CN105327346B - 一种单克隆抗体在治疗银屑病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双功能单克隆抗体在治疗银屑病中的应用。具体地，本发明提供了一种单克隆抗体的用途，用于制备治疗银屑病的药物组合物；其中，所述的单克隆抗体具有如SEQ ID NO.:1所示序列。实验证明，本发明单克隆抗体通过抑制补体并协同抑制VEGF来达到对银屑病的治疗作用，效果与阳性对照组相当，且该作用具有显著的剂量依赖性。

Description

一种单克隆抗体在治疗银屑病中的应用

技术领域

本发明术语生物医药领域，具体地，涉及一种单克隆抗体在银屑病中的应用。

背景技术

银屑病俗称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，病程较长，有易复发倾向，有的病例几乎终生不愈。该病发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状况影响较大。临床表现以红斑，鳞屑为主，全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较为常见，多在冬季加重。发病机制复杂，目前主要认为与遗传、感染、免疫反应、内分泌异常、精神因素等原因有关。

目前，银屑病尚无有效的治疗方法，常用的药物有糖皮质激素、甲氨蝶呤、环孢素A、生物疗法等，但目前的治疗方法副作用大、易复发、多次给药产生耐受等。

因此，本领域迫切需要开发一种疗效好、副作用少的治疗银屑病的药物。

发明内容

本发明提供了一种单克隆抗体在银屑病中的应用。

本发明第一方面，提供了一种单克隆抗体的用途，用于制备治疗银屑病的药物组合物；其中，所述的单克隆抗体具有如SEQ ID NO.:1所示序列。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体为双功能性单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的双功能指同时具有补体信号通路和VEGF信号通路的抑制功能。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物的施用剂量为0.1-100mg/kg。

在另一优选例中，所述的治疗银屑病包括：(i)抑制补体(ii)抑制炎症因子分泌；和/或(iii)协同抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

在另一优选例中，所述的治疗银屑病包括减少其红斑、浸润、鳞屑或其表皮厚度。

在另一优选例中，所述的银屑病包括咪喹莫特诱导的银屑病。

在另一优选例中，所述的补体包括C3b、C4b。

在另一优选例中，所述的炎症因子包括皮肤IFN-γ、IL-2、TNF-α或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体由CHO细胞表达，经纯化获得。

在另一优选例中，所述治疗银屑病的治疗效果呈剂量依赖型。

本发明第二方面，提供了一种治疗银屑病和/或抑制补体的药物组合物，所述的药物组合物含有安全有效量的SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体，和药学上可接受的载体；较佳地，所述的药物组合物还包括补体抑制剂。

本发明第三方面，提供了一种体外非治疗性的抑制补体和/或协同抑制VEGF的方法，在具有SEQ ID NO.:1所示单克隆抗体的存在下，培养补体或VEGF升高的上皮细胞，从而抑制补体和/或协同抑制VEGF。

本发明第四方面，提供了一种治疗银屑病的方法，包括步骤：将具有SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体或其药物组合物施用于需要的对象，从而治疗银屑病。

在另一优选例中，所述的需要的对象为哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部皮肤病理组织学的影响。

A：空白对照组；B：模型对照组；C：IBI-B 1 mg/kg组；D：IBI-B 10 mg/kg组；E：IBI-B 50 mg/kg组。F：甲氨蝶呤50mg/kg组

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，具有SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体对银屑病具有良好的治疗作用。具体地，本发明人发现在银屑病模型小鼠中，本发明单克隆抗体能够有效地抑制皮肤的红斑、浸润、鳞屑和表皮增厚。实验证明，本发明单克隆抗体通过抑制补体并协同抑制VEGF来达到对银屑病的治疗作用，效果与阳性对照组相当，且该作用具有显著的剂量依赖性。此外，本发明单克隆抗体还能够有效地抑制皮肤患处炎症因子的分泌。在此基础上，完成了本发明。

