JP2022535089A - 生物活性剤及びそれに関連した方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、1つ以上の細胞、例えば1つ以上の細胞シグナル伝達ポリペプチドの存在下において、細胞外マトリックスから得られた1つ以上の生物活性剤の検出、同定、及び使用のための方法、並びに該生物活性剤に関する。このような生物活性剤を利用する、研究法、診断法、及び治療法も提供される。
Description
技術分野
本発明は、治療剤を含む生物活性剤、及び、選択された生物学的試料中でそれを同定する方法に関する。より特定すると、該方法は、インビトロで細胞外マトリックス、例えば無細胞細胞外マトリックス又は脱細胞化細胞外マトリックスと相互作用し、それによって、該相互作用により、治療に有効である可能性を有する1つ以上の生物活性剤を含む、1つ以上の問題の生物活性剤を遊離する、細胞の使用に関する。更なる態様では、本発明は、1つのこのような生物活性剤、すなわち幹細胞の動員活性を有する、細胞外マトリックスタンパク質のデコリンのポリペプチド断片の同定、特徴付け、及び使用に関する。
本発明は、治療剤を含む生物活性剤、及び、選択された生物学的試料中でそれを同定する方法に関する。より特定すると、該方法は、インビトロで細胞外マトリックス、例えば無細胞細胞外マトリックス又は脱細胞化細胞外マトリックスと相互作用し、それによって、該相互作用により、治療に有効である可能性を有する1つ以上の生物活性剤を含む、1つ以上の問題の生物活性剤を遊離する、細胞の使用に関する。更なる態様では、本発明は、1つのこのような生物活性剤、すなわち幹細胞の動員活性を有する、細胞外マトリックスタンパク質のデコリンのポリペプチド断片の同定、特徴付け、及び使用に関する。
発明の背景
以下は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書に提供された情報のいずれかが、先行技術であるか、又は目下記載されている若しくは特許請求されている本発明に関連しているか、又は具体的に若しくは暗に言及されているいずれかの刊行物若しくは文書が先行技術であることを認めるものではない。明細書全体における先行技術のあらゆる考察は、いずれにしても、このような先行技術が、広く知られているか、又は当技術分野におけるありふれた一般的な知識の一部を形成することを認めるものだと判断されるべきではない。
以下は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書に提供された情報のいずれかが、先行技術であるか、又は目下記載されている若しくは特許請求されている本発明に関連しているか、又は具体的に若しくは暗に言及されているいずれかの刊行物若しくは文書が先行技術であることを認めるものではない。明細書全体における先行技術のあらゆる考察は、いずれにしても、このような先行技術が、広く知られているか、又は当技術分野におけるありふれた一般的な知識の一部を形成することを認めるものだと判断されるべきではない。
一連の研究及び治療に使用するための、治療活性を有する生物活性剤を含む、生物活性剤が現在進行形で必要とされていることが理解されるだろう。広範囲に及ぶ研究及び開発の努力が、合成物質に集中しているが、生物学的な系に由来する生物活性剤もかなり興味深い。
一般的には、例えば細胞外マトリックス(ECM)を含む、組織を起源とする生物活性剤が、インタクトな組織から、偶然に又は標的化された方法を介して同定されている。しかしながら、細胞外マトリックスに由来する生物活性剤の場合、これらの方法は、多くの困難に直面する。例えば、組織は、様々な細胞型だけでなく細胞外マトリックスそれ自体も含んでいる、複雑かつ非常に不均一な物質である。したがって、正常な組織である複雑な混合物からの該物質の同定は、様々な分画技術、分離技術、及び分析技術を必要とし、これにより、治療剤を含む有用な可能性のある生物活性剤を取り損なう可能性がある。更に、細胞外マトリックス及びその成分の生物学的特性は、組織の年齢、組織の場所、及び任意の疾患の状態を含む、多くの要因に依存すると考えられている。また、細胞外マトリックス及び相互に関連する細胞集団は、様々な生物活性剤を介して媒介される、多種多様なシグナル伝達プロセスに関与している。これらのシグナル伝達事象は、持続性又は一過性であり得、関与する細胞外マトリックス成分及び細胞(群)に依存している。これにより、重要な生物活性剤が、組織内においてほんの一過性であるか又は短命である可能性が生じ、それにより、それらの同定は困難となる。それ故、既存の方法は、組織の細胞外マトリックスの複雑さ、細胞外マトリックス内における治療剤候補の相対量、組織の細胞外マトリックスにおいて起こる複雑な相互作用、並びに、生物活性剤の分離及び同定の実際上の困難さによって限界がある。
したがって、無細胞細胞外マトリックス(aECM)又は脱細胞化細胞外マトリックス(dECM)を含む、細胞外マトリックスから治療薬生体分子候補を同定するための新規な方法には、これらの限界を克服することが必要とされる。
しかしながら、現在、細胞と細胞外マトリックスの相互作用から得られる生物活性剤の同定に適した、特に、1つ以上の細胞集団と細胞外マトリックス(無細胞細胞外マトリックス及び脱細胞化細胞外マトリックスを含む)の相互作用からの生物活性剤の同定に適した、効果的かつ簡便な方法は全く存在しない。
したがって、このような物質の同定のための新規かつ改善された方法を開発する必要性、及びこのような物質それ自体についての関連した必要性が存在する。
それ故、本発明の目的は、1つ以上の生物活性剤、例えば生理活性ポリペプチド、及び/又はこのような物質を検出/又は同定する1つ以上の方法を提供すること、或いは、既存の方法に対する有用な代替法を少なくとも提供すること、或いは、公衆に有用な選択肢を少なくとも提供することである。
発明の要約
第一の態様では、本発明は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
を含む群から選択される、単離されているか、精製されているか、組換え型であるか、又は合成のポリペプチドに関する。
第一の態様では、本発明は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
を含む群から選択される、単離されているか、精製されているか、組換え型であるか、又は合成のポリペプチドに関する。
本明細書に記載の実施態様のいずれかは、本明細書に提示された態様のいずれかに関連する場合がある。
本発明の別の態様は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択された1つ以上のポリペプチドを含む、医薬組成物を含む、組成物に関する。
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択された1つ以上のポリペプチドを含む、医薬組成物を含む、組成物に関する。
1つの実施態様では、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の1つ以上のポリペプチド及び/又は本明細書に記載のような組成物を含む、試薬に関する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のような試薬及び/又は組成物を含む、キットに関する。
別の態様によると、本発明は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択されたポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現構築物に関する。
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択されたポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現構築物に関する。
本発明の別の態様は、上記のような発現構築物を含んでいるベクターに関する。
本発明の別の態様は、上記に定義されているような発現構築物又はベクターを含んでいる宿主細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、生物学的効果を媒介するための、精製されているか、単離されているか、組換え型であるか、又は合成のタンパク質の使用に関し、ここでのタンパク質は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択される。
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択される。
1つの実施態様では、生物学的効果は、それを必要とする対象においてインビボで、例えばタンパク質の投与によって媒介される。
別の実施態様では、生物学的効果はエクスビボで、例えばインビトロで、例えば生物学的試料をタンパク質と接触させることによって媒介される。例えば、生物学的効果は、インビトロで、1つ以上の細胞、1つ以上の組織、又は1つ以上の器官をタンパク質と接触させることによって媒介される。
様々な実施態様では、生物学的試料、組織(無細胞細胞外マトリックス又脱細胞化細胞外マトリックスを含む)又は細胞は、動物、例えば哺乳動物の被験体(ヒト対象を含む)、又は乳畜、例えばウシ、ヒツジ、若しくはヤギに由来する。
別の態様では、本発明は、1つ以上の生物活性剤を提供する方法に関し、該方法は、
i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;及び
iv.前記の1つ以上の生物活性剤を回収する工程
を含む。
i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;及び
iv.前記の1つ以上の生物活性剤を回収する工程
を含む。
別の態様では、本発明は、1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定する方法に関し、該方法は、
i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、1つ以上の生物活性剤を遊離するに十分な期間、細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;並びに
iv.前記の1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定する工程
を含む。
i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、1つ以上の生物活性剤を遊離するに十分な期間、細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;並びに
iv.前記の1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定する工程
を含む。
様々な実施態様では、細胞外マトリックスは、無細胞細胞外マトリックス、脱細胞化細胞外マトリックスであるか、又は細胞外マトリックスは、例えば、生細胞を実質的に含まない細胞外マトリックスなどのように、実質的に細胞を含まない。1つの実施態様では、細胞外マトリックスは実質的に内因性細胞を含まない、例えば完全に内因性細胞を含まない。
1つの実施態様では、無細胞細胞外マトリックスは、天然の無細胞細胞外マトリックスである。例えば、無細胞細胞外マトリックスは、硝子体液であるか又はそれに由来する。
1つの実施態様では、細胞外マトリックスは、脱細胞化細胞外マトリックスである。
様々な実施態様では、細胞外マトリックスは、哺乳動物、爬虫類、鳥類、及び昆虫を含む、任意の種類の動物に由来する、真皮、心膜、胃、小腸、膀胱、胎盤、腎被膜、又は体腔の裏打ちから調製される。
1つの実施態様では、細胞外マトリックスは、ヒツジ前胃マトリックス(OFM)である。
1つの実施態様では、期間は、1つ以上の細胞が、細胞外又はその成分と相互作用するのが可能となるのに十分な期間である。
1つの実施態様では、接触は、細胞外マトリックスからの1つ以上の生物活性剤の遊離に十分な期間である。1つの実施態様では、接触は、1つ以上の細胞による、生物活性剤の産生又は分泌を誘導するに十分な期間である。
1つの実施態様では、期間は、約1時間から約7日間以上である。一例では、期間は少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、又は少なくとも約24時間である。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、均一な細胞集団を含む。一例では、該細胞は、マクロファージ、例えば活性化マクロファージである。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、2つ以上の細胞集団を含む。一例では、ある集団はマクロファージを含み、及び/又はある集団は線維芽細胞を含む。他の例では、1つ以上の細胞が、1つ以上の神経細胞、1つ以上の上皮細胞、1つ以上の内皮細胞、1つ以上の幹細胞、又は1つ以上の前駆細胞を含む。
様々な実施態様では、細胞外マトリックス及び1つ以上の細胞は各々、1つの組織に由来するか、又は各々互いにインビボでは接触していない種類のものである。例えば、無細胞細胞外マトリックス及び1つ以上の細胞は各々、1つの組織に由来するか、又はインビボで病的ではない状態では互いに接触していない種類のものである。
様々な実施態様では、実施される場合、少なくとも部分的な精製は、ろ過、クロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー及び/又はイオン交換、ゲル電気泳動、沈降、又はサイズ排除(サイズ排除ろ過を含む)を含む。特定の実施態様では、1つを超える精製法が使用される。
様々な実施態様では、精製及び/又は回収は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又は高速タンパク質高圧液体クロマトグラフィーによる。
様々な実施態様では、検出及び/又は同定は、1つ以上の生物学的機能、例えば生物活性剤が生物学的応答を惹起する能力をアッセイすることによる。例えば、検出及び/又は同定は、走化性、1つ以上の細胞応答の調節、例えば遺伝子発現の調節、サイトカイン又はケモカイン産生の調節、細胞周期進行の調節、細胞分化又は増殖の調節、マクロファージ又は好中球の活性化などの細胞活性化の調節をアッセイすることによる。
様々な実施態様では、生物活性剤の生理活性は、インビトロ又はインビボで評価され、特定の実施態様では、それらは、細胞遊走、走化性、増殖、又は細胞内プロセス若しくは酵素的プロセスの阻害などのような事を含むがこれらに限定されない。
様々な実施態様では、検出及び/又は同定は、生物活性剤の直接的な検出及び/又は同定による。例えば、検出及び/又は同定は、タンパク質若しくはヌクレオチドのシークエンスによるか、クロマトグラフィーによるか、イムノアッセイによるか、又は質量分析による。
様々な実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、タンパク質分解切断によって、細胞内プロセシングによって、例えば細胞内リソソームを使用したタンパク質のエンドサイトーシス及び消化によって、酸化バーストによって、又はコンフォメーション変化によって遊離されるポリペプチド又はペプチドである。
本発明の別の態様は、1つ以上の生物活性剤の同定に使用されるための組成物を含む、細胞外マトリックスと1つ以上の細胞、例えば1つ以上の外因性細胞とを含んでいる組成物に関する。
様々な実施態様では、前記細胞外マトリックスは、無細胞細胞外マトリックス、脱細胞化細胞外マトリックスであるか、又は細胞外マトリックスは、例えば、生細胞を実質的に含まない細胞外マトリックスなどのように、実質的に細胞を含まない。1つの実施態様では、該細胞外マトリックスは、内因性細胞を実質的に含まない、例えば、完全に内因性細胞を含まない。
1つの実施態様では、無細胞細胞外マトリックスは、天然に存在する無細胞細胞外マトリックスである。例えば、無細胞細胞外マトリックスは、硝子体液であるか又はそれに由来する。
1つの実施態様では、無細胞細胞外マトリックスは、脱細胞化細胞外マトリックスである。
1つの実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、1つ以上の細胞と細胞外マトリックスとの、例えば無細胞細胞外マトリックス又は脱細胞化細胞外マトリックスとの相互作用によって遊離される。
1つ以上の細胞を含んでいる上記のような組成物の1つの実施態様では、該組成物は、均一な細胞集団を含む。一例では、該細胞はマクロファージ、例えば活性化マクロファージである。
1つ以上の細胞を含んでいる組成物の1つの実施態様では、該組成物は、2つ以上の細胞集団を含む。一例では、ある集団はマクロファージを含み、及び/又はある集団は線維芽細胞を含み、及び/又はある集団は角化細胞を含む。
一例では、1つ以上の細胞は、細胞外マトリックスが由来するのと同じ種に由来する。
本発明の更なる態様は、本明細書に記載のような方法によって同定された1つ以上の生物活性剤を含んでいる組成物に関する。
1つの実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、1つ以上の細胞と細胞外マトリックスの相互作用によって遊離される。
更なる態様では、本発明は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択されたタンパク質の有効量を生物学的試料に接触させる工程又はそれを対象に投与する工程を含む、生物学的試料における、又はそれを必要とする対象における生物学的効果を媒介する方法に関する。
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択されたタンパク質の有効量を生物学的試料に接触させる工程又はそれを対象に投与する工程を含む、生物学的試料における、又はそれを必要とする対象における生物学的効果を媒介する方法に関する。
1つの実施態様では、生物学的効果はそれを必要とする対象においてインビボで、例えば対象へのタンパク質の投与によって媒介される。1つの実施態様では、有効量は、治療有効量である。
別の実施態様では、生物学的効果はエクスビボで、例えばインビトロで、例えば生物学的試料をタンパク質と接触させることによって媒介される。例えば、生物学的効果は、インビトロで、1つ以上の細胞、1つ以上の組織、又は1つ以上の器官をタンパク質と接触させることによって媒介される。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における組織修復を調節する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のようなタンパク質の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
特定の実施態様では、治療有効量は、1つ以上の幹細胞を、例えば投与部位に、又は投与されるタンパク質が局在する部位に動員するのに十分である。
更なる態様では、本発明は、それを必要とする対象における幹細胞の欠乏に関連した疾患又は障害を処置する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のようなタンパク質の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
1つの実施態様では、疾患又は障害は、局所の幹細胞の欠乏、例えば特定の組織又は器官における幹細胞の欠乏に関連した疾患又は障害である。
更に別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における、幹細胞の動員又は関連したプロセスを調節する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のようなタンパク質の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
様々な実施態様では、関連したプロセスは、血管新生、造血、タンパク質の発現、誘導、又は沈着、組織リモデリング、修復、又は再生、細胞増殖、幹細胞の分化を含む細胞分化、細胞調節、アポトーシス、1つ以上の免疫応答の調節、腫瘍形成の調節、走化性、又は細胞動員である。
更に別の態様では、本発明は、生物学的効果を媒介する方法、それを必要とする対象における組織修復を調節する方法、それを必要とする対象における幹細胞の欠乏に関連した疾患若しくは障害を処置する方法、又はそれを必要とする対象における幹細胞の動員若しくは関連したプロセスを調節する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のような薬学的に許容可能な組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
更に別の態様では、本発明は、生物学的効果を媒介する方法、それを必要とする対象における組織修復を調節する方法、それを必要とする対象における幹細胞の欠乏に関連した疾患若しくは障害を処置する方法、又はそれを必要とする対象における幹細胞の動員若しくは関連したプロセスを調節する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のような方法で同定された生物活性剤の治療有効量を対象に投与する工程を含む。
様々な実施態様では、本明細書に記載のポリペプチドは、約1ng/kgから約1mg/kgの用量で対象に投与される。例えば、本明細書に記載のポリペプチドは、約1ng/kgから約100μg/kg、又は約1ng/kgから約10μg/kg、1ng/kgから約1μg/kg、又は約1ng/kgから約100ng/kgの用量で投与される。
