KR102641504B1 - Hapln1을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Hapln1을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 안구건조증의 예방 또는 치료방법을 개시한다. 본 발명에 의하면 안구건조증을 효과적으로 또한 안정적으로 예방 및 치료할 수 있으며 종래의 제품에 비하여 감소된 부작용을 나타낸다.
Description
본 발명은 안구건조증을 치료하기 위한 의학적 접근법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 안구건조증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 안구건조증의 치료 방법에 관한 것이다.
안구는 최적의 시각 기능을 유지하도록 조절되는 상이한 특수 세포 및 조직을 가진 복잡한 기관이다. 이 기능은 안구의 전부 및 후부에 단단한 장벽이 있어 달성되며, 이는 유체와 용질의 내부로 및/또는 외부로의 횡단의 선택적 제어에 의해 중요한 역할을 한다. 국소 및 전신 질환은 안구의 상이한 영역에 영향을 줄 수 있지만, 안구의 해부학 및 망막 및 시신경의 복잡한 생리는 효과적인 약물의 개발에 어려움이 된다. 안구는 크게 전부 (안구의 앞부분)과 후부 (안구의 뒷부분)라고 하는 2개의 구획으로 나뉜다. 안구의 전부는 각막, 결막, 전방 공막 (가장자리에서 각막이 되는 전방으로 전이되는 공막의 일부분), 홍채, 섬모체, 눈방수(aqueous humour) 및 수정체를 지칭한다. 안구의 후부(후안부라고도 함)는 전방 유리체막 및 이 막 뒤의 구조, 후부 공막 (후방으로 시신경 경막으로 전이되는 공막의 일부분), 유리체 (유리체액 및 막 포함), 망막, 황반, 맥락막 및 시신경을 포함한다.
안구건조증(Dry eye disease, DED)은 눈의 따끔거림, 긁는 느낌, 건조한 안구, 거친 안구 표면, 안구 충혈, Tear duct의 차단으로 눈물의 비정상적 분비, 빛에 과민성, 눈의 피로함, 콘택트렌즈 착용시 불쾌감, 뿌연 시야 및 이물감 등의 증상을 동반하는 질환으로서 최근 세계적으로 환자수가 증가하는 추세이다. 참고로 미국 통계에 따르면 2022년엔 2900만명의 안구건조증 환자가 발생할 것으로 예상되며, 2027년에는 66억 달러가 안구건조증 치료에 소요될 것으로 예측하고 있다. 한국 내에서도 안구건조증 환자는 매년 240만명 이상이다. 이와 같은 안구건조증의 증가 추세는 디지털화 및 스마트폰을 비롯한 많은 전자기기의 생활화 및 악화되는 주변 환경의 영향이 일조하고 있다고 생각된다.
안구건조증 중 안구건조증의 완화 내지 치료를 위하여 새로운 제품들이 개발되고 있음에도 증상을 완전하게 완화시키거나 치료는 힘들다. 안구건조증의 직접적인 원인은 눈물생성 부족과 눈물 증발 증가라 할 수 있다. 안구건조증 자체가 생명에 지장을 주는 것은 아니지만 환자는 심한 불편을 느끼며 시각 기능이 저하되고 삶의 질 및 생산성을 크게 떨어뜨린다.
본 발명자들은 HAPLN1 단백질에 관하여 예의 연구한 결과 이의 조성물을 외부에서 투여시 안구건조증의 예방 및 치료에 효능을 나타낸다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
HAPLN1과 관련하여 예를 들어 특허문헌 1에는 관절에 하나 이상의 치료적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 발현 벡터를 전달시 세포가 연골세포 또는 연골형 세포로 분화 및/또는 그러한 전달이 관절에서의 연골세포를 자극하여 추가적인 세포를 생산하도록 하는 구성을 개시하고 있다. 그 발명의 상세한 설명에는 이용되는 유전자로서 2백여개의 단백질 예시 중 HAPLN1이 언급되어 있다. 그러나 안구건조증에 관해서는 전혀 언급된 바가 없다.
나아가 특허문헌 2에는 글리코사미노글리칸이 코팅된 금속성 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 안구건조증의 증상을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이지만, 상기 조성물은 복수의 링커 분자로 코팅된 복수의 나노입자를 포함하고, 이들 중 적어도 일부는 적어도 하나의 글리코사미노글리칸 사슬에 부착된 것이고, 이 때 링커는 HAPLN1 단백질이며 상기 글리코사미노글리칸 사슬은 히알루론산 및/또는 이의 유도체를 포함함을 개시하며 상기 개시된 조성물은 국소 치료용으로 제형화될 수 있음을 개시하고 있다. 즉 특허문헌 2에서는 HAPLN1 단백질을 링커로 이용, 수화되는 글리코사미노글리칸 체인을 피부나 안구에 도입하는 구성이 개시되어 있다. 그러나 나노입자/HAPLN1의 접합체를 발명의 구성으로 한다는 점에서 HAPLN1 단백질 자체를 발명의 주성분으로 하지는 않으며 HAPLN1 단백질이 독자적으로 작용하여 뮤신 유전자의 발현을 증가시켜 눈물분비를 촉진함으로써 안구건조증을 완화시킨다는 기능과도 무관하다.
또한 비특허문헌 1에는 "연골형성장애증 및 연골 link 단백질 결핍의 출생전후의 치사효과의 유전적 구제(Genetic Rescue of Chondrodysplasia and the Perinatal Lethal Effect of Cartilage Link Protein Deficiency)"에 관한 논문으로서 유전공학적으로 연골 link protein(Crtl1) 유전자를 파괴한 마우스에서는 연골형성장애가 나타나고 출생전후에 마우스가 사망하게 되나 Crtl1 null 마우스에 연골 특이적 link protein을 도입하여 과발현하면 비정상적인 연골 형성이 방지되고 출산 전후에 사망률이 낮아진다는 것과, Crtl1 전사체 및 그 단백질을 태아로부터 성체에 이르기까지 모든 기관에서 찾았다는 사실 등을 개시하고 있다. 그러나 여기에서도 안구건조증에 관해서는 전혀 언급된 바가 없다.
한편 안구건조증을 완화하기 위한 기존의 약학 조성물로서는 면역억제(immunosuppression)나 T 세포 이동을 저해하는 기전을 이용하여 상표명 Restasis (2003, Allergan), Cequa (2018, Sun), Xiidra (2016, Novartis), Eysuvis (2020, Kala) 등이 출시되어 있다. 그러나 부족한 효능과 부작용으로 인하여 약 30 내지 70%의 안구건조증 환자들이 중간에 치료제 투약을 중단하고 있는 실정이다.
비특허문헌 1: Journal of Biological Chemistry.2003.Vol.278, No40.pp39214-29223
상기한 바와 같이 안구건조증을 비롯한 안구건조증의 예방 및 치료제로서 종래의 제품은 그 효능이 아직 부족하고 부작용이 적지 않다. 본 발명은 이러한 종래 기술의 한계를 극복한 것으로서 안구건조증을 효과적으로 및 안정적으로 치료하기 위한 약학적 조성물 및 안구건조증의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 서열동일성을 갖는 것인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 유전자에 관한 핵산이 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 안구에서 세포의 상처 치유능을 유도하는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 각막 상피 세포의 염증 인자의 발현을 감소시키는 것인 안구건조증의 예방 또는 개선용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물이 뮤신의 발현량을 증가시키는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물의 1회 국소 투여량이 1ng/ml 내지 100μg/ml인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 점안액, 인공눈물, 안 연고, 정제, 알약, 캡슐, 트로키제, 흡입제, 주사제, 패치제, 좌약으로 이루어진 군에서 선택되는 제형인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여용도인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 약학적 첨가제를 더 포함하는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 안구건조증을 예방 또는 억제하기 위한 조성물의 주요 또는 보조 유효성분으로서 포함되는 것인 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 상기 본 발명의 조성물 및 투여 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 억제와 관련된 실험용 시약 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 안구건조증을 예방 또는 억제하는 약학적 조성물의 제조에 사용하는 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하여 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
나아가 본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 안구건조증의 예방 또는 치료에 이용하는 용도에 관한 것이다.
상기한 바와 같이 본 발명의 약학적 조성물 및 치료 방법에 의하면 안구건조증을 효과적으로 또한 안정적으로 예방 및 치료할 수 있으며 종래의 제품에 비하여 감소된 부작용을 나타낸다. 이는 본 발명의 조성물은 그 유효 성분인 HAPLN1 단백질이 화학적으로 합성된 분자가 아니고 생체분자이기 때문에 가능한 것이라 추측된다.
도 1a는 본원발명의 실시예 1에 관한 실험 계획을 나타낸 도면이다.
도 1b 및 도 1c는 본원발명의 도1a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 생존성을 본 발명의 조성물 투여 후 24시간 후(도 1b) 및 48시간 후(도 1c) 각각에서 확인한 실험 결과의 그래프이다.
도 2a는 본원발명의 실시예 2에 관한 실험 계획을 나타낸 도면이다.
도 2b는 본원발명의 도 2a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 증식 및 이동을 통해 상처의 회복을 확인한 실험 결과에 관한 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 2c는 도 2b의 사진상에 나타난 이동 세포로 덮힌 면적의 비율을 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본원발명의 실시예 3에 관한 것으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용하여 각종 염증 인자의 마커들의 발현량을 확인한 이미지이다.
도 3b는 도 3a에서의 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용한 각종 염증 인자의 마커들의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본원발명의 실시예 4에 관한 것으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질을 더욱 세분화된 농도 별로 처리 후, 안구각막세포에서 분비된 CCL-20의 양을 본 발명의 조성물 (HAPLN1)의 투여량에 따라 확인한 그래프이다.