双功能单克隆抗体

如本文所用，术语“IBI-BIBI-B”、“本发明单克隆抗体”、“双功能单克隆抗体”可互换使用，均指如SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体。其中，所述的“双功能”指的是对补体信号通路和VEGF信号通路的抑制作用。

活性成分

本发明的活性成分是指具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的单克隆抗体，对银屑病有显著的治疗作用。

此外，所述术语还包括具有与治疗银屑病功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：对SEQ ID NO.:1所示的序列进行1-10个，较佳地为1-5个，更佳地为1-3个氨基酸的替换、添加或删除。应理解，通常，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常不会改变蛋白质的结构和功能。对本发明SEQ ID NO.:1所示序列的氨基端或羧基端分别进行1-10个氨基酸的添加，并不会影响本发明多肽的基本功能。

在实际应用中，还可对本发明单克隆抗体进行进一步修饰以加强其稳定性。优选的例子包括对所述多肽加入保护基团，如乙酰基、叔丁氧羰基等。

本发明还包括附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的衍生蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

发明还提供本发明多克隆抗体的类似物。这些类似物与本发明多克隆抗体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

药物组合物和施用方法

本发明的药物组合物包含安全有效量的本发明的单克隆抗体以及药理上可接受的赋形剂或载体。

其中，“安全有效量”指的是：单克隆抗体的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.1-100 mg/kg本发明的单克隆抗体/剂，更佳地，含有0.3-30 mg/kg本发明单克隆抗体/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个安瓿。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的单克隆抗体以及它们之间相互掺和，而不明显降低单克隆抗体的药效。

本发明的单克隆抗体或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：肠胃外给药(如腹腔内注射剂等)。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明单克隆抗体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的药物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，日给药剂量通常为0.1-10 mg/眼，优选0.3-3 mg/眼。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的有益效果

本发明发现了单克隆抗体IBI-B可有效地治疗银屑病，减轻其红斑、皮损、浸润等临床表现，其效果与现有的银屑病治疗用药甲氨蝶呤相当，且副作用小。此外，本发明人还发现，IBI-B对银屑病的治疗作用有明显的剂量依赖性，并能够进一步协同抑制炎症因子，从而达到更好的治疗目的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1本发明双功能单克隆抗体的银屑病治疗作用

1.方法

1.1实验对象和材料：

Balb/c小鼠，雄性，体重18-22克，北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证明：SCXK(京)2009-0007。

咪喹莫特软膏：四川明欣药业有限责任公司，含量：5％，批号：130901；

IBI-B：信达生物制药(苏州)有限公司，浓度：40 mg/ml，批号：E20140402；

甲氨蝶呤：江苏恒瑞医药股份有限公司，规格：100 mg/瓶，批号：20131103

1.2分组和给药

参考Leslie等[1]方法制备小鼠银屑病模型，依据本实验室前期研究结果将Balb/c雄性小鼠以戊巴比妥钠(80mg/kg)经腹腔注射麻醉，刮除其背部毛发，形成约2cm×3cm大小的暴露区域，然后除空白组外各组涂抹5％咪喹莫特软膏，造模后给药组给予相应剂量的药物，模型组给予等体积生理盐水。实验期间每天对背部皮肤进行拍照及皮损评分。造模后第8天取背部皮肤进行病理学检测，显微镜下观察表皮厚度和炎症浸润，分组即给药剂量见表1。

表1：分组及给药剂量

N/A：未给药

1.3观察与测定

(1)皮损评分，连续进行8天。

表2：皮损评分标准

当病变程度介于两个评分标准之间时，由观察者根据经验进行适当评分。

(2)组织学分析

第8天组织取材进行HE染色，显微镜下观察表皮厚度(使用Image-pro plus6.1软件进行测量)，炎症浸润。表皮厚度的检测方法：每个组织随机选取30个部位表皮厚度值进行观察统计，计算平均值。