本明細書に開示された数字の範囲への言及(例えば1~10)はまた、その範囲内の全ての有理数(例えば1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9、及び10)、及びまたその範囲内の有理数の任意の範囲(例えば2~8、1.5~5.5、及び3.1~4.7)への言及も取り込むことを意味する。これらは単に具体的に意図するものの例であり、列挙された最低値と最高値の間の数値の全ての可能な組合せが、本出願において同じように明確に記述されていると判断される。
当業者は、本明細書に使用される程度に関する様々な用語の意味を理解しているだろう。例えば、量(例えば「約9%」)への言及の文脈において本明細書に使用されているような「約」という用語は、依然として所望の機能を遂行するか又は所望の結果を達成する記述の量に近い又はこれを含む量を示し、例えば、「約9%」は、9%、及び依然として所望の機能を遂行するか又は所望の結果を達成する、9%に近い量を含み得る。例えば、「約」という用語は、記述の量の10%未満以内、5%未満以内、1%未満以内、0.1%未満以内、又は0.01%未満以内にある量を指し得る。また、「約」という用語が、例えば、図、濃度、量、整数、又は数値に言及して使用される場合、正確な図、濃度、量、整数、又は数値も特に考えられる。
本発明の他の目的、態様、特色、及び利点は、以下の説明から明らかとなろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、単に説明のために示されていることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神及び範囲内での様々な変更及び改変が、この詳細な説明から当業者には明らかとなろうからである。
詳細な説明
本発明は、1つ以上細胞と無細胞細胞外マトリックスとの相互作用中に産生されるか、又は該相互作用によって遊離された、治療剤を含む、1つ以上の生物活性剤の同定法に関する。特定の実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、組織の細胞外マトリックスから派生し、例えばここでは該物質は、細胞外マトリックスの一成分、細胞外マトリックスの一成分の断片、又は例えば1つ以上の細胞と細胞外マトリックスとの相互作用によって改変され、それ故、それが天然の細胞外マトリックスにおいて有する形とは異なる、細胞外マトリックスの一成分若しくは断片である。
本発明は、1つ以上細胞と無細胞細胞外マトリックスとの相互作用中に産生されるか、又は該相互作用によって遊離された、治療剤を含む、1つ以上の生物活性剤の同定法に関する。特定の実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、組織の細胞外マトリックスから派生し、例えばここでは該物質は、細胞外マトリックスの一成分、細胞外マトリックスの一成分の断片、又は例えば1つ以上の細胞と細胞外マトリックスとの相互作用によって改変され、それ故、それが天然の細胞外マトリックスにおいて有する形とは異なる、細胞外マトリックスの一成分若しくは断片である。
他の実施態様では、1つ以上の生物活性剤は、それらと無細胞細胞外マトリックスとの相互作用の結果として、1つ以上の細胞によって産生されるか、分泌されるか、又は発現される。
本明細書において使用する「生物活性剤」は、生物学的応答を惹起することができる、例えば、1つ以上の細胞において、又は実際には1つ以上の組織、器官若しくは生物において生物学的応答を刺激することのできる剤である。特に考えられる生物活性剤は、生物学的な系によって又は生物学的相互作用若しくは刺激に応答して産生されるものであり、したがって、それ自体、特徴が生物学的である。例えば、本明細書において考えられるような、生物活性剤は、特定の実施態様では、タンパク質又はポリペプチド、脂質、多糖、核酸、ケモカイン、ビタミン、ホルモン、代謝産物、増殖因子、サイトカイン、エクソソームなどである。特に考えられる生物活性剤は、生物学的応答を惹起するもの、例えば、細胞の走化性及び/又は動員、組織リモデリング及び/又は組織修復の調節、創傷の治癒及び/又は再生、免疫応答の調節、血管新生の調節、組織微小環境の調節、血管新生、造血、タンパク質の発現、誘導、又は沈着、細胞増殖、細胞分化(幹細胞分化を含む)、細胞調節(細胞周期調節を含む)、アポトーシス、1つ以上の免疫応答の調節、並びに腫瘍形成の調節の中の1つ以上を惹起するものである。
当業者は、この説明を読めば、特に、細胞の走化性及び動員、例えば組織リモデリング、組織修復の調節、並びに創傷の治癒、免疫応答の調節、血管新生の調節、並びに組織微小環境の調節に関する、研究及び治療法における、これらの生物活性剤の及びそのための様々な使用が提供される。
本発明の様々な態様が、以下の小区分に更に詳述されている。特記されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明に属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書(定義を含む)が御するだろう。本明細書に記載のと類似しているか又は等価である方法及び材料が、本発明の実施に使用されてもよいが、適切な方法及び材料の例は、以下に記載されている。本明細書に記載の材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定するものではない。
定義
本明細書において使用する「及び/又は」という用語は、「及び」又は「又は」を意味し得る。
本明細書において使用する「及び/又は」という用語は、「及び」又は「又は」を意味し得る。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「含む(comprise)」、「含む(comprises)」及び「含んでいる」という用語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるものではなく、「少なくとも一部にはからなる」を意味する。「含む(comprise)」、「含む(comprises)」又は「含んでいる」という用語を含む本明細書における各記述を解釈する場合、該用語が前置きされているもの以外の対象物も存在し得る。「含んでいる(including)」、「含む(include)」及び「含む(includes)」などの関連用語も同じように解釈される。
本明細書において使用する場合の「から実質的になる」という用語は、記述の対象物を指し、明記の対象物の基本的な特徴を実質的に変化させない、他の対象物の存在も可能とする。
本明細書において使用する「からなる」という用語は、特許請求の範囲に明記されていない全ての要素、工程、又は成分を除く、特許請求された本発明の明記された材料又は工程を意味する。
細胞外マトリックス
本明細書に使用するに適した細胞外マトリックスの生体材料は、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンをその天然の立体配置及び天然の濃度で含んでいる、コラーゲンを基剤とした生分解性マトリックスである。
本明細書に使用するに適した細胞外マトリックスの生体材料は、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンをその天然の立体配置及び天然の濃度で含んでいる、コラーゲンを基剤とした生分解性マトリックスである。
本発明に使用するための1つの細胞外コラーゲン性マトリックスは、恒温脊椎動物の細胞外マトリックスである。細胞外マトリックスは、様々な入手源、例えば、ブタ、ウシ、及びヒツジ、又は他の恒温脊椎動物を含む、食肉生産のために育てられた動物から収集された腸組織から得ることができる。脊椎動物の細胞外マトリックスは、商業的食肉生産作業の豊富な副産物であり、したがって、低コストな組織移植片材料である。
細胞外マトリックスの生体材料は、天然的に会合している細胞外マトリックスタンパク質、糖タンパク質、及び、細胞外マトリックスの入手源に応じて細胞外マトリックス内に天然に見られる他の因子を含む。
本明細書において考えられる特定の実施態様では、本開示に従って使用される細胞外マトリックスは、無細胞細胞外マトリックス(aECM)、すなわち、実質的に細胞を含まない組織の細胞外マトリックスである。
様々な実施態様では、本明細書において有用な無細胞細胞外マトリックスは、天然に存在する無細胞細胞外マトリックス、すなわち、インビボで実質的に細胞を含まない細胞外マトリックスである。例としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、又は鳥類の眼に由来する、硝子体液の細胞外マトリックスが挙げられる。
他の実施態様では、細胞外マトリックスは、インビボでは1つ以上の細胞と会合しているが、それから実質的に全ての細胞が除去されている、細胞外マトリックスに由来する。本明細書において、例えば研究室における能動的な操作によるものであれ、又は他の処理によるものであれ、脱細胞化されている細胞外マトリックスは一般的に、脱細胞化細胞外マトリックス(dECM)と呼ばれる。
したがって、本明細書で考えられる特定の実施態様では、組織に見られる細胞外マトリックスを脱細胞化することにより、細胞外マトリックスが単離又は部分精製されている。これらの種類の材料は、創傷治癒及び軟組織再生に、典型的には患者において欠落しているか又は損傷を受けた細胞外マトリックスを一過性に置き換えるための足場として広く使用されている。脱細胞化細胞外マトリックスは、組織の細胞外マトリックスを模倣しているので、患者の細胞は、外因性脱細胞化細胞外マトリックスに付着し、増殖し、分裂するだろう。時と共に、脱細胞化細胞外マトリックスは、患者の新規組織に取り込まれるだろう。脱細胞化細胞外マトリックスは、正常な細胞と細胞外マトリックスの相互作用を模倣したプロセスを介した再生中に、患者の細胞と相互作用するだろうと報告されている。例えば、脱細胞化細胞外マトリックスは、新規組織における脈管形成を刺激し、構造的リモデリングを受けると報告されている。組織に見られる細胞外マトリックスと同様に、これらの脱細胞化細胞外マトリックスは、構造的分子、接着分子、及びシグナル伝達分子の不均一な混合物を含有している。
細胞外マトリックスは、任意の適切な入手源、例えばヒツジ前胃から得ることができる。典型的には、細胞外マトリックスは、宿主細胞が減少するか又は完全に除去されるように脱細胞化されるだろう。
前胃組織は、本発明に使用するための細胞外マトリックスの好ましい入手源である。適切な前胃の細胞外マトリックスは典型的には、反芻動物の前胃の粘膜固有層-粘膜下層を含む。本発明の特定の実施態様では、粘膜固有層-粘膜下層は、前胃の第一胃、第二胃、又は第三胃に由来する。これらの組織足場材料は典型的には、起伏のある管腔表面を有する。細胞外マトリックスの組織足場材料は更に、脱細胞化された組織、例えば、上皮、基底膜、又は筋層の一部、及びその組合せを含有していてもよい。組織足場材料はまた、1つ以上の線維タンパク質(I型コラーゲン、III型コラーゲン、又はエラスチン、及びその組合せを含むがこれらに限定されない)も含み得る。
1つの特に考えられる例では、脱細胞化細胞外マトリックスは、残留ヒツジ(ovine)(ヒツジ(sheep))細胞を除去し、結果として得られた細胞外マトリックスを消毒するプロセスを使用して、ヒツジ前胃組織から調製される。この脱細胞化細胞外マトリックスは本明細書において、「ヒツジ前胃マトリックス」(OFM)と称される。本明細書において使用する「ヒツジ前胃マトリックス」という用語及び略称のOFMは、反芻動物の前胃の粘膜固有層-粘膜下層を含有している細胞外マトリックス足場材料を指す。本明細書において使用する「粘膜固有層-粘膜下層」という用語は、反芻動物の前胃の粘膜固有層と粘膜下層とを混ぜることによって形成された組織構造を指す。OFMは、血管形成を刺激し、かつ構造的リモデリングを受けるための、組織細胞外マトリックスの様々な成分を含有していることが示された。
本明細書において有用な細胞外マトリックスは通常、取扱いが簡単で、凍結乾燥などの乾燥を受け入れ、そしてすぐに滅菌されるだろう。
様々な実施態様では、細胞外マトリックスは、ヒト又は動物の組織源、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、シカ、又はヒトの組織に由来する。例えば、細胞外マトリックスは、ヒトの脱細胞化細胞外マトリックス、ヒツジの脱細胞化細胞外マトリックス、ウシの脱細胞化細胞外マトリックス、ブタの脱細胞化細胞外マトリックス、シカの脱細胞化細胞外マトリックス、又はヤギの脱細胞化細胞外マトリックスであるか、又はそれを含む。
1つの実施態様では、細胞外マトリックスは、胎児又は新生仔の組織に由来する。別の実施態様では、細胞外マトリックスは、若年、成体、又は老齢の組織に由来する。
1つの実施態様では、細胞外マトリックスは、健康な組織に由来する。他の実施態様では、細胞外マトリックスは、疾患を有する組織に由来し、例えば癌組織に由来する細胞外マトリックスである。
1つの実施態様では、細胞外マトリックスは、完全器官に由来するか、又は特定の組織に由来し、例えば、細胞外マトリックスは、肝臓、腎臓、肺、腸、羊膜、神経、皮膚、又は血管組織に由来する。
特に考えられる実施態様では、細胞外マトリックスは、反芻動物の前胃に由来する。特定の実施態様では、細胞外マトリックスは、前胃の第一胃、第二胃、又は第三胃に由来する。細胞外マトリックスは、特定の実施態様では、このような組織に由来する、上皮、基底膜、又は筋層の一部、及びその組合せを含むだろう。
様々な実施態様では、細胞外マトリックスは、1つ以上の線維タンパク質(I型コラーゲン、III型コラーゲン、又はエラスチン、及びその組合せを含むがこれらに限定されない)も含む。
本明細書に記載の方法の特定の実施態様では、特定の組織に由来する脱細胞化細胞外マトリックスを、その組織に由来するか又はインビボでは会合している1つ以上の細胞と接触させることが理解されるだろう。しかしながら、他の実施態様では、特定の組織に由来する脱細胞化細胞外マトリックスを、通常はその組織の中にないか又はインビボでは会合していない1つ以上の細胞と接触させる。例えば、腸に由来する細胞外マトリックスを、1つのこのような実施態様では、哺乳動物の皮膚から単離された角化細胞と接触させる。
実質的に細胞を含まずかつ実質的に他の物質も含まない細胞外マトリックスが使用される、本明細書に記載の方法の実施態様が、特に考えられるが、他の実施態様では、細胞外マトリックスは、他の物質、例えば1つ以上の構造的支持体(例えば1つ以上のポリマーシートを含む)と会合していてもよいことが理解されるだろう。本明細書に記載の同定法の文脈において、細胞外マトリックスを1つ以上の細胞と接触させる場合に存在するあらゆる他の物質は理想的には、生物学的に不活性である、及び/又は、1つ以上の細胞と細胞外マトリックスとの相互作用に影響を及ぼすことができないだろうことが理解されるだろう。細胞外マトリックスに構造的支持体を与えるに有用なポリマーの代表例としては、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、乳酸コポリマー(PLLA)、及び乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)が挙げられる。
細胞外マトリックスを脱細胞化する方法
本明細書に記載の方法は、実質的に細胞を含まない細胞外マトリックスの使用から恩恵を受ける。
本明細書に記載の方法は、実質的に細胞を含まない細胞外マトリックスの使用から恩恵を受ける。
当業者は、被験体動物の中にあるか又はそれに由来する適切な組織から無細胞細胞外マトリックスを単離するに適切な方法を含む、細胞外マトリックスを単離し、続いて使用するためにそれを調製するのに適した外科的方法をよく知っているだろう。細胞外マトリックスを脱細胞化する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第4,902,508号、米国特許第5,554,389号、米国特許第6,099,567号、及び米国特許第8,415,159号(これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
1つの実施態様では、本明細書に記載のような使用に適した細胞外マトリックスは、反芻動物の前胃などの器官壁を横断する経壁浸透圧流によって調製される。一般的には、器官は、ある溶液で充填され、密封され、その後、別の溶液に浸漬される。2つの溶液間の塩分の差により、経壁浸透圧流が発生する。浸透圧勾配は、溶液(すなわち高張液及び低張液)の配置を変更することによって、いずれかの方向で確立され得ることが理解されるだろう。勾配は好ましくは、器官の自然な流れを模倣した方向に確立される。例えば、反芻動物の前胃に由来する組織を処理する場合、勾配は好ましくは、組織の管腔側表面から反管腔側表面に確立される。
経壁浸透圧流による細胞外マトリックスの脱細胞化のための例示的な方法は、国際公開公報第2010/014021号として公開されている、PCT国際特許出願PCT/NZ2009/000152号において、及び米国特許第8,415,159号に提示され、これらは各々、その全体が参照により本明細書に援用される。
簡潔に言えば、好ましくはヒツジ種から収集された、脊椎動物の前胃の区域の、組織の2つの側面間に経壁浸透圧流をかけ、これにより、組織の全部又は一部の中にある組織層は、分離及び/又は脱細胞化される。経壁浸透圧流は、該組織の全部若しくは一部の管腔側から反管腔側に、又は該組織の全部若しくは一部の反管腔側から管腔側に向かう。これは、例えば、高張液と低張液の間で組織を分離することによって達成され得、これにより、経壁浸透圧流は、低張液から高張液に向かう。
前記方法は、特定の実施態様では、上皮、基底膜、又は胃筋層、及びその組合せを含む、組織層の全部又は一部を除去することを更に含むだろう。
高張液及び低張液は通常、例えば、水及び場合により少なくとも1つの緩衝液、洗浄剤、又は塩を含むだろう。高張液は、低張液よりも高い濃度の溶質を含有している。特定の方法では、高張液は4MのNaClを含み、低張液は0.28%のトリトンX-200及び0.1%EDTAを含む。別の特定の方法では、低張液は0.1%のSDSを含む。更に別の方法では、低張液は、0.028%のトリトンX-200、0.1%EDTA、及び0.1%SDSを含む。
細胞外マトリックスは、水和状態で保存されても、又は脱水状態で保存されてもよい。凍結乾燥又は風乾させた細胞外マトリックスを、再水和又は部分的に再水和させてもよく、そして本発明に従って、その生体栄養特性及び力学的特性を有意に低減させることなく使用され得る。
本明細書において使用する「脱細胞化された」という用語は、組織又は器官の一部からの、例えば細胞外マトリックスからの、細胞及びそれらに関連した破片の除去を指すことは本開示から明白であろう。
本明細書において使用する「脱細胞化細胞外マトリックス」(dECM)という用語は、脱細胞化された動物又はヒトの組織を指し、他の物質と相互作用するための又は他の物質を担持するための構造的完全性及びフレームワークのためのマトリックスを提供することは、本開示から明らかであろう。
本明細書の方法に使用するに適した細胞
事実上全ての組織の細胞(線維芽細胞、免疫細胞(例えばマクロファージ、好中球、及び樹状細胞を含む)、内皮細胞、及び幹細胞(例えば間葉系幹細胞及び前駆細胞)を含む)が、例えば様々なシグナル伝達経路、細胞外マトリックス接着分子及び受容体を介して、インビボで持続的に細胞外マトリックスと相互作用することが当業者によって理解されるだろう。例えば、線維芽細胞はコラーゲン及び他の細胞外マトリックスタンパク質を合成し、これはその後、会合して線維となる。線維芽細胞は、持続的なフィードバックループで線維の収縮及びマトリックスの剛性の制御に密接に関与している。他の細胞も、マトリックスの分解及び再構築に関与している。例えば、マクロファージ及び肥満細胞などの炎症細胞は、損傷後にプロテーゼを放出して、マトリックスを分解する。同じように、浸潤性内皮細胞、角化細胞、及び線維芽細胞も、プロテアーゼを放出して組織リモデリングを促進し、一方、数多くのサイトカイン及び増殖因子も、血管新生、走化性、増殖、コラーゲン合成、及び炎症を含む、重要な創傷治癒プロセスに関与している。
事実上全ての組織の細胞(線維芽細胞、免疫細胞(例えばマクロファージ、好中球、及び樹状細胞を含む)、内皮細胞、及び幹細胞(例えば間葉系幹細胞及び前駆細胞)を含む)が、例えば様々なシグナル伝達経路、細胞外マトリックス接着分子及び受容体を介して、インビボで持続的に細胞外マトリックスと相互作用することが当業者によって理解されるだろう。例えば、線維芽細胞はコラーゲン及び他の細胞外マトリックスタンパク質を合成し、これはその後、会合して線維となる。線維芽細胞は、持続的なフィードバックループで線維の収縮及びマトリックスの剛性の制御に密接に関与している。他の細胞も、マトリックスの分解及び再構築に関与している。例えば、マクロファージ及び肥満細胞などの炎症細胞は、損傷後にプロテーゼを放出して、マトリックスを分解する。同じように、浸潤性内皮細胞、角化細胞、及び線維芽細胞も、プロテアーゼを放出して組織リモデリングを促進し、一方、数多くのサイトカイン及び増殖因子も、血管新生、走化性、増殖、コラーゲン合成、及び炎症を含む、重要な創傷治癒プロセスに関与している。
1つの実施態様では、インビトロで無細胞細胞外マトリックスに接触している1つ以上の細胞は、任意の動物細胞であるか又はこれを含む。例えば、該細胞は、哺乳動物細胞である。別の例では、該細胞は任意の組織の細胞である。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、任意の真核細胞又は原核細胞、例えば、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞(酵母細胞を含む)である。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、不死化細胞株に由来するか又は初代細胞株に由来する、細胞であるか又はこれを含む。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、1つの組織、例えば末梢血単核細胞(PMNC)に由来する細胞の混合物であるか又はこれを含む。
