于局部施用。局部制剂包括但不限于，软膏、乳膏、洗剂、溶液、糊剂、凝胶、膜、棒、脂质体、纳米颗粒。在一些实施方案中，通过使用贴剂、绷带或创伤敷料施用局部制剂。
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物配制成固体、交联的凝胶或脂质体形式的组合物。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物配制成不溶性的交联的水凝胶。
在一些实施方案中，局部制剂包含胶凝(或增稠)剂。合适的胶凝剂包括但不限于，纤维素、纤维素衍生物、纤维素醚(例如，羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素)、瓜耳胶、黄原胶、刺槐豆胶、藻酸盐(例如、海藻酸)、硅酸盐、淀粉、黄蓍胶、聚羧乙烯(carboxyvinyl polymer)、角叉菜胶、石蜡、矿脂、阿拉伯胶(阿拉伯树胶)、琼脂、硅酸铝镁、海藻酸钠、硬脂酸钠、墨角藻、膨润土、卡波姆(carbomer)、角叉菜胶、卡波普(carbopol)、黄原胶、纤维素、微晶纤维素(MCC)、角豆胶、角叉菜(chondrus)、葡萄糖、红藻胶(furcellaran)、明胶、印度树胶(ghatti gum)、瓜尔胶、锂蒙脱石、乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨糖醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、刺梧桐树胶(sterculia gum)、聚乙二醇(例如，PEG 200-4500)、黄蓍胶、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、氧化聚明胶、果胶、聚明胶肽、聚维酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物(PVM/MA)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙酯)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)或它们的组合。
在一些实施方案中，本文所公开的局部制剂包含软化剂。软化剂包括但不限于，蓖麻油酯、可可脂酯、红花油酯、棉籽油酯、玉米油酯、橄榄油酯、鳕鱼肝油酯、杏仁油酯、鳄梨油酯、棕榈油酯、芝麻油酯、角鲨烯酯、kikui油酯、大豆油酯、乙酰化单酸甘油酯、乙氧基化单硬脂酸甘油酯、月桂酸己醇酯、异月桂酸己醇酯、异己棕榈酸酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸甲酯、油酸癸酯、异癸基油酸酯、十六烷基硬脂酸癸酯、异丙基异硬脂酸酯、甲基异硬脂酸酯、二异丙基己二醛酯、己二酸二异己酯、二己基癸基己二酸酯、癸二酸二异丙酯、乳酸十二烷基酯、乳酸十四烷基酯和乳酸十六烷基酯、肉豆蔻酸油醇、硬脂酸油醇和油酸油酯、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、花生酸、山萮酸、芥酸、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、十六醇、硬脂醇、异硬脂醇、羟基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山萮醇、瓢儿菜醇、2-辛基十二烷基醇、羊毛脂和羊毛脂衍生物、蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、硬脂酸硬脂酯、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、卵磷脂和胆固醇。
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与一种或多种天然聚合物配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与天然聚合物(是纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素)配制。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物配制与来自天然聚合物配制的聚合物凝胶。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与来自天然聚合物配制的聚合物凝胶配制，该聚合物是例如但不限于纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素及其组合。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与交联聚合物配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联聚合物配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联聚合物和交联聚合物配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与交联的乙酰透明质酸凝胶配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与不溶性的交联的HA凝胶配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与非交联的乙酰透明质酸凝胶配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与胶原基质配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与纤维蛋白基质配制。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与纤维蛋白/胶原基质配制。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物被配制用于施用至眼或与其相关的组织。适于施用药至眼的制剂包括但不限于溶液、悬浮液(例如，水性悬浮液)、软膏、凝胶，乳膏、脂质体、囊泡、药质体、纳米颗粒或其组合。在一些实施方案中，用于局部施用至眼的本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物喷雾、洗涤或它们的组合地施用。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物通过可注射的贮库制剂施用至眼。
如本文所用，“贮库制剂”是植入到眼中或与其相关的组织(例如，巩膜)(例如皮下、肌肉内、玻璃体内或结膜下之内)中的控释制剂。在一些实施方案中，通过在可生物降解的聚合物内形成本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的微胶囊包封基质(也称为微胶囊基质)而配制贮库制剂。在一些实施方案中，通过将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包埋在脂质体或微乳剂中而配制贮库制剂。
用于施用至眼的制剂具有眼科上可接受的渗涨度(tonicity)。在某些情况下，泪液具有相当于0.9％氯化钠溶液的等渗值。在一些实施方案中，约0.6％至约1.8％氯化钠等值的等渗值适合于局部施用至眼。在一些实施方案中，本文所公开的用于施用至眼的制剂具有约200至约600mOsm/L的摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，本文所公开的用于施用至眼的制剂是低渗的，因此需要添加任何合适的以达到适当的渗涨度范围。眼科上可接受的调节渗涨度的物质包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
用于施用至眼的制剂具有眼科上可接受的澄清度。眼科上可接受的澄清剂的实例包括但不限于，聚山梨醇20、聚山梨醇80或它们的组合。
在一些实施方案中，用于施用至眼的制剂包含眼科上可接受的粘度增强剂。在一些实施方案中，粘度增强剂增加本文公开的制剂保留在眼中的时间。在一些实施方案中，增加本文所公开的制剂保留在眼中的时间允许更好的药物吸收和效果。粘膜粘附聚合物的非限制性实例包括羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基异丁烯酸)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。
在一些实施方案中，将用于施用至眼的制剂施用或递送至眼的后段(例如，视网膜、脉络膜、玻璃体和视神经)。在一些实施方案中，本文所公开的用于施用至眼、用于递送至眼的后段的局部制剂包含增溶剂，例如，葡聚糖硫酸酯和/或环糊精。用于一些实施方案中的葡聚糖硫酸酯包括但不限于，葡聚糖硫酸酯、环糊精硫酸酯和β-1,3-葡聚糖硫酸酯(天然的和它们的衍生物)，或者暂时结合并且保留在组织中的任何化合物，包含成纤维细胞生长因子(FGF)，其提高了药物的稳定性和/或溶解性，和/或提高本文所公开的用于施用至眼的局部制剂的渗透和眼部吸收。用于在一些实施方案中作为增溶剂使用的环糊精衍生物包括但不限于，α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基β-环糊精、羟丙基γ-环糊精、羟丙基β-环糊精、硫酸化α-环糊精、硫酸化β-环糊精、磺丁基醚β-环糊精。
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物配制用于直肠或阴道给药。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为栓剂施用。在一些实施方案中，通过将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与合适的非刺激性赋形剂(其在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，并且因此在直肠中将融化以释放药物)混合而制备适合于直肠给药的组合物。在一些实施方案中，通过将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇的混合物或聚乙二醇的脂肪酸酯混合而制备适合于直肠给药的组合物。
在某些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物任选地与控释颗粒、脂质复合物、脂质体、纳米颗粒、微球、微粒、纳米胶囊或增强或促进局部递送至皮肤的其他药剂掺合。在美国专利第3,737,337号中描述了用于制备药物制剂的常规的微胶囊封装处理的实例，通过引用该说明书并入本文。
剂量
施用的药物组合物的量部分地取决于被治疗的个体。在药物组合物被施用给人类受试者的情况下，每日剂量通常由处方医生决定，其中剂量一般根据年龄、性别、饮食、体重、一般健康状况和个体响应、个体症状的严重性、被治疗的精确的疾病或病症、被治疗的疾病或病症的严重性、给药时间、给药途径、组合物的处置、排泄速率、药物组合以及处方医生的判断而变化。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的剂量约0.001至约1000mg/kg体重/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.5至约50mg/kg/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.001至约7g/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.01至约7g/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.02至约5g/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.05至约2.5g/天。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量为约0.1至约1g/天。
在一些实施方案中，在疾病或病症的发生之前、期间或之后施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，在疾病或病症的发生之前、期间或之后施用联合治疗。在一些实施方案中，在疾病或病症的发生之前、期间或之后施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和联合治疗。在一些实施方案中，施用包含本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3组合物的时机不同。因此，在一些实例中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物作为预防药施用并且连续施用至倾向产生病症或疾病的受试者以防止疾病或病症的发生。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物在症状发作期间或症状发作后尽快施用至受试者。在一些实施方案中，在症状开始发作的前48小时内引入施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，优选在症状发作的前48小时内，更优选在症状发作的前6小时内，并且最优选在症状发作的3小时内。在一些实施方案中，初始施用是通过任何实用的途径，如，例如，静脉内注射、单次快速注射、约5分钟至约5小时的输液、丸剂、胶囊、透皮贴剂、口腔递送或其组合。优选在检测到或怀疑疾病或病症之后尽快施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，并且持续所需的治疗疾病的时间长度，如，例如，约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗的持续时间由于每个受试者而不同，并且使用已知的标准确定持续时间。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物或包含复合物的制剂施用至少2周，优选约1个月至约5年，更优选约1个月至约3年。
在一些实施方案中，以单次剂量，一日一次，施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，以多次剂量，每日多于一次，施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，每日两次施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，每日三次施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，每日四次施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，每日超过四次施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，在一些实施方案中，以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症的症状的量将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至已经罹患疾病或病症的个体。用于这一用途有效的量取决于疾病或病症严重性和病程、先前的治疗、个体的健康状况、体重和对药物的反应，以及治疗医生的判断。
在预防性应用中，在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至处于特定疾病的风险中的个体。这样的量被定义为是“预防地有效的量或剂量”。在这样的用途中，精确量还取决于个体的健康状况、体重和个体的其他物理参数。
在个体的病情没有好转的情况下，基于医生的判断，长期施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，即，持续延长的时间周期，包括贯穿个体生命的整个持续时间，以改善或以其他方式控制或限制个体的疾病或病症的症状。
在一些实施方案中，在个体的状况确实好转的情况下，基于医生的判断，连续施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物或者暂时减少施用的药物的剂量或暂停一定的时间长度(即“休药期”)。在一些实施方案中，休药期的长度在2天至1年之间变化，仅举例来说，包括，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在一些实施方案中，休药期期间的剂量减少10％-100％之间，仅通过举例的方式，包括，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦发生个体的病症的改善，如有需要则施用维持剂量。在一些实施方案中，随后，施用的剂量或频率或这两者均作为症状的函数降低至保持改善的疾病、失调或病症的水平。在一些实施方案中，一旦出现任何复发症状，个体需要长期的间歇治疗。
在一些实施方案中，本文所公开的药物组合物是以适于精确剂量的单次给药的单位剂量。在单位剂型中，制剂被分成包含适量的本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量是以包含分离的量的制剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊，以及在小瓶或安瓿瓶中的粉剂。在一些实施方案中，水性悬浮液组合物被包装在单次剂量的不可再封闭容器中。在一些实施方案中，使用多次剂量的可再封闭容器，在这种情况下，在组合物中包括防腐剂是典型的。在一些实施方案中，用于肠胃外注射的制剂以单位剂量形式存在，其中单位剂量形式包括但不限于安瓿瓶，或者在多剂量容器中，添加防腐剂。
适合于本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的每日剂量是，例如，约0.01至2.5mg/kg每体重。在较大哺乳动物(包括但不限于人)中所指示的每日剂量，是约0.5mg至约100mg的范围，方便地以分份剂量施用，包括但不限于一天最多四次或以延长释放的形式。用于口服给药的合适的单位剂量形式包括约1至50mg活性成分。上述范围仅是建议性的，由于关于个体治疗方案的变量的数目庞大，并且来自这些推荐值的相当大的偏移的情况并不少见。在一些实施方案中，剂量取决于许多变量而变化，不限于所用的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的活性、待治疗的疾病或病症、给药的方式、个体受试者的要求、被治疗的疾病或病症的严重性和医师的判断。
在一些实施方案中，通过在细胞培养物或实验动物中进行标准药学程序确定这样的治疗方案的毒性和治疗功效，包括但不限于，LD50(在群体中50％的致死剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的测定。在一些实施方案中，有毒的和治疗的效果之间的剂量比率是治疗指数，它可表示为LD50和ED50之间的比率。表现出优选高治疗指数的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，获得自细胞培养测定和动物研究的数据被用于配制在人中使用的剂量范围。本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的剂量优选在包括具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。在一些实施方案中，在此范围内变化的剂量取决于采用的剂型和利用的给药途径。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物被包装成包含包装材料、可有效地预防和/或治疗疾病或病症的药物组合物、以及指示药物组合物用于治疗疾病或病症的标签的制造物品。在一些实施方案中，药物组合物被包装在包含单次剂量或多次剂量的药物组合物的量的单位剂型中。在一些实施方案中，包装的组合物包含在施用之前重新配置(例如，用水或盐水)的冻干粉末的药物组合物。
医疗装置和生物材料组合物
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装于表面上，或配制成用于植入式医疗装置的涂层。用于将乙酰透明质酸共价附接到表面(诸如但不限于，金属、聚合物、陶瓷、二氧化硅和复合材料表面)的方法是本领域众所周知的，并且在一些实施方案中，其与用于本文提供将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物装配在这些表面上的方法结合使用(参见例如，美国专利第5,356,433号、第5,336,518号、第4,613,665号、第4,810,784号、第5,037,677号、第8,093,365号)。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在植入式医疗装置或其部分的表面上。在一些实施方案中，根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物是纯化的，然后直接附接在植入式医疗装置或其部分的表面上。在一些实施方案中，根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物是纯化的，然后配制成用于附接到医疗装置或其部分上的涂层。在一些实施方案中，将该涂层直接施加到表面上或施加到预处理或涂覆的表面，其中所述预处理或涂覆被设计成帮助该涂层向基底的粘附。在一些实施方案中，根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物是纯化的，然后附接至已涂覆有能够促进nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接的物质的医疗装置或其部分上。例如，在一些实施方案中，医疗装置或其部分涂敷有粘合剂聚合物，其在其表面上提供用于共价附接nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的乙酰透明质酸的官能团。在一些实施方案中，将偶合剂，例如但不限于碳二亚胺，用于将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接在聚合物涂层上。在一些实施方案中，光学固定(photoimmobilization)用于将根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物共价附接至医疗装置或其部分。在一些实施方案中，使用间隔分子(spacer molecule)将根据本文提供的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至医疗装置或其部分上，该间隔分子包含光化学或热化学的反应性基团。
在一些实施方案中，通过例如浸涂将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的涂层制剂施加于基底。应用的其他方法包括但不限于喷雾、洗涤、气相沉积、刷涂、滚涂、帘覆、旋涂和本领域已知的其他方法。
示例性的植入式医疗装置包括但不限于，人工关节、矫形外科装置、骨植入体、接触镜、缝合线、手术缝合钉、手术夹、导管、血管成形术气囊、传感器、外科装置、电极、针、注射器、创口引流管、分流器、尿道插入物、金属或塑料植入体、心脏瓣膜、人造器官、有缝带环、瓣膜成形环、导丝、克氏针或德纳姆销、支架、支架移植物、血管移植物、起搏器、丸剂、晶片、医用导管、输液套管、植入式除颤器、神经刺激器、葡萄糖传感器、脑脊液分流器、植入式药泵、脊柱保持架、人工脊椎盘、眼植入体、耳蜗植入体、乳房植入体、髓核的替代装置、耳管、眼内晶状体、药物递送系统、微粒、纳米粒子和微胶囊。
在具体的实施方案中，植入式医疗装置是包含本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的植入体或假体。在具体的实施方案中，假体是人工关节。在一些实施方案中，假体是人造髋关节、人造膝、人造盂肱关节、人造踝。
在具体实施方案中，植入体是支架。在具体的实施方案中，植入体是冠状动脉支架、输尿管支架、尿道支架、前列腺支架、骨支架或食管支架。在具体的实施方案中，植入体是骨植入体，诸如但不限于，骨整合型植入体或颅面假体(例如，人造耳、眼眶假体、鼻假体)。
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在用于将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物递送至受试者的微粒或纳米颗粒上(参见，例如，WO 03/015755和US2004/0241248)。
在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物附接至、组装在、或者作为表面上的涂层或者任何本文提供的或本领域已知的此类植入式医疗设备的部分上而提供。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物从涂层洗脱并在植入后进入周围组织。
在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接组装在支架、微粒、用于递送生物材料的微胶囊或微载体上，诸如干细胞或胰岛素生成细胞。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物直接附接至微胶囊上或直接组装在微胶囊上。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与用于形成微胶囊的材料组合，并且产生包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的微胶囊。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于涂覆微胶囊的内表面。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于涂覆微胶囊的外表面。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于涂覆微胶囊的内表面和外表面。
用于包封细胞的示例性材料包括但不限于热固性水凝胶，如琼脂糖、藻酸盐和人造聚合物，如聚(NiPAAm-共-AAC)、聚(乙二醇)(PEG)和PEG衍生物如PEG二丙烯酸酯和寡(聚(乙二醇))富马酸。在一些实施方案中用于干细胞的培养和微胶囊封装的方法是本领域已知的，其被用于产生包含本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的微胶囊。
在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料。在一些实施方案中，细胞或多个细胞是干细胞，诸如但不限于，间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞或多个细胞是分化的细胞，诸如，但不限于，胰岛素生成细胞。在一些实施方案中，细胞或多个细胞是自体细胞(即，来自或衍生自细胞的受者的细胞)。在一些实施方案中，细胞或多个细胞是异体细胞(即，不是来自或衍生自细胞的受者的细胞)。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料并且微胶囊的内表面涂覆有本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料并且微胶囊的外表面涂覆有本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，微胶囊包含细胞、多个细胞或其他生物材料并且微胶囊的外表面和内表面均涂覆有本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，施用微胶囊以治疗疾病或病症。在本文其他地方描述了示例性的疾病和病症以及可以施用微胶囊的治疗方法，并且包括但不限于炎性和免疫相关疾病。
治疗方法
在某些实施方案中，本文所公开了治疗有需要的个体的方法，其包括向个体施用本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在某些实施方案中，本文所公开了治疗有需要的个体的方法，其包括向个体施用通过本文描述的方法产生的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。以下为非限制性的治疗方法的实例，其包括施用本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于抑制以下中的至少一项：瘢痕形成、炎症、导致自身免疫疾病或免疫排斥的免疫反应、粘附、血管发生以及要求细胞或组织再生的病症。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于促进创伤愈合。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于促进干细胞扩增。在一些实施方案中，将本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于促进组织再生。
在一些实施方案中，治疗有需要的个体的方法包括通过任何合适的方法将本文描述nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至该个体。在一些实施方案中，治疗有需要的个体的方法包括通过任何合适的途径将本文描述nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至该个体。用于施用的合适的方法将取决于待治疗的疾病或病症。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物局部施用至治疗部位。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物全身施用。施用本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的示例性方法包括但不限于肠胃外、肠内、皮下、经皮、透皮、皮内、静脉内、局部、吸入或植入。
瘢痕形成
在某些实施方案中，本文描述了预防、减少或逆转有需要的受试者中的瘢痕形成的方法，该方法包括向受试者施用包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物。
如本文所用，“瘢痕形成”是指瘢痕的形成。在一个方面，所述瘢痕是肥厚性瘢痕或瘢痕瘤瘢痕或由痤疮引起的瘢痕。如本文所用，“瘢痕”是由胶原的产生过剩引起的纤维组织区域。在某些情况下，创伤愈合包括成纤维细胞向损伤部位的迁移。在某些情况下，成纤维细胞沉积胶原。在某些情况下，成纤维细胞在创伤部位沉积过量胶原，产生瘢痕。
在某些情况下，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物防止或抑制TGF-β信号传导。在某些情况下，TGF-β通过刺激纤维素增生和胶原沉积物和抑制细胞外基质降解(通过上调蛋白酶抑制剂的合成)来调节细胞外基质。在某些情况下，预防或抑制TGF-β的表达导致预防瘢痕强度降低。在一些实施方案中，施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物防止或减少瘢痕形成。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或防止成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的能力。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物逆转肌成纤维细胞向成纤维细胞的分化。
在一些实施方案中，本文公开的方法用于预防、减轻或逆转瘢痕的形成。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患有导致瘢痕形成(例如，皮炎瘢痕、瘢痕疙瘩、挛缩瘢痕、肥厚性瘢痕或由痤疮引起的瘢痕)的病症的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在创伤之前或之后向有需要的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括手术之前或之后向有需要的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
在一些实施方案中，本文公开的方法用于预防或减轻眼睛或其周围组织上的瘢痕形成。在一些实施方案中，本文公开的方法包括向患有由眼或周围组织(例如，早产儿视网膜病变)的瘢痕形成引起的病症的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在眼或周围组织的创伤之前或之后向有需要的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在眼或周围组织的手术之前或之后向有需要的个体施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。
炎症
在某些实施方案中，本文描述了预防或减少有需要的受试者中的炎症的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物。如本文所用，“炎症”意指从血浆和/或白细胞(例如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞和嗜中性粒细胞)迁移至感染或创伤(例如，钝力创伤、穿透性创伤或手术)部位导致的生理反应。
在某些情况下，白细胞与抗原接触后分泌细胞因子。如本文所用，“细胞因子”是信号传导蛋白质或糖蛋白质。在某些情况下，细胞因子与结合至细胞表面受体。在某些情况下，细胞因子诱导白细胞至感染部位的趋化性。在某些情况下，白细胞上的细胞表面受体检测细胞因子的化学梯度。在某些情况下，白细胞遵循至感染部位的梯度。在某些情况下，细胞因子与细胞表面受体的结合导致某些基因及其转录因子的上调或下调。在某些情况下，基因表达的变化导致细胞因子的产生、细胞因子产量的增加或细胞表面受体的存在的增加。
作为非限制性的实例，细胞因子包括白介素IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1(也称为CCL2)和TNF-α。白介素1以两种亚型存在于体内：IL-1α和IL-1β。在某些情况下，IL-1的存在增加了在内皮细胞上的粘附因子的表达。反过来，这能够使白细胞迁移至感染部位。在某些情况下，IL-8诱导白细胞的趋化性。在某些情况下，TNF-α诱导白细胞的趋化性。在某些情况下，MCP-1向组织损伤和感染部位募集白细胞。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制细胞因子的产生和/或活性。在某些情况下，细胞因子浓度的降低通过减少白细胞数目和/或白细胞向损伤部位迁移的速率来减少或预防炎症。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物诱导白细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或淋巴细胞)凋亡。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物降低活化的白细胞的数目或该白细胞被激活的速率。在某些情况下，白细胞的浓度的降低通过减少迁移到损伤部位的细胞数目(例如，通过凋亡促进此类细胞的死亡)减少或防止炎症。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制巨噬细胞向炎性表型(即在M1型)的极化。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物降低或抑制刺激巨噬细胞中的IL-12或IL-23的表达。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物促进刺激巨噬细胞向调节子或损伤愈合M2表型极化。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少受试者的炎症。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少由诱导受试者的炎症的病况或疾病引起的组织损伤。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有炎症的受试者。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有急性炎症的受试者。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有慢性炎症的受试者。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有炎性病症的受试者。在一些实施方案中，炎性病症是巨噬细胞介导的炎性病症。在一些实施方案中，炎性病症是T细胞介导的炎性病症。在一些实施方案中，炎性病症是Th-17介导的免疫病症。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有急性炎症反应的受试者。在一些实施方案中，所述急性炎症反应是由例如，变态反应、脓毒症、内毒素休克或局部缺血，例如但不限于心肌梗死和中风引起。在一些实施方案中，所述急性炎症反应是由细菌感染、原生动物感染、原生动物感染、病毒感染、真菌感染或其组合引起。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少急性炎症。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少由急性炎症引起的组织损伤。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少由局部缺血，包括心肌梗死和中风引起的组织再灌注损伤。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有慢性炎症的受试者，该慢性炎症通过适应性免疫与淋巴细胞的激活相关。在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有Th1应答的受试者。在一些实施方案中，Th1应答导致生物移植的免疫排斥。在一些实施方案中，移植是异体移植。在一些实施方案中，移植物是自体移植。在一些实施方案中，炎性病症是移植物抗宿主病或组织移植排斥。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少受试者的慢性炎症。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有慢性炎症的受试者，该慢性炎症与炎性病症有关的Th17细胞免疫应答相关。在一些实施方案中，炎性病症是自身免疫性疾病或白细胞缺陷。
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物施用至患有炎性病症的受试者，该炎性病症是急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、大疱性类天疱疮、南美锥虫病、慢性阻塞性肺疾病、腹腔疾病、皮肌炎、1型糖尿病、2型糖尿病、子宫内膜异位症、肺出血肾炎综合征、Graves病、格林-巴利综合征、桥本氏病、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、系统性红斑狼疮(SLE)、代谢综合征、多发性硬化症、重症肌无力、心肌炎、发作性睡病、肥胖、寻常型天疱疮、恶性贫血、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、精神分裂症、硬皮病、
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综合征、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿、过敏性鼻炎、前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、大肠癌、脑癌、转移性骨病、胰腺癌、淋巴瘤、鼻息肉、消化道肿瘤、溃疡性结肠炎、克罗恩病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流结肠炎、白塞氏综合征(
Figure GDA0003352411270000942
syndrome)、感染性肠炎、不确定性结肠炎、炎性肝病、缺血、心肌梗死、中风、内毒素休克、脓毒性休克、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、风湿性多肌痛、阿尔茨海默症、帕金森症、癫痫、AIDS痴呆、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、囊性纤维化、急性白细胞介导的肺损伤、远端直肠炎、韦格纳肉芽肿病、纤维肌痛、葡萄膜炎、结膜炎、银屑病、湿疹、皮炎、平滑肌增殖病症、脑膜炎、带状疱疹、脑炎、肾炎、结核病、视网膜炎、特应性皮炎、胰腺炎、牙周龈炎、凝固性坏死、液化性坏死、纤维素样坏死、新内膜增生或其组合。
在一些实施方案中，炎性病症是眼或周围组织的炎性病症。在一些实施方案中，炎性病症是结膜炎。在某些情况下，结膜炎由暴露致过敏原引起。在某些情况下，结膜炎由细菌感染引起。在一些实施方案中，炎性病症是角膜炎。如本文所用，“角膜炎”是以角膜的炎症为特征的病症。在一些实施方案中，炎性病症是角膜结膜炎(即，结膜炎和角膜炎的组合(即，角膜炎症))。在一些实施方案中，炎性病症是睑炎。如本文所用，“睑炎”是以眼睑边缘的炎症为特征的眼科疾病。在一些实施方案中，炎性病症是睑结膜炎(即，结膜炎和睑炎的组合(即，眼睑炎))。在一些实施方案中，炎性病症是巩膜炎。如本文所用，“巩膜炎”是以巩膜的炎症为特征的病症。在一些实施方案中，炎性病症是巩膜外层炎。如本文所用，“巩膜外层炎”是以充血和球结膜水肿为特征的巩膜外层的炎性病症。在一些实施方案中，炎性病症是葡萄膜炎。如本文所用，“葡萄膜炎”是以葡萄膜为特征的炎性病症。在一些实施方案中，病症是视网膜炎。如本文所用，“视网膜炎”是视网膜的炎性病症。在一些实施方案中，病症是脉络膜炎。如本文所用，“脉络膜炎”是葡萄膜，睫状体和脉络膜的炎性病症。
异常血管生成
在某些实施方案中，本文公开了预防或减少有此需要的受试者的血管生成的方法，该方法包括：向受试者施用包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物。如本文所用，“血管生成”指新血管的形成。在某些情况下，血管生成促进肿瘤的生长和转移。此外，在某些情况下，异常血管生成是湿性年龄相关性黄斑变性(wARMD)和糖尿病性增殖性视网膜病变的基础。在某些情况下，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物预防或减少血管生成。
在某些情况下，配体与VEGF受体-2(VEGFR-2)的结合启动酪氨酸激酶信号级联反应，该反应刺激不同地刺激血管渗透性(eNOS，产生NO)、增殖/存活(bFGF)、迁移(ICAM/VCAM/MMP)以及最终分化为成熟的血管的因子的产生。在某些情况下，在VEGFR-2与其配体结合后，内皮细胞形成类似毛细血管的管状结构。
如本文所用，“湿性年龄相关性黄斑变性”、“wARMD”或“湿性ARMD”指以来自脉络膜的血管的增殖为特征的眼部病症。在某些情况下，湿性ARMD由于黄斑下的血液和蛋白质渗漏而导致视力丧失。在某些情况下，如果不进行治疗，这些血管的出血、渗漏和瘢痕形成导致光感受器的不可逆性损伤以及快速的视力丧失。
如本文所用，“糖尿病性增殖性视网膜病变”指以血管壁机能不全为特征的眼部病症。在某些情况下，视网膜中氧的缺乏导致沿视网膜及在玻璃体液中的血管生成。在某些情况下，新血管出血、遮蔽视力并破坏视网膜。
在某些情况下，毛细血管的增殖为肿瘤提供营养物从而使肿瘤扩增。在某些情况下，毛细血管的增殖能够快速地除去细胞废物从而能够使肿瘤生长。在某些情况下，血管生成促进转移。在某些情况下，毛细血管的增殖增加了癌细胞将能够进入血管并因此在新的位点生成新的肿瘤的可能性。
在一些实施方案中，使用本文所描述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物进行治疗的示例性癌症类型包括但不限于，急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’sLymphoma)、类癌瘤、癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性病症、结肠癌、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤眼、眼癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(颅外)、生殖细胞肿瘤(性腺外)、生殖细胞肿瘤(卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视通路神经胶质瘤(Visual Pathway Glioma)、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(急性淋巴细胞)、白血病(急性髓系白血病)、白血病(慢性淋巴细胞性白血病)、白血病(慢性粒细胞白血病)、嘴唇和口腔癌、肝癌、肺癌(非小细胞)、肺癌(小细胞)、淋巴瘤(皮肤T细胞)、淋巴瘤(非霍奇金型)、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、Markel细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/血浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓细胞性白血病(Myelogenous Leukemia)、髓样白血病(MyeloidLeukemia)、骨髓增殖性病症、鼻腔及鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原发性神经外胚层瘤(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors)、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤(卡波西氏)、肉瘤(子宫)、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌(Merkel细胞)、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃(胃部)癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、妊娠、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃氏巨球蛋白血症(
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Macroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms’Tumor)。
创伤修复和组织再生
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作创伤覆盖物或用于促进创伤修复。在一些实施方案中，组织由于损伤(例如，烧伤；手术切口；由感染、外伤或毒素而引起的坏死区域；裂伤)而被损坏、受损或缺失。在一些实施方案中，组织由于烧伤而被损坏、受损或缺失。在一些实施方案中，组织由于创伤(例如，切口、裂伤、擦伤)而被损坏、受损或缺失。在一些实施方案中，组织由于坏死而被损坏、受损或缺失。在一些实施方案中，组织由于溃疡而被损坏、受损或缺失。
烧伤
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物应用于烧伤。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物应用于一度烧伤。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物应用于二度烧伤。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物应用于三度烧伤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于烧伤部位上之前施用于基底。
创伤