(3)细胞因子分析

第8天取皮肤组织检测炎症细胞因子，采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测小鼠皮肤表面的IFN-γ、IL-2和TNF-α的量。

1.4统计学方法

结果使用Microsoft office Excel 2007、spss 13.0 for windows软件进行单因素方差分析结合t或者Dunnett T3检验，p<0.05认为有差异，p<0.01认为有显著差异，p<0.001认为有特别显著的差异。

2.结果

2.1红斑评分

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部红斑的影响，见表3a-b。

表3：IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部红斑的影响(n＝10)

表3a

表3b

##p<0.01，###p<0.001与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比较

实验结果表明，从造模第3天到第8天，模型组小鼠背部皮肤的红斑明显增加，IBI-B各剂量组从第3天开始能够明显抑制红斑的形成，呈剂量依赖关系。甲氨蝶呤5 mg/kg第3-8天能够明显抑制红斑的形成。

2.2浸润评分

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部浸润的影响，见表4a-b。

表4：IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部浸润的影响(n＝10)

表4a

表4b

#p<0.05，###p<0.001与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比较。

实验结果表明，从造模第3天到第8天，模型组小鼠背部皮肤的浸润明显增加，IBI-B各剂量组从第4天开始能够明显抑制浸润的形成，呈剂量依赖关系。甲氨蝶呤5 mg/kg第3-8天能够明显抑制浸润的形成。

2.3鳞屑评分

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部鳞屑的影响，见表5a-b。

表5：IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部鳞屑的影响(n＝10)

表5a

表5b

##p<0.01，与空白组比较###p<0.001与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与模型组比较。

实验结果表明，从造模第3天到第8天，模型组小鼠背部皮肤的鳞屑明显增加，IBI-B各剂量组从第3天开始能够明显减少鳞屑的形成，呈剂量依赖关系。甲氨蝶呤5mg/kg第3-8天能够明显减少鳞屑的形成。

2.4总评分

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部皮损总评分的影响，见表6a-b。

表6：IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部皮损总评分的影响(n＝10)

表6a

表6b

##p<0.01，###p<0.001与空白组比较；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与模型组比较

实验结果表明，从造模第3天到第8天，模型对照组小鼠背部皮肤的损伤明显比空白对照组严重，IBI-B各剂量组从第3天开始能够明显抑制小鼠的皮肤损伤，呈剂量依赖关系。甲氨蝶呤5mg/kg第3-8天能够明显抑制小鼠的皮肤损伤。

2.5表皮厚度

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部表皮厚度的影响见表7。

表7.IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部表皮厚度的影响(n＝10)

###p<0.001与空白组比较；**p＜0.01，***p<0.001与模型组比较

实验结果表明，小鼠背部涂抹咪喹莫特软膏后第8天，与空白对照组相比，模型对照组的背部皮肤表皮厚度明显增加。与模型对照组相比，IBI-B各剂量组和甲氨蝶呤组均能够明显抑制咪喹莫特诱导的表皮增厚。

2.6背部皮肤HE染色

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部皮肤病理组织学的影响，见图1。

HE染色结果表明，模型对照组小鼠背部皮肤的表皮厚度明显增加，表皮内细胞数量明显增加，真皮炎症细胞浸润明显。IBI-B各剂量组对咪喹莫特诱导的表皮厚度和细胞数量增加均具有明显的抑制作用，真皮炎症细胞浸润减少。甲氨蝶呤组同样能够明显降低小鼠的表皮厚度和表皮细胞数量，抑制炎症细胞浸润。

2.6细胞因子

IBI-B对咪喹莫特诱导银屑病小鼠背部表皮细胞因子的影响，见表8。

##p<0.01，###p<0.001与空白组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型组比较

实验结果表明，小鼠背部涂抹咪喹莫特软膏后第8天，与空白对照组相比，模型对照组的背部皮肤IFN-γ、IL-2和TNF-α明显增加。与模型对照组相比，IBI-B各剂量组和甲氨蝶呤组均能够明显抑制咪喹莫特诱导的IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌。