도 4b는 본원발명의 실시예 4에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 염증인자 발현에 있어서 중요한 전사인자인 NFκB의 활성을 western blot으로 확인하고(상측도면), 이에 대한 상대적 발현량을 정량한 그래프(하측 도면)을 보여준다.
도 5a은 실시예 5에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 뮤신 유전자들의 발현 정도를 알아보기 위한 본원발명의 실시예 5에 관한 실험 계획을 나타낸 도면이다.
도 5b는 도 5a의 실험 계획에 따라 구현된 실험으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 MUC4의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA의 발현량에 대해 상대적으로 정량화한 그래프이다.
도 5c는 도 5a의 실험 계획에 따라 구현된 실험으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 MUC16의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA의 발현량에 대해 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 6a는 실시예 6에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 결막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후, 대표적인 뮤신 단백질인 MUC5Ac의 발현을 나타낸 사진이며 도 6b는 도 6a에서 확인된 MUC5Ac를 분비하는 세포수의 비율을 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 마우스 건성안 모델에서 HAPLN1의 효능을 평가하기 위한 실험 계획이다.
도 7b는 각막 형광 점수 어세이(Corneal Fluorescein Scores) 점수 기록을 위한 구획 설명도이다.
도 7c는 눈물량 분비 (Tear volume) 어세이의 방법을 나타내는 그림이다.
도 8a는 본원발명의 실시예 8에 있어서 형광 염색을 통해 각막 손상과 개선 정도를 보여주는 안구 사진이다(0일, 6일, 11일).
도 8b는 도 8a의 형광 점수 어세이의 점수 결과를 수치화하여 나타낸 그래프이다(0일, 6일, 11일).
도 8c는 마우스 건성안 모델에서의 눈물량 분비 (Tear volume) 어세이의 결과, 즉, Schirmer's test strip에 흡수된 눈물량을 수치화하여 나타낸 그래프이다(0일, 6일, 11일).
도 9a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 박리된 각막 상피 세포의 상태를 나타내는 사진이다.
도 9b는 도 9a의 사진에서 박리된 각막 상피 세포의 수를 계수하여 수치화한 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 결막에 존재하는 술잔세포(Goblet cell)의 이미지를 보여주는 사진이다.
도 10b는 도 10a의 사진에서 나타난 술잔세포의 수를 정량화한 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증반응의 대표적 사이토카인인 IL-1β의 발현 정도를 Immunohistochemistry를 통해 확인한 사진이다.
도 11b는 도 11a의 사진에서 나타난 IL-1β의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증세포 마커인 CD45의 발현 정도를 Immunofluorescence(IF)를 통해 확인한 사진이다.
도 12b는 도 12a의 사진에서 나타난 CD45의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 13a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증세포 마커인 CD11b의 발현 정도를 Immunofluorescence(IF)를 통해 확인한 사진이다.
도 13b는 도 13a의 사진에서 나타난 CD11b의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 염화벤잘코늄을 이용한 토끼 건성안 모델의 유도와 이에 대한 HAPLN1의 효능을 평가하기 위한 실험 계획을 나타내는 도면이다.
도 15a는 토끼 안구 각막의 손상 정도를 나타내기 위한 CFS(Corneal Fluorescein Scores) 수치를 도출하기 전의 안구의 이미지이다.
도 15b는 염화 벤잘코늄을 이용하여 유도된 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물의 농도 별로 눈물막 파괴 시까지 걸리는 시간(TFBUT: Tear Film Break Up Time)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15c는 도 15a의 이미지에 따라 안구 각막의 손상 정도를 나타내기 위한 CFS(Corneal Fluorescein Scores) 수치를 본 발명의 조성물의 농도별로 측정하여 0일, 5일, 10일 및 15일에서 각각 수치화한 그래프이다.
도 15d는 15a에 있어서 Schirmer test strip에 흡수된 눈물량을 측정한 결과로서 눈물의 양(tear volume)을 본 발명의 조성물의 농도별로 측정하여 0일, 5일, 10일 및 15일에서 각각 수치화한 그래프이다.
도 16a는 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 각막 상피 세포가 박리된 정도를 나타내는 사진이다.
도 16b는 도 16a에서 각 경우에 대해 박리(detached)된 각막 상피 세포의 수를 계수하여 수치화한 그래프이다.
도 17a는 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 결막에 존재하는 술잔세포(Goblet cell)의 상태를 나타내는 사진이다.
도 17b는 도 17a에서 각 경우에 대해 사진에서 나타난 술잔세포의 수를 정량화한 그래프이다.
도 1b 및 도 1c는 본원발명의 도1a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 생존성을 본 발명의 조성물 투여 후 24시간 후(도 1b) 및 48시간 후(도 1c) 각각에서 확인한 실험 결과의 그래프이다.
도 2a는 본원발명의 실시예 2에 관한 실험 계획을 나타낸 도면이다.
도 2b는 본원발명의 도 2a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 증식 및 이동을 통해 상처의 회복을 확인한 실험 결과에 관한 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 2c는 도 2b의 사진상에 나타난 이동 세포로 덮힌 면적의 비율을 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본원발명의 실시예 3에 관한 것으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용하여 각종 염증 인자의 마커들의 발현량을 확인한 이미지이다.
도 3b는 도 3a에서의 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용한 각종 염증 인자의 마커들의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본원발명의 실시예 4에 관한 것으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질을 더욱 세분화된 농도 별로 처리 후, 안구각막세포에서 분비된 CCL-20의 양을 본 발명의 조성물 (HAPLN1)의 투여량에 따라 확인한 그래프이다.
도 4b는 본원발명의 실시예 4에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 염증인자 발현에 있어서 중요한 전사인자인 NFκB의 활성을 western blot으로 확인하고(상측도면), 이에 대한 상대적 발현량을 정량한 그래프(하측 도면)을 보여준다.
도 5a은 실시예 5에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 뮤신 유전자들의 발현 정도를 알아보기 위한 본원발명의 실시예 5에 관한 실험 계획을 나타낸 도면이다.
도 5b는 도 5a의 실험 계획에 따라 구현된 실험으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 MUC4의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA의 발현량에 대해 상대적으로 정량화한 그래프이다.
도 5c는 도 5a의 실험 계획에 따라 구현된 실험으로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후 MUC16의 mRNA의 발현량을 GAPDH의 mRNA의 발현량에 대해 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 6a는 실시예 6에 있어서 고삼투압 조건 하 인간 결막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 농도 별로 처리 후, 대표적인 뮤신 단백질인 MUC5Ac의 발현을 나타낸 사진이며 도 6b는 도 6a에서 확인된 MUC5Ac를 분비하는 세포수의 비율을 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 마우스 건성안 모델에서 HAPLN1의 효능을 평가하기 위한 실험 계획이다.
도 7b는 각막 형광 점수 어세이(Corneal Fluorescein Scores) 점수 기록을 위한 구획 설명도이다.
도 7c는 눈물량 분비 (Tear volume) 어세이의 방법을 나타내는 그림이다.
도 8a는 본원발명의 실시예 8에 있어서 형광 염색을 통해 각막 손상과 개선 정도를 보여주는 안구 사진이다(0일, 6일, 11일).
도 8b는 도 8a의 형광 점수 어세이의 점수 결과를 수치화하여 나타낸 그래프이다(0일, 6일, 11일).
도 8c는 마우스 건성안 모델에서의 눈물량 분비 (Tear volume) 어세이의 결과, 즉, Schirmer's test strip에 흡수된 눈물량을 수치화하여 나타낸 그래프이다(0일, 6일, 11일).
도 9a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 박리된 각막 상피 세포의 상태를 나타내는 사진이다.
도 9b는 도 9a의 사진에서 박리된 각막 상피 세포의 수를 계수하여 수치화한 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 결막에 존재하는 술잔세포(Goblet cell)의 이미지를 보여주는 사진이다.
도 10b는 도 10a의 사진에서 나타난 술잔세포의 수를 정량화한 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증반응의 대표적 사이토카인인 IL-1β의 발현 정도를 Immunohistochemistry를 통해 확인한 사진이다.
도 11b는 도 11a의 사진에서 나타난 IL-1β의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증세포 마커인 CD45의 발현 정도를 Immunofluorescence(IF)를 통해 확인한 사진이다.
도 12b는 도 12a의 사진에서 나타난 CD45의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 13a는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 눈물샘에서 염증세포 마커인 CD11b의 발현 정도를 Immunofluorescence(IF)를 통해 확인한 사진이다.
도 13b는 도 13a의 사진에서 나타난 CD11b의 발현 정도를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 염화벤잘코늄을 이용한 토끼 건성안 모델의 유도와 이에 대한 HAPLN1의 효능을 평가하기 위한 실험 계획을 나타내는 도면이다.
도 15a는 토끼 안구 각막의 손상 정도를 나타내기 위한 CFS(Corneal Fluorescein Scores) 수치를 도출하기 전의 안구의 이미지이다.
도 15b는 염화 벤잘코늄을 이용하여 유도된 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물의 농도 별로 눈물막 파괴 시까지 걸리는 시간(TFBUT: Tear Film Break Up Time)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 15c는 도 15a의 이미지에 따라 안구 각막의 손상 정도를 나타내기 위한 CFS(Corneal Fluorescein Scores) 수치를 본 발명의 조성물의 농도별로 측정하여 0일, 5일, 10일 및 15일에서 각각 수치화한 그래프이다.
도 15d는 15a에 있어서 Schirmer test strip에 흡수된 눈물량을 측정한 결과로서 눈물의 양(tear volume)을 본 발명의 조성물의 농도별로 측정하여 0일, 5일, 10일 및 15일에서 각각 수치화한 그래프이다.
도 16a는 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 각막 상피 세포가 박리된 정도를 나타내는 사진이다.