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于皮肤的创伤(例如，切口、裂伤、擦伤、溃疡、穿刺(puncture)、渗透)。在一些实施方案中，所述创伤是缺血性创伤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于创伤上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗创伤。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于器官(例如，皮肤、脑、胃、肾、肝、肠、肺、膀胱、气管、食道、阴道、输尿管和血管壁)的切口。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于手术切口。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于结肠切除术的部位。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于胃切除术的部位。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于乳腺手术(例如，缩胸手术、丰胸手术和乳房切除术)的部位。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于创伤上之前施用于基底。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作皮肤的切口(例如，表皮、真皮和/或皮下组织的切口)上的覆盖物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于在痔疮手术之后修复或补充皮肤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于创伤上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗创伤。
坏死
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作坏死组织(例如，来自感染)的区域上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作坏死皮肤的区域上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于坏死组织的区域上。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于坏死组织上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗坏死组织。
溃疡
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作溃疡上的保护性覆盖物。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗溃疡。在一些实施方案中，所述溃疡是糖尿病性溃疡，例如糖尿病性足或腿溃疡。在一些实施方案中，所述溃疡是缺血性创伤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于溃疡上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗溃疡。在一些实施方案中，所述溃疡是未愈合的溃疡。例如，在一些实施方案中，所述未愈合的溃疡是皮肤上的创伤或溃疡，其已经持续约3-4周时间而未治愈。
在一些实施方案中，所述溃疡是足溃疡(例如，糖尿病性足溃疡或动脉供血不足性溃疡)。在一些实施方案中，治疗足溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；以及(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上。在一些实施方案中，治疗足溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上；以及(c)采用保护性屏障(例如，银电池敷料(silvercell dressing)、metipel、纱布或绷带)覆盖药物组合物。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于溃疡上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗溃疡。
在一些实施方案中，所述溃疡是静脉淤滞性(VS)溃疡。在一些实施方案中，治疗VS溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；以及(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上。在一些实施方案中，治疗VS溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上；以及(c)采用保护性屏障(例如，创伤薄纱、抗菌敷料(antimicrobialdressing)、纱布或绷带)覆盖药物组合物。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于创伤上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗溃疡。
在一些实施方案中，所述溃疡是角膜溃疡(即，溃疡性角膜炎)。在一些实施方案中，治疗角膜溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；以及(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上。在一些实施方案中，治疗角膜溃疡包括：(a)准备创伤(例如，清除创伤)；(b)将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物放置于创伤上；以及(c)采用保护性屏障(例如，接触镜或绷带)覆盖药物组合物。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在放置于创伤上之前施用于基底。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物治疗溃疡。
治疗性细胞疗法
在一些实施方案中，将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与细胞疗法组合使用。在一些实施方案中，将本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与治疗性细胞共同施用。治疗性细胞包括表现出用于治疗疾病或病症的治疗性质的任何细胞。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是异源表达一种或多种治疗性基因产物的重组细胞。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是移植的细胞。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述治疗性细胞是表达一种或多种干细胞标记物(例如，Oct-3/4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4)的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞疗法是干细胞移植。在一些实施方案中，施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物以促进移植和组织再生的干细胞的扩增。在一些实例中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于减少或抑制由干细胞移植引起的炎症、瘢痕形成和异常血管生成。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于通过取代饲养层而在体外扩增期间维持干细胞的特性。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于将分化的细胞重编为干细胞。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于体外扩增和培养干细胞以便随后移植入受试者。
在一些实施方案中，所述干细胞疗法是胚胎干细胞疗法。在一些实施方案中，所述干细胞疗法是成人干细胞疗法。在一些实施方案中，所述干细胞疗法是间充质干细胞疗法。在一些实施方案中，施用所述干细胞疗法以治疗疾病或病症，例如，但不限于，心血管疾病、癌症、糖尿病、脊髓损伤、神经变性疾病、阿尔茨海默症、帕金森症、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症(Amytrophic lateral sclerosis)、杜氏肌营养不良、肌肉损伤或营养不良、中风、烧伤、肺病、视网膜病、肾病、骨关节炎和风湿性关节炎。
在一些实施方案中，干细胞用于治疗糖尿病。1型糖尿病由胰腺的胰岛中的分泌胰岛素的β细胞的自身免疫所介导的破坏而引起。2型糖尿病由全身性胰岛素抵抗和胰腺β细胞的胰岛素分泌减少而引起。已在体外证明干细胞分化成产生胰岛素的细胞(参见，例如，Schuldiner等人.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:11307–11312；Guo等人.,(2009)Endocr Rev 30:214-227)。因此，在一些实施方案中，将干细胞，包括ESC和ASC及其衍生物，例如部分分化的干细胞，用于干细胞疗法中进行胰腺β细胞的再生。
在一些实施方案中，将用于治疗的干细胞或分化的细胞在微胶囊装置中进行封装。在一些实施方案中，微胶囊包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物共价附接至微胶囊。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物装配于微胶囊的表面，例如，内表面或外表面或者两者上。在一些实施方案中，将nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3配制为包覆微胶囊。在一些实施方案中，微胶囊包含孔以允许营养物通过细胞进入微胶囊和/或允许由封装的细胞分泌的蛋白质和分子(例如，胰岛素)流出微胶囊。在一些实施方案中，细胞首先固定在微载体(例如，用
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包覆的珠子)上，并随后封装在微胶囊内。用于封装细胞，如干细胞的方法是本领域已知的且描述于，例如，Serra等人,(2011)PLoS ONE 6(8):e23212中。在一些实施方案中，将封装细胞的任何方法与本文提供的方法结合使用。
在一些实施方案中，将异基因治疗性干细胞(例如，产生胰岛素的岛细胞)在微胶囊装置中进行封装以用于产生胰岛素。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物促进干细胞的扩增。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少了对用于糖尿病治疗的含有干细胞的微胶囊的炎性反应。在一些实施方案中，微胶囊包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制或减少了对含有干细胞的微胶囊的炎性反应。
软组织应用
在某些实施方案中，本文公开了本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于修复、重建、替代或补充受体的被损坏的、受损的或缺失的软组织(例如，肌腱)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物直接施用于组织。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与基于细胞或组织的疗法结合施用。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与单个细胞、多个细胞或组织混合，并作为基于组织的疗法的一部分施用。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于包覆单个细胞、多个细胞或组织并作为基于组织的疗法的一部分施用。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作软组织的切口上的覆盖物(例如，眼睑在不同的软组织层之间形成组织平面)。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底并随后用作软组织的切口上的覆盖物(例如，眼睑在不同的软组织层之间形成组织平面)。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作软组织的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物预防关节或肌腱修复中的粘连。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于肌腱或关节的修复(例如，肩袖修复、手部肌腱修复)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于增强肌腱或关节。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于预防愈合的肌腱与周围组织、肌腱或关节的粘连。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于预防肌腱上瘢痕组织的形成。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于增大足和踝的较小肌腱和韧带，包括胫后肌腱、腓骨肌腱、屈肌腱和伸肌腱，以及外踝复合体的韧带。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于加强膝周围的四头肌和髌腱的一期修复。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作关节置换中用于骨移植物的骨膜补片。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3用于在整个关节修正手术后增大不足的髋关节和膝关节的囊状组织。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于撕裂的肩袖的修复。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作肩袖肌或肌腱(例如，冈上肌腱)上的补片。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于重建肩袖肌或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于增大肩袖肌或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于加强肩袖肌或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于预防软组织与肩袖肌或肌腱(例如，冈上肌腱)的粘连。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于修复牙龈。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于修复牙龈退缩。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底并用作牙龈上的补片。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底并用作暴露的牙根表面上的补片。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于重建牙龈。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于增大牙龈。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于增强牙龈。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于预防软组织与牙龈的粘连。
在一些实施方案中，将包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作筋膜的切口或撕裂口的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作筋膜的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作筋膜的替代物或补充物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复疝(例如，用于修复筋膜)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复腹股沟疝。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复股疝。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复脐疝。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复切口疝。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复膈疝。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复腹膜后疝(Cooper’s hernia)、上腹疝、食管裂孔疝、Littre疝、腰疝、Maydl疝、闭孔疝、马裤疝(pantaloon hernia)、食管旁疝、脐旁疝、会阴疝、腹膜前疝(properitonealhernia)、Richter疝、滑动性疝、坐骨疝、半月线疝、运动疝、韦尔波疝(Velpeau hernia)或Amyand疝。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于修复椎间盘突出。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作椎间盘的切口或撕裂口上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作纤维变形环的切口或撕裂口上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作椎间盘的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作纤维环的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作椎间盘的替代物或补充物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作椎间盘的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作纤维环的替代物或补充物。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用在脑或一个(或所有)脑膜(即，硬脑膜、软脑膜和/或蛛网膜)的切口上。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作一个(或所有)脑膜(即，硬脑膜、软脑膜和/或蛛网膜)的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作一个(或所有)脑膜(即，硬脑膜、软脑膜和/或蛛网膜)的替代物。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用在肺或胸膜的切口上。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作胸膜的结构(或构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作胸膜的替代物。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用在鼓膜的切口上。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作鼓膜的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作鼓膜的替代物。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作心脏或心包的切口上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作心包的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作心包的替代物。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作腹膜的切口上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作腹膜的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作腹膜的替代物。
眼科应用
在某些实施方案中，本文公开了包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于修复、重建、替代或补充受体的被损坏的、受损的或缺失的眼组织的用途。
青光眼的治疗
如本文所用，“青光眼”指以视神经中视网膜神经节细胞损失为特征的病症。在某些情况下，青光眼部分或完全由前房(AC)中眼内压的增加而引起。眼内压根据眼的睫状突产生的液体眼房水以及眼房水通过小梁网的排出而变化。
青光眼引流装置(Glaucoma Drainage Device，GDD)是植入眼睛中以通过提供旁路途径用于眼房水排出来减轻眼内压的医疗装置。GDD管如果不进行覆盖，将腐蚀并使眼睛易受眼内感染的影响。因此，GDD管需要进行覆盖。目前，用于覆盖GDD管的补片由心包膜、巩膜和角膜制成。这些补片为约400-550微米厚。这些薄的补片导致它们在2年中熔化了25％，从而有可能使分流管重新暴露。
在一些实施方案中，将本文公开的包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于覆盖GDD管。在一些实施方案中，基底/nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物为300-600微米厚。在一些实施方案中，基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物并没有在2年中熔化25％。
眼部溃疡的治疗
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于覆盖眼腈的持续性上皮缺陷和/或溃疡。
在一些实施方案中，使用外科海绵清除溃疡的基底，并除去邻近溃疡边缘的粘着性差的上皮(例如，以得到眼睛中上皮粘着性变得很大的部分)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物转移至受体眼睛。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物随后通过缝合线(例如，间断的10-0尼龙缝合线或连续的10-0尼龙缝合线)固定至眼睛并将缝合线结埋藏。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物通过使用纤维蛋白胶固定至眼睛。在一些实施方案中，在基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物或整个眼睛(例如，接触镜)上施加保护层。在一些实施方案中，基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物进一步包括抗生素(例如，新霉素、硫酸多粘菌素b和地塞米松)。
结膜、巩膜、眼睑和眶缘表面的重建
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用于结膜、巩膜、眼睑和眶缘表面的重建。在一些实施方案中，结膜表面的损伤由睑球粘连细胞溶解；肿瘤、病变和/或瘢痕组织的手术移除；准分子激光屈光性角膜切削术和治疗性角膜切削术或它们的组合引起。
冠状动脉应用
在某些实施方案中，本文公开了包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于修复、重建、替代或补充受体的被损坏的、受损的或缺失的冠状动脉组织的用途。
缺血再灌注损伤的预防
本文公开了包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于抑制或减少由缺血引起的急性炎症(例如心肌梗死或中风)而导致的组织损伤的用途。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于患有缺血病况(例如但不限于，心肌梗死或中风)的受试者。
冠状动脉旁路
本文公开了包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于冠状动脉旁路手术的用途。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物移植到冠状动脉上从而绕过以动脉粥样硬化为特征的动脉部分。
心脏瓣膜
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物施用在心脏瓣膜上。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作心脏瓣膜的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作心脏瓣膜的替代物。
静脉和动脉
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物施用于静脉或动脉。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作静脉或动脉的结构(构造)支持体。
神经应用
在某些实施方案中，本文公开了包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于修复、重建、替代或补充受体的被损坏的、受损的或缺失的神经组织的用途。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作神经(例如，末梢神经)上的覆盖物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作神经移植物、神经转移物或修复的神经上的覆盖物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作神经(例如，末梢神经)的切口上的覆盖物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作神经(例如，末梢神经)的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物预防神经修复中的粘连。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作受损伤神经的非压缩包装(non-constricting encasement)。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物预防或最小化瘢痕的形成、神经的封装、慢性压缩、束缚和神经卡压。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物预防或最小化神经瘤的形成。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物预防或最小化神经修复期间出现的内源性生长因子(神经生长因子)的迁移。
脊柱应用
在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在脊柱手术中的用途。
在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在椎板切除术中使用。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后的硬膜外纤维化和/或瘢痕粘连。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在脊柱手术(例如，椎板切除术)后植入硬脑膜和上覆组织之间。在一些实施方案中，在脊柱手术(例如，椎板切除术)后在硬脑膜和上覆组织之间植入包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物，减少或预防成纤维细胞迁移至硬脑膜以及硬脑膜上的胶原沉积。
在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后增殖性瘢痕的生长。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防手术后(例如，椎板切除术后)硬膜外/硬膜外/神经周围的瘢痕的生长。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后增殖性瘢痕的生长。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防椎板切除术后膜的生长。
在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后硬脑膜外压缩或硬脑膜束缚的发展。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后束缚的神经根的生长。在一些实施方案中，包含本文所述的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后蛛网膜炎的发展。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物进一步包括颗粒骨组织。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物并包含颗粒骨组织的药物组合物在脊柱融合过程中使用。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物并包含颗粒骨组织的药物组合物植入邻近的椎骨之间。在一些实施方案中，在两个邻近的椎骨之间植入包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物并包含颗粒骨组织的药物组合物促进了椎骨的融合。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作硬脑膜的切口上的保护性移植物。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作硬脑膜的结构(构造)支持体。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于基底，并将基底/nHC-HA/PTX3或基底/rcHC-HA/PTX3复合物用作硬脑膜的替代物。
nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的多方面应用
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于补片或创伤敷料。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作皮肤填充剂。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注入皮下面部组织。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物在面部的皱纹和老化线(例如，鼻唇沟纹、嘴角沟纹、眼角鱼尾纹和额头纹)下方注入。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于丰唇。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注入唇部。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗关节炎(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、脓毒性关节炎、强制性脊柱炎、椎关节强硬)。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注入患有关节炎的关节(例如，膝)。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗脚部关节炎。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗第一跖指(MTP)关节(例如，拇指僵化)的关节炎。在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物施用于背唇切除术后的MTP关节。在一些实施方案中，施用包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物减少了一种或多种与拇指僵化或背唇切除术过程相关的不良症状(例如，瘢痕形成、关节僵直、肿胀、炎症和疼痛)。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗一种或多种与骨刺相关的症状(例如，瘢痕形成、关节僵直、肿胀、炎症和疼痛)。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于抑制有此需要的个体的骨吸收。在一些实施方案中，所述个体患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨退化、佩吉特病(Paget’s disease)或骨肿瘤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注入关节中。在一些实施方案中，使包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与骨接触(例如，通过使用创伤敷料或绷带)。在一些实施方案中，包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物包覆骨支架、骨植入体或骨假体(例如，骨整合型植入体)。如本文所用，“骨整合型植入体”意指包含成骨细胞和支撑结缔组织迁移进入的孔的三维植入体。在一些实施方案中，将骨支架插入骨的髓内管。在一些实施方案中，将骨支架放置于跗骨窦中。在一些实施方案中，将骨支架放置于膝或关节中。在一些实施方案中，将骨支架放置于骨折处。在一些实施方案中，骨支架是可扩大或缩小的。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于在有需要的个体中促进或诱导骨形成。在一些实施方案中，该个体患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨退化、佩吉特氏病或骨肿瘤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注射至关节。在一些实施方案中，使包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与骨接触(例如，通过使用创伤敷料或绷带)。在一些实施方案中，包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物覆盖上骨支架、骨植入体或骨假体(例如，骨整合型植入体)。如本文所用，“骨整合型植入体”意指包含成骨细胞和支撑结缔组织迁移进入的孔的三维植入体。在一些实施方案中，将骨支架插入骨的髓内管。在一些实施方案中，将骨支架放置在跗骨窦中。在一些实施方案中，将骨支架放置在膝或关节中。在一些实施方案中，将骨支架放置在骨折处。在一些实施方案中，骨支架是可扩大或缩小的。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于抑制破骨细胞的分化。在一些实施方案中，该个体患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨退化、佩吉特氏病或骨肿瘤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注射至关节。在一些实施方案中，使包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与骨接触(例如，通过使用创伤敷料或绷带)。在一些实施方案中，包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物覆盖上骨支架、骨植入体或骨假体(例如，骨整合型植入体)。如本文所用，“骨整合型植入体”意指包含成骨细胞和支撑结缔组织迁移进入的孔的三维植入体。在一些实施方案中，将骨支架插入至骨的髓内管。在一些实施方案中，将骨支架放置在跗骨窦中。在一些实施方案中，将骨支架放置在膝或关节中。在一些实施方案中，将骨支架放置在骨折处。在一些实施方案中，骨支架是可膨胀或可收缩的。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于在有需要的个体中促进由成骨细胞的矿化。在一些实施方案中，该个体患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨退化、佩吉特氏病或骨肿瘤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注射至关节。在一些实施方案中，使包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与骨接触(例如，通过使用创伤敷料或绷带)。在一些实施方案中，包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物覆盖上骨支架、骨植入体或骨假体(例如，骨整合型植入体)。如本文所用，“骨整合型植入体”意指包含成骨细胞和支撑结缔组织迁移进入的孔的三维植入体。在一些实施方案中，将骨支架插入至骨的髓内管。在一些实施方案中，将骨支架放置在跗骨窦中。在一些实施方案中，将骨支架放置在膝或关节中。在一些实施方案中，将骨支架放置在骨折处。在一些实施方案中，骨支架是可膨胀或可收缩的。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于在有需要的个体中平衡骨吸收和骨形成。在一些实施方案中，该个体患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨退化、佩吉特氏病或骨肿瘤。在一些实施方案中，将包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物注射至关节。在一些实施方案中，使包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与骨接触(例如，通过使用创伤敷料或绷带)。在一些实施方案中，包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物覆盖上骨支架、骨植入体或骨假体(例如，骨整合型植入体)。如本文所用，“骨整合型植入体”意指包含成骨细胞和支撑结缔组织迁移进入的孔的三维植入体。在一些实施方案中，将骨支架插入至骨的髓内管。在一些实施方案中，将骨支架放置在跗骨窦中。在一些实施方案中，将骨支架放置在膝或关节中。在一些实施方案中，将骨支架放置在骨折处。在一些实施方案中，骨支架是可膨胀或可收缩的。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗牙科矫正或牙周病状。在一些实施方案中，牙周病状选自牙龈炎，牙龈退缩或牙周炎。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用作抗炎药或用于促进骨整合或愈合。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物与牙移植联合使用，以促进植入体的骨整合，抗炎和愈合。
在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于治疗声音嘶哑或语音障碍。在一些实施方案中，包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物用于注射喉成形术，以修复声带。
在一些实施方案中，将包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的药物组合物涂覆到医用植入体(例如，支架)。在一些实施方案中，本文公开的医用植入体/nHC-HA/PTX3或植入体/rcHC-HA/PTX3复合物植入至有需要的个体，其中所述nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物部分地或完全地释放至个体。在一些实施方案中，医用植入体是支架(例如，骨支架或冠状动脉支架)。在一些实施方案中，医用植入体是骨支架。在一些实施方案中，医用植入体是冠状动脉支架。
组合
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与第二治疗剂联合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与两种或更多种治疗剂联合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与一种或多种治疗剂联合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法与2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种治疗剂联合使用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂以相同剂型施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与第二治疗剂以单独的剂型施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与第二治疗剂同时施用(例如，同时，基本同时或在同一治疗方案内)。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二治疗剂相继施用。在一些实施方案中，在第二治疗剂之前或之后施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二活性剂的施用间的时间段从几分钟到数小时不等，这取决于各个药剂的特性，诸如效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和药剂动力学图。在一些实施方案中，靶分子浓度的昼夜变化确定最佳剂量间隔。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二活性剂的施用之间的时间是约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月或更长时间。
在一些实施方案中，与单独施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物时所需的剂量相比，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的共同施用导致较低的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的所需剂量。在一些实施方案中，与单独施用第二剂量时所需的剂量相比，第二治疗剂的共同施用导致较低的第二剂量的所需剂量。本领域中已知并描述了用于在实验上确定在联合治疗方案中使用的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法。例如，本领域中已经广泛地描述了使用节律性给药，即，提供更频繁的更低的剂量以最小化毒副作用。组合治疗进一步包括在不同时间启动和停止的定期治疗，以协助个体的临床管理。
在一些实施方案中，改进了nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和一种或多种额外的治疗剂的组合治疗。在一些实施方案中，改进了组合治疗，由此相对第二治疗剂的量，增加了nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量。在一些实施方案中，改进了组合治疗，由此相对第二治疗剂的量，减少了nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量。在一些实施方案中，改进了组合治疗，由此相对nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量，增加了第二治疗剂的量。在一些实施方案中，改进了组合治疗，由此相对nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的量，减少了第二治疗剂的量。
在一些实施方案中，第二治疗剂选自细胞毒素剂、抗菌剂、抗血管生成剂、化疗剂、抗癌剂或放射治疗。在一些实施方案中，第二治疗剂选自烷化剂、抗代谢药、替尼泊苷；抗肿瘤酶、拓扑异构酶抑制剂、丙卡巴肼、米托蒽醌、铂配位复合物、生物应答调节剂和生长抑制剂、激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、芳香酶抑制剂、抗雌激素、抗雄激素、皮质类固醇、戈那瑞林激动剂、微管活性剂、亚硝基脲、脂质或蛋白激酶靶向剂、免疫调制药物(IMiD)、蛋白质或脂质磷酸酶靶向剂、抗血管生成剂、Akt抑制剂、IGF-I抑制剂、FGF3调节剂、mTOR抑制剂、Smac模拟物、HDAC抑制剂、诱导细胞分化的药剂、缓激肽1受体拮抗剂、血管紧缩素II拮抗剂、环加氧酶抑制剂、类肝素酶抑制剂、淋巴因子抑制剂、细胞因子抑制剂、IKK抑制剂、P38MAPK抑制剂、HSP90抑制剂、多重激酶抑制剂、二膦酸盐、雷帕霉素衍生物、抗凋亡通路抑制剂、凋亡通路激动剂、PPAR激动剂、RAR激动剂、Ras亚型抑制剂、端粒酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、氨肽酶抑制剂、SHIP激活剂-AQX-MN100、Humax-CD20(奥法木单抗)、CD20拮抗剂、IL2-白喉毒素融合物或它们的组合。在一些实施方案中，抗菌剂为抗病毒、抗细菌或抗真菌剂。非限制示例性的抗菌剂包括那些归类为氨基糖甙、β-内酰胺、喹诺酮或荧光喹诺酮、大环内酯、磺胺类、磺胺甲噁唑、四环素、链酶杀阳菌素、噁唑烷酮(诸如利奈唑胺)、克林霉素、林可霉素、利福霉素、糖肽类、多黏菌素(polymxins.)脂肽抗生素及上述在药学上可接受的钠盐、药学上可接受的钙盐、药理学上可接受钾盐、脂质制剂、衍生物和/或类似物。抗真菌剂的非限制示例性分类包括：咪唑或三唑，诸如克霉唑、咪康唑、酮康唑、益康唑、布康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、特康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑(UK 109,496)、泊沙康唑、雷夫康唑或氟曲马唑；多烯抗真菌剂，诸如两性霉素B、脂质体两性霉素B、纳他霉素、制霉菌素和制霉菌素脂质制剂；细胞壁活性环状脂肽抗真菌剂，其包括棘白菌素如卡泊芬净、米卡芬净、安道芬净、西洛芬净；LY121019；LY303366；抗真菌的烯丙基胺组，如特比萘芬。抗真菌剂的另外其它的非限制实例包括奈替芬、托萘酯、中杀菌素、克念菌素、抗滴虫霉素、哈霉素、金色制霉素、杀子囊菌素、抗酵母素、防霉菌素、抗滴虫霉素、制酵母菌素、庚霉素、抑念珠霉素、灰黄霉素、BF-796、MTCH 24、BTG-137586、普拉米星(MNS 18184)、贝那米星；两性霉素B脂质体注射剂；尼柯霉素Z；氟胞嘧啶或真菌霉素。抗病毒剂的非限制实例包括西多福韦、金刚烷胺、金刚烷乙胺、阿昔洛韦、丙氧鸟苷、喷昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸、利巴韦林或伐昔洛韦。在一些实施方案中，抗菌剂为先天性免疫肽或蛋白质。先天性肽或蛋白质的一些示例性分类是转铁蛋白、乳铁蛋白、防御素、磷脂酶、溶菌酶、内源性抗菌多肽类物质、serprocidins、杀菌通透性增加蛋白质、两亲α螺旋肽以及其它合成的抗菌蛋白质。在一些实施方案中，抗菌剂是防腐剂。
在一些实施方案中，第二治疗剂选自ARRY-797、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素C2、C3、D和F1、环磷酰胺、美法仑、雌莫司汀、美登醇、利福霉素、曲张链丝菌素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、地托比星、洋红霉素、依索比星、米托蒽醌、博来霉素A、A2和B、喜树碱、伊立替康、托泊替康、9-氨基喜树碱、10,11-亚甲基二氧喜树碱、9-硝基喜树碱、硼替佐米、替莫唑胺、TAS103、NPI0052、考布他汀、考布他汀A-2、考布他汀A-4、卡奇霉素、新制癌菌素、埃博霉素A B,C和半合成的变体、赫赛汀、美罗华、CD40抗体、天冬酰胺酶、白介素、干扰素、亮丙瑞林、和培门冬酶、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、呋喃佛尿嘧啶、5'-脱氧氟尿嘧啶核苷、UFT、MITC、S-1卡培他滨、己烯雌酚、他莫昔芬、toremefine、tolmudex、盐酸诺拉曲塞、氟他胺、氟甲睾酮、比卡鲁胺、非那雄胺、雌二醇、曲沃昔芬、地塞米松、醋酸亮丙瑞林、雌莫司汀、屈洛昔芬、甲羟孕酮、甲地孕酮、氨鲁米特、睾内酯、睾酮、己烯雌酚、羟孕酮、丝裂霉素A,B和C、甲基丝裂霉素、顺铂、卡铂、奥沙利铂、四铂、铂-DACH、奥马铂、沙利度胺、来那度胺、CI-973、端粒酶、CHIR258、Rad 001、SAHA、Tubacin、17-AAG、索拉非尼、JM-216、鬼臼毒素、表鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、特罗凯、易瑞沙、伊马替尼、米替福新、哌力福新、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲蝶呤、二氯-甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、azattuoprine、别嘌呤醇、克拉屈滨、氟达拉滨、喷司他丁、2-氯腺苷、脱氧胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、阿扎胞苷、5-氮杂胞嘧啶、吉西他滨、5-氮杂胞嘧啶-阿拉伯糖苷、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、环氧长春碱、异长春碱和长春地辛、紫杉醇、泰索帝和/或多西紫杉醇。