结论

IBI-B对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型背部皮肤的红斑、浸润、鳞屑、表皮增厚和真皮炎症细胞浸润等损伤症状均具有明显的抑制作用，以及对IFN-γ、IL-2和TNF-α等炎症因子的分泌有明显抑制作用，具有明显的剂量依赖性。表明IBI-B对治疗银屑病可能有治疗作用。

实施例2本发明双功能单克隆抗体对VEGF信号通路的抑制作用

1.实验材料：

EndoGRO-VEGF Complete Culture Media Kit：Millipore SCME002

DMEM培养基：Gibco 11966-025

VEGF₁₆₅：Peprotech 100-20

CCK-8：Sigma 96992

2.实验步骤：

2.1将生长状态良好地HUVEC消化计数。

2.2用Millpore培养基重悬内皮细胞至2X10⁴个/ml，铺2000个/孔的HUVECs(100ul)于96孔板上。

2.324h后吸出培养基更换为含有10ng/mlVEGF和35nM的IgG、VEGF-Trap、CR1、IBI-B的DMEM双有培养基并设置无VEGF的阴性对照、和含VEGF但无抗体的阳性对照。另外还有仅有PBS的空白对照。每组设置3个复孔进行平行实验。

2.4再过48h之后每孔加入10ulCCK-8。

2.54h之后使用酶标仪读数OD450nM，无细胞的DMEM作为背景。

3.实验结果：

35nM浓度下VEGF-Trap和IBI-B能明显抑制VEGF诱导的HUVEC增殖，IgG和CR1无明显抑制作用。

实施例3本发明双功能单克隆抗体对补体信号通路的抑制作用

1.CH50溶血实验

1.1实验材料：

绵羊红细胞：广州蕊特007001

溶血素：广州蕊特

人补体血清：Sigma S1764

缓冲液GVB0：0.1％明胶，5mM巴比妥，145mMNaCl，调整PH至7.2～7.4范围后定容至1L

GVB++：0.1％明胶，5mM巴比妥，145mMNaCl，0.15mMCaCL2,0.5mMMgCL2调整PH至7.2～7.4后定容至1L

0.1M蔗糖GVB：5.14g蔗糖加入150mlGVB0

GVB-EDTA：0.1％明胶，5mM巴比妥，145mMNaCl，10mMEDTA调整PH至7.2～7.4范围后定容至1L

以上缓冲夜使用前均通过高温高压灭菌锅灭菌

1.2实验步骤：

1.2.1致敏绵羊红细胞

a.将绵羊红细胞用PBS洗涤3次

b.将绵羊红细胞再用GVB-EDTA洗涤1至2次，使450g离心10min的红细胞上清澄清

c.将绵羊红细胞计数，GVB-EDTA调整浓度至1X10⁹个

d.将1:2000效价的溶血素用GVB-EDTA1:1000稀释。

e.将红细胞与溶血素混合，在37°水浴40min。

f.800g离心10min后用GVB-EDTA和0,1M蔗糖GVB分别洗涤一次后用0.1M蔗糖GVB保存。

1.2.2.溶血实验

a.提前一天取出-20℃保存的人血清补体与4℃解冻。

b.1:10稀释人血清补体(GVB++)。50ul/孔，置于96孔板中。设置无血清对照孔加入50ulGVB++3孔

c.加100ul，1:3倍稀释的IBI-B/CR1/VEGF-Trap/IgG于96孔板中，与稀释的补体混匀。抗体最大浓度为500nM/ml，最小浓度为0.0762nM/ml，每组平行试验三个复孔。

d.设置对照孔：B:100ul的GVB++,3孔。N:100ul的ddH2O，3孔.