도 16b는 도 16a에서 각 경우에 대해 박리(detached)된 각막 상피 세포의 수를 계수하여 수치화한 그래프이다.
도 17a는 토끼 건성안 모델에서 본 발명의 조성물을 농도별로 처리후 16일 째에 결막에 존재하는 술잔세포(Goblet cell)의 상태를 나타내는 사진이다.
도 17b는 도 17a에서 각 경우에 대해 사진에서 나타난 술잔세포의 수를 정량화한 그래프이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
나아가 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 안구에서 세포의 상처 치유능을 유도하도록 작용할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 세포의 증식과 상처로의 이동을 촉진하기 때문이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 각막 상피 세포의 염증 인자의 발현을 감소시키도록 작용할 수 있다. 상기 염증 인자의 예로는 Interleukins, CCL/CXCL family, Chitinase 3-like 1, pNFkB 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 본 발명의 약학적 조성물은 뮤신의 발현량을 증가시키도록 작용할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 각종 뮤신 패밀리 및 galectin-3의 mRNA의 발현을 촉진시키기 때문이다.
본 발명의 명세서에 있어서, "rhHAPLN1"는 recombinant human HAPLN1의 약자로서 재조합 인간 HAPLN1을 나타낸다.
특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여와 양립 가능한 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물도 또한 조성물에 포함될 수 있다. 다시 말하면 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 약학적 첨가제를 더 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 점안액, 인공눈물, 안 연고, 정제, 알약, 캡슐, 트로키제, 흡입제, 주사제, 패치제, 좌약으로 이루어진 군에서 선택되는 제형일 수 있다.
투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥 내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 바람직하게는 비경구 투여용도이다.
비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 다음 성분이 포함될 수 있다: 주사용수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절 제제. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 넣을 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 조성물은 멸균된 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조(extemporaneous preparation)를 위한 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥 내 투여에 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에 조성물은 무균이어야하고 주사가 용이할 정도로 유동적이어야한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 등장제, 예를 들어 당, 만니톨과 같은 폴리알콜, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 도모할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입시킨 다음 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 위에서 열거한 다른 필요 성분을 포함하는 멸균 비히클에 통합하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조로서, 활성 성분의 분말과 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 원하는 임의의 추가 성분을 생성한다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고 정제, 트로키 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 구강용 조성물은 또한 구강 세정제로 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 바인더, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화 규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 향료.
흡입에 의한 투여를 위해 화합물은 적절한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스, 또는 네불라이저를 함유하는 압력 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투할 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여용, 세제, 담즙 염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여를 위해 활성 화합물은 당해 기술분야에 일반적으로 알려진 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 좌약 (예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상적 인 좌약베이스와 함께) 또는 직장 전달을 위한 체류 관장의 형태로 제조될 수 있다.
세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용하기 위한 다양한 용량을 제형화하는 데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적 유효량 (즉, 유효 투여량)은 선택된 환자의 상황에 따라 달라진다. 예를 들어, 약 1pg 내지 1000mg 범위의 단일 용량이 투여될 수 있다; 일부 구체예에서, 10, 30, 100, 또는 1000 pg, 또는 10, 30, 100, 또는 1000 ng, 또는 10, 30, 100, 또는 1000 μg, 또는 10, 30, 100 또는 1000 mg이 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 1ng/ml 내지 100μg/ml, 바람직하게는 3ng/ml 내지 50μg/ml, 더 바람직하게는 5ng/ml 내지 500ng/ml, 특히 바람직하게는 10ng/ml 내지 200ng/ml의 조성물이 투여할 수 있다. 조성물은 1 일 1 회 이상부터 1 주일에 1 회 이상 투여할 수 있으며 격일로 한 번씩을 포함한다. 숙련된 기술자는 개체를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 용량 및 시기에 특정 요인이 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것인데 이에는 질병 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 개체의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 기타 기존 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 본 발명의 분자의 치료적 유효량으로 개체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 환자의 상황에 따라 그 투여량이 5 mg/kg/주 내지 500 mg/kg/주, 예를 들어 5 mg/kg/주, 10 mg/kg/주, 15 mg/kg/주, 20 mg/kg/주, 25 mg/kg/주, 30 mg/kg/주, 35 mg/kg/주, 40 mg/kg/주, 45 mg/kg/주, 50 mg/kg/주, 55mg/kg/주, 60mg/kg/주, 65mg/kg/주, 70mg/kg/주, 75mg/kg/주, 80mg/kg/주, 85mg/kg/주, 90mg/kg/주, 95mg/kg/주, 100mg/kg/주, 150mg/kg/주, 200mg/kg/주, 250mg/kg/주, 300mg/kg/주, 350mg/kg/주, 400mg/kg/주, 450mg/kg/주 및 500mg/kg/주의 범위 내에 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 이중작용성 분자의 투여량은 10 mg/kg/주 내지 200 mg/kg/주, 20 mg/kg/주 내지 150 mg/kg/주 또는 25 mg/kg/주 내지 100 mg/kg/주의 범위 내에 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 2 주 내지 6 개월, 예를 들어 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10주, 11 주, 12 주, 13 주, 26 주, 6 개월, 8 개월, 10 개월 또는 1 년 이상 동안 주당 1x 회 투여된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 주당 2x 회 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 격주로 투여된다.
본 발명의 조성물은 약리학적 유효량의 HAPLN1 단백질 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로 제형화할 수 있다. 약리학적 또는 치료학적 유효량은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 데 효과적인 함량을 의미한다. "약리학적 유효량" 및 "치료학적 유효량" 또는 간단히 "유효량"이라는 어구는 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 데 효과적인 이중작용성 분자의 양을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 임상 치료가 질병 또는 장애와 관련된 측정 가능한 매개 변수가 20 % 이상 감소할 때 효과적인 것으로 간주된다면, 그 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 치료적 유효량은 해당 매개 변수를 최소 20 % 감소시키기에 필요한 양이다.
본 발명의 적절하게 제형화된 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 직장, 질 및 국소 (협측 및 설하 포함) 투여를 포함하는 비경구 경로와 같은 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 정맥 내 또는 비경구 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
일반적으로 분자의 적절한 투여량 단위는 하루당 수용자의 체중 kg 당 0.001 내지 0.25mg의 범위, 또는 1 일당 체중 1kg 당 0.01 내지 20마이크로그램의 범위, 또는 1 일당 체중 kg 당 0.01 내지 10 마이크로그램의 범위, 또는 1 일 체중 1kg 당 0.10 내지 5 마이크로그램의 범위, 또는 1 일당 체중 kg 당 0.1 내지 2.5 마이크로그램의 범위이다. 분자를 포함하는 약학적 조성물은 1 일 1 회 투여할 수 있다. 그러나, 치료제는 또한 하루 종일 적절한 간격으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 하위 용량을 포함하는 투여 단위로 투여할 수 있다. 투여 단위는 또한, 예를 들어, 수일 기간에 걸쳐 분자의 지속적이고 일관된 방출을 제공하는 통상적인 지속 방출 제형을 사용하여 수일에 걸쳐 단일 용량으로 배합될 수 있다. 지속 방출 제형은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이 구체예에서, 투여량 단위는 일일 투여량의 상응하는 배수를 포함한다.
약학적 조성물은 투여 지침과 함께 키트, 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 하여 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 안구건조증이 있는 (또는 이에 민감한) 개체를 치료하는 예방방법 및 치료 방법을 둘 다 제공한다.
본 명세서에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 또는 장애, 질병 또는 장애의 증상, 또는 질병에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 개선, 개량 또는 영향을 주기 위한 목적으로 환자에게 치료제 (예를 들어, 본 발명의 분자)의 적용 또는 투여, 또는 단리된 조직 또는 세포주에 대한 치료제의 적용 또는 투여로 정의되는데, 상기 환자는 질병 또는 장애, 질병 또는 장애의 증상, 또는 질병 또는 장애에 대한 소인을 갖고 있는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에게 본 발명의 조성물을 투여함으로써 상기 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 개체에서 예방하는 방법을 제공한다. 질병에 걸릴 위험이 있는 개체는 예를 들어 본 명세서에 기술된 진단 또는 예후 분석 중 임의의 하나 또는 조합에 의해 식별될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하여 안구건조증을 치료 또는 억제하는 방법, 즉 안구건조증의 증상의 발병을 변경하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 시험관내(in vitro) 또는 대안적으로 생체 내(in vivo)에서 (예를 들어, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써) 수행될 수 있다.
또한 본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물의 제작에 이용하는 용도에 관한 것이다.
나아가 본 발명의 일 양상은 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 안구건조증의 예방 또는 치료에 이용하는 용도에 관한 것이다.
발명의 실시를 위한 형태
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[제조예 1]
히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1)의 제조
아미노산 서열번호 1의 인간 HAPLN1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CHO-K1 세포에 삽입하여 재조합 인간 HAPLN1 단백질을 생산하는 CHO-K1 세포주를 제작하였다.