在一些实施方案中，第二活性剂是烟酸、贝特类药物、他汀类药物、Apo-A1模拟多肽(例如，DF-4,Novartis)、apoA-I转录上调剂、ACAT抑制剂、CETP调节剂、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体拮抗剂、P2Y12受体拮抗剂、Lp-PLA2-抑制剂、抗肿瘤坏死因子(TNF)剂、白介素-1(IL-1)受体拮抗剂、白介素-2(IL-2)受体拮抗剂、白介素-6(IL-6)受体拮抗剂、白介素-12(IL-12)受体拮抗剂、白介素-17(IL-17)受体拮抗剂、白介素23(IL-23)受体拮抗剂、细胞毒性剂、抗菌剂、免疫调节剂、抗生素、T细胞共刺激阻断剂、病症修饰抗风湿剂、B细胞消耗剂、免疫抑制剂、抗淋巴细胞抗体、烷化剂、抗代谢物、植物碱、萜类、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤抗生素、单克隆抗体、激素疗法(例如，芳香酶抑制剂)或其组合。
在一些实施方案中，第二活性剂是抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体阻断抗体、抗TNF抗体、抗TNF受体阻断抗体、抗IL1β抗体、抗IL1β受体阻断抗体、抗IL-2抗体、抗IL-2受体阻断抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6受体阻断抗体、抗IL-12抗体、抗IL-12受体阻断抗体、抗IL-17抗体、抗IL-17受体阻断抗体、抗IL-23抗体或抗IL-23受体阻断抗体。
在一些实施方案中，第二活性剂是烟酸、苯扎贝特、环丙贝特、安妥明、吉非贝齐、非诺贝特、DF4(Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2)、DF5、RVX-208(Resverlogix)、阿伐麦布、帕替麦布硫酸盐(CS-505)、CI-1011(2,6-二异丙基[(2,4,6-三异丙基)乙酰基]氨基磺酸酯)、CI-976(2,2-二甲基-N-(2,4,6-三甲氧基苯基)十二烷酰胺)、VULM1457(1-(2,6-二异丙基苯基)-3-[4-(4'-硝基苯基)苯基]脲)、CI-976(2,2-二甲基-N-(2,4,6-三甲氧基苯基)十二烷酰胺)、E-5324(正丁基-N'-(2-(3-(5-乙基-4-苯基-1H-咪唑-1-基)丙氧基)-6-甲基苯基)脲)、HL-004(N-(2,6-二异丙基苯基)十四烷基硫代乙酰胺)、KY-455(N-(4,6-二甲基-1-戊吲哚啉基-7-基)-2,2-二甲基丙酰胺)、FY-087(N-[2-[N'-戊烷基-(6,6-二甲基-2,4-庚二炔基)氨基]乙基]-(2-甲基-1-萘基-硫基)乙酰胺)、MCC-147(Mitsubishi Pharma)、F12511((S)-2',3',5'-三甲基-4'-羟基-α-十二烷基硫代乙酰苯胺)、SMP-500(Sumitomo Pharmaceuticals)、CL 277082(2,4-二氟-苯基-N[[4-(2,2-二甲基丙基)苯基]甲基]-N-(庚基)脲)、F-1394((1s,2s)-2-[3-(2,2-二甲基丙基)-3-壬脲基]氨基环己烷-1-基3-〔N-(2,2,5,5-四甲基-1,3-二氧杂环乙烷-4-羰基)氨基]丙酸酯)、CP-113818(N-(2,4-双(甲硫基)-6-甲基吡啶-3-基)-2-(己硫基)癸酸酰胺)、YM-750、托彻普、anacetrapid、JTT-705(Japan Tobacco/Roche)、阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、洛溪非班、variabilin、XV 459(N(3)-(2-(3-(4-甲脒基苯基)异噁唑啉-5-基)乙酰)-N(2)-(1-丁氧羰基)-2,3-二氨基丙酸酯)、SR 121566A(3-[N-{4-[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]-1,3-噻唑-2-基}-N-(1-羰基甲基吡啶-4-基)氨基]丙酸，三盐酸化物)、FK419((S)-2-乙酰基氨基-3-[(R)-[1-[3-(哌啶-4-基)丙酰基]哌啶-3-基羰基]氨基]丙酸三水合物)、氯吡格雷、普拉格雷、坎格雷洛、AZD6140(AstraZeneca)、MRS 2395(2,2-二甲基-丙酸3-(2-氯-6-甲基氨基嘌呤-9-基)-2-(2,2-二甲基-丙酰氧基)-丙基酯)、BX 667(BerlexBiosciences)、BX 048(Berlex Biosciences)、达拉地(SB 480848)、SB-435495(GlaxoSmithKline)、SB-222657(GlaxoSmithKline)、SB-253514(GlaxoSmithKline)、阿法赛特、依法利珠单抗、甲氨蝶呤、阿曲汀、异维甲酸、羟基脲、霉酚酸酯、柳氮磺胺吡啶、6-硫鸟嘌呤、卡泊三醇、Taclonex、倍他米松、他扎罗汀、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶，依那西普，阿达木单抗，英夫利昔单抗、阿巴西普、利妥昔单抗、曲妥单抗、抗CD45单克隆抗体AHN-12(NCI)、碘-131抗B1抗体(Corixa)、抗CD66单克隆抗体BW 250/183(NCI,Southampton GeneralHospital)、抗CD45单克隆抗体(NCI,Baylor College of Medicine)、抗体抗anb3整合素(NCI)、BIW-8962(BioWa Inc.)、抗体BC8(NCI)、抗体muJ591(NCI)、铟In 111单克隆抗体MN-14(NCI)、钇Y 90单克隆抗体MN-14(NCI)、F105单克隆抗体(NIΑID)、单克隆抗体RAV12(Raven Biotechnologies)、CAT-192(人抗TGF-β1单克隆抗体，Genzyme)、抗体3F8(NCI)、177Lu-J591(Weill Medical College of Cornell University)、TB-403(BioInventInternational AB)、阿那白滞素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢霉素A、来氟米特、d-青霉胺、阿米替林、或去甲替林、苯丁酸氮芥、氮芥、普拉睾酮、LJP 394(阿贝莫司钠)、LJP 1082(LaJolla Pharmaceutical)、依库珠单抗、贝利单抗、rhuCD40L(NIΑID)、依帕珠单抗、西罗莫司、他克莫司、吡美莫司、沙利度胺、抗胸腺细胞球蛋白-马(Atgam,Pharmacia Upjohn)、抗胸腺细胞球蛋白-兔(Thymoglobulin,Genzyme)、莫罗单抗CD3(FDA Office of OrphanProducts Development)、巴利昔单抗、赛尼哌、利鲁唑、克拉屈滨、那他珠单抗、干扰素β-1b、干扰素β-1a、替扎尼定、巴氯芬，美沙拉嗪、安萨科、颇得斯安、氨水杨酸、巴柳氮、奥沙拉嗪、6-巯基嘌呤、AIN457(抗IL-17单克隆抗体，Novartis)、茶碱、D2E7(人抗TNFmAb，KnollPharmaceuticals)、美泊利单抗(抗IL-5抗体，SB 240563)、卡纳单抗(抗IL-1β抗体，NIAMS)、抗IL-2受体抗体(Daclizumab,NHLBI)、CNTO 328(抗IL-6单克隆抗体，Centocor)、ACZ885(全人抗白介素-1β单克隆抗体，Novartis)、CNTO 1275(全人抗IL-12单克隆抗体，Centocor)、(3S)-N-羟基-4-({4-[(4-羟基-2-丁炔基)氧基]苯基}磺酰基)-2,2-二甲基-3-硫代吗啉甲酰胺(apratastat)，戈利木单抗(CNTO 148)、奥那西普、BG9924(Biogen Idec)、Certolizumab Pegol(CDP870,UCB Pharma)、AZD9056(AstraZeneca)、AZD5069(AstraZeneca)、AZD9668(AstraZeneca)、AZD7928(AstraZeneca)、AZD2914(AstraZeneca)、AZD6067(AstraZeneca)、AZD3342(AstraZeneca)、AZD8309(AstraZeneca),)、[(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸(硼替佐米)、AMG-714、(抗IL 15人单克隆抗体，Amgen)、ABT-874(抗IL-12单克隆抗体，Abbott Labs)，MRA(托珠单抗，抗IL-6受体单克隆抗体，Chugai Pharmaceutical)、CAT-354(人抗白介素-13单克隆抗体，Cambridge Antibody Technology,MedImmune)、阿司匹林、水杨酸、龙胆酸、胆碱水杨酸镁、水杨酸胆碱、胆碱水杨酸镁、水杨酸胆碱、水杨酸镁、水杨酸钠、二氟尼柳、卡洛芬、非诺洛芬、非诺洛芬钙、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、nabutone、正酮洛酸、酮咯酸氨丁三醇、萘普生、奥沙普秦、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、甲氯芬那、甲氯灭酸钠、甲灭酸、吡罗昔康、美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、帕瑞考昔、艾托考昔、罗美昔布(Sankyo)、JTE-522(Japan Tobacco Inc.)、L-745,337(Almirall)、NS398(Sigma)、倍他米松(Celestone)、泼尼松(Deltasone)、阿氯米松、醛固酮、安西萘德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、去氧皮质酮、地奈德、去羟米松、去氧皮质酮、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼泥酯、氟氯耐德、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸肤轻松、氟考、氟可龙、氟米龙、氟倍龙、氟泼尼定、氟替卡松、福莫可他、福莫特罗、哈西奈德、卤米松、氢化可的松、氢化可的松醋丙酯、氢化可的松、丁丙酸酯、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲羟松、甲基强的松、甲基强的松龙、甲基强的松龙醋丙酯、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡松、泼尼松、利美索龙、替可的松、曲安西龙、乌倍他索、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁、克拉屈滨、5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、甲氧苄氨嘧啶、乙胺嘧啶、培美曲塞、紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、更生霉素、阿霉素、柔红霉素、戊柔比星、去甲氧柔红霉素、表柔比星、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、非那雄胺、戈舍瑞林、氨鲁米特、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、依西美坦、4-雄甾烯-3,6,17-三酮(“6-OXO”；1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)、福美坦、睾内酯、法倔唑或其组合。
在一些实施方案中、第二治疗剂是抗生素。在一些实施方案中、第二治疗剂是抗细菌剂。在一些实施方案中、第二治疗剂是阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、巴龙霉素、格尔德霉素、除莠霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯(defprozil)、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢托罗、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、大观霉素、氨曲南、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、磺胺米隆、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、sulfanimilimde、柳氮磺吡啶、磺胺二甲异唑、甲氧苄氨嘧啶、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素(oxtetracycline)、四环素、胂凡纳明、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普汀/达福普汀、利福平、磺甲硝咪唑及其组合。
在一些实施方案中、第二治疗剂是抗病毒剂。在一些实施方案中、第二治疗剂是阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安泼那韦、阿比朵尔、阿扎那韦、artipla、溴夫定、西多福韦、双汰芝、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦、恩替卡韦、fomvirsen、福沙那韦、膦甲酸、膦乙酸、更昔洛韦、加德西、伊巴他滨、肌酐普拉诺贝、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素、包括干扰素I型(如IFNα和IFNβ)、干扰素II型、干扰素III型、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、MK-0518、马拉韦罗、吗啉胍、奈非那韦、奈韦拉平、索拉菲尼、核苷类似物、奥司他韦、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来可那立、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚烷乙胺、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、三氟尿苷、三协唯(trizivir)、醋胺金刚烷、特鲁瓦达、缬更昔洛韦、维立韦罗、阿糖腺苷、韦拉米啶、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。
在一些实施方案中、第二治疗剂是抗真菌剂。在一些实施方案中、第二治疗剂是阿莫罗芬(amrolfine)、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、奥昔康唑、硫康唑、特康唑、噻康唑、尼柯霉素Z、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B、脂质体制霉菌素(liposomalnystastin)、匹马菌素、灰黄霉素、环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一碳烯酸、碘氯羟喹及其组合。
在一些实施方案中、第二治疗剂是抗寄生虫剂。在一些实施方案中、第二治疗剂是双甲脒、硝硫氰胺、阿维菌素、卡巴氧、乙胺嗪、二甲硝咪唑、二脒那秦、伊维菌素、macrofilaricide、马拉硫磷、双虫脒(mitaban)、奥沙尼喹、苄氯菊酯、吡喹酮、双羟萘酸噻嘧啶、司拉克丁、葡萄糖酸锑钠、噻菌灵及其组合。
与细胞和组织的组合
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与一个细胞、多个细胞或组织共同施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与治疗性细胞共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织转移共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与干细胞转移共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与器官转移共同施用。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织转移同时施用(例如，同时、基本同时或在同一治疗方案内)。在一些实施方案中，在组织转移前或后施用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织转移的施用间的时间段从几分钟到数小时不等，这取决于各个药剂的特性，诸如效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和药剂动力学图。在一些实施方案中，靶分子浓度的昼夜变化确定最佳剂量间隔。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物和第二活性剂的施用间的时间是约小于1小时、小于1天、小于1周或小于1个月。
在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织转移和免疫抑制剂共同施用。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与组织转移和钙神经素抑制剂(例如，环保菌素或他克莫司)、mTOR抑制剂(雷帕霉素；依维莫司)；抗增殖剂(咪唑硫嘌呤或麦考酚酸)；皮质类固醇(例如，脱氢皮质或氢化可的松)；单克隆抗-IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗或达利珠单抗)；多克隆抗-T-细胞抗体(例如，抗-胸腺细胞球蛋白(ATG)或抗淋巴细胞球蛋白(ALG))或其组合。
在一些实施方案中，组织涂覆有本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，多个干细胞涂覆有本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，器官涂覆有本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物。在一些实施方案中，用本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物涂覆组织防止宿主免疫系统作用于组织。
在一些实施方案中，器官、组织或多种干细胞与本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，器官、组织或多种干细胞与包含本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的组合物接触。在一些实施方案中，该组合物具有约7.0到约7.5的pH。在一些实施方案中，该组合物具有7.4的pH。在一些实施方案中，该组合物进一步包含钾、镁和棉子糖。在一些实施方案中，该组合物进一步包含腺苷、谷胱甘肽、别嘌呤醇和羟乙基淀粉中的至少一种。在一些实施方案中，该组合物是补充了本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的UW溶液。
在一些实施方案中，器官、组织或多种干细胞与本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约36小时或约48小时。在一些实施方案中，在保护组织和血管调理的温度下(例如，小于环境温度)发生接触。在一些实施方案中，在4℃下发生接触。
医疗装置的组合
在一些实施方案中，本文所公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与医疗装置共同施用。在一些实施方案中，医疗装置或其部分与本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物接触。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物用于涂覆医疗装置或其部分，如本文其它地方所述。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与医疗装置的联合施用减少、抑制或防止针对植入的装置的炎症反应。在一些实施方案中，本文公开的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与医疗装置的联合施用减少、抑制或防止由在植入的医疗装置上的微生物生长产生的感染性生物膜的形成(即慢性生物膜感染)。这样的生物膜的实例是那些由细菌，例如但不限于金黄色葡萄球菌产生的。
制品和试剂盒
本文提供的制剂包括包装材料。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员熟知的。药物包装材料的实例包括但不限于，泡罩包装、瓶、管、吸入器、吸入器(例如，加压计量剂量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、喷雾器(例如，喷射或超声喷雾器)和其他单次呼吸液体系统)、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶子和任何适用于选定的制剂以及预期给药和治疗方式的包装材料。在一些实施方案中，药物组合物并入、应用至或涂覆至医疗装置，如植入体、导管、人工关节、支架、瓣膜、纳米颗粒或微胶囊。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物或组合作为试剂盒而提供。试剂盒任选地包括一种或多种组件，例如使用说明书、装置和另外的试剂(例如，用于稀释组合物和/或重构冻干蛋白质的灭菌水或盐水溶液)，以及组件，如用于实施该方法的管、容器和注射器。示例性试剂盒包括本文提供的药物组合物或组合，并任选地包括使用说明、用于向受试者施用药物组合物或组合的装置、用于在受试者中检测nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的装置、用于在从受试者获得的样品中检测nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的装置和用于向受试者施用额外的治疗剂的装置。
试剂盒可以任选地包括说明书。说明书通常包括有形表述，其描述nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物，和任选的包含于试剂盒中的其他组件，和给药方法，包括用于确定受试者的正常状态、适当的剂量、给药方案和用于施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的适当的给药方法的方法。在一些实施方案中，说明书包括在治疗时间的持续时间内用于监测受试者的指导。
在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的药物组合物和诊断项目。例如，这样的试剂盒包括用于在受试者中测量选定的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的浓度、数量或活性的项目。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包括用于向受试者施用nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的装置。在一些实施方案中，任何用于向受试者施用药物的各种本领域中已知的装置都包括于本文提供的试剂盒中。示范性装置包括但不限于，吸入器(例如，加压计量剂量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、喷雾器(例如，喷射或超声喷雾器)和其他单呼吸液体系统)、皮下注射针头、静脉注射针头、导管和液体分配器，如点眼药器。通常情况下，用于施用试剂盒的nHC-HA/PTX3复合物的装置将与nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的期望的给药方法兼容。
干细胞培养物的扩充
在某些实施方案中，本文所公开了在包含本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上扩增分离的干细胞的方法。如本文所述，HC-HA/PTX3复合物促进干细胞的聚集、防止细胞的分化并保护干细胞标记物的表达。
在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3复合物或rcHC-HA/PTX3复合物上的扩增保留一种或多种胚胎干细胞(ESC)标记物(例如，Oct4、Nanog、Sox2(SRY(性别决定区Y)-box 2)、Rex1(Zfp42)、SSEA4(阶段特异性胚胎抗原-4)、MYC/c-Myc和KLF4、周细胞标记物(例如NG2(神经元的神经胶质抗原2/硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4))、PDGFR-β(血小板衍生的生长因子受体B)和α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白))和血管生成标记物(例如，CD133/2、FLK-1(VEGF-R2、Ly-73)、vWF(血管性血友病因子)、CD34、CD31(PECAM-1)和CD146)的表达。在一些实施方案中，由常规方法诸如蛋白质表达分析(例如，Western印迹分析、免疫荧光、免疫组织化学、荧光激活细胞分选)或mRNA分析(例如，聚合酶链反应(PCR)或Northern)确定干细胞标记物的表达。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3抑制在培养的细胞中的TGF-β信号传导。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3抑制在培养的干细胞中的TGF-β信号传导。在一些实施方案中，TGF-β信号传导的抑制是指存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与不存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物相比，细胞中在TGF-β的细胞信号传导途径诸如pSMAD 2/3信号传导、α平滑肌形成中的一种或多种蛋白质或标记物的活性或表达的降低。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3在培养的细胞中诱导BMP信号传导。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3在培养的干细胞中诱导BMP信号传导。在一些实施方案中，TGF-β信号传导的抑制是指存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物与不存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物相比，细胞中在BMP信号传导途径诸如BMP-2、BMP-4、BMP-6和pSMAD1/5/8中的一种或多种蛋白质的活性或表达的提高。
在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是胎儿干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是诱导的多能干细胞/祖干细胞(IPSC)。
在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是脂肪干细胞(ASC)。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是脐带干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是羊膜干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是角膜缘细胞，如角膜缘利基细胞或角膜缘上皮细胞祖细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是内皮干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，分离的干细胞是骨髓干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是神经干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是内皮祖细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是骨骼肌干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是乳腺干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是肠干细胞。
在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是诱导多能干细胞/祖干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是源自成人分化或部分分化的细胞的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是源自成纤维细胞的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞是源自人角膜成纤维细胞的诱导多能干细胞。
在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自胎儿组织，例如胎盘组织或脐带组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自羊膜。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自脂肪组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自角膜缘组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自骨髓。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自内皮组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自角膜缘组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自神经组织，在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自角膜缘组织。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自骨骼肌。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自皮肤。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自消化系统。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自胰腺。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自肝脏。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自嗅粘膜。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自生殖细胞群组。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自血液。在一些实施方案中，在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3上培养的分离的干细胞源自脐带血液。
在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是从羊膜或脐带分离的nHC-HA/PTX3。在一些实施方案中，HC-HA/PTX3复合物是重构的HC-HA复合物。在一些实施方案中，HA共价连接至HC。在一些实施方案中，IαI的HC是重链1(HCl)。在一些实施方案中，HC-HA复合物包括五聚环蛋白-3(PTX3)。
在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包括小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包含I类、II类或III类SLRP。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物包含PTX3和小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自I类SLRP，如饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自II类SLRP，如双糖链蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、PRELP(脯氨酸精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白质)、角膜蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖选自III类SLRP，如骺蛋白聚糖和骨甘蛋白聚糖。
在一些实施方案中，分离的干细胞在包含固定的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3的基底上进行扩增。在一些实施方案中，固定的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3包含一个或多个小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，SLRP选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包含硫酸角质素。
在一些实施方案中，分离的干细胞在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的培养基上进行扩增。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3包含一个或多个小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)。在一些实施方案中，SLRP选自尿抑胰酶素、饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白质包含糖胺聚糖。在一些实施方案中，小亮氨酸丰富蛋白聚糖包括硫酸角质素。在一些实施方案中，培养基是胚胎干细胞培养基、改良的胚胎干细胞培养基、补充激素上皮培养基和/或其组合。在一些实施方案中，该培养基补充有一种或多种生长因子。在一些实施方案中，培养基补充有EGF、bFGF和/或LIF。在一些实施方案中，培养基补充有Rho相关激酶的抑制剂(ROCK抑制剂)。
诱导和维持多能性
在某些实施方案中，本文公开了在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上诱导细胞的多能性或维持干细胞的多能性的方法。如本文所述，HC-HA/PTX3复合物有助于在干细胞群组的连续传代中维持干细胞标记物的表达并防止细胞分化。此外，如本文所述，HC-HA/PTX3复合物在细胞的分化的或部分分化的群组中促进干细胞性质的诱导。
在某些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物促进或诱导分化的或部分分化的细胞的多能性。在某些实施方案中，与在缺失nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3的复合物下培养的分化的或部分分化的细胞相比，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物促进或诱导分化的或部分分化的细胞的多能性。在示例性方法中，在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养分化的细胞或部分分化的细胞，从而在细胞中诱导多能性。
在某些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物进一步促进或诱导干细胞的多能性。在某些实施方案中，与在缺失nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物下培养的干细胞相比，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物进一步促进或诱导干细胞的多能性。在示例性方法中，在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养干细胞，从而在干细胞中维持多能性。在示例性方法中，在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养干细胞，从而在干细胞中进一步诱导多能性。
使用在蛋白质因子下的遗传重编程，相当于胚胎干细胞的多能干细胞已源自人成年皮肤组织。iPSC通常由某些与干细胞相关的基因的转染衍生成非多能细胞，如成年成纤维细胞。转染通常通过病毒载体例如逆转录病毒完成，其中该多能性基因可操作地连接至用于基因表达的启动子。生产多能干细胞所必需的四个关键的多能性基因为Oct-3/4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4。其它基因可增强诱导效率。在一些研究中，Oct4、Sox2、Nanog和Lin28已用于诱导多能性。在某些情况下，3-4周后，少量的转染细胞开始在形态学上和生化上变得类似于多能干细胞，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素选择来分离。
在一些实施方案中，提供了用于使用少于四种基本转录因子Oct-3/4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4的异源表达在分化的或部分分化的细胞中诱导多能性的方法。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达Oct-3/4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和/或Klf4中的至少一种。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达选自Oct-3/4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc和/或Klf4的一种、两种或三种因子。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达Oct-3/4(Pou5f1)。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达Sox2。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达c-Myc。在一些实施方案中提供了用于诱导多能性的方法，其中nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的使用增强了诱导分化或部分分化细胞的多能性，该分化或部分分化细胞通过异源基因转移表达Klf4。
在一些实施方案中，为了表达Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4中的一种或多种而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4中的至少一种而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4中的一种、两种或三种而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达Oct-3/4(Pou5f1)而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达SOX2而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达c-Myc而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达Klf4而转导分化的或部分分化的细胞；并且在包含nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物的基底上培养转导的细胞。在一些实施方案中，为了表达一种或多种额外的基因诸如例如Nanog、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1和β-连环蛋白而转导细胞。
在一些实施方案中，用包含编码一种或多种Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4的一种或多种基因的病毒载体转导分化的或部分分化的细胞。在一些实施方案中，用包含编码一种或多种Oct-3/4(Pou5f1)、SOX2、c-Myc和Klf4的一种或多种基因的两种或更多种病毒载体转导分化的或部分分化的细胞。
各种用于诱导、培养和维持诱导的多能性干细胞和评估诱导的干细胞的多能性(包括评估干细胞标记物和诱导不同细胞谱系)的方法在本领域中是公知的并且包括美国专利第7,682,828号、第8,048,999号、第8,211,697号、第7,951,592号和美国专利公开号第2009/0191159和2010/000375所述的方法。
在一些实施方案中，与在不存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物下培养的转导细胞相比，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物降低达到转导细胞中的多能性诱导的时间。在一些实施方案中，与在不存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物下培养的转导的细胞相比，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物增加了转导的细胞的百分比，其中与在不存在nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物下培养的转导的细胞相比，该转导的细胞群体被诱导出多能性。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物提高了转导细胞中的多能性水平。在一些实施方案中，nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物减少了用于在转导细胞中诱导多能性所需的异源转录因子的数目。
在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制分化细胞、干细胞或iPSC中的TGFβ1信号传导。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制分化细胞、干细胞或iPSC中的SMAD2或SMAD3的核转位。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物抑制分化细胞、干细胞或iPSC中的α平滑肌肌动蛋白的形成。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物激活分化细胞、干细胞或iPSC中的BMP4信号传导。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物激活分化细胞、干细胞或iPSC中的BMP6信号传导。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物诱导分化细胞、干细胞或iPSC中的胚胎细胞标记物的表达。在一些实施方案中，本文提供的nHC-HA/PTX3或rcHC-HA/PTX3复合物诱导分化细胞、干细胞或iPSC中的c-myc、KLF-4、Nanog、巢蛋白、Oct4、Rex-1、Sox-2和SSEA-4的表达。
实施例
包含下列实施例仅为了说明的目的而并非意在限制所请求保护的主题的范围。
实施例1：来自人羊膜提取物(AME)的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物的纯 化
羊膜提取物(AME)和AM粉末(AMP)的制备
从Bio-tissue(Miami,FL)获得的冷冻人AM用PBS洗涤2-3次，以除去储存介质。为了制备AME，将AM转移至无菌的50ml离心管中并且在4℃下以5000×g离心5分钟，以除去过量的液体。对AM进行称重(～10mg/cm2)，将其转移至100mm或150mm的无菌培养皿中，并在液氮容器的气相中冷冻20分钟，之后用一次性手术刀将其切成小块并且用Tissue-Tearor(Biospec Products,Inc.,Bartlesville,OK)使其在PBS中匀浆化。匀浆在4℃下混合30分钟并在48,000×g下离心30分钟。收集上清液，称为AME，并用于nHC-HA/PTX3纯化或储存于-80℃。
为了制备冻干的AM粉末(AMP)，将在-80℃冰箱中冷冻的AM转移至台式冻干机(Freezone 4.5,Labconco,Kansas City,MO)中并在其中冻干16小时。然后通过混合磨(Retsch,Newtown,PA)将冻干的AM微粉化成其基质形式(AMP)。将AMP储存于-20℃以下以供进一步分析。
天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物的纯化
将AME溶解于初始密度为1.35g/ml的CsCl/4M盐酸胍混合物中，并在15℃下以125,000×g离心48小时。每个管从上到下收集共计15个级分(0.8ml/级分)。各个级分的总蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒来确定。各个级分的乙酰透明质酸(HA)浓度通过来自Corgenix(Westminster,CO)的基于ELISA的HA定量测试试剂盒来确定(图1A)。将包含HA但不包含可检测蛋白质的第8-15号级分合并，并用于第二次超速离心。保存合并的级分的样品(称为第一AM)以供分析。合并的级分用初始密度为1.40g/ml的CsCl/4M盐酸胍进行调节，离心，并用与以上所述相同的方式进行分级分离(图1B)。将包含HA但不包含可检测蛋白质的第3-15号级分合并(称为第二AM)，并用蒸馏水透析以除去CsCl和盐酸胍。用与以上对于AMP所述相同的方式将透析液冻干。或者，将透析液与3倍体积的包含1.3％(w/v)乙酸钾的95％(v/v)乙醇在0℃下混合1小时。在15,000×g离心后，用70％(v/v)乙醇洗涤沉淀物并再次离心。将沉淀物短暂风干，储存于-80℃。粉末和沉淀物被称为nHC-HA/PTX3复合物。
在一些情况下，合并的样品经历三或四次超速离心。在这些超速离心中，仅合并第7-12号级分，且CsCl/4M盐酸胍的初始密度为1.42g/ml。三次或四次超速离心后，合并的第7-12号级分被称为nHC-HA/PTX3(第3)或nHC-HA/PTX3(第4)。
第一、第二、第三或第四次超速离心之后，AME合并的级分在25℃下用或者不用0.05N NaOH处理1小时。来自第一、第二、第三或第四次超速离心的合并的级分也用20单位/ml的透明质酸酶(HAase)(Seikagaku Biobusiness Corporation,Tokyo,Japan)在60℃消化2小时。