1つの実施態様では、1つ以上の細胞は、皮膚に由来する上皮細胞及び角化細胞などの1つの組織に由来するものであれ、骨髄由来幹細胞及び血液由来マクロファージなどの複数の組織に由来するものであれ、異なる細胞の混合物であるか又はこれを含む。
様々な実施態様では、1つ以上の細胞は、ストレスに、又は、低酸素分圧、栄養枯渇、変化したpH、特定の培地、上昇したCO2、微生物若しくはウイルスによる攻撃などの1つ以上の特殊な培養条件にかけられるか、又はかけられていた。
様々な実施態様では、1つ以上の細胞は、サイトカイン又はリポ多糖の添加によって誘導される表現型のような、M1又はM2マクロファージ表現型などの、特定の表現型をとるように誘導されているか又は誘導されていた。
様々な実施態様では、1つ以上の細胞は、遺伝子的に改変、例えば、1つ以上の特定のタンパク質を発現するように、又は1つ以上の遺伝子突然変異を含むように遺伝子的に改変又は誘導されているか又はされていた。
様々な実施態様では、細胞と細胞外マトリックスの表面積の比は、1000個の細胞/cm2から1,000,000個の細胞/cm2の範囲であり得るが、通常、約100,000個の細胞/cm2の桁であろう。共培養液は、制御された温度及び湿度下で、1時間から7日間以上の期間かけてインキュベートされる。特定の例では、期間は少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、又は少なくとも約24時間である。
1つの具体的に考えられる実施態様では、マクロファージ細胞は、例えば、本明細書の実施例に例示されているようなヒツジ前胃マトリックス上で培養される。
生物活性物質の同定
本明細書で考えられるような1つ以上の生物活性剤の検出及び/又は同定は、特定の実施態様では、1つ以上の細胞と無細胞細胞外マトリックスとの相互作用後に回収された試料などの出発物質を、様々な画分へと分離するために、現代のクロマトグラフィー分離技術(例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又は高速タンパク質高圧液体クロマトグラフィー)を利用するだろう。
本明細書で考えられるような1つ以上の生物活性剤の検出及び/又は同定は、特定の実施態様では、1つ以上の細胞と無細胞細胞外マトリックスとの相互作用後に回収された試料などの出発物質を、様々な画分へと分離するために、現代のクロマトグラフィー分離技術(例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又は高速タンパク質高圧液体クロマトグラフィー)を利用するだろう。
特定の実施態様では、これらの画分は、問題の適切な生物学的モデルを使用してアッセイされる。成功裡の一連の単離及び精製を用いて、治療剤を、画分の生物学的活性に基づいて同定することができる。
特定の実施態様では、本明細書に記載の1つ以上の生理活性ポリペプチドなどの、1つ以上の生物活性剤の検出及び/又は同定は、生物活性剤それ自体の直接検出を含む。特定の実施態様では、このような検出は、当技術分野において周知である検出法、例えば質量分析、高速液体クロマトグラフィー、2二元SDS-PAGE、又は抗体との結合による。このような検出のための例示的な方法が本明細書に提示され、試料の迅速なスクリーニングに容易にかけられる。
特定の実施態様では、検出及び/又は同定は、1つ以上の生物活性剤、例えば本明細書に記載の1つ以上の生理活性タンパク質に選択的かつ特異的に結合することのできる、1つ以上の抗体を利用する。本明細書に記載の検出法又は診断法の特定の実施態様では、抗原と抗体の結合は、イムノアッセイを使用して検出される。イムノアッセイの設計は変更されてもよい。例えば、イムノアッセイは、競合に基づいていても、又は直接反応に基づいていてもよい。更に、プロトコールは固相支持体を使用しても、又は細胞内物質を使用しても、若しくは細胞外物質を使用してもよい。抗体と抗原の複合体の検出は、標識された抗体(標識された二次抗体を含む)の使用を含み得る。様々な実施態様では、標識は、例えば、酵素、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、又は色素分子標識であり得る。
イムノアッセイは、様々なフォーマット、例えばチップに基づいたイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、フロースルー(垂直フロー)試験又はラテラルフローアッセイ、免疫蛍光試験(IFT)、又はウェスタンブロット分析を含み得る。
特定の実施態様では、1つ以上の生物活性剤、例えば本明細書に記載の1つ以上の生理活性ポリペプチドの検出は、生物活性剤によって媒介される、1つ以上の生物学的効果の検出を含む。本明細書に例示される代表例としては、インビトロの細胞走化性アッセイにおける、1つ以上の細胞の動員を含む。様々な生物学的効果及び/又は応答に関する多くのアッセイが、当業者には公知である。例としては、細胞増殖アッセイ、例えば、線維芽細胞増殖又は角化細胞増殖のアッセイ;細胞遊走アッセイ、例えば、内皮細胞遊走、間葉系幹細胞遊走、線維芽細胞遊走、角化細胞遊走のアッセイ;細胞分化アッセイ、例えば、神経組織、骨髄細胞、軟骨細胞(骨形成、軟骨形成などを含む)に由来する前駆細胞のアッセイ;細胞分極アッセイ、例えばマクロファージ分極アッセイ;免疫細胞活性化アッセイ、例えば好中球活性化アッセイ、肥満細胞活性化アッセイ、T細胞活性化アッセイ、B細胞活性化アッセイ(抗体産生アッセイを含む);食作用アッセイ、例えば好中球食作用アッセイ、マクロファージ食作用アッセイ、及び肥満細胞食作用アッセイ;細胞アポトーシスアッセイ、例えば腫瘍細胞アポトーシスアッセイ、及び内皮細胞アポトーシスアッセイ;抗細菌、抗真菌、及び抗ウイルスアッセイ;並びに、血管新生アッセイ、例えば内皮細胞遊走アッセイ及び内皮細胞出芽アッセイが挙げられる。
生物活性剤
1つ以上の細胞によって発生したタンパク質分解活性を通して産生されたものなどの、改変された又は断片化されたタンパク質及びペプチドを含む、細胞外マトリックスの中に存在するか又はそれに由来するタンパク質は、本開示に従って、同定、単離、及び使用を受け入れられる生物活性剤の例である。
1つ以上の細胞によって発生したタンパク質分解活性を通して産生されたものなどの、改変された又は断片化されたタンパク質及びペプチドを含む、細胞外マトリックスの中に存在するか又はそれに由来するタンパク質は、本開示に従って、同定、単離、及び使用を受け入れられる生物活性剤の例である。
一例では、前記タンパク質は、
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
を含む群から選択されるタンパク質である。
a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の細胞(1つ以上の幹細胞を含む)と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチド、ここでの、該ポリペプチドは、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用又は動員することができるモチーフ又は領域を含む;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
を含む群から選択されるタンパク質である。
他の例では、生物活性剤は、マトリカイン、マトリクリプチン、細胞外マトリックスタンパク質のサブドメイン、又は細胞外マトリックスタンパク質の中に存在するか若しくはそれに由来するリガンドである。
タンパク質分解活性を通して産生されたものなどの、改変された又は断片化されたタンパク質及びペプチドを含む、細胞外マトリックスの中に存在するか又はそれに由来するタンパク質は、組織リモデリング、血管新生、及び細胞増殖を含む、多くのプロセスに関与していると報告されている。このようなタンパク質の例としては、いわゆるマトリカイン及びマトリクリプチンが挙げられ、これらは、細胞外マトリックスタンパク質のサブドメインに由来するか又はそれを含んでいるポリペプチドであり、これらは細胞シグナル伝達を調節することができる。
マトリカインは、リガンドとして作用し、リガンド-受容体の結合後に細胞の行動を変化させる、細胞外マトリックスタンパク質の特定の領域である。例えば、コラーゲンのジスコイジンドメイン受容体(DDR)結合配列は、よく特徴付けられたマトリカインである(Bellon, Martiny et al. 2004, Maquart, Pasco et al. 2004, Tran, Lamb et al. 2005)。上皮細胞内の受容体DDR-1へのこのリガンドの結合により、報告によると、平滑筋細胞が遊走すると報告されている。間葉系幹細胞(MSC)内の受容体DDR-2への同じ共通配列の結合により、報告によると、MMP-1が産生され、これにより、近くの線維状コラーゲンが分解される。
これに対して、マトリクリプチンは、その生物学的活性を惹起するために及び/又はそれらの標的受容体に結合するために、例えば親タンパク質のタンパク質分解的切断、細胞内プロセシングによって、又はコンフォメーション変化後に、それらの親タンパク質から放出されなければならないリガンドである。
マトリカイン及びマトリクリプチンのリガンドは、通常はnM範囲で作用するサイトカインと比較して、mM範囲のより低い結合親和性で作用することが多いと報告されている。このより低い結合親和性は、リガンドが、親タンパク質内で直列反復配列として存在する可能性があるという事実によって、及びこれらのリガンドは通常、標的細胞に内部移行しないか又は枯渇しないために、補なわれると示唆されている。更に、これらのリガンドは細胞外マトリックスに由来するので、細胞外マトリックス内の細胞は、それらの産生部位に近接し、細胞外マトリックス内に存在する細胞におけるこれらのリガンドの局所濃度は、遠くから勾配を形成する分泌増殖因子とは異なり、比較的に高い可能性がある。
マトリクリプチン又は潜在性のペプチド断片は、特定の場合において、それらが由来する親タンパク質とは異なる又は変化した生理活性機能を有するだろう。例えば、コラーゲン及びエラスチンの断片は、創傷治癒細胞の遊走、分化、及び増殖を促進すると報告されている。基底膜の崩壊も、報告によると、角化細胞とタンパク質(例えばフィブロネクチン、IV型コラーゲン、及びラミニン)との間の接着分子を破壊し、角化細胞を活性化させる。一時的なマトリックスタンパク質、特にグリコサミノグリカン及びプロテログリカンの破壊により、シグナル伝達分子が放出され、これにより線維増殖、血管新生、及びまた炎症応答も改変されると報告されている。ヘパリン硫酸は、ヘパリナーゼによって分解されて、低分子量の断片を産生し、これは線維芽細胞増殖因子2の活性を促進し、そしてヒアルロン酸の分解産物は、ヒヨコ漿尿膜(CAM)モデルにおいて血管新生を誘導すると報告されている。マトリクリプチンの上皮増殖因子様反復配列は、ラミニン5上に存在するが、このリガンドは、その生物学的機能を働かせるであろう前に、MT1-MMP(膜型マトリックスメタロプロテアーゼ)及びMMP-2の作用によって利用可能とならなければならない。マトリクリプチンの他の例としては、エラスターゼ、カテプシン、MMPよってXVIII型コラーゲンから放出されたエンドスタチン;MMP-9によってIV型コラーゲンから放出されたタムスタチン;並びに、MMP-2、MMP-9、MMP-7、及びMMP-12によって放出されたエラスチンのXGXXPG共通配列が挙げられる。
当業者は、この説明を読めば、これらのタンパク質が、本明細書で考えられた方法によって同定されることのできる生物活性剤の代表例であると判断することができることを認識するだろう。したがって、特に例えば細胞走化性及び動員、例えば組織リモデリング、組織修復及び創傷治癒の調節、免疫応答の調節、血管新生の調節、並びに組織微小環境の調節に関する、研究法及び治療法における、これらのタンパク質の及びこれらのタンパク質のための、様々な用途が提供される。
本明細書において使用するのに適したタンパク質としては、天然に存在するタンパク質及びペプチド、並びに、天然に存在するタンパク質又はペプチドとは1つ以上のアミノ酸の変異を有するタンパク質及びペプチドを含むその誘導体が挙げられる。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体を指す。特記されない限り、「アミノ酸」という用語は、それぞれの構造がこのような立体異性体形を可能とする場合、D型及びL型の両方の立体異性体を含む。
天然アミノ酸としては、アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン(Gin又はQ)、グルタミン酸(Glu又はE)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(He又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、トレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Tip又はW)、チロシン(Tyr又はY)、及びバリン(Val又はV)が挙げられる。
非天然アミノ酸としては、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、ナフチルアラニン(「naph」)、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、3級ブチルグリシン(「tBuG」)、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2’-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ホモプロリン(「hPro」又は「homoP」)、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン(「3Hyp」)、4-ヒドロキシプロリン(「4Hyp」)、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルアラニン(「MeAla」又は「Nime」)、N-アルキルグリシン(「NAG」)、例えばN-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-アルキルペンチルグリシン(「NAPG」)、例えばN-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン(「Norval」)、ノルロイシン(「Norleu」)、オクチルグリシン(「OctG」)、オルニチン(「Orn」)、ペンチルグリシン(「pG」又は「PGly」)、ピペコリン酸、チオプロリン(「ThioP」又は「tPro」)、ホモリジン(「hLys」)、及びホモアルギニン(「hArg」)が挙げられるがこれらに限定されない。
「アミノ酸類似体」という用語は、C末端カルボキシル基、N末端アミノ基、及び側鎖官能基の1つ以上が、可逆的に若しくは不可逆的に、化学的に遮断されているか、又はさもなくば別の官能基へと修飾されている、天然若しくは非天然のアミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸-(β-メチルエステル)は、アスパラギン酸のアミノ酸類似体であり;N-エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸類似体であり;又は、アラニンカルボキシアミドは、アラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、S-(カルボキシメチル)-システイン、S-(カルボキシメチル)システインスルホキシド、及びS-(カルボキシメチル)-システインスルホンが挙げられる。
「発現構築物」という用語は、問題のポリヌクレオチド分子の転写、及び場合により転写物からポリペプチドへの翻訳を可能とする配列を含む、遺伝子構築物を指す。発現構築物は典型的には、5’から3'の方向に以下を含む:
(1)構築物が導入されるであろう宿主細胞において機能的であるプロモーター、
(2)発現させる予定のポリヌクレオチド、及び
(3)構築物が導入されるであろう宿主細胞において機能する終結因子。
(1)構築物が導入されるであろう宿主細胞において機能的であるプロモーター、
(2)発現させる予定のポリヌクレオチド、及び
(3)構築物が導入されるであろう宿主細胞において機能する終結因子。
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子を修飾、操作、複製、増幅、又は輸送するために、分子生物学的技術への使用を受け入れられる、通常二本鎖DNAであるがこれに限定されない、ポリヌクレオチド分子を指す。特定の実施態様では、ベクターは、ポリヌクレオチド分子(例えば遺伝子構築物、例えば発現構築物であるがこれらに限定されない)を宿主細胞又は生物に輸送するために使用される。特定の例では、ベクターは、1つを超える宿主系において複製及び/又は維持されることができる。
ポリペプチドの「断片」は、ポリペプチドの部分配列であり、典型的には酵素活性若しくは結合活性などの活性に必要とされる機能を遂行する、及び/又は、該ポリペプチド若しくはその一部、例えばエピトープの3次元構造を与える、配列である。ポリペプチドの断片は、それが由来する完全長ポリペプチドによって有される若しくは示されるのとは異なる機能若しくは機能群を有するか若しくは惹起し得ることが理解されるだろう。
本明細書において使用する「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。様々なクラスのアミノ酸ポリマー(例えばペプチド、タンパク質、ポリペプチドなど)に関連した名称は幾分自由裁量によるが、ペプチドは一般的に約50アミノ酸長以上であることが認識されるだろう。ペプチドは、天然のアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び/又は修飾されたアミノ酸を含み得る。ペプチドは、天然のタンパク質又は非天然(合成を含む)配列の部分配列であってもよい。
本明細書において使用する「合成ペプチド」という用語は、天然ペプチド及び/又は天然タンパク質に見られるものとは明確に異なるアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。本明細書において使用する「合成ペプチド」は任意の適切な方法(例えば、組換え発現、化学合成、酵素合成など)によって産生又は合成され得、そして親ペプチドへの任意の化学的修飾を含んでいてもよく、そして、切断短縮、欠失、環化などの方法、又は出発ペプチドと同じ生物学的機能(群)を保持する合成若しくは半合成の非ペプチド誘導体を含み得るがこれらに限定されない。タンパク質合成法、例えば固相合成法は当技術分野において周知である。
「ペプチドの模倣体」又は「ペプチド模倣体」という用語は、タンパク質又はペプチドに由来する配列をまねたペプチド様分子を指す。ペプチドの模倣体又はペプチド模倣体は、アミノ酸及び/又は非アミノ酸成分を含有し得る。ペプチド模倣体の例としては、化学的に修飾されたペプチド、ペプトイド(側鎖が、α-炭素ではなくむしろ、ペプチド骨格の窒素原子に付加されている)、β-ペプチド(α-炭素ではなくむしろ、β炭素にアミノ基が結合している)などが挙げられる。化学的修飾は、アミノ酸側鎖、α-炭素原子、末端アミン基、又は末端カルボキシ基における1つ以上の修飾を含む。化学的修飾は、化学的部分の付加、新規結合の作出、又は化学的部分の除去であり得る。アミノ酸側鎖における修飾としては、リジンε-アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、若しくはリジンのN-アルキル化、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、リジンε-アミノ基の環化を介したグルタミン酸若しくはアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基を用いたラクタム形成、炭化水素の「ステープリング」(例えば、αヘリックスコンフォメーションを安定化させるため)、及びグルタミン若しくはアスパラギンの脱アミド化が挙げられるがこれらに限定されない。末端アミノ基の修飾としては、デスアミノ、N-低級アルキル、N-ジ-低級アルキル、制約されたアルキル(例えば分岐、環状、融合、アダマンチル)、及びN-アシル修飾が挙げられるがこれらに限定されない。末端カルボキシル基の修飾としては、アミド、低級アルキルアミド、制約されたアルキル、(例えば分岐、環状、融合、アダマンチル)アルキル、ジアルキルアミド、及び低球アルキルエステル修飾が挙げられるがこれらに限定されない。低級アルキルはC1~C4アルキルである。更に、1つ以上の側鎖又は末端基は、通常の技能を有するペプチド化学者には公知である保護基によって保護されていてもよい。アミノ酸のα-炭素は、一メチル化又は二メチル化されていてもよい。