상기 아미노산 서열번호 1은 다음과 같다:
MKSLLLLVLISICWADHLSDNYTLDHDRAIHIQAENGPHLLVEAEQAKVFSHRGGNVTLPCKFYRDPTAFGSGIHKIRIKWTKLTSDYLKEVDVFVSMGYHKKTYGGYQGRVFLKGGSDSDASLVITDLTLEDYGRYKCEVIEGLEDDTVVVALDLQGVVFPYFPRLGRYNLNFHEAQQACLDQDAVIASFDQLYDAWRGGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPREPCGGQNTVPGVRNYGFWDKDKSRYDVFCFTSNFNGRFYYLIHPTKLTYDEAVQACLNDGAQIAKVGQIFAAWKILGYDRCDAGWLADGSVRYPISRPRRRCSPTEAAVRFVGFPDKKHKLYGVYCFRAYN
단백질 생산량 및 품질이 우수한 세포주를 MCB(Master Cell Bank)로 선정하였다. 상기 MCB를 계대배양하여 0.40±0.05×106 cells/mL의 농도로 Thermo사의 Hyperforma SUB 250 L 바이오리액터에 접종하고 유가 배양(Fed-Batch Culture) 하였다. 기본 배지로는 22.36 g ActiPro™ 배지 + 0.5846 g 글루타민 + 10.00 g HT Supplement(Thermo Fisher Scientific사) + 4.29 g 10 N NaOH + 1.80 g NaHCO3를 사용하였다. 배양 온도는 36.5℃, 용존산소량(Dissolved oxygen, DO)은 40.0%, pH는 7.00±0.20로 설정하였다. pH 조절 용액으로 1 M 탄산나트륨 일수화물(Sodium Carbonate Monohydrate)을 사용하였다. 공급 배지(feeding medium, FM)로는 181.04 g HyClone™ Cell Boost 7a + 12.28 g 10 N NaOH의 FM020a 및 94.60 g HyClone™ Cell Boost 7b + 105.93 g 10 N NaOH의 FM020b를 사용하였다.
위와 같이 배양된 세포로부터 재조합 인간 HAPLN1 (rhHAPLN1) 단백질을 회수(Harvest and Clarification), 한외여과/투석여과 1 (Ultrafiltration/Diafiltration 1, UF/DF1), 음이온 교환 크로마토그래피, S/D (Solvent/Detergent) 바이러스 불활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 (Mixed-mode Chromatography, MMC), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 한외여과/투석여과 2 (Ultrafiltration/Diafiltration 2, UF/DF2) 및 중간 심층 여과 (Intermediate Depth Filtration, Int. DF) 등의 과정을 거쳐 분리 및 정제하였다. 이하의 실시예에서는 이와 같은 본 발명의 조성물을 이용하였다.
[제조예 2]
HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명 조성물의 제조
상기 제조예 1에서 정제한 HAPLN1 단백질을 20 mM 아세트산 완충액, 8% (w/v) 슈크로스, 0.04% (w/v) PS80, pH 5.0에서 안정화시켜 HAPLN1 단백질 자체를 주된 유효성분으로서 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하였다.
[제조예 3]
HAPLN1 단백질을 코딩하는 유전자를 담고 있는 발현 벡터를 함유하는 본 발명 조성물의 제조
HAPLN1 단백질을 코딩하는 유전자를 담고 있는 발현 벡터를 함유하는 조성물을 jetPRIME Transfection Reagent Kit (PolyPlus사 114-15 제품)을 사용하여 제조하였다. 보다 구체적으로 OriGene사 RC209274 제품을 사용하여 Human HAPLN1을 발현하도록 설계된 플라스미드 벡터를 제조하였다(이하, "Human HAPLN1 ORF Clone"라 함). 이는 host 세포의 핵 내에서 자신이 수송하는 유전자를 발현시킬 수 있다.
참고로 jetPRIME Transfection Reagent Kit는 jetPRIME 완충액과 jetPRIME Transfection 시약으로 구성되며, jetPRIME 완충액은 host 세포로 수송할 플라스미드 벡터를 희석하는 용도이고, jetPRIME Transfection 시약은 플라스미드 벡터를 vesicle(liposome)형태로 포집하여 host 세포 내로 침투되도록 작용한다.
상기 Human HAPLN1 ORF Clone을 jetPRIME 완충액에 희석하여 HAPLN1 단백질을 코딩하는 유전자를 담고 있는 발현 벡터를 함유하는 본 발명 조성물을 제조하였다.
이에 대해 jetPRIME Transfection 시약을 첨가하여 10분간 방치하여 플라스미드 벡터가 vesicle(liposome)형태로 포집되도록 한 후 배양 중인 세포 위에 떨어뜨린다. 세포를 48시간 이상 배양한 후, Human HAPLN1 유전자 발현 증가를 Real-time qPCR로 확인하고, Human HAPLN1 단백질 발현 증가를 Western blot으로 확인하였다.
[실시예 1]
고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명의 조성물(HAPLN1 단백질)의 안구건조증 완화 효과(세포 생존성)의 확인
대부분의 안구건조증은 눈물의 분비가 적거나 눈물의 증발이 많아져서 안구내 수성층의 눈물이 줄어들게 된다. 이때 눈물 속의 단백질, 지질, 탄수화물 등은 일정한 농도를 유지하지만 물은 감소하게 되므로 삼투압이 증가한다. 이러한 원리를 기반으로 세포 수준의 연구에서는 NaCl을 세포 배양액에 첨가하여 삼투압을 조절, 안구건조증 모델을 확립하고 약물의 효능을 평가하므로 본 실시예에서도 314mOsM의 경우 정상 대조군, 상대적으로 높은 삼투압인 450mOsM의 경우를 안구건조증 모델로 설정하고 고삼투압 조건에서 인간 각막 상피 세포에 HAPLN1 단백질이 안구건조증을 완화할 수 있는지 그 효과를 검증하였다. 이는 인간 각막 상피 세포의 세포 생존성(Cell viability)과 관련된다.
본 실험에서는 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)를 이용하였는데 세포 생존성(cell viability)와 세포독성(cytotoxicity) 측정에 사용되는 민감한 발색측정(colorimetric)방법이다. 즉 세포에 대해 수용성이 매우 높은 tetrazolium salt인 WST-8을 가하여 세포 내의 디히드로제나아제 활성을 낮춰서 포르마잔 염료(formazan dye)가 세포내에서 오렌지색을 띄게 한다. 이 염료의 양은 생존 세포의 수와 상관관계를 보여주므로 염료의 양이 많이 보일 수록 생존 세포가 많다는 것을 알 수 있다.
즉 패트리 접시에 상기 인간 각막 상피 세포를 시딩하고 24시간 동안 저삼투압(314mOsM) 조건하에서 인큐베이션하였다. 이후 고삼투압(450mOsM) 조건 하에서 48시간 인큐베이션한 후 PBS 완충액으로 세척하고 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리하였다. 그 다음 추가로 24시간, 48시간 인큐베이션한 후 이들 세포에 대해 CCK-8 키트로 어세이하였다(도 1a). 도 1b 및 도 1c는 도1a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 생존성을 본 발명의 조성물 투여 후 24시간 후(도 1b) 및 48시간 후(도 1c) 각각에 확인한 실험 결과의 그래프이다. 이에 의하면 본 발명의 조성물 중 HAPLN1 단백질을 5에서 100ng/ml 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양한 결과, 전 농도에서 정상 세포군(저삼투압 대조군) 이상 또는 비슷한 CCK-8 흡광도(450nm)를 나타내었다.
참고로 그래프에서 CsA는 대조약물인 Restasis의 주 성분인 Cyclosporin A를 의미하며 본 발명의 조성물은 놀랍게도 그 농도에 무관하게 0.1 내지 0.5μM의 Cyclosporin A 보다 높은 수치를 나타내었다.
이 결과를 통하여 450mOsM 처리에 의해 세포의 생존율이 떨어지지만 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물 처리 그룹에서 생존율이 증가한 것을 확인하였으므로 세포의 생존 증가에 HAPLN1 단백질이 기여한다는 것이 입증되었다. 즉 인간 각막 상피 세포에서의 안구건조증을 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물이 완화할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 2]
고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명의 조성물(HAPLN1 단백질)의 안구건조증 완화 효과(세포 증식 및 이동)의 확인
안구건조증과 관련하여 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물이 안구건조증 완화 효과의 하나로서 세포의 상처 치유능(wound healing)을 유도한다는 점을 세포 증식(cell proliferation) 및 이동(migration) 현상으로 검증하였다.
24 웰에 상기 인간 각막 상피 세포를 시딩하고 24시간 동안 저삼투압(314mOsM) 조건하에서 인큐베이션하였다. 이후 고삼투압(450mOsM) 배지로 교체하여 조건 하에서 48시간 인큐베이션한 후 패트리 접시의 표면을 세로로 긁어서 스크래치를 내고 2회 세척후 고삼투압 배지를 재차 교환함과 동시에 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리하였다(도 2a). 스크래치를 낸 시점 (0h)에서 현미경을 사용하여 사진을 촬영하고 30시간 이후 다시 사진을 촬영하여 스크래치를 냈던 영역의 감소를 확인하였다(도 2b). 이를 이미지화 하고 ImageJ를 이용하여 처음 면적 대비 세포로 채워진 면적의 비율을 확인하였다(도 2c).
도 2b는 본원발명의 도 2a의 실험 계획에 따라 실험을 수행한 결과로서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질의 안구건조증 완화 효과 중 세포 증식 및 이동을 확인한 이미지이며 도 2c는 도 2b의 사진상에 나타난 이동 세포로 덮힌 면적을 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 2b 및 도 2c에 따르면 HAPLN1 단백질을 5에서 100ng/ml로 처리한 경우 전부에서 스크래치 표면을 덮는 세포 증식 및 이동 현상이 나타났으며, 특히 고삼투압 조건임에도 불구하고 5, 10ng/ml의 HAPLN1을 처리한 경우, 스크래치 표면의 약 60%를 덮는 세포 증식 및 이동이 나타났으며 이는 정상세포가 약 82%의 결과를 보이는 것과 비교 시 매우 뛰어난 효능을 나타내는 것이다. 또한 다른 농도에서도 유의하게 효능이 나타남을 확인하였다. 참고로 그래프에서 CsA는 대조약물인 Restasis의 주 성분인 Cyclosporin A를 의미하며 본 발명의 조성물은 놀랍게도 그 농도에 무관하게 0.1μM의 Cyclosporin A 보다 높은 수치를 나타내었다.