来自合并的级分的样品以及NaOH和HAase处理的样品然后在0.5％琼脂糖凝胶上运行，并且通过用全染色剂染料进行染色(图1C)或者通过使用抗IαI重链1(HCl)(图1D和1F)、五聚环蛋白3(PTX3)(图1E和1G)、IαI重链2(HC2)(图1H)、IαI重链3(HC3)(图1I)、尿抑胰酶素(图1J)、TNF-刺激的基因6(TSG-6)(图1K)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)(图1L)或IGFBP1-3和PF4(图1M)(其中后两种通过使用人血管发生阵列(每个阵列包含56种不同的血管发生蛋白质，R&D SYSTEMS,Minneapolis,MN)的蛋白质斑点试验来分析)的抗体进行Western印迹法来分析。简言之，将1.5ml的人AM提取物(25μg/ml HA)和纯化的nHC-HA/PTX3(第2)(25μg/ml HA)分别与预包被在膜上的检测抗体在4℃下孵育过夜，随后与第二抗体孵育过夜。用暴露于X射线胶片的化学发光来检测信号。在显影的X射线胶片上的阵列数据通过在透射型扫描仪上扫描胶片而定量，并且阵列图像文件通过ImageJ1.46软件(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD)进行分析。
生物化学表征显示：nHC-HA/PTX3由与IαI和PTX3的重链(HC1)共价连接的高分子量HA(HMW HA)(图1C)组成。nHC-HA/PTX3中的HC1和PTX3仅在透明质酸酶(HAase)或NaOH处理后释放(图1D-G)，这表明：如所报道的，HCl通过酯键与HA连接。
相反，nHC-HA/PTX3不包含HC2(图1H)、HC3(图1I，仅在NaOH处理后检测到的～12kDa处的条带可能是非特异性的)、尿抑胰酶素(图1J)、TSG-6(图1K)和TSP-1(图1L)。胰岛素样生长因子结合蛋白1-3(IGFBP1-3)和血小板因子4(PF4)通过蛋白质斑点试验(类似于ELISA)在nHC-HA/PTX3(第2)中检测到(图1J)；不清楚它们是否仍然存在于nHC-HA/PTX3(第4)中。
实施例2：通过共价连接制备固定化的HA(iHA)
将来自HMW HA(Healon,Advanced Medical Optics,Santa Ana,CA)或nHC-HA/PTX3(第2)的一系列乙酰透明质酸(HA)量(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10和25μg/孔)加至包含磺基-NHS(0.184mg/ml)和EDAC(0.123mg/ml)(均来自Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)的偶联溶液中，并在CovalinkTM-NH 96孔板(Thermo Fisher ScientificInc.)中在4℃下孵育16小时。用8M盐酸胍(GnHCl)洗涤三次，随后用PBS洗涤后，通过来自Corgenix(Westminster,CO)的HA ELISA根据制造商的方案对来自HMW HA或nHC-HA/PTX3的偶联的HA进行定量测量(图6A)。从AM中纯化的HMW HA和nHC-HA/PTX3剂量依赖性地且共价地偶联至Covalink-NH 96孔的表面上。所得的iHA或固定化的nHC-HA/PTX3耐受8M盐酸胍的洗涤。HMW HA或nHC-HA/PTX3的HA在2μg/孔的HA当量输入下最大化地偶联(图6A)。
为了确定偶联效率，将来自HMW HA或nHC-HA/PTX3的HA偶联至96孔板的每个孔的CovalinkTM-NH上，并通过HA ELISA测量来自HMW HA或nHC-HA/PTX3的未结合及结合的HA(图6B)。将来自HMW HA或nHC-HA/PTX3的2μg HA加入至在H2O中包含磺基-NHS(0.184mg/ml)和EDAC(0.123mg/ml)[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]的偶联溶液中，并在CovalinkTM-NH 96孔板(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)中在4℃下孵育16小时。与孔偶联的或在洗涤溶液(合并的)中未结合的HA都用来自Corgenix(Westminster,CO)的HA ELISA根据制造商的方案进行测量。将各个孔中偶联的或未结合的HA的总量除以输入HA量(2μg/孔)，以计算偶联效率或未结合的百分比。HMW HA的平均偶联效率被确定为70.5±13.4％，而nHC-HA/PTX3的平均偶联效率被确定为69.0±5.7％(图6B)。因此，2μg/孔输入HA得到约1.4μg iHA。
实施例3：纯化的天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)复合物的活性
LPS刺激的巨噬细胞与固定化的nHC-HA/PTX3的附着
将在DMEM/10％FBS(Life Technologies,Grand Island,NY)中的RAW264.7细胞(100μl，2.5×105个细胞/ml)[美国模式培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA]接种于包含固定化的HA(Advanced Medical Optics,Santa Ana,CA,2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照的96-孔板中，并用脂多糖(LPS)(1μg/ml)(n＝3)[LPS-EB Ultrapure,InvivoGen,San Diego,CA]进行刺激。类似地，如上所述进行HA和nHC-HA/PTX3在Covalink-NH 96孔板表面上的固定。简言之，将Covalink-NH 96-孔板在70％乙醇中灭菌2小时，用蒸馏水洗涤3次，并且每个96-孔板加入100μl含有20μg/ml HA或nHC-HA/PTX3的蒸馏水中的0.184mg/ml磺基-NHS(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)和0.123mg/ml EDAC(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)(PBS对照孔含有除HA和nHC-HA/PTX3之外的所有试剂)。在除去偶联溶液之前，该板在4℃下孵育过夜或在25℃下孵育2小时，用含有2M NaCl和50mM MgSO4的PBS洗涤3次，随后用PBS洗涤3次。孵育90分钟后，除去未附着的细胞，并且对附着的细胞进行拍照并通过CyQuant试验进行计数(图2A)。与对照孔相比，含有固定化的nHC-HA/PTX3的孔观察到LPS刺激的巨噬细胞的附着增多超过3倍。含有固定化的HA的孔抑制LPS刺激的巨噬细胞的附着。
然后检查附着的LPS刺激的巨噬细胞的细胞活力。LPS刺激的RAW264.7细胞(100μl，2.5×105个细胞/ml)如上所述在固定化的PBS对照、HA或nHC-HA/PTX3上在DMEM/10％FBS中孵育24小时(n＝3)。孵育后，通过MTT分析测量附着的巨噬细胞的细胞活力。在这些固定化的基底上在细胞之间未观察到细胞活力的显著差异(所有p值>0.05)(图2B)。
然后检查阻断抗体和肽抑制LPS刺激的巨噬细胞与固定化的nHC-HA/PTX3附着的能力。RAW264.7细胞(2.5x105个细胞/ml的浓度)与针对CD44(10μg/ml)、TLR2(10μg/ml)、TLR4(10μg/ml)、整联蛋白αv(20μg/ml)、β1(20μg/ml)、β2(20μg/ml)或β3(20μg/ml)或RGD肽(SDGRG、RGDS、GRGDS，均为1mg/ml)的阻断抗体以及同种型对照抗体[大鼠IgG(10μg/ml)、小鼠IgG(10μg/ml)或Armenian仓鼠IgG(20μg/ml)]或RGD对照肽(1mg/ml)在DMEM/10％FBS中在冰上预孵育30分钟(n＝3)。(抗CD44的抗体和大鼠IgG来自BD Pharmingen,San Diego,CA；抗TLR2、TLR4的抗体和小鼠IgG来自InvivoGen,San Diego,CA；抗整联蛋白αv、β1、β2、β3的抗体和Armenian仓鼠IgG来自Biolegend,San Diego,CA；RGD肽来自Sigma-Aldrich,StLouis,MO)。加入LPS(1μg/ml)后，将细胞接种至含有固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照的板中并且孵育90分钟(n＝3)。孵育后，除去未附着的细胞，并且对附着的细胞拍照且通过CyQuant试验计数(图2C)。该结果显示：抗CD44和TLR4的抗体显著抑制LPS刺激的巨噬细胞的附着，表明这些抗体参与了LPS刺激的巨噬细胞与固定化的nHC-HA/PTX3的附着。
LPS刺激的巨噬细胞的极化
通过经RNA和蛋白质分析确定编码M1和M2标记物的基因的表达来检查固定化的nHC-HA/PTX3使LPS刺激的巨噬细胞向M1或M2表型的极化。
将DMEM/10％FBS中的RAW264.7细胞(100μl，2.5×105个细胞/ml)接种至含有固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照的96-孔板中，并且用LPS(1μg/ml)刺激4小时(n＝3)。孵育后，除去未附着的细胞，并且从附着的细胞中提取总RNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Mm99999915_g1)作为内源对照，通过定量实时PCR测定M1标记物(肿瘤坏死因子α(TNF-α)(Mm00443258_m1)和白介素12亚基p40(IL-12p40)(Mm00434165_m1))和M2标记物(白介素-10(IL-10)(Mm00439614_m1)、精氨酸酶-1(Arg-1)(Mm00475988_m1)、LIGHT/TNSF14(Mm00444567_m1和鞘氨醇激酶-1(SPHK1)(Mm0044884_g1))的mRNA表达。在7300实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行实时PCR。扩增方案包括在95℃下初始活化10分钟，随后进行在95℃下变性15秒和在60℃下退火和延伸1分钟的40个循环。通过比较CT法(ΔΔCT)分析相对基因表达数据。所有试验均一式三份进行；结果以GAPDH作为内部对照进行归一化。所有引物均来自Applied Biosystems。与对照相比，在附着至固定化的nHC-HA/PTX3而非HA的细胞中观察到了M2标记物IL-10、Arg-1、LIGHT和SPHK1的表达的显著诱导(图3A)。此外，M1标记物、TNF-α和IL-12p40的表达降低。
如上所述，在含有固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照的板上，在用LPS(1μg/ml)刺激在DMEM/10％FBS中处理4小时的细胞的培养上清液中，测定分泌的TNF-α蛋白质的量(n＝3)。通过ELISA根据制造商的方案(R&D Systems,Minneapolis,MN)测定TNF-α的量。
与PBS对照相比，在含有固定化的nHC-HA/PTX3的板上孵育的细胞的细胞培养上清液中观察到TNF-α量的减少(图3B)。在固定化的HA板中未观察到TNF-α量的变化。
IRF-5的高表达是M1巨噬细胞的特征。IRF-5直接激活编码IL-12p40、IL-12p35和IL-23p19的基因的转录并且抑制编码IL-10的基因。检查IRF-5蛋白质的表达及其在固定化的nHC-HA/PTX3上的细胞定位。接种至固定化的对照或nHC-HA/PTX3上的细胞用LPS(1μg/ml)在DMEM/10％FBS中刺激4小时或24小时。通过Western印迹法检测细胞裂解物(LPS刺激24小时)中IRF-5蛋白质的表达(图3C，左)(第一抗体：abcam,Cambridge,MA；第二抗体：DAKO,Carpinteria,CA)。在平行的实验中，将细胞(LPS刺激4小时)固定并用抗IRF-5抗体进行免疫染色。通过共聚焦免疫荧光显微镜检查(LSM 700共聚焦显微镜,Zeiss,Oberkochen,Germany)检查IRF-5的细胞定位(图3C,右)。固定化的nHC-HA/PTX3降低IRF-5的表达且防止IRF-5的核定位。这些结果与固定化的nHC-HA/PTX3对M1表型的抑制相一致。
活化的嗜中性粒细胞的凋亡和凋亡嗜中性粒细胞的巨噬细胞吞噬作用
使用葡聚糖密度[Lymphocyte Poly(R),Cedarlane USA,Burlington,NC]离心法根据制造商的方案从正常人外周血中分离嗜中性粒细胞。将分离的嗜中性粒细胞以2×106个细胞/ml接种到在固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照上的IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基,Life Technologies,Grand Island,NY)中，并且用PBS(静息的)、N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)(1μM)(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)或LPS(1μg/ml)处理24小时(n＝3)。通过细胞死亡检测ELISA(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)根据制造商的方案测定细胞裂解物中的嗜中性粒细胞的凋亡。固定化的nHC-HA/PTX3而非HA促进fMLP或LPS激活的嗜中性粒细胞而非静息的嗜中性粒细胞的凋亡(图3D)。
然后检查静息的或LPS刺激的巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用。RAW264.7细胞(1×105个细胞/ml)在固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照上，在DMEM/10％FBS中，在进行或不进行LPS(1μg/ml)刺激下培养6天(n＝3)。然后取出细胞培养基，并将100μl含有2×106个细胞/ml的凋亡嗜中性粒细胞的IMDM(通过用roscovitine(20μM)(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)处理分离的静息人嗜中性粒细胞8小时来制备)加入至包含静息的或LPS刺激的巨噬细胞的各个孔中。在37℃下孵育30分钟后，用冷PBS洗涤各个孔三次，并且收集细胞裂解物(包含巨噬细胞和被吞噬的嗜中性粒细胞)，以通过测量被巨噬细胞吞噬的嗜中性粒细胞的ELISA试验来确定人髓过氧化物酶(MPO)的活性。收集细胞裂解物，并根据制造商的方案进行人髓过氧化物酶(MPO)ELISA试验(n＝4)(R&D Systems,Minneapolis,MN)。然后用通过BCA蛋白质试验(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)在各自的细胞裂解物中测量的总蛋白质来对MPO进行归一化，并表示为吞噬指数。无LPS(-LPS)刺激的静息细胞的吞噬指数在本实验中被定义为100％。固定化的nHC-HA/PTX3而非HA促进静息的或LPS处理的巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用(图3E)。
这些结果证明：固定化的nHC-HA/PTX3(第2)增强了活化的嗜中性粒细胞的凋亡和巨噬细胞对凋亡嗜中性粒细胞的吞噬作用。
参与固定化的nHC-HA/PTX3对M2巨噬细胞的极化的受体的分析
为了确定特定受体在M2巨噬细胞极化中的参与，在存在或不存在受体阻断抗体下进行M1和M2巨噬细胞标记物的定量mRNA表达。在DMEM/10％FBS中的RAW264.7细胞(2.5×105个细胞/ml)与PBS(对照)或针对CD44(10μg/ml)、TLR4(10μg/ml)或CD44/TLR4(各为10μg/ml)的阻断抗体在冰上预孵育30分钟(n＝3)。然后用LPS(1μg/ml)刺激细胞并在37℃下在固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照上孵育4小时。从总细胞中提取总RNA。如上所述以GAPDH作为内源对照，通过定量PCR来确定M1标记物(IL-12p40)和M2标记物(IL-10、LIGHT和SPHK1)的相对mRNA表达(图4A)。固定化的nHC-HA/PTX3而非HA消除了IL-12p40的表达，而促进IL-10、LIGHT和SPHK1的表达。CD44阻断抗体比TLR4阻断抗体更能抑制这种表达模式。相反，抗TLR4的阻断抗体比抗CD44的阻断抗体更能影响由固定化的HA引起的IL-12p40和IL-10转录物的表达。
还确定了IL-12和IL-10的蛋白质表达。从如上所述处理的(除了24小时(而不是4小时)以外)在固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照上培养的细胞中收集细胞培养上清液(n＝3)。通过ELISA(Biolegend,San Diego,CA)根据制造商的方案确定细胞培养上清液中的IL-12或IL-10蛋白质的量(图4B)。固定化的nHC-HA/PTX3消除了IL-12蛋白质的表达，而显著地促进IL-10蛋白质的表达。抗CD44的阻断抗体抑制这种表达模式。相反，固定化的HA促进IL-12蛋白质的表达，而抑制IL-10的表达，并且抗TLR4的阻断抗体更能影响该表达模式。
nHC-HA/PTX3(第2)与nHC-HA/PTX3(第4)复合物的比较
通过检查各复合物诱导巨噬细胞的细胞聚集(指示极差的细胞附着)和/或促进M2巨噬细胞极化的能力来比较nHC-HA/PTX3(第2)和nHC-HA/PTX3(第4)复合物。RAW264.7细胞(2.5×105个细胞/ml)在固定化的HA(2μg/孔)、nHC-HA/PTX3(2μg/孔)或PBS对照上在DMEM/10％FBS中培养，并用200单位/ml IFN-γ/1μg/ml LPS(均来自InvivoGen,San Diego,CA)刺激4小时或24小时(n＝3)。4小时后，用光学显微镜检查细胞聚集并拍照(图5A)。固定化的nHC-HA/PTX3(第4)而非nHC-HA/PTX3(第2)促进巨噬细胞的细胞聚集，这表明nHC-HA/PTX3(第4)不促进细胞向板的附着，而nHC-HA/PTX3(第2)却能促进。
24小时后，从细胞培养上清液获得样品，并通过各自的ELISA(Biolegend,SanDiego,CA)根据制造商的方案测定IL-12p40蛋白质和IL-23蛋白质浓度(图5B和5C)。nHC-HA/PTX3(第2)和nHC-HA/PTX3(第4)均抑制IFN-γ/LPS刺激的巨噬细胞中IL-12p40和IL-23蛋白质的产生。
实施例4：在不存在IαI的情况下，TSG-6和PTX3与固定化的HA(iHA)的体外结合
TSG-6与iHA的结合
如上所述制备固定化的HA(2μg/孔输入)。一系列的人TSG-6(在小鼠骨髓瘤细胞系NS0中过量表达，具有人TSG-6的Trp18至Leu277，带有C末端10个His的标签，登录号：P98066；R&D SYSTEMS,Minneapolis,MN,目录号：2104-TS)浓度(0、0.24、1.2、6、12和24μg/ml，100μl体积/孔)与iHA在反应缓冲液(含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下孵育2小时。通过8M盐酸胍和PBS的洗涤除去未结合的TSG-6。通过改进的TSG-6ELISA(R&D SYSTEMS,Minneapolis,MN)测量结合的TSG-6。由于TSG-6已经结合至在孔中偶联的iHA，所以省略样品与预包被的TSG-6抗体孵育的步骤。随后的步骤根据制造商的方案进行(图7A)。当iHA为约1.4μg(2μg HA/孔，基于～70％的偶联效率)时，TSG-6剂量依赖性地结合iHA且在约6μg/ml(或0.6μg，在0.1ml的反应溶液中)下达到其最大结合容量。TSG-6与HA的摩尔比为约37：1，基于TSG-6为35kDa且HA为～3,000kDa。
然后检查TSG-6/iHA复合物抵抗解离的能力。如上所述制备iHA(2μg/孔输入)。TSG-6(6μg/ml，100μl)与iHA在37℃下孵育2小时。通过用PBS(作为对照)或用不同解离剂或还原剂：6M盐酸胍/PBS、8M盐酸胍/PBS、2％SDS/PBS、100mM DTT/PBS和25mM NaOH/H2O洗涤除去未结合的TSG-6。如上所述，通过改进的TSG-6ELISA测量结合的TSG-6(图7B)。所形成的TSG-6/iHA复合物是稳定的并且耐受各种解离剂和/或还原剂的处理。在所有组之间未见统计学显著性。
PTX3与iHA的结合
如上所述制备固定化的HA(2μg/孔输入)。一系列的PTX3(在小鼠骨髓瘤细胞系NS0中过量表达，具有人PTX3的Glu18至Ser277，带有C末端6个His的标签，登录号：P26022；R&DSYSTEMS,Minneapolis,MN)浓度(0、0.04、0.2、1、5和25μg/ml,100μl体积/孔)与iHA在反应缓冲液(含有5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下孵育2小时。通过8M GnHCl和PBS的洗涤来除去未结合的PTX3。通过改进的PTX3 ELISA(R&D SYSTEMS,Minneapolis,MN)测定结合的PTX3。因为PTX3已经结合至在孔中偶联的iHA，所以省略样品与预包被的PTX3抗体孵育的步骤。随后的步骤根据制造商的方案进行(图8A)。当iHA为约1.4μg(2μg HA/孔，基于～70％的偶联效率)时，PTX3剂量依赖性地结合iHA且在约5μg/ml(或0.5μg在0.1ml的反应溶液中)下达到其最大结合容量。PTX3与HA的摩尔比为约24：1，基于PTX3为45kDa且HA为～3,000kDa。
然后检查PTX3/iHA复合物抵抗解离的能力。如上所述制备iHA(2μg/孔输入)。PTX3(5μg/ml，100μl)与iHA在37℃下孵育2小时。通过用PBS(作为对照)或用不同解离剂或还原剂：6M盐酸胍/PBS、8M盐酸胍/PBS、2％SDS/PBS、100mM DTT/PBS和25mM NaOH/H2O洗涤除去未结合的PTX3。如上所述，通过改进的PTX3 ELISA测量结合的PTX3(图8B)。所形成的PTX3/iHA复合物是稳定的并且耐受各种解离剂和/或还原剂的处理。在所有组之间未见统计学显著性。
TSG-6和PTX3与iHA的同时结合
如上所述制备iHA(2μg/孔输入)。6μg/ml的TSG-6和5μg/ml的PTX3(如上所述的最大结合浓度)单独或组合地与iHA在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中孵育。如上所述通过各自的改进的ELISA测量结合的TSG-6或PTX3。与单独加入TSG-6或PTX3时相比，当两种蛋白质同时与iHA孵育时，TSG-6或PTX3对与iHA的结合不存在竞争或协同作用(p>0.05)。这些数据表明：iHA上的TSG-6和PTX3结合位点是不同的并且可能不重叠(图9)。
TSG-6和PTX3与iHA的顺序结合
检查TSG-6和PTX3向iHA的顺序添加，以确定预结合的TSG-6或PTX3是否将抑制其他蛋白质与iHA的结合。将6μg/ml的TSG-6或5μg/ml的PTX3预结合至如上所述制备的iHA。用8M GnHCl和PBS洗涤后，PTX3(0、5或5μg/ml)或TSG-6(0、1.2或6μg/ml)的系列浓度随后分别与预结合的TSG-6/iHA或预结合的PTX3/iHA在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中孵育。通过各自的改进的ELISA测量随后结合的TSG-6和PTX3。
预结合的TSG-6(6μg/ml)部分阻止随后的PTX3与iHA结合(图10A)(当分别以1μg/ml和5μg/ml加入随后的PTX3时，p＝0.05和0.01)(图5A)。预结合的PTX3(5μg/ml)不干扰随后的TSG-6与iHA的结合(当分别以1.2μg/ml和6μg/ml加入随后的TSG-6时，p＝0.56和0.74)(图10B)。这些数据表明：TSG-6结合后iHA在结构上发生了改变，因此它干扰随后的PTX3结合。
实施例5：LPS刺激的巨噬细胞向固定化的TSG-6/iHA和PTX3/iHA复合物的附着
如上所述，Covalink-NH 96个孔与PBS(对照)、HA(iHA)或天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)共价偶联。然后加入TSG-6(6μg/ml)或PTX3(5μg/ml)并使其与iHA结合。将DMEM/10％FBS中的RAW264.7巨噬细胞(100μl，1×105个细胞/ml)接种至各个偶联的孔中，并用1μg/ml LPS进行处理。孵育24小时后，对细胞形态进行拍照。
当与塑料对照相比时，巨噬细胞较差地附着至iHA(即，导致更多的聚集的细胞)。TSG-6/iHA进一步阻碍这种附着，从而导致大量的和较大的细胞聚集。与此相反，PTX3/iHA促进细胞附着，产生与在固定化的nHC-HA/PTX3上所显示的模式相类似的模式(图11)。
实施例6：TSG-6/iHA和PTX3/iHA复合物对M1和M2标记物的调节
RAW264.7细胞如实施例5所述进行培养，并且用1μg/ml LPS在PBS(对照)、固定化的HA(iHA)、TSG-6/iHA、PTX3/iHA或nHC-HA/PTX3上刺激4小时。从细胞中分离总RNA，并且如上所述通过定量PCR测量M2标记物IL-10和M1标记物IL-12p40的mRNA表达(图12A和12D)。或者，用1μg/ml LPS(图12B和12E)或IFN-γ/LPS(图12C)刺激细胞24小时，并且使用各自的ELISA测量细胞培养基中IL-10、IL-12p70和IL-23的蛋白质表达。
与对照(Ctrl)的表达相比，在iHA(无)上IL-12p40 mRNA(IL-12p70的两个亚基之一)的表达未显著变化(p>0.05)(图12A)。相比之下，IL-12p40 mRNA在TSG-6/iHA上显著上调(p<0.01)，但在PTX3/iHA和nHC-HA/PTX3上显著下调(p<0.05)(图12A)。然而，IL-12p70蛋白质的表达在对照或单独的iHA上仅可检测到但没有任何显著差异(p>0.05)，但在TSG-6/iHA、PTX3/iHA和nHC-HA/PTX3上未检测到(图12B)。IL-12p40还充当IL-23的亚基。据观察，IL-23蛋白质的表达在TSG-6/iHA和PTX3/iHA上显著上调(p<0.01)，但在nHC-HA/PTX3上未检测到(p<0.05)(图12C)。这些数据表明：TSG-6/IHA和PTX3/iHA都有效地抑制IL-12而不抑制IL-23。
与对照相比，RAW264.7细胞的IL-10 mRNA表达在单独的iHA上没有显著改变(p>0.05)，但在TSG-6/iHA、PTX3/iHA和nHC-HA/PTX3上显著上调(p<0.05)(图12D)。然而，类似于固定化的nHC-HA/PTX3的阳性对照，IL-10蛋白质的表达在PTX3/iHA上仅显著上调(p<0.05)(图12E)。这些数据表明：遵循细胞附着的下列不同模式(实施例5)，所得细胞表现出不同的功能，并且PTX3/iHA比TSG-6/iHA在上调IL-10方面更有效。
实施例7：HC1和HC2从IαI向固定化的HA的体外转移
如上所述，Covalink-NH 96个孔与PBS(对照)、HA(iHA)或天然HC-HA/PTX3(nHC-HA/PTX3)共价偶联。系列TSG-6浓度(0、0.24、1.2、6、12μg/ml，在100μl中)单独地与iHA在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中孵育。人IαI(5μg/ml)(根据Blom等人1999)J.Biol.Chem.274,298–304从人血浆制备)与TSG-6同时加入或顺序(2小时后)加入。通过类似于上述TSG-6和PTX3 ELISA的各自改进的ELISA测量结合的HC1、HC2(针对HC1和HC2的抗体来自abcam,Cambridge,MA)或IαI(DAKO,Carpinteria,CA)。
数据表明，与同时添加TSG-6和IαI相比，当TSG-6预结合至iHA随后添加IαI时，结合至iHA的HC1(图13A)或IαI(图13B)的量在较高TSG-6浓度(6和12μg/ml)下较低。在样品中未检测到HC2(数据未示出)。用透明质酸酶孵育该孔，以消化结合的HA并从HA上释放结合的蛋白质，并且用抗-TSG-6抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)通过Western印迹分析这些样品；与随后加入IαI(即，在TSG-6与iHA结合之后，图13C)相比，当IαI与TSG-6同时加入时，结合至iHA的TSG-6的量较低。当5μg/ml的PTX3和5μg/ml的IαI同时与iHA孵育时，PTX3而非IαI与iHA结合(图13D)。
这些数据表明，在溶液中游离的TSG-6比结合到iHA的TSG-6更有效地将HC1从IαI转移至iHA上(图13A和13B)。与TSG-6和IαI同时与iHA孵育相比，当TSG-6预结合至单独的iHA时，更多的TSG-6与iHA结合(图13C)，这表明如果与TSG-6同时加入，则IαI阻止TSG-6与iHA结合，并且TSG-6在与IαI结合上比与iHA结合上可能具有更高的亲和力。此外，在溶液中游离的或结合至iHA的PTX3不将HC从IαI转移到iHA(图13D)。
实施例8：PTX3对形成HC1·TSG-6和HC2·TSG-6复合物的影响
IαI(40μg/ml)和TSG-6(6μg/ml)与或不与PTX3(20μg/ml或120μg/ml)在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下孵育2小时。使用针对HC1(图14A)、HC2(图14B)、TSG-6(图14C)、尿抑胰酶素(abcam,Cambridge,MA)(图14D)和PTX3(数据未示出)的抗体，通过Western印迹法对反应样品进行分析。在不含HMW HA的溶液中，TSG-6形成HC1·TSG-6和HC2·TSG-6复合物，并产生HMW IαI(图14A和图14B)。HMW IαI的形成在图14E中示出。此数据表明，HC1和HC2均被溶液中的TSG-6转移至HMW HA。
PTX3的同时加入剂量依赖性地抑制HC2·TSG-6而非HC1·TSG-6的形成(图14A和14B)。与此相反，包含HC2的HMW IαI增加而包含HC1的HMW IαI减少(图14A和14B)。在不含HMW HA且含有或不含PTX3的溶液中加入TSG-6时，TSG-6形成二聚体(图14C)。这些结果表明：1)IαI中的HC1和HC2要么与TSG-6形成复合物要么通过TSG-6的作用形成HMW IαI；2)关于由TSG-6转移HC1和HC2，PTX3不同地干扰上述过程。不存在HC1或HC2的截短形式。图14F示出了PTX3对HC2·TSG-6的抑制。
TSG-6和PTX3分别释放分别为约40kDa和45kDa的尿抑胰酶素的糖基化形式和糖基化且硫酸软骨素偶联的形式(图14D)。该数据与公布的数据一致，表明TSG-6和PTX3都与IαI相互作用，并且还表明TSG-6和PTX3与IαI不同地相互作用，导致尿抑胰酶素的不同后果。
在一个单独的实验中，HMW HA(250μg/ml)、IαI(40μg/ml)和TSG-6(6μg/ml)与或不与PTX3(1、2.5和5μg/ml)在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下在溶液中孵育24小时。用抗IαI的抗体，通过Western印迹法对反应样品进行分析(图14G)。在包含HMW HA而不包含PTX3的溶液中，来自IαI的HC被TSG-6完全转移至HMW HA。在PTX3的存在下，TSG-6介导的HC转移被剂量依赖性地抑制，导致LMW中间物(～130kDa且可能由HC1-TSG-6组成)或未加工的前-IαI(～130kDa,未加工的IαI(220kDa)和HMW IαI(保留在加样孔中)的累积(图14G)。这些数据与以下结果一致：PTX3特异性地防止HC2-TSG-6的形成，导致HC2转移和可能的HC1转移的抑制。
实施例9：在同时添加TSG-6、PTX3和IαI下，在体外由固定化的HA形成重建的HC- HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物
如实施例3所述制备固定化的HA(在各个孔中～14μg/ml或100μl中的1.4μg)。IαI(5μg/ml)和TSG-6(12μg/ml)同时在iHA上与或者不与PTX3(1、5或20μg/ml)在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下孵育2小时。用8M GnHCl和PBS洗涤后，通过各自改进的ELISA来测量结合的HC1、TSG-6和PTX3(分别为图15A、15D和15F)。各孔用8M GnHCl和PBS再次洗涤，并且用1单位/ml的透明质酸酶在60℃下在10mM乙酸盐缓冲液(包含75mMNaCl,pH 6.0)中消化具有结合的组分的iHA 2小时。用针对HC1(图15B)、HC2(图15C)、TSG-6(图15E)和PTX3(图15G)的抗体，通过Western印迹法对样品进行分析。
TSG-6、PTX3和IαI向iHA的同时加入导致包含HMW HC1而不含HC2的rcHC-HA/PTX3复合物和截短的HC1和HC2(图15A-C)。PTX3剂量依赖性地减少复合物中HMW HC1的量。这些数据显示：PTX3剂量依赖性地干扰TSG-6将HC1和HC2转移到iHA(图15A-C)，得到较少的HC1/截短的HC1和截短的HC2(图15B和15C)。TSG-6单体减少而HMW TSG-6(或者是多聚体的或者是与PTX3和/或HC复合的)没有改变(图15D和E)。
该数据还表明，在存在或不存在IαI下，PTX3不干扰结合到iHA的TSG-6。已公布的数据表明：当测试较小的MW HA(Baranova等人(2011)J Biol Chem.286(29):25675-86)时，TSG-6与iHA形成二聚体。本文提出的数据表明：在IαI的存在下，TSG-6与HMW HC-HA/PTX3复合物复合。由于PTX3以剂量依赖性的方式减少游离的TSG-6，所以进一步表明，在IαI的存在下，PTX3促进TSG-6向HC-HA/PTX3复合物中的结合。在这种情况下，大多数PTX3以多聚体形式存在于HC-HA/PTX3复合物中，这类似于已在NHC-HA/PTX3中观察到的情况，而具有含量逐渐降低的单体、二聚体或三聚体(图15F和G)。
实施例10：PTX3的顺序加入对在体外由TSG-6和IαI在固定化的HA上形成重建的 HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物的影响
如实施例3所述制备固定化的HA(～14μg/ml)。IαI(5μg/ml)和TSG-6(12μg/ml)在iHA上在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下孵育2小时。除去未结合的IαI和TSG-6后，包含或不包含PTX3(1、5或20μg/ml)的反应缓冲液与预结合的HC和TSG-6在37℃下孵育2小时。用8M GnHCl和PBS洗涤后，分别通过ELISA测定结合的HCl、TSG-6和PTX3(分别为图16A、16D和16F)。然后再次用8M GnHCl洗涤该孔。然后将PBS对照和具有结合的组分的iHA用1单位/ml的透明质酸酶在60℃下消化2小时。用针对HC1(图16B)、HC2(图16C)、TSG-6(图16E)、PTX3(图16G)的抗体，通过Western印迹法对样品进行分析。
当在TSG-6和HC已预结合至iHA上之后加入PTX3时，PTX3剂量依赖性地降低HC1向HMW复合物的转移(完整的HC1和截短的HC1都减少)，但增加了复合物中的截短的HC2的量。与实施例7所示的数据一致，结合的TSG-6比游离的TSG-6在将HC转移至iHA方面效率更低。
类似于实施例8中所示的数据，PTX3也剂量依赖性地减少HMW TSG-6和单体TSG-6(图16D和16E)，这表明PTX3的后续加入连续地消耗预结合的TSG-6。然而，PTX3不再能够引入TSG-6/HC-HA复合物中(图16F和16G)。因为iHA中的预结合的TSG-6也部分地阻止PTX3与iHA结合(参见实施例4)，这一发现表明：由TSG-6和IαI形成rcHC-HA/PTX3复合物在结构上不同于TSG-6/iHA，其程度为完全排除PTX3与iHA的结合。
实施例11：由固定化HA上的预结合的PTX3和随后加入TSG-6和IαI在体外形成重建 的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物
如实施例3所述制备固定化的HA(～14μg/ml)。PTX3(5μg/ml)和iHA在反应缓冲液(包含5mM MgCl2的PBS,pH 7.5)中在37℃下在反应缓冲液中孵育2小时。除去未结合的PTX3后，包含TSG-6(6μg/ml)和IαI(5、25和125μg/ml)的反应缓冲液在37℃下孵育2小时。用8MGnHCl和PBS洗涤后，分别通过ELISA测定结合的HCl、TSG-6和PTX3(分别为17A、17C和17E)。然后再次用8M GnHCl洗涤该孔。然后将PBS或具有结合的组分的iHA用1单位/ml的透明质酸酶在包含75mM NaCl的10mM乙酸盐缓冲液(pH 6.0)中在60℃下消化2小时。用针对PTX3(图17B)、TSG-6(图17D)、HC1(图17F)和HC2(图17G)的抗体，通过Western印迹法对样品进行分析。
在IαI和TSG-6的存在下，预结合的PTX3剂量依赖性地增加了对PTX3的ELISA免疫反应性和多聚体的PTX3的量，但减少了HC-HA/PTX3复合物中的单体PTX3的量(图17A和17B)。该数据表明，多聚体PTX3促进针对该抗体的免疫反应性。
预结合的PTX3剂量依赖性地排除了单体TSG-6，而减少了rcHC-HA/PTX3复合物中的TSG-6(图17C和17D)。当IαI与TSG-6的摩尔比为3：1时，检测到结合的TSG-6(单体和HMW两种形式)的显著减少，其中，结合的多聚体PTX3也最大化。
基于HC1 ELISA数据，结合的HC1没有显著变化(图17E)。通过增加IαI浓度而剂量依赖性地增加了HC2的转移。
实施例12：在体外由预结合的TSG-6形成的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复 合物与固定化HA上的预结合的PTX3之间，巨噬细胞附着活性的比较
如实施例3所述将Covalink-NH 96个孔与PBS(对照)、HA(iHA)或nHC-HA/PTX3共价偶联。IαI(5μg/ml)、TSG-6(6μg/ml)或PTX3(5μg/ml)如下同时或顺序地结合到iHA：(1)(IαI/TSG-6/PTX3)/iHA：IαI、TSG-6和PTX3同时与iHA在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时；(2)(IαI/TSG-6)/PTX3/iHA：IαI和TSG-6首先与iHA在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时。除去未结合的IαI/TSG-6，用8M GnHCl和PBS洗涤后，加入PTX3并且在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时；(3)(PTX3)/IαI/TSG-6/iHA：PTX3首先与iHA在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时。除去未结合的PTX3，用8M GnHCl和PBS洗涤后，加入IαI/TSG-6并且在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时。复合物形成后，将100μl的RAW264.7细胞(1×105个细胞/ml)接种至各个偶联的孔中并用1μg/ml LPS处理。孵育24小时后，对细胞形态拍照。
与对照一样，巨噬细胞较差地附着至iHA。在IαI的存在下，同时的TSG-6和iHA或预结合至iHA的TSG-6((IαI/TSG-6/PTX3)/iHA或(IαI/TSG-6)/PTX3/iHA)抑制细胞附着并促进细胞聚集(图18)，类似于无IαI的情况(参见实施例5)。反之，预结合至iHA的PTX3[(PTX3)/IαI/TSG-6/iHA]促进细胞附着，类似于如实施例5所示的无IαI的预结合的PTX3。后者类似于nHC-HA/PTX3的阳性对照(图18)。
实施例13：在体外由预结合的TSG-6形成的重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复 合物与固定化HA上的预结合的PTX3之间，M1和M2标记物表达调节的比较
在rcHC-HA/PTX3复合物上培养的巨噬细胞中IL-10和IL-12p40的表达
如实施例12所述，RAW264.7细胞在固定化的基底上在DMEM/10％FBS中培养，并用1μg/ml的LPS刺激4小时。分离总RNA，并如上所述通过定量PCR测量IL-10和IL-12p40 mRNA的表达(图19A和19C)。或者，用1μg/ml的LPS刺激细胞24小时，并且通过各自的ELISA测量细胞培养上清液中的IL-10和IL-12p70蛋白质(图19B和19D)。
与PBS对照相比，iHA未显著改变IL-10 mRNA的表达(p＝0.56)，但在通过在iHA上同时添加TSG-6、IαI和PTX3而形成的复合物上显著上调(图19中的IαI/TSG-6/PTX3(a))(p＝0.0008)。类似地，IL-10mRNA的表达在通过预结合至iHA的TSG-6和随后添加IαI和PTX3而形成的复合物(图19中的IαI/TSG-6/PTX3(b))(p＝0.04)上和阳性对照nHC-HA/PTX3(p＝0.008)上显著上调。IL-10 mRNA的表达在nHC-HA/PTX3上显著高于在IαI/TSG-6/PTX3(a)上(p＝0.04)，但并未显著高于在IαI/TSG-6/PTX3(b)上(p＝0.55)。相反，IL-10 mRNA的表达在通过预结合至iHA的PTX3而形成的复合物(在图19中的IαI/TSG-6/PTX3(c))上未显著上调(p＝0.74)(图19A)。如通过ELISA测量的，IL-10蛋白质的表达仅被nHC-HA/PTX3显著上调(p＝0.03)(图19B)。
与对照相比，iHA未显著改变IL-12p40(IL-12p40是IL-12p70的两个亚基之一，并且另一个亚基为IL-12p35)mRNA的表达(p＝0.1)。相反，IL-12p40 mRNA的表达在通过在iHA上同时添加TSG-6、IαI和PTX3而形成的复合物(图19中的IαI/TSG-6/PTX3(a))上(p＝0.05)和由预结合至iHA的TSG-6形成的复合物(图19中的IαI/TSG-6/PTX3(b))上(p＝0.04)显著上调。相反，IL-12p40 mRNA的表达在由预结合的PTX3形成的复合物(图19中的IαI/TSG-6/PTX3(c))上被完全消除，并且被nHC-HA/PTX3显著下调(p＝0.01)。在后两个条件之间存在统计学显著性差异(p＝0.04)(图19C)。与对照相比，IL-12p70蛋白质的表达未被iHA显著改变(p＝0.32)，但在由预结合的PTX3形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(c))上显著下调(p＝0.03)(图19D)。相反，IL-12p70蛋白质的表达在通过在iHA上同时添加TSG-6、IαI和PTX3而形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(a))上、在由预结合的PTX3形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(c))上和在nHC-HA/PTX3上被消除(p分别＝0.05、0.02和0.01)。
在各种刺激物的存在下培养的巨噬细胞中1L-23的表达
在单独的实验中，测定静息RAW264.7细胞(无)或受刺激细胞在DMEM/10％FBS中24小时的细胞培养上清液中的IL-23蛋白质，该刺激是用IFN-γ(200单位/ml)、LPS(1μg/ml)、IFN-γ/LPS、含有免疫复合物或IC的LPS(1μg/ml)(LPS/IC)[IC含有150μg/ml IgG-调理的OVA(IgG-OVA)，并且通过在25℃下将十倍摩尔过量的兔抗-OVA IgG(Cappel,Durham,NC)与OVA(Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)混合30分钟而制得]或IL-4(10ng/ml)(R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激。根据制造商的方案，通过IL-23ELISA(Biolegend,San Diego,CA)测量细胞培养上清液中的IL-23蛋白质(图19E)。IL-23蛋白质在静息RAW264.7细胞的细胞培养上清液中和在用LPS(1μg/ml)、含有免疫复合物的LPS(LPS/IC)或IL-4(10ng/ml)刺激24小时的细胞的细胞培养上清液中未检测到，但在用IFN-γ(200单位/ml)和IFN-γ/LPS刺激24小时下变为可检测的(图19E)。
在rcHC-HA/PTX3复合物上培养的巨噬细胞中IL-23的表达
在单独的实验中，如上所述在固定化的基底上培养RAW264.7细胞，并用IFN-γ/LPS刺激24小时。如上所述通过IL-23ELISA测量细胞培养上清液中的IL-23(图19F)。
与对照相比，用200单位/ml IFN-γ/1μg/ml LPS刺激24小时的RAW264.7细胞的细胞培养上清液中的IL-23蛋白质未受iHA显著影响(p＝0.02)，但在通过在iHA上同时添加TSG-6、IαI和PTX3而形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(a))上(p＝0.002)和在由预结合至iHA的TSG-6形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(b))上(p＝0.0005)显著上调。相反，类似于nHC-HA/PTX3(p＝0.05)，IL-23蛋白质在由预结合的PTX3形成的复合物(IαI/TSG-6/PTX3(c))上完全消除(p＝0.05)(图19F)。
实施例14：HC-HA/PTX3用于治疗慢性移植物抗宿主病的用途
异体造血干细胞移植(HSCT)是针对血液恶性肿瘤的一种潜在治愈性治疗。然而，慢性移植物抗宿主病(cGVHD)仍然是主要的并发症。GVHD在45-60％中引起眼部表现，其中干眼症是最常见的并发症，在近50％的异体HSCT受者中发生。事实上，干眼症是诊断cGVHD的区别性指征和症状。cGVHD患者或者表现为与cGVHD相关的早期轻度干眼症或者表现为根据NIH共识会议分类的所谓“cGVHD的区别特征”。已经注意到HSCT后的两种类型的干眼症；一种具有严重的眼表面和泪液功能损伤，其中在干眼症发作后不久发生的反射性流泪减少，而另一种是轻微的，具有正常的反射性流泪。干眼症通常在移植6个月后发生，且已报道其严重性与cGVHD和睑板腺疾病的存在相关。与cGVHD相关的严重干眼症的发作早于轻度干眼症。例如，严重干眼症发生在HSCT后的6.8±2.5个月，而轻度干眼症发生在HSCT后的13.2±9.1个月。25名HSCT后患者的50只眼睛与14名年龄匹配的健康对照的28只眼睛的比较研究表明：在与cGVHD相关的干眼症中比正常对照和HSCT后无干眼症的受试者中更多地注意到MG梗阻、降低的角膜敏感度、增强的泪液蒸发速度、降低的结膜GCD、增加的结膜鳞状上皮化生和炎性细胞。此外，严重干眼症中的结膜炎性细胞显著高于轻度干眼症(P<0.03)。而且，大多数严重干眼症患者患有全身性cGVHD，而在轻度干眼症组中只有少数患者患有全身性cGVHD。这些发现表明与cGVHD相关的严重和轻度干眼症的不同病理过程。由于在HSCT后患者(不论他们是否患有与cGVHD相关的干眼症)中注意到全面的眼表面改变，因此他们的结果表明炎性过程的程度似乎在与cGVHD相关的干眼症的结果中起到关键作用。与正常对照和HSCT后无干眼症的受试者相比，在与cGVHD相关的严重干眼症和轻度干眼症患者中，结膜刷细胞学标本显示显著增加的炎性细胞数。而且，严重干眼症标本中的炎性细胞的数目显著高于轻度干眼症标本中的炎性细胞数。此外，来自与cGVHD相关的干眼症患者的结膜和泪腺的活检样品中表达许多炎症标记物，证实了炎症与cGVHD相关干眼症的发病机制相关。
在cGVHD中产生多种瘢痕形成形成并发症的一个可能的原因是经由慢性炎症释放的细胞因子因浸润供体淋巴细胞而引起的结膜基底上皮和泪腺肌上皮的EMT。先前已经认识到，炎症和过度纤维化是慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的显著组织学特征，但这些变化的基础机理仍然是未知的。cGVHD表现出类似于硬皮病的特征，展示出皮肤损伤中显著的纤维化、肺纤维化和慢性免疫缺陷。眼部cGVHD的临床特征包括干眼症、沙眼或眼疼的发作，包括结膜下纤维血管组织形成在内的瘢痕性结膜炎，和巩膜缩短(其为结膜纤维化的特有特征)。除了皮肤损伤中的硬化特征之外，口中的粘膜萎缩、食管的上三分之一至中间三分之一的缩窄或狭窄、由硬化引起的关节僵硬或挛缩和肺的闭塞性支气管炎也一起表明全身性GVHD-介导的纤维化的特征。受影响的外分泌腺和粘膜中的主要组织学发现是间质的明显纤维化和成纤维细胞数目的显著增加，伴有轻度的淋巴细胞浸润。临床上，干眼症的严重程度与纤维化变化程度相关，而不与淋巴细胞浸润的程度相关，这表明过量的细胞外基质累积主要造成外分泌功能障碍。间质中的成纤维细胞也通过附着至淋巴细胞并表达II类人白细胞抗原和共刺激分子而在炎症中起作用。这些发现一起表明，成纤维细胞在cGVHD的发病机制中发挥重要作用。而且，我们已发现，在cGVHD患者的泪腺中累积的成纤维细胞具有嵌合状态。因此，起源于循环供体来源的前体的成纤维细胞和受体来源的成纤维细胞可以通过相互作用T细胞而参与cGVHD患者中的过度纤维化。目前还不清楚是否通过抑制T细胞浸润控制炎症将会在cGVHD中导致较少的瘢痕性并发症。