本明細書に記載のタンパク質又はペプチドのいずれか1つが、特定の実施態様では、1つ以上の天然のアミノ酸、1つ以上のアミノ酸類似体を含むか、或いは、合成ペプチド若しくは合成ポリペプチド若しくはペプチドの模倣体であるか又はそれを含むことが理解されるだろう。同様に、本明細書に記載のタンパク質又はペプチドのいずれか1つが、特定の実施態様では、所望の生物学的活性(すなわち、例えば、親タンパク質若しくはペプチドと質的に類似した生理活性であるが、親タンパク質若しくはペプチドによって惹起されるのとは量的に異なる次元の作用、又は実際に異なる生理活性)を有する、ペプチド類似体を開発するための、1つ以上の修飾、合成法、又はタンパク質工学操作法のための出発点であろうことが理解されるだろう。
本明細書において使用する「融合ポリペプチド」という用語は、それぞれのアミノ残基及びカルボキシル残基を通してペプチド結合によって融合して、1つの連続したポリペプチドを形成した、2つ以上のアミノ酸配列、例えば2つ以上のポリペプチドドメインを含んでいるポリペプチドを指す。2つ以上のアミノ酸配列は、リンカー若しくはスペーサー若しくは追加のポリペプチドを通して、それらのそれぞれのアミノ末端及びカルボキシル末端を通して、直接融合していても、又は間接的に融合していてもよいことが理解されるべきである。
本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、任意の長さであるが好ましくは少なくとも10アミノ酸であるアミノ酸鎖(完全長タンパク質を含む)を包含し、ここではアミノ酸残基はペプチド共有結合によって連結されている。本明細書に記載のポリペプチドは、精製された天然産物であるか、又は、組換え技術若しくは合成技術を使用して部分的に若しくは完全に産生される。該用語は、ポリペプチド、ポリペプチド凝集物、例えば二量体又は他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体、又はその誘導体を指し得る。
本明細書において考えられる具体的なポリペプチド及びタンパク質について、個々の細菌株の間に天然の変異体が存在し得ることが理解されるだろう。これらの変異は、全体の配列におけるアミノ酸の相違(群)によって、又は、該配列内の(1つの)アミノ酸(群)の欠失、置換、挿入、逆位、若しくは付加によって実証され得る。生物学的活性及び免疫学的活性を実質的に変化させないアミノ酸の置換は周知である。関連したアミノ酸間のアミノ酸置換、又は進化中に頻繁に起こる置換は、とりわけ、Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Valである。他のアミノ酸の付加置換としては、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val、及びAla/Gluが挙げられる。この情報に基づいて、迅速かつ高感度なタンパク質の比較のための、及び相同タンパク質間の機能的類似性を決定するための方法が開発された。本明細書に記載の例示的な実施態様のこのようなアミノ酸の置換、並びに、欠失及び/又は挿入を有する変異は、結果として得られたタンパク質がその免疫反応性を維持している限り、本発明の範囲内である。このことは、本明細書に記載の1つ以上のタンパク質が、異なる野生単離株から単離された場合に、同じ免疫学的特徴を有する同じタンパク質を依然として示しつつ、100%未満の同一性レベルを有し得るのかを説明する。本明細書において具体的に同定されたタンパク質に特異的な抗体と反応することのできるタンパク質を依然として提供する、本明細書に記載の特定のタンパク質のアミノ酸配列におけるそうした変異は、本明細書において同定されたタンパク質の免疫学的に機能的な等価体であると判断され、したがって、該タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない。
タンパク質が、例えば診断目的若しくは治療目的のために、例えば抗体と反応させるために、又は生物学的作用、例えばインビボにおける天然タンパク質に関連した1つ以上の生物学的機能を媒介するために使用される場合、完全なタンパク質を使用することは都合が良い場合があるが、必ずしも使用する必要はない。また、そのタンパク質のポリペプチド断片(例えば、そのまま、又は担体と結合させて、又は融合ポリペプチド内の一成分として)、又は所望の生物学的効果、例えばそのタンパク質に対する免疫応答を惹起できる、又はそのタンパク質に特異的な抗体によって認識されることのできる、細胞シグナル伝達効果を媒介することができるなどの、そのタンパク質若しくは関連したアミノ酸配列に由来するポリペプチド断片を使用することも可能である。このようなポリペプチド断片は、それが有する機能、例えばそれが由来していた完全長タンパク質と共有する機能に関連して言及され得る。例えば、免疫学的効果を有するポリペプチド断片は、免疫原性断片と称され得、ここで「免疫原性断片」は、脊椎動物宿主において免疫応答を誘発するか又は親タンパク質に特異的な抗体によって認識されるその能力を保持している、完全長タンパク質の断片であると理解される。同様に、それが由来していた完全長タンパク質によって惹起される1つ以上の生物学的効果を保持しているか若しくは有するか、又は、関連した若しくは異なる生物学的効果を有する、ポリペプチド断片は、本明細書において、「生理活性断片」又は「生理活性ポリペプチド断片」と称される。同様に、生物学的効果を有するポリペプチド、例えば細胞内で生物学的応答を刺激することができるか又は治療効果を惹起することができるポリペプチドは、本明細書において、「生理活性断片」又は「生理活性ポリペプチド断片」又はその文法上の等価体と称され得る。
このようなポリペプチド断片、並びにこのような断片をコードしているDNA断片を同定するために、様々な技術が利用可能である。例えば、免疫原性断片の場合、このような断片は、1つ以上の決定基又はエピトープを含み得る。エピトープの検出のためのよく確立された経験的方法及びコンピューター計算法が存在し、これは当業者には周知である。例えば、コンピューターアルゴリズムは、既知のエピトープとのそれらの配列的及び/又は構造的一致に基づいて、免疫学的に重要なエピトープとして、特定のタンパク質断片を指定することができる。これらの領域の決定は典型的には、親水性基準及び二次構造の特色の組合せに基づいている。免疫原性断片(又はエピトープ)は通常、最小6のアミノ酸長、より一般的には8アミノ酸長、好ましくは8を超える、例えば9、10、12、15、又は更には20以上のアミノ酸長を有する。それ故、このような断片をコードする核酸配列は、少なくとも18、より一般的には24、好ましくは27、30、36、45、又は更には60の核酸長を有する。
同様に、当業者は、特定の生物学的応答の同定又は検出に標的化された様々なアッセイを使用して、生理活性断片を同定する方法を知っているだろう。本明細書において考えられる生理活性断片の同定又は検出に使用するに適した代表的な方法は、実施例を含む、以下において提示されている。
ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、天然ポリペプチド、組換え型ポリペプチド、及び合成で作製されたポリペプチド、例えば、1つ以上の非天然アミノ酸、1つ以上のアミノ酸類似体、及びペプチドの模倣体を含んでいるポリペプチドを包含する。変異ポリペプチド配列は好ましくは、本発明の配列に対して、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、少なくとも56%、少なくとも57%、少なくとも58%、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を示す。同一性は、少なくとも20アミノ酸の位置、好ましくは少なくとも50アミノ酸の位置、少なくとも100アミノ酸の位置、又は本発明のポリペプチドの全長におよぶ比較窓にわたり見られる。
ポリペプチド配列の同一性は、以下の方法で決定され得る。対象ポリペプチド配列は、NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)から公共的に入手可能である、BLASTP(BLASTのプログラム一式、バージョン2.2.10[2004年10月]に由来)のbl2seqを使用して候補ポリペプチド配列と比較する。低複雑度領域のフィルタリングは無効にされるべきであること以外は、bl2seqのデフォールトパラメーターを利用する。
ポリペプチド配列の同一性はまた、グローバル配列アラインメントプログラムを使用して、候補ポリヌクレオチド配列と対象ポリヌクレオチド配列との間の重複の全長上で計算されてもよい。上記に考察されているようなEMBOSS-needle(http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/において入手可能)及びGAP(Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.)も、ポリペプチド配列の同一性を計算するのに適したグローバル配列アラインメントプログラムである。
本明細書において考えられるポリペプチド変異体はまた、そうした配列の機能的等価性を保存している可能性が高く、かつ妥当に考えて偶然に発生したとは考えられない、1つ以上の具体的に同定された配列に対する類似性を示すものも包含する。ポリペプチドに関するこのような配列類似性は、BLASTのプログラム一式(NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)のバージョン2.2.10[2004年10月])から公共的に入手可能なbl2seqプログラムを使用して決定され得る。ポリペプチド配列の類似性は、以下のunixコマンドラインパラメーターを使用して調べられ得る。
bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-FF-pblastp
変異ポリペプチド配列は好ましくは、具体的に同定された配列のいずれか1つと比較して、1×10-10未満、より好ましくは1×10-20未満、1×10-30未満、1×10-40未満、1×10-50未満、1×10-60未満、1×10-70未満、1×10-80未満、1×10-90未満、1×10-100未満、1×10-110未満、1×10-120未満、1×10-123未満のE値を示す。
-FFというパラメーターは、低複雑度区画のフィルタリングを無効にする。-pというパラメーターは、配列対のための適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似領域を発見し、各々のそのような領域について「E値」を報告し、これはランダムな配列を含有している一定の基準サイズのデータベース内で偶然にこのような一致を認めることを予想できる予想回数である。1よりはるかに低い、小さなE値については、これはこのようなランダムな一致のおよその確率である。
その生物学的活性の有意な改変を伴わない記載のポリペプチド配列の1つ又はいくつかのアミノ酸の保存的置換も、本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法を知っているだろう(例えば、Bowie et al., 1990, Science 247, 1306参照)。
本明細書において考えられるポリペプチド変異体はまた、ポリペプチドをコードしているが、異なるアミノ酸配列を有するように異なってプロセシングされているという点で野生型ポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードしている、核酸から産生されたものを包含する。例えば、1つの実施態様では、変異体は、野生型ポリペプチドを産生するものに対する一次RNA転写物の選択的スプライシングパターンによって産生される。
他の実施態様では、生物活性剤は、脂質、多糖、核酸、ケモカイン、ビタミン、ホルモンなどである。
治療法及び治療用組成物
本明細書に記載の方法及び生物活性剤は、特定の実施態様では、それを必要とする対象における、治療法に、例えば、1つ以上の疾患、障害、病状、又は容態の処置に使用される。
本明細書に記載の方法及び生物活性剤は、特定の実施態様では、それを必要とする対象における、治療法に、例えば、1つ以上の疾患、障害、病状、又は容態の処置に使用される。
本明細書において使用する「対象」は、動物、通常、哺乳動物(哺乳動物のペット用動物又はヒトを含む)である。代表的なペット用動物としては、ネコ、ウマ及びイヌが挙げられる。代表的な農業用動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、及びブタが挙げられる。
本明細書において考えられる様々な治療法が典型的には、有効量の生物活性剤の投与を具現するだろうことが理解されるだろう。
「有効量」は、有益な又は所望の結果(臨床結果を含む)を奏功するに十分な量である。有効量は、様々な投与経路によって1回以上の投与で投与され得る。有効量は、他の因子の中でもとりわけ、適応される疾患又は容態、疾患又は容態の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、投与される薬剤の効力、投与形態、並びに所望される処置に応じて変更されるだろう。当業者は、これらの任意の他の関連した因子を考慮して、適切な用量を決定することができるだろう。
処置される予定の具体的に考えられる疾患、障害、病状、又は容態としては、対象における幹細胞応答の調節から恩恵を受けるであろうものが挙げられる。
本明細書において使用する「処置」という用語及び関連した用語、例えば「処置している」及び「処置する」は一般的に、いくつかの所望の治療効果が達成される、ヒト対象又はヒト以外の被験体の処置に関する。治療効果は、例えば、疾患又は容態の阻止、低減、寛解、停止、又は予防であり得る。
本明細書において使用する「幹細胞」という用語は、分化することなく自己再生することができ、他の細胞型に分化することができる、細胞を指す。「幹細胞」という用語は、文脈により与えられるように、全能性細胞、多能性細胞、及び複能性細胞を包含する。
本明細書において使用するのに特に考えられる代表的な幹細胞としては、幹細胞を含有している組織源からの単離後に、インビトロで培養された幹細胞が挙げられる。1つの実施態様では、幹細胞は間葉系幹細胞である。
幹細胞は、他の細胞型に分化することができ、分化することなく自己再生する能力も有する。必要に応じて様々に分化した機能的な細胞を供給することによって、幹細胞は、新規組織の形成に、及び損傷を受けたか又は疾患を有する組織の修復のために重要である[Li, L., & Xie, T. (2005). Stem cell niche: structure and function. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21, 605-631.]。この前駆細胞の機能に加えて、幹細胞はまた、例えば、生理活性因子の分泌を介して、及び他の細胞型の行動を調節することを通して、組織再生及び修復を促進するというそれら自身の機能も示す[Duscher, D., Barrera, J., Wong, V. W., Maan, Z. N., Whittam, A. J., Januszyk, M., & Gurtner, G. C. (2016). Stem cells in wound healing: the future of regenerative medicine? A mini-review. Gerontology, 62(2), 216-225.]。正常な組織の増殖及び修復の一部として、局所的な内因性幹細胞は、これらの機能を遂行するが、広範な組織傷害の環境では又は疾患要因が併存する場合には、正常な内因性幹細胞集団では十分ではない場合もある[Kanji, S., & Das, H. (2017). Advances of stem cell therapeutics in cutaneous wound healing and regeneration. Mediators of inflammation, 2017.]。
幹細胞療法は、再生医療において非常に可能性を有すると認識され、追加の幹細胞の投与は、皮膚創傷[Falanga, V., Iwamoto, S., Chartier, M., Yufit, T., Butmarc, J., Kouttab, N., & Carson, P. (2007). Autologous bone marrow-derived cultured mesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray accelerate healing in murine and human cutaneous wounds. Tissue engineering, 13(6), 1299-1312.]、神経系の損傷[di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., & Kalbermatten, D. F. (2010). Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery, 63(9), 1544-1552.]及び心筋梗塞[Berry, M. F., Engler, A. J., Woo, Y. J., Pirolli, T. J., Bish, L. T., Jayasankar, V., & Sweeney, H. L. (2006). Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 290(6), H2196-H2203.]を含む、多種多様な損傷及び疾患状態において改善された転帰を示す。
しかしながら、現在の幹細胞の投与技術は不十分かつ侵襲的であり、ドナー組織の収集、抽出、濃縮、及び単離された幹細胞集団の再投与を必要とする。したがって、内因性幹細胞の局所的動員を誘導することができる治療剤は、幹細胞の活性から恩恵を受ける容態の処置にかなり有用である。
例えば、成人の骨髄において、間葉系幹細胞(MSC)は、自己再生することができ、組織修復に重要な役割を果たす、再生細胞のプールである。まず、間葉系幹細胞は、損傷部位に必要とされる細胞へと分化することができる。それらは、造血幹細胞のニッチを維持することによって造血を支える。それらは、炎症応答を調節するサイトカイン、並びに、細胞動員、血管新生及びコラーゲン合成などの治癒プロセスを促進する栄養因子を放出する。間葉系幹細胞は、線維芽細胞、線維細胞、及び周皮細胞と共に、筋線維芽前駆細胞へと分化することができ、これは、細胞マトリックス相互作用、マトリックスの剛性、及び力学的ストレスによって刺激されて、筋線維芽細胞(創傷治癒において細胞を産生する一次マトリックス)となる。
骨髄由来幹細胞はまた、周皮細胞、内皮細胞、及び角化細胞を形成すると報告されている。間葉系幹細胞は、損傷部位に必要とされる細胞型へと分化することができるだけでなく、他の創傷治癒細胞の調節にも重要な役割を果たしている。間葉系幹細胞は、線維芽細胞遊走速度、増殖速度、及びコラーゲン合成速度、並びに、内皮細胞のチューブ形成を増加させる。創傷治癒の炎症段階の間に、間葉系幹細胞は、IL-10とIL-4を産生する、T細胞の増殖を遮断することによって免疫応答を調節する。増殖段階中に、間葉系幹細胞は、傍分泌シグナルを放出して、角化細胞、皮膚線維芽細胞、及び他の近くの幹細胞を動員する。それらは、創傷を治癒する重要な増殖因子、例えば角化細胞増殖因子(KGF)、血管内皮増殖因子、及び血小板由来増殖因子を分泌する。最後に、リモデリング中に、間葉系幹細胞は、マトリックスメタロプロテイナーの発現及びコラーゲンの沈着を調節する。
したがって、特定の部位への間葉系幹細胞の動員を惹起することのできる生物活性剤の投与は、間葉系幹細胞が惹起することができる無数の生物学的応答から恩恵を受けるであろう、疾患、障害、病状、又は容態の処置に有用である。問題の部位への他の幹細胞型の動員も同様に、治療有用性を有するだろう。
1つのこのような生物活性剤は、本明細書に記載のMayDayペプチドである。したがって、本明細書において特に考えられるのは、本明細書に記載の1つ以上のタンパク質を利用する、検出法、診断法、研究法及び治療法、組成物、試薬、及びキットである。
したがって、本発明は、例えば、本明細書に記載のような方法を介して、1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定するためのキットに関し、ここでのキットは、無細胞細胞外マトリックス及び場合により1つ以上の外因性細胞を、場合により本明細書に記載のような1つ以上の組成物と一緒に含む。
本発明において、MayDay又は断片、変異体、ペプチド類似体、又はその誘導体の生理学的効果は、軟組織再生のより広い脈絡において、幹細胞を動員することであるが、これはまた、以下を含むがこれらに限定されない下流の生物学的プロセスにも関与し得る;血管新生、脈管形成、組織リモデリング、循環中の幹細胞の濃縮、及び筋肉組織再生。
幹細胞の動員は、軟組織の修復、及び、筋肉を含む軟組織に関連した疾患、障害、又は病状における管理又は介入に広く有益である。このような損傷、疾患、又は病状としては、心筋梗塞、外科的発明若しくは外傷に因る組織の欠損、末梢血系における前駆細胞を含む幹細胞の濃縮が挙げられ得るがこれらに限定されない。
1つの態様では、本発明は、本明細書に記載のような方法によって同定された有効量の生物活性剤、例えば有効量の本明細書に記載のポリペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒、及び薬学的に許容可能な担体を含んでいる、医薬組成物に関する。
医薬組成物は、有効量の2つ以上の物質、例えば本明細書に記載の2つ以上のペプチドを組み合わせて含んでいてもよい。
それを必要とする対象における、タンパク質又はペプチドを含む生物活性剤の治療的投与を含む、生理活性タンパク質などの生物活性剤の投与に適した組成物は、当技術分野において公知である。