[실시예 3]
고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명의 조성물(HAPLN1 단백질)의 염증 완화 효과의 확인 1
본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물이 안구건조증 완화 효과의 하나로서 염증을 완화한다는 점을 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용하여 염증인자(Interleukins, CCL/CXCL family, Chitinase 2-like 1)의 발현양으로 검증하였다.
먼저 6 웰에 상기 인간 각막 상피 세포를 4계대 이후의 것을 시딩하고 24시간 동안 저삼투압(314mOsM) 조건하에서 인큐베이션하였다. 이후 고삼투압(450mOsM) 조건 하에서 48시간 인큐베이션한 후 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물을 농도별로 처리하였다(즉 10μg/ml HAPLN 1μl to 1ml media --> 작동 농도 10ng/ml). 그 다음 추가로 24시간 인큐베이션한 후 이들 세포의 배양액을 수집하고 Human XL cytokine array (R&D Systems. ARY022B)을 이용하여 각 마커의 발현 정도에 대한 어세이를 수행하고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. HAPLN1 단백질의 농도별로 염증 인자의 마커들의 상대적 발현량을 나타낸 도 3b 중의 각각의 그래프에 따르면 450mOsM 고삼투압조건에서 IL-6, IL-17A, CCL20, CXCL10, CCL5, CD54, CD176 등 염증관련인자들의 분비가 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나 본 발명의 조성물에 있어서 HAPLN1 단백질 함량 10 내지 100ng/ml에서 비처리군에 비하여 염증 인자의 발현량이 적다는 것, 즉 세포의 염증이 완화되었다는 것을 알 수 있다. 다시 말하여 정상 세포에서 상기 인자의 발현량을 1.0으로 보았을 때 비정상군의 발현량은 1 이상으로 모두 증가하지만 본 발명의 rhHAPLN1 재조합단백질 포함 조성물의 처리시에는 각종 염증 인자의 발현량을 정상군 수준 또는 그 이하로 떨어뜨린 것을 보여준다. 특히 MIP-3α/CCL20과 IP-10/CXCL10은 고삼투압(450mOsM) 조건 하에서 염증 인자의 발현량이 상당히 높다. 그러나 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물의 처리시 각종 염증 인자, IL-6, IL-17A, MIP-3α/CCL20과 IP-10/CXCL10, RANTES5/CCL5, ICAM-1/CD54, Fas ligands/CD178 등을 낮춰 줄 수 있음을 확인하였으며, IL-17A, Fas ligand/CD178, FGF-7, FGF-19, Angiogenin, RBP-4 및 Chitinase 3-like 1의 경우 정상 세포 수준으로 떨어뜨린 것을 확인하였다.
이 결과를 통하여 인간 각막 상피 세포에 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물이 안구건조증 완화의 일환으로 세포의 염증을 완화한다는 점을 검증하였다.
[실시예 4]
고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명의 조성물(HAPLN1 단백질)의 염증 완화 효과의 확인 2
실시예 3에서 변화의 폭이 가장 컸던 CCL-20의 발현에 있어서 HAPLN1 단백질을 포함한 본 발명의 조성물의 효과를 재확인하기 위해 농도를 보다 세분화하여 ELISA 실험법을 수행하였다(도 4a). 또한, 염증인자 발현에 있어서 중요한 전사인자인 NFκB의 활성을 Western blot으로 확인하였다(도 4b). 실험 준비방법은 앞에서 수행하였던 Cytokine array와 같은 조건으로 진행하였고 ELISA 실험법은 제조사의 방법을 따랐다.
앞서 수행하였던 Cytokine array의 결과와 유사하게 ELISA 실험법을 이용한 결과에서, 450mOsM 고삼투압조건에서 염증 인자 CCL20의 분비가 거의 4배로 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 4a). 그러나 본 발명의 HAPLN1 단백질 포함 조성물이 5, 10, 20, 50 및 100ng/ml에서는 HAPLN1 단백질의 비처리군에 비하여 염증 인자의 발현량이 상대적으로 적다는 것, 즉 세포의 염증이 크게 완화되었다는 것을 알 수 있다.
또한 염증인자의 발현 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 전사인자인 NFκB의 인산화(phosphorylation)가 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물에 의해 감소함을 확인할 수 있었다(도 4b).
이 결과를 통하여 인간 각막 상피 세포에서 HAPLN1 단백질을 포함한 본 발명의 조성물이 안구건조증 완화의 일환으로 NFκB의 활성 억제를 통해 세포의 염증을 완화한다는 점을 재차 검증하였다.
[실시예 5]
In vitro 모델에서 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명이 조성물(HAPLN1 단백질)의 안구건조증 완화 효과(뮤신의 증가)의 확인 1
뮤신(mucin)은 점액소라고도 하며 끈적끈적한 액체로서 주로 점액다당류와 당단백으로 구성되어 있다. 안구건조증은 술잔세포(Goblet cell)의 감소를 유발하며 이는 젤-형성 뮤신의 분비의 감소와 밀접한 연관성이 있으므로 안구건조증의 중요한 표지인자이다. 뮤신의 종류는 두가지가 있는 바 제1군은 막 연관 뮤신(membrane associated mucin (MAM))으로서 MUC3A/B, MUC4, MUC11/12, MUC16, MUC17등이 대부분이며, 제2군은 분비되는 뮤신으로서 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC19 등이다. 제1군의 MAM에 속하는 뮤신들은 mucus gel을 형성하는데 상대적으로 기여도가 낮으며 제2군의 분비되는 뮤신이 gel-forming 형태를 구성하는데 중요하게 작용한다. 제2군의 분비되는 뮤신은 주로 술잔 세포와 같은 특별한 세포에서 합성 및 분비되는 폴리머, 거대분자(macromolecule)이며, MUC5AC는 결막세포에서 그 발현이 확인되었다. Glycocalyx mucins의 발현은 안구건조증과 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(doi:https://doi.org/10.1167/iovs.17-23756).
본 실시예는 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물이 MAM과 분비되는 뮤신의 발현이 모두 증가되는지를 확인하고 이에 따라 본 발명의 조성물이 안구건조증의 완화 효과를 나타낸다는 점을 검증하기 위한 것이다.
먼저 HCEC(인간 각막 상피세포, 5계대)는 각막 상피세포 기저배지를 이용하여 3.7 x 105 세포/웰로 6개의 웰에 시딩하였다. 24시간 후, HCEC는 서로 다른 삼투압(314, 450mOsM)의 배지로 전처리되었다. 48시간 인큐베이션 후 본 발명의 조성물을 rhHAPLN1(0, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/ml)의 농도 별로 또한 대조약물인Cyclosporine A(0.1 μM)를 24시간 동안 처리하였다. 이후 세척하고 샘플링하여 RT- qPCR을 수행하였다(도 5a).
총 mRNA는 Qiagen kit를 사용하여 HCEC 세포로부터 정제되었다. cDNA는 iscript cDNA 합성 키트를 사용하여 합성하였다. 그 후, RT-qPCR를 수행하고 결과 데이터를 상대적 발현량(배수)으로 표시하였다(도 5b - 5c).
결과에 따르면 안구건조증 유발 모델에서는 MUC4 및 MUC16의 발현량이 정상군에 비하여 감소하였지만 MUC4의 경우 10에서 200ng/ml, 특히 50에서 200ng/ml의 HAPLN1 단백질을 포함한 본 발명의 조성물로 처리되었을 때 비처리군에 비하여 MUC4의 발현량이 크게 증가되었다는 것을 나타낸다(도 5b). 또한 MUC16의 경우 20에서 200ng/ml, 특히 50에서 200ng/ml의 HAPLN1 단백질을 포함한 본 발명의 조성물로 처리되었을 때 비처리군에 비하여 MUC4의 발현량이 크게 증가되었다는 것을 나타낸다(도 5c).
이 결과를 통하여 인간 각막 상피 세포에 HAPLN1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물이 안구건조증 완화의 일환으로 각종 뮤신의 발현을 증가시킨다는 점이 입증되었다.
[실시예 6]
In vitro 모델에 대해 고삼투압 조건 하 인간 각막 상피 세포(Human Corneal Epithelial Cell, HCEC)에서 본 발명의 조성물(HAPLN1 단백질)의 안구건조증 완화 효과(뮤신의 증가)의 확인 2
뮤신의 발현과 관련하여 술잔세포에서의 MUC5AC 분비는 눈물막을 유지하는데 중요한 조건이라 할 수 있다. 즉 술잔세포는 눈물막 유지에 필수적인 Mucin Glycocalix를 분비하는 세포로 잘 알려져 있고 건성안에서는 그 수가 감소하는 것으로 알려져 있다. MUC5AC는 술잔세포의 마커로도 잘 알려져 있다.
먼저 4계대배양의 HConEpiC (human Conjunctiva epithelial cell)을 24 웰에 시딩하고 24시간 배양하고 난 후, 450mOsM 고삼투압 처리와 동시에 HAPLN1 단백질의 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/ml)를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 Cyclosporine A(0.1 μM)를 처리했다. 72시간 배양 후 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정하고 완충액으로 세척하였다. 이후 Anti-MUC5AC를 이용하여 형광염색법 수행하였다(DAPI는 핵을 표지).
실험 결과로서 도 6a는 MUC5AC의 단백질 발현과 분비를 나타낸 형광 사진이며 도 6b는 도 6a에서처럼 MUC5AC가 분비되는 세포의 수를 정량하여 나타낸 그래프이다. 이에 따르면 본 발명의 조성물을 HAPLN1(10, 20, 50, 100, 200 ng/ml)의 농도 별로 처리한 경우 전부에서 오히려 정상 대조군에 비해 MUC5AC를 분비하는 세포의 수가 확연히 많았으며 농도에 따라서는 심지어 Cyclosporine A(0.1 μM, 즉 120.261ng/ml)를 처리한 경우보다 많았다.