e.盖上盖子，37℃恒温摇床，130rpm，30min。

f.加5*108个/ml的EA(致敏绵羊红细胞)，50ul/孔。

g.盖上盖子，37℃恒温摇床，130rpm，45min。

h.离心1000g，3min，15℃。

i.吸上清100ul于96孔板，酶标仪405nm读数。

计算溶血率＝(实验组-无血清对照组)/(ddH2O-无血清对照组)备注：因为血清稀释倍数较高未作血清对照。

1.3实验结果：

CR1和IBI-B对补体经典激活的途径引发的绵羊红细胞溶血有抑制作用。CR1的EC₅₀为2.65nM IBI-B的EC₅₀为4.76nM。VEGF-Trap和IBI-B则无明显抑制作用。

2.ACH50溶血实验

2.1实验材料：

补体血清：Sigma S1764

兔红细胞：新西兰大白兔耳动脉取血

GVB0：0.1％明胶，5mM巴比妥，145mMNaCl，调整PH至7.2～7.4范围后定容至1L

0.01MMgCl和0.01MEGTA溶于水后调节PH至7.2～7.4，并定容至100ml

以上缓冲夜使用前均通过高温高压灭菌锅灭菌

2.2实验步骤：

a.提前一天取出-20℃保存的人血清补体，于4℃解冻。

b.人血清补体(GVB0)20ul/孔，置于96孔板中。

c.加100ul/孔，IBI-B/CR1/VEGF-Trap/IgG于96孔板中，与稀释的补体混匀。抗体最大浓度为500nM/ml，最小浓度为2nM/ml，每组平行试验三个复孔。

d.加10ul/孔的0.16mM的Mg2+EGTA

e.每孔加入20ulGVB0补齐150ul

f.设置对照孔：Blank：GVBE 130ul/孔，3孔；Negative:130ul/孔的ddH2O，3孔。补体血清对照孔180ulGVB0和20ul补体。

g.盖上盖子，37℃恒温摇床，130rpm，30min。

h.加50ul/孔的Er(兔红细胞)2.5*10⁸个/ml。

i.盖上盖子，37℃恒温摇床，130rpm，45min。

j.离心，1000g，3min，15℃。

k.吸上清100ul，酶标仪405nm读数。

计算溶血率＝(实验组-血清对照组)/(ddH2O-无血清对照组)

2.3实验结果：

CR1和IBI-B对补体旁路途径激活引起的兔红细胞溶血效应有很明显的抑制作用。CR1的EC₅₀为17.30nM，IBI-B的EC₅₀为23.67nM。VEGF-trap和IgG则没有明显抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗银屑病的药物组合物；其中，所述的单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其中所述的治疗银屑病包括减少红斑和鳞屑；并且所述的药物组合物的施用剂量为50-100mg单克隆抗体/kg。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体为双功能性单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的双功能指同时具有补体信号通路和VEGF信号通路的抑制功能。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物含有SEQ ID NO.:1所示序列的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的施用剂量为50mg/kg、或100mg/kg。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗银屑病包括：(i)抑制补体信号通路；(ii)抑制炎症因子分泌，所述的炎症因子包括皮肤IFN-γ、IL-2、TNF-α或其组合；和/或(iii)协同抑制血管内皮生长因子信号通路。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗银屑病还包括减少皮肤炎症浸润和皮肤表皮厚度。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的银屑病包括咪喹莫特诱导的银屑病。

9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的补体包括C3b、或C4b。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体由CHO细胞表达，经纯化获得。

12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗银屑病的治疗效果呈剂量依赖型。

13.一种治疗银屑病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有安全有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的单克隆抗体，和药学上可接受的载体，并且，所述的药物组合物还包括补体抑制剂。

14.一种体外非治疗性的抑制补体信号通路和协同抑制VEGF信号通路的方法，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的单克隆抗体的存在下，培养补体和VEGF升高的上皮细胞，从而抑制补体信号通路和协同抑制VEGF信号通路。