例えば、生物活性剤、例えば本明細書に記載のようなポリペプチド、例えばいわゆるMayDayペプチド、又はその断片、変異体、ペプチド類似体、若しくは誘導体は、特定の実施態様では、薬学的に許容可能な担体、賦形剤と共に製剤化されるか、或いは、他の物質と組み合わせて、生物活性剤のバイオアベイラビリティ、又は半減期、又は効力を向上させ、そして該組成物は対象に投与される。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、本明細書に記載のMayDayペプチド又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物などの生物活性剤と一緒に、対象に投与され得る、担体(補助剤又はビヒクル)を指す。
かつてこのような担体は食塩水(0.9%塩化ナトリウム)であるが、他の担体も適用可能である。
前記組成物に使用され得る薬学的に許容可能な担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達システム(SEDDS)、例えばd-a-トコフェロールポリエチレングルコール1000スクシネート、製薬上の剤形で使用される界面活性剤、例えばTween、又は他の類似したポリマー送達マトリックス、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基剤とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びラノリンが挙げられるがこれらに限定されない。
シクロデキストリン、例えばα-、β-、及びγ-シクロデキストリン、又は化学的に修飾された誘導体、例えばヒドロキシアルキルシクロデキストリン(2-及び3-ヒドロキシプロピル-3-シクロデキストリンを含む)、又は他の可溶化誘導体もまた、送達を増強するために有利には使用され得る。油溶液又は懸濁液はまた、乳剤又は懸濁剤などの薬学的に許容可能な剤形の製剤化に一般的に使用される、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、又はカルボキシメチルセルロース若しくは類似した分散剤も含有していてもよい。
前記組成物は、経口又は非経口(局所、皮下、筋肉内及び静脈内を含む)投与を含むがこれらに限定されない、任意の選択された経路による、対象への投与を可能とするように製剤化される。
例えば、前記組成物は、目的の投与経路及び標準的な製薬上の慣行に応じて選択された適切な薬学的に許容可能な担体(賦形剤、希釈剤、助剤、及びその組合せを含む)を用いて製剤化され得る。例えば、該組成物は、散剤、液剤、錠剤、若しくはカプセル剤として経口投与されても、又は軟膏剤、クリーム剤、若しくはローション剤として局所的に投与されてもよい。適切な製剤は、必要に応じて、乳化剤、抗酸化剤、芳香剤、又は着色剤を含む、追加の物質を含有していてもよく、即時放出、遅延放出、改変された放出、持続放出、パルス放出、又は徐放性放出のために適応させ得る。
本明細書に記載のようなポリペプチドの投与に関する特定の実施態様では、投与は典型的には、問題の部位への、例えば損傷部位における軟組織への、直接的な注射又は沈着を含むだろう。
前記組成物は、バイオアベイラビリティ若しくは活性を最適化させるように、又は例えば長時間、治療範囲内に血漿中濃度、血中濃度、及び組織中濃度を維持するように製剤化され得る。例えば作用部位における生物活性剤の濃度を最適化するために徐放性送達製剤が使用されてもよい。
前記組成物は、定期的な投与のために、例えば持続した曝露をもたらすために製剤化されてもよい。
前記組成物は、非経口経路を介して投与されてもよい。非経口剤形の例としては、活性物質の水性液剤、等張食塩水又は5%ブドウ糖、又は他の周知の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。例えばシクロデキストリン、又は当業者には周知である他の可溶化剤を、治療剤の送達のための薬学的賦形剤として利用してもよい。
経口投与に適した剤形の例としては、治療有効量の組成物をもたらすことのできる、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、若しくは類似の剤形、又は任意の液体の剤形、例えばシロップ剤、水性液剤、乳剤などが挙げられるがこれらに限定されない。カプセル剤は、任意の標準的な薬学的に許容可能な物質、例えばゼラチン又はセルロースを含有してもよい。錠剤は、慣用的な手順に従って、活性成分と、固形担体及び潤滑剤との混合物を圧縮することによって製剤化され得る。固形担体の例としては、デンプン及び糖ベントナイトが挙げられる。
活性成分はまた、結合剤、例えばラクトース若しくはマンニトール、慣用的な充填剤、及び打錠化剤を含有している、ハードシェル錠剤又はカプセル剤の剤形で投与されてもよい。経口投与用の剤形は、腸溶性コーティングを用いて製剤化することにより、胃内における剤形の溶出若しくは崩壊を防いで、薬剤の遅延放出及び/又は胃より後の(例えば腸管上部における)薬剤の放出を可能とすることができる。
経皮投与に適した剤形の例としては、経皮パッチ、経皮包帯などが挙げられるがこれらに限定されない。
前記組成物の局所投与に適した剤形の例としては、皮膚への直接的な適用であれ、又はパッド、パッチなどの媒介物を介した適用であれ、任意のローション剤、スティック剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ゲル剤などが挙げられる。
前記組成物の坐剤投与に適した剤形の例としては、身体開口部に挿入された任意の固形剤形、特に直腸に、膣内に、及び尿道に挿入されたものが挙げられる。
前記組成物の注射に適した剤形の例としては、静脈内注射、皮下、真皮下、及び筋肉内投与、又は経口投与による、1回又は複数回の投与などの、ボーラスを介した送達が挙げられる。
前記組成物の持効性製剤の投与に適した剤形の例としては、ペプチドのペレット剤又は固形剤が挙げられ、ここでのペプチドは、生分解性ポリマー、マイクロエマルション、リポソームのマトリックスに封入されているか、又はマイクロカプセル化されている。
前記組成物用の注入装置の例としては、所望の回数の用量又は定常状態の投与をもたらすための注入ポンプが挙げられ、これには埋め込み可能な薬物ポンプが挙げられる。
前記組成物用の埋め込み可能な注入装置の例としては、生物活性剤が生分解性ポリマー若しくは合成ポリマー、例えばシリコン、シリコンゴム、シラスティック若しくは類似したポリマー中に封入されているか又は分散されている、任意の固形剤形が挙げられる。
前記組成物の経粘膜送達に適した剤形の例としては、活性成分に加えて、当技術分野において適切であることが知られているような担体を含有している、浣腸、膣座薬、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡状剤、噴霧化溶液、散剤及び類似した製剤のための貯蔵用液剤が挙げられる。このような剤形としては、薬学的に許容可能な水性溶媒又は有機溶媒又はその混合物中の溶液及び/又は懸濁液、並びに/或いは粉末を含んでいる組成物を含む、該組成物の吸入又はガス注入に適した剤形が挙げられる。該組成物の経粘膜投与は、任意の粘膜を使用し得るが、一般的には鼻腔、頬側、膣、及び直腸組織を利用する。該組成物の鼻腔内投与に適した製剤は、液体剤形で、例えば鼻腔スプレー、点鼻液で、又はポリマー粒子の水性若しくは油性の溶液を含むネブライザーによるエアゾール投与により投与され得る。製剤は、例えば、食塩水中の水溶液、ベンジルアルコール若しくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強させる吸収促進剤、フルオロカーボン、及び/又は当技術分野において公知である他の可溶化剤若しくは分散剤を使用した溶液として調製され得る。
前記組成物の頬側又は舌下投与に適した剤形の例としては、ロゼンジ剤、錠剤などが挙げられる。該組成物の眼内投与に適した剤形の例としては、薬学的に許容可能な水性溶媒又は有機溶媒中の溶液及び/又は懸濁液を含む、インサート及び/又は組成物が挙げられる。
前記組成物の製剤の例は、例えばSweetman, S. C. (編). Martindale. The Complete Drug Reference、第33版、Pharmaceutical Press、シカゴ、2002、2483頁;Aulton, M. E. (編) Pharmaceutics. The Science of Dosage Form Design、チャーチヒルリビングストン、エジンバラ、2000、734頁;及びAnsel, H. C, Allen, L. V. and Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第7版、リッピンコット1999, 676頁に見られ得る。薬物送達システムに使用される賦形剤は、例えば、Kibbe, E. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients、第3版、米国薬学会、ワシントン、2000、665頁を含む、当業者には公知である様々な刊行物に記載されている。米国薬局方はまた、錠剤又はカプセル剤として製剤化されているものを含む、放出制御経口剤形の例を提供する。例えば、長期持続放出及び遅延放出の錠剤及びカプセル剤の薬物放出能を決定する具体的な試験も説明している、米国薬局方23/米国国民医薬品集18、米国薬局方協会、ロックビル、MD州、1995年(本明細書では以後「USP」)を参照されたい。長期持続放出物品及び遅延放出物品の薬物放出についてのUSP試験は、経過試験時間に対する用量単位からの薬物の溶解に基づく。様々な試験装置及び手順の説明は、USPに見られ得る。長期持続放出剤形の分析に関する更なる指針は、米国食品医薬品局によって提供されている(産業ガイド。長期持続放出経口剤形:開発、評価、及びインビトロ/インビボ相関の応用、ロックビル、MD州:医薬品評価研究センター、米国食品医薬品局、1997年を参照)。
2つ以上の物質が投与又は使用される場合、2つ以上の物質が同時に、順次、又は別々に投与又は使用され得る。
本発明は、以下の実施例を参照して更に説明される。特許請求されているような本発明は、いずれにしても、これらの実施例によって制限されるものではないことが理解されるだろう。
実施例
実施例1:生物活性剤の代表的なアッセイ
本実施例は、生物活性剤候補(この場合、走化性活性を有する生物活性剤)を同定するための、トランズウェル遊走バイオアッセイにおける、マクロファージ(MΦ)と組み合わせたヒツジ前胃マトリックス(OFM)の使用を記載する。
実施例1:生物活性剤の代表的なアッセイ
本実施例は、生物活性剤候補(この場合、走化性活性を有する生物活性剤)を同定するための、トランズウェル遊走バイオアッセイにおける、マクロファージ(MΦ)と組み合わせたヒツジ前胃マトリックス(OFM)の使用を記載する。
方法
ovAD-MSCの単離
ヒツジ脂肪由来間質細胞(ovAD-MSC)は、Li et al.(Li, Curley et al. 2018)に従って、ドナー動物の皮下脂肪組織から単離された。脂肪組織は、成体雌ヒツジの肩から無菌的に切除された。組織標本は、約1×1cmに切断され、その後、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)(ギブコ社)(3回、20mL)で室温で10分間濯いだ。組織を刻み、その後、クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)由来の0.1%コラゲナーゼ/DPBS(10mL)(シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、MI州、米国)を用いて、50rpmで穏やかに振盪しながら37℃で1時間消化した。等容量のDMEM10を加え、100mmの細胞培養プレート(コーニング社、NY州、米国)上で一晩インキュベートした。接着細胞を(DMEM2、10mL)で濯ぎ、3継代、DMEM2中で継代させた。細胞を、DMEM2(10mL)中で維持し、培地を3日間毎に交換し、TrypLE(商標)Express(1.5mL)(ギブコ社)を使用して週1回トリプシン処理した。
ovAD-MSCの単離
ヒツジ脂肪由来間質細胞(ovAD-MSC)は、Li et al.(Li, Curley et al. 2018)に従って、ドナー動物の皮下脂肪組織から単離された。脂肪組織は、成体雌ヒツジの肩から無菌的に切除された。組織標本は、約1×1cmに切断され、その後、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)(ギブコ社)(3回、20mL)で室温で10分間濯いだ。組織を刻み、その後、クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)由来の0.1%コラゲナーゼ/DPBS(10mL)(シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、MI州、米国)を用いて、50rpmで穏やかに振盪しながら37℃で1時間消化した。等容量のDMEM10を加え、100mmの細胞培養プレート(コーニング社、NY州、米国)上で一晩インキュベートした。接着細胞を(DMEM2、10mL)で濯ぎ、3継代、DMEM2中で継代させた。細胞を、DMEM2(10mL)中で維持し、培地を3日間毎に交換し、TrypLE(商標)Express(1.5mL)(ギブコ社)を使用して週1回トリプシン処理した。
ovAD-MSCの分化
細胞(ovAD-MSC、3回継代)を分割し、単層が80%の集密度となるまで、24ウェルプレート(コーニング社)のDMEM2中に、100,000個の細胞/mL(0.5mL)の濃度で播種した。培地を、骨形成分化培地、軟骨形成分化培地、又は脂肪生成分化培地(1mL)(StemPro(商標)骨形成分化キット、脂肪生成分化キット、軟骨形成分化キット、ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、米国)に交換した。細胞を、それぞれの培地中で2週間維持し、培地は3日間毎に交換した。分化した細胞単層を、DPBS(1mL)で濯ぎ、その後、10%中性緩衝ホルマリン(1mL)(シグマ・アルドリッチ社)で室温で10分間かけて固定した。単層の脂肪細胞は、オイルレッドO(0.5%w/vのイソプロパノール、1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色され、0.1%のヘマトキシリン溶液(1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で対比染色された。骨細胞は、2%のアリザリンレッドS(1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色された。軟骨細胞は、アルシアンブルー8XG溶液(1mL、1%w/vの3%酢酸、pH2.5、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色された。培養液を、ROH2O(3回、1mL)で濯ぎ、その後、オリンパス倒立位相差顕微鏡(IX51、オリンパス、東京、日本、データは示されていない)を使用して画像撮影した。
細胞(ovAD-MSC、3回継代)を分割し、単層が80%の集密度となるまで、24ウェルプレート(コーニング社)のDMEM2中に、100,000個の細胞/mL(0.5mL)の濃度で播種した。培地を、骨形成分化培地、軟骨形成分化培地、又は脂肪生成分化培地(1mL)(StemPro(商標)骨形成分化キット、脂肪生成分化キット、軟骨形成分化キット、ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、米国)に交換した。細胞を、それぞれの培地中で2週間維持し、培地は3日間毎に交換した。分化した細胞単層を、DPBS(1mL)で濯ぎ、その後、10%中性緩衝ホルマリン(1mL)(シグマ・アルドリッチ社)で室温で10分間かけて固定した。単層の脂肪細胞は、オイルレッドO(0.5%w/vのイソプロパノール、1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色され、0.1%のヘマトキシリン溶液(1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で対比染色された。骨細胞は、2%のアリザリンレッドS(1mL、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色された。軟骨細胞は、アルシアンブルー8XG溶液(1mL、1%w/vの3%酢酸、pH2.5、室温、10分間)(シグマ・アルドリッチ社)で染色された。培養液を、ROH2O(3回、1mL)で濯ぎ、その後、オリンパス倒立位相差顕微鏡(IX51、オリンパス、東京、日本、データは示されていない)を使用して画像撮影した。
マクロファージとヒツジ前胃マトリックスの共培養
ヒツジ前胃マトリックスを約4×4cmの試料に切断し、100mmの培養プレート(コーニング社)中のDMEM(2mL)中で37℃で16時間かけて予め馴化させた。DMEM(100,000個の細胞/mLで1mL)中のRAW264.7(ATCC、TIB-71)(Raschke, Baird et al. 1978)マクロファージ(MΦ)を、ヒツジ前胃マトリックス(約100,000個の細胞)上に播種し、インキュベート(30分間、37℃)して、細胞を付着させた。追加のDMEMを加えて、最終容量を1ウェルあたり5mLとした。試料を、37℃で24時間インキュベートした。対照として、マクロファージを、同じ濃度で空のプレートに播種した。培地を吸引し、回収し、フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)(シグマ・アルドリッチ社)を、最終濃度10μMで加えた。それぞれの試料の馴化培地の試料(マクロファージのみ、ヒツジ前胃マトリックスのみ、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス)を滅菌ろ過し(0.22μm)、使用前に-20℃で保存した。
ヒツジ前胃マトリックスを約4×4cmの試料に切断し、100mmの培養プレート(コーニング社)中のDMEM(2mL)中で37℃で16時間かけて予め馴化させた。DMEM(100,000個の細胞/mLで1mL)中のRAW264.7(ATCC、TIB-71)(Raschke, Baird et al. 1978)マクロファージ(MΦ)を、ヒツジ前胃マトリックス(約100,000個の細胞)上に播種し、インキュベート(30分間、37℃)して、細胞を付着させた。追加のDMEMを加えて、最終容量を1ウェルあたり5mLとした。試料を、37℃で24時間インキュベートした。対照として、マクロファージを、同じ濃度で空のプレートに播種した。培地を吸引し、回収し、フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)(シグマ・アルドリッチ社)を、最終濃度10μMで加えた。それぞれの試料の馴化培地の試料(マクロファージのみ、ヒツジ前胃マトリックスのみ、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス)を滅菌ろ過し(0.22μm)、使用前に-20℃で保存した。
トランズウェル遊走アッセイ
トランズウェル遊走アッセイを、24ウェルトランズウェルシステム(6.5mmのトランズウェル(登録商標)、コーニング社)を使用して、Boyden et al.(Boyden 1962)の方法に従って実施した。馴化培地試料(ヒツジ前胃マトリックス、マクロファージ、及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ)を、DMEMで1:1に希釈し、胎児ウシ血清を補充することにより、0.5%(DMEM0.5)の最終濃度が得られた。DMEM0.5及び組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2(シグマ・アルドリッチ社)(DMEM0.5中50ng/mL)を、陰性対照及び陽性対照としてそれぞれ使用した。各ウェルについて、400μlの各試験試料を、3つ組で下のチャンバーに加えた。ovAD-MSC(5回継代)を、TrypLE(商標)Express(1.5mL)(ギブコ社)を使用してトリプシン処理し、計数し、DMEM0.5に再懸濁し、100,000個の細胞/mLとした。100μLの容量の細胞懸濁液をインサート(上のチャンバー)に蒔いた。培養液を6時間インキュベートし、その後、トランズウェル膜をプレートから取り出し、DPBS(500μL)で濯いだ。遊走していない細胞を、綿棒を使用してインサートから除去し、その後、インサートを、ROH2Oで80%v/vまで希釈された氷冷メタノール(0.5mL)(シグマ社)で10分間かけて固定した。固定されたインサートを、20%メタノール/ROH2O(v/v)中0.5%(w/v)クリスタルバイオレット(シグマ・アルドリッチ社)染色溶液0.5mLを含有している新規プレートに30分間かけて移した。インサートを、ROH2O(3回、100mL)で濯ぎ、その後、乾燥させた。細胞を、倒立顕微鏡(IX51、オリンパス社、東京、日本)によって400倍の倍率で画像撮影し、インサート全体にわたり1つのインサートあたり5つの代表的な画像を撮影した。遊走した細胞の数は、ImageJ(NIH、ベセスダ、米国)を使用して手作業で計数し、膜の面積(0.33cm2)を乗じて、1つのインサートあたりの遊走した細胞の総数を決定した。遊走した細胞の数は、培地のみの対照において遊走した細胞数と比較して表現された。結果は、培地のみの対照と比較した、正規化された細胞の遊走として表現され、3回の独立した実験の平均値を示す。統計分析(t検定)は、グラフパッドプリズム(バージョン8.4.1)を使用して実施された;「*」、p<0.05;「**」、p<0.01;「***」、p<0.001;「****」、p<0.0001。