[실시예 7]
본 발명의 HAPLN1 단백질 함유 점안제제의 제조
본 발명의 주성분인 HAPLN1 단백질 이외에는 하기 표 1의 성분으로 통상의 점안제제 제조방법에 따라 점안제제를 각각 제조하고 본원 조성물의 기능을 제대로 나타내는지를 구조적분석(UPLC), 기능적분석 (Linking ability assay), 가속 가혹조건 및 안정성 테스트의 각종 시험을 통해 확인하였다. 그 결과에 따라 본 발명의 HAPLN1 단백질 함유 약학 조성물을 하기 표 2의 점안제제의 제형 3종으로 제조하였다. 여기서 점도조절제로 카복시메틸셀룰로오스 나트륨 (CMC-Na), 완충제로 Tris HCl 삼투압 조절제, 등장화제로 NaCl을 선정하여 제제를 확립하였다.
각각의 본 발명의 조성물 내에서 HAPLN1 단백질의 농도는 제조예 1, 2 및 3과 같으며 각각 저농도(0.5μg/ml), 중농도(5μg/ml), 및 고농도(50μg/ml)의 3종이었으며 전부 투명한 용액이었다.
| 점도조절제 | PVA (Polyvinyl alcohol) |
| Poloxamer | |
| PVP K-30 | |
| 카복시메틸셀룰로오스 나트륨 | |
| 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 | |
| 안정제 | 에데트산나트륨 |
| 리신 | |
| 아르기닌 | |
| HP-ß-CD | |
| 소르비톨 | |
| 완충제 | 아미노카프로산 |
| 보존제 | 염화벤잘코늄 |
| 등장화제 | 염화나트륨 |
| 만니톨 | |
| pH조절제 | 0.01M NaOH |
| 0.01M HCl |
| 첨가제 | 목적 | 제조예 1 | 제조예 2 | 제조예 3 | 단위 |
| HAPLN1 단백질 (pH 8.0) |
유효성분 | 0.5 | 5.0 | 50 | μg/ml |
| 삼투압 | 240-290 | 267 | 267 | 279 | mOsM/kg |
| CMC-Na | 점도조절제 | 10 (w/v%) | mg/ml |
||
| Tris HCl | 완충제 | 5 | mM |
||
| NaCl | 삼투압조절제 | 125 | mM |
||
| Tween80 | 안정화제 (계면활성제) |
0.025 | % | ||
| pH | ~7.4 | 7.72 | |||
* CMC-Na (Sodium carboxymethyl cellulose): 수분을 끌어들여 눈물층을 두텁게 하여 주고 안구 표면을 코팅해주는 성분 * 첨가조성 중 나머지 성분은 멸균증류수를 사용함.
[실시예 8]
In vivo 건성안 모델에서 본 발명의 HAPLN1 단백질 함유 점안제제의 효능 평가 1
상기 실시예 7에서 제조한 제조예 1, 2 및 3의 조성물에 대하여 마우스의 안구에 대해 저습도 + 스코폴라민 유도 안구건조증(DED) 모델을 이용하여 각막 형광 점수 어세이(Corneal Fluorescein Scores)와 눈물량 분비(Tear volume) 어세이를 각각 수행하였다.
1.저습도 + 스코폴라민 유도 안구건조증 모델
Mouse, C57BL/6, female, 암컷 96마리 8주령 입수
안구건조증 시험개시시 동물 수 주령 : Mouse, C57BL/6, female, 암컷 58마리 10주령
동물 입수 시 공급처에서 제공한 시험계의 미생물모니터링 성적서를 참조하고 입수시에 외관을 관찰하여 검수검역을 실시하였다. 외관적으로 이상이 없는 동물들을 사육구역으로 반입하여 시험을 실시하는 동물실내에서 2주일간 순화시켰다. 2주일간의 검역·순화 기간을 거치며 건강 및 실험의 실시에 적합성 여부를 확인하여 건강한 동물을 선별하였다. 검역 및 순화 기간 중 이상이 없는 동물만을 사용하여 안구건조증을 유도하고 각막 형광 염색(corneal fluorescein stain)을 통하여 각막 손상 정도를 평가하고, 임상 점수(clinical score)에 따라 Z-배열법으로 시험군을 분리하였다. 안구건조증 시험그룹은 각막 형광 염색의 점수(corneal fluorescein stain score) 7~15점 사이의 안구를 대상으로 구성하며, sham (normal) 그룹의 경우 각막 형광 염색의 점수 5점 이상의 안구를 제외하고 구성하였다. 참고로 대조물질로는 T세포 생성을 억제시켜주는 면역억제제로서 레스타시스 0.05% 5uL 투여하였고, 농도는 500 μg/mL이었다.
2. 안구건조증의 유도
시험동물을 상대습도 30% 이하의 desiccating stress chamber에서 사육을 하면서 saline (0.9% normal saline, 중외제약)에 2.5 mg/mL의 농도로 조제한 scopolamine hydrobromide (S0929, Sigma-aldrich)를 10 mL/kg의 용량으로 10일간 1일 4회(QID; 오전 09:30, 오후 12:00, 오후 15:00, 오후 17:30)에 피하 주사하여 안구건조증을 유발시켰다. 피하주사는 반복 투여에 의한 손상을 최소화하기 위하여 등쪽에서 투여 위치를 옮겨가며 실시하였다. 시험물질 투여 시작 후 안구건조증을 유지하기 위하여 마우스를 상대습도 30% 이하의 조건에서 사육하면서 scopolamine을 매일 1회(QD; 오전 09:30)에 목 주위 피하에 주사하여 안구건조증을 유지하였다.
3. 투여 방법 및 투여 횟수
군 분리 다음날부터 시험물질 및 대조물질을 1일 2회 (BID; 오전 09:30 및 오후 17:30) 각각 한 방울(5 μl)씩 양안에 마이크로피펫으로 점안 투여하였다(도 7a).
4. 각막 형광 점수 어세이(도 7b)
(1) 산동제(트로페린)을 한방울 점안하여 동공을 크게 유도하고 남아있는 산동제는 면봉을 안각 끝부분에 대고 제거하였다.
(2) 0.2% fluorescein sodium salt를 양안에 각각 10μl씩 점안하여 각막의 손상부위를 형광염색하였다.
(3) 생리식염수로 안구를 가볍게 세척한 뒤 blue light 하에서 각막의 이미지를 촬영하고, NIE (National Institute of Eye) 가이드라인에 따라 각막의 영역을 5영역으로 나누어 한 영역당 0-3점의 점수로 기록하고 그 값을 합산하여 형광 점수(fluorescein score)를 산출하였다.
5.눈물량 분비 어세이(도 7c)
(1) 마우스의 전신마취를 유도하였다(10mg/kg 자일라진, 100mg/kg 케타민 복강주사).
(2) 오전 (09:30)에 scopolamine hydrobromide을 투여하고 약 3시간 후에 이하의 측정을 실시하였다.
(3) 눈물의 양은 ½ 두께로 절단한 Schirmer’s test strip을 이용하여 측정하였는데, Schirmer test strip은 하안검 안쪽에서 접촉할 수 있도록 설치하며, 5분동안 눈물이 흡수될 수 있도록 유지하였다. 이후 해당 안구에 생리식염수 한방울(5μl)을 떨어뜨렸다.
(4) Strip의 젖은 부위의 길이를 자로 측정하였다.
6. 실험 과정의 상세
가. 체중 측정
모든 동물에 대하여 군 분리 시점(Day 0)과 매 평가 시점(투여 시작 후 6일, 11일 및 16일)마다 평가 전에 체중을 측정하였다.
나. 일반 증상 관찰
모든 동물에 대하여 시험물질 투여 시점부터 시험 종료 시점까지 매일 1일 1회 이상 안구의 상태 관찰을 포함한 임상 관찰(cage-side observation)을 실시하였다.
다.눈물 양 측정(Schirmer’s test) 및 임상학적 각막손상 평가(corneal fluorescein score)
Desiccating stress와 scopolamine hydrobromide 투여에 의한 안구건조증 유발 후, 군 분리 시점(Day 0)과 시험물질 투여 후 6일, 11일 및 16일에 마우스를 10 mg/kg 자일라진(럼푼® 바이엘)과 100 mg/kg 케타민(케타민®, 유한양행)을 복강주사하는 방법으로 전신 마취를 유도한 후 평가를 실시하였다. 마취가 충분히 유도되지 않는 경우, 초회 마취를 유도한 용량의 1/3 마취제를 마우스 대퇴부에 근육주사하는 방법으로 추가 마취를 실시하였다(주사 마취제의 특성상 마취 유도과정에서 마취사하는 동물이 발생할 수도 있다). 평가는 오전(09:30)에 scopolamine hydrobromide을 투여하고 약 3시간 후에 실시하였다. 눈물양은 1/2 두께로 절단한 Schirmer’s test strip (Bio Color Tear Test®, Bio Optics)을 이용하여 측정한다. Schimer’s test strip은 하안검 안쪽에서 접촉할 수 있도록 설치하였으며, 5분 동안 눈물이 흡수될 수 있도록 유지하고 평가가 종료된 이후 해당 안구에 생리식염수를 한 방울(5 uL) 떨어뜨렸다. Schimer’s test strip의 젖은 부위(염색된 부분)의 길이는 자를 이용하여 측정하였다. 이후 산동제(트로페린®, 한국알콘)를 한방울 점안하여 산동을 유도하고, 안구에 남아 있는 산동제는 한 면봉을 안각 끝부분에 대고 빨아드리는 방법으로 제거하였다. 이어서 0.2% fluorescein sodium salt (후루오레사이트®, 한국알콘)를 양안에 각각 10 μL씩 점안하여 각막의 손상 부위를 형광 염색하였다. 그리고 생리식염수로 가볍게 안구를 세척한 뒤 blue light 하에서 각막의 이미지를 촬영(Micron-IV®, Phoenix)한 후, NIE (National Institute of Eye) 가이드라인에 따라 각막의 영역을 5 영역으로 나누어 한 영역 당 0-3점의 점수로 scoring하고 그 값을 합산하여 fluorescein score를 산출하였다. 마취부터 눈물 양 측정 및 CFS 평가는 15분 이내에 완료하며, 평가가 종료되면 마우스 안구에 항생제 점안액(토베란 점안액®, 대우제약)을 한 방울 점안하였다.