先前，通过将免疫组织化学与Y-染色体荧光原位杂交(FISH)方法相结合来检测人cGVHD组织样品中的供体来源的成纤维细胞。使用由Zhang等人((2002)J Immunol.168:3088-3098)建立的鼠模型，可重现上述结果。在这种模型上，泪液量在移植后3周开始减少。泪腺管周围的早期纤维化和进行性纤维化早在移植后3周就检测到，并且以类似于人样品的方式逐渐进展，最多达8周。为了成功创建GVHD组和对照组，我们已进行该实验超过20次，基于对泪腺组织样品和泪液量的分析，总重现性为70-80％。
在一个典型的移植实验中，7到8周龄雄性和雌性B10.D2(H-2d)和BALB/c(H-2d,Sankyo Laboratory,Ltd)小鼠分别用作供体和受体，使用加入的脾细胞作为成熟T细胞的来源。简言之，雌性受体小鼠接受来自Gammacel 137Cs源(J.L.Shepherd&Associates,SanFernando,CA)的700cGy的致死性辐射。大约6小时后，通过尾静脉向其注射悬浮在RPMI1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)中的雄性受体骨髓(1×106/小鼠)和脾(2×106/小鼠)细胞。对照组(同基因BMT)由接受相同量的雌性BALB/c脾细胞和骨髓细胞的雌性BALB/c受体小鼠组成。(Zhang等人(2002)J Immunol.168:3088-3098)。对于HC-HA/PTX3治疗，在骨髓移植后预定的时间，诸如骨髓移植后7、14、21和28天，通过结膜下注射施用HC-HA/PTX3复合物。
使用包括但不限于以下的试验评估治疗效果：用Mallory染色测量泪腺纤维化，使用HSP47(胶原特异性分子伴侣)作为活化的成纤维细胞的标记物来确定每个视野内活化的成纤维细胞的数目，使用棉线试验来测量在匹鲁卡品刺激下的泪腺泪生成，以及使用RT-PCR测定纤维发生细胞因子如HSP47、IL-4、IL-6和TGF-β的水平。
可以预期，用HC-HA/PTX3复合物的治疗将导致小鼠模型中泪腺纤维化的减少。然后在临床条件下将HC-HA/PTX3复合物通过结膜下注射而施用于人类受试者，以用于治疗由cGVHD引起的干眼症。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例15：HC-HA/PTX3在小鼠模型中治疗炎症的用途
在本实施例，在HSV-1坏死性角膜基质角膜炎的鼠模型中测试了抗炎症功效。从Charles River Wiga(Sulzfeld,Germany)获得的总共240只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)通过腹膜内注射2mg盐酸氯胺酮和400ng盐酸甲哌卡因而麻醉。对于各只小鼠，使用27号针在手术显微镜下以8个水平和8个垂直划痕的交错图案刮一只眼睛的中心角膜。向每个受伤的角膜施加5μl含有1×105个空斑形成单位的HSV-1病毒(KOS株)的悬浮液，该HSV-1病毒常规在Vero细胞中繁殖，储存在-80℃下，并通过标准的空斑形成试验进行定量。在HSV-1接种后第14天，将已发展为严重溃疡性间质性角膜炎的小鼠角膜纳入该研究(约50％产率)并细分成3组，每组包括40个角膜(n＝6用于临床检查，n＝5用于组织学，n＝5用于免疫染色，n＝6用于细胞因子ELISA，n＝5用于TUNEL，和n＝10用于流式细胞术，和n＝3用于消耗/备份)。未感染的对侧眼用作阴性对照组。阳性对照组接受使用210-O尼龙缝合线闭合眼睑的睑缘缝合术。实验HC-HA/PTX3组接受与阳性对照相同的睑缘缝合术且接受每日4次局部施用包含纯化的HC-HA/PTX3复合物的组合物。实验HA组接受相同的睑缘缝合术，但接受每日4次局部施用仅HA的组合物。两天后，在所有三个组中取消睑缘缝合术。使用手术显微镜(Zeiss，Germany)，用0-4+的分数评估各角膜的基质炎症的严重程度，1+具有小于25％的角膜浑浊伴角膜新血管形成、水肿和变薄，2+为小于50％，3+为小于75％，且4+为75-100％。通过经CO2室及随后进行颈椎脱位施以安乐死后，使用针对CD11b(嗜中性粒细胞和巨噬细胞)、F4/80(巨噬细胞)、GR-1(PMN)和CD3(T细胞)的第一抗体对每个组的5个角膜进行冷冻切片免疫染色(见方法部分)，且每个组的另外5个角膜进行苏木精-曙红染色和TUNEL染色。另外，由每个组的6个角膜制备的角膜匀浆进行IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNFα水平的ELISA测定。用胶原酶从每个组的10个角膜中释放的细胞准备用于流式细胞术，以通过MTT试验对活细胞进行定量，并通过膜联蛋白V-PE凋亡检测试剂盒(BD-Pharmingen,Heidelberg,Germany)对凋亡细胞进行定量。
预期在待纳入研究中的接种后两周内，50％的小鼠HSV-1感染的角膜会发展为严重的角膜基质角膜炎(炎症)、水肿和溃疡。两天后，未感染的角膜将保持正常，而对照组中的感染的角膜在取消睑缘缝合术时将维持类似的严重的炎症。类似于对照组，实验HA组中的角膜将表现出类似的严重的炎症。相反，实验HC-HA/PTX3组的角膜将显示炎症减少，这与以下结果相关并被以下结果所证实：与阳性对照组和实验HA组相比，基于组织学和CD11b、F4/80、Gr-1和CD3免疫染色，炎性(PMN/巨噬细胞)和免疫(T-细胞)浸润显著减少；基于ELISA，炎性和免疫细胞因子如IL-1α、IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α显著减少；以及角膜组织中的TUNEL阳性细胞和用胶原酶从角膜中释放和死细胞(MTT)及凋亡细胞显著增多(使用膜联蛋白-V/7-AAD的流式细胞术)。总的来说，这些数据支持HC-HA/PTX3复合物在该鼠HSV-1模型中发挥临床抗炎功效的观点。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例16：HC-HA/PTX3在兔模型中抑制瘢痕形成的用途
在本实施例中，在准分子激光辅助屈光性角膜切削术(PRK)的兔模型中测试了抗瘢痕形成的功效。使用共30只体重(BW)为2.5-3.0kg的新西兰白兔(性别不限)并被细分成3组(每组n＝10)：非PRK对照组、PRK HA组和PRK HC-HA/PTX3组。PRK之前及对于所有CMTF检查，兔子通过肌内注射5mg/kg BW甲苯噻嗪和30mg/kg BW氯胺酮和局部施用0.5％盐酸丁卡因眼用溶液(Ortopics Laboratories Corp.,Fairton,NJ)进行麻醉。对于两个PRK组，通过在恰好大于消融区的区域内用钝刮刀轻轻刮擦而手动地移除每只动物的一只眼睛的角膜上皮，用生理盐水冲洗裸露的基质，并且用纤维素海绵轻轻地移除过量的液体。使用LaddarVision准分子激光器(Alcon,Ft.Worth,TX)进行标准的6mm直径、9.0D PRK近视矫正PRK，以实现118μm的预测的理论基质消融深度。紧接PRK后并在此之后，对PRK HC-HA/PTX3组施用含有HC-HA/PTX3复合物的组合物，而对PRK HA组施用仅含有HA的组合物，两组均在此之后每日四次施用，共3周。此外，所有PRK治疗的眼眼均滴加局部0.1％双氯芬酸钠(PRK后立即滴加一滴)和0.3％硫酸庆大霉素(每日3次，共3天)。
在PRK之前和PRK后一周、两周、三周和四周、两个月和四个月，使用配有24X表面接触物镜的改良Tandem扫描共焦显微镜(Tandem Scanning Corporation,Reston,VA)对所有术后眼睛(来自每组n＝6)进行体内CMTF。在角膜形态的标准共焦检查之后，将摄像机设置(增益、千伏和黑面水平)切换到手动并在研究过程中保持不变，以允许所有扫描的直接比较。CMTF作为通过整个角膜的连续的z轴扫描来进行。通过在覆盖所有区域的面积中进行10个连续CMTF扫描将角膜、上皮和基质厚度映射至中心3mm区域内。随后的计算仅使用从与光消融轮廓的中心相对应的最薄基质区域所获得的数据。从CMTF录像产生基于图像强度深度的CMTF图谱。通过CMTF图谱测量角膜反射率，并以任意单位(U)表示，该任意单位被定义为μm*像素强度，作为角膜浑浊的估计值。
为了鉴别并测量基质纤维化组织的存在，如之前所报道的，来自各组(对照和治疗)的3个PRK处理的动物用溶解于0.2M碳酸氢钠中的0.5％5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素(DTAF)进行活体染色。2分钟染色后，在局部抗生素给药前彻底冲洗眼睛以去除多余的染料。PRK后4个月，通过静脉内注射戊巴比妥钠(120mg/kg BW)对动物施以安乐死。安乐死之后，将所有角膜通过前房灌注包含2％低聚甲醛的PBS(pH7.2)而原位固定3分钟，切除，置于新鲜的固定液中，并在4℃储存。组织然后包埋至OCT，在液氮中骤冻，并使用冷冻切片机切片。对组织进行连续逐层切片，以识别光消融的中央和最深部，并使用针对角膜蛋白聚糖、CD3434、FITC偶联的鬼笔环肽、ED-A纤连蛋白、S-100A4和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的抗体进行免疫染色，以将角膜浑浊的变化(根据CMTF光反射率)与角膜细胞至成纤维细胞和肌成纤维细胞的表型变化相关联。此外，在用DTAF染色的那些眼睛中，通过确定基底上皮细胞和DTAF染色的角膜组织(代表原始的、未受损的角膜基质)之间的距离来测量沉积的纤维化组织的厚度。
可以预期，体内共焦显微镜检查将揭示特征性的上皮、基底层、基质和内皮特征，这些特征将与定义明确的峰很好地关联，当对非PRK对照的角膜和接受PRK的角膜分析体内CMTF-图谱时，所述峰的强度和位置随时间发生变化。根据公布的数据，在PRK后1周，PRK处理的角膜将显示来自表面上皮、光消融的基质表面、纺锤状成纤维细胞层和内皮的四个峰，而非PRK对照的角膜将显示来自表面上皮、基底层和内皮的三个峰。预期在PRK后1周，两个实验组之间不会有太大的差别。在PRK后2周，实验PRK HA组将由于纺锤状成纤维细胞的持续细胞迁移而显示接近光消融的基质表面的增强的峰强度。然而，预期在实验PRK HC-HA/PTX3组中，再增殖的成纤维细胞的强度(根据峰的高度)将大为降低。在PRK后3周至四个月期间，在实验PRK HA组中由于无细胞前基质的再增殖的完成，对应于纺锤状成纤维细胞的层的峰将与来源于光消融的基质表面的峰融合，并且将导致对应于光消融的基质表面的峰的反射率急剧增加。与此相反，在实验PRK HC-HA/PTX3组中将不存在反射率的这种急剧增加。光反射率的这种差异也可通过计算来源于特定角膜内结构的CMTF峰的面积来定量。预期实验PRK HA组在PRK后前2-3周内将表现出反射率强度的大幅线性增加，而此后表现出反射率的缓慢线性下降。与此相反，预期在这两个时期内，在实验PRK HC-HA/PTX3组中将存在反射率的显著降低。总的来说，这些CMTF数据支持：在无细胞前基质的再增殖期间，HC-HA/PTX3复合物对角膜细胞活化、迁移和细胞募集发挥抑制作用，从而解释了为什么角膜光散射(浑浊)与先前报道的抗TGF-β抗体类似地减少。因此，在前基质内存在活化的、迁移的、基质内创伤愈合角膜细胞的较低的细胞性和反射率，和新的基质细胞外基质的较少沉积，以及正常的静止角膜细胞群体的更快建立。这一结论得到以下结果的证实：与PRK后2-3周期间的实验PRK HA组相比，实验PRK HC-HA/PTX3组中活化的角膜细胞(在表达角膜蛋白聚糖的细胞中的F-肌动蛋白)、成纤维细胞(S-100A4的细胞质染色，ED-A纤连蛋白的膜表达)以及肌成纤维细胞(S100A4的细胞核表达和α-SMA的细胞质表达)显著减少。还预期，与PRK HA组相比，在PRK HC-HA/PTX3组中基底上皮细胞与DTAF染色的角膜组织之间的距离将显著降低，表示显著减少的纤维化组织。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例17：HC-HA/PTX3用于治疗动脉粥样硬化的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物用于治疗动脉粥样硬化。
动脉粥样硬化包括炎性细胞群体，尤其是巨噬细胞的参与。在疾病进展中观察到巨噬细胞的表型转换。在动脉粥样硬化中，循环单核细胞通过CCR2和内皮细胞粘附介导的机制被募集到血管内膜和内膜下层中的脂肪沉积物积累部位。一旦抵达，这些细胞变为活化的并且分化成巨噬细胞。随后脂肪沉积物开始成熟成斑块，伴随炎性细胞、平滑肌细胞的持续募集和细胞外基质的产生。在早期动脉粥样硬化中的初始浸润巨噬细胞群是异质的，但具有主要是M2样的表型。在病变进展和扩展的同时，观察到向主要是M1的表型的转换。这种表型转换可能是由于巨噬细胞吞噬斑块中过量的氧化的低密度脂蛋白(LDL)以及局部Th1细胞产生IFN-γ，从而导致泡沫细胞巨噬细胞的发育。泡沫细胞巨噬细胞展现出高度活化的表型，导致产生促炎介质和使得斑块不稳定的MMP，潜在地导致血栓栓塞。防止M2向M1转换或者选择性消耗M1巨噬细胞的疗法在临床上用于动脉粥样硬化斑块的稳定化。
将通过本文描述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至患有动脉粥样硬化的受试者。例如，采用HC-HA/PTX3复合物包被植入式医疗装置，如支架，以用于植入炎症部位或炎症部位附近。用HC-HA/PTX3复合物治疗动脉粥样硬化预计将减少炎症并防止血栓栓塞。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例18：HC-HA/PTX3用于治疗肥胖症和胰岛素抗性的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗肥胖症和胰岛素抗性。
在瘦和肥胖状态下，脂肪组织巨噬细胞(ATM)均包含显著比例的脂肪组织的细胞组分。在正常人中，ATM构成高达10％的该组织的细胞成分。相比较而言，在肥胖受试者中这一数字上升到高达40％。在正常的、非肥胖受试者中，ATM具有极化的M2表型，其特征在于提高的基线STAT6和PPAR-γ表达。这些细胞在营养物代谢中发挥重要的和有益的作用。PPAR-γ的缺乏导致M2巨噬细胞功能受损和对饮食诱导的炎症和胰岛素抗性的易感性。与此相反，ATM在肥胖过程中在脂肪组织内累积，具有强极化的促炎M1表型。这些细胞产生高水平的TNFα、IL-6和IL-1β，所有这些均在来自胰岛素抗性个体的升高水平的脂肪组织中观察到。高水平的促炎介质局部地损害了固有的胰岛素加工细胞的功能。
将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至罹患肥胖症或胰岛素抗性的受试者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为凝胶溶液施用以供治疗。预期用HC-HA/PTX3复合物治疗将促进脂肪组织巨噬细胞(ATM)从促炎性M1表型到M2表型的表型转换并且恢复正常的胰岛素加工。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例19：HC-HA/PTX3用于治疗1型糖尿病的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗1型糖尿病。
1型糖尿病(1型糖尿病、T1DM、IDDM，或者曾经称为青少年糖尿病)是一种由胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏而导致的糖尿病形式。随后的胰岛素缺乏导致血液和尿液葡萄糖增加。典型症状是多尿(尿频)、多饮(增多的口渴)、多食(增多的饥饿感)和体重减轻。
将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以包含用HC-HA/PTX3复合物包被的自体或异体胰岛素生产细胞的微胶囊的形式施用至罹患1型糖尿病的受试者。例如，通过注射将微胶囊施用于受试者。预期用HC-HA/PTX3包被的微胶囊的治疗将允许产生在受试者中释放的胰岛素并且防止或减少针对细胞治疗或微胶囊的炎性应答，从而减轻1型糖尿病及其症状。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例20：HC-HA/PTX3用于治疗纤维化的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗纤维化或纤维化病症。
进行性纤维化病症，如特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化和系统性硬化症，被巨噬细胞紧密调节。“促纤维化”的巨噬细胞表现出M1属性并产生多种介质，包括TGFβ1、PDGF和胰岛素样生长因子1，它们直接激活成纤维细胞和成肌纤维细胞，这些细胞控制ECM沉积。促纤维化巨噬细胞也产生MMP、TIMP和IL-1β。IL-1β刺激TH17细胞产生IL-17，IL-17是博来霉素诱发的肺纤维化(与IPF具有类似特征的纤维化病症)的重要的诱导物。M2样巨噬细胞产生IL-10、RELMα和ARG1抑制纤维化。
将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至罹患纤维化或纤维化病症的受试者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为溶液、凝胶或者作为植入式医疗装置上的涂层而施用。预期用HC-HA/PTX3复合物治疗将减少M1巨噬细胞以及成纤维细胞和成肌纤维细胞的活化，并且增加在受试者的受累部位存在的M2巨噬细胞的量，从而抑制纤维化及其症状，例如瘢痕形成。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例21：HC-HA/PTX3用于治疗慢性炎症的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗慢性炎性病症，如类风湿性关节炎。
许多自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎，涉及对自身抗体的炎症应答，其活化Fc受体从而触发肥大细胞和巨噬细胞的活化，以及嗜中性粒细胞的侵入。这导致激烈的局部炎症应答，如果不解决，将随着修复和破坏的循环随时间导致组织损伤。在类风湿性关节炎中，CSF1由滑膜成纤维细胞组成型产生并募集组织浸润的单核细胞和巨噬细胞。此外，局部产生的CSF1，连同RANKL一起，诱导单核细胞分化为破骨细胞，其引发骨丢失。
将通过本文描述的方法产生的HC-HA/PTX3复合物施用至罹患慢性炎性病症如类风湿性关节炎的患者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为溶液、凝胶或者作为植入式医疗装置上的涂层而施用。预期用HC-HA/PTX3治疗将抑制M1促炎巨噬细胞，诱导嗜中性粒细胞凋亡，并抑制破骨细胞分化，从而治疗炎性病症及其症状。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例22：HC-HA/PTX3用于治疗急性炎症应答的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗由诸如心肌梗死、中风或脓毒症的病症引起的急性炎症应答。将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至患有由诸如心肌梗死、中风或脓毒症的病症引起的急性炎症应答的受试者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为溶液通过静脉输注施用。预期HC-HA/PTX3复合物将通过抑制M1炎性巨噬细胞而降低或防止由急性炎症引起的损伤。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例23：HC-HA/PTX3用于治疗癌症的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗癌症。
已观察到大量炎性细胞参与肿瘤发展和进展，并通常被描述为“阴燃炎症(smoldering inflammation)”。这些发现导致了良好建立的炎性细胞(特别是巨噬细胞)与癌症之间的联系。最初认为癌基因的发展导致了癌症的标志微环境，其中转化的细胞分泌促进组织发育并防止凋亡以及抑制细胞毒性免疫应答(称为“内源性途径”)的细胞因子和趋化因子。现在认识到另一途径导致肿瘤发生的存在。这种“外源性途径”最初特征在于由持续的微生物感染、自身免疫性疾病或未知来源的其他病因导致的慢性促炎环境。在这些情况下长期产生大量炎性介质可导致肿瘤细胞增殖和存活，或导致在正常细胞中诱导遗传不稳定性，以及导致的癌基因的表达和免疫抑制性细胞因子的产生。因此，在许多情况下，早期肿瘤发展的特征在于极化的炎性、M1样巨噬细胞环境。
将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至患有癌症如实体瘤癌症的受试者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为溶液、凝胶或者作为植入式医疗装置上的涂层而施用以用于局部、注射或植入应用。因为HC-HA/PTX3可以抑制M1巨噬细胞的极化，因此预期使用HC-HA/PTX3治疗会抑制或阻止癌症或其进展到晚期表型。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例24：HC-HA/PTX3用于治疗未愈合的皮肤创伤或溃疡的用途
在本实施例中，施用通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物以用于治疗皮肤上未愈合的创伤或溃疡。
已经存在约3-4周而未愈合的皮肤上的未愈合的创伤或溃疡被称为未愈合的溃疡。通常导致未愈合的溃疡的疾病是血管疾病、糖尿病、皮肤癌和一些感染。
将通过本文所述的方法生成的HC-HA/PTX3复合物施用至患有皮肤上的未愈合的创伤或溃疡的受试者。例如，HC-HA/PTX3复合物作为溶液、凝胶局部地或皮下施用以供在创伤或溃疡部位进行治疗。预期使用HC-HA/PTX3治疗将通过促进创伤愈合和组织再生性巨噬细胞的M2表型而促进创伤或溃疡的愈合。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例25：HC-HA/PTX3用于治疗高风险角膜移植的用途
在本实施例中，施用HC-HA/PTX3以治疗高风险角膜移植。Mafia小鼠，其双眼基质内注射EGFP+巨噬细胞与LPS(每只眼睛5μg)。在每只眼中，OS(左眼；左侧眼)用PBS处理(2个或4个注射部位)，而OD(右眼，右侧眼)在LPS注射后立即使用HC-HA/PTX3处理一次(2个或4个注射部位；每个注射部位5μl包含HC-HA/PTX3的1mg/ml HA组合物)。在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天使用体内活体显微镜检查对整个角膜拍摄照片。基于绿色荧光的强度对EGFP阳性细胞进行计数，以确定EGFP浸润水平。在角膜移植小鼠模型中，与PBS载体对照相比，将HC-HA/PTX3注射到结膜下部位预期将减少炎症(即，巨噬细胞的浸润)并改善移植角膜的存活率。
在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是分离的天然HC-HA/PTX3复合物(nHC-HA/PTX3)。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从脐带组织中分离。在一些实例中，该nHC-HA/PTX3从羊膜中分离。在一些实例中，在本文所述的治疗方法中使用的HC-HA/PTX3复合物是重建的HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)。
实施例26：脐带(UC)中HA、PTX3、TSG-6、HC1、HC2、HC3和尿抑胰酶素的分布
在本实施例中，通过免疫染色在脐带(UC)中检测到HA、PTX3、TSG-6、HC1、HC2、HC3和尿抑胰酶素的体内分布。对UC组织冷冻切片进行针对HA、PTX3、TSG-6和包括HC和尿抑胰酶素在内的IαI的各种组分的免疫染色。UC由上皮层和包含羊膜下层和华顿氏胶的基质组成，华顿氏胶含有三条血管，即，一条静脉和两条动脉(图20a，具有一条动脉血管，阶段)。在UC上皮、羊膜下层和华顿氏胶中观察到强阳性HA染色，并在血管壁中观察到弱HA染色(图20a，HA)。采用HAase消化，上述HA染色消失(图20a，HA(+HAase))，这符合HA的特异性染色。
在华顿氏胶中存在PTX3的强阳性免疫染色，并且在羊膜下层和上皮中存在弱PTX3染色(图20a，PTX3)。HAase消化未增强羊膜下层和上皮中的PTX3染色(未示出)，这表明弱PTX3染色不是由于HA的掩蔽效应。在血管内皮中还观察到阳性PTX3染色(未示出)，但在动脉和静脉的血管壁中并未观察到。
TSG-6和尿抑胰酶素都存在于整个UC中，TSG-6主要存在于细胞内及其周围，且与华顿氏胶相比在上皮中存在更多TSG-6。HC1也具有与HA类似的定位，不同之处在于上皮和血管壁具有微弱的HC1染色。在上皮中存在从弱到无的HC2和HC3染色，但在UC的基质中不存在。这些结果表明，与AM相比，UC产生丰富的HA、PTX3、TSG-6、HC1和尿抑胰酶素以及不成比例地较少的HC2和HC3。确定UC组成型地表达上述蛋白质和HC-HA/PTX3复合物。
此外，PTX3存在于UC中，具有与已在AM中报道的不同的分布模式。在UC华顿氏胶中存在较多的PTX3，并且在上皮和羊膜下层中存在较少的PTX3。与此相反，更多的PTX3存在于AM的上皮和基质致密层中。对于下列标记物，UC具有与AM相类似的模式：更多的HA存在于UC的整个基质中，并且较少的HA存在于UC的上皮中。这类似于AM中的HA的分布模式。TSG-6主要定位于UC的上皮和羊膜下层中，并且尿抑胰酶素见于整个UC中。
实施例27：顺序从AM和UC获得的PBS和GnE的提取物的比较
本实施例确定了从AM中进行PBS提取后的不溶性部分是否仍然包含任何PTX3、TSG-6和IαI以及HC-HA/PTX3复合物。PBS提取后用4M GnHCl从AM的不溶性部分中提取蛋白质以检查是否存在PTX3、TSG-6和IαI。此外，具有PBS的UC还顺序用4M GnHCl提取，以检测这两个不同的提取物中的PTX3、TSG-6、HC和尿抑胰酶素。
根据He等人(2009)J.Biol.Chem.284:20136-20146中描述的方法，将AM、CH和UC用搅拌机在冷PBS中匀浆化，对于AM为1:1(g/ml)或者对于UC为1:1.5(g/ml)，并在4℃下混合1小时。混合物在4℃下以48000g离心30分钟。PBS提取物的上清液分别被称为AME、CHE和UCE。另外，还用PBS提取来自UC的华顿氏胶混合物，并且这样的提取物被命名为UJE。PBS提取后AM、CH、UC和UC胶混合物的不溶性沉淀物进一步用4M GnHCl缓冲液(100mM乙酸钠,pH 5.8,4M GnHCl,10mM EDTA,1％Triton X-100)在4℃下提取24小时。在4℃下以48000g离心30分钟后，收集上清液并分别命名为AMGnE、CHGnE、UCGnE和UJGnE。分别通过HA ELISA和BCA试验检测每个提取物中的HA和蛋白质浓度。
GnHCl进一步从PBS提取后的不溶性沉淀物中提取丰富的HA和蛋白质
在顺序PBS和GnHCl提取物中的HA和蛋白质浓度总结于表1中，其中也比较了两个提取物之间的HA/蛋白质比。通常，4M GnHCl从PBS提取后的AM、CH、UC和UC胶混合物的不溶性沉淀物中进一步提取丰富的蛋白质和HA。GnHCl缓冲液比PBS从不溶性沉淀物中提取更多的蛋白质但提取较少的HA。然而，UCGnE仍含有与AME和CHE类似的量的蛋白质和HA。也就是说，在PBS和GnHCl提取物中，UC比AM和CH含有更多的HA。
表1.从PBS提取后AM、CH、UC和UC胶混合物的不溶性沉淀物中提取的4M GnHCl提取物(GnE)中蛋白质和HA的定量
Figure GDA0003352411270001761
与AM细胞相比，在UC细胞的PBS提取物中存在较高量的单体、二聚体和HMW PTX3。但HMW PTX3以较高的量存在于AM细胞的GnHCl提取物中。
使用抗PTX3抗体的AME分析显示了对应于天然PTX3单体大小的～45kDa的条带和在加样孔底部的HMW条带(图21A，泳道4)。NaOH处理没有影响45kDa条带，但完全消除了HMW条带，导致PTX3的HMW成片条带(图21A，泳道5)，这是NaOH处理的HC-HA复合物中PTX3的显著特点，其中在进行或不进行NaOH处理的情况下没有检测到单体PTX3但是检测到90kD二聚体(图21A，泳道2和3)。PTX3的HMW成片条带代表PTX3与HC-HA之间形成的复合物。CHE具有相同的PTX3条带模式，但在NaOH处理后具有较少的PTX3成片条带，这与免疫染色结果一致。胎盘提取物具有与CHE相同的结果。值得注意的是，除UCE中的单体之外，PTX3更多地以二聚体和HMW成片条带的形式存在，并且在NaOH处理后它们的强度进一步增加。类似于AME，UCE也产生比AME多的HMW成片条带模式。这些结果表明，UCE比AME含有更多的PTX3，而CHE和胎盘提取物几乎不含有PTX3。
与AME(图21A)相比，AMGnE显示出强HMW PTX3成片条带，弱二聚体和单体水平的PTX3，并且HMW PTX3成片条带的强度在NaOH处理之后进一步增加(图21B，泳道3和4)，这表明AMGnE比AME含有更多的HMW PTX3。在AM的水不溶性部分中存在更多的PTX3。无论是否用NaOH处理，CHGnE都仅在加样孔中具有HMW条带，而没有HMW PTX3成片条带。在进行或不进行NaOH处理的情况下，UCGnE和UJGnE具有与AMGnE相同的PTX3模式，不同之处在于PTX3成片条带的强度比AMGnE略弱(图21B，泳道3和4)。UCGnE中PTX3成片条带的强度也比UCE中弱，这表明UCGnE比UCE含有较少的HMW PTX3；即，在UC的水溶性部分中存在较多的PTX3。
上述结果表明，AM和UC都含有HMW PTX3。在AM中，较多的HMW PTX3是不溶于水的并且在PBS提取后能够通过GnHCl提取，而UC中较多的PTX3是水溶性的，其大多数可以通过PBS提取。
IαI和HC1主要在AM PBS提取物中，但在UC中，大部分IαI在PBS提取物中，而HC1在GnHCl提取物中，而UCGnE中比UCE中存在更多的尿抑胰酶素，且在其他两种提取物中没有不同。
图22显示80kDa HC1条带存在于除UCE之外的所有PBS提取物和除AMGnE之外的所有GnE提取物中。在所有PBS提取物中NaOH使该条带增加，而在GnE中不然，这表明AM包含被NaOH释放的游离的和结合的水溶性HC1(即，与HC-HA中的HA和IαI中的尿抑胰酶素结合的酯)，这与Zhang等人(2012)J.Biol.Chem.287:12433-12444相一致。UC包含被NaOH释放的水溶性结合HCl，并且还含有与水不溶性细胞外组分结合的水不溶性游离HCl，其被SDS和2-ME解离，但不受NaOH影响。这与UC中的强阳性HC1染色一致。HMW HC1条带存在于加样孔中的所有PBS和GnHCl提取物中，并被NaOH减少，从而表明它是HC-HA复合物。HMW HC1条带在UCGnE中比在UCJGnE中弱，说明华顿氏胶含有更多的水不溶性HC-HA复合物。游离的IαI见于所有的PBS提取物中，而不存在于所有GnE提取物中，这表明它是水溶性的。然而，游离PαI见于所有的PBS和GnHCl提取物中，表明PαI具有与IαI不同的相互作用。在UCGnE中比在UCE中发现更多的尿抑胰酶素，在其他两种提取物中没有差异，突出地表明大部分尿抑胰酶素都与UC中的其他水不溶性分子结合，并且这指示独特的功能。
TSG-6存在于AM的HMW复合物中而不存在于UC GnHCl提取物中
图23表明，已在AME中报道的35kDa TSG-6条带(Zhang等人(2012)J.Biol.Chem.287:12433-12444)存在于AMGnE中，但不存在于所有其他提取物中，这表明TSG-6不存在于UC的GnE中。这种条带不受NaOH影响，证实TSG-6未与可被NaOH切割的HMW物质结合。然而，HMW TSG-6条带见于AMGnE和CHGnE中，但不存在于UCGnE和UJGnE中。另外，该条带并未被NaOH改变，表明TSG-6强烈地结合HMW物质。在通过4X超速离心从GnE中纯化的HC-HA中并未检测到TSG-6，表明尽管TSG-6仍在不溶性基质中结合，但在超速离心过程中可被GnHCl分离。
综上所述，GnHCl进一步从PBS提取后的AM和UC的不溶性部分中提取丰富的HA和蛋白质。在PBS和GnHCl提取物中，UC比AM和CH包含更多的HA。HMW PTX3以较高的水平存在于AMGnHCl提取物中，并且以较高的水平存在于UC PBS提取物中。在PBS提取后的不溶解部分中保留更多的HMW PTX3。HC1主要是在AM PBS提取物中而不在UC GnHCl提取物中。HMW TSG-6是在AMGnE中而不在UCGnE和UJGnE中，表明TSG-6仍在不溶性基质中结合，但在超速离心过程中可被GnHCl分离。
实施例28：通过四次连续超速离心从AM和UC PBS提取物中纯化HC-HA复合物，以及 检测HC-HA复合物中PTX3、HC、尿抑胰酶素和TSG-6的存在
在本实施例中，通过四次连续超速离心从AME和UCE中纯化HC-HA复合物，并且通过Western印迹法检测AM和UC HC-HA复合物中PTX3和HC、尿抑胰酶素和TSG-6的存在。
第4AM HC-HA复合物比第2和第3HC-HA复合物含有更多的HMW PTX3和HC1，并且更纯。
使用抗PTX3抗体，与在PBS提取物中发现的单体相比，对第1至第4AM HC-HA的Western印迹分析显示90kDa的条带(二聚体)。这表明，通过超速离心在4M GnHCl中进一步提取解构了二聚体状态，显示了在第1、第2、第3和第4HC-HA复合物的凝胶顶部的HMW条带(图24A)。与纯化的PTX3对照相比，90kDa条带为PTX3二聚体，且高分子量条带是含有PTX3的HC-HA复合物。在HAase处理后，在所有HC-HA复合物中90kDa条带未改变，但是在第3和第4级分中模糊地检测到HMW成片条带。也就是说，从第1到第4，HMW条带逐渐消失，而成片条带逐渐显现，其在第4HC-HA复合物中更为加强。在所有HC-HA复合物中不存在45kDa PTX3单体条带。结果表明，HC-HA复合物包含能够与HC-HA结合的PTX3的多聚体形式，并且随着超速离心次数增加，含有PTX3的HC-HA复合物变得更纯。在使用或不使用HAase的HC-HA复合物中90kDa PTX3二聚体的存在表明：1)在HC-HA复合物中存在的PTX3二聚体被SDS和2-ME解离，且2)HMW PTX3耐受SDS和2-ME。PTX3二聚体为2ME得到的产物在下文进一步证实(图24A)。
使用抗HC1抗体，80kDa HC1条带仅在来自所有四个HC-HA复合物的早期第1和第2级分中中检测到(图24B)。HAase处理后，HC1条带得到加强，并且在第1至第4HC-HA复合物中也出现了多个较小的条带。结果表明，纯化的HC-HA复合物不包含游离的HC，并且HC-HA由HC1制成。与上述PTX3 Western印迹结果一致，随着超速离心次数的增加，HC-HA复合物变得更纯。在所有的HC-HA复合物中未发现HC2(图24Cc)、HC3和TSG-6(图24D)。
TSP-1仅存在于AM GnHCl提取物中而不存在于PBS提取物和第1至第4HC-HA复合物中。
血小板反应蛋白-1(TSP-1)仅在AM GnHCl提取物中作为三聚体被检测到，而在PBS提取物和第1至第4HC-HA复合物中未检测到(图25)。HAase处理后，它作为成片条带出现，说明TSP-1是水不溶性的并且强烈地与HC-HA结合。然而，在不溶性基质中与HC-HA的这种结合可以被GnHCl和CsCl解离。
类似于第4AM HC-HA复合物，第4UC HC-HA复合物含有PTX3和HC1而不含HC2、HC3、尿抑胰酶素和TSG-6，并且2ME的缺失不产生PTX3二聚体但产生HC1
使用抗PTX3抗体，对进行或不进行HAase处理的第4UC HC-HA的Western印迹分析表明，第4UC HC-HA复合物中的PTX3条带模式(图26a，泳道5和6)类似于第4AM HC-HA复合物中的PTX3条带模式(图26a，泳道3和4)。当样品缓冲液不含有2-ME时，在使用或不使用HAase下，90kDa PTX3二聚体在UC HC-HA复合物中消失(图26a，泳道7和8)，表明在HC-HA复合物中90kDa PTX3二聚体的出现是由于样品缓冲液中的2-ME减少了与HC-HA结合的PTX3。使用抗HC1抗体，仅高分子量HC-HA条带在第4UC HC-HA复合物中检测到(图26b，泳道6)，类似于在第4AM HC-HA复合物中的条带(图26b，泳道4)。HAase处理后，HC-HA条带消失且HC1条带增加(泳道7)，类似于第4AM HC-HA复合物(泳道5)，但其强度比在第4AM HC-HA中略弱。这表明，通过S-S，HC1与PTX3形成复合物。当样品缓冲液不含有2-ME时，出现具有稍高于普通HC1的MW的较强条带，显示HC1经S-S与PTX3连接。在第4AM和UC HC-HA复合物中未检测到HC2、HC3(图26c)、尿抑胰酶素(图26d)和TSG-6(图26e)。
实施例29：通过四次连续超速从总AM和UC GnHCl提取物中纯化HC-HA复合物以及 与PBS提取物的比较
该实施例确定可从AM和UC中获得更多的HC-HA复合物，该HC-HA复合物有更合理的PTX3和HC-HA成分，并且其在临床上有更有效的治疗作用。通过6M GnHCl缓冲液(200mMTris-HCl，pH 8.0、6M GnHCl、10mM EDTA、10mM氨基己酸、10mM N-乙基马来酰亚胺、2mMPMSF)提取AM和UC：通过以1：4比例(g/ml)将6M GnHCl缓冲液添加至AM和UC粉末进行从AM和UC中提取GnHCl。样品在4℃下混合过夜，并在4℃下以48,000g离心30分钟。上清液即GnHCl提取物。使用与从PBS提取物中纯化第4HC-HA相同的程序，从AM和UC GnHCl提取物中纯化第4HC-HA复合物。HC-HA复合物的表征通过Western印迹分析来进行，以检查PTX3、HC、尿抑胰酶素、TSG-6以及其他可能的蛋白质。运行HC-HA的琼脂糖凝胶以观察HA的含量和分子量。
GnHCl比PBS从AM和UC中提取更多的HC-HA复合物
从AM和UC提取的GnHCl提取物被命名为AMEG和UCEG，并分别通过BCA试验和HAELISA检测它们的HA和蛋白质含量。第4HC-HA复合物从GnHCl提取物中纯化，并且同样地检测其HA和蛋白质含量。表2总结了PBS和GnHCl提取物及它们的第4HC-HA复合物中的蛋白质和HA含量。结果表明，AM和UC GnHCl提取物与相应的PBS提取物相比包含更多的HA且具有更高的HA/蛋白质比。此外，从GnHCl提取物中纯化了更多的HC-HA复合物。
表2.来自AM和UC的提取物和第4HC-HA中蛋白质和HA的定量。
Figure GDA0003352411270001811
AM第4GnHCl HC-HA复合物包含更多的HC1和HMW PTX3，但包含得比进行或不进行HAase或NaOH处理的PBS HC-HA少，并且PBS和GnHCl HC-HA均不包含TSP-1。
使用抗HC1抗体，GnHCl HC-HA在加样孔中显示出与PBS HC-HA相同的HMW条带，但HAase消化仅释放较弱的HC1(图27a，泳道6和7)。NaOH处理也释放较弱的HCl条带，其较HAase释放的条带具有稍高的MW(图27a，泳道8)，其在NaOH处理后的PBS HC-HA中未看到。这些结果表明GnHCl HC-HA包含HC1但量少于PBS HC-HA。类似地，不同于PBS HC-HA，使用抗-PTX3抗体，在进行或不进行HAase消化下，GnHCl HC-HA都仅显示二聚体PTX3而没有明显的HMW PTX3成片条带(图27b，泳道6和7)。NaOH还导致HMW和二聚体PTX3的出现。这些结果表明GnHCl HC-HA比PBS HC-HA包含更少的HMW PTX3。
与HC1印迹相似，在GnHCl HC-HA中用NaOH处理后比用HAase处理后有更高MW的PTX3二聚体。这些结果共同表明，NaOH释放将HC1连接至HA并且可与PTX3相关联的酯键。因为GnHCl HC-HA具有比PBS HC-HA更高的HA含量，GnHCl HC-HA复合物包含不被PTX3或HC1结合的HA，导致纯化产物中实际的HC-HA/PTX3复合物含量的降低以及纯化产物中较少的HC1和HMW PTX3。使用抗-TSP-1在PBS HC-HA中未检测到TSP-1。应当注意，在GnHCl HC-HA中也未检测到TSP-1。由于GnHCl提取物包含TSP-1，这些结果表明TSP-1被超速离心解离，因此其不存在于GnHCl HC-HA中。
琼脂糖凝胶显示在GnHCl HC-HA中有丰富的HA
PBS HC-HA从顶部加样孔至琼脂糖凝胶底部显示出“连续的HA成片条带”，并且HAase完全消除了HA成片条带(图28，泳道3和4)。GnHCl HC-HA在加样孔中显示了条带和HA成片条带，其开始于4,570kDa位置至琼脂糖凝胶底部(图28，泳道5)。GnHCl HC-HA中的HA在加样孔至HA成片条带的开始之间存在断裂，尽管其强度比在PBS HC-HA中的强。此外，HAase未完全消除GnHCl HC-HA中的HA成片条带和HMW HA条带(图28，泳道6)。在第4次超速离心后来自GnHCl提取物的顶部级分(1-6级分)也显示出与GnHCl HC-HA的“底部级分”相同的HA成片条带模式(图28，泳道7和8)。这些结果表明GnHCl HC-HA包含较多的HMW HA(MW小于PBSHC-HA)，但缺乏HMW HA成片条带的一部分，其对应于GnHCl HC-HA的Western印迹中HMWPTX3成片条带的缺乏。这表明消失的HMW HA成片条带(其存在于PBS HC-HA中)至少部分是通过PTX3和HC-HA的交联形成的，并且GnHCl HC-HA的加样孔中的HMW HA与除了PTX3之外的组分复合。
GnHCl HC-HA包含一些在通过考马斯蓝染色在PBS HC-HA中未发现的蛋白质。
图29A显示，在顶部加样孔中的条带，主要的140kDa和一些次要的70kDa，双55kDa和20kDa条带，存在于AM GnHCl HC-HA和GnHCl HC-HA的顶部级分中，但不存在于所有其他PBS HC-HA中。这表明，AM GnHCl HC-HA包含一些在PBS HC-HA中不存在的蛋白质。此外，90kDa和25kDa条带在GnHCl HC-HA顶部级分中也是可视化的。因为Western印迹在PBS HC-HA中检测到HC1，通过考马斯蓝染色，HC1也应该存在于PBS HC-HA中。其在PBS HC-HA中不存在的原因是因为由于过量加样导致加样的HC-HA未进入凝胶这一事实。140kDa显示为宽条带，表明其包含糖部分。此外，HAase不影响这些条带，表明这些物质被SDS和2-ME解离。
与AM GnHCl HC-HA相比，UC GnHCl HC-HA显示在顶部加样孔中的条带，90kDa、70kDa、双55kDa、35kDa和20kDa条带(图29B，泳道4和5)。其中还存在一条微弱的140kDa条带。这些条带没有被HAase影响。此外，GnHCl HC-HA的顶部级分还从顶部孔至200kDa位置显示出成片条带，其在HAase处理后减少。所有条带在UC PBS HC-HA中均不存在。这些结果表明，UC GnHCl HC-HA也包含在PBS HC-HA中不存在的一些蛋白质，并且关于其包含的蛋白质条带，UC GnHCl HC-HA不同于AM GnHCl HC-HA。
上述结果表明，GnHCl HC-HA在以下几个方面不同于来自AM和UC两者的PBS HC-HA：(1)GnHCl HC-HA比PBS HC-HA(来自Western印迹)包含更少的HC1和HMW PTX3，而类似于PBS HC-HA，TSG-6、HC2和HC3在GnHCl HC-HA中也不存在。(2)GnHCl HC-HA包含更多的HMWHA但缺乏一片HMW PTX3，其对应于通过PBS HC-HA(来自琼脂糖凝胶)显示的Western印迹中的HMW PTX3成片条带。(3)GnHCl HC-HA包含主要为MW 140kDa的一些蛋白质，其在PBS HC-HA(来自考马斯蓝染色凝胶)中未发现。
总之，与PBS提取物相比，GnHCl从AM和UC组织中提取更多的HA和蛋白质，导致更高的HA/蛋白质比。对于AM和UC两者，从GnHCl提取物中纯化更多的HC-HA复合物(根据HA含量)。GnHCl HC-HA包含HC1和HMW PTX3，但对于AM和UC都比在PBS HC-HA中少得多。GnHClHC-HA在琼脂糖凝胶中缺乏HMW HA物质，其对应于通过PBS HC-HA显示的Western印迹分析中的HMW PTX3成片条带。GnHCl HC-HA包含在PBS HC-HA中未发现的一些蛋白质。
实施例30：从AM和UC纯化的GnHCl HC-HA复合物中未知蛋白质条带身份的确定
本实施例通过运行SDS-PAGE胶，随后在有或无去糖基化的条件下对来自AM和UC的GnHCl HC-HA进行CB染色或Western印迹分析，从而确定GnHCl HC-HA中未知条带的身份。该样品是来自PBS和GnHCl提取物两者的冻干的AM和UC 4x HC-HA(包含30μg HA)。冻干的HC-HA与50μl TFMS和20μl苯甲醚在冰上孵育3h并使用含有125μl N-乙基吗啉的TFMS中和。使用5-10倍体积的丙酮在-20℃过夜或在-80℃持续1h使样品沉淀。将样品离心并将干燥的沉淀物溶于SDS样品加样缓冲液中用于电泳。使用角蛋白酶(内切-β-半乳糖苷酶)进行酶促去糖基化以除去硫酸角质素链和N-连接的寡糖，或使用软骨素酶(Cabc)除去硫酸软骨素链。HC-HA(包含30μg HA)与0.1U/ml角蛋白酶在50mM乙酸钠(pH 5.8)中37℃孵育2h，或与5U/mlCabc在PBS中37℃孵育2h。运行SDS-PAGE凝胶以测试CB染色，随后进行Western印迹分析。
硫酸角质素和骨黏附蛋白聚糖存在于AM GnHCl HC-HA中而不存在于PBS HC-HA中。
进行Western印迹分析。其结果示于图30B和C中。在进行或不进行HAase消化下在AM GnHCl HC-HA中使用抗-硫酸角质素抗体的Western印迹显示宽的70kDa(60-80kDa)条带(图30B，泳道6-8)，而在PBS HC-HA中则没有，这表明这种～70kD硫酸角质素蛋白聚糖负责图30D所示的阳性免疫染色。这种70kD条带对应于在考马斯蓝染色凝胶中所示的在进行或不进行HAase处理的GnHCl HC-HA中注意到的相同条带(图30A)。
为了进一步确定这种70kD硫酸角质素蛋白聚糖是否是SLRP，在Western印迹中使用抗-腔蛋白聚糖、抗-纤调蛋白聚糖和抗-骨黏附蛋白聚糖抗体。抗-骨黏附蛋白聚糖抗体识别60kD条带，但不识别进行或不进行HAase消化的GnHCl HC-HA中的70kD条带(图30C，泳道6-8)，但不在PBS HC-HA中。具有硫酸角质素链的骨黏附蛋白聚糖具有～80kD的分子量，而其非硫酸角质素蛋白质则为～60kD。检测到大小为60kD的硫酸角质素条带，但仅为70kD的宽大小，这表明通过抗-骨黏附蛋白聚糖检测到的60kD条带是非硫酸角质素骨黏附蛋白聚糖。AM GnHCl HC-HA包含与HC-HA密切关联的非硫酸角质素骨黏附蛋白聚糖，并且在6MGnHCl和氯化铯的存在下可经受4次超速离心。但是，其在样品缓冲液中被SDS和2-ME释放。结果也表明70kD硫酸角质素蛋白聚糖不是骨黏附蛋白聚糖。在GnHCl HC-HA中没有检测到腔蛋白聚糖和纤调蛋白聚糖，这表明80kD蛋白聚糖既不是腔蛋白聚糖也不是纤调蛋白聚糖。
AM GnHCl HC-HA的去糖基化和分析
通过TFMSA对HC-HA进行去糖基化以使用角蛋白酶和软骨素酶去除所有的聚糖，从而去除特定聚糖，以观察在AM GnHCl HC-HA中的140kD和～80kD条带是否存在任何变化，并进一步确定～80kD硫酸角质素蛋白聚糖是否是角膜蛋白聚糖、PRELP或骨蛋白聚糖。作为证实上述去糖基化的影响的第一步，进行考马斯蓝染色。
在图31A中，考马斯蓝(CB)染色的凝胶，AM GnHCl HC-HA(图31A，泳道2)显示出主要140kDa、70kDa、双50kDa、20kDa和弱35kDa条带的相同条带以及凝胶顶部的HMW条带。K/C/H对这些条带并未产生很大影响，除了产生主要的80kDa、弱100kDa以及30kDa条带外观(图31A，泳道3)。这种模式类似于在C/K/H下从AM GnHCl HC-HA的顶部级分获得的模式(图31A，泳道6)。这些结果表明140kDa、70kDa和55kDa条带不是硫酸角质素和/或硫酸软骨素，并且在GnHCl HC-HA中存在其他在C/K/H之后作为主要80kDa物质释放的硫酸角质素和/或硫酸软骨素蛋白质。TFMSA处理导致除了20kDa条带以外的上述所有条带均消失，并产生清晰的新50kDa条带和HMW成片条带(图31A，泳道4)。TFMSA/H使成片条带消失，从而产生新的25kDa条带但并没有改变50kDa条带(图31A，泳道5)。这一结果表明，140kDa、70kDa、55kDa和80kDa条带是具有不同聚糖链量的相同的50kDa物质。