トランズウェル遊走アッセイを、24ウェルトランズウェルシステム(6.5mmのトランズウェル(登録商標)、コーニング社)を使用して、Boyden et al.(Boyden 1962)の方法に従って実施した。馴化培地試料(ヒツジ前胃マトリックス、マクロファージ、及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ)を、DMEMで1:1に希釈し、胎児ウシ血清を補充することにより、0.5%(DMEM0.5)の最終濃度が得られた。DMEM0.5及び組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2(シグマ・アルドリッチ社)(DMEM0.5中50ng/mL)を、陰性対照及び陽性対照としてそれぞれ使用した。各ウェルについて、400μlの各試験試料を、3つ組で下のチャンバーに加えた。ovAD-MSC(5回継代)を、TrypLE(商標)Express(1.5mL)(ギブコ社)を使用してトリプシン処理し、計数し、DMEM0.5に再懸濁し、100,000個の細胞/mLとした。100μLの容量の細胞懸濁液をインサート(上のチャンバー)に蒔いた。培養液を6時間インキュベートし、その後、トランズウェル膜をプレートから取り出し、DPBS(500μL)で濯いだ。遊走していない細胞を、綿棒を使用してインサートから除去し、その後、インサートを、ROH2Oで80%v/vまで希釈された氷冷メタノール(0.5mL)(シグマ社)で10分間かけて固定した。固定されたインサートを、20%メタノール/ROH2O(v/v)中0.5%(w/v)クリスタルバイオレット(シグマ・アルドリッチ社)染色溶液0.5mLを含有している新規プレートに30分間かけて移した。インサートを、ROH2O(3回、100mL)で濯ぎ、その後、乾燥させた。細胞を、倒立顕微鏡(IX51、オリンパス社、東京、日本)によって400倍の倍率で画像撮影し、インサート全体にわたり1つのインサートあたり5つの代表的な画像を撮影した。遊走した細胞の数は、ImageJ(NIH、ベセスダ、米国)を使用して手作業で計数し、膜の面積(0.33cm2)を乗じて、1つのインサートあたりの遊走した細胞の総数を決定した。遊走した細胞の数は、培地のみの対照において遊走した細胞数と比較して表現された。結果は、培地のみの対照と比較した、正規化された細胞の遊走として表現され、3回の独立した実験の平均値を示す。統計分析(t検定)は、グラフパッドプリズム(バージョン8.4.1)を使用して実施された;「*」、p<0.05;「**」、p<0.01;「***」、p<0.001;「****」、p<0.0001。
結果
ヒツジ前胃マトリックスのみ、マクロファージのみ、又はヒツジ前胃マトリックス-マクロファージの共培養液に応答した、間葉系幹細胞(MSC)の走化性の定量が、図3に示されている。
ヒツジ前胃マトリックスのみ、マクロファージのみ、又はヒツジ前胃マトリックス-マクロファージの共培養液に応答した、間葉系幹細胞(MSC)の走化性の定量が、図3に示されている。
容易に理解できるように、このovAD-MSC遊走アッセイでは、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ馴化培地は、培地のみの対照と比較して、相対的な細胞遊走の統計学的に有意な増加がもたらされた(それぞれ2.14±1.19及び0.98±0.47、図3)。マクロファージのみ(MΦ、1.21±0.57、図3)及びヒツジ前胃マトリックスのみ(OFM、1.27±0.55、図3)に由来する馴化培地は、相対的な細胞遊走に対して有意な増加を示したが、ヒツジ前胃マトリックスとマクロファージの両方の組合せは、最大の相対的な細胞遊走をもたらした。
したがって、ヒツジ前胃マトリックスの存在下におけるマクロファージの培養は、ヒツジ前胃マトリックスのみ又はマクロファージのみよりも、間葉系幹細胞の動員において有意により良好であった。
本発明者らは、いかなる理論にも拘りたくはないが、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージの共培養液から得られた効力の観察された増加は、マクロファージとヒツジ前胃マトリックスの相互作用により、脱細胞化細胞外マトリックスから1つ以上の遊離した生物活性物質が産生されたことに関連し、ここでの1つ以上の遊離した生物活性物質は、分離された場合の2つの個々の成分と比較して、改善された間葉系幹細胞の動員を示すと考える。
実施例2:生理活性ポリペプチドの単離
本実施例は、本明細書に記載のような代表的な方法を使用した、生理活性ポリペプチドの単離を説明する。
本実施例は、本明細書に記載のような代表的な方法を使用した、生理活性ポリペプチドの単離を説明する。
ヒツジ前胃マトリックスを、蛍光タグであるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識することにより、様々な画分の精製及び単離中における、ヒツジ前胃マトリックス由来のペプチドの追跡を可能とした。
FITCのストック溶液は、DMSO中10mg/mLで作製され、遮光性容器中に-20℃でアリコートとして保持された。1mg/mLのFITCの新鮮な溶液を、0.1MのNaHCO3、pH9.3中で新しく作製し;これを希釈して、10mL中10μg/mLの最終作業濃度が得られた。
ヒツジ前胃マトリックス(16mmの皿又は4×4cm2)は、穏やかな振盪器上で遮光性ボックス中の、NaHCO3中10μg/mLのFITC溶液と共に4℃で16時間インキュベートすることにより染色された。結合していないFITCは、10mLのPBSで20分間かけて振盪(50rpm)しながら3回洗浄することにより除去された。ヒツジ前胃マトリックスは、1%胎児ウシ血清を含む細胞培養培地中で16時間かけて馴化させ、PBS中で更に3回洗浄して、細胞の接種のための調製において、できるだけ多くの胎児ウシ血清を除去した。マクロファージ細胞を、PBSで洗浄して、全ての胎児ウシ血清を除去し、1mL中100万個の細胞の密度となるまで遠心沈殿させた。1mL中の細胞を、4×4cm2のヒツジ前胃マトリックス上に播種し、ペトリ皿中で30分間インキュベートして、細胞を付着させ、その後、10mLの無血清培地を各皿に加えた。培養液を48時間インキュベートし、その後、培地を回収し、0.22μmのシリンジ駆動フィルターを使用してろ過し、4℃で保存した。
ゲルろ過を使用して、ろ過された培地から全ての遊離したペプチドを単離した。陰イオン交換用の緩衝液は、10mMのトリスpH8.4又は「DEAE緩衝液」であった。ジエチルアミノエチル(DEAE)ビーズを、10mMのトリスで膨潤させ、1mLのビーズを、末端を切り取ったピペットを使用して、15mLのチューブに加えた。チューブを、10mMのトリスで充填し、その後、ビーズを200rpmで10分間遠心分離にかけ、各回の洗浄時に10mLのトリス緩衝液で置き換えることによって、ビーズを3回洗浄した。
問題のタンパク質候補を含有しているろ過された0.5mLの培地溶液試料を、1mLのDEAEビーズに加えた。チューブを2分間ボルテックスにかけ、その後、室温で5分間放置し、タンパク質を結合させた。チューブを2分間かけて遠心沈殿させ、結合していないタンパク質を含有している上清を回収した。同じ容量のDEAE緩衝液(0.5mLの10mMのトリスpH8.4)を、DEAE-試料の混合物に加え、チューブを1分間ボルテックスにかけた。チューブを2分間遠心分離にかけ、洗浄緩衝液と未結合タンパク質を含有している上清を回収した。150mMのNaClを含む10mMのトリス溶液0.4mLをビーズに加え、チューブを2分間ボルテックスにかけ、その後、室温で5分間放置して、タンパク質の溶出を可能とした。ビーズを2分間遠心分離にかけ、150mMの塩溶出液を含有している上清を回収した。この工程は、400mMのNaClを含む10mMトリス溶液を用いて繰り返して、400mMの塩溶出液を回収した。各々の回収された画分についての蛍光を測定することにより、初期の試料に対する、及び回収された画分の容量と比較した、蛍光指数が得られた。試料を、未希釈の試料としてトリシンのSDS-PAGEによって分離し、高速真空を使用して元来の容量の10分の1まで濃縮した。
問題のヒツジ前胃マトリックス由来ペプチドを含有している、蛍光標識された画分を、実施例1に上記されているような、寒天プラグ走化性アッセイを使用してアッセイした。
結果
様々な量の部分精製されたポリペプチドの生理活性が図4に示されている。分かるように、10ngの部分精製されたタンパク質は、陰性対照と比較して、間葉系幹細胞の走化性の有意な増加を惹起するのに十分である。また更に増加した走化性が、より多くの量(25ng、及び100ng)の部分精製されたポリペプチドで観察された。
様々な量の部分精製されたポリペプチドの生理活性が図4に示されている。分かるように、10ngの部分精製されたタンパク質は、陰性対照と比較して、間葉系幹細胞の走化性の有意な増加を惹起するのに十分である。また更に増加した走化性が、より多くの量(25ng、及び100ng)の部分精製されたポリペプチドで観察された。
したがって、本実施例に記載の方法及びアッセイは、生理活性ポリペプチドの検出に有用であり、そして、それに続く方法における生理活性ポリペプチド(群)の同定を可能とする試料の調製に適している。
実施例3:生理活性ペプチドの同定
本実施例は、上記の実施例2において部分精製された、生理活性ポリペプチドの更なる同定を説明する。
本実施例は、上記の実施例2において部分精製された、生理活性ポリペプチドの更なる同定を説明する。
方法
馴化培地試料のトリス-グリシンのSDS-PAGEによる分離
馴化培地の試料(30μL)を、4×レムリ緩衝液(100mMトリス、pH6.8、8%w/vのSDS、40%v/vのグリセロール、20%w/vのβ-メルカプトエタノール、0.2%のw/vのブロモフェノールブルー)で3:1に希釈した。試料を、100℃の水浴中で10分間煮沸した。トリス-グリシンゲル(4%のアクリルアミド濃縮用ゲル及び20%アクリルアミド分離ゲル)は、バイオラッドゲルシステムを用いて作製され、グリシン泳動緩衝液(25mMのトリス、192mMのグリシン、0.1%w/vのSDS、pH8.3)(シグマ・アルドリッチ社)を用いて泳動させた。1ウェルあたり総容量15μLの各試料、及び8μLのタンパク質スタンダードラダー(プレシジョンPlusプロテイン(商標)2色スタンダード、バイオラッド社、ハーキュリーズ、CA州、米国)を載せた。トリス-グリシンゲルを、100Vで1時間泳動させた。蛍光タンパク質バンドを、フルオロスキャンアセントFL(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で可視化し、その後、穏やかに振盪しながらクーマシーブリリアントブルー(0.1%w/vのクーマシーブリリアントブルーR-250、50%v/vのメタノール、10%の氷酢酸)で室温で3時間かけて染色した。クーマシー染色ゲルを、タイフーンFLA9500(GEヘルスケア社、シカゴ、IL州、米国)を使用して画像撮影した。
馴化培地試料のトリス-グリシンのSDS-PAGEによる分離
馴化培地の試料(30μL)を、4×レムリ緩衝液(100mMトリス、pH6.8、8%w/vのSDS、40%v/vのグリセロール、20%w/vのβ-メルカプトエタノール、0.2%のw/vのブロモフェノールブルー)で3:1に希釈した。試料を、100℃の水浴中で10分間煮沸した。トリス-グリシンゲル(4%のアクリルアミド濃縮用ゲル及び20%アクリルアミド分離ゲル)は、バイオラッドゲルシステムを用いて作製され、グリシン泳動緩衝液(25mMのトリス、192mMのグリシン、0.1%w/vのSDS、pH8.3)(シグマ・アルドリッチ社)を用いて泳動させた。1ウェルあたり総容量15μLの各試料、及び8μLのタンパク質スタンダードラダー(プレシジョンPlusプロテイン(商標)2色スタンダード、バイオラッド社、ハーキュリーズ、CA州、米国)を載せた。トリス-グリシンゲルを、100Vで1時間泳動させた。蛍光タンパク質バンドを、フルオロスキャンアセントFL(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で可視化し、その後、穏やかに振盪しながらクーマシーブリリアントブルー(0.1%w/vのクーマシーブリリアントブルーR-250、50%v/vのメタノール、10%の氷酢酸)で室温で3時間かけて染色した。クーマシー染色ゲルを、タイフーンFLA9500(GEヘルスケア社、シカゴ、IL州、米国)を使用して画像撮影した。
結果
ヒツジ前胃マトリックスFITC10、マクロファージ、及びヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージから作製された馴化培地の試料を、トリス-グリシンゲル上で分離し、結果として得られたタンパク質バンドの蛍光を介して画像撮影した(図5B)。マクロファージのみの培養液は、蛍光標識されたタンパク質を生じず(図5Bのレーン4)、ヒツジ前胃マトリックスFITC10のみから調製された馴化培地は主に、高分子量のタンパク質バンドを生じた(約75~250kDa、図5Bのレーン2)。共培養液(ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ)に由来する馴化培地は、約12kDaにおいて明確な蛍光標識されたタンパク質バンドを生じた(青色の点線のボックス、図5Bのレーン3)。
ヒツジ前胃マトリックスFITC10、マクロファージ、及びヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージから作製された馴化培地の試料を、トリス-グリシンゲル上で分離し、結果として得られたタンパク質バンドの蛍光を介して画像撮影した(図5B)。マクロファージのみの培養液は、蛍光標識されたタンパク質を生じず(図5Bのレーン4)、ヒツジ前胃マトリックスFITC10のみから調製された馴化培地は主に、高分子量のタンパク質バンドを生じた(約75~250kDa、図5Bのレーン2)。共培養液(ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ)に由来する馴化培地は、約12kDaにおいて明確な蛍光標識されたタンパク質バンドを生じた(青色の点線のボックス、図5Bのレーン3)。
実施例4:生理活性ペプチド「MayDay」の同定
本実施例は、上記の実施例2及び3で部分精製された、生理活性ポリペプチド(本明細書ではMayDayと称される)の質量分析(MS)を介した同定を説明する。
本実施例は、上記の実施例2及び3で部分精製された、生理活性ポリペプチド(本明細書ではMayDayと称される)の質量分析(MS)を介した同定を説明する。
方法
試料の調製
ヒツジ前胃マトリックス(4×4cm)を、上記のような0.1Mの重炭酸ナトリウム中0及び10μg/mLのFITCで標識した。結果として得られた標識された及び標識されていない物質(ヒツジ前胃マトリックス及びヒツジ前胃マトリックスFITC10)を、DMEM(5mL)中で16時間かけて馴化させた。ヒツジ前胃マトリックスとマクロファージの共培養を上記のように実施したが、最終容量0.5mLのDMEM中のヒツジ前胃マトリックス試料(4×4cm)あたり約50,000個の細胞のRAW265.7マクロファージを使用するために方法は改変された。培養液を24時間インキュベートし、これらの試料(ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ、ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ、及びマクロファージのみ)由来の馴化培地を回収した。試料を、0.22μmのフィルターを使用して滅菌ろ過し、上記のように、PMSFで処理した。試料を、PBS(5mL)を用いて脱塩し、アミコンウルトラ-15遠心式フィルター(ウルトラセル-PLメンブレン、3kDa、メルク/ミリポア社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国)を使用した限外ろ過によって濃縮し、使用前に-20℃で保存した。
試料の調製
ヒツジ前胃マトリックス(4×4cm)を、上記のような0.1Mの重炭酸ナトリウム中0及び10μg/mLのFITCで標識した。結果として得られた標識された及び標識されていない物質(ヒツジ前胃マトリックス及びヒツジ前胃マトリックスFITC10)を、DMEM(5mL)中で16時間かけて馴化させた。ヒツジ前胃マトリックスとマクロファージの共培養を上記のように実施したが、最終容量0.5mLのDMEM中のヒツジ前胃マトリックス試料(4×4cm)あたり約50,000個の細胞のRAW265.7マクロファージを使用するために方法は改変された。培養液を24時間インキュベートし、これらの試料(ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ、ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ、及びマクロファージのみ)由来の馴化培地を回収した。試料を、0.22μmのフィルターを使用して滅菌ろ過し、上記のように、PMSFで処理した。試料を、PBS(5mL)を用いて脱塩し、アミコンウルトラ-15遠心式フィルター(ウルトラセル-PLメンブレン、3kDa、メルク/ミリポア社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国)を使用した限外ろ過によって濃縮し、使用前に-20℃で保存した。
タンパク質の定量は、製造業者の説明書に従って、タンパク質の決定用のビシンコニン酸(BCA)キット(シグマ・アルドリッチ社)を使用して実施された。
溶液中のトリプシンによる消化
マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックスの試料をPBSに再懸濁して、最終濃度を0.1mg/mLとした。試料(20μg)を、10mMの1,4-ジチオトレイトール(DTT)(シグマ・アルドリッチ社)(20μL、60分間、60℃)で還元し、その後、20mMのヨードアセトアミド(シグマ・アルドリッチ社)(20μL、30分間、室温で暗闇で)を用いてアルキル化した。試料(60μL)を0.1μgのトリプシン(シグマ・アルドリッチ社)を用いて一晩(37℃)消化した。試料を乾燥させ、その後、ローディング緩衝液(0.1Mの重炭酸ナトリウム)で復元し、その後、ESI MS/MS分析にかけた。
マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックスの試料をPBSに再懸濁して、最終濃度を0.1mg/mLとした。試料(20μg)を、10mMの1,4-ジチオトレイトール(DTT)(シグマ・アルドリッチ社)(20μL、60分間、60℃)で還元し、その後、20mMのヨードアセトアミド(シグマ・アルドリッチ社)(20μL、30分間、室温で暗闇で)を用いてアルキル化した。試料(60μL)を0.1μgのトリプシン(シグマ・アルドリッチ社)を用いて一晩(37℃)消化した。試料を乾燥させ、その後、ローディング緩衝液(0.1Mの重炭酸ナトリウム)で復元し、その後、ESI MS/MS分析にかけた。
サイズ排除クロマトグラフィー
凍結乾燥させた試料であるマクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス馴化培地を、PBSに再懸濁して、0.1mg/mLの最終タンパク質濃度とした。試料(100μl、約100μg)を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(GEスーパーデックス75 10/300GL、GEヘルスケア社、MA州、米国)にかけ、50mMのリン酸ナトリウム(pH7)、150mMのNaClの移動相、及び0.35mL/分の流速を使用して、96ウェルプレートに分画した。溶出液を、214nm、220nm、及び280nmでモニタリングした。画分を、既知の保持時間及び以下の標準物質(アルドラーゼ、コンアルブミン、炭酸脱水酵素、リボヌクレアーゼA、及びアプロチニン)の分子量に基づいてプールした。プールした試料(約1mL)を、10mMのDTTを用いて60℃で1時間還元し、その後、25mMのヨードアセトアミド(30分間、室温)を用いてアルキル化した。トリプシン(500ng)を各試料に加え、その後、37℃で一晩消化した。試料を、OMIX C18100μLのチップ(アジレント社/バリアン社、A57003100K、サンタクララ、CA州、米国)を使用して脱塩し、その後、100μLのアセトニトリル(ACN)/ギ酸で溶出した。試料を乾燥させ、その後、ローディング緩衝液で復元し、その後、ESI MS/MS分析にかけた。
凍結乾燥させた試料であるマクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス馴化培地を、PBSに再懸濁して、0.1mg/mLの最終タンパク質濃度とした。試料(100μl、約100μg)を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(GEスーパーデックス75 10/300GL、GEヘルスケア社、MA州、米国)にかけ、50mMのリン酸ナトリウム(pH7)、150mMのNaClの移動相、及び0.35mL/分の流速を使用して、96ウェルプレートに分画した。溶出液を、214nm、220nm、及び280nmでモニタリングした。画分を、既知の保持時間及び以下の標準物質(アルドラーゼ、コンアルブミン、炭酸脱水酵素、リボヌクレアーゼA、及びアプロチニン)の分子量に基づいてプールした。プールした試料(約1mL)を、10mMのDTTを用いて60℃で1時間還元し、その後、25mMのヨードアセトアミド(30分間、室温)を用いてアルキル化した。トリプシン(500ng)を各試料に加え、その後、37℃で一晩消化した。試料を、OMIX C18100μLのチップ(アジレント社/バリアン社、A57003100K、サンタクララ、CA州、米国)を使用して脱塩し、その後、100μLのアセトニトリル(ACN)/ギ酸で溶出した。試料を乾燥させ、その後、ローディング緩衝液で復元し、その後、ESI MS/MS分析にかけた。