라. 안구 적출
투여 시작 후 18일에 양안의 lacrimal gland와 cornea, conjunctiva 및 meibomian gland (meibomian gland 포함 하안검)을 샘플링 한 후 냉동 상태로 의뢰자에 제공하였다. 단, 의뢰자의 요청이 있는 경우, 상술한 방법 대신 상하안검이 포함되도록 양안을 적출하여, Davidson’s sol.과 포르말린으로 고정한 후 파라핀 조직 슬라이드로 제작할 수도 있다.
마. 자료의 통계처리
실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하고 GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, CA)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대한 정규성 검정은 Shapiro-wilk normality test를 시행하였다. 정규분포를 따르는 경우에는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군(부형제군)과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Tukey’s multiple comparison test를 실시하며, 정규분포를 따르지 않는 경우는 Kruskal Wallis test를 실시하고 Dunn’s multiple comparisons test로 사후검정을 실시하였다(유의수준: 양측 5% 및 1%).
7. 실험 결과
(1) 마우스 건성안 모델에서의 각막 형광 점수(CFS)로 각막의 손상 정도 평가
각막 형광 점수 어세이의 영상 결과는 도 8a에 나타내었다. 여기서 Sham은 안구건조증을 유발하지 않은 정상 대조군 모델에 해당하며, DED control은 안구건조증을 유발하고 약물이 포함되어 있지 않은 비히클을 처리한 비처리 대조군 모델에 해당하며, Cyclosporine A는 종래의 치료제로서 처리한 예를 나타낸다. rhHAPLN1(0.5μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 1, rhHAPLN1(5μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 2, 및 rhHAPLN1(50μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 3을 처리한 예를 각각 나타낸다.
여기서는 상기 3.에서와 같이 군 분리 다음날부터 시험물질 및 대조물질을 1일 2회 (BID; 오전 09:30 및 오후 17:30) 각각 한 방울(5 μl)씩 양안에 마이크로피펫으로 점안 투여하였다.
상기 각막 형광 점수 어세이의 결과를 수치화하여 그래프로서 도 8b에 나타내었다.
투여 결과에 따르면 안구건조증 모델에서 증가한 CFS 수치가 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 무관하게 일관되게 감소하였으며, 특히 11일이후에는 Cyclosporine A(대조약물인 Restasis의 주 성분)보다 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 CFS 수치를 더 많이 감소시켰다.
(2) Mouse 건성안 모델에서의 눈물 양 평가
눈물 부피 어세이의 결과는 수치화하여 도 8c에 나타내었다.
투여 결과에 따르면 안구건조증 모델에서 감소된 눈물양이 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 무관하게 Cyclosporine A(대조약물인 Restasis의 주 성분)보다 더 일관되게 증가하였으며, 특히 11일이후에는 Cyclosporine A보다 훨씬 더 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 눈물량을 증가시켰다.
(3) 각막 상피 세포의 박리 평가
약물 처리 16일후 2일 째에 안구를 적출하였고 파라핀 블럭화를 진행하였고 제작된 슬라이드에서의 H & E(hematoxylin and eosin) staining을 통해 조직을 염색하였다(도 9a). 박리(Detachment)된 각막 상피세포(Corneal Epithelial cell)의 수를 측정하고 수치화하였다(도 9b).
그 결과 안구건조증 모델에서는 손상된 각막 상피 세포의 수가 증가되었다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 무관하게 손상된 세포의 수가 감소되었음을 확인하였다.
(4) 술잔 세포의 증감 평가
약물 처리 16일 째에 안구를 적출하였고 파라핀 블럭화를 진행하였고 제작된 슬라이드에서의 PAS staining을 통해 조직을 염색하였다(도 10a). PAS staining은 술잔세포를 특이적으로 염색하는데, 술잔세포에는 mucopolysaccharides, mucoprotein이 많이 존재하므로 이들의 α=glycol기가 과요오드산(periodic acid)에 의해 산화되어 알데히드를 생성하고, 이것이 Schiff reagent와 반응하여 붉은 자주색으로 염색되게 된다는 원리에 의한 것이다.
여기서 결막에 존재하는 술잔세포의 수를 측정하고 수치화하였다(도 10b). 그 결과 안구건조증 모델에서는 손상된 술잔 세포의 수가 감소되었다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 무관하게 술잔 세포의 수가 건성안 모델보다 크게 증가하였으며 정상 Sham 대조군에 상당하는 수준임을 확인하였다.
(5) 눈물샘(Lacrimal gland)에서의 항염증 작용 평가 1
안구건조증이 유도되면 안구와 눈물샘에서 염증반응이 유도되게 되고 염증반응의 대표적인 cytokine인 IL-1β의 증가와 더불어 면역세포의 침습이 일어나게 된다.
본 실시예에서는 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물의 항염증 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 눈물샘에서 IL-1β의 발현을 Immunohistochemistry를 통해 확인하고자 하였다. 이를 위해 약물 처리 16일 후 2일 째에 안구를 적출하였고 파라핀 블럭화를 진행하였다. 제작되어진 슬라이드를 이용하여 IHC를 진행하고 Anti-IL1β 항체를 사용하여 IL-1β의 발현(갈색)을 확인하였다(도 11a). 도 11b는 도 11a에서 확인된 IL-1β의 발현양을 정량하여 나타낸 그래프이다.
그 결과 안구건조증 모델에서는 눈물샘에서 IL-1β의 발현이 증가하였다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 HAPLN1 5μg/ml 이상의 농도에서 정상세포에 상당하는 sham 대조군의 수준으로 IL-1β의 발현이 감소하였다. 이는 본원 발명 조성물의 항염증 효과를 입증하는 것이다.
(6) 눈물샘(Lacrimal gland)에서의 항염증 작용 평가 2
안구건조증이 유도되면 안구와 눈물샘에서 염증반응이 유도되게 되고 면역세포에서의 염증 마커인 CD45의 세포 표면에서의 발현 증가는 면역세포의 침습을 보여주는 것이다.
본 실시예에서는 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물의 항염증 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 눈물샘에서 CD45의 발현 여부를 확인하였다. 즉 약물 처리 16일 후 2일 째에 안구를 적출하였고 파라핀 블럭화를 진행하였다. Section slide에서 IHC-IF를 수행하고 Anti-CD45 항체를 사용하여 CD45의 발현(녹색)을 확인하였다. 도 12b는 도12a의 발현량을 정량하여 나타낸 그래프이다.
그 결과 안구건조증 모델에서는 눈물샘에서 CD45의 발현이 증가하였다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 CD45의 발현이 감소하였으며 특히 Cyclosporine A(대조약물인 Restasis의 주 성분)보다 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 CD45의 발현량을 더욱 감소시켰다. 이는 본원 발명 조성물의 항염증 효과를 입증하는 것이다.
(7) 눈물샘(Lacrimal gland)에서의 항염증 작용 평가 3
안구건조증이 유도되면 안구와 눈물샘에서 염증반응이 유도되게 되고 면역세포에서 염증 마커인 CD11b의 발현 증가는 면역세포의 침습을 보여준다.
본 실시예에서는 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물의 항염증 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 눈물샘에서 CD11b의 발현 여부를 확인하였다. 즉 약물 처리 16일 후 2일 째에 안구를 적출하였고 파라핀 블럭화를 진행하였다. Section slide에서 IHC-IF를 수행하고 Anti-CD11b 항체를 사용하여 CD11b의 발현(녹색)을 확인하였다. 도 13b는 도13a의 발현량을 정량하여 나타낸 그래프이다(도 13b).
그 결과 안구건조증 모델에서는 눈물샘에서 CD11b의 발현이 증가하였다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 CD11b의 발현이 감소하였으며 특히 Cyclosporine A(대조약물인 Restasis의 주 성분)보다 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 CD11b의 발현량을 훨씬 더 감소시켰다. 이는 본원 발명 조성물의 항염증 효과를 입증하는 것이다.
[실시예 9]
In vivo 건성안 모델에서 본 발명의 HAPLN1 단백질 함유 점안제제의 효능 평가 2
상기 실시예 7에서 제조한 제조예 1, 2 및 3의 조성물에 대하여 토끼의 안구에 대해 0.1% BAC(Benzalkonium chloride, 염화벤잘코늄) 유도 안구건조증(DED) 모델을 이용하여 각막 형광 점수 어세이(Corneal Fluorescein Scores)와 눈물량 분비(Tear volume) 어세이를 각각 수행하였다.
1.토끼에 대한 안구건조증 모델의 수립
하기 실험의 수순으로 토끼에 대해 안구건조증을 유발한 모델을 수립하고 본원발명의 조성물의 효능을 검증하였다(도 14)
(1) 안구건조의 유도
토끼의 양쪽 눈에 일 2회(9:00, 17:00)에 걸쳐 0.1% BAC(Benzalkonium chloride, 염화벤잘코늄) 1방울(0.05 ml)을 점안하여 14일간 점안한 뒤 안검사(Day 14) 하여 안구건조가 유도된 것을 확인하고, 군을 분리하였다.