为了确定50kDa条带是否源自60kDa骨黏附蛋白聚糖，使用抗-骨黏附蛋白聚糖抗体进行Western印迹分析。结果显示AM GnHCl HC-HA中的60kDa物质(图31B，泳道4)，与图31C中所示的发现是一致的。C/K/H未改变其分子量(图31B，泳道5和6)，但是进行或不进行HAase(T/H)处理的TFMSA将其完全改变为强度较低的55kDa物质(图31，泳道7和8)。与没有T/H条件下相比，在T/H条件下AM GnHCl HC-HA的顶部级分显示出较强的条带但较小的MW，且没有强度变化(图31B，泳道9和10)。这些结果进一步证实AM GnHCl HC-HA包含骨黏附蛋白聚糖，其不含硫酸角质素和硫酸软骨素。在TFMSA处理后骨黏附蛋白聚糖条带强度下降的原因是由于(1)蛋白质被TFMSA降解；(2)其被TFMSA处理后也释放的大量具有相同MW的其他蛋白质所阻断。未经任何处理时在PBS HC-HA中骨黏附蛋白聚糖是不可检测的，但是在TFMSA/HAase处理后出现了60kDa双条带，表明PBS HC-HA包含紧密结合至HA的微量骨黏附蛋白聚糖。
使用抗-饰胶蛋白聚糖抗体的Western印迹在AM GnHCl HC-HA中显示出非常强的宽140kDa物质(80-160kDa)和弱的双50kDa物质(图31C，泳道4；31D，泳道4和5)，而在PBSHC-HA中没有(图31C，泳道2；31D，泳道2和3)。宽140kDa物质对应于带有一条硫酸软骨素或硫酸皮肤素链和不同数量的聚糖的饰胶蛋白聚糖，而双50kDa物质可能对应于糖基化程度较低的饰胶蛋白聚糖。因为HAase不影响饰胶蛋白聚糖物质，这表明它们可被SDS和2-ME释放。上述观点被C/H证实，其增加了70kDa物质(图31C，泳道5)，并且被C/H/K证实，其给出了相同的结果(图31B，泳道6)。因此，70kDa物质是不含软骨素的饰胶蛋白聚糖。这一70kDa物质是次要组分，因为无论是C/H还是A/H/K均没有显著改变主要宽140kDa物质。TFMSA处理完全删除了宽140kDa物质，同时产生对应于去糖基化的饰胶蛋白聚糖核心蛋白质的主要43kDa物质，以及次要95kDa、80kDa和弱30kDa物质(图31C，泳道7)。TFMSA/H处理显示出与单独的TFMSA时相同的物质模式，除了所有这些物质的强度均得到增强，表明饰胶蛋白聚糖紧密结合至HA。TFMSA/H还导致从PBS HC-HA上释放微弱的43kDa物质，表明AM PBS HC-HA还包含少量紧密结合至HA的饰胶蛋白聚糖。在进行或不进行TFMSA/H下，AM GnHCl HC-HA的顶部级分显示了与底部级分相同的模式，其中强度比后者更强(图31C，泳道9和10)，这表明顶部级分也包含丰富的饰胶蛋白聚糖。上述结果表明，CB染色凝胶中的主要140kDa、70kDa和双50kDa物质是由饰胶蛋白聚糖通过CS并且主要通过非CS和非KS形成的。
不同于饰胶蛋白聚糖，使用抗-双糖链蛋白聚糖抗体的Western印迹在400kDa的一处强区域显示出HMW成片条带，并且在进行或不进行HAase处理的AM GnHCl HC-HA中显示弱45kDa物质(图31E，泳道4；2F，泳道4和5)，而在PBS HC-HA中则不显示(图31D，泳道2；F，泳道2和3)。45kDa物质与双糖链蛋白聚糖核心蛋白质相对应，而HMW成片条带是具有硫酸软骨素或硫酸皮肤素链的糖基化双糖链蛋白聚糖。HAase增强400kDa以上具有较少HMW成片条带的400kDa区域，这表明一些双糖链蛋白聚糖也结合至HC-HA。C/H或C/K/H没有显著改变HMW成片条带和45kDa物质，但增加了可能是不含软骨素的双糖链蛋白聚糖的70kDa物质(图31E，泳道5和6)。由于70kDa物质的数量非常小且上述处理没有显著改变主要HMW成片条带，因此AM GnHCl HC-HA中的大多数双糖链蛋白聚糖与CS或KS不相关。TFMSA处理完全删除了HMW成片条带并产生对应于去糖基化的饰胶蛋白聚糖核心蛋白质的主要45kDa物质，以及弱95kDa、80kDa和30kDa物质(图31E，泳道7)，这表明了在AM GnHCl HC-HA中双糖链蛋白聚糖的存在。95kDa和80kDa物质是部分去糖基化的双糖链蛋白聚糖，而30kDa物质是降解的双糖链蛋白聚糖。TFMSA与HAase处理一起显示与单独TFMSA时相同的模式，除了所有这些物质的强度均得到增强，这表明双糖链蛋白聚糖也紧密结合至HA。在进行或不进行TFMSA/HAase处理的AM GnHCl HC-HA的顶部级分显示出与底部级分相同的模式，其强度比后者强(图31E，泳道9和10)，这表明顶部级分也包含丰富的双糖链蛋白聚糖。使用抗硫酸角质素抗体的Western印迹分析显示出在进行或不进行角蛋白酶或软骨素酶处理的AM GnHCl HC-HA中存在70kDa硫酸角质素蛋白质，不改变分子大小(图31G)，这表明角蛋白酶未完全消除硫酸角质素或者在这种物质中KS的量是微小的。与进行或不进行单独HAase消化(图31G，泳道4和5)下相比，使用抗-PTX3抗体的Western印迹分析显示HMW PTX3成片条带增加，在使用K的AMGnHCl HC-HA中显示，并且在使用K/H时甚至更多(图31H，泳道6和8)。软骨素酶没有这样的影响，这表明一些包含KS的物质与GnHCl HC-HA中的PTX3结合。对进行或不进行角蛋白酶消化的UC GnHCl HC-HA的Western印迹分析获得了相同的结果(见下，图32G)。Western印迹证明在AM GnHCl HC-HA中没有纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、PRELP、骨甘蛋白聚糖、骺蛋白聚糖、骨膜蛋白和TSG-6以及尿抑胰酶素。
总之，AM GnHCl HC-HA包含大量结合至HC-HA的饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖，但PBS HC-HA仅包含微量的饰胶蛋白聚糖并且不包含双糖链蛋白聚糖。AM GnHCl HC-HA包含骨黏附蛋白聚糖及包含硫酸角质素的物质，而PBS HC-HA则不包含。AM GnHCl HC-HA中极少量的饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖包含硫酸软骨素链。
UC GnHCl HC-HA的去糖基化和分析表明在UC GnHCl HC-HA中存在丰富的饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖，而在PBS HC-HA中不存在。在UC GnHCl HC-HA中还存在硫酸角质素、骨黏附蛋白聚糖和尿抑胰酶素。
CB染色(图32A)在UC GnHCl HC-HA中的顶部加样孔中显示了160kDa、90kDa、70kDa、双50kDa、35kDa和20kDa条带的相同条带(图32A，泳道4)。C/H或C/H/K没有显著影响这些条带，除了导致主要80kDa和弱30kDa条带的出现(图32A，泳道5和6)。TFMSA处理减少了除20kDa条带以外的上述所有条带，但增加了主要50kDa条带、次要80kDa条带和HMW成片条带(图32A，泳道7)。TFMSA/H使成片条带和80kDa条带消失但导致弱25kDa的出现并降低了50kDa条带的强度(图32A，泳道8)。这些结果与从AM GnHCl HC-HA得到的结果相似(图31A)，表明UC GnHCl HC-HA与AM GnHCl HC-HA具有相似的组成。进行或不进行TFMSA/H处理的UCGnHCl HC-HA的顶部级分显示出与底部级分相同的模式(图32A，泳道9和10)，表明它们具有与底部级分相同的组分。未去糖基化的UC PBS HC-HA仅在加样孔中或加样孔下显示HMW条带，以及20kDa条带。TFMSA/H删除了HMW条带但除了弱80kDa和25kDa条带以外主要增加了50kDa条带，表明UC PBS HC-HA包含一些仅被完全去糖基化和HA降解释放的糖基化蛋白。
使用抗-饰胶蛋白聚糖抗体进行的Western印迹分析表明，在进行或不进行HAase的UC GnHCl HC-HA中有宽160kDa物质(图32B，泳道4和5)，但在PBS HC-HA中则没有(图32B，泳道2和3)，这表明UC GnHCl HC-HA与AM GnHCl HC-HA类似，也包含饰胶蛋白聚糖。由于糖基化水平不同，其分子量与在AM GnHCl HC-HA中不同。HAase显著减少了160kDa物质，表明其与HC-HA结合。在进行或不进行HAase下的角蛋白酶也降低了160kDa物质的强度，表明其同样包含一些KS。值得注意的是，在进行或不进行HAase消化下的C导致160kDa物质和顶部孔的物质消失，但产生强50kDa和90kDa物质以及HMW成片条带，表明与在AM GnHCl HC-HA中相比在UC GnHCl HC-HA中主要为硫酸软骨素，其中少部分包含硫酸软骨素链。这些结果进一步证实了UC GnHCl HC-HA包含饰胶蛋白聚糖，并且UC中的此饰胶蛋白聚糖在(1)糖基化、(2)附接的糖胺聚糖类型和(3)总量上不同于AM。
在进行或不进行HAase的UC GnHCl HC-HA中，使用抗-双糖链蛋白聚糖抗体的Western印迹显示顶部孔中的强HMW物质，在400kDa区域和140kDa区域的HMW成片条带，以及45kDa物质(图31C，泳道4和5)，而在PBS HC-HA中则没有(图31C，泳道2和3)。HAase增强了400kDa区域，不影响孔中的HMW物质，表明一些物质紧密结合至HA。在进行或不进行HAase下的角蛋白酶除了减少45kDa物质外未显著改变上述物质(图32C，泳道6和8)，这表明45kDa物质包含KS而其他物质则不包含。单独的软骨素酶消除了顶部孔中的HMW物质并减弱了400kDa区域的强度，但增加了强且宽的50kDa物质、100kDa物质和28kDa物质，在这些物质之间带有成片条带(图32C，泳道7)。软骨素酶加上HAase具有相同的结果，其中全部成片条带得到加强并使28kDa物质消失(图32C，泳道9)。这些结果表明与饰胶蛋白聚糖相似，在UCGnHCl HC-HA中的双糖链蛋白聚糖主要带有硫酸软骨素链。这个发现不同于AM HC-HA中的结果，其中少部分是硫酸软骨素。同样在HC-HA中大部分双糖链蛋白多糖形成HMW复合物，一些与HC-HA结合。
在进行或不进行HAase消化的UC GnHCl HC-HA中使用抗-尿抑胰酶素抗体的Western印迹显示宽35kDa条带，而在PBS HC-HA中则没有(图32D，泳道4和5)。35kDa条带对应于天然尿抑胰酶素的MW。在进行或不进行HAase消化下的角蛋白酶使该35kDa条带锐度更清晰但不改变其MW(图32D，泳道6和8)，而在进行或不进行HAase消化下的软骨素酶使35kDa尿抑胰酶素变成25kDa核心尿抑胰酶素(图32D，泳道7和9)，进一步证实了在UC GnHCl HC-HA中尿抑胰酶素的存在，并与报道一样包含CS。因为在软骨素酶处理后也形成HMW成片条带，这表明尿抑胰酶素通过CS紧密结合至HC-HA。这些结果不同于不包含尿抑胰酶素的AMGnHCl HC-HA。
与仅进行或不进行HAase消化(图32E，泳道4和5)相比，使用抗-PTX3抗体的Western印迹在H、K、C及尤其是K/H处理后的UC GnHCl HC-HA中显示HMW PTX3成片条带增加(图32E，泳道6和8)。这些结果证实了HMW PTX3在GnHCl HC-HA中的存在及其在GnHCl HC-HA中的强结合。此外，包含KS的物质的存在进一步帮助了这样的强结合，其身份仍不清楚。这也解释了我们以前的数据(没有酶消化)可能低估了在UC GnHCl HC-HA中HMW PTX3的量。
使用抗-硫酸角质素抗体的Western印迹在孔中显示HMW物质及在UC PBS HC-HA中显示微弱的55kD条带。HAase并未改变该条带但使60kDa条带更明显(图32F，泳道2和3)。然而，在进行或不进行HAase的UC GnHCl HC-HA中通过抗-硫酸角质素抗体识别了140kD条带(图32F，泳道4和5)。在进行或不进行HAase处理下的角蛋白酶未删除140kDa条带，但在它们之间增加了主要35kDa条带和几种其他条带，包括在PBS HC-HA中所见的60kDa和55kDa条带(图32F泳道6和8)。
在进行或不进行HAase处理下的软骨素酶也未删除140kDa条带，但增加了90kDa条带以及在PBS HC-HA中所见的60kDa和55kDa条带(图32F，泳道7和9)。软骨素酶处理还导致HMW成片条带的出现，其在HAase处理后减少，表明UC GnHCl HC-HA除了硫酸角质素蛋白还包含丰富的硫酸软骨素蛋白。很显然，在UC GnHCl HC-HA(140kDa)中的硫酸角质素蛋白与在AM GnHCl HC-HA(～80kDa)中的硫酸角质素蛋白具有不同的MW，并且可能是由于在链中的不同聚糖量而导致的。
使用抗-骨黏附蛋白聚糖抗体在UC GnHCl HC-HA中检测到主要60kD条带和弱80kD条带(图32G，泳道4)，但在PBS HC-HA中则未检测到。这两个条带没有显著受到角蛋白酶或软骨素酶或HAase的影响。80kD应该是硫酸角质素的骨黏附蛋白聚糖，而～60kD应该是非硫酸角质素的骨黏附蛋白聚糖。结果表明，UC GnHCl HC-HA既包含硫酸角质素的骨黏附蛋白聚糖又包含非硫酸角质素的骨黏附蛋白聚糖。
总之，在UC GnHCl HC-HA中未检测到纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、PRELP、骨甘蛋白聚糖、骺蛋白聚糖、骨膜蛋白和TSG-6。UC GnHCl HC-HA包含饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、骨黏附蛋白聚糖、硫酸角质素和尿抑胰酶素。其中双糖链蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖是丰富的，而PBS HC-HA不包含丰富的这些物质。
总结
我们通过4x超速离心从AM和UC的PBS及GnHCl提取物中纯化了HC-HA复合物。从GnE纯化的HC-HA在产率和化学组成方面与从PBS提取物中纯化的HC-HA相当不同(见表1)。在量上，从GnE纯化的HC-HA比从PBS纯化的包含更多的HA。在化学组成上：GnHCl HC-HA包含更多的HMW HA(其MW略小于PBS HC-HA)但缺少对应于通过PBS HC-HA(来自琼脂糖凝胶)显示的Western印迹中HMW PTX3成片条带的一片HMW HA。在进行或不进行HAase消化下，GnHCl HC-HA比PBS HC-HA包含更少的HC1和HMW PTX3，但在角蛋白酶加HAase处理后检测到更多的PTX3(来自Western印迹)，表明在GnHCl HC-HA中HMW PTX3紧密结合至硫酸角质素蛋白质。无论PBS HC-HA还是GnHCl HC-HA均不包含TSG-6、HC2和HC3。尿抑胰酶素存在于UC GnHClHC-HA中但不存在于UC PBS HC-HA以及AM PBS和GnHCl HC-HA中。AM GnHCl HC-HA包含丰富的饰胶蛋白聚糖，相对比UC GnHCl HC-HA中更多。AM和UC PBS HC-HA两者都包含微弱量的饰胶蛋白聚糖。AM和UC GnHCl HC-HA包含丰富的双糖链蛋白聚糖，尤其是在UC GnHCl HC-HA中。在PBS HC-HA中不存在双糖链蛋白聚糖。AM和UC GnHCl HC-HA包含骨黏附蛋白聚糖。AM和UC PBS HC-HA不包含双糖链蛋白聚糖、包含硫酸角质素的物质、纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、PRELP、骨甘蛋白聚糖、骺蛋白聚糖、骨膜蛋白以及骨桥蛋白、TSP-1。在AM和UC GnHCl HC-HA中不存在纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、PRELP、骨甘蛋白聚糖、骺蛋白聚糖、骨膜蛋白以及骨桥蛋白、TSP-1、无孢蛋白。GnHCl HC-HA包含可见的蛋白质条带，主要为在PBS HC-HA(来自考马斯蓝染色凝胶)中未发现的MW 200kDa、80kDa和60kDa。
表3.从PBS和GnHCl提取物中纯化的4x HC-HA复合物的总结比较
Figure GDA0003352411270001931
*注意：此信息不同于提取物，表明存在可通过超速离心解离的TSP-1。
表4.顺序地从AM和UC获得的PBS和GnE的提取物的总结比较
Figure GDA0003352411270001932
实施例31：人羊膜基质细胞组成型表达PTX3导致HC-HA/PTX3复合物的形成
在本实施例中，检查了从AM纯化的HC-HA中的PTX3表达及其对AM中的HC-HA/PTX3复合物形成的影响。
实验步骤
1.材料
盐酸胍、氯化铯、EDTA、无水乙醇、乙酸钾、乙酸钠、氯化钠、氢氧化钠、Tris碱、Triton X-100、3-(N,N-二甲基棕榈基铵基)丙磺酸盐(Zwittergent3-16)、蛋白酶抑制剂混合物(包括4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟盐酸盐、抑肽酶、盐酸苯丁抑制素、E-64、亮抑酶肽和胃酶抑素A)及苯甲磺酰基氟化物均从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得。链霉菌属透明质酸酶(HAase)和生物素化的HA结合蛋白质(HABP)来自Seikagaku Biobusiness Corporation(Tokyo,Japan)。Dulbecco改进的Eagle培养基、Ham的F12营养培养基、胎牛血清、Hank平衡盐溶液、庆大霉素、两性霉素B及RIPA缓冲液购自Invitrogen(Grand Island,NY)。Slide-A-Lyzer透析盒(3.5K MWCO)来自Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)。BCA蛋白质检测试剂盒来自Pierce(Rockford,IL)。HA定量检测试剂盒来自Corgenix(Westminster,CO)。4–15％梯度丙烯酰胺预制胶和硝酸纤维素膜来自Bio-Rad(Hercules,CA)。IαI在我们的实验室根据已公布的方法(1，38)由人血浆制备。PTX3 mAb(MNB4)和pAb来自Enzo Life Sciences,Inc.(Plymouth,PA)。重组人TNF、重组人五聚环蛋白3/TSG-14和人/鼠TSG-6MAb(MAB2104)来自R&D Systems(Minneapolis,MN)。针对全长ITIH1的小鼠抗人ITIH1多克隆抗体和针对第124-321位氨基酸的兔抗人ITIH2多克隆抗体来自Abcam Inc.(Cambridge,MA)。HiPerFect转染试剂和RNeasy Mini RNA分离试剂盒来自QIAGEN(Valencia,CA)。用于靶向内源性人PTX3的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸(ACACUUGAGACUAAUGAAAGAGAGA)和非靶向siRNA对照寡核苷酸(杂乱RNA)siRNA来自OriGene Technologies,Inc.(Rockville,MD)。Western LightingTM化学发光试剂来自PerkinElmer,Inc.(Waltham,MA)。超速离心机(LM8型,SW41转子)来自Beckman Coulter,Inc.(Fullerton,CA)。
2.细胞培养和琼脂糖覆盖
人体组织根据赫尔辛基宣言进行处理。经过南弗罗里达Baptist医疗机构审查委员会的批准(协议号03-028)，从在Baptist医院(Miami,FL)选择剖腹生产术后的健康母亲获得新鲜的人胎盘。如先前所述，初级人AM上皮细胞和基质细胞(分别称为AMEC和AMSC)从新鲜胎盘中分离出来(Chen等人(2007)Stem Cells.25:1995-2005；Li等人(2008)J.Cell.Physiol.215:657-664)，并在37℃、5％CO2的增湿气氛下，在补充激素的上皮培养基(SHEM，其由DMEM/F12(1:1,v/v)、5％(v/v)FBS、0.5％(v/v)二甲亚砜、2ng/ml EGF、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、0.5μg/ml氢化可的松、0.1nM霍乱毒素、50μg/ml庆大霉素、1.25μg/ml两性霉素B组成)(Chen等人(2007)Stem Cells 25:1995-2005；Chen等人(2011)Tissue Eng Part C Methods17:537-548)中培养。每2天更换一次培养基。将80％汇合的细胞切换至为含有0.5％FBS的DMEM/F1持续48h，以使细胞静止并随后使用20ng/ml TNF或20ng/ml IL-1β处理4h或24h，之后进行RT-PCR和Western印迹分析。对于琼脂糖覆盖培养，将AMEC、AMSC和HSF在SHEM中以2×104/cm2的密度接种于12-孔(1×105个细胞/孔)和6-孔(2x105个细胞/孔)板中。在第1天将培养基更换为含有5％KnockOut血清替代物和2-磷酸-L-抗坏血酸的无血清SHEM并再培养2天。在移除培养基后，含有1mM 2-磷酸-L-抗坏血酸的DMEM/F12中的3％琼脂糖(低熔点型，第VII型，Sigma，A9045)在1ml或0.5ml处层叠，以室温下达到1mm厚的凝胶层5-10分钟，之后分别在每个6或12孔板中添加3ml或1.5ml含有或不含5ng/ml TNF的无血清SHEM培养基前。在第5天在不更换中间培养基的情况下收获细胞。
3.siRNA转染
AMEC和AMSC在6孔板中在SHEM中培养直到80％汇合。将细胞切换至含有0.5％FBS的DMEM/F12持续48h，并使用含有100nM PTX3 siRNA或杂乱(sc)RNA的PepMuteTM siRNA转染细胞。在48h后，收获细胞并对其进行RT-PCR和Western印迹分析。
4.通过超速离心从AM和无血清培养基中纯化HC-HA复合物
如先前所述(He等人(2009)J.Biol.Chem.284:20136-20146；Yoneda等人(1990)J.Biol.Chem.265:5247-5257；He等人(2008)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.49:4468-447532)，从AM和细胞培养基中纯化HC-HA复合物。简单地说，将从Bio-tissue,Inc.(Miami,FL)获得的冷藏保存的人AM切成小片，在液氮中冷冻，并使用BioPulverizer研磨成细粉。粉末以1：1(g/ml)比例与冷的磷酸盐缓冲液(PBS)混合。混合物在温和搅拌下保持在4℃下1h，并随后以48,000g在4℃离心30min。随后将上清液(称为AM提取物)与含有10mM EDTA、10mM氨基己酸、10mM N-乙基马来酰亚胺和2mM PMSF的8M胍HCl/PBS溶液混合(体积比为1：1v/v)，并分别使用氯化铯调整为1.35g/ml(AM提取物)或1.40g/ml(细胞提取物)的密度，并使其以35,000rpm在15℃进行等密度离心48h。将所得的密度梯度分成12管(1ml/管)，其中分别使用HA定量试验试剂盒和BCA蛋白质试验试剂盒测定HA和蛋白质的含量。合并来自第一次超速离心的级分(其包含大部分HA)，通过添加CsCl使其浓度为1.40g/ml、超速离心并以如上所述的相同方式进行分级分离。合并来自第二次超速离心的级分(其包含HA但未有可检测的蛋白质)，并通过添加CsCl以1.42g/ml的浓度继续第三次和第四次超速离心。将来自第二次和第四次超速离心的级分在蒸馏水中进行透析，并随后使用含有1.3％(w/v)乙酸钾的3倍体积的95％(v/v)乙醇在0℃沉淀1h。以15,000g离心后，将沉淀物进行短暂风干，贮存于80℃，并分别称为AM第2HC-HA和第4HC-HA。
5.免疫染色
在进行或不进行琼脂糖覆盖的条件下，包含AM和绒毛膜部分以及细胞培养基的人胎膜使用4％低聚甲醛在室温下固定15min，使用PBS中的0.2％(v/v)Triton X-100通透化处理20min。在使用PBS中的0.2％(w/v)牛血清白蛋白封闭1h后，将切片与生物素化的HABP(对于HA，5μg/ml)、抗-PTX3、抗-HC1或抗-HC2抗体(均在封闭溶液中以1：200稀释)在4℃湿度箱中孵育过夜。使用PBS洗涤后，将它们与Alexa Fluor 488链霉抗生物素(对于HA，以1：200稀释)或各自的第二抗体(即，Alexa Fluor 488抗-小鼠IgG或Alexa Fluor 555-偶联的抗-大鼠IgG)在室温下孵育1h。同种型匹配的非特异性IgG抗体用作对照。或者，在固定之前使用50U/mL链霉菌属HAase在37℃将切片处理4h。细胞核用Hoechst 33342进行染色，并且使用Zeiss LSM700共焦激光扫描显微镜(Zeiss,Germany)获得图片。
6.实时PCR
使用RNeasy Mini RNA分离试剂盒从细胞培养基中提取总RNA。使用克隆的AMW第一链cDNA合成试剂盒与寡核苷酸(dT)引物由1μg总RNA逆转录cDNA。使用AmpliTaq Gold快速PCR主混合物和特异性PTX3引物(46-48)通过qPCR扩增第一链cDNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因表达用于对扩增产物的量进行归一化。
7.Western印迹
收集培养上清液，并通过用冷PBS洗涤细胞六次，随后在温和搅拌下在RIPA缓冲液中4℃孵育1h并以14,000g在4℃离心30min，获得细胞裂解物。培养上清液和细胞裂解物中的蛋白质浓度使用BCA蛋白质试验试剂盒进行定量。样品在50mM NaOH中25℃孵育1h或溶解于0.1M乙酸钠缓冲液(pH 6.0)中并在存在或不存在20单位/ml链霉菌属HAase下在60℃孵育1h。随后在变性和还原条件下将其在4-15％(w/v)梯度丙烯酰胺预制胶上通过SDS-PAGE进行解析，并转移至硝酸纤维素膜上。该膜随后在50mM含有150mM NaCl和0.05％(v/v)Tween-20的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中用5％(w/v)脱脂牛奶封闭，随后与不同的第一抗体连续孵育，随之与其各自的HRP偶联的第二抗体孵育。通过Western LightingTM化学发光试剂对免疫反应性蛋白质进行可视化。
结果
AM上皮和致密基质中的阳性PTX3染色
在新鲜的人胎膜的横截面上使用抗-人PTX3抗体进行免疫荧光染色，该人胎膜由上皮层和无血管基质组成，其可被进一步细分为致密层和海绵层，以及下方富含细胞的绒毛膜(图33，阶段)。在上皮的顶面和致密基质中均发现了阳性PTX3染色。相反，PTX3染色在海绵基质和绒毛膜中明显减弱(图33，PTX3)。HAase消化未增强后者中的PTX3染色，表明在这两个区域中的弱PTX3染色并非由于掩蔽效应。使用生物素化的HABP在AM基质中发现强阳性HA免疫染色，并且在AM上皮中发现相对弱的染色(图33，HA)，而在AM基质下的绒毛膜的上层中注意到HA的弱染色，但在绒毛膜的下层中注意到了强染色。当用HAase对组织切片进行预消化时这种染色消失(图33，HA(+HAase))，表明HA染色是特异性的。各HC的免疫染色也在AM上皮、基质细胞和基质及绒毛膜中显示阳性染色(图33，HC1和HC2)。这些结果表明AM中PTX3的存在，主要是在致密基质和上皮中。
AM可溶性提取物和纯化的HC-HA复合物中PTX3的存在
为了进一步研究AM中PTX3的存在，在50mM NaOH处理以切割酯键之前和之后，我们首先通过等渗盐缓冲液进行了AM提取物的Western印迹分析。重组PTX3以45kDa、90kDa、180kDa和HMW物质出现(图34，泳道2)。可溶性AM提取物在加样孔的底部显示45kDa和HMW物质(大部分不进入凝胶)(图34，泳道3)。NaOH处理不影响45kDa物质，但完全消除了HMW物质，导致了PTX3的HMW成片条带(图34，泳道4)。这些结果表明PTX3在AME中作为单体和HMW复合物存在。由于后者可被能切割HC-HA之间的酯共价连接的NaOH解离成HMW成片条带，加样孔中的含有HMW PTX3的物质可能与HC-HA相关。
为了进一步证实PTX3是否与AM HC-HA复合物相关，如先前报道的(He等人(2009)J.Biol.Chem.284:20136-20146.；Zhang等人(2012)J.Biol.Chem.287:12433–12444)，我们通过两次和四次连续超速离心从AM可溶性提取物中纯化HC-HA复合物，并在进行或不进行HAase消化下进行Western印迹分析。与可溶性AME中发现的单体相反，对应于天然PTX3二聚体的大小的90kDa物质显示于AM第2和第4HC-HA复合物中，除了在加样孔底部的HMW条带外(图34，泳道5和7)。另外，在第2HC-HA复合物中也发现了弱HMW成片条带并且在第4HC-HA复合物中发现了强HMW成片条带。在HAase处理后，90kDa二聚体仍然在两种HC-HA复合物中，但是HMW成片条带在第4HC-HA中得到加强，在第2HC-HA中增加，在凝胶顶部HMW条带消失(图34，泳道6和8)，这类似于AME中所见的结果。发现在含有或没有HAase的HC-HA复合物中90kDa PTX3二聚体的存在是由2-ME引起的从HC-HA的解离引起的，因为2-ME的消除导致此90kDa物质不存在(未示出)。这些结果表明，尽管经过四次超速离心，但HC-HA复合物依然含有与HC-HA结合以形成HC-HA/PTX3复合物的PTX3。
使用抗-HC1抗体的Western印迹分析显示HC-HA复合物在加样孔底部作为HMW物质存在，其在HAase消化时消失(图34，泳道10-13)，并且显示HC-HA复合物中HC1的存在，其在HAase消化后从HC-HA复合物中释放(图34，泳道11和13)。我们未检测HC2及TSG-6(未示出)。这些结果共同证实了从AM纯化的HC-HA仅含HC1。我们也注意到在第2和第4HC-HA复合物之间的主要差异，即，游离80kDa HC1条带仅在第2HC-HA复合物中检测到(图34，泳道11)，而在第4HC-HA复合物中未检测到，表明后者不含游离的HC1。第4HC-HA中HA的存在通过琼脂糖凝胶电泳来证实，其显示为从顶部加样孔至凝胶底部的连续HA成片条带，并且这样的成片条带通过HAase消化被分解。
AMEC和AMSC表达PTX3 mRNA和蛋白质
我们随后确定AM上皮和基质细胞培养物合成PTX3。我们如所报道的(Chen等人(2007)Stem Cells 25(8):1995-2005；Li等人(2008)J Cell Physiol.215(3):657-64；Zhang等人(2012)J.Biol.Chem.287:12433–12444)培养这些细胞，并提取总RNA以供RT-PCR，提取蛋白质以供Western印迹分析，并将其与人皮肤成纤维细胞(HCF)比较，据报道其仅在促炎细胞因子如TNF和IL-1的刺激下才表达PTX3 mRNA和蛋白质。如所预期的，qRT-PCR结果表明PTX3转录物的表达在静息HSF中很低，但被TNF和IL-1β上调(图35A)。尽管PTX3转录物在静息AMEC和AMSC中的表达也很低，但其被TNF或IL-1β显著升高(图35A)。Western印迹分析证实，PTX3蛋白质在裂解物中很低(45kDa)并且在静息HSF的培养基中未检测到(图35B，泳道2)，但是在添加TNF或IL-1β24h后在裂解物中检测到而在培养基中未检测到。相反地，PTX3蛋白质在静息AMEC中是可检测的，并且其在裂解物(45kDa)和培养基(45kDa和90kDa)中被TNF或IL-1b显著增加(图35B，泳道5、6和7)，其中TNF比IL-1b更有效。在AMSC中注意到了相同的发现(图34B，泳道8、9和10)。为了证明来自所有细胞的裂解物中的75kDa和135kDa条带以及培养基中的50kDa条带均为非特异性的，因为这些条带在TNF或IL-1b下并未发生改变，进行PTX3 siRNA转染，并且确实下调了裂解物中的45kDa物质以及45kDa和90kDa物质，但未下调这些非特异性条带(图35C)。这些结果共同表明，静息AM细胞确实合成并分泌了PTX3，并且进一步被促炎性刺激上调。
AM基质细胞产生HC-HA/PTX3复合物
先前的研究已经表明，HC-HA(即SHAP-HA)复合物可从补充PBS的培养基中培养的小鼠皮肤成纤维细胞的细胞层中分离，并且分离的HC-HA同时包含源自FBS的IαI的HC1和HC2(Yoneda等人(1990)J.Biol.Chem.265:5247-5257；Huang等人(1993)J.Biol.Chem.268:26725-26730)。然而，我们报道了AM细胞通过使用其内源性产生的IαI产生HC-HA(Zhang等人(2012)J.Biol.Chem.287:12433–12444)。由于AM细胞合成PTX3蛋白质，其可被TNF和IL-1进一步增加，我们旨在确定它们是否产生也含有PTX3的HC-HA。我们使用HSF作为对照，其仅在包含血清的条件下在促炎刺激(例如，TNF和IL-1)下表达PTX3(Yoneda等人(1990)J.Biol.Chem.265:5247-5257；Huang等人(1993)J.Biol.Chem.268:26725-26730)(图35)，并且与在含有或没有TNF的无血清及含血清条件下培养的AMEC和AMSC进行比较。我们还将3％琼脂糖覆盖于细胞单层上，因为已经发现这种方法在细胞表面或附近捕获分泌的原胶原，而不是进入角膜细胞培养物上的培养基中(Hassell等人(2008)Experimental EyeResarch.87:604-611；Etheredge等人(2010)Matrix Boil.29:519-524)。在覆盖5天之后，HSF、AMSC和AMEC变得更致密，尤其是在包含血清的条件下(图36)。在AMEC中上皮形态变得更清晰。
然后，我们通过HA ELISA试验测定培养基中的HA浓度而确定3％琼脂糖覆盖在捕获分泌的HA中是否同样有效。在无琼脂糖覆盖下，HA水平在AMSC和AMEC的无血清培养基中均很容易检测到，而在HSF的无血清培养基中则不容易检测到。TNF显著增加了所有这三种细胞培养基的HA水平(图37)。在含血清培养基中进一步促进了上述模式。在所有三种培养物中，在无血清和含血清条件下琼脂糖覆盖均使HA水平减少了超过50％。这些结果表明琼脂糖覆盖的确减少了进入培养基的HA水平。
为了确定琼脂糖覆盖后分泌的HA何时被真正地捕获在细胞外基质中，我们使用生物素标记的HABP，针对HC1和HC2的特异性抗体，以及两种不同的抗-PTX3抗体，即，分别为MNB4和生物素标记的pAb，对PTX3/HA、HC1/HA和HC1/PTX3进行了双重免疫染色。在无血清条件下，在HSF中的细胞外周区域中注意到阳性HA染色，而PTX3染色为阴性(图38)。采用TNF刺激，在细胞质中观察到阳性PTX3染色(图38B)，证实HSF中TNF对PTX3的诱导型表达。TNF并未显著增加HA染色强度，但诱导了电缆状结构(图38G)，这类似于已在培养的肾脏近端小管上皮细胞所报道的(Selbi等人(2006)Kidney International.70:1287-1295)。未观察到PTX3与HA的共定位，表明在TNF刺激后的HSF中PTX3与HA不相关。相反地，作为细胞表面和细胞外基质上的纤维网，在静息AMSC中检测到阳性HA染色，与细胞外基质中的HA共定位(图38C和6K)。TNF进一步增加了PTX3染色强度和HA原纤维的量(图38D和38K)。
在静息AMEC中，阳性HA染色也在具有一些纤丝状外观的细胞外隙中发现，但仅在细胞没那么致密的散布区域中(图38E和38L)。在AMEC中也观察到PTX3和HA共定位。TNF处理进一步增加了PTX3染色强度和HA原纤维的量(图38F)。这些结果进一步证实PTX3是被AMSC和AMEC组成型表达的，并且其表达可被TNF进一步增加。在进行(图38G和38J)或不进行(未示出)TNF处理的条件下，仅在一些HSF中观察到弱的阳性HC1染色，并且尤其是在HA电缆状结构中与HA共定位(图38G)。然而，我们在HC1和PTX3之间未注意到共定位(图38J)。相反地，在AMSC中注意到强阳性HC1染色，并在细胞膜上与HA共定位(图38H)以及在细胞质中与PTX3共定位(图38K)。AMEC也显示出强阳性HC1染色并在细胞膜中与HA共定位(图38I)以及在细胞质和细胞膜中与PTX3共定位(图38L)。这些结果共同表明，富含HA的基质在AMSC、AMEC和HSF中通过琼脂糖覆盖被有效捕获，并仅在无血清条件下在AMSC和AMEC中同时包含HC1和PTX3，进一步证实这样的HC-HA/PTX3复合物通过内源性IαI合成。
为了进一步证实在琼脂糖覆盖条件下HC-HA/PTX3复合物的形成，我们使用6MGnHCl提取细胞层，并在进行或不进行NaOH处理下，在无血清和含血清条件下在AMSC和HSF培养物中进行Western印迹分析。在进行或不进行TNF刺激和NaOH处理的条件下，无血清HSF显示170kDa和140kDa物质，但未显示对应于对照PTX3的45kDa物质，表明这两个条带均为非特异性的(图38D，泳道2-5)。具有TNF的含有血清的HSF显示微弱的140kDa物质和一些小MW物质，与在无血清HSF中看到的相似(图39，泳道11和12)。相反地，无血清AMSC显示出弱HMWPTX3成片条带、90kDa和45kDa物质(图39，泳道6)，其中后两者分别对应于PTX3二聚体和单体(图39，泳道2)。这些结果与在AME中见到的结果相似(图34)。也观察到与在无血清HSF中所见到的相同的非特异性170kDa物质和一些小分子物质。NaOH处理增加了HMW PTX3成片条带但未影响PTX3单体和二聚体(图39，泳道7)及其他物质。TNF增加了HMW PTX3成片条带、PTX3二聚体和单体以及其他物质(图39，泳道8和9)。具有TNF的含有血清的AMSC显示出强HMW PTX3成片条带、90kDa PTX3二聚体和45kDa PTX3单体(图39，泳道13)。NaOH处理显著增加了HMW PTX3成片条带及60kDa和50kDa处的两种物质(图39，泳道14)。由于NaOH断裂HC和HA之间的酯键从而导致HC-HA的解离，这些结果表明HMW PTX3从HC-HA复合物释放。上述结果共同表明AMSC产生含有PTX3的HC-HA复合物而HSF则不产生。
HC-HA/PTX3复合物(rcHC-HA/PTX3)的体外重建
为了进一步证实HC-HA/PTX3复合物可能如何产生，我们使用HA、TSG-6、IαI和PTX3在体外重建HC-HA/PTX3复合物。我们首先将HA固定于塑料上，并成功地添加重组TSG-6，纯化IαI或血清作为IαI的来源。据报道，TSG-6可通过与固定表面上的HA结合而形成稳定的TSG-6/HA复合物(Wisniewski等人(2005)J Biol Chem.280:14476-84)，并且游离的和HA结合的TSG-6均可将HC从IαI转移至固定化的HA以形成HC-HA(Colon(2009)J Biol Chem.284:2320-31)。如预期的，使用抗-IαI抗体的Western印迹法未在单独的对照iHA中检测到任何物质(图40A，泳道2)。当同时将IαI和TSG-6添加至iHA时，检测到弱的220kDa IαI、85kDaHC2、强的～80kDa HC1和50kDa物质(图40A，泳道3)，表明在TSG-6的存在下HC1和HC2均被转移至iHA以形成HC-HA。HC1和HC2的条带强度的比较表明，与HC2相比，更多的HC1被TSG-6转移至iHA，导致截短的50kDa物质。当PTX3同时与IαI和TSG-6添加至iHA时，IαI物质的强度降低但HC1强度以PTX3剂量依赖的方式增加(图40A，泳道4-6)，同时HC2是不可检测的，表明通过TSG-6催化，PTX3优先地促进HC1转移至固定化的HA而未促进HC2转移。当在同时添加IαI和TSG-6之后添加PTX3时，检测到HC1但未检测到IαI或HC2，并且HC1强度也以PTX3剂量依赖的方式增加(图40A，泳道7-9)，证实PTX3促进HC1转移至固定化的HA而未促进HC2转移。这些结果表明不论其是同时地还是顺序地，PTX3均独特地促进主要HC1转移至固定化的HA以形成HC1-HA复合物。使用抗-TSG-6抗体的Western印迹显示，在iHA上的IαI和TSG-6中间通过同时或顺序添加PTX3而形成的rcHC-HA中检测到35kDa TSG-6单体和75kDa二聚体。由于TSG-6条带的强度以剂量依赖的方式降低，表明结合至固定化的HA的TSG-6可被PTX3竞争出来(图40B)。当PTX3与IαI和TSG-6同时添加时，使用抗PTX3-抗体的Western印迹在加样孔显示出突出的HMW PTX3成片条带，具有微弱的四聚体和二聚体条带，并且它们的强度以PTX3剂量依赖的方式增加(图40C，泳道4-6)。这个发现表明PTX3优先地并强烈地结合至rcHC-HA复合物，其中该结合耐受8M GnHCl洗涤。相反地，当在添加IαI和TSG-6之后顺序添加PTX3时，我们未检测到HMW PTX3和四聚体和二聚体物质(图40C，泳道7-9)，表明PTX3和预先形成的rcHC-HA PTX3之间的结合不太强而无法抵抗8M GnHCl洗涤。因此，这些体外重建实验表明PTX3必须与HA、IαI和TSG-6同时在体内产生以允许HC-HA/PTX3的形成。这种解释得到了体内组织切片以及通过AMSC形成的细胞外基质中HA、HC和PTX3的免疫共定位的支持。
实施例33：HC-HA复合物对TGFβ1信号传导的影响
固定化的HC-HA通过下调TGF-β1的表达但上调TGF-β3信号传导抑制TGFβ1信号传导。TGFβ1信号传导的此种抑制由于TGFβRII和TGFβRIII的进一步抑制能抵抗通过添加血清或外源性TGF-β1而进行的激发。结果，固定化的HC-HA通过抑制SMAD2/3信号传导和α平滑肌形成的表达来防止角膜成纤维细胞的成肌纤维细胞分化。这种作用也足够有效以将角膜成纤维细胞复原成角膜细胞。HC-HA(不溶性(I))不同于HC-HA(可溶性(S))，其包含额外的小亮氨酸丰富蛋白质(SLRP)，并且通过上调BMP和其受体的表达而激活TGFβ1和BMP信号传导的表达，因此，激活了pSMAD1/5/8，其共同进一步促进了聚集体的形成。这些作用可进一步使角膜成纤维细胞去分化为神经嵴祖细胞。
在该实施例中，检查了在进行或不进行外源性TGFβ1激发的条件下，固定化的可溶性和不溶性HC-HA对人角膜成纤维细胞中的TGF-β信号传导的影响。此外，检测了HC-HA复合物对SMAD2/3信号传导和αSMA表达的抑制的影响。
实验和临床研究支持冷藏保存的羊膜(AM)的抗瘢痕形成治疗作用。我们的研究表明，重链乙酰透明质酸复合物(HC-HA)被AM独特地产生并可从AM中纯化，并抑制人角膜成纤维细胞中的TGF-β1启动子活性。目前尚不清楚HC-HA是否抑制TGF-β1 mRNA和蛋白质表达以及促进已知会抵消TGF-β1信号传导的TGF-β3 mRNA和抑制蛋白质表达，并且如果是这样的话，HC-HA对TGF-β信号传导的这类抑制是否被翻译为pSMAD2/3的核转位的抑制。
如果在AM上培养，小鼠角膜细胞可在塑料上的无血清DMEM/ITS或DMEM/10％FBS中维持未分化的状态(表达角膜蛋白聚糖)。在无血清DMEM/ITS中使用10％血清或10ng/mlTGF-β1处理角膜细胞诱导Smad2/3磷酸化和核定位(3h)以及α-SMA表达(5天)。使用血清或TGF-β1处理的AM上的角膜细胞中Smad2/3和α-SMA的活化均被抑制(Kawakita等人(2005)JBiol Chem.280(29):27085-92)。我们的研究表明HC-HA抑制人角膜成纤维细胞中的TGF-β1启动子活性。预计pSmad2/3信号传导和α-SMA形成将被HC-HA抑制。
如上所述，在使用或不使用固定化的HA、可溶性HC-HA(PBS)(2X或4X))或不溶性HC-HA(GnHCl)(2X或4X)的情况下，将人角膜成纤维细胞(或Limbal肺泡细胞，p3)接种于塑料盘中48h。所述细胞随后用或不用TGFβ1处理24h，然后收获以用于mRNA定量和信号传导的测定。对于TGFβ受体蛋白质的测定，细胞用或不用TGFβ1处理24h，然后收集蛋白质样品以允许从表达mRNA表达蛋白质的时间。对于TGF-β1ELISA，细胞用或不用TGF-β1处理24h，随后在新鲜培养基中培养24(和48)h。收集上清液用于TGF-β1ELISA。对于TGF-β2和TGF-β3ELISA，细胞用或不用TGF-β1处理48h。收集上清液用于TGF-β2和TGF-β3ELISA。直到72h时拍摄不同培养物的相差图像。
进行了以下实验：
1.通过实时PCR对TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及其受体的mRNA半定量：用于评估TGF-β家族和其受体的mRNA转录物表达。实时RT-PCR图谱包括在95℃下10分钟的初始活化，随后是40个循环的在95℃下15分钟变性，以及在60℃下1分钟的退火和延伸。
2.通过免疫染色确定α-平滑肌形成和SMAD2/3信号传导：使用标准免疫染色程序进行以监测α-平滑肌形成和SMAD2/3信号转导。
实验1和2的实验组为：
PBS
PBS+TGF-β1
HA
HA+TGF-β1
2X HC-HA PBS
2X HC-HA PBS+TGF-β1
4X HC-HA PBS
4X HC-HA PBS+TGF-β1
2X HC-HA Gn
2X HC-HA Gn+TGF-β1
4X HC-HA Gn
4X HC-HA Gn+TGF-β1
3.通过Western印迹对TGFβR的定量：用于使用其相应的抗体(R&D Systems)对TGFβRI、TGFβRII和TGFβRIII的蛋白质浓度进行定量。加样顺序如下：
Figure GDA0003352411270002061
4.用于对培养基中的TGFβ进行定量的ELISA：来自R&D Systems的QuantikineHuman TGF-β1和TGF-β2ELISA试剂盒和来自Norvus Biologicals的TGF-β3ELISA试剂盒是固相ELISA，设计为测量酸活化的细胞培养基上清液、血清、血浆和尿液中的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β13。它们包含重组的人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3并已经显示精确地定量重组因子。使用天然TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3获得的结果显示出与使用重组试剂盒标准获得的标准曲线平行的线性曲线。将这些试剂盒用于确定培养基中的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。实验4的实验组为：
PBS
PBS+TGF-β1
HA
HA+TGF-β1
4X HC-HA PBS
4X HC-HA PBS+TGF-β1
4X HC-HA Gn
4X HC-HA Gn+TGF-β1
结果
接种于DMEM/10％FBS的HCF到72h时仅在不溶性HC-HA上形成聚集物(图41)。在DMEM/ITS(胰岛素/转铁蛋白/硒)培养基中经过24h血清饥饿之后这样的聚集物依然持久。随后将细胞在三种不同的培养基中培养：A-DMEM/ITS培养48h；B-24h DMEM/ITS，24h DMEM/10％FBS；C-24DMEM/ITS，含有10ng/ml TGF-β1的DMEM/ITS中培养24h。在HC-HA中培养的细胞在4X HC-HA(Gn)上形成小聚集物，但在其他培养条件中不形成(图41)。然而，在接种于固定化的基底上的DMEM/10％FBS中2小时后，仅对照上的HCF附着良好。HA、HC-HA[HC-HA(4X，PBS)和4X，GnHCl]上的细胞均为圆形的，表明它们未良好附着。孵育72h之后，所有的细胞均附着良好，然而，在固定化的HC-HA上有较少细胞。HC-HA(4X,PBS)上这些基底上的细胞数大于HC-HA(4X,GnHCl)上的细胞数。在培养24h后HCF开始在HC-HA(Gn)上形成聚集物，并在培养72h之后浓缩为更大的聚集物。在TGFβ1刺激后，我们观察到培养在HC-HA(4X，PBS；4X，Gn)上的HCF的聚集物。
总之，在存在/不存在TGFβ1激发下，HC-HA(Gn)促进HCF的聚集，而HC-HA(PBS)在TGFβ1激发下促进HCF的聚集。聚集的意义是未知的。
在DMEM/ITS中，TGFβ1和TGFβ3转录物的表达被HC-HA(Gn)提高，但是TGFβ3转录物被HC-HA提高(PBS)(图42)。正如自身诱导中所预计的，TGFβ1和TGFβ3 mRNA在塑料上培养的HCF中分别被TGFβ1激发增加4倍和2倍，TGFβ1蛋白质相应地从60pg/ml增加至105pg/ml(由于实验误差，TGFβ3蛋白在实验中未检测)。在无血清条件下，可溶性4X HC-HA减少TGFβ1蛋白质表达。尽管其促进TGFβ1mRNA的表达，但不溶性HC-HA也减少分泌的TGFβ1，并依旧高于在DMEM/ITS中培养的对照。此外，观察到可溶性和不溶性HC-HA对TGFβRII和TGFβRIII的显著的抑制。结果，自分泌TGFβ信号传导在可溶性或不溶性HC-HA上培养的HCF中均被抑制，但旁分泌TGFβ信号传导在不溶性HC-HA上培养的HCF中保持。此外，在没有TGFβ1刺激的无血清条件下，可溶性和不溶性4X HC-HA均将TGFβ3 mRNA表达上调3倍，已知其可抵消TGF-β1信号传导。在TGFβ1刺激下，当HCF在可溶性和不溶性HC-HA上培养时，TGFβ3 mRNA表达分别增加5倍和8倍，表明可溶性和不溶性HC-HA强烈地促进TGFβ3转录物表达。这些结果也表明从AM纯化的HC-HA不仅通过抑制TGFβ1信号传导而且通过TGFβ3表达的显著上调促进了AM的抗瘢痕形成作用。从我们的结果看来，HC-HA(PBS和Gn)似乎在mRNA和蛋白质水平上不影响TGFβ2表达。总之，HC-HA(PBS)抑制TGFβ1，但激活用TGFβ1激发的HCF中的TGFβ3信号传导，而HC-HA(Gn)既激活了TGFβ1信号传导又激活了TGFβ3信号传导。