トリス-トリシンのSDS-PAGE及びゲル内タンパク質消化
試料(マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックスFITC10、及びマクロファージのみ)は上記のように調製され、その後、4×レムリ緩衝液で3:1に希釈し、上記のように変性させた。1ウェルあたり15μLの全容量の各試料、及び8μLのタンパク質スタンダードラダー(プレシジョンPlusプロテイン(商標)2色スタンダード、バイオラッド社)を載せた。トリス-トリシンゲル(4%アクリルアミド濃縮用ゲル及び16%のアクリルアミド分離用ゲル)を、陽極緩衝液(100mMのトリス、100mMのトリシン、0.1%w/vのSDS、pH8.25)及び陰極緩衝液(100mMのトリス、pH8.9)を使用して泳動した。ゲルを、氷上で(約4℃)60Vで2時間泳動させた。トリス-トリシンゲルを、フルオロスキャンアセントFL(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で蛍光により可視化し、その後、穏やかに振盪しながらクーマシーブリリアントブルー(0.1%のクーマシーブリリアントブルーR-250、50%v/vのメタノール、及び10%の氷酢酸)で室温で3時間かけて染色した。クーマシー染色ゲルを、タイフーンFLA9500スキャナー(GEヘルスケア社、シカゴ、IL州、米国)を使用して画像撮影した。
試料(マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックスFITC10、及びマクロファージのみ)は上記のように調製され、その後、4×レムリ緩衝液で3:1に希釈し、上記のように変性させた。1ウェルあたり15μLの全容量の各試料、及び8μLのタンパク質スタンダードラダー(プレシジョンPlusプロテイン(商標)2色スタンダード、バイオラッド社)を載せた。トリス-トリシンゲル(4%アクリルアミド濃縮用ゲル及び16%のアクリルアミド分離用ゲル)を、陽極緩衝液(100mMのトリス、100mMのトリシン、0.1%w/vのSDS、pH8.25)及び陰極緩衝液(100mMのトリス、pH8.9)を使用して泳動した。ゲルを、氷上で(約4℃)60Vで2時間泳動させた。トリス-トリシンゲルを、フルオロスキャンアセントFL(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で蛍光により可視化し、その後、穏やかに振盪しながらクーマシーブリリアントブルー(0.1%のクーマシーブリリアントブルーR-250、50%v/vのメタノール、及び10%の氷酢酸)で室温で3時間かけて染色した。クーマシー染色ゲルを、タイフーンFLA9500スキャナー(GEヘルスケア社、シカゴ、IL州、米国)を使用して画像撮影した。
分子量12kDaのバンドに対応する問題の領域を、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックス、マクロファージ+ヒツジ前胃マトリックスFITC10の両方を含有している、レーンのゲルから切り出した。試料を、ジチオトレイトール(DTT)(10mM、20μL)を用いて60℃で1時間かけて還元し、その後、ヨードアセトアミド(20mM、20μL)を用いて室温で暗闇で30分間かけてアルキル化した。タンパク質を、100ngのトリプシンを用いて室温で一晩消化した。試料を、30μLまで濃縮し、その後、ESI MS/MSにかけた。
ESI MS/MS分析
Triple TOF 5600(AB Sciex社、レッドウッドシティー、CA州、米国)に連動させた、Eksigent社のウルトラナノLCシステム(Eksigent社、リバーモア、CA州、米国)に注入した。消化された試料(10μL、20μL又は40μL)を、ペプチドトラップ(ペプチドキャップトラップ、Michrom Bioresources社、オーバーン、CA州、米国)に注入し、10μl/分で0.1%のギ酸水/2%アセトニトリル(ACN)を用いて5分間かけて脱塩した。その後、ペプチドトラップを、分析用カラム(Halo C18、160Å、2.7μm、75μm×10cm、Advances Materials社、ウィルミントン、DE州、米国)へのラインに切り替えた。トリプシンで消化された試料及びゲル内消化された試料からのペプチドを、溶媒勾配;95%(0.1%ギ酸水)/5%(99.9%のアセトニトリル/0.1%のギ酸)から60%(0.1%ギ酸水)/40%(99.9%のアセトニトリル/0.1%のギ酸)を使用して、550nL/分の流速で42分間の時間をかけてカラムから溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーからのペプチドを、溶媒勾配;H2O:アセトニトリル(95:5;+0.1%のギ酸)からH2O:アセトニトリル(5:95;+0.1%のギ酸)を使用して、一定の流速で(500nL/分)で80分間の期間をかけてカラムから溶出した。
Triple TOF 5600(AB Sciex社、レッドウッドシティー、CA州、米国)に連動させた、Eksigent社のウルトラナノLCシステム(Eksigent社、リバーモア、CA州、米国)に注入した。消化された試料(10μL、20μL又は40μL)を、ペプチドトラップ(ペプチドキャップトラップ、Michrom Bioresources社、オーバーン、CA州、米国)に注入し、10μl/分で0.1%のギ酸水/2%アセトニトリル(ACN)を用いて5分間かけて脱塩した。その後、ペプチドトラップを、分析用カラム(Halo C18、160Å、2.7μm、75μm×10cm、Advances Materials社、ウィルミントン、DE州、米国)へのラインに切り替えた。トリプシンで消化された試料及びゲル内消化された試料からのペプチドを、溶媒勾配;95%(0.1%ギ酸水)/5%(99.9%のアセトニトリル/0.1%のギ酸)から60%(0.1%ギ酸水)/40%(99.9%のアセトニトリル/0.1%のギ酸)を使用して、550nL/分の流速で42分間の時間をかけてカラムから溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーからのペプチドを、溶媒勾配;H2O:アセトニトリル(95:5;+0.1%のギ酸)からH2O:アセトニトリル(5:95;+0.1%のギ酸)を使用して、一定の流速で(500nL/分)で80分間の期間をかけてカラムから溶出した。
溶出液を、情報依存的取得(IDA)モードで陽イオンナノフローエレクトロスプレー分析にかけた。IDAモードでは飛行時間型質量分析のサーベイスキャンを取得し(m/z350~1500、0.25秒間)、サーベイスキャンにおいて10個の最も強力な複数に荷電したイオン(計数>150)を順次、MS/MS分析にかけた。m/z100~1500の質量範囲のMS/MSスペクトルを200ミリ秒間蓄積し、全サイクル時間は2.3秒間であった。生データファイル(.wiff)は、mascot generic files(.mgf)にAB SCIEX社のコマンドドライバーソフトウェア(AB SCIEX社、レッドウッドシティー、CA州、米国)を使用して変換された。データファイルを、Mascot(Matrix Science社、英国)にかけ、スイスプロットデータベース(ヒツジ(Ovis aries)[sp_sheep_140625])に対して検索した。
結果
ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージから調製された大容量の馴化培地が調製され、質量分析が、3つの異なる方法を介して調製された試料に対して進められた;1.馴化培地の溶液中トリプシンによる消化;2.サイズ排除クロマトグラフィーによる精製;3.1次元のトリス-トリシンゲルでの分離及びゲル内トリプシンによる消化。約12kDaの問題のタンパク質は、トリス-トリシンゲルを介して明瞭に分離された(データは示されていない)。各アプローチにおいて、ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージの両方の試料を、蛍光を介して問題のタンパク質(群)を追跡する手段としてのFITC試料を使用して分析した。ESI MS/MS分析を、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ試料のみに対して実施し、FITC標識に起因するあらゆる複雑化させる要因を回避した。MASCOTデータベースを使用して、3つの試料調製法から同定された全てのタンパク質断片を同定した。
ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージから調製された大容量の馴化培地が調製され、質量分析が、3つの異なる方法を介して調製された試料に対して進められた;1.馴化培地の溶液中トリプシンによる消化;2.サイズ排除クロマトグラフィーによる精製;3.1次元のトリス-トリシンゲルでの分離及びゲル内トリプシンによる消化。約12kDaの問題のタンパク質は、トリス-トリシンゲルを介して明瞭に分離された(データは示されていない)。各アプローチにおいて、ヒツジ前胃マトリックスFITC10+マクロファージ及びヒツジ前胃マトリックス+マクロファージの両方の試料を、蛍光を介して問題のタンパク質(群)を追跡する手段としてのFITC試料を使用して分析した。ESI MS/MS分析を、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ試料のみに対して実施し、FITC標識に起因するあらゆる複雑化させる要因を回避した。MASCOTデータベースを使用して、3つの試料調製法から同定された全てのタンパク質断片を同定した。
細胞外マトリックスタンパク質のデコリン(DCN)は一貫して、MASCOTの検索結果から同定された。データベースの検索により、ヒツジタンパク質のデコリンとの一致(emPAI;0.08)として以下に示されているいくつかの独特なペプチド(Uniprot;Q9TTE2、骨プロテオグリカンII、PG-S2、PG40としても知られている、39947Daの質量)が同定された。
3つの異なる方法を介して同定されたペプチドは、図6Aに示されている。溶液中のトリプシンで消化された試料により、デコリン配列の多くにわたって広がる、最も多くのタンパク質のヒット(「青色」、図6A)が得られた。このことは、トリプシンで消化された試料が相対的に不純であることから発生している可能性が最も高い。サイズ排除クロマトグラフィーを介して調製された試料は、デコリンのN末端配列に整列した1つの配列を与え(「黄色」、図6A)、トリス-トリシンゲルから調製された試料は、デコリンのN末端領域にこれも整列した更なる配列を与えた(「緑色」、図6A)。これらの後者の2つの独特なペプチドの配列は以下に提示されている:
1.KISPGAFAPLVKL
2.RVVQCSDLGLEKV
1.KISPGAFAPLVKL
2.RVVQCSDLGLEKV
以下の表1は、完全長デコリンタンパク質のアミノ酸配列[配列番号1]を提示し、これらの2つの独特なペプチドに対応するアミノ酸配列は、下線で示されている。図6Aは、デコリン配列内のデコリンのN末端部分内の他の独特なペプチドの場所を示し、一方、MMP12タンパク質分解切断部位の場所が図6Bに示されている。組換えMayDay31~170ポリペプチド[配列番号2]に対応する、及びデコリンの2つのN末端断片に対応する、アミノ酸配列(各々はそれぞれ、MMP12切断部位、MayDay31~177[配列番号3]、及びMayDay31~188[配列番号4]で終結している)は表1に示されている。ここでも、上記に示されるこれらの2つの独特なペプチドに対応するアミノ酸配列の場所は、下線で示されている。
コンピューター分析を、MERPOSデータベースを使用して実施して、既知のヒトデコリン切断部位に対する配列相同性に基づいて、ヒツジデコリンのタンパク質分解切断部位を予測した。図6Bに示されているように、デコリンは、MMP-2、-3、-7、-12、及び-13、並びに、ADAMTs5を含む、多くの予測されたプロテアーゼ部位を含有している。特に、2つのMMP-12部位が、残基177~178及び188~189の間に存在すると予測された。
実施例5:MMP12によるデコリンの消化を介した、生理活性MayDayペプチドの産生及び評価
本実施例は、実施例4で同定されたMayDayポリペプチドの産生、及び、MMP12を使用して親タンパク質を切断するその生理活性の評価を説明する。
本実施例は、実施例4で同定されたMayDayポリペプチドの産生、及び、MMP12を使用して親タンパク質を切断するその生理活性の評価を説明する。
MMP-12触媒ドメインのストック溶液(Sino Biologicals社、北京、中国)及びデコリン(Sino Biologicals社)は、ROH2O中0.25mg/mLで調製され、使用前に-20℃で保存された。デコリンの試料(10μL)を、0、0.1、5、又は10μLのMMP-12溶液で消化し、1:1、2:1、100:1のタンパク質:酵素の比が得られた。最終容量の試料を、MMP-12緩衝液(50mMのトリス、100mMのNaCl、0.05%w/vのブリッジ35、pH8.0)を用いて40μLとした。試料を、穏やかに振盪しながら、37℃で16時間インキュベートした。
消化された試料(30μL)を、4×レムリ緩衝液で3:1に希釈し、上記のように変性させた。総容量30μLを、プレキャストビス-トリスゲル(4~12%のBolt NuPAGE、インビトロジェン社、カールズバッド、CA州、米国)に載せた。ビス-トリスゲルをタンタンパク質標準溶液(5μL)(SeeBlueタンパク質標準物質、インビトロジェン社)と共に泳動した。ゲルを、BOLT泳動緩衝液(Bolt(商標)MES SDS泳動緩衝液、インビトロジェン(商標))中でインビトロジェンミニゲルシステム(インビトロジェン(商標))を使用して100Vで90分間かけて泳動させた。ゲルを濯ぎ(3回、ROH2O、10mL)、その後、上記のようにクーマシーで染色した。
デコリン及びMMP12により消化されたデコリンを、SDS pageゲル上で分析し、図7Aに示されているように、タンパク質の断片化を実証した。
この後、試料を、デコリン+MMP12を使用したトランズウェルアッセイに加え、デコリンのみ(250ng)及びMMP12のみ(25ng)の対照と共に、3つの試料の生理活性を決定した。
トランズウェル遊走アッセイのための試料は、以下のように調製された:デコリン(0.25mg/mLで20μL)及びMMP-12(0.25mg/mLで10μL)を、上記のように、2:1のタンパク質:酵素の比を与える消化緩衝液を用いて40μlとなるように作製した。対照として、デコリンのみ(0.25mg/mLで20μL)及びMMP-12のみ(0.25mg/mLで10μL)を、消化緩衝液を用いて40μLとなるように作製し、消化緩衝液のみの試料(「対照」)を、同じ時間かけてインキュベートした。試料を、37℃で16時間一晩インキュベートした。インキュベート後、各溶液を0.5mlのDMEM0.5と合わせて、酵素消化液をクエンチした。ovAD-MSC細胞を使用したトランズウェル遊走アッセイを、上記のように実施した。膜の画像を取得し、遊走した細胞を、ImageJを使用して計数した。結果は、培地のみの試料と比較した、正規化された細胞遊走として表現され、3回の独立した実験の平均値を示す。統計分析(t検定)を、グラフパッドプリズム(バージョン8.4.1)を使用して実施した;「*」p<0.05、「**」p≦0.01、p≦0.001;「****」p≦0.0001。
結果
トランズウェル膜の下のチャンバー上に存在する遊走した細胞の数が図7Bに示されている。明らかに分かるように、非常に多くの細胞が、デコリンの存在下において、MMP12で消化された場合に、下のチャンバーに遊走する。比較すると、より少ない細胞が、培地のみの陰性対照試料を用いて、及び未消化のデコリンタンパク質を用いて観察された。
トランズウェル膜の下のチャンバー上に存在する遊走した細胞の数が図7Bに示されている。明らかに分かるように、非常に多くの細胞が、デコリンの存在下において、MMP12で消化された場合に、下のチャンバーに遊走する。比較すると、より少ない細胞が、培地のみの陰性対照試料を用いて、及び未消化のデコリンタンパク質を用いて観察された。
本実施例は、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ培養液から得られたMayDayポリペプチドを用いて観察されたものと同等な、酵素的に産生されたMayDayタンパク質の細胞動員を惹起する能力を実証する。したがって、本実施例は、本明細書に記載のような分析法で同定された生理活性ポリペプチドの生物学的活性が、合成で作製されたポリペプチドによって再現できることを確立する。
実施例6:組換え生理活性MayDayペプチドの産生及び評価
本実施例は、本明細書で同定されたMayDayポリペプチドの組換え産生、及びその生理活性の評価を説明する。
本実施例は、本明細書で同定されたMayDayポリペプチドの組換え産生、及びその生理活性の評価を説明する。
方法
組換えのヒスチジンのタグの付いたMayDay(31~170)(rec-HISovMayDay(31-170))を、確立された手順に従って、発現させ、Biomatik(オンタリオ、カナダ)によって精製した。簡潔に言えば、そのN末端に6×ヒスチジンタグの融合したヒツジデコリン配列31~170を、pET30aクローニングベクターにクローニングした。発現プラスミドを、大腸菌(E.coli)BL21細胞に形質転換し、600nmにおける吸光度が0.6に達するまで、細胞を、50μg/mLのカナマイシン(シグマ・アルドリッチ社)の補充されたルリアブロス(LB)培地中で37℃で増殖させ、その後、イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)(0.2mM)(シグマ・アルドリッチ社)を培地に加え、細胞を15℃で16時間更にインキュベートした。細胞懸濁液を、溶解緩衝液(50mMのトリス、pH8.5、300mMのNaCl、20mMのヒスチジン)(シグマ・アルドリッチ社)と共に超音波処理にかけた。上清を、溶解緩衝液で予め平衡化したニッケル-IDAアフィニティカラムに載せ、遠心分離にかけ、上清を回収した。画分をSDS-PAGEによって分析した。画分をプールし、最終緩衝液(50mMのトリス、pH8.5、150mMのNaCl)に対して透析した。
組換えのヒスチジンのタグの付いたMayDay(31~170)(rec-HISovMayDay(31-170))を、確立された手順に従って、発現させ、Biomatik(オンタリオ、カナダ)によって精製した。簡潔に言えば、そのN末端に6×ヒスチジンタグの融合したヒツジデコリン配列31~170を、pET30aクローニングベクターにクローニングした。発現プラスミドを、大腸菌(E.coli)BL21細胞に形質転換し、600nmにおける吸光度が0.6に達するまで、細胞を、50μg/mLのカナマイシン(シグマ・アルドリッチ社)の補充されたルリアブロス(LB)培地中で37℃で増殖させ、その後、イソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)(0.2mM)(シグマ・アルドリッチ社)を培地に加え、細胞を15℃で16時間更にインキュベートした。細胞懸濁液を、溶解緩衝液(50mMのトリス、pH8.5、300mMのNaCl、20mMのヒスチジン)(シグマ・アルドリッチ社)と共に超音波処理にかけた。上清を、溶解緩衝液で予め平衡化したニッケル-IDAアフィニティカラムに載せ、遠心分離にかけ、上清を回収した。画分をSDS-PAGEによって分析した。画分をプールし、最終緩衝液(50mMのトリス、pH8.5、150mMのNaCl)に対して透析した。
組換えのヒスチジンのタグの付いたMayDay(31~171)(rec-HISovMayDay(31-170))を、トランズウェル遊走アッセイで、上記のようにovAD-MSCを使用して試験した。rec-HISovMayDay(31-170)は、PBS(0.1mg/mL)中で調製され、その後、DMEM0.5で0.05、0.50、及び5.00ng/mLの最終濃度となるまで希釈された。ヒト組換えSDF-1(シグマ社)は、PBS(0.1mg/mL)中で調製され、DMEM0.5中50ng/mLの最終濃度となるまで希釈された。膜の画像を取得し、遊走した細胞を、ImageJを使用して計数した。結果は、培地のみの試料と比較した、正規化された細胞遊走として表現され、3回の独立した実験の平均値を示す。統計分析(t検定)を、グラフパッドプリズム(バージョン8.4.1)を使用して実施した;「*」p<0.05、「**」p≦0.01、「***」p≦0.001;「****」p≦0.0001。
結果
トランズウェル膜の下のチャンバー上に存在する遊走した細胞の数が図8に示されている。明らかに分かるように、たった5ng/mLの組換えのMayDayポリペプチドの存在が、50ng/mLのSDF-1で観察されたのと同等な、かなりの細胞遊走を惹起した。これに対して、非常に少ない細胞が、培地のみの陰性対照試料を用いて観察された。
トランズウェル膜の下のチャンバー上に存在する遊走した細胞の数が図8に示されている。明らかに分かるように、たった5ng/mLの組換えのMayDayポリペプチドの存在が、50ng/mLのSDF-1で観察されたのと同等な、かなりの細胞遊走を惹起した。これに対して、非常に少ない細胞が、培地のみの陰性対照試料を用いて観察された。