(2) 시험물질의 점안
위 모델 토끼에 대해 일 2회(8:30, 16:30)에 걸쳐 군별로 시험물질을 점안하였다(Day 15~30 (총 16일간 점안)).
실험동물: New Zealand white rabbit 42마리 (Male, 개별 사육)
군 분 리:
G1. No DED with vehicle (안구건조 미유발군)
G2. DED with vehicle (안구건조 유발군)
G3. DED with Restasis (Cyclosporine)
G4. DED with 시험물질 (0.5μg/ml HAPLN1 Dose-1)
G5. DED with 시험물질 (5μg/ml HAPLN1 Dose-2)
G6. DED with 시험물질 (50μg/ml HAPLN1 Dose-3)
* 모든 군은 군별 점안 16일 후 2일째 안락사
* 모든 군은 일 2회 군별 점안
총 42마리의 토끼 사용 (각 그룹당 7마리)
(3) 안 검사
토끼에 대해 Xylazine, Ketamine을 각각 근육주사하여 마취를 유도하고, 알카인 1방울 점안 후 Weck cel cellulose spear로 여분의 눈물 및 점안액을 제거하였다. STT paper를 하안검에 걸친 뒤 5분간 젖은 부분의 길이를 측정하였다(STT-2). 또한 TFBUT(Tear Film Break Up Time, 눈물막 파괴 시까지 걸리는 시간 측정)를 측정하여 눈물막의 안정성을 검사하였다. 나아가 슬릿 검사를 통해 각막 상태 및 형광염색 여부를 확인하였다.
(4) 샘플 채취 및 분석
상기 토끼들에 대해 결막을 포함하여 안구를 적출한 뒤 특수 고정액에 고정하여 파라핀 포매하고, 박절 후 목적에 맞추어 염색 및 분석을 진행하였다. 이 때 안구는 H & E (Hematoxylin & Eosin) 염색 후 각막 상피 조직의 분리(Detachment) 여부를 분석하였다. PAS 염색 후 결막 내 술잔세포의 분포를 계측하였다. 또한 결막 상피 압흔 후(Impression Cytology) PAS 염색, 술잔세포 (Goblet cell) 분포도 계측하였다.
2. 실험 결과
(1) 각막 형광 점수(CFS)로 각막의 손상 정도 평가
각막 형광 점수 어세이의 영상 결과는 도 15a에, 이를 수치화한 그래프는 도 15c에 나타내었다. 투여 결과에 따르면 안구건조증 모델에서 증가한 CFS 수치가 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 무관하게 일관되게 감소하였으며, 특히 10일이후에는 Restasis보다 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 CFS 수치를 훨씬 더 감소시켰다.
(2) 눈물막의 안정성 향상에 관한 본원발명의 조성물의 효능 평가
본 실시예에서는 안구에 Sodium Fluorescein을 한방울 떨어뜨린 다음 형광염색부위에서 검은 스팟이 나타날 때까지의 시간을 측정하는 방법을 사용하였는데 상기 검은 스팟은 눈 깜빡임 이후에 몇 초 이내로 나타날 수 있으며 이는 안구건조증 상황에서 매우 빠르게 나타난다. 즉 이는 TFBUT(Tear Film Break Up Time, 눈물막 파괴 시까지 걸리는 시간 측정)를 측정하여 눈물막의 안정성을 검증하는 것이다.
시료 별로 눈물막 파괴 시까지 걸리는 시간 측정을 측정하여 그래프로서 실험 결과를 나타내었다(도 15b). 여기서 Sham은 안구건조증을 유발하지 않은 정상 대조군 모델에 해당하며, DED control은 안구건조증을 유발하고 약물이 포함되어 있지 않은 비히클을 처리한 비처리 대조군 모델에 해당하며, Restasis(유효 성분은 Cyclosporine A)는 종래의 치료제로서 처리한 예를 나타낸다. HAPLN1(0.5μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 1, HAPLN1(5μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 2, 및 HAPLN1(50μg/ml)은 본 발명의 조성물인 제조예 3을 처리한 예를 각각 나타낸다. 도 15a에서 HS-601은 본원 발명의 HAPLN1 단백질 함유 조성물의 실험명을 나타낸다.
도 15b에서 보는 바와 같이 투여 결과에 따르면 안구건조증 모델에서는 눈물막 파괴시까지의 시간이 10초 이하로 매우 짧았으나 본원발명의 조성물 투여시 그 시간이 지속적으로 증가하였으며 특히 10일 이후에는 HAPLN1의 농도에 무관하게 Restasis보다 더 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 눈물막 파괴시까지의 시간을 증가시켰다. 특히 HAPLN1 단백질의 고농도(50μg/ml)에서는 30초 이상으로 그 시간이 증가된 것을 확인할 수 있다.
(3) 토끼 건성안 모델에서의 눈물 양 평가
눈물량 분비 어세이의 결과는 수치화하여 도 15d에 나타내었다.
투여 결과에 따르면 안구건조증 모델에서 감소된 눈물양이 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시, 5일 째부터 농도 의존적으로 대조약물인 Restasis보다 더 일관되게 눈물량이 증가하였으며, 특히 10일 이후에는 Restasis보다 훨씬 더 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물이 눈물량을 증가시켰다.
(4) 각막 상피 세포의 박리 상태 평가
15일의 안 검사 이후 약물 처리 16일 후 1일 째에 안구를 적출하여 조직 병리 분석을 행하고 파라핀 블럭화를 진행하였다. Section slide에서 H & E staining을 통해 조직을 염색하였다(도 16a). 200μm2의 범위에서 박리(Detachment)가 일어난 각막 상피세포(Corneal Epithelial cell)의 수를 측정하고 수치화하였다(도 16b).
그 결과 안구건조증 모델에서는 박리된 즉 손상된 각막 상피 세포의 수가 증가되었다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 농도 의존적으로 박리된 세포의 수가 감소되었음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물 중 HAPLN1 단백질이 고농도(50μg/ml)로 함유된 경우 그 박리의 정도가 가장 낮았다.
(5) 토끼 건성안 모델에서의 술잔 세포의 증감 평가
15일의 안 검사 이후 약물 처리 16일 후 1일 째에 안구를 적출하여 조직 병리 분석을 행하고 파라핀 블럭화를 진행하였다. Section slide에서 PAS staining을 통해 조직을 염색하였다(도 17a). 200μm2의 범위에서 술잔세포의 수를 측정하고 수치화하였다(도 17b).
그 결과 안구건조증 모델에서는 손상된 술잔 세포의 수가 극도로 감소되었다. 그러나 HAPLN1 단백질을 함유하는 본 발명의 조성물 처리시 그 농도에 비례하여 술잔 세포의 수가 안구건조증 모델보다 확연히 증가되었음을 확인하였다. 다만 본 발명의 조성물 중 HAPLN1 단백질이 고농도(50μg/ml)로 함유된 경우 대조약물인 Restasis보다 술잔 세포의 수가 훨씬 증가되었음을 확인하였다.
상기한 바와 같이 본 발명의 약학적 조성물 및 치료 방법에 의하면 안구건조증을 효과적으로 또한 안정적으로 예방 및 치료할 수 있으며 종래의 제품에 비하여 감소된 부작용을 나타낸다.
서열번호 1:
MKSLLLLVLISICWADHLSDNYTLDHDRAIHIQAENGPHLLVEAEQAKVFSHRGGNVTLPCKFYRDPTAFGSGIHKIRIKWTKLTSDYLKEVDVFVSMGYHKKTYGGYQGRVFLKGGSDSDASLVITDLTLEDYGRYKCEVIEGLEDDTVVVALDLQGVVFPYFPRLGRYNLNFHEAQQACLDQDAVIASFDQLYDAWRGGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPREPCGGQNTVPGVRNYGFWDKDKSRYDVFCFTSNFNGRFYYLIHPTKLTYDEAVQACLNDGAQIAKVGQIFAAWKILGYDRCDAGWLADGSVRYPISRPRRRCSPTEAAVRFVGFPDKKHKLYGVYCFRAYN
MKSLLLLVLISICWADHLSDNYTLDHDRAIHIQAENGPHLLVEAEQAKVFSHRGGNVTLPCKFYRDPTAFGSGIHKIRIKWTKLTSDYLKEVDVFVSMGYHKKTYGGYQGRVFLKGGSDSDASLVITDLTLEDYGRYKCEVIEGLEDDTVVVALDLQGVVFPYFPRLGRYNLNFHEAQQACLDQDAVIASFDQLYDAWRGGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPREPCGGQNTVPGVRNYGFWDKDKSRYDVFCFTSNFNGRFYYLIHPTKLTYDEAVQACLNDGAQIAKVGQIFAAWKILGYDRCDAGWLADGSVRYPISRPRRRCSPTEAAVRFVGFPDKKHKLYGVYCFRAYN
Claims (15)
- 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자에 관한 핵산이 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 안구에서 세포의 상처 치유능을 유도하는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 각막 상피 세포의 염증 인자의 발현을 감소시키는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 뮤신의 발현량을 증가시키는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물의 1회 국소 투여량이 1ng/ml 내지 100μg/ml인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 점안액, 인공눈물, 안 연고, 정제, 알약, 캡슐, 트로키제, 흡입제, 주사제, 패치제, 좌약으로 이루어진 군에서 선택되는 제형인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여용도인 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 약학적 첨가제를 더 포함하는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 안구건조증을 예방 또는 억제하기 위한 조성물의 추가적인 성분으로서 포함되는 것인 조성물.
- 청구항 1, 또는 청구항 3 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 투여 지침을 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료용 키트.
- 삭제
- 삭제
- 히알루론산과 프로테오글리칸 연결 단백질 1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1; HAPLN1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하여 이를 필요로 하는, 인간을 제외한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 안구건조증을 예방 또는 억제하는 방법.
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