在塑料对照中，在TGFβ激发下TGFβRII mRNA上调了8倍(图43)。TGFβII和TGFβIII受体mRNA在无血清条件下分别被HC-HA(PBS和Gn)上调了2倍至8倍，但在TGFβ1激发下被完全抑制。对于HA也注意到了相同的结果。当在HC-HA(分别为PBS和Gn)上培养的HCF被TGFβ激发时，TGFβRII和TGFβRIII的相应蛋白质表达分别下调了3倍和3倍，以及2倍和3倍。在这种情况下，HA未改变这些蛋白质表达。这样的下调可能部分解释了通过AM的抗炎症和抗瘢痕形成效应的机制。总之，当HCF在HA和HC-HA(PBS和Gn)上培养时，TGFβR2和TGFβR3的mRNA表达增加。
免疫染色表明HC-HA(PBS和Gn)抑制在进行或不进行TGFβ1激发的DMEM/ITS中的pSMAD2/3核转位(图44)。使用TGFβ时这样的影响更明显。这个发现进一步证实TGFβ1、TGFβRII和TGFβRIII的抑制被翻译为SMAD-介导的信号传导的抑制。
此外，免疫染色结果表明可溶性和不溶性HC-HA在TGFβ1激发后均抑制α-SMA的形成，进一步支持了在添加或不添加TGFβ1下，可溶性和不溶性HC-HA对TGF-β1信号传导的这种使HCF分化为成肌纤维细胞受到抑制(图45)。
总之，在无血清和TGFβ1激发条件下，可溶性HC-HA下调了TGF-β1但上调了TGF-β3表达，而不溶性HC-HA对HCF中的TGF-β1和TGF-β3表达均上调。由于可溶性和不溶性HC-HA对TGFβRII和TGFβRIII的表达均下调，这些变化导致对TGFβ信号传导的抑制，这由缺少pSMAD2/3的核转位和α平滑肌形成的抑制得到证明。
实施例34：HC-HA复合物对BMP信号传导的影响
在本实施例中，检查了对固定化的HC-HA与额外的TGF-β1对BMP信号传导的影响。还测定了通过pSMAD1/5/8的激活对BMP信号传导的激活。
BMP构成TGFβ超家族的亚组，该超家族包括BMP1-3、BMP3b、BMP4-7、BMP8a、BMP8b、BMP9-15。BMP结合II型受体(ALK2、ALK3或ALK6)，其激活I型受体以使Smad1、Smad5和Smad8磷酸化，导致pSmad1/5/8的核转位(在Massague 2000；Herpin,2007中进行了综述)。还不清楚哪些特异性BMP和BMP受体存在于HCF中，以及如果是这样的话，当TGFβ信号传导受到抑制时BMP信号传导是否可以被HC-HA(PBS和Gn)和额外的TGFβ1激活，以及如果是这样的话，哪些形式的BMP和BMP受体在控制BMP信号传导中起主要作用，以及BMP信号传导的这种激活是否通过pSMAD1/5/8。
将人角膜成纤维细胞接种于含有或不含有固定化的HA或HC-HA PBS(4X)或HC-HAGn(4X)的塑料上48小时，随后如上所述用或不用TGFβ1处理24小时以供mRNA定量和pSMAD1/5/8的测定。为了测定BMP受体蛋白质，在收集蛋白质样品以允许蛋白质表达之前，用或不用TGF-β1处理细胞48小时。对于BMP ELISA，用或不用TGF-β1处理细胞48小时。收集上清液以供BMP ELISA。直到72小时采集各个培养物的相差图像。
对培养物进行下列实验：
1.通过实时PCR对BMP及其受体的mRNA半定量：用于估计BMP家族和它们的受体的mRNA转录物表达。
2.通过免疫染色测定α-平滑肌形成和SMAD1/5/8信号传导：通过免疫染色进行以监测α-平滑肌肌形成和SMAD2/3信号传导。
实验1和2的实验组是：
PBS
PBS+TGF-β1
HA
HA+TGF-β1
4X HC-HA PBS
4X HC-HA PBS+TGF-β1
4X HC-HA Gn
4X HC-HA Gn+TGF-β1
3.使用BMPR1A、BMPR1B和BMPR2抗体通过Western印迹分析对BMPR的定量：用于分别定量BMPR1A、BMPR1B和BMPR2的蛋白浓度。加样顺序如下：
Figure GDA0003352411270002111
4.用于定量培养基中的BMP的ELISA：我们使用BMP ELISA试剂盒(R&D Systems)以测定培养基中的BMP。实验4的实验组是：
PBS
PBS+TGF-β1
HA
HA+TGF-β1
4X HC-HA PBS
4X HC-HA PBS+TGF-β1
4X HC-HA Gn
4X HC-HAGn+TGF-β1
结果
在静息状态下，HA以及HC-HA(PBS)和HC-HA(Gn)两者激活BMP6的转录物表达分别达7倍和4倍(图46)。在TGFβ1的存在下，HA以及HC-HA(PBS)和HC-HA(Gn)两者激活BMP4的转录物表达6倍、11倍和6倍，并且BMP6在HCF中的mRNA表达分别是30倍、37倍和46倍，这表明HA与可溶性和不溶性HC-HA可上调BMP4/6的表达，而额外的TGFβ1进一步显著上调BMP4和BMP6信号传导。未检测到BMP7和BMP9。
虽然TGFβ1本身没有激活BMPR1A的转录物表达，但HC-HA(PBS)和HC-HA(Gn)，而非HA，在TGFβ1的存在下分别激活BMPR1A的转录物表达7倍和3倍，这表明BMPR1A可能在HC-HA+TGFβ1激活的BMP信号传导中发挥主要作用(图47)。此外，TGFβ1激活BMPR1B3倍，且激活BMPR2 3倍，但在含有或不含有HA与HC-HA(PBS)和HC-HA(Gn)的塑料上激活4倍，这表明TGFβ1本身非特异性地激活BMPR1B和BMPR2的mRNA表达。HC-HA(PBS)或HC-HA(Gn)增强BMPR2的转录物表达至4倍。BMP-BMPR1A预期激活SMAD1/5/8的信号传导而BMP-BMPRII激活非-SMAD信号传导。
免疫荧光结果表明，TGFβ1本身中度激活HCF中pSMAD1/5/8的核转位，无论使用何种基底(图48)。HC-HA(PBS和Gn)通过pSMAD1/5/8的核转位强烈促进BMP4/6信号传导的活化，如具有pSMAD1/5/8的更多细胞核和pSMAD1/5/8的更强核染色所证明的。
ID1是螺旋-环-螺旋(HLH)蛋白质，其可与转录因子(已知被SMAD1/5/8的信号传导调节的下游基因)的碱性HLH家族的成员形成异二聚体。我们的结果表明，当HCF培养于HC-HA(PBS)和HC-HA(Gn)中时，SMAD1/5/8的活化分别导致ID1 mRNA的4倍和8倍的上调，这表明在HCF中的SMAD1/5/8信号传导确实被HC-HA+TGFβ所活化(图49)。由于ID1没有DNA结合活性，因此可以抑制与其相互作用的碱性HLH蛋白的DNA结合和转录激活的能力，我们预期ID1在细胞生长、衰老和分化中发挥重要作用。
实施例35：HC-HA复合物对于肌成纤维细胞分化和人角膜成纤维细胞逆转为角膜 细胞或较年轻的祖细胞的影响
角膜细胞，一种镶嵌在角膜基质中的神经嵴来源的细胞的独特群体，表达包含硫酸角质素的蛋白聚糖，包括角膜特异性角膜蛋白聚糖。角膜蛋白聚糖(Kera)是成年脊椎动物眼中的角膜特异性硫酸角质素蛋白聚糖(KSPG)。它属于小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)基因家族，是脊椎动物角膜基质内的细胞外KSPG的主要成分之一。角膜KSPG在基质组装(负责角膜透明度)中发挥关键的作用。腔蛋白聚糖构成大约角膜KSPG的一半。其余大部分角膜硫酸角质素修饰角膜蛋白聚糖。在成年组织中，角膜蛋白聚糖被限制在角膜基质内，并且角膜蛋白聚糖表达被认为是角膜细胞的表型标记(Liu等人(2003)J.Biol Chem.278(24):21672-7；Carlson等人(2005)J Biol Chem.280(27):25541-7)。在塑料皿上，当培养于包含血清的培养基中时，人、牛、兔的角膜细胞失去其特有的树突状形态和角膜蛋白聚糖表达(Espana等人(2003)Invest Ophthalmol Vis Sci.44(12):5136-41；Espana等人(2004)Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985-91)。这些暴露的细胞下调包含硫酸角质素的蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖和CD34的表达，并且上调包含软骨素-硫酸皮肤素的蛋白聚糖和α-SMA的表达，这表明这些细胞变得更加分化。
先前的研究表明，由于Smad信号传导途径的下调，当培养于AM基质表面时，即使将TGF-β加入包含血清的培养基中，人(Espana等人(2003)Invest Ophthalmol Vis Sci.44(12):5136-41；Espana等人(2004)Invest Ophthalmol Vis Sci.45(9):2985-91)和鼠(Kawakita等人(2005)J Biol Chem.280(29):27085-92)角膜细胞可以维持其表型，而不分化成表达α-SMA的成肌纤维细胞。羊膜基质可以维持培养物中的角膜蛋白聚糖表达并且防止角膜细胞分化成肌成纤维细胞(Kawakita等人(2005)J Biol Chem.280(29):27085-92)。角膜细胞维持树枝状形态，继续表达角膜基质特异性角膜蛋白聚糖至少5代(以1：2分离)，并且在包含血清的条件下或加入TGF-β1下不表达α-SMA(Espana等人(2004)InvestOphthalmol Vis Sci.45(9):2985-91)。鼠角膜细胞也可以在AM上扩增至少8代，而不会失去其正常的表型并且Smad介导的TGF-β信号传导途径的抑制在维持表达角膜蛋白聚糖的表型中是至关重要的(Kawakita等人(2005)J Biol Chem.280(29):27085-92)。在本实施例中，检查了固定化的HC-HA是否是这样，如果是的话，则检查额外的TGFβ1是否能够影响其后果。
结果
HA上调角膜蛋白聚糖mRNA表达4倍(图50)。将人角膜成纤维细胞接种于含有或不含有固定化的HA的塑料上48小时，无血清饥饿24小时，然后在被收获用于mRNA定量和SMAD2/3信号传导测定之前使用或不使用TGFβ1处理24小时。对于TGF-β受体蛋白质的测定，因为蛋白质的表达滞后于mRNA表达，因此在收集蛋白质样品之前使用或不使用TGFβ1处理细胞48小时。对于TGF-β1ELISA，使用或不使用TGFβ1处理细胞24小时，然后在新鲜培养基中培养24(和48)小时。收集上清液用于TGF-β1ELISA。对于TGF-β2和TGF-β3的ELISA，使用或不使用TGFβ1处理细胞48小时。收集上清液用于TGF-β2和TGF-β3的ELISA。正如预期的那样，固定化的HC-HA提升角膜蛋白聚糖mRNA的表达14倍和16倍，这表明当培养于不含TGFβ1的HC-HA中时这些HCF更为年轻。在TGFβ1激发之后，在塑料和HA上角膜蛋白聚糖的mRNA表达水平显著下调。然而，在HC-HA(可溶性，PBS)上角膜蛋白聚糖表达仍维持3倍。在HC-HA(不溶性，Gn)上角膜蛋白聚糖不表达。我们预计在HC-HA(I)上所产生的表型应该比角膜细胞更为年轻。
相应地，固定化的HC-HA(I/S)提升角膜蛋白聚糖的蛋白质水平8倍和10倍，这表明当培养于HC-HA(S/I)上时，这些HCF实际上恢复成角膜细胞(图51)。通过其他测试的处理，我们没有看到任何相应的角膜蛋白聚糖蛋白表达，包括HA(角膜蛋白聚糖mRNA的4倍增加)和4X HC-HA(PBS)(角膜蛋白聚糖mRNA的3倍增加)，这指示角膜蛋白聚糖mRNA的这种中度提高表达不足以促进角膜蛋白聚糖的相应的蛋白质表达。
实施例36：HC-HA复合物对HCF中ESC标记物表达的影响
实施例35显示出强有力的证据表明HCF不仅阻止在外源性TGF-β1的激发下经历肌成纤维细胞分化，而且也在存在或不存在外源性TGF-β1的情况下恢复成角膜细胞伴随角膜蛋白聚糖的表达。因此，我们研究HCF是否可以被进一步重编程为较年轻的祖细胞，尤其是当接种在含有外源性TGF-β1的固定化的HC-HA(不溶性，GnHCl)上时，已证明这会抑制TGF-β信号传导、促进BMP信号传导，但关闭角膜蛋白聚糖表达。我们研究了在ESC、内皮祖细胞和周细胞中发现的一些标记物的表达，正如我们最近报道的在血管发生祖细胞中发现的那样。为了进一步研究在由HC-HA调节的这些条件下HCF潜在的重编程，我们还研究了四种关键转录因子的表达，即Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4，已有报道它们发挥将成人分化成纤维细胞重编程为iPSC的关键作用。
结果
如上述实施例35中所述对HCF培养物上进行基因表达的检查。结果表明HCF在4XHC-HA上表达更多的(2至6倍)ESC标记物，诸如cMYC、KLF-4、Nanog、巢蛋白、Oct4、Rex-1、SOX-2和SSEA-4，并且当HCF被外源性TGF-β1激发时与塑料对照相比ESC标记物多2至4倍(p<0.05，n＝3)(图52)。这些结果表明HC-HA，尤其是HC-HA(不溶性)，可以将HCF重编程为较年轻的祖细胞。
实施例37：溶液中的HC-HA通过影响MC3T3-E1细胞活力和分化而抑制骨生成
在本实施例中，我们对溶液中的HC-HA(可溶性级分)和HA对未分化的MC3T3-E1细胞的活力和分化的影响进行了评估。MC3T3-E1是自C57BL/6小鼠建立的成骨细胞细胞系。MC3T3-E1细胞具有分化为成骨细胞和骨细胞的能力，并已被证明在体外形成钙化的骨组织。
在含有不同浓度的HA(1、5、25、100μg/ml)或HC-HA(1、5、25μg/ml)的完全培养基(α-MEM、10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中培养MC3T3-E1细胞，用PBS作为载体对照，并以1.6×104个细胞/ml接种于塑料细胞培养物处理的96孔板中。通过MTT试验测量细胞活力。结果表明，在除了25μg/ml HC-HA的所有条件下从24小时至48小时在550nm处的吸光度上升，这表明在对照组、1至100μg/ml的HA和1至5μg/ml的HC-HA中细胞增殖正常地进行(图53)。
接着，研究了HC-HA或HA对MC3T3-E1分化为成骨细胞的影响。将MC3T3-E1细胞重悬浮在非诱导培养基(1.6×105/ml)中并且接种于96孔板中并孵育直至汇合。去除非诱导培养基并且加入诱导培养基1(含有0.2mM抗坏血酸-2-磷酸和10mM甘油-2-磷酸的完全培养基，体外骨生成测定试剂盒的制造商说明书，目录号ECM810，Millipore)。在12天的分化之后，使用茜素红染色法测量和定量成骨细胞矿化。结果表明，在对照中AR实际上被诱导培养基促进。与先前的报道相一致(Kawano(2011)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications.405:575–580)，100μg/ml的HA，而非25μg/ml的HA，与对照相比进一步促进AR染色。与此相反，AR染色没有被5μg/ml的HC-HA降低(p＝0.11)，但被25μg/ml的HC-HA显著降低(p＝0.00002)(图54)。这些结果表明，在诱导期间提高HC-HA的浓度也减少了骨形成。
实施例38：使用MC3T3-E1模型系统，HC-HA和AMP对成骨细胞分化的剂量依赖性反 应
先前的研究结果表明，HC-HA和AMP剂量依赖性地抑制破骨细胞从RANKL诱导的RAW264.7细胞分化(参见国际PCT公开第WO2012/149486号)。AMP(羊膜粉末)是羊膜的冻干的、然后粉碎的形式。在本实施例中，对针对骨生成的HC-HA和AMP的IC50进行测定，并与针对破骨细胞生成的HC-HA和AMP的IC50进行比较。
碱性磷酸酶(ALP)测定和茜素红染色(AR-S)是两种用于测量MC3T3-E1细胞分化的测定方法。ALP由成骨细胞分泌，长期以来一直是广泛认可的成骨细胞活性的生化标记物(Sabokbar(1994)Bone Miner.27(1):57-67)，并因此作为早期骨生成标记物。茜素红(AR)染料与钙形成螯合物，并因此AR-S用于使矿化可视化。因为可以容易地提取出ARS染料，所以其也可以用于矿化的定量(Gregory等人(2005)Analytical Biochemistry 329:77–84)。
A部分
实验设计：
MC3T3-E1培养
采用来自Millipore体外骨生成试剂盒的MC3T3-E1细胞模型系统，其中该试剂盒由包含10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-MEM(Invitrogen，目录号ICM810)基础培养基组成。将细胞以50,000个细胞/cm2进行接种并在100mL细胞培养皿中以95％空气和5％CO2 37.0℃进行培养，并在汇合之前进行传代。一旦获得足够的细胞数，随后将细胞以1.6x105个细胞/ml接种于每孔(52个孔)具有100μL体积的基础培养基的96孔培养皿中。每个浓度接种在4个孔中，其中2个孔用于ALP测定、2个孔用于AR-S染色。在5％的CO2加湿空气中于37℃培养细胞并且每48-72小时更换培养基，直到汇合。
待研究的剂量范围来自在成骨细胞分化中获得的初步数据(见上文)以及HC-HA和AMP相对于破骨细胞分化的剂量-响应曲线。因为25μg/ml的HC-HA显著抑制MC3T3-E1细胞增殖和向成骨细胞的分化，并完全抑制破骨细胞从RAW264.7细胞分化(参见国际PCT公开第WO2012/149486号)，因此其被选择作为最高浓度。由于5μg/ml的HC-HA显示出小于50％的抑制，这表明用于成骨细胞分化的HC-HA的IC 50可能比P-214的IC 50高，选择在0.1、0.5、1、5、10和25μg/ml范围的HC-HA浓度。基于HC-HA的初步数据，选择下列浓度的AMP：1、5、25、125、250μg/ml。由于在MC3T3-E1细胞内ALP活性在分化的第12天达到峰值(Maeda(2004)Journal of Cellular Biochemistry 92:458–471；Wang,(2008)J Dent Res.87(7):650-654)，我们选择在诱导后第12天研究骨生成。
一旦汇合，将来自每个孔中的培养基更换为100μL骨生成诱导培养基#1。骨生成诱导培养基包含0.2mM抗坏血酸-2-磷酸和10mMβ-甘油磷酸(体外骨生成测定试剂盒，目录号ECM810，Millipore)。将10μL AMP和HC-HA的工作溶液加入到诱导培养基#1中。(制备AMP(AMP-4；批号CB102971，参见国际PCT公开第WO 2012/149486号)(5mg/ml)和HC-HA(He等人,(2009)J.Biol.Chem.284(30):20136–20146)(250μg/ml)在PBS中的储备溶液，并相应地用合适的培养基(骨生成诱导培养基#1)稀释至各个实验浓度(对于HC-HA为0.1、0.5、1、5、10和25μg/ml，对于AMP为1、5、25、125、250μg/ml))。每3天更换培养基。
在分化第6天，用包含抗坏血酸、β-甘油磷酸和褪黑激素的100μL新鲜的骨生成诱导培养基#2更换培养基。将10μl AMP和HC-HA的工作溶液加入到100μl骨生成诱导培养基#2(0.2mM抗坏血酸-2-磷酸、10mM的甘油-2-磷酸和50nM褪黑激素溶液，体外骨生成测定试剂盒的制造商说明书，目录号ECM810，Millipore)中，以在培养孔中达到最终试验浓度。每2-3天更换培养基。随后用ALP测定法(H-156)和ARS染色测定法按照制造商说明书(体外骨生成测定试剂盒(目录号ECM810))测定样品。
茜素红S染色
在不干扰细胞的情况下将来自每个孔的培养基吸出。用200μL PBS洗涤细胞1次。通过加入100μL 70％的乙醇且在室温孵育15分钟而将细胞固定。然后除去固定剂，在不干扰细胞单层的情况下用过量蒸馏水漂洗细胞3次(每次5分钟)。除去水并加入100μL/孔的茜素红染色溶液。将孔在室温孵育1小时。除去过量的染料，用去离子水洗涤细胞4次(每次洗涤轻轻摇动5分钟)。将0.1-0.15mL水加入到每个孔中以防止细胞干燥。在显微镜下对染色的细胞进行拍照。
然后从每个孔中除去过量的水。将100μL 10％的乙酸溶液加入每个孔中并摇动孵育30分钟。用细胞刮棒小心地将松散附着的单层除去，并且将细胞和乙酸转移至1.5mL微量离心管中，并剧烈涡旋30分钟。将样品加热至85℃保持10分钟，然后转移到冰上5分钟以冷却该管。将管中的浆液以20,000xg离心15分钟。移取400μL上清液并转移到一个新的1.5mL离心管中。用150μL 10％的氢氧化铵将pH中和至4.1-4.5的范围内。将150μL的每个样品加入到透明底96孔板中并在OD405下读取。绘制茜素红浓度相对于OD405的曲线。
ALP测定(BioAssay Systems：QuantiChrom ALP测定试剂盒，目录号：DALP-250)
用PBS洗涤每孔(96孔板)中的细胞，并且在溶解于蒸馏水中的100μL 0.2％的Triton X-100中室温摇动20分钟进行裂解。将200μL蒸馏水和200μL校准溶液(由试剂盒提供)转移到对照单独孔内。将50μL样品转移到单独的孔中。将150μL工作溶液(200μL测定缓冲液、5μL醋酸镁(5mM)、2μL pNPP液体底物(10mM))加入到样品孔中(最终反应体积为200μL)。短暂地轻轻敲打该板以进行混合。在第0分钟和第4分钟在平板读取仪上读取OD405值。
结果
相差显微镜检查
通过13天的诱导，阴性对照保持为六边形(图55)。所述单层比阳性对照更为光滑，这表明在后者中存在更多的细胞或更多的细胞堆积。阳性对照中的细胞在诱导开始后变成梭形形状。更长的时间后，纺锤样环在诱导的大约第4天沿着塑料培养皿的边缘(约2-3mm外)生成。
0.1μg/ml至10μg/ml的HC-HA，细胞单层未与阳性对照的不同，这表明这些浓度的HC-HA没有负面地影响诱导(图55A)。正如阳性对照一样，细胞还产生梭形形状且所述单层产生纺锤样环。然而，在25μg/ml时，在诱导的第13天观察到细胞密度显著降低以及细胞形态学的改变。
在大于25μg/ml的浓度下，AMP沉积的颗粒沉降在单层上(图55B)。由于在每次培养基改变后AMP浓度均得以补充，在诱导期在单层顶部上的AMP沉积物增加。用低于125μg/ml的AMP处理不影响细胞形态，因为细胞也生成带有纺锤环的梭形形状，这表明AMP没有负面地影响诱导。在高于125μg/ml的浓度时，AMP颗粒密度增加至模糊地目视观察到纺锤环形成的程度。然而，细胞密度和形态保持与阳性对照不变，这也证实AMP没有负面地影响诱导。
茜素红染色
阴性对照产生了蓝灰色的背景色，其中部分单层显示出浅粉色。相反，阳性对照产生玫瑰红色背景(图56)。
0.1μg/ml的HC-HA产生铁锈红色，可见的纺锤环染色成红棕色，这与阳性对照的显著不同(图56A)。这种趋势在0.5μg/ml至1μg/ml之间持续，且在10μg/ml时颜色轻微减弱，这表明在0.1至5μg/ml时保持矿化，并且有可能在0和0.1μg/ml之间存在剂量依赖性关系。在25μg/ml HC-HA时，铁锈红色的背景消失，并返回成浅紫红色，在细胞连接之间具有明显的白色间隙。
1μg/ml至125μg/ml的AMP产生从较浅的锈棕色(1μg/ml)(似乎比0.1μg/ml HC-HA更浅，这表明剂量反应是更加渐进的)至锈红色(5μg/ml和25μg/ml)、红棕色(125μg/ml)背景，并在250μg/ml显著增加至深红褐色的剂量依赖的颜色变化(图56B)。应当注意，在用大于5μg/ml的AMP处理的细胞单层的顶部出现了AMP颗粒，并且颗粒大小比细胞本身更小，并且显示出与染色的背景的颜色相匹配。
通过OD值的定量分析，用0.1μg/ml HC-HA处理的ARS染色相对于阳性对照增加了3倍，具有统计学显著性(p<0.05)(图57A)。观察到0.1μg/ml至10μg/ml的浓度的一些变化，这可能是由于小样本量(N＝2)。观察到25μg/ml HC-HA处理的OD值显著降低。对于AMP，用125μg/ml的AMP进行处理较之阳性对照加倍了矿化的量并且是统计学显著的(p<0.05)(图57B)。在1μg/ml AMP观察到OD值相对于阳性对照稍稍降低，从1μg/ml至25μg/ml，存在OD值稍稍剂量依赖性增加。在250μg/ml AMP，OD405比125μg/ml减少。一些变异可以归因于小样本量(N＝2)。
ALP染色
在两个AM衍生物的组中，阴性对照相较于阳性对照显示出5倍的ALP活性，这可能因阴性对照中的样品损耗而发生，这减小了样本量(图58)。较小的样本量导致阴性对照的标准偏差值比阳性对照高8倍，并且这种大得多的变异导致了增加。
与阳性和阴性对照相比，使用任意量的HC-HA处理诱导的MC3T3-E1降低了ALP活性(图58A)。不同浓度组之间ALP活性不同，直到25μg/ml时，此时ALP活性显著降低。值得注意的是，在每个实验组与阳性对照中存在相对于平均值非常小的变异。
在1μg/ml时，ALP活性比阳性对照几乎高4倍(图58B)。这一现象在5μg/ml和25μg/ml时受阻，ALP活性比阳性对照降低了几乎3倍。将浓度增加至125μg/ml至250μg/ml使得ALP活性恢复至接近1μg/ml的水平。由此看来，ALP活性不与矿化的量一致。
结果总结
与阴性对照相比，阳性对照显现出更多的梭形细胞并在塑料孔边缘周围形成“环”(图55A)，通过茜素染色观察到颜色的改变(图56A)，以及可检测的但不显著的OD405变化(图57A)。先前，以5×104个细胞/35mm接种于塑料培养皿中的MC3T3-E1细胞也显示在第4天之后形成分层的胶原原纤维，至第18天形成层状纤丝，以及直至诱导的第21天形成结节区域(Sudo(1983)J.Cell.Biol.96:191-198)。这一先前的研究未记录与我们观察到的相同的环形成。[或者，他们可能是将所述环解释为分层的胶原原纤维。如果是这样，则该环区应容易发生矿化。]
在文献中茜素红染色被描述为表示矿化的深红色的颜色。矿化和成骨细胞结节被描述为染色成深红色且颜色的强度随着矿化而增加(Wang,(2006)Biotechnol.Prog.22(6):1697-701；Zhao,2007)。在405nm下读取ARS染色，其对应于可见光谱中的紫色。不同于我们的结果，来自公布的数据的MC3T3-E1矿化的ARS染色的彩色照片并未在单层中显示出铁锈红或红棕色。我们的结果中较深的颜色表示更多的ARS染色，从而与公布的结果相比具有更多的骨生成。ARS染色和定量中的OD改变量随培养条件和细胞类型而改变。在6孔板(10cm2/孔)中培养人间充质干细胞(hMSC)30天获得了OD405从0.5至4的增加(Gregory等人(2005)Analytical Biochemistry 329:77-84)。在24孔板中培养MC3T3-E1细胞28天(α-MEM、抗坏血酸、β-甘油磷酸)获得了0.6的OD值。然而，第16天和第26天的OD值比第28天低得多，分别低于0.05和0.2(Burkhardt(2006)University of Basel,硕士论文)。在阳性对照中缺乏明显的颜色改变可能是由于第13天的时间，尽管其最适合于ALP，但对于ARS而言太短。
0.1μg/ml HC-HA还诱导“环改变”(图55A)、颜色的明显增加(图56A)以及比阳性对照组高3倍的OD值(p<0.05)(图57A)，这表明较低剂量的HC-HA促进矿化并且在0和0.1μg/ml之间存在剂量-响应曲线。
0.5至10μg/ml的HC-HA也显示出“环”(图55A)，保持与0.1μg/ml相同的颜色(图56A)，并且产生无统计学显著性的OD405。25μg/ml的HC-HA降低了细胞密度、改变了细胞形态、失去了“环”(图55A)、没有产生任何颜色改变(类似阴性对照)(图56A)，并且生成了可以忽略的OD405(像阴性对照那样)。
来自25μg/ml的AMP残留颗粒(图55B)，来自1μg/ml的AMP以正向的剂量-响应关系增加了颜色(图56B)，但直到125μg/ml AMP时OD405才显示统计学显著的增加(p<0.05)，然后在250μg/ml时下降，这不与颜色变化相一致。不同于HC-HA，较高剂量的AMP没有造成对细胞形态的任何不良影响。
B部分
随后通过增加样本量和合并Gregory等人用于人MSC的茜素染色的方法((2005)Analytical Biochemistry 329:77-84)和本领域中已知的其他方法而改善茜素红染色法。在下面的表格中提供了Gregory等人的方法、上述的我们以前的方法和本实施例中概述的新方法之间的比较。以往的研究表明，诱导下的MC3T3-E1分化可以细分为三个阶段，即，增殖(第1至9天)、ECM形成(第9天至第16天)和矿化(在形成的ECM中沉积矿物质)(第16天以后)(Quarles等人(1992)Bone Miner Res.7(6):683-92；Hong等人.(2010)Exp CellRes.316(14):2291-300)。为了比较来自不同组的研究，以汇合作为第0日开始对事件进行计时至关重要。
表5
Figure GDA0003352411270002221
Figure GDA0003352411270002231
*在用于ARS染色和定量的3种方法之间具有差别的步骤。
实验设计：
在如A部分和表5中所述的分化培养基中对细胞进行培养和刺激。18天中每3天更换分化培养基。采用0.1μg/ml HC-HA和125μg/ml AMP进行检测。如A部分所述进行ARS检测，且在表5中记录改变。
结果
细胞形态与环形成
未诱导的细胞在接种后获得了扁平的长方体形状(图59A)。细胞边界在第4天变得更加清晰，具有隆起的边缘，而且一些细胞在第6天形成梭形形状。未产生纺锤细胞或多个层。
从第1天至第3天，细胞保持了长方体形状，并且单层保持平坦(图59B)。到第3天，细胞边界变得更加清晰，细胞边缘变得隆起。此外，小的圆细胞样结构在单层上可见(用黑色圆圈表示)。细胞形态直到第4天变为伴有梭形细胞和组织在多个层中的细胞的出现。小的圆细胞状结构的出现持续增加至第6天和第7天。
用HC-HA处理的诱导的细胞的细胞形态改变反映了阳性对照的变化(图60A)。HC-HA没有留下像AMP的单层上的颗粒。像阳性对照那样，小的圆细胞状结构(以黑色圆圈表示)出现于第3天，并持续增加至第7天。
AMP颗粒(以黑色箭头标注)停留在单层的顶部上并且阻碍了对下面的单层的观察(图60B)。没有覆盖AMP颗粒的区域在第0天和第1天显示出圆形的和立方形的形状。在第2天，一些梭形形状的细胞出现在单层上。很难辨别和区分小的圆细胞样结构和较小的AMP颗粒，并且这些结构的产生仍然不明。在第5天，梭形形状延长以形成纺锤状细胞。第6天，长的纺锤细胞与AMP颗粒形成网状相互作用(在黑色圆圈内示出)。
在第3天，在孔的边缘附近产生梭形形状细胞(距边缘1–2mm)(图61A)。纺锤细胞和环不从第4天起形成。细胞表现出在边缘处彼此重叠，并成长为梭形形状。从第0天至第2天，没有纺锤状细胞沿孔的边缘(图61B)。在第3天，注意到在边缘以环形结构堆叠的相似的梭形细胞。从第5天起，这些细胞被集中为距边缘约2mm的突出的环。在第6天，单层显示出从沿边缘附近某些区域的塑料表面脱离(由白色→表示)。
细胞沿边缘保持光滑和立方形直到第2天(图62A)。在第2天在边缘附近产生梭形形状细胞。一些小的圆细胞状结构也在此时在边缘附近可见。在第3天产生纺锤状细胞，并持续在孔周围的环内变薄直到第5天。在第6天在边缘附近的区域观察到单层从塑料孔脱离(用白色箭头标注)。在第2天梭形形状细胞出现在孔边缘附近(图62B)。在第3天远离边缘(约1至2mm之外)产生纺锤状细胞并且直到第5天形成。在第5天在边缘附近的一些区域观察到单层从塑料孔脱离。在第6天脱离持续，但单层不像HC-HA处理的细胞和阳性对照细胞那样多地脱离。
ARS染色和定量
阴性对照单层在一些区域染色成浅粉色(图63)。阳性对照在中心染色成浅粉色，但在纺锤环区域呈现鲜艳的深红色颜色，表明MC3T3-E1细胞在环中重度沉积矿化而非在单层的其余部分。0.1μg/ml HC-HA组和阳性对照的中心单层和纺锤环的染色的强度和颜色均相同。在细胞顶端上的AMP颗粒染色成红棕色。染色的颗粒阻碍了对下方的细胞的目视观察，但开口显示出缺乏突起的单层细胞，其带有一些稀疏的类似于阴性对照染色成浅粉色颜色的细胞。由于AMP处理的细胞未显示出可见的纺锤环，因而ARS未像阳性对照那样在边缘周围染色成深红色。
在阳性对照和HC-HA处理的细胞中，GnHCl处理使得细胞基质溶解并去除深红色的ARS染料，同时使得单层完好。GnHCl消化的和变性的细胞蛋白，在这之后留下细胞外基质。在AMP实验组中，AMP颗粒密度下降，但大多数颗粒仍留在孔的底部。在长培养时间下，AMP颗粒可以与未由GnHCl溶解的ECM基质形成紧密相互作用。曾经染色成鲜艳的红棕色的颗粒现在呈现出像AMP自然呈现的颜色的浅褐色。但是，没有观察到清晰的单层结构；这支持了观察到在AMP之间的间隙中的细胞单层。这些细胞可能从单层迁移到AMP颗粒中，并用其作为支架用于分化和矿化。
通过从2mM至31.3μM的连续稀释，ARS标准显示出从深红色到乳粉色的渐变(图64A)。在HC-HA和AMP处理的样品之间存在明显的颜色变化。HC-HA处理的细胞提取物表现出澄明的奶油色，而AMP处理的细胞提取物显示出淡奶油粉色。阳性对照也呈现出像HC-HA处理的细胞那样的相同的颜色和颜色强度水平，而阴性对照呈现出较浅的颜色并且与空白相似(未示出)。OD405值停留在与以前的实例中的值相同的范围内(图64B)。相较于阴性对照，阳性对照显示出OD值的统计上显著的2倍降低。HC-HA处理的(0.1μg/ml)细胞显示出OD值比阳性对照略有增加，但差异在统计上并不显著。当与阳性对照相比时，AMP(125μg/ml)处理OD值略有下降，但是这一降低并不是统计学显著的。
通过从2mM至31.3μM的连续稀释，ARS标准显示出从深红色到乳粉色的渐变(图65A)。阴性对照提取物呈现出比空白稍深的淡奶油色(未示出)。阳性对照呈现出浅金色颜色，且该颜色明显比阴性对照更暗。HC-HA也呈现出与阳性对照相同强度的浅金色颜色。AMP处理的提取物呈现出比阳性组和HC-HA提取物组较暗的橙金色颜色。OD405值停留在最高约为0.25的相同的范围内(图65B)。阴性对照显示出接近0的可忽略的OD值。阳性对照和HC-HA(0.1μg/ml)处理的提取物显示出接近0.05的平均OD值。AMP处理的(125μg/ml)提取物与阳性组和HC-HA处理组相比显示出OD的统计上显著的5倍增加(p＝0.039)。
总结
细胞形态
培养于αMEM w/10％FBS中的MC3T3-E1细胞生长至汇合，并成为长方体形状。像在目标#1和#2中的结果，不添加抗坏血酸、β-甘油磷酸和褪黑激素时细胞不分化。没有诱导培养基时，不形成纺锤细胞和纺锤环(图59)。在抗坏血酸、β-甘油磷酸和褪黑激素存在时MC3T3-E1细胞被诱导至分化。接种后，由长方体形状细胞形成平滑单层。诱导3天后，细胞获得梭形形状。至第5天，细胞伸长且成为纺锤状。
在本实施例中，在诱导的第3天形成纺锤环，伴有在距离孔壁1至2mm形成纺锤状细胞。在第6天，观察到单层从孔边缘和塑料底部脱离(图60)。在第2天在单层上开始产生小的圆细胞状结构并且数量增加至第6天(图59)。它们没有漂浮在培养基中，并牢固地附着在单层中，其余的大多在细胞边界之间。这些结构可表示基质囊泡(MV)，其是定位于软骨和骨的初始钙化位点的胞外、膜–包埋颗粒。通过从分化生长板软骨细胞和成骨细胞的外质膜特定区域的膜的出芽和挤压断离，发生基质囊泡合成(Anderson等人(2003)Curr RheumatolRep.5(3):222-6)。
用HC-HA处理没有改变分化导致的MC3T3-E1细胞形态变化(图60)。在阳性对照的报告时间段之后形成梭形形状细胞、纺锤状细胞和纺锤环(图61)。AMP颗粒停留在类似于先前结果的细胞单层的顶部上(图60)。这阻碍了对诱导的细胞单层和细胞形态变化的全面观察。然而，通过在AMP微粒未停留的开口记录到一些观察。不同于HC-HA，AMP处理加快细胞形态变化并且在诱导第2天之前一天可见一些梭形细胞。AMP处理的细胞形成与HC-HA处理的细胞和阳性对照相似的纺锤环(图62)。然而，单层比其他两个实验组更早脱离(图62)(在第5天，而不是第6天)。
ARS染色和定量
ARS染色显示出与先前报道的显著不同的颜色(图66)。在阴性对照细胞单层中ARS染色成淡粉色而非蓝灰色。ARS染色也显示出鲜艳的深红色集中在纺锤环，而非先前结果中的阳性对照和HC-HA处理的细胞的锈棕色。AMP颗粒染色成红棕色而非深褐色，并且下方的细胞被染色成浅粉色而非锈棕色。ARS溶液的降解可能促成了颜色的变化。
在乙酸提取之后，单层仍显现出剩余显著量的染色。乙酸在从单层中完全去除ARS染色中不是有效的。用乙酸提取，在阳性和阴性对照的OD值之间存在统计学显著性差异(图68)，这与目视观察到的阳性对照中有更多的ARS染色相匹配(图66)。然而，乙酸提取在显示AMP组的OD值与阳性和HC-HA组相比的统计学显著升高时不是有效的(图66)，尽管AMP组的目视观察比其他两组在测定提取物中具有更多的颜色(图67)。AMP颗粒沉积物可能使得从AMP组中去除ARS更加困难。矿化的基质和细胞也可能与阻碍ARS的乙酸提取的AMP颗粒具有相互作用。
GnHCl从细胞单层去除ARS比乙酸处理更加彻底(图69)。此外，在不使用细胞刮刀以除去单层的情况下颜色溶解于GnHCl溶液。这两种方法似乎留下肉眼不可见的和不受离心影响的颗粒。对于GnHCl，这可能是钙和形成微粒的溶解基质。这引起每个样品的重复之间的变化。在670nm读取以去除颗粒解决了这一GnHCl提取方法的问题。
GnHCl提取无法建立阴性和阳性对照之间的可量化的统计显著性(图71)以匹配ARS染色的目视观察。GnHCl提取还显示出0.1μg/ml的HC-HA未在在分化中的MC3T3-E1细胞促进更多矿化(图71)，并且这与乙酸提取的结果相匹配。通过在96孔板中观察测定提取物的颜色，阳性对照和HC-HA孔在颜色或强度上未显示出差异(图70)。
GnHCl提取显示出125μg/ml的AMP在分化中的MC3T3-E1细胞相较于阳性对照促进更多矿化(图71)。这与单层的ARS染色(图66)和96孔测定板中的提取物的目视观察(图70)相匹配，其中AMP比HC-HA或阳性对照显示出更深的金黄色颜色。
根据这些结果，GnHCl是更好的提取方法，因为其从单层更加彻底地去除了ARS染色并使之完好；有较少的技术错误，因为并不需要从孔中刮掉单层。提取物的颜色可以通过分光光度计读数得以定量。
C部分
上述初步研究并没有因为ARS检测的小样本量和不完全进行而表现出对成骨细胞分化的HC-HA和AMP的剂量响应曲线的统计学显著结果。这表明0.1μg/ml的HC-HA可增强矿化。而且，10μg/ml至25μg/ml的HC-HA可能影响细胞活力并降低矿化。HC-HA的剂量曲线应包括低于0.1μg/ml的较低浓度以及高于10μg/ml的浓度。不同于HC-HA，5μg/ml至125μg/ml的AMP可促进矿化。在本实验中，使用B部分的方法重新测试HC-HA和AMP的剂量响应。在本实验中，在第15天将ARS染色用于测定，并且采用10％乙酸染色和定量的修正方案。
实验设计
通过在96孔板中在αMEM培养基重量/10％FBS中接种3×104个细胞/cm2/孔而使用B部分所示的基于3T3-E1细胞的同样的模型系统。一旦汇合，通过加入抗坏血酸、β-甘油磷酸、褪黑激素诱导培养基而将细胞诱导至分化。对于每个条件，测试N＝3。汇合之后(第0天＝接种)，以0.02μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml和25μg/ml加入HC-HA溶液，而以1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml和125μg/ml加入AMP溶液。对于ARS染色，采用B部分的优化的方法。
结果
阴性对照MC3T3-E1细胞在培养中未产生纺锤状形状或纺锤环(图66A)。单层中心和外围染色成米色的颜色。阳性对照细胞产生梭形和纺锤状细胞，大约在培养的第5天(诱导的第4天)伴有纺锤环的出现。ARS染色在中心显现出浅栗色，并且大多集中在纺锤环内伴有深红色的颜色。提高HC-HA浓度至1.25μg/ml对细胞的形态或ARS染色的强度和形式没有影响。在2.5μg/ml，MC3T3-E1细胞的纺锤环开始降解，并且ARS颜色从深红色变为红棕色。至20μg/ml时，细胞丧失了梭形和纺锤形状；细胞边缘也不太清晰和隆起。细胞密度降低，并且单层未像以前一样出现隆起。GnHCl成功提取了ARS染料并且OD450值的变异系数为5％至19％。阳性对照显示出统计学显著增加的OD值(图66B)。
阴性对照MC3T3-E1细胞在培养中未产生纺锤状形状或纺锤环(图67A)。单层中心和外围染色成米色的颜色。阳性对照细胞产生梭形和纺锤状细胞，大约在培养的第5天(诱导的第4天)伴有纺锤环的出现。ARS染色在单层的中心显现出浅栗色。AMP处理产生停留在细胞单层顶部的AMP颗粒，并且从62.5μg/ml以上的浓度阻断了对单层的观察。仅用AMP处理和未经诱导的MC3T3-E1细胞没有沿边缘显现出纺锤环，并且ARS染色呈现出带有浅粉色背景的深红色。从7.8μg/ml至31.25μg/ml，AMP颗粒并未完全覆盖单层并且细胞呈现梭形和纺锤形。沿着边缘，可以看到纺锤环。ARS染色显示中心单层染色成浅栗色并且染料像阳性对照那样沿纺锤环集中成深红色颜色。GnHCl成功提取了ARS染料并且OD450值的变异系数为3％至10％(图67B)。
结果总结
细胞形态/ARS染色
与先前的结果类似，随细胞由立方体形状变为梭形和纺锤形而进行MC3T3-E1分化。随着诱导时间的增加，沿着孔的边缘(约2mm远)形成纺锤环，并随着时间的推移使单层收缩。与阳性对照不同，阴性对照从未形成纺锤状细胞或纺锤环。当阴性对照单层染色成均一的米色时，阳性对照在中心呈现出浅栗色/粉色并且在纺锤环呈现集中的深红色。
在10μg/ml HC-HA，细胞形态从低浓度改变，伴有较少的细胞显示出梭形和纺锤形。细胞密度降低，并且单层看起来较不隆起。在20μg/ml HC-HA，细胞密度急剧下降，并且很少的细胞是纺锤形。单层看上去如同阴性对照那样光滑。对于这两种浓度，这些变化在培养和诱导的第5天开始发现。在这两种浓度下，纺锤环或者不充分地形成或者不存在。在2.5μg/ml和以上的浓度，增加HC-HA浓度引起纺锤环解体。
在所有AMP处理的细胞中，在AMP颗粒停留的区域周围染色成深红色。围绕孔的边缘，通过AMP颗粒的开口不可见单层。用125μg/ml AMP处理未诱导的MC3T3-E1显示出与用125μg/ml AMP处理诱导的MC3T3-E1相似的染色。带有停留的AMP的细胞被染色成块状的深红色，未观察到下方的染色的单层。从7.8μg/ml至15.6μg/ml AMP，可见细胞形态。细胞呈现梭形和纺锤形，伴有沿孔的边缘形成纺锤环。ARS染色类似阳性对照浅栗色的中心和深红色纺锤环区域。
GnHCl处理对于从染色的单层中提取ARS染料是成功的。提取显示出OD450从阴性对照至阳性对照统计学显著(p<0.01)的2倍的增加。HC-HA处理的细胞显示出随着HC-HA浓度的增加而降低矿化的趋势。在10μg/ml和20μg/ml HC-HA，矿化较之阳性对照存在统计学显著(p<0.05)的降低。AMP剂量依赖地增加了分化中的MC3T3-E1细胞的矿化。
用AMP处理未诱导的细胞也显示出矿化，并且比阳性对照更加出现AMP诱导和促进的矿化(p<0.01)。此外，在125μg/ml AMP，对未诱导的细胞进行处理显示出比在诱导培养基中培养的细胞更多的矿化(p<0.05)。
实施例39：AMP对成骨细胞分化的影响
尽管ARS染色显示出明显的由AMP染色的剂量依赖性增加，并且在125μg/ml显示出矿化统计学上的显著增加，不清楚这种变化是否由ARS对AMP的非特异性结合引起。因为AMP的作用不同于HC-HA，尤其是在高剂量下，即，促进矿化但不抑制它，排除AMP的作用是否依赖于细胞与AMP直接接触是很重要的。通过使用3μm孔径的Transwell板解决了这一问题，其对于HC-HA通过但小到足以阻止AMP颗粒是足够的。因为具有这一孔径的可用的Transwell板适合于24孔板，所以相应地改变该测定的培养条件。采用125μg/ml AMP的浓度用于该测定。
实验设计：
将MC3T3-E1细胞(处于P2的细胞；ATCC，目录号：CRL-2593TM)以1×105个细胞/ml的密度接种到12孔的平的、透明底的孔上。在PBS中制备如上述使用的相同的AMP储备溶液(AMP-4；批号CB102971)至5mg/ml。对于不含有Transwell的孔，将17.5μL AMP储备溶液加入到0.7ml培养基(基础或诱导培养基)中以在α-MEM重量/10％FBS(无诱导)或诱导培养基#1随后#2(有诱导)中均达到125μg/ml的AMP浓度。对于含有Transwell的孔，以如上所述的相同方式直接将17.5μL AMP储备溶液加入至Transwell膜的中央内。在诱导的第0天之后每3天更换培养基(含有10％FBS的α-MEM；如上所述的诱导培养基#1和#2)。根据如上所述进行ARS染色和定量程序，不同的是使用4％低聚甲醛代替70％乙醇固定细胞单层，且染色2小时而非1小时。
结果
在诱导的第4天产生环的形成(图68)。环由塑料孔边缘约2-3mm之外的周围的细胞单层构成。它们分层生长、卷曲，然后单层在许多孔中与塑料脱离。没有诱导时，细胞保持大致六边形形状，随培养时间伴有一些梭形形状，并且较之诱导的细胞该单层保持光滑(图69)。诱导致使梭形形状的细胞和单层变得隆起并且细胞之间的边界变得更加清晰。在诱导后直至第4天，观察到纺锤样环沿培养板的边缘产生。用AMP处理并不影响细胞活力；也没有影响环的形成，这表明AMP并没有负面地影响诱导。加入Transwell并未影响细胞生长或形态。
无transwells的情况下，125μg/ml的AMP使得颗粒停留在细胞单层上(图69A)。没有诱导时，AMP本身没有引起细胞形成纺锤形状并且没有生成环，从而表明AMP单独不足以引起诱导，类似于阴性对照。在诱导下，125μg/ml AMP引起如阳性对照的细胞形态的改变，这表明AMP本身没有负面地影响诱导。通过Transwell，125μg/ml的AMP在细胞单层上留下可忽略的颗粒(图69B)。没有诱导时，AMP不足以诱导细胞分化并且细胞与阴性对照相似。在诱导和125μg/ml AMP处理下，细胞产生梭形和纺锤状形状并且至第14天与阳性对照类似，再次表明AMP没有负面地影响诱导。
阴性对照产生了灰褐色背景色伴有在单层内的块状的浅粉色，这与前述实验的阴性对照的的蓝灰色颜色不同(图70)。未诱导但经Transwell处理时，即使用AMP处理，单层仅染色成类似于阴性对照的灰褐色背景，这表明AMP本身没有引起诱导。没有Transwell时，与阴性对照相比，存在表现出背景颜色显著降低的区域，这表明AMP颗粒停留在单层上可能阻断该颜色(由**标记)，且AMP本身未生成阳性颜色表明存在矿化。
阳性对照产生玫瑰粉色伴有环染色成铁锈红，其比前述实验的阳性对照的玫瑰红色更深。加入Transwell未影响阳性对照的颜色，确认Transwell本身并不影响诱导。使用AMP但不使用Transwell时，单层产生比阳性对照更强的铁锈红颜色，伴有环染色成更深的颜色，这表明AMP施加额外的正向诱导。与此相反，使用Transwell，背景色的强度降低到阳性对照的水平，同时环保持相同的颜色，这表明Transwell对诱导的AMP的效果施加负面影响。
定量结果不足以提供统计学显著性，并且不与ARS染色的视觉分析匹配(图71)。然而，总的趋势表明，阳性对照比阴性对照显示出更多的矿化。此外，当在AMP和诱导的存在下包括Transwell时，存在表明较少的OD405的趋势。
结果总结
推测由于皿的尺寸较大，因此对于环的形成(图69A)的观察可能是容易的。然而，可能是由于固定剂的改变，阴性对照的背景色与先前的实验不同。此外，在阴性和阳性对照之间存在更剧烈的颜色变化，特别是在环区域(图70)。在阳性对照中引入Transwell不影响细胞形态(图69B)或ARS染色的颜色(图70)。
未经诱导处理下，未经Transwell处理的AMP明显阻止阳性的ARS染色(图70)，并且经过Transwell处理的AMP表现出与阴性对照相同的颜色。AMP本身不会引起非特异性的ARS并且不会引起任何诱导。在诱导处理下，未经Transwell处理的AMP比阳性对照引起更多的颜色。与此相反，经过Transwell处理的AMP似乎产生与阳性对照相同的颜色。
先前的ARS定量结果显示125μg/ml AMP较之阳性对照组促进3倍以上的矿化(p<0.05)(图67)，但在图71中并非如此。
在用AMP直接处理的细胞与AMP处理和通过Transwell的细胞之间细胞形态无差别(图69A，69B)。两个细胞组均产生环的形成并且目视观察未显示出环结构之间的明显区别。ARS染色在两个实验组之间显示可忽略的背景颜色的差异。然而，直接用AMP处理的细胞表现出更为弥漫的环形成，这可能是来自AMP颗粒的散射效应(图70)。
AMP不需要与MC3T3-E1细胞直接接触而影响矿化。虽然从这一实验中不清楚AMP是否促进矿化，但AMP已经显示出不影响细胞形态或细胞活力(图69)。
B部分
我们的结果显示，125μg/ml AMP较之在第15天生长和分化的阳性对照显著增加MC3T3-E1细胞的矿化(图65)。AMP被直接输送至培养基中并且AMP颗粒停留在细胞单层的顶端上；因此，AMP在目标1B中的作用须要直接接触。
在A部分，我们试图探究AMP的影响是否通过在MC3T3-E1细胞的分化中充当支架或者是否因子从颗粒中释放以促进矿化。然而，小样本量和用10％乙酸ARS染色提取中的技术错误影响了数据，并且未发现统计显著性。使用在实施例38中用4M盐酸胍的ARS染色和提取的改进的技术方法重复该实验。
实验设计：
如上所述的，在24孔板中将MC3T3-E1细胞以3×104个细胞/cm2/孔接种于加有10％FBS的αMEM培养基中。一旦汇合，通过加入抗坏血酸、β-甘油磷酸、褪黑激素而将细胞诱导至分化。对于每个条件，N＝3进行测试。将细胞接种的当天计为第0天，并在细胞汇合后进行诱导。总诱导时间＝15天。有两个实验组：AMP直接加入到诱导培养基中以及AMP输送至Transwell。AMP浓度和以前一样保持在125μg/ml。阴性对照(无诱导)加入或不加入AMP但没有插入。如上所述在诱导的第15天进行ARS染色和定量。
结果
没有诱导培养基的情况下，阴性对照细胞保持六边形伴有一些梭形形状(图72A)。未观察到纺锤状形状，并且沿周边没有纺锤环形成。ARS将单层染色成浅粉色。在诱导下，阳性对照细胞保持纺锤状的形状。细胞边界更加突出和隆起；纺锤环沿孔边缘的附近周边形成。单层中心染色成栗色，且ARS染色集中在纺锤环中伴有强烈的深红色颜色。用AMP直接处理引起AMP颗粒停留在单层上并且模糊了细胞的形态。然而，邻近培养孔边缘，在两组中AMP颗粒之间的空隙均显示出缺乏下方的突出的单层。在单独的AMP处理和AMP处理加诱导之间细胞形态无明显差异。可见的细胞呈纺锤样形状。未像阳性对照那样观察到纺锤环。ARS染色在中心呈现深红色染色伴有沿周边红褐色染色。在诱导和非诱导组之间难以区分染色的颜色和式样。用AMP通过Transwell处理未使得AMP颗粒停留在单层上。细胞呈狭长和纺锤状，伴有沿孔边缘纺锤环形成。像阳性对照那样，单层中心染色成栗色的颜色，且ARS染料集中在纺锤环内，伴有强烈的深红色颜色。GnHCl成功提取了ARS染料并且OD450值的变异系数为2％至15％(图72B)。