本実施例は、ヒツジ前胃マトリックス+マクロファージ培養液から得られたMayDayポリペプチドで観察されたものと同等な、組換え産生されたMayDayタンパク質の細胞動員惹起能を示した。したがって、本実施例は、本明細書に記載のような分析法で同定された生理活性ポリペプチドの生物学的活性が、組換え発現されたポリペプチドによって再現され得ることを確立する。
実施例7:組換えMayDayペプチドの生理活性のインビボでの評価
本実施例は、インビボの間葉系幹細胞動員モデルにおける、組換えMayDayポリペプチドの評価を説明する。
本実施例は、インビボの間葉系幹細胞動員モデルにおける、組換えMayDayポリペプチドの評価を説明する。
方法
組換えMayDay(31~170)の発現
タグのないタンパク質(rec-ovMayDay(31-170))を、上記のように、BL21E.coli細胞において、pSUMOベクターを使用して発現させた。増幅及び発現後、上清を、溶解緩衝液で予め平衡化したQセファロース(商標)fast flowに載せ、遠心分離にかけ、上清画分をSDS-PAGEによって分析した。純度(85%超)がSDS-PAGEによって確認された。凍結乾燥させた画分は-20℃で保存された。
組換えMayDay(31~170)の発現
タグのないタンパク質(rec-ovMayDay(31-170))を、上記のように、BL21E.coli細胞において、pSUMOベクターを使用して発現させた。増幅及び発現後、上清を、溶解緩衝液で予め平衡化したQセファロース(商標)fast flowに載せ、遠心分離にかけ、上清画分をSDS-PAGEによって分析した。純度(85%超)がSDS-PAGEによって確認された。凍結乾燥させた画分は-20℃で保存された。
マウス骨髄-間葉系幹細胞(muBM-MSC)の蛍光標識
muBM-MSCを、Balb/cマウスへの注入直前に、Cellvue NIR815蛍光細胞標識キット(Licor社、リンカーン、米国)を使用して標識した。80%の集密度のmuBM-MSCのプレートをDMEM(5mL)に再懸濁し、遠心分離にかけ、希釈剤C(Licor社、リンカーン、米国)に再懸濁して、2×107個の細胞/mLの最終濃度が得られた。細胞を、製造業者の説明書に従って、近赤外線の色素(NIR815)で標識した。簡潔に言えば、Cellvue色素ストック溶液(2μL、4×10-6M)を希釈剤C(1mL)に加えた。その後、色素を、希釈剤C(1mL)中のmuBM-MSCに加え、37℃で5分間インキュベートした。反応液をFBS(2mL)でクエンチした。細胞を、400rpmで10分間の遠心分離によってペレット化し、その後、PBS(3回、10mL)で濯いだ。最終洗浄後、細胞を、完全培地(5mL)に再懸濁し、使用前に37℃に保持した。
muBM-MSCを、Balb/cマウスへの注入直前に、Cellvue NIR815蛍光細胞標識キット(Licor社、リンカーン、米国)を使用して標識した。80%の集密度のmuBM-MSCのプレートをDMEM(5mL)に再懸濁し、遠心分離にかけ、希釈剤C(Licor社、リンカーン、米国)に再懸濁して、2×107個の細胞/mLの最終濃度が得られた。細胞を、製造業者の説明書に従って、近赤外線の色素(NIR815)で標識した。簡潔に言えば、Cellvue色素ストック溶液(2μL、4×10-6M)を希釈剤C(1mL)に加えた。その後、色素を、希釈剤C(1mL)中のmuBM-MSCに加え、37℃で5分間インキュベートした。反応液をFBS(2mL)でクエンチした。細胞を、400rpmで10分間の遠心分離によってペレット化し、その後、PBS(3回、10mL)で濯いだ。最終洗浄後、細胞を、完全培地(5mL)に再懸濁し、使用前に37℃に保持した。
インビボでの間葉系幹細胞の走化性
試験品、組換えMayDay(rec-ovMayDay31-170)、及びヒト組換えSDF-1(シグマ社)を、0.9%無菌食塩水(ブラウン社、メルズンゲン、ドイツ)中で調製した。5つの処置群が使用された;rec-ovMayDay(31-170)[1μg/動物、(約0.05μg/kg);10μg/動物(約0.5mg/kg)及び25μg/動物(約1.25mg/kg)];SDF-1 10μg/動物、(約0.5mg/kg)及び0.9%の無菌食塩水。Balb/cマウスを、イソフルランを使用して麻酔し、腹側臥位に置かれ、麻酔ガスは鼻錐を介して投与された。注入部位(後肢及び尾)は、クロルヘキシジンで拭いて準備された。試験品は、Balb/cマウス(1つの試験品あたりn=3)に、30μLの筋肉内注射を介して、右後肢の筋肉(「処置された」)に投与された。
試験品、組換えMayDay(rec-ovMayDay31-170)、及びヒト組換えSDF-1(シグマ社)を、0.9%無菌食塩水(ブラウン社、メルズンゲン、ドイツ)中で調製した。5つの処置群が使用された;rec-ovMayDay(31-170)[1μg/動物、(約0.05μg/kg);10μg/動物(約0.5mg/kg)及び25μg/動物(約1.25mg/kg)];SDF-1 10μg/動物、(約0.5mg/kg)及び0.9%の無菌食塩水。Balb/cマウスを、イソフルランを使用して麻酔し、腹側臥位に置かれ、麻酔ガスは鼻錐を介して投与された。注入部位(後肢及び尾)は、クロルヘキシジンで拭いて準備された。試験品は、Balb/cマウス(1つの試験品あたりn=3)に、30μLの筋肉内注射を介して、右後肢の筋肉(「処置された」)に投与された。
5~10分後、NIR815で標識されたmuBM-MSC(約5×106個の細胞)が、各動物の尾静脈に注入された(5mL/kg)。動物を、光学イメージングシステム(Pearl Trilogy、Licor社、リンカーン、米国)を使用して、予め決められた時点で画像撮影した;標識されたmuBM-MSCの投与から0時間後、3時間後、6時間後、12時間後及び24時間後。24時間後、動物を、頸部脱臼によって安楽死させた。「処置された」部位の後肢筋肉組織、並びに、各動物の左後肢と匹敵する「正常な」組織が解剖された。更に、主要な器官(脳、脾臓、肝臓、腸、腎臓、及び肺)が全ての動物から収集された。
外植された「処置された」及び「正常な」筋肉組織を、800nmのチャネル(励起:786nm、発光:814nm)を使用して、Pearl Trilogyイメージングシステムを使用して画像撮影し、各々についての蛍光シグナル(ピクセル)は、Image studioソフトウェア(バージョン5.2、Licor社)を使用して決定された。各試料について、バックグラウンド蛍光シグナル(ピクセル)も、等しい面積(cm2)の組織試料に基づいて測定された。試料の蛍光は、試験試料(「処置された」及び「正常な」)のシグナルから対応するバックグラウンド蛍光を差し引いたものに基づいて決定された。
単離されたmuBM-MSCの複能性は、三系統の分化アッセイ(骨形成、脂肪生成、及び軟骨形成)によって確認された(データは示されていない)。
結果
組換えMayDayペプチドの注射された動物は、図9で容易に分かるように、注入部位へのドナー細胞の動員を示した。注入部位への有意な細胞の動員は、ビヒクルのみの対照では全く観察されなかった。
組換えMayDayペプチドの注射された動物は、図9で容易に分かるように、注入部位へのドナー細胞の動員を示した。注入部位への有意な細胞の動員は、ビヒクルのみの対照では全く観察されなかった。
試験されたrec-ovMayDay(31-170)の全濃度において、注入部位へのmuBM-MSCの局在化は有意に増加し(「正常」対「処置された」、図9A)、このことは、rec-ovMayDay(31-170)の投与部位へのmuBM-MSCの動員を示唆する。より高い濃度の10及び25μgのrec-ovMayDay(31-170)を受けている部位(「処置された」、図9A)は、ビヒクルのみの対照を受けている部位と比較して、有意により高い局所的なmuBM-MSCの動員を示した。細胞動員から生じた有意に増加した蛍光が、正常な対照と比較して、rec-ovMayDay(31-170)の注入された動物から切除された筋肉組織において観察され、切除された組織において観察された蛍光は、rec-ovMayDay(31-170)濃度の増加と共に増加した(図9A、下のパネル)。
注入部位におけるシグナル強度が定量され、図9に提示された結果は、組換えMayDayペプチドの投与時に増加した細胞の動員を明瞭に示し、SDF1の投与では程度がより低かった。最も高い25μgの用量のrec-ovMayDay(31-170)は、10μgのSDF-1という対照よりも、有意により多くのmuBM-MSCの局在をもたらした。
これらの実施例は、生物活性剤を、本明細書に記載の方法を使用して調製し、単離し、同定し、産生する(例えば組換え法による)ことができることを、並びに、このような物質の生理活性を、研究上、診断上、及び治療上の価値を有する生物活性剤の提供のために評価し利用することができることを明確に実証する。
本明細書において使用される「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含んでいる」という単語及び類似した単語は、排他的又は網羅的意味で解釈されるものではない。換言すれば、それらは、「を含むがこれらに限定されない」を意味するものである。「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、又は「含んでいる」という用語を含む、本明細書における各記述を解釈する場合、該用語が前にある対象物以外の対象物も存在し得る。
上記及び下記に(存在する場合)列挙された全ての出願、特許及び刊行物の全開示は、参照により本明細書に援用される。
前の記載において、既知のその均等物を有する整数又は成分に言及される場合、そうした整数は、個々に示されているかのように、本明細書に援用される。
本明細書に記載の本発明の好ましい実施態様への様々な変更及び改変は当業者には明らかであろうことが注記されるべきである。このような変更及び改変は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、そしてその付随する利点を減少させることなく行なわれ得る。それ故、このような変更及び改変は、本発明に含まれることが意図される。
本発明はまた、出願明細書に言及されているか又は示されている部分、要素、及び特色から個々に、或いは前記の部分、要素、又は特色のその2つ以上の任意の又は全ての組合せをまとめたものからなると広く言われ得る。
本発明の態様は、単に実施例を用いて説明され、例えば、示された特許請求の範囲に定義されているような本発明が存在する場合、本発明の範囲から逸脱することなく、変更、改変、及び追加が行なわれ得ることが理解されるべきである。更に、特定の特色に対する公知の均等物が存在する場合、このような均等物は、本明細書に具体的に言及されているかのように援用される。
Claims (29)
- a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチドであって、1つ以上の幹細胞を含む1つ以上の細胞と相互作用する又はを動員することができるモチーフ又は領域を含む、ポリペプチド;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチドであって、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用する又はを動員することができるモチーフ又は領域を含む、ポリペプチド;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
を含む群から選択される、単離されているか、精製されているか、組換え型であるか、又は合成のポリペプチド。 - 請求項1に記載の1つ以上のポリペプチドを含む、医薬組成物を含む組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物、請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物を含むベクター、又は上記に定義されている発現構築物若しくはベクターを含む宿主細胞。
- i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、該細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により、1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;及び
iv.1つ以上の生物活性剤を回収する工程
を含む、1つ以上の生物活性剤を提供する方法。 - i.細胞外マトリックスを提供する工程;
ii.インビトロにおいて、1つ以上の細胞を、1つ以上の生物活性剤を遊離するに十分な期間、該細胞外マトリックスと接触させる工程;
iii.場合により、1つ以上の生物活性剤を少なくとも部分的に精製する工程;及び
iv.1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定する工程
を含む、1つ以上の生物活性剤を検出及び/又は同定する方法。 - 前記細胞外マトリックスが、無細胞細胞外マトリックス、脱細胞化細胞外マトリックスであるか、又は細胞外マトリックスは実質的に細胞を含まない、請求項4又は請求項5に記載の方法。
- 前記無細胞細胞外マトリックスが、天然の無細胞細胞外マトリックスである、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、哺乳動物、爬虫類、鳥類、及び昆虫を含む、任意の種類の動物に由来する、真皮、心膜、胃、小腸、膀胱、胎盤、腎被膜、又は体腔の裏打ちから調製される、請求項4~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、ヒツジ前胃マトリックス(OFM)である、請求項4~8のいずれか一項に記載の方法。
- 接触は、1つ以上の生物活性剤を細胞外マトリックスから遊離するに十分な期間である、請求項4~9のいずれか一項に記載の方法。
- 接触は、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、又は少なくとも約24時間の期間である、請求項4~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞が、均一な細胞集団を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、マクロファージ、例えば活性化マクロファージである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス及び前記1つ以上の細胞が各々1つの組織に由来するか、又は各々互いにインビボで接触していない種類のものである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の生物活性剤が、タンパク質分解切断によって、細胞内プロセシングによって、例えば細胞内リソソームを使用したタンパク質のエンドサイトーシス及び消化によって、酸化バーストによって、又はコンフォメーション変化によって、遊離されるポリペプチド又はペプチドである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の生物活性剤の同定に使用するための組成物を含む、細胞外マトリックスと1つ以上の細胞、例えば1つ以上の外因性細胞とを含む組成物であって、該細胞外マトリックスは、無細胞細胞外マトリックス、脱細胞化細胞外マトリックスであるか、又は細胞外マトリックスは、実質的に細胞を含まない、組成物。
- 前記無細胞細胞外マトリックスが、天然の無細胞細胞外マトリックスである、請求項16に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックスが、脱細胞化細胞外マトリックスである、請求項16に記載の組成物。
- a)哺乳動物のデコリンの1~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
b)哺乳動物のデコリンの31~188残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
c)哺乳動物のデコリンの1~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
d)哺乳動物のデコリンの31~188残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
e)哺乳動物のデコリンの1~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
f)哺乳動物のデコリンの31~177残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
g)哺乳動物のデコリンの1~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
h)哺乳動物のデコリンの31~177残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
i)哺乳動物のデコリンの1~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
j)哺乳動物のデコリンの31~170残基に対応するアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
k)哺乳動物のデコリンの1~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
l)哺乳動物のデコリンの31~170残基内の任意のアミノ酸配列に対応する少なくとも10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなる哺乳動物のデコリンのN末端断片;
m)配列番号1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
n)上記のa)~m)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか、から実質的になるか、又はからなるポリペプチド;
o)上記のa)~n)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチドであって、1つ以上の幹細胞を含む1つ以上の細胞と相互作用する又はを動員することができるモチーフ又は領域を含む、ポリペプチド;並びに
p)上記のa)~o)のいずれか1つに由来する少なくとも約10連続したアミノ酸を含むか又はからなるポリペプチドであって、1つ以上の間葉系幹細胞と相互作用する又はを動員することができるモチーフ又は領域を含む、ポリペプチド;
q)上記のa)~p)のいずれか1つの機能的断片、機能的変異体、ペプチド類似体、又はペプチド模倣体、又は誘導体;並びに
r)上記のa)~q)のいずれか1つに対して少なくとも約70%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、
s)上記のa)~r)のいずれか2つ以上の任意の組合せ
を含む群から選択されるポリペプチドの有効量を生物学的試料に接触させることを含むか又はそれを対象に投与することによる、生物学的試料における、又はそれを必要とする対象における、生物学的効果を媒介する方法。 - 前記生物学的効果が、それを必要とする対象においてインビボで、例えば前記ポリペプチドを該対象に投与することによって、媒介される、請求項19に記載の方法。
- 前記生物学的効果が、エクスビボで媒介される、請求項19に記載の方法。
- 前記生物学的効果が、インビトロで、例えば生物学的試料を前記ポリペプチドと接触させることによって、媒介される、請求項21に記載の方法。
- いずれかの先行する請求項に記載のポリペプチド又は組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における組織修復を調節する方法。
- 前記治療有効量が、1つ以上の幹細胞を例えば投与部位に、又は投与されたポリペプチドが局在化する部位に動員するのに十分である、請求項23に記載の方法。
- いずれかの先行する請求項に記載のポリペプチド又はいずれかの先行する請求項に記載の薬学的に許容可能な組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における幹細胞の欠乏に関連した疾患又は障害を処置する方法。
- 前記疾患又は障害が、特定の組織又は器官における幹細胞の欠乏などの、局所の幹細胞の欠乏に関連した疾患又は障害である、請求項25に記載の方法。
- いずれかの先行する請求項に記載のポリペプチド又はいずれかの先行する請求項に記載の薬学的に許容可能な組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における幹細胞の動員又は関連したプロセスを調節する方法。
- 前記関連したプロセスが、血管新生、造血、タンパク質の発現、誘導、又は沈着、組織リモデリング、修復、又は再生、細胞増殖、幹細胞の分化を含む細胞分化、細胞調節、アポトーシス、1つ以上の免疫応答の調節、腫瘍形成の調節、走化性、又は細胞動員である、請求項27に記載の方法。
- いずれかの先行する請求項に記載の方法で同定された生物活性剤の治療有効量を対象に投与することを含む、生物学的効果を媒介するか、それを必要とする対象における組織修復を調節するか、それを必要とする対象における幹細胞の欠乏に関連した疾患若しくは障害を処置するか、又はそれを必要とする対象における幹細胞の動員若しくは関連したプロセスを調節する、方法。
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