结果总结
形态/ARS染色
培养于α-MEM重量/10％FBS中21天的阴性对照没有沿边缘产生纺锤状细胞或纺锤环。阳性对照，在使用AA、β-甘油磷酸酯和褪黑激素诱导20天后，MC3T3-E1细胞在孔边缘的周围产生纺锤状细胞和纺锤环(图72)。细胞单层的ARS颜色和染色图形与阴性和阳性对照之间的不同。阴性对照单层未能收集如阳性对照那样多的染料并且呈现出均匀的淡粉色。阳性对照单层中心染色成栗色且集中在纺锤环中的ARS染色成强烈的深红色(图72)。
在培养基中直接用AMP处理由于AMP颗粒的停留而阻碍了对AMP处理组和AMP处理伴随诱导处理组的细胞单层的观察。然而，沿孔边缘未观察到纺锤环，并且沿边缘的一些细胞呈现纺锤状形态。通过AMP颗粒的开口表明缺少下面的单层。ARS染色在仅用AMP处理组以及AMP处理伴随诱导处理组之间未在颜色或图形上显示出差别。
使用AMP处理和Transwell处理没有在单层的顶部产生AMP颗粒。细胞形态与阳性对照类似，伴随有纺锤状细胞和纺锤环的形成。ARS染色的颜色和图形也类似于阳性对照，伴随有背景单层染色成栗色且集中在纺锤环的ARS染色呈深红色。
ARS定量
在从单层内提取ARS染色中GnHCl是必要的和足够的。与对照相比，从阴性对照到阳性对照在OD450存在统计学显著的2倍增加(p<0.01)。此外，在阴性/阳性对照和AMP+诱导组之间在OD值上存在约6倍的增加。从96孔板至24孔板在表面积上存在6.5倍的增加，这可以解释OD的增加。在培养的第20天我们还进行了ARS染色和定量，这使得培养时间增加了2天，并可能也增加了矿化。
单独的AMP相较于阴性和阳性对照组分别在OD450值上引起统计学显著的10倍(p<0.01)和3倍(p<0.01)的增加。因此，单独的AMP足以诱导和促进分化。AMP伴随诱导相较于单独的AMP在OD450稍有下降(p<0.05)，但相较于阳性对照在OD上表现出3倍的增加(p<0.01)。诱导培养基阻碍分化和矿化。
通过Transwell输送的AMP伴随诱导较之AMP直接输送伴随诱导显示出低3倍的OD值(p<0.01)，并且比阳性对照显示出稍低的OD值(p<0.05)。AMP需要直接接触以促进分化。没有直接接触时，AMP抑制MC3T3-E1的矿化。
实施例40：AMP对MSC中骨生成的诱导的影响
我们的结果表明，AMP在与前成骨细胞接触时促进MC3T3-E1分化。然而，还不清楚AMP如何影响分化程度和定向程度较低的细胞系生长和分化至成骨细胞谱系，诸如间充质干细胞(MSC)。
MC3T3-E1细胞是前成骨细胞、单能的，并因此只需要补充以推进其向成骨细胞的分化。其他祖细胞系诸如胚胎干细胞(ESC)或间充质干细胞(MSC)是分化程度较低的，并且分别是寡能的和多能的。因此，通过研究AMP对来自人体不同区域的MSC的影响，我们可以更好地理解AMP在成骨细胞分化编程中的作用和涉及的因子。这项研究将使我们能够缩小AMP能够影响的细胞类型以及其在不同的祖细胞中诱导骨生成的影响。
实验设计
使用了下列细胞系：MC3T3-E1(ATCC，Manassas，VA)、来自人骨髓细胞的间充质干细胞(Lonza，Wlakerfield，MD)、缘隔细胞(Tissue Tech，Miami，FL)、人羊膜(hAM)基质细胞(Tissue Tech，Miami，FL)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(ATCC，Manassas，VA)。
在96孔塑料培养板中将细胞以3×104个细胞/cm2/孔接种于加有10％FBS的αMEM培养基中。一旦汇合，通过加入抗坏血酸、β-甘油磷酸和褪黑激素(AGM)而将细胞诱导至成骨细胞分化。对于每个条件，N＝5进行测试。总诱导时间＝20天。第0天计为细胞接种的当天，并在细胞汇合之后进行诱导。每种细胞类型有3个实验组：阴性对照、阳性对照、仅AMP处理。对于AMP处理组，使用125μg/ml的AMP浓度。在20天的培养时间中每3天更换培养基(100μL)。加入具有AMP的阴性对照(无诱导或细胞)。在第20天如上所述进行ARS染色和定量。然后在450nm对提取液进行读取。
结果
HUVEC细胞至第4天形成细胞生长的网状图形(图74A)。然而，直到第21天有显著的细胞死亡，死亡的细胞停留在细胞网络的顶部。大部分的HUVEC细胞不能用10％的低聚甲醛固定，并且用ARS染色的少数细胞呈深褐色。尽管AMP停留在HUVEC细胞的顶部并且覆盖细胞的网络，但当ARS染色时AMP颗粒与细胞从塑料孔脱离；少数剩余的AMP颗粒也染色成深褐色。
未诱导的hBM MSC保持长的成纤维细胞形状(图74A)。随着诱导，至第4天MSC变得狭长，伴有更为隆起的细胞边缘。至第10天，诱导的MSC产生纺锤状细胞，并且细胞在单层上彼此重叠生长。在第17天，重叠的纺锤细胞形成距孔中央约5mm的致密环。ARS染色显示出，未诱导的MSC单层染色成奶油色，并且纺锤环染色成红橙色。AMP处理的MSC包含覆盖单层的AMP颗粒。随着时间推移，单层收缩在AMP颗粒集中区域的周围。ARS染色呈深红褐色。
未诱导的hAM间充质干细胞保持矩形形状(图74A)。至第4天，在诱导下，细胞形态改变，并且细胞伸长，伴有形成一些梭形形状。AMP颗粒至第4天在AMP处理的基质细胞中停留并覆盖一些单层。未由AMP颗粒覆盖的细胞在第4天是矩形形状。至第17天，未由AMP颗粒覆盖的细胞伸长，类似于阳性对照中的诱导的细胞。至第21天，AMP颗粒覆盖孔并且不能观察到细胞形态。ARS染色显示未诱导的细胞染色成奶油色，而诱导的细胞染色成浅粉色。AMP处理的细胞染色成深红褐色，类似于AMP处理的hBM MSC。
用4M GnHCl提取产生2％至15％的OD450值的变异系数(图74B)。
结果总结
结果表明，无论是诱导剂或AMP处理，在HUVEC的阴性对照中均未发现矿化。对于hBM MSC和hAM间充质干细胞，诱导剂均可促进矿化，但比由AMP促进的矿化明显较少。
实施例41：在MC3T3-E1分化过程中AMP对矿化和细胞增殖的影响
MC3T3-E1细胞在成为成熟的成骨细胞前经历三个主要阶段：增殖，基质沉积/成熟，和矿化(图75)。我们的研究结果表明AMP促进了MC3T3-E1细胞中的矿化。观看ARS染色时，其显示用AMP处理的细胞与阳性和阴性对照相比染色较深且较致密(图72)。此外，当AMP颗粒覆盖单层时，AMP颗粒下缺少单层(图77)。一种可能是，AMP充当MC3T3-E1细胞的支架并且这种在3D基质中的相互作用允许细胞生长和矿化。因此，AMP可以通过增加MC3T3-E1细胞的增殖而促进矿化。
实验设计
如上所述将MC3T3-E1细胞以3×104个细胞/cm2/孔接种于含有加有10％FBS的αMEM培养基的24孔板中。一旦汇合，通过加入抗坏血酸、β-甘油磷酸、褪黑激素而诱导至细胞分化。对于每个条件，测试了N＝3。将细胞接种的当天计为第1天，并在细胞汇合后进行诱导。总诱导时间＝20天。在四个时间点进行取样：第1天、第2天、第7天、第10天、第13天、第20天。每个时间点有四组：阴性对照、阳性对照、仅AMP处理、AMP+(有诱导)。采用的AMP浓度为125μg/ml。
对于采用MTT测定法检测增殖的实验，增殖的培养周期为9天。在4个时间点进行取样：第1天、第2天、第4天和第9天。每个时间点有3组：仅有细胞、仅AMP、AMP+细胞。采用的AMP浓度为125μg/ml。
结果
矿化
在第1天，将细胞接种24小时并且未用诱导培养基或AMP处理(图76)。细胞呈圆形并在单层上显现更为隆起。ARS染色呈浅褐色，没有或几乎没有矿化。在第2天，没有诱导下，阴性对照细胞变成六边形。ARS将单层染色成浅桃色。在诱导下，阳性对照细胞看起来与阴性对照相同且无矿化，并且ARS染色为浅桃色。用AMP处理引起MC3T3-E1细胞形态改变，观察到梭形细胞和纺锤细胞。ARS染色显示从第1天起矿化增加且单层染色为浅粉色。然而AMP颗粒停留的区域染色呈红褐色。AMP处理结合诱导处理也改变了一些细胞的形态。出现梭形细胞且单层也染色成浅粉色并且AMP颗粒周围的区域染色成红褐色。在第7天，阴性对照细胞更加呈现为六边形且细胞界限更加明确。存在矿化增加且单层染色成浅褐色。阳性对照，在诱导下，产生纺锤形细胞和纺锤环。ARS也染色成深粉色并伴有更多矿化。用AMP处理以及AMP处理结合诱导处理引起AMP颗粒停留并且无法观察细胞形态。无法观察到具有单个细胞的细胞单层。ARS显示AMP颗粒周围的区域染色为红棕色以及单层染色成浅粉色。GnHCl成功提取了ARS染料且OD450值的变异系数范围为6％至16％。
结果总结
第2天后阴性对照MC3T3-E1细胞随着细胞培养显示出ARS染色增加因此显示出矿化增加(图76)。类似于先前的结果，诱导培养基培养的阳性对照MC3T3-E1细胞出现了形态变化并且在第7天产生了梭形细胞和纺锤环(图76)。AMP处理一天后(第2天)，有或没有诱导，可以看到细胞形态的变化。细胞变为纺锤状甚至为成纤维细胞的形态(图76A)。这种变化在阴性或阳性对照中观察不到。此外，这种变化在诱导的MC3T3-E1细胞中至少在培养4天后才能观察到(图76A)。
如通过ARS定量所示(图76B)，至第2天AMP处理的以及AMP结合诱导处理的细胞相对阳性对照表现出矿化在统计学上显著增加。单层染色为浅粉色，但AMP颗粒停留的小区域呈现出增加的矿化并且染色成深红褐色(图76A)。这一矿化的增加持续整个培养期。
仅AMP处理与AMP结合诱导处理相比没有促进矿化。
增殖
为了确定AMP是否通过促进细胞增殖以促进矿化，将MC3T3-E1细胞接种在带有αMEM培养基加上10％FBS的3×104细胞/cm2/孔的96孔板中。一旦汇合，AMP组用新鲜的125μg/ml的AMP进行处理，其每3天添加于培养基中。在第1、2和4天进行MTT测定测定，而在第1、2和16天进行BrdU测定。
在未处理的MC3T3-E1细胞中，第1天至第4天细胞活力增加(图77A)。在AMP处理的细胞中，在第2天细胞活力降低，然后在第4天不止加倍，遵循仅细胞组的趋势。BrdU测定显示在第1天后仅细胞处理组和AMP处理细胞组(图77B)的细胞增殖均有降低。仅细胞组的增殖在第2天减少了一半以上，并在第16天继续减少。在AMP处理的细胞中，细胞增殖仅在第16天表现出统计学显著减少。这些结果表明，AMP在16天的培养期内没有促进增殖。
结果总结
通过MTT测定所示，在MC3T3-E1细胞中从第1天至第4天细胞活力增加。AMP处理的MC3T3-E1细胞表现出从第1天到第2天细胞活力降低，但随后为与未经处理的细胞相似的向上趋势。然而，在第4天AMP处理细胞的细胞活力大约为未处理MC3T3-E1细胞的一半。细胞增殖，如通过BrdU测定所测定的，从第1天到第16天一直降低。与AMP处理的细胞不同，未经处理的MC3T3-E1细胞的细胞增殖在第2天降低了一半以上。在第16天，AMP处理和未处理的MC3T3-E1细胞表现出相同的细胞增殖水平。
实施例42：在AMP处理的MC3T3-E1和hBM MSC中在骨生成早期阶段表达的基因的鉴 定。
人骨髓间充质干细胞(hBMMSC)是多能的，可以分化成多种组织类型如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞(Born,2012 J Cell Biochem.113(1):313-21.)。在体内移植时，它们能够形成新骨，并且在体外，hBM MSC可以通过在β-甘油磷酸、抗坏血酸、维生素D3和低剂量的地塞米松中培养而被引导至骨生成。hBMMSC的骨生成是由成骨细胞相关基因的表达调控，其包括特异性转录因子、黏附分子和ECM蛋白质(Born(2012)J Cell Biochem.113(1):313-21；Vater(2011)Acta Biomater.7(2):463-77.)。向成熟成骨细胞的进程反映了MC3T3-E1的进程，并且其发生伴随着细胞扩充能力的丧失、成骨标记物表达的增加和ECM的矿化(Born(2012)J Cell Biochem.113(1):313-21)。首先，细胞通过胶原蛋白I(Col I)的表达起始ECM的合成。同时，骨特异性碱性磷酸酶(bALP)的表达增加并且在第4天，可以观察到较之对照在诱导的细胞(6x104细胞/60mm培养皿)中ALP水平显著增加(Born(2012)JCell Biochem.113(1):313-21；Jaiswal(1997)J Cell Biochem.64:295–312)。随着分化继续，细胞产生蛋白质如骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白、骨粘连蛋白和骨钙蛋白。最后，与MC3T3-E1细胞中的骨生成十分相似，ECM的矿化指示成熟的成骨细胞。
在本实施例中，在三个细胞系的骨生成早期阶段表达基因和转录因子：对MC3T3-E1细胞和hBM MSC细胞进行了测定。我们的研究结果表明在第2天(处理的第1天)较之阳性对照在AMP-处理的MC3T3-E1细胞中矿化统计学上显著增加。因此，该实验聚焦于骨生成的早期阶段以鉴定处理后AMP对特定基因的影响。
实验设计
如上所述以3×104细胞/cm2/孔将MC3T3-E1细胞或人骨髓MSC细胞接种在包含加有10％FBS的αMEM培养基的24孔板中。一旦汇合，通过加入抗坏血酸和β-甘油磷酸进行诱导细胞分化。对于每个试验在每个时间点进行N＝2的测试。在4个时间点取样：第0天(汇合后但在诱导/处理前)、第1天、第2天、第4天和第6天。每个时间点有三组：阴性对照、阳性对照、仅AMP处理。使用的AMP浓度为125μg/ml。
结果
hMSC表达
在培养24小时内AMP诱导内源BMP2和BMP6转录物的强烈表达(分别为60倍和5倍)(图78A)。BMP2在第1天达到其峰值(120倍)并在呈现出下降之前保持在较高水平(60到10倍之间)直到第4天。相比之下，BMP6在4小时达到峰值，然后从第1天开始表现出逐渐下降。作为比较，AMP没有改变BMP4、BMP7和BMP9的表达水平。尽管如此，AG只在第4天诱导BMP2和BMP6(1-2倍)的温和上调以及BMP4在第1天之后的显著上调(4-10倍)。作为比较，AGM没有改变BMP7和BMP9的表达。
Runx2对于AMP在第1天而对于AGM在第2天达到峰值(图78A)。然后两组都逐步回落之后在第6天达到另一个峰值，Runx2诱导多能间充质细胞分化为不成熟的成骨细胞，引导不成熟的骨形成。此外，Runx2在成骨细胞分化的早期阶段触发主要骨基质基因的表达，但Runx2对于在成熟的成骨细胞中维持这些基因的表达不是必需的(Komori(2010)Adv ExpMed Biol.658:43-9)。
ALP和Sox9在第4天达到峰值，伴有被AMP上调的水平小于AGM(图78A)。这一趋势与ALP和Sox9是Runx2的下游的观点是一致的。ALP在骨生成的早期阶段表达，并创建碱性环境，其导致钙从溶液中析出并结晶。
AMP上调VEGF，其在4小时和第4天达到峰值，但AGM只在第4天上调VEGF(图78A)。在第1天，AMP上调CXCR4而AGM上调SDF1，前者快速下降而后者较缓慢。Kortesidis等((2005)Blood.105(10):3793-801)提出SDF-1可以将原始未定型BMSSC细胞群体定位在它们的血管周围微环境中直至需要进行增殖和分化以响应环境因素，其可能破坏SDF-1/CXCR4的相互作用，进行增殖和分化。在MSC的7个预调节实验中，CXCR4的表达通常约为2至4倍的增加(Cencioni等人((2012)Cardiovasc Res.94(3):400-7)，但是我们的AMP的结果表明在第1天之后存在60倍的增长。
SDF-1的表达在MSC的各组中都是非常高的，虽然在图78A中其表现并非如此。在第20个循环左右可见SDF-1，而在第17个循环左右可见GAPDH。从文献中可知基质细胞衍生因子-1激活祖细胞上的粘附分子，且抗SDF-1的mAb抑制造血祖细胞的跨内皮迁移(Imai等人(1999)Blood 93(1):149-56)。SDF-1激活CXCR4+/CD34+细胞，并导致其粘附和跨内皮迁移(Bhakta等人(2006)Cardiovasc Revasc Med.7:19–24.)。从第2天至第6天AMP组的GAPDH的表达确有增加，因此人们会假定增殖。这一趋势未见于其他样品中。此外，无法检测到BMP9(第40个循环以后)、在第33个循环左右检测到CXCR4、在第19个循环左右检测到VEGF并且在第27个循环左右检测到SOX-9。在第28个循环左右检测到BMP4、BMP7无法检测到(第40个循环以后)、BMP2在第20个左右检测到、Runx2在第25个循环左右、BMP6在第27个循环左右检测到以及ALPL在第24个循环左右检测到。
MC3T3-E1的表达
据了解，MSC是多能的，其中骨祖细胞已沿谱系途径更远地下推，只能产生骨形成。与预期相反，尤其与人MSC相比BMP2在小鼠细胞中几乎没有表达(图79)。已证明在人中BMP对促进骨生成是低效的，但在小鼠细胞中能力超强(Osyzka等人(2004)Cells TissuesOrgans.176(1-3):109-19.,Skarzynska等人(2011)Connect Tissue Res.52(5):408-14)。基因芯片显示BMP-2的表达在MC3T3细胞中并不突出(Beck等人(2001)Cell Growth&Differentiation 12:61-83)。观察到的人和啮齿类动物细胞之间的差异可能表明，不同于人体细胞中的Smad1，啮齿动物的Smad1在骨生成过程中并不经过ERK连接子磷酸化。可选地，啮齿动物细胞中的Smad1活性可能不被ERK介导的连接子磷酸化所抑制(Skarzynska等人(2011)Connect Tissue Res.52(5):408-14)。在无反应的人MSC中BMP诱导的骨生成需要对ERK和磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)途径的调节(抑制)；在无血清培养的人MSC中抑制胰岛素/IGF-I激活的PI3-K/Akt途径降低了BMP诱导的碱性磷酸酶和骨桥蛋白的表达，但增加了BMP激活的Smad(Osyzka等人(2005)Endocrinology.2005(8):3428-37)。
与hMSC相比Runx2也被证明在MC3T3细胞中不同。在第2天在MC3T3细胞中存在导致基因的上调很明显的事件。AGM组似乎表现出AMP组相反的效果，其可能与Pi3K、MAPK途径相关。Ibsp，也称为骨唾液蛋白(BSP)，在第2天在AMP组中上调但在其他时间不表达。在阳性组，在第2天之后高表达BSP。
Bglap-rs1，也被称为骨钙蛋白(OCN)，也在第2天在AMP组中上调而不在其他地方表达。与BSP一致，在第2天之后OC在阳性组中高表达。通过对这些结果的分析人们会想到BSP和OCN需要被上调，因为它们是已知由成熟的成骨细胞表达。Runx2在MC3T3中调节Col1、BSP和OCN的表达，这与我们的结果一致。与BSP和OCN一样，Runx2在第2天增加而不在其他地方表达。综上所述，AMP下调骨生成基因的表达但促进矿化。
实施例43：使用MC3T3-E1模型系统，从AM中纯化的nHC-HA/PTX3对矿化的影响。
以前的实验已清楚地证明AMP促进矿化的独特性能而不依赖诱导剂如抗坏血酸、β-甘油磷酸和褪黑激素(AGM)。在这些实验中，在存在AGM或不存在AGM下将AMP加入到鼠成骨细胞前体细胞系(MC3T3)中以确定AMP的效力。也在多个时间点使用GnHCl提取法进行的茜素红染色以进行进一步定量。有人总结AMP不仅不依赖AGM提高矿化，同时也以更快的速度增强了矿化。AMP的进一步研究显示，AMP展示出的骨诱导作用需要直接的细胞接触。也就是说，与AMP直接接触时，细胞不需要引入AGM就会加快和增强矿化。
以前的研究表明在诱导下MC3T3-E1分化可以细分为三个阶段，即，增殖(第1天至第9天)、ECM的形成(第9天到第16天)，和矿化(在形成的ECM中沉积矿物质)(第16+天)(Quarles等人(1992)J Bone Miner Res.7(6):683-92.；Hong等人(2010)Exp CellRes.316(14):2291-300)。然而我们以前的目标4已经显示使用AMP可以在7至10天内轻易地检测到矿化。因此，我们将在第8天进行我们的ARS试验以确定从AM中纯化的NHC-HA/PTXS是否负责促进矿化。选择第8天是因为所观察到的结果应该如目标4是明显的并且将只在第0天、第3天与第6天需要更换培养基。
已经知道nHC-HA/PTX3负责羊膜上已知的抗炎、抗血管发生和抗瘢痕形成的治疗反应。我们的假设是固定化的HC-HC/PTX3负责AMP促进矿化的效果。因为它也包含了HA，因此我们也将比较nHC-HA/PTX3和HA以观察假设的效果唯一地出现在nHC-HA/PTX3中而不在HA中。透明质酸(HA)是一种包含单一的重复双糖单位的未硫酸化的糖胺聚糖。它是结缔组织中促进基质组装和组织水化的重要组成部分。Luben等人推测HA作为钙结合剂用作酶从吸收位点扩散的屏障或调节破骨细胞的移动性。Stern和Raisz指出透明质酸似乎是最适于研究的，因为它已清楚地与骨质吸收相联系。通过其吸湿性的性质，HA可以占据其自身体积的10000倍。因此，HA允许增殖细胞避免抑制性接触。在有丝分裂之前透明质酸合成并且使分裂的细胞从其基底分离，允许细胞运动(Balazs(2001)Am J Physiol RegulatoryIntegrative Comp Physiol 280:R466–R472)。
实验设计：
小鼠MC3T3-E1细胞(C-136)取自液氮冷冻罐并且生长在带有每三天更换直至80％汇合～1.5x106个细胞[4*(3.1x104)*9＝1,116,000细胞]的αMEM培养基加上10％FBS的100mm培养皿(5培养皿)中。然后将细胞接种在3.1x104个细胞/cm2/96塑料孔中。每2-3天更换培养基(100ul每96孔)，即，在第0天(星期三)、第2天(星期五)和第5天(星期一)并在第8天停止培养。每个条件测试N＝4。
各组的总结如下：
对照组：
阴性对照：常规96孔板上无处理
阳性对照1：常规96孔板上加AGM
阳性对照2：每3天添加125μg/ml AMP至常规的96孔板中
实验组：
阴性对照：Covalink-NH96孔板
实验组1：每3天添加AGM至Covalink-NH 96孔板中
实验组2：将20μg/ml HA固定在Covalink-NH 96孔板上
实验组3：将20μg/ml HA固定在Covalink-NH-96孔板上且每3天添加AGM(H-124)
实验组4：将20μg/ml nHC-HC/PTX3固定在Covalink-NH 96孔板上
实验组5：将20μg/ml nHC-HC/PTX3固定在Covalink-NH 96孔板上且每3天添加AGM
对于AGM组：在第0天和第3天，更换骨生成诱导培养基#1(抗坏血酸、β-甘油磷酸)。在第6天，更换骨生成诱导培养基#2(抗坏血酸、β-甘油磷酸、褪黑激素)。在第0天，仅制备0.2ml的10X诱导培养基。在第3天和第6天新鲜制备10ml骨生成诱导培养基。诱导培养基的说明书从体外骨生成试验试剂盒(Millipore)获得。
诱导培养基#1：9.88mlαMEM培养基加上10％FBS、20μl抗坏血酸2-磷酸500X(Millipore，Part.2004011)、100μl甘油-2-磷酸100X(Millipore，Part.2004011)。
诱导培养基#2：9.87mlαMEM培养基加上10％FBS、20μl抗坏血酸2-磷酸500X(Millipore，Part.2004011)、100μl甘油-2-磷酸100X(Millipore，Part.2004011)、10μl的50uM的褪黑激素(Millipore，Part.2004011)。将500μl的dH2O加入到6ug提供的褪黑激素中。
ARS染色和定量如上所述进行。使用Nikon Eclipse CFI60以10X拍摄照片。
结果
将MC3T3-E1细胞在不同的孔板中培养8天。在第8天，拍摄孔中的相衬照片并且在下面可以看到(图79A、79B)。阴性对照孔显示圆形细胞且ARS染色为很浅的粉色。使用诱导培养基的孔显示更鲜艳的红色并且在孔的周边看到纺锤形细胞。在外周环看到更丰富的ARS染色。AMP处理显示ARS处理后为深红色且很难看到细胞，因为AMP在其之上沉淀。实验期间未观察到聚集(即使已经观察到在固定化的HC-HA之上有其他细胞类型聚集)。在第6、7和8天拍摄显微照片。
在第8天使用盐酸胍提取法并将孔板孵育过夜。虽然裸眼很难发现，但GnHCl能够提取ARS染料；所有的孔似乎具有相同的浅粉色/红色。因为读板器没有在490nm或更近下读取的功能，因此在450nm对ARS的提取物进行定量。结果可见于图79C中。*符号表示p<0.05的统计学显著性。(+表示有AGM，-表示无AGM)
与之前的结果一致，AMP能够成功地促进矿化而无需诱导剂。本实验仅历时8天，结果并不如历时20天的目标4明显。用AGM处理的所有条件较之相对应的阴性对照显示出矿化增加。我们的研究结果还表明固定化的nHC-HA/PTXS不负责促进AMP中的矿化。因此，肯定存在AMP的另一活性成分促进了矿化。
实施例44：HC-HA/PTX3(PBS)和HC-HA/PTX3(Gn)对软骨内成骨的影响
骨生成和软骨发生的主转录因子(分别为Runx2和Sox9)均由HC-HA条件下的细胞通过14天的培养周期表达。HC-HA/PTX3，可溶和不溶性，能够促进BMP2的表达以及在一定程度上促进BMP6的表达而无需商业提供的骨诱导剂AGM(即，抗坏血酸、甘油磷酸、褪黑激素)(见下文)。
软骨发生标记物胶原蛋白2通过HC-HA/PTX3(PBS)高度表达而无需AGM。HC-HA/PTX3(Gn)及加入AGM也能上调胶原蛋白2。骨生成标记物(BSP、ALPL、OSX)在第14天在HC-HA条件下上调，从而确定从软骨过渡到骨基因型。
实验设计：
培养条件：从液氮冷冻罐中取出购自Lonza(Basel,Switzerland)的人骨髓源性间叶系干细胞并且使其生长在包含每3天更换的相同培养基的100mm培养皿中直到80％汇合。细胞培养基为包含10％胎牛血清和抗生素的αMEM。每3天更换培养基(每100mm培养皿10ml)，并且将细胞传代至80％汇合，直到其到达上述期望的细胞数。以3.1x104个细胞/96塑料孔将用于实验的细胞接种在有或无骨诱导剂抗坏血酸2-磷酸盐、甘油2-磷酸和褪黑激素(AGM)的固定化的HA、HC-HA(PBS)或HC-HA(Gn)上。加入的AGM的最终浓度分别为0.2mM、10mM和50nM。细胞接种(第0天)的同时加入AGM并且在第1、7和14天提取mRNA。为了对基因表达进行定量，进行qPCR。每3天更换培养基(每96孔100ul)。
实验组的总结如下：
阴性对照：Covalink-NH 96孔板
实验组1：每3天将AGM添加到Covalink-NH96孔板中
实验组2：将20μg/ml HA固定在Covalink-NH 96孔板上
实验组3：将20μg/ml HA固定在Covalink-NH 96孔板上且每3天添加AGM
实验组4：将20μg/ml 4X nHC-HC/PTX3固定在Covalink-NH-96孔板上
实验组5：将20μg/ml 4X nHC-HC/PTX3固定在Covalink-NH-96孔板上且每3天添加AGM
实验组6：将20μg/ml 4X nHC-HC/PTX3(GuHCl提取物)固定在Covalink-NH-96孔板上
实验组7：将20μg/ml 4X nHC-HC/PTX3(GuHCl提取物)固定在Covalink-NH-96孔板上且每3天添加AGM
对于AGM诱导组：在第0天和第3天，用骨生成诱导培养基#1(抗坏血酸、甘油磷酸)更换培养基。在第6天，用骨生成诱导培养基#2(抗坏血酸、甘油磷酸、褪黑激素)更换培养基。在第0天，制备10X诱导培养基。在第3天和第6天，新鲜制备10ml骨生成诱导培养基。制备诱导培养基的说明书从体外骨生成试验试剂盒(Millipore)获得。
诱导培养基#1：9.88ml加有10％FBS、20μl抗坏血酸2-磷酸500X(Millipore，Part.2004011)、100μl甘油-2-磷酸100X(Millipore，Part.2004011)的αMEM培养基。
诱导培养基#2：9.87ml加有10％FBS、20μl抗坏血酸2-磷酸500X(Millipore，Part.2004011)、100μl甘油-2-磷酸100X(Millipore，Part.2004011)、10μl 50uM的褪黑激素(Millipore，Part.2004011)的αMEM培养基。添加500μl的dH2O至6ug提供的褪黑激素中。
在第1、7和14天从细胞中提取mRNA并通过qPCR测定基因表达(图80A-E)。对下列基因进行了测定：骨生成标记物Runx2、碱性磷酸酶(ALPL)、标记物胶原蛋白1(COL1)、Osterix(OSX)和骨唾液蛋白(BSP)以及软骨发生标记物Sox9和胶原蛋白2(COL2)、肥厚标记物胶原10(COL10)和MMP13。对第14天的培养物进行如上所述的ARS染色和定量(图81A、81B)。
在塑料上AGM上调BMP4。HA上调BMP4(早期)，但下调(后期)BMP6且对BMP2没有影响(图80B)。没有文献数据表明HA本身上调BMP。然而，添加AGM上调BMP2和BMP6。
4X的可溶性的HC-HA最初上调BMP4但在后期下调BMP4(类似HA)以及显著上调BMP2(类似AMP，但没有瞬时的BMP6)(图80B)。与此相反，添加AGM没有改变BMP的表达模式。
4X不溶性HC-HA最初上调BMP4但下调BMP4(后期)(类似HA)以及显著上调BMP2(类似可溶性HCHA)(图80B)。[与可溶性一致]类似地，加入AGM没有改变表达模式。
我们的结果表明可溶性HC-HA和不溶性HC-HA能够通过软骨内成骨机制形成骨分化和矿化。骨标记物(COL1、OSX、ALP和BSP)的表达很明显与软骨细胞标记物(Col2)和肥厚标记物(Col10、MMP13)的表达类似(图80A-E)。这些HC-HA条件之间的区别在于不溶性HC-HA能够促进较大幅度的基因表达和更显著的骨结节(即使没有AGM)而水溶性的HC-HA需要AGM(数据未示出)。因此，可溶性和不溶性HC-HA/PTX3均能够在无骨诱导剂AGM的情况下促进BMP2的表达。
无AGM的HA也显示软骨发生标记物(COL2)，而且还通过ARS定义的矿化显示了骨形成的迹象以及ALP和OC的略微增加。然而，HC-HA/PTX3(PBS)比HA有更高的软骨发生的表达和更高的骨标记物ALP、OSX和BSP的表达。然而，这些条件都不显著表达肥厚标记物。HC-HA/PTX3(Gn)比上述两种情况表达多得多的ALP、OSX和BSP。肥厚标记物MMP13也进行了表达并且软骨发生标记物COL2稍有表达。
HA加上AGM促进骨生成并且增加BMP2、ALP、OSX、BSP和OC的表达以及呈现出肥厚标记物COL10和MMP13。然而，HA较之HC-HA组产生了更少的骨特异性mRNA表达以及骨结节形成。另一主要区别是HA下调SOX9但后期增加BMP6的表达。
所有先前的数据表明不溶性HCHA是骨的最强诱导剂，并且更重要的是，诱导软骨内成骨机制。
实施例45：nHC-HA/PTX3抑制炎症和免疫应答并且提高小鼠角膜移植存活
实验和临床研究表明羊膜(AM)、AM提取物和nHC-HA/PTX3[间-α-胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链(HC)和乙酰透明质酸(HA)形成的共价复合物]抑制促炎症应答。本实施例表明，nHC-HA/PTX3/PTX3可以调节T细胞反应并降低小鼠角膜移植排斥反应。
可以通过增殖和各种细胞因子的生产而评估T细胞活化(图82)。在这种情况下，从表达特异性针对卵白蛋白(OVA)的转基因TCR的OT-II小鼠中分离脾细胞，并以OVA进行刺激至4天(图83)。通过BrdU标记测定细胞增殖并通过各自的ELISA测定细胞因子(IFN-g和IL-2)的表达。1mg/ml的nHC-HA/PTX3而非HA在第2天与第4天显著地抑制以OVA肽段处理的脾细胞的增殖(图84)以及IFN-γ和IL-2的产生(图85)(所有p<0.05)。此外，通过注射LPS而在体内激活角膜T细胞。
在角膜内注射LPS之前或期间时通过绿色荧光蛋白阳性的巨噬细胞向Mafia小鼠角膜内的内向通量而确定对nHC-HA/PTX3的注射部位、体积和频率的优化。通过在结膜下和穹窿之间的每次注射给予5μl至所有四个扇形体而进一步优化注射方案。nHC-HA/PTX3处理4天后，角膜用820单位/ml的胶原酶在37℃消化1小时。通过FACS分离EGFP-和EGFP+细胞。LPS注射前用nHC-HA/PTX3预处理3天显著抑制EGFP+巨噬细胞向LPS-注射的角膜的内向通量(9.1±0.3相对于12.3±0.4，nHC-HA/PTX3相对于PBS，p＝0.02)(图86)。重要的是，即使EGFP+巨噬细胞确实迁移到角膜中，其中一些被转化为显著上调Arg-1和IL-10，但下调IL-12(p<0.05)所指示的M2表型(图87)。通过qPCR测定Arg-1、IL-10和IL-12的mRNA表达。最后，使用野生型BALB/c小鼠作为受体和C57BL/6小鼠作为供体进行异源角膜移植，并通过使用裂隙灯生物显微镜每周两次测量移植清晰度以取得结果分数。连续两次获得得分≥3而无分辨率的移植被视为排斥。与PBS对照相比，同种异体移植排斥反应通过每周两次在一个扇形体注射10μl nHC-HA/PTX3而得到显著抑制(p<0.05)，并通过每周两次在4个扇形体注射5μl而进一步降低(p<0.002)(图88)。
这些实验证明nHC-HA/PTX3显著地抑制小鼠角膜移植排斥反应。这一功能的机制可能归因于nHC-HA/PTX3下调促炎性巨噬细胞和抑制T细胞免疫应答的能力。
实施例46：使用nHC-HA/PTX3和AMP治疗干燥应激导致的鼠干眼症
干眼症，又称为眼泪功能失调综合征，是一种世界范围内存在高患病率和显著发病率的常见的眼表疾病。它是一种特征在于慢性自身反应性T细胞介导的炎症和泪腺功能单位功能障碍(LFU；角膜、结膜、泪腺和睑板腺)的基于自身免疫的炎性疾病。
Figure GDA0003352411270002511
综合征(SS)是一种普遍的慢性自身免疫疾病，特征是唾液和泪腺被单核细胞浸润，导致实质组织的次生损害。
SS中的干燥性角结膜炎(KCS)是严重和潜在威胁视力的眼表上皮疾病，特征在于浸润产生IL-17和干扰素(IFN)-γ的CD4+T细胞。抑制T细胞活化的化合物(例如，环孢菌素A)在动物和人中减轻干眼症。巨噬细胞可经历经典的M1激活(例如，通过IFN-γ和/或TLR配体诸如LPS)以表达高水平的炎性细胞因子(如TNF-α、IL-12和IL23)，其激活导致许多慢性炎性疾病的Th1和Th17淋巴细胞(图89)。本实施例证明施用nHC-HA/PTX3和AMP对此类病症的治疗是有用的。
每只眼睛四个注射部位抑制巨噬细胞向角膜的浸润
MAFIA小鼠允许在体内跟踪巨噬细胞流是因为它们被绿色荧光蛋白标记。这些小鼠被用于确定nHC-HA/PTX3或AMP能否阻止LPS诱导的巨噬细胞流入至角膜，一个角膜炎模型。以5μl或更小的合适的量在结膜下和穹窿之间的每个注射部位注射LPS。用LPS进行基质内注射(每眼5μg)MAFIA小鼠的眼睛(巨噬细胞为EGFP+)。在每只眼睛中，用PBS(2或4的注射部位)处理OS而用nHC-HA/PTX3(2或4个注射部位；每注射部位含5μl的1mg/ml HA的nHC-HA)或AMP(2或4个注射部位，每注射部位含5μl的10mg/ml蛋白质的AMP)处理OD一次。在LPS注射后立即进行处理。在第1天、第2天、第3天及第6天使用体内活体显微镜检查对整个角膜进行成像。基于绿色荧光的强度对EGFP阳性的细胞进行计数。
在第1天，在注射LPS伴随用PBS处理后在大部分角膜周边区域检测到EGFP阳性巨噬细胞。用nHC-HA/PTX3或者AMP处理没有显著增加或减少角膜中的巨噬细胞。
在第2天，在PBS处理的角膜中的巨噬细胞比第1天显著增加(p<0.05)，nHC-HA/PTX3(2个和4个注射部位，p<0.05)和AMP(2个和4个注射部位，p<0.05)处理亦是如此。具体地，2次注射nHC-HA/PTX3比用PBS处理(p>0.05)有更多巨噬细胞浸润角膜，但4次注射nHC-HA/PTX3的角膜中较少(p>0.05)。对于AMP处理，2次注射无显著影响但4次注射略微减少巨噬细胞的浸润，这表明每只眼4次注射nHC-HA/PTX3或AMP对有效减少巨噬细胞的浸润是必需的。
在第3天，在PBS、nHC-HA/PTX3和AMP处理下巨噬细胞的浸润继续。
2次注射、4次注射nHC-HA/PTX3或者2次注射AMP的处理都不抑制浸润。唯一显示出抑制的处理是4次注射AMP(p<0.05)。
在第6天，巨噬细胞的浸润减少。然而，HC-HA/PTX3或AMP的处理与对照相比都没有显著的抑制作用。
这些数据表明从第1天至第3天EGFP阳性的巨噬细胞继续浸润至LPS注射的角膜，并在第4天或第5天达到峰值，然后在第6天下降，这符合先前报告的数据(图90)。在第2天每只眼4次注射nHC-HA/PTX3的处理或在第2天和第3天4次注射AMP轻微地抑制巨噬细胞的浸润。这表明AMP比nHC-HA/PTX3对阻断LPS引起的巨噬细胞的浸润有更好的效价。
使用AMP预处理，由于额外的注射及nHC-HA/PTX3或AMP的后续注射，显著抑制损伤引起的巨噬细胞浸润
每个MAFIA小鼠的左眼(OS)用PBS(5μl)或AMP(5μl的10mg/ml蛋白)在如上定义的结膜下/穹窿的4个位点进行预处理。每只小鼠的右眼(OD)不进行处理。三天后，每只眼睛在角膜处注射LPS(5μg)并随即用PBS(5μl)、HC-HA/PTX3(5μl的1mg/ml HA)或AMP(5μl的10mg/ml蛋白)在4个位点进行处理。利用体内活体显微镜对EGFP+巨噬细胞的浸润进行计数，其并没有显示巨噬细胞对鼠角膜浸润的任何显著的减少(p>0.05)(数据未示出)。然后，我们通过体内荧光显微镜对该定量方法的准确性进行了研究。
为了更准确地测量巨噬细胞的浸润并检测所产生的巨噬细胞的表型(例如，M1相对于M2)，我们决定通过对在第4天去除的角膜进行胶原酶消化和FACS而定量EGFP阳性的巨噬细胞。然后，通过与EGFP阴性的巨噬细胞的比率对阳性巨噬细胞进行归一化以评估巨噬细胞浸润的程度。在未进行预处理的组中，PBS对照组中注射LPS引起巨噬细胞浸润(图91，A，蓝条)。这种浸润被nHC-HA/PTX3(9.1±0.3相对于12.3±0.4，p＝0.02)或AMP(2.1±0.1相对于12.3±0.4，p＝0.02)显著抑制。对抑制巨噬细胞的浸润AMP处理比nHC-HA/PTX3处理更好(p＝0.02)。
与未进行预处理的组相比，在预处理组中PBS对照组LPS注射显著引起巨噬细胞的浸润(37.2±1.3相对于12.3±0.4,p＝0.01)(图91，A，红条)。这种差异是可预期的，由于预处理期间4次结膜下注射造成的伤害引起了炎症，其增强了巨噬细胞浸润至随后用LPS处理的角膜。然而，这一强烈增加的浸润完全被AMP预处理以及随后的nHC-HA/PTX3(8.2±0.3相对于37.2±1.3,p＝0.02)或AMP处理(2.3±0.1相对于37.2±1.3,p＝0.02)所抑制。再次，在抑制巨噬细胞浸润方面，AMP预处理伴随AMP处理较之AMP预处理伴随nHC-HA/PTX3处理更好(2.3±0.1相对于8.2±0.3,p＝0.02)。然而，在无预处理组和AMP预处理的nHC-HA/PTX3或AMP组之间在抑制方面不存在显著性差异(p>0.05)。qPCR数据显示nHC-HA/PTX3预处理降低M1的标记物IL-12p40和IL-12p35而增加了M2的标记物Arg-1(图91，B)。AMP处理和预处理显著地降低了IL-12p40和IL-12p35但极大地增加了Arg-1和IL-10。总之，AMP预处理可以完全消除预处理过程中额外伤害引起的巨噬细胞的浸润。这一效果通过随后注射nHC-HA/PTX3或者AMP同时伴有注射LPS而得以持续。在4天之后注意到这一益处，且AMP比nHC-HA/PTX3更有效。
在小鼠实验性干眼模型中nHC-HA/PTX3或AMP可减少DS诱导的ALKC。
设计
物种：C57BL/6小鼠
终点：角膜上皮屏障功能(OGD染色)
样本量：每组15只
群组：2个对照组和3个处理组(PBS、nHC-HA/PTX3和AMP)：1)非干眼，未处理对照(UT)-留在单独的动物饲养室；2)实验干眼，未处理对照(EDE)；3)PBS；4)nHA-HC/PTX；5)AMP。
干燥应激(DS)
通过药理胆碱阻断泪液分泌以及通过暴露在通风和低湿度的环境受控的室中5天(周一至周五)而创建干燥应激模型。小鼠被放置在专门设计的带孔的笼中，其包含那些其两侧替换为金属丝网以允许气流通过笼的标准鼠笼。将每个笼放置在恒定气流(电风扇)前。通过共5天每天4次(上午8:30、上午11:30、下午1:30、下午4:30)皮下注射东莨菪碱(在0.2mL中0.5mg,Sigma-Aldrich)而抑制泪腺分泌。环境受控室中的湿度维持在约25-30％的相对湿度，其由4个便携式除湿机及天花板上的除湿器单元而实现。
治疗过程(5日方案)
在每个实验中，包含3个对照：
未处理对照，由一组保留在40～70％相对湿度的动物饲养室中的小鼠组成。这些小鼠从不暴露于DS，也不接受任何局部处理。
干眼对照，由一组放置在环境干眼室中但不接受处理的小鼠组成。
载体对照，由一组经历DS处理但接受PBS处理的小鼠组成。
此外，还包括两个实验组：nHA-HC/PTX3和AMP。
关于注射，我们以PBS作为溶剂对照使用nHC-HA/PTX3(含有1mg/ml的HMW HA)和AMP(含10mg/ml的总蛋白)。所有的溶液(PBS、nHC-HA/PTX3和AMP)用30 G吸入到结核菌素注射器中。注射位置为结膜下接近穹窿(图92)。在3、6、9和12点钟以每个注射位点5μl注射四(4)支注射剂。扩散的溶液完全覆盖整个结膜下外周，造成少量的结膜或整体充血/肿胀(如果有，应该在15分钟内消失)，其阻碍了眼睛的闭合和角膜表面破裂或发炎。在第1天及第3天进行注射(对于所有试剂)，即总共2次。在表6中总结了这一注射流程。
表6.实验组和nHC-HA/PTX3或AMP降低小鼠实验性干眼模型中DS诱导的ALKC所需的试剂。
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角膜染色的测量
在第5天上午，小鼠在进行泪液量的测量后接受1s.c.剂量的东莨菪碱处理。在此东莨菪碱剂量2小时后，用俄勒冈绿葡聚糖(OGD-488)进行角膜染色，其为70kDa分子大小的共轭荧光染料(分子探针)。该过程包括在安乐死1分钟前使用玻璃毛细吸管将0.5μl OGD滴注在角膜处。使小鼠吸入异氟烷麻醉气体随后进行颈椎脱位处理。然后眼睛用2ml BSS进行冲洗。将过量的液体小心地用滤纸从眼表面吸干而不触及角膜。在470nm的激发波长和488nm的发射波长下使用带有CoolSnap HQ2冷却的CCD照相机的Nikon SMZ-1500体视显微镜捕获双眼的数字图像，曝光时间为1秒。对每只动物的双眼进行了评估。使用NikonElements软件对3个数字图像中角膜中央的感兴趣的固定区域(1-mm直径的圆)中的荧光强度进行测定，并且数据被存储在数据库(Excel，Microsoft)中。结果表示为灰度的平均值±标准偏差。将3个独立实验的结果进行平均以进行组间统计比较。
在C57BL/6小鼠中创建5天的实验干眼症(EDE)模型中将nHC-HA/PTX3和冻干羊膜粉末(AMP)对T辅助细胞途径调节因子水平的影响进行比较。通过实时PCR对下列组中角膜上皮细胞和结膜中的Th1(IL-12、IFN-γ和T-Bet)、Th1-17(IL-23、IL-17、ROR-γt、IL-6、TGF-β1、MMP-3和MMP-9)及Th2(IL-4、IL-13和GATA3)相关因子的表达进行测定。
统计分析
使用GraphPad Prism5.0软件(GraphPad Inc)进行统计学分析。单向方差分析(ANOVA)用于测定组之间的总体差异，随后是事后检验(Tukey事后)。非配对t检验用于评估2个实验组之间的统计学差异。
实施例47：HC-HA激活IGF1-HIF1α-VEGF信号传导以促进血管发生，其通过在人角 膜成纤维细胞中加入TGFβ1而被进一步促进。
在本实施例中，研究了HC-HA复合物对人角膜成纤维细胞中的血管发生标记物的诱导效果。
如上所述将人角膜成纤维细胞(96孔板中3000个细胞/孔)接种在有或无固定化的HA、可溶性HC-HA(PBS)(4X)或不溶性HC-HA(GnHCl)(4X)的塑料皿中48小时。然后在收获细胞进行IGF1、HIF1α和VEGF的mRNA定量之前使用或不使用TGFβ1处理24小时。实验组为：
PBS
PBS+TGF-β1
HA
HA+TGF-β1
4X HC-HA PBS
4X HC-HA PBS+TGF-β1
4X HC-HA Gn
4X HC-HA Gn+TGF-β1
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA并使用高容量逆转录试剂盒(Applied Biosystems)进行逆转录。使用特异性引物-探针混合物和DNA聚合酶在7000Real-time PCR System(Applied Biosystems)中进行实时RT-PCR扩增每个细胞成分的cDNA。实时RT-PCR谱包括在95℃10分钟的初始活化，接着95℃15秒变性和60℃1分钟的退火和延伸进行40个循环。使用2％琼脂糖凝胶、随后根据EC3成像系统(BioImaging System)用溴化乙锭连同PCR标记物进行染色而对每个PCR产物(IGF1、HIF1α和VEGF)的大小进行确定。
当细胞在静止条件下时HC-HA诱导IGF1 mRNA 2至6倍的增加及VEGF mRNA的2倍的增加(图92)。与此相反，当细胞用TGFβ处理(10ng/ml)时，HC-HA诱导IGF1 mRNA的5至12倍的增加及VEGF mRNA 5至9倍的增加。已证明VEGF对血管发生起重要作用，增加给定网络中的毛细血管数目。血管内皮生长因子的激活由上游调节因子如IGF1和HIF1α控制。我们的研究结果表明HC-HA激活IGF1-HIF1α-VEGF网络以促进血管发生，其可通过在人角膜成纤维细胞中加入TGFβ1而进一步得以促进。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅以示例的方式提供。现在可以进行各种变更、更改和替换。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。其意图在于，下列权利要求限定本发明的范围并且从而涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等价物。
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Claims (15)

1.一种重建的HC-HA/PTX3(rcHC-HA/PTX3)复合物，其由高分子量乙酰透明质酸(HMWHA)、间-α-抑制剂(IαI)蛋白重链1(HC1)和重链2(HC2)和五聚环蛋白3(PTX3)组成。
2.一种重建的HC-HA/PTX3/SLRP复合物，其由HMW HA、HC1、HC2、PTX3和小亮氨酸丰富蛋白聚糖(SLRP)组成。
3.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于预防或逆转组织中的瘢痕形成或纤维化的药物中的用途。
4.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于预防或减少有需要的受试者中的炎症的药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述炎症与自身免疫性疾病、变态反应、白细胞缺陷、感染、移植物抗宿主病或其组合相关。
6.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于治疗有需要的受试者中的皮肤创伤或溃疡的药物中的用途。
7.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于促进或诱导有需要的受试者中的骨形成的药物中的用途，其中所述受试者患有关节炎、骨质疏松症、牙槽骨降解、或佩吉特病。
8.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于预防或减少有需要的受试者中不希望的血管发生的药物中的用途。
9.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于抑制或预防移植受者中的移植排斥的药物中的用途。
10.一种体外诱导干细胞扩充的方法，其包括使干细胞在体外与有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物或如权利要求2所述的重建的HC-HA/PTX3/SLRP复合物接触。
11.有效量的如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物在制备用于向有需要的受试者提供细胞疗法的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述细胞选自干细胞和分化的细胞。
13.一种医疗装置，其包含用如权利要求1所述的rcHC-HA/PTX3复合物涂覆的基底。
14.一种组合物，其包含权利要求1的rcHC-HA/PTX3复合物和药物上可接受的赋形剂或载体。
15.一种组合物，其包含权利要求1的rcHC-HA/PTX3复合物和选自下述的药物上可接受的聚合物：纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、血纤蛋白、血纤蛋白原、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素及其组合。
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